JP6858784B2 - サブトラクティブイムノアッセイ方法およびその方法を実施するためのラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイストリップ - Google Patents
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Description
−これは、携帯型比色計を保存する機器を必要としない簡単なイムノクロマトグラフィーアッセイ形式である。唯一の操作は、サンプル中の黄色ブドウ球菌の磁性ビーズに基づく濃縮ならびに任意選択の固定化および/または透過処理であり、これらの操作は、磁性または常磁性ビーズ、外部磁石、ピペット、数種のバッファー、固定剤および透過処理剤を必要とする。これらのパーツは総て、上記のイムノアッセイを実施するためにキットに含まれ得る。
−携帯型比色計による定量が可能である。
−イムノクロマトグラフィーアッセイを用いたサンプリングは、50マイクロリットルの液体しか必要とせず、黄色ブドウ球菌数(CFU−コロニー形成単位)が非常に少ない可能性があるサンプルの不必要な希釈を防ぐ少量でのサンプル処理が可能である。磁性または常磁性ビーズを用いた細菌の濃縮は、前記アッセイの感度を増大させる可能性が高い。提案されたアッセイは、感度500CFU/ml、実際には、25CFU/ストリップ(ストリップに適用された50マイクロリットル中)でのイムノクロマトグラフィーアッセイ形式に基づいている。従って、前記濃縮工程は、<500CFU/mlまで前記アッセイの感度を増大させることができる。
−全アッセイ期間は1時間を越えない。最終的な検出および定量までのスワブを得るアッセイ時間形態は、35分〜54分の間であり、洗浄および処理に6分であると推定される。サンプル溶出1〜2分、Ebf(黄色ブドウ球菌−MRSAおよびMSSAの両方)の検出5分、黄色ブドウ球菌の固定化20分、生物の透過処理1分、黄色ブドウ球菌の捕捉1〜2分、捕捉磁石からの黄色ブドウ球菌の溶出4分、PBP2a(MRSA)およびPBP2(MSSA)の検出5〜20分。合計時間=34分〜54分。処理/PBS洗浄は6分を超えてはならない。
−記載されたアッセイは、黄色ブドウ球菌の肉眼による検出を可能にする。
−混合集団におけるMRSAおよびMSSAの同時同定が可能である。
Ebf(細胞外フィブリノーゲン結合タンパク質)は、細胞外マトリックス中のフィブリノーゲンとの結合を通じてアドヘシンとして作用する。これはまた、莢膜産生が開始されていない感染の初期段階において黄色ブドウ球菌によって開始される補体活性化を中和する働きをし得る補体タンパク質C3と結合する(参考文献9)。Ebfは、病原性/侵襲性黄色ブドウ球菌におけるその高度に保存された性質および構成的発現のため、および細胞外培地へのその分泌が、細菌のいかなる処理も行わずに、イムノクロマトグラフィーアッセイ(ICA)ラテラルフロー検出に容易に受け入れられることとなるため、黄色ブドウ球菌の指標として選択される。
プロテインAの免疫グロブリン結合特性を利用することによりMRSAおよびMSSAの検出/定量の感度を最適化するために、前記イムノアッセイは黄色ブドウ球菌の濃縮から始める。プロテインAは、細胞表面上に発現される高度に保存された黄色ブドウ球菌特異的マーカーである。IgG FcドメインとのプロテインAの結合は、20秒以内の非常に迅速な結合速度を示す(参考文献10)。従って、細菌の捕捉もまた、黄色ブドウ球菌プロテインAを検出するために間接的に役立つ。
PBP2aおよびそのコード遺伝子mec Aは、MRSAにのみ存在し、これらの生物のメチシリン耐性機構の中心である。PBP2とは異なるPBP2aは、β−ラクタムに対して低い親和性を有する。PBP2のトランスグリコシラーゼ活性と併せて、PBP2a トランスペプチダーゼ活性は、MRSA細胞におけるβラクタムの存在下でのペプチドグリカン合成を可能にする(参考文献11;参考文献12;参考文献13)。PBP2aは、MRSAに特有であり、従って、試験サンプルからのMRSA細胞の検出および選択的枯渇のために選択される。文献において用いられている、PBP2a検出用に市販されている多くのイムノアッセイがある。多数のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体がPBP2aに対して利用可能である。
PBP2は、主要細胞壁成分であるペプチドグリカンの合成に関与する重要な酵素であり、総ての黄色ブドウ球菌細胞中に存在する。この酵素は、トランスペプチダーゼとしてのみ作用するPBP2aとは異なり、トランスグリコラーゼ活性およびβ−ラクタム感受性トランスペプチダーゼ活性の両方を示す。記載のアッセイは、PBP2を介してMSSA細胞の存在を評価する前に試験サンプルから総てのMRSA細胞を除去するように設計されている(サブトラクティブイムノアッセイ)。
Copan Diagnostics Inc.のESwabは、好気性生物および嫌気性生物を含む臨床試料の採取および輸送用に認可されたスワブ(CLSI M40−A性能基準;微生物の輸送システムの品質管理(Quality Control of Microbiological Transport Systems))である。このスワブは、冷蔵庫(4〜8℃)および室温(20〜25℃)の両方で最大48時間、好気性生物および嫌気性生物の生存力を維持する。ESwabは、患者のサンプルを採取するために使用され、サンプルは、スワブから1ml PBS中に1〜2分間自動溶出される(Eswabに必要なボルテックスは不要)(参考文献18)。スワブ溶出液は、ピペットで新しいチューブに移すことができる。他のスワブシステムも使用し得る。しかしながら、上述のESwabは、他のスワブと比較して、研究された微生物についてほぼ1log(ベース10)高いカウントを与えた(参考文献26)。
Ebfイムノクロマトグラフィーディップスティックを、スワブ溶出液に挿入し、一度テストゾーン内で赤色が発色したら、黄色ブドウ球菌の存在を示すことが読み取られる。Ebfについての陽性結果に続いて、溶出液中の細菌を、PBS中の等容量の2.7%パラホルムアルデヒドおよび0.005%グルタルアルデヒドで20分間(黄色ブドウ球菌の平均倍加時間)固定する(参考文献16;参考文献19;参考文献20)。液量をPBSで30倍に増やし、固定液を0.045%ホルムアルデヒド、0.0008%グルタアルデヒド(gluteraldehyde)の終濃度に希釈する。0.4%ホルムアルデヒドが架橋するためには37℃で4分必要であるため、これらの濃度では、固定化は起こらない可能性がある(参考文献21)。
免疫検出の感度を高めるために、磁気捕捉によりスワブ溶出液から黄色ブドウ球菌を濃縮する。黄色ブドウ球菌は、2つの理由から、プロテインL−ビーズから遊離されるべきである:(i)プロテインLは、ヒト免疫グロブリンκ鎖に結合し、これがマウス免疫グロブリンのκ鎖Iに結合する。利用可能な抗体試薬(PBP2およびPBP2aに対する抗体)が、κIIIもしくはIV、またはプロテインLに結合しないλ型軽鎖−IgG類でない限り、プロテインLの存在は、ICA中に抗体に無差別に結合するために、イムノアッセイの機能を完全に損なわせる;(ii)記載したアッセイ形式の主要な診断目標である混合集団においてビーズに結合する黄色ブドウ球菌のMRSA細胞とMSSA細胞とはICAによってもはや区別されない。
本明細書に記載のICAアッセイに使用することができる抗体を以下に列挙する。これらの抗体は市販されておりかつ/または文献で使用されている。
−抗Ebf抗体:抗Ebfマウスまたはヒトポリクローナル精製IgG(参考文献25)。
−抗PBP2a抗体:捕捉mab IgM(クローン 1G12)および検出mab IgG(クローン 10G2)(参考文献14);捕捉mab クローン番号M8121521および検出mab クローン番号M8121522(Fitzgerald Industries International製);捕捉mab クローン番号M8121523および検出mab クローン番号M8121522(Fitzgerald Industries International製);Biosource製抗PBP2aマウスモノクローナル抗体 カタログ番号MBS530969、MBS530221およびMBS531915(MyBioSource、Inc製);
−抗PBP2抗体:抗PBP2ウサギポリクローナル(参考文献16)。
2つのコンジュゲートパッド10、20を有するペーパーベースのラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ1は、全黄色ブドウ球菌細胞におけるPBP2aと、その後のPBP2との連続検出のために提供される。ストリップ構築物を図1に示している。
1.)サンプルアプリケーションゾーン3(サンプルアプリケーションパッド)。このゾーンは、サンプル液(スワブ溶出液または黄色ブドウ球菌濃縮後の溶出液)に浸漬され、この場所からサンプル液はストリップに沿って最後のゾーン(吸収パッド)まで移動する。
2.)第1のコンジュゲーションゾーン10(第1のコンジュゲートパッド)。このゾーンは、遊離した第1の検出抗体を含有する。第1の検出抗体は、検出下の第1の分析物(本明細書ではPBP2a)に特異的であり、シグナル発生系(第1の検出タグ)とコンジュゲートされる。第1の検出タグは、シグナルのための金ナノ粒子(AuNp)であり得、それは高感度であり、そのシグナルは第1の分析物の存在下で発色した赤色の形態で肉眼で見えるためである。サンプルは、アプリケーションゾーン(サンプルアプリケーションパッド)から第1のコンジュゲーションゾーン(第1のコンジュゲートパッド)まで流れ、そこで、第1の検出抗体(例えば、AuNp標識抗体)は第1の分析物に結合する。
3.)第1のテストライン11(第1の捕捉/テストゾーン)。このゾーンは、第1の分析物(例えば、PBP2a)に特異的であるが、第1のコンジュゲートパッドの第1の検出抗体とは異なるエピトープを認識する、固定化された第1の捕捉抗体を含有する。第1のコンジュゲートパッドにおいて形成される複合体、第1の分析物−第1の検出抗体は、第1の分析物を介して固定化された第1の捕捉抗体と結合し、第1の捕捉ゾーンにおいて複合体を濃縮する。第1のテストラインにおけるAuNpの集束は、肉眼で見える明瞭な赤色として現れ、その強度は第1の分析物濃度に比例して増加する。PBP2aを含有するMRSA細胞は、第1の捕捉ゾーンにおいて捕捉および検出され、サンプルから完全に枯渇される。
4.)第1のコントロールライン12(第1のコントロールゾーン)。余分な第1の検出抗体(例えば、AuNpタグ付き)と、サンプルからの非結合物質とは、第1のコントロールゾーンに移動する。このゾーンは、第1の検出抗体(AuNpコンジュゲート)に特異的に結合する第1の対照抗体を含有する。第1のコントロールゾーンは、余分な遊離した第1の検出抗体を吸収するとともに、ストリップ装置が適切に機能しているという確認の役割を果たす。第1のコントロールライン上の赤色は、装置が作動していることを示す。
5.)第2のコンジュゲーションゾーン20(第2のコンジュゲートパッド)。その時点で第1の検出抗体(抗PBP2a−AuNp抗体)および第1の分析物(MRSA細胞)を含まない、細菌細胞を含む非結合物質は、第2のコンジュゲートパッドまで流れる。第2のコンジュゲートパッドは、第2の分析物(例えば、PBP2)に特異的な、遊離した第2の検出抗体(例えば、AuNpとコンジュゲートされた抗PBP2抗体)を含有する。
6.)第2のテストライン21(第2の捕捉/テストゾーン)。このゾーンは、第2の分析物(例えば、PBP2)に特異的であるが、第2のコンジュゲートパッドの第2の検出抗体とは異なるエピトープ(a different epitope form)を認識する、固定された第2の捕捉抗体を含有する。第2のコンジュゲートパッドにおいて形成される複合体、第2の分析物−第2の検出抗体は、第2の分析物を介して固定された第2の捕捉抗体と結合し、第2の捕捉ゾーンにおいて複合体を濃縮する。第2のテストラインにおけるAuNpの集束は、肉眼で見える明瞭な赤色として現れ、その強度は第2の分析物濃度に比例して増加する。従って、PBP2を含有するMSSA細胞は、ここで捕捉および検出される。
7.)第2のコントロールライン22(第2のコントロールゾーン)。余分な第2の検出抗体(例えば、AuNpタグ付き)と、サンプルからの非結合物質とは、第2のコントロールゾーンに移動する。このゾーンは、第2の検出抗体(AuNpコンジュゲート)に特異的に結合する第2の対照抗体を含有する。第2のコントロールゾーンは、余分な遊離した第2の検出抗体を吸収し、ストリップ装置が適切に機能しているという確認の役割を果たす。第2のコントロールライン上の赤色は、装置が作動していることを示す。
8.)吸収ゾーン5(吸収パッド)。最後に、吸収パッドは、未反応/非結合物質を含有する不必要なサンプル液を吸収する。
以下では、イムノクロマトグラフィーストリップの構築のための可能性がある方法を記載する。
テストゾーン(単数または複数)について(MRSA、MSSAまたは両方が存在するかどうかに依存)およびPBP2検出のコントロールゾーン(サンプル通過する最後のコントロールライン)について発色するまで、イムノクロマトグラフィーストリップを50μlの細胞懸濁液に浸漬する(免疫磁気捕捉および遊離後)。赤色テストラインの強度は、細菌濃度の増加と正の相関がある。
−MRSAのみの存在下では、PBP2aについて赤色となり(陽性)、PBP2について赤色とならず(陰性);
−MSSAのみの存在下では、PBP2aについて赤色とならない(陰性)が、PBP2について赤色となり(陽性);または
−MRSAおよびMSSAの両方の存在下では、PBP2aについて赤色となり(陽性)、PBP2について赤色となる(陽性)。
赤色テストラインの強度は、細菌濃度の増加と正の相関がある。MRSA/MSSAの濃度を定量する1つの可能性は、Auナノ粒子の色強度を読み取るCCDカメラデバイスのない携帯型比色計である(参考文献17)。この計器は、発光ダイオード(LED)、フォトダイオード、対数集積チップ、電源、LM324クァッドオペアンプ、およびコンデンサーで構成される。LEDは光源である。フォトダイオードは、EPIGAP−EPD−470−5/0.5の400nm〜550nmに特定である。対数集積チップLOG102AIDは、反射光の対数尺度を取る。リーダーは、LEDにより濃度バーを5段階で表示する。リーダーは、テストラインおよびコントロールラインで色反射によって誘導される電圧変化を捕捉する。コントロールラインとテストラインとの間での電圧の相対的差異を測定して、読み取りのばらつきを最小限に抑え、計器の適切な機能を保証する。
2 支持体
3 サンプルアプリケーションパッド
4 ニトロセルロースメンブレン
4’ ニトロセルロースメンブレン
5 吸収パッド
10 第1のコンジュゲーションパッド
11 第1のテストライン(ニトロセルロースメンブレン上にスポッティングされる)
12 第1のコントロールライン(ニトロセルロースメンブレン上にスポッティングされる)
20 第2のコンジュゲーションパッド
21 第2のテストライン(ニトロセルロースメンブレン上にスポッティングされる)
22 第2のコントロールライン(ニトロセルロースメンブレン上にスポッティングされる)
Claims (17)
- サンプル中の第1の分析物および第2の分析物の存在または不在を検出するための方法であって、第1の分析物のみが固有の抗原またはエピトープを有することを除いて前記2つの分析物は同一であり、以下の順序で以下の工程:
a)第1の検出タグを用いて第1の分析物にタグ付けするために、第1の分析物に第1の検出抗体をコンジュゲートする工程;
b)第1の分析物を捕捉し、かつサンプルから第1の分析物を完全に枯渇させるために、第1の分析物の固有の抗原またはエピトープに第1の捕捉抗体をコンジュゲートする工程;
c)第2の検出タグを用いて第2の分析物にタグ付けするために、第1の分析物を完全に枯渇させた前記サンプル中の第2の分析物に第2の検出抗体をコンジュゲートする工程;
d)第1の分析物を完全に枯渇させた前記サンプルから第2の分析物を捕捉するために、第2の分析物に第2の捕捉抗体をコンジュゲートする工程;
e)前記第1の捕捉抗体および前記第2の捕捉抗体の部位それぞれにおいて前記第1の検出タグおよび前記第2の検出タグの存在または不在を検出し、それにより、前記サンプル中の第1の分析物および第2の分析物の存在または不在を検出する工程
を含むイムノアッセイを含んでなる、方法。 - 前記第1の検出抗体および前記第2の検出抗体が、前記サンプル中でまたは前記サンプルとともに自由に移動できる遊離した第1の検出抗体および第2の検出抗体であり、かつ、前記第1の捕捉抗体および前記第2の捕捉抗体がそれぞれ、基体上の所定の部位に固定された、固定化された第1の捕捉抗体および第2の捕捉抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の捕捉抗体の濃度が前記第1の検出抗体の濃度以上である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1の検出抗体に対する前記第1の捕捉抗体の濃度が、1:1〜5:1の間の比にある、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1の検出抗体に対する前記第1の捕捉抗体の濃度が、1.5:1〜3:1の間の比にある、請求項1または2に記載の方法。
- 前記方法が、サンプル流れ方向に、サンプルアプリケーションパッド(3)、第1のコンジュゲーションパッド(10)、少なくとも1本の第1のテストライン(11)および任意選択により少なくとも1本の第1のコントロールライン(12)を有するニトロセルロースメンブレン(4)、第2のコンジュゲーションパッド(20)、少なくとも1本の第2のテストライン(21)および任意選択により少なくとも1本の第2のコントロールライン(22)を有するニトロセルロースメンブレン(4’)、ならびに吸収パッド(5)を含んでなるラテラルフローアッセイストリップ(1)を用いたラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイであり;
その第1のコンジュゲーションパッド(10)が、前記第1の検出抗体を含有し、その第1のテストライン(11)が、前記第1の捕捉抗体によって形成され、その第2のコンジュゲーションパッド(20)が、前記第2の検出抗体を含有し、かつ、その第2のテストライン(21)が、前記第2の捕捉抗体によって形成され、その任意選択の少なくとも1本の第1のコントロールライン(12)が、前記第1の検出抗体に特異的に結合する第1の対照抗体を含有し、その任意選択の少なくとも1本の第2のコントロールライン(22)が、前記第2の検出抗体に特異的に結合する第2の対照抗体を含有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1の分析物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)であり、かつ、前記第2の分析物が、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の検出抗体および前記第1の捕捉抗体が、ペニシリン結合タンパク質2a(PBP2a)の異なるエピトープに特異的であり;かつ、前記第2の検出抗体および前記第2の捕捉抗体が、ペニシリン結合タンパク質2(PBP2)の異なるエピトープに特異的である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、生物試料、環境試料または食品試料から採取される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イムノアッセイを実施する前に、前記サンプルが、IgG抗体コーティングされた磁性ビーズを用いて、黄色ブドウ球菌を単離濃縮することによって前処理され、前記IgG抗体が、そのFab領域で磁性ビーズに結合しており、黄色ブドウ球菌のプロテインAと特異的に相互作用するように、そのFc領域は使われていない状態である、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の分析物および第2の分析物を検出するために、請求項1〜10のいずれか一項に記載のイムノアッセイを実施するためのラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップであって、第1の分析物のみが固有の抗原またはエピトープを有することを除いて前記2つの分析物は同一であり、サンプル流れ方向に、サンプルアプリケーションパッド(3)、第1のコンジュゲーションパッド(10)、少なくとも1本の第1のテストライン(11)および任意選択により少なくとも1本の第1のコントロールライン(12)を有するニトロセルロースメンブレン(4)、第2のコンジュゲーションパッド(20)、少なくとも1本の第2のテストライン(21)および任意選択により少なくとも1本の第2のコントロールライン(22)を有するニトロセルロースメンブレン(4’)、ならびに吸収パッド(5)を含んでなり;
前記第1のコンジュゲーションパッド(10)が、第1の検出タグを用いて前記第1の分析物にタグ付けするために、前記第1の分析物に対する第1の検出抗体を含有し;
前記第1のテストライン(11)が、前記第1の分析物を捕捉しかつ前記サンプルからその第1の分析物を完全に枯渇させるために、前記第1の分析物の固有の抗原またはエピトープに対する第1の捕捉抗体によって形成され;
前記第2のコンジュゲーションパッド(20)が、第2の検出タグを用いて前記第2の分析物にタグ付けするために、第1の分析物を完全に枯渇させた前記サンプル中の前記第2の分析物に対する第2の検出抗体を含有し;
前記第2のテストライン(21)が、第1の分析物を完全に枯渇させた前記サンプルから前記第2の分析物を捕捉するために、前記第2の分析物に対する第2の捕捉抗体によって形成され;
前記任意選択の少なくとも1本の第1のコントロールライン(12)が、前記第1の検出抗体に特異的に結合する第1の対照抗体を含有し;
前記任意選択の少なくとも1本の第2のコントロールライン(22)が、前記第2の検出抗体に特異的に結合する第2の対照抗体を含有する、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。 - 前記第1の検出抗体および前記第2の検出抗体が、前記サンプル中でまたは前記サンプルとともに自由に移動できる遊離した第1の検出抗体および第2の検出抗体であり、前記第1の捕捉抗体および前記第2の捕捉抗体がそれぞれ、前記第1のテストラインおよび前記第2のテストライン(11、21)の部位に固定された、固定化された第1の捕捉抗体および第2の捕捉抗体であり、かつ、前記任意選択の第1のコントロールラインおよび第2のコントロールライン(12、22)の抗体が、前記第1のコントロールラインおよび前記第2のコントロールライン(12、22)の部位に固定されている、請求項11に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。
- 前記第1の分析物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)であり、かつ、前記第2の分析物が、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)である、請求項11または12に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。
- 前記第1の検出抗体および前記第1の捕捉抗体が、ペニシリン結合タンパク質2a(PBP2a)の異なるエピトープに特異的であり;かつ、前記第2の検出抗体および前記第2の捕捉抗体が、ペニシリン結合タンパク質2(PBP2)の異なるエピトープに特異的である、請求項11〜13のいずれか一項に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。
- 第1のコンジュゲーションパッド(10)および第1のテストライン(11)の少なくとも1つのさらなるセットが、第1のコンジュゲーションゾーン(10)および第1のテストライン(11)の第1のセットに続く、請求項11〜14のいずれか一項に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップ。
- サンプル中の第1の分析物および第2の分析物の存在または不在を検出するためのキットであって、請求項11〜15のいずれか一項に記載のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップを含んでなる、キット。
- 以下:
スワブからサンプルを溶出するための薬剤を含んでなる、患者からサンプルを採取するためのスワブ;
サンプル中の黄色ブドウ球菌の不在または存在を検出するためのEbfイムノクロマトグラフィーディップスティック;
黄色ブドウ球菌を単離濃縮するためのIgG抗体コーティングされた磁性ビーズであって、前記IgG抗体は、そのFab領域で磁性ビーズに結合しており、黄色ブドウ球菌のプロテインAと特異的に相互作用するように、そのFc領域は使われていない状態であり;洗浄工程および磁性ビーズからの黄色ブドウ球菌の溶出のための薬剤を含んでなる、磁性ビーズ;および
黄色ブドウ球菌の固定化および透過処理のための薬剤
の少なくとも1つをさらに含んでなる、請求項16に記載のキット。
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