CN101519450B - 一种融合蛋白及其用于检测荚膜组织胞浆菌的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种融合蛋白、包含该蛋白的ELISA试剂盒及其用于检测荚膜组织胞浆菌的用途，以分离的荚膜组织胞浆菌基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增得到M基因片段和GH17基因片段；在原核表达载体中定向插入荚膜组织胞浆菌M基因片段和GH17基因片段，构建得到M-GH17基因片段重组原核表达载体；将M-GH17重组原核表达载体转化宿主细胞，筛选重组单克隆，诱导后特异性表达，得到融合蛋白M-GH17；用该融合蛋白再进一步制备用于的检测荚膜组织胞浆菌的ELISA试剂盒。用本发明的包含融合蛋白M-GH17的ELISA试剂盒，按照普通ELISA方法检测待测血清，根据终止后的吸光值确定阳性、阴性、可疑的判断临界值，即可对待测血清样本进行荚膜组织胞浆菌检测。
Description
技术领域
本发明涉及融合蛋白及荚膜组织胞浆菌的检测，特别涉及用酶联免疫吸附试验检测荚膜组织胞浆菌的方法。
背景技术
荚膜组织胞浆菌病(Histoplasmosis，HP)由双相型真菌荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum，HC)引起。我国自1958年报道首例HP以来，陆续有该病的临床报道。但由于荚膜组织胞浆菌病的临床症状与肺结核、黑热病相似；病理形态又极易与马尔尼菲青酶菌、杜氏利什曼原虫、弓形虫、新型隐球菌等相混淆，而国内临床医务工作者又对该病的认识普遍不足，故存在高漏诊率和高误诊率现象，播散型HP常因未得到及时正确的治疗而死亡。因此加强对HP快速诊断的研究成为必要，以期能尽量减少国内较高的漏诊误诊现状，降低该病的病死率。
目前，国内外对于HP的诊断有如下几种方法：
1.真菌培养：取临床标本接种固体或液体培养基，观察菌落特征与镜下形态、霉菌相与酵母相的转化；尿素酶反应等。该方法特异性好，为判断HP的金标准，但耗时长，操作繁琐，不便于早期快速筛查。
2.病理学检查：取病变组织涂片、固定、染色，镜下观察荚膜组织胞浆菌形态特征。但由于组织胞浆菌病理形态与杜氏利什曼原虫等相似，故该方法难以大规模推广。
3.变态反应：接种荚膜组织胞浆菌于葡萄糖琼脂斜面培养基，培养一段时间后，转接至液体培养基继续培养，收集培养上清，经纯化处理后，制得荚膜组织胞浆菌素。使用时，疑似患者前臂屈肌表面皮内注射该荚膜组织胞浆菌素，注射后48小时观察红肿及结块大小，以5毫米作为阳性片段标准。皮试阳性揭示曾受过或正在受荚膜组织胞浆菌感染，有一定的诊断价值。但由于荚膜组织胞浆菌素组成成份复杂，与其它病菌的组成成份相互交叉，所以可能存在一定程度上的假阳性。
4.血清学诊断：以往荚膜组织胞浆菌血清学检查常用到的方法有免疫双扩法、补体结合实验等。近年来血清学诊断有所发展，通过检测血液、脑脊液和尿液中的荚膜组织胞浆菌抗原成份以判断感染荚膜组织胞浆菌与否。此方法灵敏度高、操作简便，可提供早期诊断依据。必须指出的是，血清学诊断的敏感性和特异性与用于检测的抗原/抗体的活性及其特异性密切相关。目前用于检测荚膜组织胞浆菌抗体的抗原来源于荚膜组织胞浆菌蛋白提取物，其制备工艺复杂，并且耗时、耗力，更为严重的是其成份复杂，导致检测结果灵敏度高但特异性差。
5.基因诊断：通过PCR方法扩增荚膜组织胞浆菌的特异性基因片段以用于该菌的鉴定、分型及流行病学调查。该方法敏感性好、特异性高，但由于仪器的限制，该方法无法在基层医疗机构大规模推广。
因此，建立一种快速、简单，特异性好的荚膜组织胞浆菌的检测方法，将对荚膜组织胞浆菌病的大规模临床鉴别诊断及快速诊断具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17及编码该融合蛋白的DNA，以及该融合蛋白在检测荚膜组织胞浆菌中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种将荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17基因转化宿主细胞并通过载体特异性表达荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17的方法。
本发明的又一目的在于提供一种包含荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17的ELISA试剂盒及其用于检测荚膜组织胞浆菌的用途。
为实现上述发明目的，发明人以分离的荚膜组织胞浆菌基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增得到M基因(GenBank登录号为AF026268)的特异性片段和GH17基因(GenBank登录号为ACU27588)的特异性片段；所说的M基因片段和GH17基因片段的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。在原核表达载体中定向插入荚膜组织胞浆菌M基因片段，构建得到M基因片段的重组原核表达载体；在该重组原核表达载体中再定向插入荚膜组织胞浆菌GH17基因片段，构建得到M-GH17基因片段重组原核表达载体；将M-GH17重组原核表达载体转化宿主细胞，筛选重组单克隆，诱导后特异性表达，得到融合蛋白M-GH17。
本发明中，原核表达载体最好选用PET-28a(+)。M-GH17重组原核表达载体转化宿主细胞时，宿主细胞选用大肠杆菌。采用卡那青霉素抗性筛选重组菌单克隆，以丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后特异性表达，分离纯化后得到。
本发明制备融合蛋白M-GH17的更进一步的详细步骤为：
1)以分离的荚膜组织胞浆菌基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增得到荚膜组织胞浆菌M基因片段和GH17基因片段。
2)在原核表达载体PET-28a(+)的多克隆位点NdeI和BamHI之间定向插入荚膜组织胞浆菌M基因片段，构建得到重组原核表达载体PET-28a(+)-M。
3)在重组原核表达载体PET-28a(+)-M的多克隆位点EcoRI和XhoI之间定向插入荚膜组织胞浆菌GH17基因片段，构建得到重组原核表达载体PET-28a(+)-M-GH17。
4)重组原核表达载体PET-28a(+)-M-GH17转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用卡那青霉素抗性筛选重组菌单克隆，重组表达菌株接种LB液体培养基培养，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导，Western-blot实验证实该重组表达菌株能够特异性表达荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17，以包涵体形式存在，分离纯化得到融合蛋白M-GH17。
利用上述制得的融合蛋白M-GH17，发明人还制备出用于荚膜组织胞浆菌鉴别诊断的酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒：将纯化得到的M-GH17融合蛋白、荚膜组织胞浆菌感染标准阳性血清、标准阴性血清、包被液、封闭液、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液组装成荚膜组织胞浆菌鉴别诊断试剂盒。具体溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加双蒸水定容至1000mL。使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加双蒸水定容至1000mL。
用本发明的包含融合蛋白M-GH17的ELISA试剂盒，按照普通ELISA方法检测待测血清，根据终止后的吸光值确定阳性、阴性、可疑的判断临界值，即可对待测血清样本进行荚膜组织胞浆菌检测。
相对于现有的荚膜组织胞浆菌检测方法，本发明具有以下的优点和有益效果：本发明通过查找目前已知的荚膜组织胞浆菌基因序列，比对其它病原微生物相关序列，计算机模拟该抗原优势表位，兼顾敏感性和特异性，最终确定选取荚膜组织胞浆菌M基因片段和GH17基因片段作为目的序列，并采用分子生物学技术创造性的将此两个基因片段融合表达，得到荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17，并利用此融合蛋白建立酶联免疫吸附实验(ELISA)方法，用于荚膜组织胞浆菌的血清学诊断。本发明与现有血清学方法检测荚膜组织胞浆菌相比，由于抗原特异性得到了极大提高，所以检测结果更加准确，极大程度得降低了误诊率；同时由于抗原是由荚膜组织胞浆菌优势抗原表位融合表达制得，所以其检测敏感性并没有降低。此外，该融合抗原制备方法简单易行，纯化工艺成熟，适合工业化大量生产。利用该融合蛋白作为包被抗原组装成ELISA试剂盒，操作简单易行，使用准确、快速，相对于目前培养增殖荚膜组织胞浆菌，以荚膜组织胞浆菌素为检测试剂的检测方法，本检测方法生产工艺简单实用、生产成本低，适合大规模生产和大规模临床诊断所需，本发明的ELISA试剂盒将为荚膜组织胞浆菌的防治提供强有力的工具。
本发明所涉及到的原核表达载体PET-28a(+)是基因工程领域最常用的原核表达载体之一，没有生物危险性。在此基础上构建得到的重组原核表达载体PET-28a(+)-M-GH17也不具有任何生物危险性。构建融合蛋白M-GH17所用的大肠杆菌菌株为BL21(DE3)，该菌株为分子生物学领域最常用的表达菌株之一，也不具有生物危险性。整个制备过程安全性高，不存在荚膜组织胞浆菌污染、扩散的潜在风险。
附图说明
图1显示的是原核表达载体PET-28a(+)-M-GH17构建流程图；
图2显示的是诱导表达并纯化后的融合蛋白M-GH17的SDS-PAGE电泳图；
图3显示的是融合蛋白M-GH17的Western-blot检测结果。
具体实施方式
以下用具体实施例对本发明作进一步详细说明。
一、荚膜组织胞浆菌M基因片段的克隆
如附图1所示，将荚膜组织胞浆菌接种于葡萄糖琼脂斜面培养基上，25℃培养3周后收集并提取其基因组DNA。以所提取的荚膜组织胞浆菌基因组DNA为模板，通过PCR方法得到荚膜组织胞浆菌M基因片段，引物序列如下：
F1：5′GCCATATGCCTCTAAACACGGCCGC 3′(上游引物)
R1：5′GCGGATCCTTTGTTGTTGGCGCTGTTAA 3′(下游引物)
PCR反应条件为94℃变性1分钟，55℃退火15秒，72℃延伸40秒，总共30个循环，最后再72℃延伸5分钟。PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并连接pMD19-T载体(命名为T-M)，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切及测序得到M基因片段的序列(如序列表SEQ ID No：1所示)。
二、荚膜组织胞浆菌GH17基因片段的克隆
将荚膜组织胞浆菌接种于葡萄糖琼脂斜面培养基上，25℃培养3周后收集并提取其基因组DNA。以所提取的荚膜组织胞浆菌基因组DNA为模板，通过PCR方法得到荚膜组织胞浆菌GH17基因片段，引物序列如下：
F1：5′GCGAATTCGGCCAGGTTTGGGCG 3′(上游引物)
R1：5′GCCTCGAGTTAATCGACCATGAAGCACCAC 3′(下游引物)
PCR反应条件为94℃变性1分钟，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，总共30个循环，最后再72℃延伸5分钟。PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并连接pMD19-T载体(命名为T-GH17)，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切及测序得到GH17基因片段的序列(如序列表SEQ ID No：2所示)。
三、重组原核表达载体PET-28a(+)-M的构建
用限制性内切酶NdeI和BamHI于37℃分别双酶切T-M载体和PET-28a(+)载体12小时，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收M基因片段和PET-28a(+)载体。使用T4连接酶将回收的M基因片段和PET-28a(+)载体于4℃过夜连接后，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃过夜培养。第二日，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，碱裂解法提取质粒，经NdeI和BamHI双酶切鉴定后得到阳性重组质粒，命名为PET-28a(+)-M。
四、重组原核表达载体PET-28a(+)-M-GH17的构建
用限制性内切酶EcoRI和XhoI于37℃分别双分别酶切T-GH17载体和PET-28a(+)-M载体12小时，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收GH17基因片段和PET-28a(+)-M载体。使用T4连接酶将回收的GH17基因片段和PET-28a(+)-M载体于4℃过夜连接后，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃过夜培养。第二日，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，碱裂解法提取质粒，经EcoRI和XhoI双酶切鉴定后得到阳性重组质粒，命名为PET-28a(+)-M-GH17。
五、融合蛋白M-GH17表达菌株的构建
将构建好的重组表达载体PET-28a(+)-M-GH17转化BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃过夜培养。第二日，挑取数个平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，分别取部分菌液保存并制备蛋白电泳样品，剩余菌液均加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达4个小时后制备蛋白电泳样品。将诱导前和诱导后的蛋白电泳样品于12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，并使用考马斯亮蓝溶液染色。染色结果发现，诱导前样品无融合蛋白M-GH17表达，而诱导后样品明显表达融合蛋白M-GH17。以上结果说明制备得到融合蛋白M-GH17表达菌株。
六、最佳诱导物浓度的确定
将融合蛋白M-GH17表达菌株在LB平板上划线，37℃过夜培养后挑取挑取单个菌落接种于5mL LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养12小时后，用卡那青霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基将该菌液按1∶100稀释，分装至5支试管(每管5mL)，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.7，分别加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为0.1.0mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L，继续培养3小时后取等量菌液进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据融合蛋白M-GH17表达量确定最佳异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为1.0mmol/L。
七、最佳诱导时间的确定
将融合蛋白M-GH17表达菌株在LB平板上划线，37℃过夜培养后挑取挑取单个菌落接种于5mL LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养12小时后，用卡那青霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基将该菌液按1∶100稀释，分装至5支试管(每管5mL)，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.7，加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为最佳诱导浓度1.0mmol/L，分别诱导培养3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时后取等量菌液进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，SDS-PAGE电泳图参见附图2，图中1、2为纯化M-GH17融合蛋白，3为蛋白Marker。根据融合蛋白M-GH17表达量确定最佳异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导时间为4小时。
八、荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17的大量表达及纯化
从含卡那青霉素抗性的LB平板上挑取PET-28a(+)-M-GH17重组菌单克隆至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养12小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1∶100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.7，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，用细菌裂解液重悬，-70℃冷冻30分钟，超声破碎3分钟，4℃离心取沉淀，弃上清。取10mL包涵体变性溶液搅拌溶解沉淀，4℃离心后，取上清加PEG4000至0.2％(W/V)、氧化型谷胱苷肽至1mmol/L、还原型谷胱苷肽至2mmol/L，4℃静置30分钟后转至截留分子量为10kD-12kD的透析袋中，于PBS(10mmol/L，pH7.4)中过夜透析。透析后立即取出并分装，于-70℃保存备用。
细菌裂解液配方：Tris-Cl 50mmol/L，pH8.0
EDTA 1mmol/L
NaCl 100mmol/L
包涵体变性溶液：细菌裂解液+SKL 0.3％(W/V)
九、Western Blot检测
纯化后的融合蛋白M-GH17行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移到PVDF膜，一抗分别为人荚膜组织胞浆菌阴性血清和人荚膜组织胞浆菌阳性性血清，二抗为HRP标记的羊抗人IgG抗体，底物为Western Blot常用的鲁咪诺荧光底物。X光底片曝光、显影、定影。免疫印迹检测的结果参见附图3，图中1为荚膜组织胞浆菌阴性血清，2、3是荚膜组织胞浆菌阳性血清。
相关溶液配方：
1.电泳缓冲液：
Gly1 8.8g，Tris 3.03g，SDS 1g，加双蒸水定容至1000ml。
2.转膜缓冲液：
Gly 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加双蒸水定容至1000ml。
3.洗涤液：
Tris 3g，NaCl 8g，KCl 0.2g，Tween-201ml，定容至1000ml(pH7.8)。
4.荧光底物：
Pierce公司产品(货号：Prod#34075)。
十、荚膜组织胞浆菌诊断试剂盒的制备
1.试剂盒组成：抗原包被酶标板1块、洗涤液50mL、阴性对照样品500μL、阳性对照样品500μL、显色液A、B各50mL、终止液25mL、二抗工作液50mL。
2.相关溶液配方：
包被液：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加双蒸水定容至1000mL。使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加双蒸水定容至1000mL。
3.抗原包被酶标板的制备
将上述实施例8中制备得到的荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17用包被液稀释至终浓度1μg/mL，按100μL/孔加入到酶标板中，37℃静置2小时后于4℃过夜。弃包被液，加封闭液200μL/孔，37℃1小时后弃封闭液，于37℃烘干。将酶标板放入专用锡箔袋，加一小袋干燥剂，抽真空，封口。
十一、荚膜组织胞浆菌诊断试剂盒操作步骤及片段标准
荚膜组织胞浆菌诊断试剂盒中的各个组成成份平衡至室温后，将待测血清、阴性对照血清和阳性对照血清加入到酶标板中(100μL/孔)，37℃温育1小时，甩干，洗涤液洗涤5次，拍干。每孔加酶标二抗(羊抗人IgG)100μL，37℃温育30分钟，甩干，洗涤液洗涤5次，拍干。每孔加入已混好的显色液100μL，37℃温育10分钟。没孔加入终止液50μL，轻轻振荡后置于酶标仪，OD450测吸光值。判断标准：OD450≥0.2为阳性，疑为荚膜组织胞浆菌感染；OD450＜0.2为阴性，未感染荚膜组织胞浆菌。
实验结果显示，本发明利用荚膜组织胞浆菌M基因片段和GH17基因片段所制备得到的融合蛋白M-GH17，并用其所建立的ELISA方法可快速有效鉴别诊断荚膜组织胞浆菌感染。
SEQ ID NO1：荚膜组织胞浆菌M基因片段的核苷酸序列；
SEQ ID NO2：荚膜组织胞浆菌H17基因片段的核苷酸序列；
SEQ ID NO3：荚膜组织胞浆菌M蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO4：荚膜组织胞浆菌H17蛋白的氨基酸序列。
SEQUENCE LISTING
<110>中南大学
<120>一种融合蛋白及其用于检测荚膜组织胞浆菌的用途
<130>0
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
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<213>Histoplasma capsulatum
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Asn Asn Thr Asp Leu Val Phe Met Asp Gly Ser Lys Ser Phe Tyr Leu
35 40 45
Asn Phe Asp Asn Ser Thr Ser Asp Thr Gly Ile Tyr Phe Val Asn Leu
50 55 60
Asn Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gln Leu Tyr Lys Asp Ser Asp Asn Lys
65 70 75 80
Leu Leu Trp Gly Gly Ala Gln Gln Glu Arg Asp Gly Trp Met Trp Cys
85 90 95
Phe Met Val Asp
100
Claims (8)
1.一种荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17，其特征在于该融合蛋白是由如序列表SEQ ID No：3的氨基酸序列和SEQ ID No：4的氨基酸序列连接形成的多肽。
2.一种编码如权利要求1所述的融合蛋白M-GH17的DNA，其特征在于该DNA包含荚膜组织胞浆菌M基因片段和GH17基因片段，所述荚膜组织胞浆菌M基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述GH17基因片段如SEQ IDNo：2所示。
3.一种包含荚膜组织胞浆菌M基因片段和GH17基因片段并能融合表达如权利要求1所述蛋白M-GH17的重组大肠杆菌菌株。
4.如权利要求1所述的融合蛋白M-GH17的制备方法，其特征在于包含以下步骤：以分离的荚膜组织胞浆菌基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增得到M基因的特异性片段和GH17基因的特异性片段；在原核表达载体PET-28a(+)中定向插入荚膜组织胞浆菌M基因片段，构建得到M基因片段的重组原核表达载体；在该重组原核表达载体中再定向插入荚膜组织胞浆菌GH17基因片段，构建得到M-GH17基因片段重组原核表达载体；将M-GH17重组原核表达载体转化宿主细胞，筛选重组单克隆，诱导后特异性表达，得到融合蛋白M-GH17。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述M-GH17重组原核表达载体转化宿主细胞时，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：从所述荚膜组织胞浆菌PCR扩增M基因片段所用的上游引物为：5′GCCATATGCCTCTAAACACGGCCGC 3′；下游引物为：5′GCGGATCCTTTGTTGTTGGCGCTGTTAA 3′。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：从所述荚膜组织胞浆菌PCR扩增GH17基因片段所用上游引物为：5′GCGAATTCGGCCAGGTTTGGGCG 3′；下游引物为：5′GCCTCGAGTTAATCGACCATGAAGCACCAC 3′
8.一种用于荚膜组织胞浆菌鉴别诊断的ELISA试剂盒，包含常规ELISA试剂盒所用的包被液、封闭液、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液，其特征在于：还包含如权利要求1所述的荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17，以及荚膜组织胞浆菌感染标准阳性血清和标准阴性血清。
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