CN114487404B - 用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条及检测方法。用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条，包括依次粘贴在底板上的样品垫、NC膜、吸水垫和底板，其中NC膜上设有检测线和质控线，检测线包被有青霉素‑BSA，质控线包被有His融合标签抗体。本发明还提供用于检测细菌内碳青霉烯酶的试剂盒，包括细菌裂解液、反应孔I、II和所述试纸条；反应孔I包被有美罗培南，反应孔II包被有胶体金标记的PBP 4’受体蛋白复合物。本发明选用性质稳定的美罗培南作为底物，以金标青霉素结合蛋白PBP 4’作为受体，通过检测底物消耗情况间接检测样品中碳青霉烯酶的有无。为细菌内碳青霉烯酶的快速检测提供有力技术手段。

Description

用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条及检测方法
技术领域
本发明属于免疫学分析领域，具体地说，涉及用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条及检测方法。
背景技术
碳青霉烯类药物是治疗多重耐药革兰氏阴性杆菌所致感染最有效的抗菌药物之一。然而随着该类药物在临床的广泛应用，细菌对其耐药性逐渐增强，碳青霉烯类耐药菌已成为全球公共卫生领域的严重威胁。碳青霉烯类耐药菌的主要耐药机制是产生能够水解该类药物的碳青霉烯酶。其中Ambler分类中的A类丝氨酸碳青霉烯酶KPC，B类金属碳青霉烯酶NDM、VIM、IMP，和D类丝氨酸碳青霉烯酶OXA-48已在全球范围内广泛流行。鉴于细菌对碳青霉烯类药物耐药的严峻形势，细菌内碳青霉烯酶的检测对于临床碳青霉烯类耐药菌的预防与控制具有重要意义。
现有检测碳青霉烯酶的方法包括基因型检测和表型检测。其中，基于PCR的基因型检测灵敏度高，但需要专业的技术人员和昂贵的仪器设施，无法检出新的变异，使其在临床应用受限。基于酶活性的表型检测中，美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的检测方法为Carba NP和mCIM。其中，Carba NP检测在2h内得到结果，但对一些碳青霉烯酶的检测灵敏度低至11％。mCIM检测灵敏度高，不足之处在于检测时间长达18h。临床检测中亟需兼顾灵敏度和检测时间的酶活性检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简便、检测快速的使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶免疫层析检测试纸条及检测方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条，包括样品垫、NC膜、吸水垫和底板，所述NC膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上。
其中，所述检测线包被有完全抗原青霉素-BSA；所述质控线包被有His融合标签抗体；
所述完全抗原青霉素-BSA是由青霉素与载体蛋白BSA偶联而成。
优选地，所述试纸条的检测线上包被的完全抗原青霉素-BSA的终浓度为2mg/mL，质控线上包被的His融合标签抗体的终浓度为2mg/mL。
优选地，所述底板为PVC板。
优选地，所述样品垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
进一步地，所述试纸条是将样品垫、NC膜和吸水垫由底板的一面交互层叠黏贴到所述底板上；其中，NC膜位于最底层，样品垫和吸水垫以与NC膜2-3mm的重叠接触贴于NC膜两端。
第二方面，本发明提供用于检测细菌内碳青霉烯酶的试剂盒，其特征在于，包括细菌裂解液、反应孔I、反应孔II和所述用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条。
其中，所述反应孔I包被有美罗培南(美罗培南可以替换成亚胺培南、厄他培南等碳青霉烯类药物，优选稳定性好的美罗培南)，所述反应孔II包被有胶体金标记的PBP 4’受体蛋白复合物。
优选地，所述PBP 4’受体蛋白(截短体)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述细菌裂解液为：0.1％TritonX-100+20mM PBS+0.1mM ZnSO4，pH7.4。
优选地，反应孔I包被的美罗培南的终浓度为600ng/mL，反应孔II包被的胶体金标记的PBP 4’受体蛋白复合物的终浓度为10μg/孔。
在本发明的一个具体实施方式中，反应孔II的制备过程包括：
1、制备PBP 4’蛋白
A、PBP 4基因的合成
从Genbank中获取PBP 4基因的氨基酸序列(Accession：ANW82089)，根据大肠杆菌的密码子偏好性进行PBP 4基因的碱基序列的密码子优化，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的基因序列。PBP 4基因编码的PBP 4受体蛋白的氨基酸序列全长如SEQ ID NO:2所示。
B、载体的构建
通过截短目的片段(PBP 4受体蛋白25-431aa，)，用His标签表达，克隆至表达载体pET-28a，得到重组质粒pET-28a-PBP 4’。
C、PBP 4’重组蛋白的表达与纯化
构建完成的重组质粒转入感受态细胞转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃条件下进行诱导表达。
4℃，3200g离心15min收集菌体；然后使用20mM Tris-HCl(含150mM NaCl)重悬菌体，功率3000W，开启10s/停止10s，超声15min裂解菌体。采用Ni-NTA镍柱纯化系统纯化表达的PBP 4’重组蛋白，得到PBP 4’蛋白，用于连接金纳米粒子，作为金标受体蛋白。
2、制备金标受体蛋白
A、合成并表征金纳米粒子
采用种子生成法合成平均粒径为35nm的GNPs。称取1.47mg柠檬酸三钠，溶解于20mL超纯水，加入0.5mL 0.4％(w/v)的氯金酸溶液和0.6mL 0.1M硼氢化钠溶液，室温放置30min，获得种子溶液。取2.5mL 0.4％(w/v)氯金酸溶液，用超纯水稀释至100mL，搅拌煮沸15min。随后，向该溶液中加入0.75mL种子溶液和0.4mL新鲜配制的1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液。继续搅拌煮沸，直到溶液变为酒红色。保持沸腾5min后，停止加热，将溶液冷却至室温，得到GNPs溶液。通过TEM和UV-Vis鉴定颗粒的粒径和分散性。
B、金纳米粒子标记受体蛋白
10mL GNPs溶液加入一定体积0.01mM K2CO3，以调节溶液pH。重组受体蛋白先用适宜的缓冲液稀释至0.4mg/mL，随后取一定量的受体蛋白加入到上述GNPs溶液中，室温振荡混匀45min。加入1mL金标封闭液(BSA终浓度为1％，w/v)，室温振荡封闭2h。封闭结束后，4℃8000g离心30min，弃去上清，重复洗涤2次。沉淀重悬于1mL金标重悬液中，得到金标PBP 4’受体蛋白。将得到的金标受体蛋白分装至PVC塑料制成的透明微孔冻干(80μL/孔)，得到含有金标受体蛋白的红色微孔，即为反应孔II。
第三方面，本发明提供所述用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条或所述用于检测细菌内碳青霉烯酶的试剂盒在细菌内碳青霉烯酶检测中的应用。
本发明中，所述碳青霉烯酶包括Ambler分类中A、B、D类的碳青霉烯酶，如KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48。
第四方面，本发明提供细菌内碳青霉烯酶的免疫层析检测方法，包括以下步骤：
(1)挑取待测单菌落，加入到200μL细菌裂解液中，涡旋5s，得到裂解产物；
(2)将裂解产物转移至反应孔I内，反复吹打，于40℃保温20min，得到降解产物；
(3)将降解产物转移至反应孔II内，反复吹打，于40℃温育4min；
(4)温育结束后，将试纸条的样品垫一端插入到反应孔II内，继续于40℃孵育4min；
(5)孵育结束后，根据检测线和质控线的显色结果判定待测菌是否含碳青霉烯酶、
进一步地，步骤(5)中结果判定标准如下：
阴性：质控线显色，检测线不显色；
阳性：质控线显色，检测线显色；
无效：质控线不显色，无论检测线是否显色，结果判为无效。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用与碳青霉烯类药物产生不可逆结合的青霉素结合蛋白PBP 4’建立了一种检测细菌中碳青霉烯酶活性的竞争型侧流免疫层析法。利用青霉素结合蛋白与碳青霉烯类药物结合的不可逆性，可高灵敏度检测美罗培南，从而间接反映碳青霉烯酶的有无。该方法检测五种主要的碳青霉烯酶KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48的LOD分别为12ng/mL、18ng/mL、317.8ng/mL、15ng/mL、31.78ng/mL。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中青霉素结合蛋白PBP 4’的SDS-PAGE检测结果。其中，M：蛋白Marker；1：诱导纯化后的蛋白。
图2为本发明较佳实施例中竞争型侧流免疫层析法对美罗培南检测的标准曲线。
图3为本发明较佳实施例中竞争型侧流免疫层析法对五种主要碳青霉烯酶的检测结果。从左到右依次为：
KPC：0ng/mL、1.2ng/mL、12ng/mL、120ng/mL、1200ng/mL、12000ng/mL；
NDM：0ng/mL、1.8ng/mL、18ng/mL、180ng/mL、1800ng/mL、18000ng/mL；
IMP：0ng/mL、1.5ng/mL、15ng/mL、150ng/mL、1500ng/mL、15000ng/mL；
OXA-48：0ng/mL、3.178ng/mL、31.78ng/mL、317.8ng/mL、3178ng/mL、31780ng/mL；
VIM：0ng/mL、3.178ng/mL、31.78ng/mL、317.8ng/mL、3178ng/mL、31780ng/mL。
图4为本发明较佳实施例中竞争型侧流免疫层析法对临床菌株的检测结果。A：从左到右依次为：表达NDM的6株肺炎克雷伯菌、1株奇异变形杆菌；B：从左到右依次为：表达NDM的8株大肠杆菌；C、从左到右依次为：表达KPC的14株肺炎克雷伯菌；D：从左到右依次为：表达OXA-10的1株大肠杆菌；联合表达OXA-1和NDM的1株大肠杆菌；E：从左到右依次为：表达OXA-1的1株大肠杆菌；表达ESBL的13株肺炎克雷伯菌、4株大肠杆菌；标准质控菌株大肠杆菌ATCC 25922。
具体实施方式
本发明提供一种使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶快速检测试纸条及酶活性检测方法。包括细菌裂解液、设有碳青霉烯酶底物的白色微孔(反应孔I)、设有金标受体蛋白的红色微孔(反应孔II)、检测试纸(用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条)。本发明选用理化性质稳定的美罗培南作为底物，以金标青霉素结合蛋白PBP 4’作为受体，通过检测底物消耗情况间接检测样品中碳青霉烯酶的有无。以此原理研制了一种使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶快速检测试纸条，并对其方法学系统评估，结果显示试纸条检测快速、使用便捷、特异性好、灵敏度高，为细菌内碳青霉烯酶的快速检测提供有力技术手段。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶快速检测试剂盒，包括细菌裂解液、白色微孔(反应孔I)、红色微孔(反应孔II)和检测试纸(用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条)。
在一个具体实施方案中，所述细菌裂解液的配方为：0.1％TritonX-100+20mM PBS+0.1mM ZnSO4，pH7.4。
在一个具体实施方案中，所述白色微孔内设有冻干碳青霉烯酶底物美罗培南，所述红色微孔内设有胶体金-PBP 4’受体蛋白标记物(胶体金标记的PBP 4’受体蛋白复合物)。
在一个具体实施方案中，重组PBP 4’受体蛋白为通过截短PBP 4序列，N端添加His-tag标签，克隆至表达载体pET-28a，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，经IPTG诱导表达，使用Ni-NTA镍柱纯化得到的。
在一个具体实施方案中，检测试纸由样品垫、NC膜和吸水垫由底板的一面交互层叠黏贴到所述底板上；其中，NC膜位于最底层，样品垫和吸水垫以与NC膜2-3mm的重叠接触贴于NC膜两端。
所述NC膜中间部位设有质控线和检测线，质控线包被有His融合标签抗体，检测线包被有青霉素-BSA(PenG-BSA)。所述质控线和检测线为平行设置。
本发明还提供一种使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶酶活性检测方法，该方法操作简便，检测快速，灵敏度高。
具体地，使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶酶活性检测方法，包括以下步骤：
(1)用接种环挑取一环在LB固体培养基上过夜培养的单菌落，加入到200μL细菌裂解液中，涡旋5s。
(2)将步骤(1)中液体转移至白色微孔，5-10次缓慢吹打至孔底白色物质完全溶解后置于40℃下反应20min(混匀过程应避免产生气泡)。
(3)将白色微孔内液体全部转移至红色微孔，5-10次缓慢吹打至孔底红色物质完全溶解后40℃温育4min(混匀过程应避免产生气泡)。
(4)取出所需数量的试纸条做好标记，在上述温育结束后，将试纸条海绵端朝下插入到红色微孔中继续温育4min，温育结束后，1min内判读结果，其余时间判断无效。
(5)结果判断：
阴性：质控线显色，检测线不显色；
阳性：质控线显色，检测线显色；
无效：质控线不显色，无论检测线是否显色，结果判为无效。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的细菌裂解液为：0.1％TritonX-100+20mM PBS+0.1mM ZnSO4，pH7.4。
实施例1细菌内碳青霉烯酶免疫层析检测试剂盒及检测方法
本实施例提供一种使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶快速检测试剂盒，包括细菌裂解液、设有美罗培南的白色微孔(反应孔I)、设有胶体金-受体蛋白PBP 4’标记物的红色微孔(反应孔II)和和检测试纸(用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条)。
1、使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶快速检测试纸条的制备
(1)制备PBP 4’蛋白
A、PBP 4基因的合成
从Genbank中获取PBP 4基因的氨基酸序列(Accession：ANW82089)，根据大肠杆菌的密码子偏好性进行PBP 4基因的碱基序列的密码子优化，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的基因序列。
B、载体的构建
通过截短目的片段(25-431aa)，用His标签表达，克隆至表达载体pET-28a，得到重组质粒pET-28a-PBP 4’。
C、PBP 4’重组蛋白的表达与纯化
构建完成的重组质粒转入感受态细胞转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃条件下进行诱导表达。
4℃，3200g离心15min收集菌体；然后使用20mM Tris-HCl(含150mM NaCl)重悬菌体，功率3000W，开启10s/停止10s，超声15min裂解菌体，得到细菌裂解产物。采用Ni-NTA镍柱纯化系统纯化表达的PBP 4’重组蛋白，得到PBP 4’蛋白，用于连接金纳米粒子，作为金标受体蛋白。
(2)制备金标受体蛋白
A、合成并表征金纳米粒子
采用种子生成法合成平均粒径为35nm的GNPs。称取1.47mg柠檬酸三钠，溶解于20mL超纯水，加入0.5mL 0.4％(w/v)的氯金酸溶液和0.6mL 0.1M硼氢化钠溶液，室温放置30min，获得种子溶液。取2.5mL 0.4％(w/v)氯金酸溶液，用超纯水稀释至100mL，搅拌煮沸15min。随后，向该溶液中加入0.75mL种子溶液和0.4mL新鲜配制的1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液。继续搅拌煮沸，直到溶液变为酒红色。保持沸腾5min后，停止加热，将溶液冷却至室温，得到GNPs溶液。通过TEM和UV-Vis鉴定颗粒的粒径和分散性。
B、金纳米粒子标记受体蛋白
10mL GNPs溶液加入一定体积0.01mM K2CO3，以调节溶液pH。重组受体蛋白先用适宜的缓冲液稀释至0.4mg/mL，随后取一定量的受体蛋白加入到上述GNPs溶液中，室温振荡混匀45min。加入1mL金标封闭液(BSA终浓度为1％，w/v)，室温振荡封闭2h。封闭结束后，4℃8000g离心30min，弃去上清，重复洗涤2次。沉淀重悬于1mL金标重悬液中，得到金标PBP 4’受体蛋白。将得到的金标受体蛋白分装至PVC塑料制成的透明微孔冻干(80μL/孔)，得到含有金标受体蛋白的红色微孔，即为反应孔II。
(3)试纸条组装
试纸条主要由四部分组成：样品垫、NC膜、吸水垫和PVC板。样品垫用额外添加有表面活性剂(2％Tween-20)的金标重悬液处理，4℃浸泡过夜，在37℃干燥过夜。捕获抗原(PenG-BSA)和质控试剂(鼠源抗His标签抗体)以0.9μL/cm(二者间隔5mm)喷在NC膜中央，37℃干燥过夜。由PVC底板的一面自上而下黏贴吸水纸、NC膜、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。
(4)最佳美罗培南添加浓度的确定
用细菌裂解液稀释美罗培南，得到0、40、80、160、320、640ng/mL的美罗培南，利用上述红色微孔及组装试纸条检测美罗培南(每个浓度进行3次重复)，以美罗培南标准品浓度(ng/mL)为横坐标，T线数值为纵坐标，用Origin8.0(OriginLab Corp，Northampton，MA，USA)拟合，得到美罗培南检测标准曲线，根据标准曲线，将T线刚好不显色(T≤15)时的美罗培南临界浓度定为白色微孔内美罗培南的最佳添加浓度。将10mM PBS稀释后的最佳添加浓度美罗培南分装至PVC塑料制成的透明微孔冻干(80μL/孔)，得到含有碳青霉烯酶底物美罗培南的白色微孔。
2、使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶酶活性检测方法建立
(1)使用受体对酶催化后碳青霉烯类药物检测的细菌内碳青霉烯酶酶活性检测方法测定步骤：
A、用接种环挑取一环在LB固体培养基上过夜培养的单菌落，加入到200μL细菌裂解液中，涡旋5s。
B、将步骤A中液体转移至白色微孔，5-10次缓慢吹打至孔底白色物质完全溶解后置于40℃下反应20min(混匀过程应避免产生气泡)。
C、将白色微孔内液体全部转移至红色微孔，5-10次缓慢吹打至孔底红色物质完全溶解后40℃温育4min(混匀过程应避免产生气泡)。
D、取出所需数量的试纸条做好标记，在上述温育结束后，将试纸条海绵端朝下插入到红色微孔中继续温育4min，温育结束后，1min内判读结果，其余时间判断无效。
E、结果判断：
阴性：质控线显色，检测线不显色；
阳性：质控线显色，检测线显色；
无效：质控线不显色，无论检测线是否显色，结果判为无效。
(2)细菌内碳青霉烯酶免疫层析检测方法的建立
A、五种主要碳青霉烯酶重组蛋白—KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48的检测
将五种蛋白溶液系列稀释至1.2-31780ng/mL，用上述建立的方法进行检测，进行3次重复。确定最低检出限。
B、临床菌株检测
用所建方法检测临床菌株，测试方法对临床菌株的检测能力。分别用：表达NDM的6株肺炎克雷伯菌、1株奇异变形杆菌、8株大肠杆菌；表达KPC的14株肺炎克雷伯菌；表达OXA-1的1株大肠杆菌；联合表达OXA-1和NDM的1株大肠杆菌；表达OXA-10的1株大肠杆菌；表达ESBL的13株肺炎克雷伯菌、4株大肠杆菌；标准质控菌株大肠杆菌ATCC 25922进行检测。
3、结果
1)PBP 4’蛋白诱导表达鉴定
His标签融合蛋白PBP 4’分子表达量为45.64kDa，与预期融合蛋白分子量一致(图1)。
2)美罗培南检测标准曲线
用细菌裂解液稀释美罗培南，得到0、40、80、160、320、640ng/mL的美罗培南，利用上述红色微孔及组装试纸条检测美罗培南(每个浓度进行3次重复)，以美罗培南标准品浓度(ng/mL)为横坐标，T线数值为纵坐标，用Origin8.0(OriginLab Corp，Northampton，MA，USA)拟合，得到美罗培南检测标准曲线，根据标准曲线，将T线刚好不显色(T≤15)时的美罗培南临界浓度定为白色微孔内美罗培南的最佳添加浓度。通过测试数据拟合曲线表明(图2)，试纸条对美罗培南的检测范围为40～640ng/mL，T线刚好不显色(T≤15)时的美罗培南临界浓度为600ng/mL。
3)对5种重组碳青霉烯酶的检测结果
将五种蛋白KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48做系列稀释(用细菌裂解液进行稀释)至1.2-31780ng/mL，用上述建立的方法进行检测，进行3次重复。确定最低检出限(图3)。结果表明，该方法检测五种主要的碳青霉烯酶KPC、NDM、IMP、OXA-48、VIM的LOD分别为12ng/mL、18ng/mL、317.8ng/mL、15ng/mL、31.78ng/mL。
4)对临床菌株的检测结果
以建立好的方法检测临床菌株，测试方法对临床菌株的检测能力。分别用：表达NDM的6株肺炎克雷伯菌、1株奇异变形杆菌、8株大肠杆菌；表达KPC的14株肺炎克雷伯菌；表达OXA-1的1株大肠杆菌；联合表达OXA-1和NDM的1株大肠杆菌；表达OXA-10的1株大肠杆菌；表达ESBL的13株肺炎克雷伯菌、4株大肠杆菌；标准质控菌株大肠杆菌ATCC 25922进行检测(图4，A～E)。结果表明，表达NDM的6株肺炎克雷伯菌、1株奇异变形杆菌、8株大肠杆菌；表达KPC的14株肺炎克雷伯菌；联合表达OXA-1和NDM的1株大肠杆菌；表达OXA-10的1株大肠杆菌均为阳性结果。表达OXA-1的1株大肠杆菌、表达ESBL的13株肺炎克雷伯菌、4株大肠杆菌；标准质控菌株大肠杆菌ATCC 25922均为阴性结果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条及检测方法
<130> KHP211124603.0
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Asn Ser Asp Val Thr Pro Val Gln Ala Ala Asn Gln Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Ala Gly Leu Ser Ala Ala Tyr Glu Pro Thr Ser Ala Val Asn Val Ser
20 25 30
Gln Thr Gly Gln Leu Leu Tyr Gln Tyr Asn Ile Asp Thr Lys Trp Asn
35 40 45
Pro Ala Ser Met Thr Lys Leu Met Thr Met Tyr Leu Thr Leu Glu Ala
50 55 60
Val Asn Lys Gly Gln Leu Ser Leu Asp Asp Thr Val Thr Met Thr Asn
65 70 75 80
Lys Glu Tyr Ile Met Ser Thr Leu Pro Glu Leu Ser Asn Thr Lys Leu
85 90 95
Tyr Pro Gly Gln Val Trp Thr Ile Ala Asp Leu Leu Gln Ile Thr Val
100 105 110
Ser Asn Ser Ser Asn Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ala Lys Lys Val Ser
115 120 125
Lys Asn Thr Ser Asp Phe Val Asp Leu Met Asn Asn Lys Ala Lys Ala
130 135 140
Ile Gly Met Lys Asn Thr His Phe Val Asn Pro Thr Gly Ala Glu Asn
145 150 155 160
Ser Arg Leu Arg Thr Phe Ala Pro Thr Lys Tyr Lys Asp Gln Glu Arg
165 170 175
Thr Val Thr Thr Ala Arg Asp Tyr Ala Ile Leu Asp Leu His Val Ile
180 185 190
Lys Glu Thr Pro Lys Ile Leu Asp Phe Thr Lys Gln Leu Ala Pro Thr
195 200 205
Thr His Ala Val Thr Tyr Tyr Thr Phe Asn Phe Ser Leu Glu Gly Ala
210 215 220
Lys Met Ser Leu Pro Gly Thr Asp Gly Leu Lys Thr Gly Ser Ser Asp
225 230 235 240
Thr Ala Asn Tyr Asn His Thr Ile Thr Thr Lys Arg Gly Lys Phe Arg
245 250 255
Ile Asn Gln Val Ile Met Gly Ala Gly Asp Tyr Lys Asn Leu Gly Gly
260 265 270
Glu Lys Gln Arg Asn Met Met Gly Asn Ala Leu Met Glu Arg Ser Phe
275 280 285
Asp Gln Tyr Lys Tyr Val Lys Ile Leu Ser Lys Gly Glu Gln Arg Ile
290 295 300
Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Val Glu Asn Asp Leu Tyr Asp Val Leu Pro
305 310 315 320
Ser Asp Phe Ser Lys Lys Asp Tyr Lys Leu Val Val Glu Asp Gly Lys
325 330 335
Val His Ala Asp Tyr Pro Arg Glu Phe Ile Asn Lys Asp Tyr Gly Pro
340 345 350
Pro Thr Val Glu Val His Gln Pro Ile Ile Gln Lys Ala Asn Thr Val
355 360 365
Ala Lys Cys Met Trp Glu Glu His Pro Leu Phe Thr Ile Ile Gly Gly
370 375 380
Thr Cys Leu Val Ala Gly Leu Ala Leu Ile Val His Met Ile Ile Asn
385 390 395 400
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405
<210> 2
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Asn Leu Ile Ser Ile Ile Ile Ile Leu Cys Leu Thr Leu Ser
1 5 10 15
Ile Met Thr Pro Tyr Ala Gln Ala Thr Asn Ser Asp Val Thr Pro Val
20 25 30
Gln Ala Ala Asn Gln Tyr Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Tyr Glu
35 40 45
Pro Thr Ser Ala Val Asn Val Ser Gln Thr Gly Gln Leu Leu Tyr Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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165 170 175
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180 185 190
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260 265 270
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370 375 380
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Pro Leu Phe Thr Ile Ile Gly Gly Thr Cys Leu Val Ala Gly Leu Ala
405 410 415
Leu Ile Val His Met Ile Ile Asn Arg Leu Phe Arg Lys Arg Lys
420 425 430

Claims (7)

1.用于检测细菌内碳青霉烯酶的试剂盒，其特征在于，包括细菌裂解液、反应孔I、反应孔II和用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条；
其中，所述反应孔I包被有美罗培南，所述反应孔II包被有胶体金标记的PBP 4’受体蛋白复合物；
所述细菌裂解液为：0.1% TritonX-100+20mM PBS +0.1mM ZnSO4，pH7.4；
反应孔I包被的美罗培南的终浓度为600ng/mL，反应孔II包被的胶体金标记的PBP 4’受体蛋白复合物的终浓度为10μg/孔；
所述免疫层析试纸条包括样品垫、NC膜、吸水垫和底板，所述NC膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上；
其中，所述检测线包被有完全抗原青霉素-BSA；所述质控线包被有His融合标签抗体；
所述完全抗原青霉素-BSA是由青霉素与载体蛋白BSA偶联而成；
所述试纸条的检测线上包被的完全抗原青霉素-BSA的终浓度为2mg/mL，质控线上包被的His融合标签抗体的终浓度为2mg/mL。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PBP 4’受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底板为PVC板；
所述样品垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条是将样品垫、NC膜和吸水垫由底板的一面交互层叠黏贴到所述底板上；其中，NC膜位于最底层，样品垫和吸水垫以与NC膜2-3mm的重叠接触贴于NC膜两端。
5.权利要求1-4任一项所述试剂盒在细菌内碳青霉烯酶检测中的应用；所述碳青霉烯酶包括A、B、D类的碳青霉烯酶。
6.使用权利要求1-4任一项所述试剂盒检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）挑取待测单菌落，加入到200 μL细菌裂解液中，涡旋5 s，得到裂解产物；
（2）将裂解产物转移至反应孔I内，反复吹打，于40℃保温20min，得到降解产物；
（3）将降解产物转移至反应孔II内，反复吹打，于40℃温育4min；
（4）温育结束后，将试纸条的样品垫一端插入到反应孔II内，继续于40℃孵育4min；
（5）孵育结束后，根据检测线和质控线的显色结果判定待测菌是否含碳青霉烯酶；
其中，所述碳青霉烯酶包括A、B、D类的碳青霉烯酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（5）中结果判定标准如下：
阴性：质控线显色，检测线不显色；
阳性：质控线显色，检测线显色；
无效：质控线不显色，无论检测线是否显色，结果判为无效。
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