CN101781360A - 一种重组风疹病毒蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了的一种重组风疹病毒蛋白，它包括：风疹病毒蛋白RV的优势抗原表位E1片段，和C片段，并以其作抗原制备的风疹病毒抗体IgG免疫检测试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了风疹病毒感染临床诊断的需要。本发明一种重组风疹病毒蛋白，抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在RV疫苗研制领域具有实际应用价值。

Description

一种重组风疹病毒蛋白及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种重组风疹病毒蛋白及其应用。

背景技术

风疹病毒是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，外形呈球形的风疹病毒(Rubella virus，RuV或RV)是风疹的病原体，人类是其唯一宿主。风疹是一种以发热、呼吸道卡痰和出疹为主要症状的急性呼吸道传染病。孕妇，特别是妊娠早期的孕妇感染风疹病毒可导致胎儿先天性风疹综合征(congenital rubellasyndrome，CRS)。风疹及CRS在全世界均有发生，亚洲感染率高。孕妇患风疹后，特别是妊娠的前3～4个月内，风疹病毒可侵犯胎盘并传染给胎儿，引起先天性风疹高达30％～35％。孕妇除发生死胎、流产与早产外，可出现一种或多种畸形，如心血管畸形、眼部疾病、神经性耳聋、小头畸形、智力发育不全等，婴儿出生后病死率1岁内可达10％～20％(Enders M，Biber M，Exler S.Measles，mumps and rubella virus infection in pregnancy.Possible adverseeffects on pregnant women，pregnancy outcome and the fetus.Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz.2007，50(11)：1393-8；De Santis M，CavaliereAF，Straface G，Caruso A.Rubella infection in pregnancy.Reprod Toxicol.2006 May；21(4)：390-8.)。建立RV感染的快速、准确检测方法是预防RV感染的关键所在。

目前风疹病毒感染的诊断方法有病毒分离(Mendelson E，Aboudy Y，Smetana Z，Tepperberg M，Grossman Z.Laboratory assessment and diagnosis of congenital viral infections：Rubella，cytomegalovirus(CMV)，varicella-zoster virus(VZV)，herpes simplex virus(HSV)，parvovirus B19 and human immunodeficiency virus(HIV).Reprod Toxicol.2006，21(4)：350-82.)、分子生物学检测(Nicolas A.Laboratory methods used forthe diagnosis of rubella.The hemagglutination inhibition technic.Lyon Med.1967 Jul2；218(27)：19-54；Kusakabe H.Diagnostic tests：Rubella virus.Nippon Rinsho.2005 Jul；63 Suppl7：356-8.)和血清学诊断(Valente C，Faria MJ，Trindade L，Barros MS，Vieira AA，Albuquerque I，RodriguesR.Serologic diagnosis of several infectious diseases.Acta Med Port.1993，6(12)：605-12.)等。免疫学方法由于操作简便，临床常用，适于RV感染的实验室诊断和大规模现场调查。

在全球范围内，目前缺乏有效治疗病毒感染药物的情况下，通过接种疫苗预防病毒感染成为一种重要的医学干预手段。同时，RV疫苗的研制也是进行RV研究的重要领域之一。

发明内容

本发明的目的是，为避免由于蛋白质抗原纯度低或特异性差造成假阳性而降低检测特异性等问题，提供了用基因工程方法生产的一种重组风疹病毒蛋白。

本发明一种重组风疹病毒蛋白，包括：风疹病毒蛋白RV的优势抗原表位E1片段(从N-末端147位到326位的180个氨基酸)，和C片段(从N-末端5位到169位的165个氨基酸)；

所述一种重组风疹病毒蛋白的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述一种重组风疹病毒蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

本发明提供了一种重组风疹病毒蛋白的制备方法，它包括以下步骤：

1)、人工合成引物：

P1：AGCATATGTACGTCCAGCACCCTCACAAGAC

P2：GGTGATGGGGGTGAACTTCAGCCCCAAGGGGCC

P3：GGGGCTGAAGTTCACCCCCATCACCATGGAGGACCTC

P4：AGCTCGAGGCGGTAAAAGACCGCGCCTTCGCCC

2)、以风疹病毒为模板，以引物P1和P2扩增E1片段，以引物P3和P4扩增C片段；再以第一轮PCR扩增得到的E1片段和C片段为模板，加入引物P1和P4扩增，得到串联的重组基因片段E1C：

3)、将重组基因片段E1C插入pET-28a中，得重组质粒pET-28a-RV或称pET-28a-RVE1C。

4)、重组质粒传染至大肠杆菌中表达、纯化。

一种重组风疹病毒蛋白在制备风疹病毒疾病诊断试剂或疫苗的应用；

一种风疹病毒抗体IgG免疫检测试剂盒，它是以上述的一种重组风疹病毒蛋白为抗原，标记物为胶体金或辣根过氧化物酶。

本发明提供的一种重组风疹病毒蛋白，并以其作抗原制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了风疹病毒感染临床诊断的需要。本发明提供的RV蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在RV疫苗研制领域具有实际应用价值。

附图说明

图1PCR扩增产物的凝胶电泳图；

图2是表达质粒pET-28a-HSV的构建流程图；

图3是诱导后菌体12％SDS-PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。

具体实施方式

实施例1 重组风疹病毒蛋白的制备

1.1 风疹病毒蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆

通过计算机分析风疹病毒的全部氨基酸序列筛选出风疹病毒蛋白的优势抗原表位，包括风疹病毒E1从N-末端147位到326位的180个氨基酸和C从N-末端5位到169位的165个氨基酸。所述重组蛋白质的DNA序列如SEQ ID No.1所示，其中，E1目的肽段DNA序列是E1第439位到第978位核苷酸，C目的肽段DNA序列是C第13位到第507位核苷酸。

根据目的片段的DNA序列，即RV的E1和C上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物(P1，P2)和(P3，P4)。P1和P2用于扩增E1第439位到第978位核苷酸，P3和P4用于扩增C第13位到第507位核苷酸。引物P1和P4分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物P2和P3顺序互补，并共同对应于E1上述片段的3’末端和C上述片段的5’末端序列。

设计的二对PCR引物如下：

P1：AGCATATGTACGTCCAGCACCCTCACAAGAC

P2：GGTGATGGGGGTGAACTTCAGCCCCAAGGGGCC

P3：GGGGCTGAAGTTCACCCCCATCACCATGGAGGACCTC

P4：AGCTCGAGGCGGTAAAAGACCGCGCCTTCGCCC

以上引物由(华美生物技术有限公司)合成。

以风疹病毒培养物(中国预防医学科学院病毒研究所赠)为模板，以引物P1和P2扩增E1片段，以引物P3和P4扩增C片段；再以第一轮PCR扩增得到的E1片段和C片段为模板，加入引物P1和P4，扩增E1C，得到串联的目的基因重组片段：E1C。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARA MiniBEST Plasmid purification)回收目的DNA，操作按产品说明书进行。

1.2 表达载体pET-28a-RV的构建及鉴定

pET-28a载体(购自华美生物技术有限公司)与PCR扩增产物E1C目的DNA片段经NdeI和XhoI双酶切，产物纯化(采用TAKARA MiniBEST Plasmid purification试剂盒，购自六合通-北京TAKARA公司)后经T₄DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶NdeI和EcoRI双酶切、鉴定，有1个重组子为阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-28a-RV或称pET-28a-RVE1C。

1.3 表达重组风疹病毒蛋白的工程菌的构建

将表达质粒pET-28a-RV用化学转化法^[8]((美)J.萨姆布鲁克(JosephSambrook)，(美)D.W.拉塞尔(DavidW.Russell)著，黄培堂等译.分子克隆实验指南[M].科学出版社，2002.)转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导菌体用12％SDS-PAGE分析，结果如附图3所示，确定表达风疹病毒蛋白的菌株即为所需的工程菌株用甘油冷冻保存。

1.4 重组风疹病毒蛋白的制备和纯化

诱导培养已构建的表达风疹病毒蛋白的大肠埃希氏菌CGMCC No.(编号2307)BL21(DE3)株菌，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1∶10(W/V)加入菌体裂解液(50mmpH8.0Tris-Cl，50mm NaCl，50％甘油)，加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌(冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80次)、组氨酸亲和柱(Glutathione Sepharose 4B柱料50ml装柱，400mlPBS缓冲液平衡过柱，流速5ml/min；超声离心后的上清液用200mlPBS稀释后上样，流速3ml/min；400mlPBS缓冲液洗柱，流速5ml/min；250ml洗脱缓冲液洗脱，流速3ml/min，紫外检测仪280nm检测，收集洗脱峰)和离子交换柱层析(100mlChelatingSepharose FF装柱，300ml200mm的NiCl₂过柱，流速5ml/min；500ml平衡缓冲液洗注，流速10ml/min；将组氨酸亲和柱纯化收集液上柱，流速3ml/min，500ml平衡缓冲液洗注，流速5ml/min；用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测仪280nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS-PAGE电泳检测纯化组分)得到纯化的重组蛋白RV或称RVE1C。

1.5 重组蛋白Western-blot验证

为验证重组RV蛋白质与抗RV抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为：10份兔抗HSV抗体阳性血清(购自北京百安天地医药科技有限公司)和30份人抗RV抗体阳性血清(经ELISA法检测证实)。阴性血清为：10份对照正常兔血清和30份人抗RV抗体。结果如表1。

表1 重组蛋白Western-blot验证结果

血清样品	总例数	阳性例数	阴性例数	阳性检出率	阴性检出率
						兔抗RV抗体阳性血清	10	10	0	100％	0
对照正常兔血清	10	0	10	0	100％
						人抗RV抗体阳性血清	30	30	0	100％	0
人抗RV抗体阴性血清	30	0	30	0	100％

结果显示，用RV培养物免疫兔子所得的10份兔抗RV抗体阳性血清和30份人抗RV抗体阳性血清全部与表达抗原产生阳性反应，10份对照正常兔血清和30份人抗RV抗体阴性血清与表达抗原均产生阴性反应。结果提示重组目的基因获得表达，重组RV蛋白质与全RV蛋白质有明显的交叉反应性，并具有很强的特异性，具有实际应用意义。

实施例2 风疹病毒IgG抗体检测试剂盒的制备和性能检定

2.1 人单纯疱疹病毒IgG抗体检测试剂盒的制备

将实施例1制得的重组RV蛋白用作试剂盒标记抗原，用胶体金法测定RV IgG抗体。

该试剂盒的研制和使用如下：

1)试剂盒原理：本品采用免疫捕获法原理，用抗人IgG抗体包被硝酸纤维素膜，胶体金标记基因工程重组风疹病毒(RV)抗原为示踪物。使用时加入待检血清，如样品中含有抗RV特异性IgG抗体，则可与膜表面的抗人IgG抗体结合形成复合物，该复合物与胶体金标记的RV抗原结合而呈现紫红色条带。

2)试剂盒性能优化

以阳性和阴性质控品(收集多家医院经临床验证的抗风疹病毒IgG抗体阳性、阴性血清，用意大利SORIN公司提供的抗风疹病毒IgG抗体酶联试剂盒进行复检筛选，得到的抗风疹病毒IgG阳性、阴性血清建立为企业内部阳性和阴性质控品)为测试样品，采用方阵滴定确定最佳抗人IgG抗体和RV抗原胶体金(RV-Ag.G)结合物的工作浓度，结果如表2，由结果得出，抗人IgG抗体抗体划线包被浓度为2.0mg/ml、RV-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫。

表2 最佳抗人IgG抗体和RV-Ag.G结合物工作浓度的选择

-：阴性反应(无检测线)；±：可疑阳性(检测线隐约可见)；+：阳性反应(出现检测线)；++：较强阳性反应(检测线清晰)；+++强阳性反应(检测线颜色深)(以下解释同)在已确定抗人IgG抗体划线包被浓度为2.0mg/ml、RV-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫的基础上，以内部质控阳性和阴性质控品(来源和标准同上)为测试样品，滴定选择最佳抗人IgG抗体划线量(喷金量为20μl/cm)为1.0μl/cm。结果见表3。

表3 最佳抗人IgG抗体划线量的确定

-：阴性反应；±：可疑阳性；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++强阳性反应

在已确定抗人IgG抗体划线浓度为2.0mg/ml，划线量为1.0μl/cm和风疹病毒2型抗原胶体金复合物喷点浓度为浓缩原液到稀释一倍之间的基础上，以内部质控阳性和阴性质控品(来源和标准同上)为测试样品，采用方阵滴定选择最佳胶体金结合物喷点量为25.0μl/cm。结果见表4。

表4 最佳抗原胶体金复合物喷点量的确定

-：阴性反应；±：可疑阳性；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++强阳性反应

在已确定抗原胶体金复合物包被量的基础上来选择质控线兔抗风疹病毒抗体的包被浓度。兔抗风疹病毒抗体包被量为1.0μl/cm，包被浓度为5.0mg/ml。结果见表5。

表5 质控线兔抗风疹病毒抗体包被浓度的选择

±：质控线隐约可见；+：出现质控线；++：质控线清晰；+++：质控线清晰粗大

抗人IgG抗体划线包被后，分别用下述缓冲系统进行封闭，比较封闭效果，结果表明含PEG20000的封闭系统封闭后灵敏度和特异性都有所下降，其他封闭和不封闭的结果没有区别，所以选择不封闭硝酸纤维素膜。结果见表6。

表6 不同封闭系统的反应板比较

-：阴性反应；±：可疑阳性；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++强阳性反应

3)试剂盒的制备

1)取1.0g的HAuCl₄.H₂O溶解于100ml纯化水中，配成1％氯金酸溶液；取1ml的1％氯金酸溶液入100ml沸水中，加入2ml、1％的柠檬酸三钠，继续煮沸30min，合成胶体金；取6ml合成的胶体金溶液，在400-700nm处进行扫描检验；取合成的约30nm胶体金406ml，用0.1M K₂CO₃调PH至7，量取5mg/ml 2.65ml RV抗原用PH8.2的20mM Tris-Cl稀释至40ml，边搅拌边加入胶体金溶液，继续搅拌10min，量取1％BSA 40ml，边搅拌边加入前述溶液，继续搅拌10min，3000r/min 4℃离心10min，去沉淀，上清重新平衡后，12000r/min 4℃离心45min，去上清，重复2次；用内部质控血清对胶体金复合物进行检验，检验合格后，按前述浓度喷点包被抗原胶体金复合物，然后在37℃、相对湿30％以下通风干燥16-22小时(过夜)后切割。

2)预切割NC膜，粘贴背板，按前面确定的浓度荷划线量包被鼠抗人IgG抗体和兔抗风疹病毒抗体划线包被于NC膜上，在37℃、相对湿度30％以下的条件下干燥1.0小时。

3)撕掉包被检测线和质控线的NC膜(带背板)检测线端的纸膜，将抗原胶体金结合物垫粘贴在NC膜的质控线端，交叉约1mm，压实，将裁好的载样垫粘贴在抗原胶体金结合物垫的下端，压实，将裁好的吸水垫粘贴在NC膜的质控线端，将贴好的检测板两端裁切去掉1cm，用切条机切成4mm宽。抽取18条，用内部质控血清检测半成品检测卡。

4)将每个检测卡单独封装，每个独立包装为1人份，20人份封装成1盒。抽样检验。

各缓冲液配方如下：

1)抗人IgG抗体包被缓冲液配方：20mM Tris-Cl缓冲液(pH8.2)见表7。

表7

内容	500ml
		Tris	1.2g
2M HCl	按需要
		纯化水	定容到500ml
0.45μm过滤膜	按需要

2)兔抗风疹病毒抗体包被缓冲液配方：20mM Tris-Cl缓冲液(pH8.2)见表8。

表8

内容	500ml
		Tris	1.2g
2M HCl	按需要
		纯化水	定容到500ml
0.45μm过滤膜	按需要

3)抗原胶体金复合物包被缓冲液配方：20mM TBS缓冲液(pH8.2)见表9。

表9

内容	1000ml
		Tris	2.4g
0.15M氯化钠	8.8g
		2M HCl	按需要
1→100BSA	10g
		纯化水	定容到1000ml
0.45μm过滤膜	按需要

4)试剂盒操作方法：

a.打开检测卡的铝箔袋包装，取出检测卡。

b.将检测卡倾斜成加样孔端低于另一端不少于1.0cm。

c.取100μl待检血清加入到圆形样品孔中，室温(15℃-30℃)放置25分钟观察并记录结果。

检验结果判定：

阳性：判读窗口出现两条紫红色线条带。

阴性：判读窗口仅出现一条紫红色线条带。

无效：判读窗口质控线位置无紫红色线条带。

2.2 试剂盒性能检测实验

特异性(准确性)测定：按前述实验确定的胶体金捕获测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份丙型肝炎阳性血清标本、50份梅毒阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

灵敏度(特异性)测定：按前述实验确定的胶体金捕获测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清(临床已确定)，符合率为100％。

与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与意大利SORIN公司试剂盒检测250份血清样本的比较实验结果如表10。

表10 与意大利SORIN抗风疹病毒IgG抗体试剂盒的比较测试结果

检测总符合率：(47+199)/250＝98.4％，初步表明本试剂盒达到进口试剂盒的标准。

实施例3 风疹病毒IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)的性能检定

将实施例1制得的重组RV蛋白用作试剂盒酶标抗原制备的底物，用ELISA法测定RV IgG抗体。

3.1 该试剂盒原理和组分如下：

1)试剂盒原理：本品系用抗人IgG抗体包被的微孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记基因工程重组RV抗原为示踪物，TMB显色系统，应用捕获法原理检测人血清或血浆中的抗风疹病毒IgG抗体。

2)试剂盒主要组成成分：

预包被板、酶结合物、阴性对照、阳性对照、浓缩洗液(20×)、底物液A、底物液B、中止液。

3.2 试剂盒性能检定

特异性(准确性)测定：按捕获ELISA测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份丙型肝炎阳性血清标本、50份梅毒阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

灵敏度(特异性)测定：按捕获ELISA测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清(临床已确定)，符合率为100％。

精密性测定：按捕获ELISA测定方法，检测本试剂盒的精密性。使用本试剂盒对2份抗HSV2强阳性血清、1份阳性血清、1份阴性血清以及试剂盒的阳性对照、阴性对照进行每板双孔，共10板的检测，结果如表11，可见试剂盒的重复性良好，对不同血清检测的CV均低于15％。

表11 试剂盒的精密性

血清	平均OD	最大OD	最小OD	CV(％)
					强阳性1	3.768	4.022	3.035	3.1
强阳性2	3.089	3.576	2.365	4.2
					阳性1	2.158	2.794	1.802	6.9
阴性	0.019	0.103	0.003	5.8
					阳性对照	2.597	3.209	2.011	7.2
阴性对照	0.019	0.109	0.008	5.1

与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与意大利SORIN公司试剂盒检测250份血清样本的比较实验结果如表12。

表12 与意大利SORIN抗风疹病毒IgG抗体试剂盒的比较测试结果

检测总符合率＝(49+199)/250＝98.8％，初步表明本试剂盒达到进口试剂盒的标准。

SEQUENCE LISTING

<110>吉林大学

 

<120>一种重组风疹病毒蛋白及其应用

 

<160>2

 

<210>1

<211>1035

<212>DNA

<213>风疹病毒(Rubella virus，简称RV)

 

<400>1

tacgtccagc accctcacaa gaccgcccgg gtcaagttcc atacagagac caggaccgtc    60

tggcaactct ccgttgccgg cgtgtcgtgc aacgtcacca ctgaacaccc gttctgcaac   120

acgccgcacg gacaactcga ggtccaggtc ccgcccgacc ccggggacct ggttgagtac   180

attatgaatt acaccggcaa tcagcagtcc cggtggggcc tcgggagccc gaattgccac   240

ggccccgatt gggcctcccc ggtttgccaa cgccattccc ctgactgctc gcggcttgtg   300

ggggccacgc cagagcgtcc ccggctgcgc ctggtcgacg ccgacgaccc cctgctgcgc   360

actgcccctg ggcccggcga ggtgtgggtc acgcctgtca taggctctca ggcgcgcaag   420

tgccgactcc acatacgcgc tggaccctac ggccatgcta ccgtcgaaat gcccgagtgg   480

atccacgccc acaccaccag cgacccctgg cacccaccgg gccccttggg gctgaagttc   540

acccccatca ccatggagga cctccagaag gccctcgagg cacaatcccg cgccctgcgc   600

gcggaactcg ccgccggcgc ctcgcagtcg cgccggccgc ggccgccgcg acagcgcgac   660

tccagcacct ccggagatga ctccggccgt gactccggag ggccccgccg ccgccgcggc   720

aaccggggcc gtggccagcg cagggactgg tccagggccc cgcccccccc ggaggagcgg   780

caagaaactc gctcccagac tccggccccg aagccatcgc gggcgccgcc acaacagcct   840

caacccccgc gcatgcaaac cgggcgtggg ggctctgccc cgcgccccga gctggggcca   900

ccgaccaacc cgttccaagc agccgtggcg cgtggcctgc gcccgcctct ccacgaccct   960

gacaccgagg cacccaccga ggcctgcgtg acctcgtggc tttggagcga gggcgaaggc  1020

gcggtctttt accgc                                                   1035

 

<210>2

<211>345

<212>PRT

<213>风疹病毒(Rubella virus，简称RV)

 

<400>2

Tyr Var Gln His Pro His Lys Thr Ala Arg Val Lys Phe His Thr Glu

  1               5                  10                  15

Thr Arg Thr Val Trp Gln Leu Ser Val Ala Gly Val Ser Cys Asn Val

             20                  25                  30

The Thr Glu His Pro Phe Cys Asn Thr Pro His Gly Gln Leu Glu Val

         35                  40                  45

Gln Val Pro Pro Asp Pro Gly Asp Leu Val Glu Tyr Ile Met Asn Tyr

     50                  55                  60

Thr Gly Asn Gln Gln Ser Arg Trp Gly Leu Gly Ser Pro Asn Cys His

 65                  70                  75                  80

Gly Pro Asp Trp Ala Ser Pro ValCys Gln Arg His Ser Pro Asp Cys

                 85                  90                  95

Ser Arg Leu Val Gly Ala Thr Pro Glu Arg Pro Arg Leu Arg Leu Val

            100                 105                 110

Asp Ala Asp Asp Pro Leu Leu Arg Thr Ala Pro Gly Pro Gly Glu Val

        115                 120                 125

Trp Val Thr Pro Val Ile Gly Ser Gln Ala Arg Lys Cys Arg Leu His

    130                  135                  140

Ile Arg Ala Gly Pro Tyr Gly His Ala Thr Val Glu Met Pro Glu Trp

145                 150                 155                 160

Ile His Ala His Thr Thr Ser Asp Peo Trp His Pro Pro Gly Pro Leu

                165                 170                 175

Gly Leu Lys Phe Thr Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Gln Lys Ala Leu

            180                 185                 190

Glu Ala Gln Ser Arg Ala Leu Arg Ala Glu Leu Ala Ala Gly Ala Ser

        195                 200                 205

Gln Ser Arg Arg Pro Arg Pro Pro Arg Gln Arg Asp Ser Ser Thr Ser

    210                 215                 220

Gly Asp Asp Ser Gly Arg Asp Ser Gly Gly Pro Arg Arg Arg Arg Gly

225                 230                 235                 240

Asn Arg Gly Arg Gly Gln Arg Arg Asp Trp Ser Arg Ala Pro Pro Pro

                245                 250                 255

Pro Glu Glu Arg Gln Glu Thr Arg Ser Gln Thr Pro Ala Pro Lys Pro

            260                 265                 270

Ser Arg Ala Pro Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Arg Met Gln Thr Gly

        275                 280                 285

Arg Gly Gly Ser Ala Pro Arg Pro Glu Leu Gly Pro Pro Thr Asn Pro

    290                 295                 300

Phe Gln Ala Ala Val Ala Arg Gly Leu Arg Pro Pro Leu His Asp Pro

305                 310                 315                 320

Asp Thr Glu Ala Pro Thr Glu Ala Cys Val Thr Ser Trp Leu Trp Ser

                325                 330                 335

Glu Gly Glu Gly Ala Val Phe Tyr Arg

            340                 345

Claims (6)

1.一种重组风疹病毒蛋白，包括：风疹病毒蛋白RV的优势抗原表位E1片段和C片段。

2.一种重组风疹病毒蛋白的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种重组风疹病毒蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求3所述的一种重组风疹病毒蛋白的制备方法，它包括以下步骤：

1)、人工合成引物：

P1：AGCATATGTACGTCCAGCACCCTCACAAGAC

P2：GGTGATGGGGGTGAACTTCAGCCCCAAGGGGCC

P3：GGGGCTGAAGTTCACCCCCATCACCATGGAGGACCTC

P4：AGCTCGAGGCGGTAAAAGACCGCGCCTTCGCCC

2)、以风疹病毒为模板，以引物P1和P2扩增E1片段，以引物P3和P4扩增C片段；再以第一轮PCR扩增得到的E1片段和C片段为模板，加入引物P1和P4扩增，得到串联的重组基因片段E1C；

3)、将重组基因片段E1C插入pET-28a中，得重组质粒pET-28a-RV；

4)、重组质粒传染至大肠杆菌中表达、纯化。

5.权利要求1、3所述的一种重组风疹病毒蛋白在制备风疹病毒疾病诊断试剂或疫苗的应用。

6.风疹病毒抗体IgG免疫检测试剂盒，它是由权利要求1、3所述的一种重组风疹病毒蛋白为抗原，标记物为胶体金或辣根过氧化物酶。

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