CN114487423B - 克拉维酸免疫层析检测试纸条及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了克拉维酸免疫层析检测试纸条及检测方法。所述克拉维酸免疫层析检测试纸条，包括依次粘贴在底板上的样品垫、NC膜、吸水垫和底板，其中NC膜上设有检测线和质控线，检测线包被有完全抗原BSA‑SA2‑13，质控线包被有His融合标签抗体。本发明还提供克拉维酸检测试剂盒，包括反应孔和所述检测试纸条；其中反应孔包被有胶体金标记的β‑内酰胺酶蛋白复合物。本发明利用与克拉维酸高亲和力结合的S.AUREUS PC1蛋白建立了一种检测液样(如奶样)中克拉维酸的侧流免疫层析法。利用β‑内酰胺酶蛋白与克拉维酸的高亲和力结合，可快速、高灵敏度检测牛奶中的克拉维酸残留。

Description

克拉维酸免疫层析检测试纸条及检测方法
技术领域
本发明属于免疫学分析领域，具体地说，涉及克拉维酸免疫层析检测试纸条及检测方法。
背景技术
畜牧养殖环节中，滥用抗生素已成为乳品行业的一大隐患。农业部对乳品中抗生素的残留做了严格控制。为了逃避对生鲜乳中抗生素的监管，市场上出现了以β-内酰胺酶为主要成分的“抗生素分解剂”。不法商贩为了干扰β-内酰胺酶的检出，在乳品中添加诸如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等β-内酰胺酶抑制剂来抑制其活性，食用添加过此类β-内酰胺酶抑制剂的乳品将对人体健康带来严重危害。
克拉维酸(clavulanicacid，CLAV)是一种强力β-内酰胺酶抑制剂，与β-内酰胺酶牢固结合后使酶失活，不仅作用于金黄色葡萄球菌的β-内酰胺酶，而且对革兰氏阴性杆菌的β-内酰胺酶也有作用。针对克拉维酸残留，欧盟及我国农业部规定奶中的MRL为200μg/kg。目前国内外针对克拉维酸的检测方法主要以高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等仪器分析方法为主，此类方法灵敏度高、结果准确，但对仪器、检测人员要求严格。因此建立一种操作简便、高效、高灵敏的克拉维酸现场快速检测技术对保障国家乳品质量与安全具有重要意义。目前食品安全快速检测技术多以免疫分析技术为主。但由于克拉维酸其分子量小，缺乏特征性空间结构，且其在体内外稳定性差，易于形成多种水解产物，使得快速检测技术中克拉维酸特异性单克隆抗体的制备受限。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、检测快速的基于β-内酰胺酶蛋白检测克拉维酸的免疫层析检测试纸条及检测方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种克拉维酸免疫层析检测试纸条，包括样品垫、NC膜、吸水垫和底板，所述NC膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上。
其中，所述检测线包被有完全抗原BSA-SA2-13；所述质控线包被有His融合标签抗体；
所述完全抗原BSA-SA2-13是由半抗原SA2-13与载体蛋白BSA偶联而成。
本发明半抗原SA2-13的结构如式(I)所示：
Figure BDA0003392365340000021
式(I)的半抗原SA2-13已在文章(Rational design of aβ-lactamase inhibitorachieved via stabilization of thetrans-enamine intermediate:1.28A°crystalstructure of wt SHV-1 complex with a penam sulfone)中公开。
所述试纸条的检测线上包被的完全抗原BSA-SA2-13的终浓度为2mg/mL，质控线上包被的His融合标签抗体的终浓度为2mg/mL。
优选地，所述底板为PVC板。
优选地，所述样品垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
进一步地，所述试纸条是将样品垫、NC膜和吸水垫由底板的一面交互层叠黏贴到所述底板上；其中，NC膜位于最底层，样品垫和吸水垫以与NC膜2-3mm的重叠接触贴于NC膜两端。
第二方面，本发明提供克拉维酸检测试剂盒，包括反应孔和所述克拉维酸免疫层析检测试纸条。
其中，所述反应孔包被有胶体金标记的β-内酰胺酶蛋白复合物。
优选地，所述β-内酰胺酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
反应孔包被的胶体金标记的β-内酰胺酶蛋白复合物的终浓度为10μg/孔。
在本发明的一个具体实施方式中，反应孔的制备过程包括：
1、制备S.AUREUS PC1蛋白
1)S.AUREUS PC1基因的合成
从Genbank中获取S.AUREUS PC1基因编码的β-内酰胺酶的氨基酸序列(Accession：TJX78208.1)，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行S.AUREUS PC1基因碱基序列的密码子优化，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的基因序列。
2)载体的构建
通过将目的片段用His标签表达，克隆至表达载体pET-28a，得到重组质粒pET-28a-S.AUREUS PC1。
3)S.AUREUS PC1重组蛋白的表达与纯化
构建完成的重组质粒转入感受态细胞转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃条件下进行诱导表达。
4℃，3200g离心15min收集菌体；然后使用20mM Tris-HCl(含150mM NaCl)重悬菌体，3000W，开启10s/停止10s，超声15min裂解菌体。采用Ni-NTA镍柱纯化系统纯化表达的S.AUREUS PC1重组蛋白，得到S.AUREUS PC1蛋白，用于连接金纳米粒子，作为金标受体蛋白。
2、制备金标S.AUREUS PC1蛋白
1)合成并表征金纳米粒子
采用种子生成法合成平均粒径为35nm的GNPs。称取1.47mg柠檬酸三钠，溶解于20mL超纯水，加入0.5mL 0.4％(w/v)的氯金酸溶液和0.6mL 0.1M硼氢化钠溶液，室温放置30min，获得种子溶液。取2.5mL 0.4％(w/v)氯金酸溶液，用超纯水稀释至100mL，搅拌煮沸15min。随后，向溶液中加入0.75mL种子溶液和0.4mL新鲜配制的1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液。继续搅拌煮沸，直到溶液变为酒红色。保持沸腾5min后，停止加热，将溶液冷却至室温，得到GNPs溶液。通过TEM和UV-Vis鉴定颗粒的粒径和分散性。
2)金纳米粒子标记受体蛋白(胶体金标记的β-内酰胺酶蛋白复合物)
10mL GNPs溶液加入一定体积0.01mM K2CO3，以调节溶液pH。重组受体蛋白先用适宜的缓冲液稀释至0.4mg/mL，随后取一定量的受体蛋白加入到上述GNPs溶液中，室温振荡混匀45min。加入1mL金标封闭液(BSA终浓度为1％，w/v)，室温振荡封闭2h。封闭结束后，4℃，8000g离心30min，弃去上清，重复洗涤2次。沉淀重悬于1mL金标重悬液中，得到金标S.AUREUS PC1受体蛋白。将得到的金标受体蛋白分装至PVC塑料制成的透明微孔冻干(80μL/孔)，得到含有金标受体蛋白的红色微孔，即为反应孔。
第三方面，本发明提供所述克拉维酸免疫层析检测试纸条或所述克拉维酸检测试剂盒在克拉维酸检测中的应用。
第四方面，本发明提供克拉维酸免疫层析检测方法，包括以下步骤：
(1)取200±20μL待测液体样本加至所述试剂盒的反应孔内，反复吹打，于40±2℃孵育4～6min；
(2)将试纸条的样品垫一端插入到上述反应孔内，继续于40±2℃孵育4min；
(3)孵育结束后，根据检测线和质控线的显色结果判定待测液体样本中是否含有克拉维酸。
进一步地，步骤(3)中结果判定标准如下：
阴性：质控线显色，检测线显色；
阳性：质控线显色，检测线不显色；
无效：质控线不显色，无论检测线是否显色，结果判为无效。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用与克拉维酸高亲和力结合的S.AUREUS PC1蛋白建立了一种检测液样(如奶样)中克拉维酸的侧流免疫层析法。利用β-内酰胺酶蛋白与克拉维酸的结合的高亲和力，可快速、高灵敏度检测牛奶中的克拉维酸残留。该方法对克拉维酸的检测范围为4.7-14μg/kg，IC50为8.08μg/kg，LOD为20μg/kg。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中S.AUREUS PC1蛋白的SDS-PAGE检测结果。
图2为本发明较佳实施例中抗原MALDI-TOF检测质谱图。其中，A为未偶联前BSA的MALDI-TOF检测图，B为偶联后的完全抗原的MALDI-TOF检测图。
图3为本发明较佳实施例中牛奶中克拉维酸的检测标准曲线。
图4为本发明较佳实施例中试纸条对牛奶中不同浓度克拉维酸的检测结果。
图5为本发明较佳实施例中试纸条对牛奶中他唑巴坦、舒巴坦的检测结果。
具体实施方式
本发明提供一种基于克拉维酸敏感亚型β-内酰胺酶检测克拉维酸的快速检测试纸条及其检测方法。包括设有金标β-内酰胺酶的红色微孔及检测试纸。本发明选用可与克拉维酸高亲和力结合的β-内酰胺酶作为克拉维酸识别分子，将与克拉维酸结构类似的β-内酰胺酶抑制剂SA2-13与载体蛋白BSA偶联作为固相化捕获抗原，以此检测牛奶中的克拉维酸残留，并对其进行方法学评估。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于快速检测牛奶中克拉维酸的试剂盒，包括红色微孔(反应孔)和检测试纸(检测试纸条)。
在一个具体实施方案中，所述红色微孔内设有冻干金标重组β-内酰胺酶蛋白(胶体金标记的β-内酰胺酶蛋白复合物)。
在一个具体实施方案中，重组β-内酰胺酶蛋白为通过将S.AUREUS PC1序列N端添加His-tag标签，克隆至表达载体pET-28a，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，经IPTG诱导表达，使用Ni-NTA镍柱纯化得到的。
所述S.AUREUS PC1蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个具体实施方案中，检测试纸是将样品垫、NC膜和吸水垫由底板的一面交互层叠黏贴到所述底板上；其中，NC膜位于最底层，样品垫和吸水垫以与NC膜2-3mm的重叠接触贴于NC膜两端。
所述NC膜中间部位设有质控线和检测线，质控线包被有His融合标签抗体，检测线包被有捕获抗原BSA-SA2-13。所述质控线和检测线为平行设置。
在一个具体实施方案中，捕获抗原为通过采用碳二亚胺法将与克拉维酸结构类似的SA2-13半抗原与载体蛋白BSA进行偶联得到的完全抗原BSA-SA2-13。
本发明还提供一种基于β-内酰胺酶蛋白检测克拉维酸的快速检测方法，该方法操作简便，检测快速，灵敏度高。
具体地，本发明提供的基于β-内酰胺酶蛋白检测克拉维酸的检测方法，包括以下步骤：
A、移取200±μL待检奶样转移至红色微孔，5-10次缓慢吹打至孔底红色物质完全溶解后置于40±2℃下反应4～6min(混匀过程应避免产生气泡)。
B、取出所需数量的试纸条做好标记，在上述温育结束后，将试纸条海绵端(样品垫)朝下插入到红色微孔中继续温育4min，温育结束后，1min内判读结果，其余时间判断无效。
C、结果判断：
阴性：质控线显色，检测线显色；
阳性：质控线显色，检测线不显色；
无效：质控线不显色，无论检测线是否显色，结果判为无效。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1克拉维酸免疫层析检测试剂盒及检测方法
本实施例提供一种基于β-内酰胺酶蛋白的牛奶中克拉维酸快速检测试剂盒，包括设有金标β-内酰胺酶蛋白S.AUREUS PC1的红色微孔和检测试纸。
1、使用β-内酰胺酶蛋白对牛奶中克拉维酸检测的快速检测试纸条的制备
(1)制备S.AUREUS PC1蛋白
A、S.AUREUS PC1基因的合成
从Genbank中获取S.AUREUS PC1基因的氨基酸序列(Accession：TJX78208.1 281aa)，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行S.AUREUS PC1基因的碱基序列的密码子优化，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的基因序列。
B、载体的构建
通过将目的片段用His标签表达，克隆至表达载体pET-28a，得到重组质粒pET-28a-S.AUREUS PC1。
C、S.AUREUS PC1重组蛋白的表达与纯化
构建完成的重组质粒转入感受态细胞转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃条件下进行诱导表达。
4℃，3200g离心15min收集菌体；然后使用20mM Tris-HCl(含150mMNaCl)重悬菌体，功率3000W，开启10s/停止10s，超声15min裂解菌体。采用Ni-NTA镍柱纯化系统纯化表达的S.AUREUS PC1重组蛋白，得到S.AUREUS PC1蛋白，用于连接金纳米粒子，作为金标受体蛋白。
(2)制备金标S.AUREUS PC1蛋白
A、合成并表征金纳米粒子
采用种子生成法合成平均粒径为35nm的GNPs。称取1.47mg柠檬酸三钠，溶解于20mL超纯水，加入0.5mL 0.4％(w/v)的氯金酸溶液和0.6mL 0.1M硼氢化钠溶液，室温放置30min，获得种子溶液。取2.5mL 0.4％(w/v)氯金酸溶液，用超纯水稀释至100mL，搅拌煮沸15min。随后，向该溶液中加入0.75mL种子溶液和0.4mL新鲜配制的1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液。继续搅拌煮沸，直到溶液变为酒红色。保持沸腾5min后，停止加热，将溶液冷却至室温，得到GNPs溶液。通过TEM和UV-Vis鉴定颗粒的粒径和分散性。
B、金纳米粒子标记受体蛋白
10mL GNPs溶液加入一定体积0.01mM K2CO3，以调节溶液pH。重组受体蛋白先用适宜的缓冲液稀释至0.4mg/mL，随后取一定量的受体蛋白加入到上述GNPs溶液中，室温振荡混匀45min。加入1mL金标封闭液(BSA终浓度为1％，w/v)，室温振荡封闭2h。封闭结束后，4℃，8000g离心30min，弃去上清，重复洗涤2次。沉淀重悬于1mL金标重悬液中，得到金标S.AUREUS PC1受体蛋白。将得到的金标受体蛋白分装至PVC塑料制成的透明微孔冻干(80μL/孔)，得到含有金标受体蛋白的红色微孔。
(3)捕获抗原BSA-SA2-13的合成
称取1mM半抗原SA2-13，取500μL的DMF将其完全溶解；称取15mg NHS和25mg乙基二甲氨基碳化二亚胺进行活化；将反应瓶放置于磁力搅拌器上，设置温度为26℃，搅拌时间为12h；活化完成后作为溶液I。将0.001mM BSA加入10mL PBS于对应的反应瓶中，用10mL0.01M PBS使之完全溶解，再置于-20℃冰箱中冷却2min后取出，冷却后作为溶液Ⅱ。取溶液I缓慢滴加至对应的溶液Ⅱ中，观察溶液的浑浊程度，如浑浊持续，则减慢滴加速度(整个过程在冰盒中进行)；滴加完毕后将反应瓶置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，设置搅拌时间为24h。反应完毕后将反应液转移至透析袋中，透析48h，透析液为PBS(0.01M，pH7.4)，透析液每12h换一次。透析完毕后即得到完全抗原BSA-SA2-13。利用MALDI-TOF-MS技术对人工抗原进行测定。
(4)试纸条组装
试纸条主要由四部分组成：样品垫、NC膜、吸水垫和PVC板。样品垫用额外添加有表面活性剂的金标重悬液处理，4℃浸泡过夜，再37℃干燥过夜。捕获抗原(BSA-SA2-13)和质控试剂(鼠源抗His标签抗体)以0.9μL/cm(二者间隔5mm)喷在NC膜中央，37℃干燥过夜。由PVC底板的一面自上而下黏贴吸水纸、NC膜、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。
2、β-内酰胺酶蛋白检测克拉维酸的快速检测方法建立
(1)β-内酰胺酶蛋白检测克拉维酸的快速检测方法测定步骤
a、移取200±20μL待检奶样转移至红色微孔，5-10次缓慢吹打至孔底红色物质完全溶解后置于40±2℃下反应4～6min(混匀过程应避免产生气泡)；
b、取出所需数量的试纸条做好标记，在上述温育结束后，将试纸条海绵端朝下插入到红色微孔中继续温育4min，温育结束后，1min内判读结果，其余时间判断无效。
c、结果判断：
阴性：质控线显色，检测线显色；
阳性：质控线显色，检测线不显色；
无效：质控线不显色，无论检测线是否显色，结果判为无效。
(2)检测方法的建立
A、建立标准工作曲线
配制不同浓度的一系列克拉维酸标准液(用0.01M PBS进行配制)，分别为32、16、8、4、2μg/kg，根据测定步骤进行测定。使用Origin Lab软件分析数据，以克拉维酸浓度为横坐标，以NC膜T线显色数值为纵坐标，根据四参数方程绘制标准曲线计算IC50值，以IC20-IC80为线性范围。
B、LOD的确定
取20份空白牛奶样品，用建立的检测方法测定其中的克拉维酸浓度，计算该检测方法的LOD，公式为：LOD＝∑(CLAV浓度)/20+3δ，其中δ为20份样本的CLAV浓度的标准差。
C、添加回收测定：
在空白牛奶样本中添加高中低三个浓度的克拉维酸标准品溶液，使最终样品中的克拉维酸浓度分别为0、10μg/kg、20μg/kg，且每个浓度设定3个平行。用建立的方法测定最终样品。
3、结果
(1)S.AUREUS PC1蛋白诱导表达鉴定
His标签融合蛋白S.AUREUS PC1分子表达量为30kDa左右，与预期融合蛋白分子量一致(图1)。
(2)抗原MALDI-TOF检测质谱图
将合成的SA2-13完全抗原进行MALDI-TOF-MS分析，测定其分子质量，以BSA的分子量作对照。结果见图2，偶联后的完全抗原分子量比对照组大，说明SA2-13半抗原与BSA发生了偶联反应，生成了SA2-13半抗原BSA偶联物，分子量的增加说明了捕获抗原合成成功。根据公式计算所得抗原的偶联比为10.46:1，偶联比比较适中，可用于后续试验使用。人工抗原(完全抗原)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定结果见表1。
表1人工抗原基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定结果
Figure BDA0003392365340000081
(3)样品基质下绘制的标准曲线
配制添加有一系列克拉维酸浓度的样品标准液，分别为32、16、8、4、2μg/kg，以药物浓度为横坐标，NC膜T线数值为纵坐标，建立牛奶样品基质中克拉维酸检测的标准曲线。通过测试数据拟合曲线表明(图3)，试纸条对克拉维酸的检测范围为4.7-14μg/kg，IC50为8.08μg/kg。
(4)LOD的确定
通过对20份牛奶样本进行测定，按照LOD计算公式计算，牛奶中克拉维酸的LOD为20μg/kg。
(5)添加回收测定
试纸条对牛奶中不同浓度克拉维酸的检测结果见图4。从左到右克拉维酸的浓度分别为0、0、0、10、10、10、20、20、20ng/mL。
实施例2特异性考察
在空白牛奶样本中添加与克拉维酸结构类似的他唑巴坦、舒巴坦标准品溶液，使最终样品中的他唑巴坦、舒巴坦浓度为1μg/mL。用建立的方法测定最终样品。测定结果如图5所示。从左到右分别为：空白牛奶，1μg/mL他唑巴坦，1μg/mL舒巴坦，1μg/mL克拉维酸。
以上实验结果表明，利用克拉维酸试纸条检测与克拉维酸结构类似的他唑巴坦、舒巴坦，实验结果呈阴性，因此，克拉维酸试纸条与其结构类似物他唑巴坦、舒巴坦无交叉反应，能够特异性检测克拉维酸。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学 北京维德维康生物技术有限公司
<120> 克拉维酸免疫层析检测试纸条及检测方法
<130> KHP211124605.2
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 281
<212> PRT
<213> 金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 1
Met Lys Lys Leu Ile Phe Leu Ile Val Ile Ala Leu Val Leu Ser Ala
1 5 10 15
Cys Asn Ser Asn Ser Ser His Ala Lys Glu Leu Asn Asp Leu Glu Lys
20 25 30
Lys Tyr Asn Ala His Ile Gly Val Tyr Ala Leu Asp Thr Lys Ser Gly
35 40 45
Lys Glu Val Lys Phe Asn Ser Asp Lys Arg Phe Ala Tyr Ala Ser Thr
50 55 60
Ser Lys Ala Ile Asn Ser Ala Ile Leu Leu Glu Gln Val Pro Tyr Asn
65 70 75 80
Lys Leu Asn Lys Lys Val His Ile Asn Lys Asp Asp Ile Val Ala Tyr
85 90 95
Ser Pro Ile Leu Glu Lys Tyr Val Gly Lys Asp Ile Thr Leu Lys Ala
100 105 110
Leu Ile Glu Ala Ser Met Thr Tyr Ser Asp Asn Thr Ala Asn Asn Lys
115 120 125
Ile Ile Lys Glu Ile Gly Gly Ile Lys Lys Val Lys Gln Arg Leu Lys
130 135 140
Glu Leu Gly Asp Lys Val Thr Asn Pro Val Arg Tyr Glu Ile Glu Leu
145 150 155 160
Asn Tyr Tyr Ser Pro Lys Ser Lys Lys Asp Thr Ser Thr Pro Ala Ala
165 170 175
Phe Gly Lys Thr Leu Asn Lys Leu Ile Ala Asn Gly Lys Leu Ser Lys
180 185 190
Glu Asn Lys Lys Phe Leu Leu Asp Leu Met Leu Asn Asn Lys Ser Gly
195 200 205
Asp Thr Leu Ile Lys Asp Gly Val Pro Lys Asp Tyr Lys Val Ala Asp
210 215 220
Lys Ser Gly Gln Ala Ile Thr Tyr Ala Ser Arg Asn Asp Val Ala Phe
225 230 235 240
Val Tyr Pro Lys Gly Gln Ser Glu Pro Ile Val Leu Val Ile Phe Thr
245 250 255
Asn Lys Asp Asn Lys Ser Asp Lys Pro Asn Asp Lys Leu Ile Ser Glu
260 265 270
Thr Ala Lys Ser Val Met Lys Glu Phe
275 280

Claims (9)

1.克拉维酸检测试剂盒，其特征在于，包括反应孔和克拉维酸免疫层析检测试纸条；
其中，所述反应孔包被有胶体金标记的β-内酰胺酶蛋白复合物；
所述克拉维酸免疫层析检测试纸条包括样品垫、NC膜、吸水垫和底板，所述NC膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上；
其中，所述检测线包被有完全抗原BSA-SA2-13；所述质控线包被有His融合标签抗体；
所述完全抗原BSA-SA2-13是由半抗原SA2-13与载体蛋白BSA偶联而成；半抗原SA2-13的结构如式(I)所示：
Figure FDA0004261797460000011
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述β-内酰胺酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，反应孔包被的胶体金标记的β-内酰胺酶蛋白复合物的终浓度为10μg/孔。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条的检测线上包被的完全抗原BSA-SA2-13的终浓度为2mg/mL，质控线上包被的His融合标签抗体的终浓度为2mg/mL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底板为PVC板；
所述样品垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条是将样品垫、NC膜和吸水垫由底板的一面交互层叠黏贴到所述底板上；其中，NC膜位于最底层，样品垫和吸水垫以与NC膜2-3mm的重叠接触贴于NC膜两端。
7.权利要求1-6任一项所述试剂盒在克拉维酸检测中的应用。
8.克拉维酸免疫层析检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取200±20μL待测液体样本加至权利要求1-6任一项所述试剂盒的反应孔内，反复吹打，于40±2℃孵育4～6min；
(2)将试纸条的样品垫一端插入到上述反应孔内，继续于40±2℃孵育4min；
(3)孵育结束后，根据检测线和质控线的显色结果判定待测液体样本中是否含有克拉维酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中结果判定标准如下：
阴性：质控线显色，检测线显色；
阳性：质控线显色，检测线不显色；
无效：质控线不显色，无论检测线是否显色，结果判为无效。
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