CN103834668B - 一种重组肺炎支原体蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组肺炎支原体蛋白，以及该重组肺炎支原体蛋白在制备检测试剂盒中的应用。本发明的重组肺炎支原体蛋白制备的诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，很好的满足了肺炎支原体感染临床诊断的需要。

Description

一种重组肺炎支原体蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种肺炎支原体蛋白及其应用。

背景技术

肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae，MP）是引起上呼吸道感染、气管支气管炎及非典型肺炎的常见病原体之一。由于肺炎支原体感染所致的社区获得性肺炎患者临床表现不典型，经过10-20d的潜伏期，可出现一些非特异性症状如头痛和发热，常伴有无力和干咳，根据临床症状不易作出鉴别诊断。常被忽视而导致严重的合并症。由于肺炎支原体无细胞膜，作用于细胞膜的抗菌药物对其无杀伤作用，加上其感染初期临床表现不明显，另外，MP感染还可以造成肺外各系统改变，且有死亡病例的报道，已引起临床关注。因此，及时、有效的进行肺炎支原体感染的实验室诊断变得尤为重要。

MP感染可在任何年龄发生，尤其以5～20岁更多见。MP通过飞沫，以气溶胶微粒的形式传播，感染后引起肺炎支原体肺炎（Mycoplasmalpneumonia，MPP），每隔3～5年出现1次地区性流行，占各类肺炎总数的10%～20%，入伍新兵患肺炎者30%～50%由MP引起，约占非细菌性肺炎的1/3以上。另外，还可以造成肺外各系统改变，且有死亡病例的报道，已引起临床关注。

肺炎支原体肺炎的临床表现、X线征象均缺乏特异性，且须与病毒性肺炎、军团菌肺炎相鉴别，只能通过实验室检查病原体分离阳性和血清学试验进行鉴别诊断、确诊。虽然分离培养虽然是最可靠的确诊依据，但存在着临床标本中病原体含量少、呼吸道污染的杂菌较多、分离培养需要时间长、阳性率低以及支原体培养要求高，一般实验室难以开展等缺点。因而不能作为临床快速诊断的方法。而血清学检查具有简便快速的特性使其在临床上得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组肺炎支原体蛋白，本发明的另一目的是提供该重组肺炎支原体蛋白在制备检测试剂盒中的应用。

本发明提供了一种编码肺炎支原体蛋白的重组DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的肺炎支原体蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明还提供了一种肺炎支原体蛋白的表达载体pET-28a-rMP-p116，它是将SEQIDNO.1所示所述的重组DNA序列插入到质粒pET-28a上得到的重组质粒，其质粒图谱如附图2所示。将表达载体pET-28a-rMP-p116导入大肠杆菌中，得到表达肺炎支原体蛋白的工程菌株，其保藏编号为CGMCCNo.8895，于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明利用SEQIDNO.1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备肺炎支原体蛋白可以通过如下步骤实现：

1）获得具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；

2）将该核苷酸序列导入质粒，优选pET-28a质粒；

3）将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21（DE3）菌株中；

4）在有利于所述核苷酸序列表达的条件下（转速200r/min、37℃培养3小时，加入1mmol/mL诱导剂，转速200r/min、37℃诱导表达5小时）培养所述宿主细胞；

5）回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。

本发明提供的检测肺炎支原体感染的试剂盒，其组分中的抗原是本发明所述的重组肺炎支原体蛋白。优选地，用于标记肺炎支原体蛋白的标记物为体金。

本发明所述的采用胶体金标记抗原的试剂盒中，MP抗原划线包被浓度为1.0mg/ml，MP抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫，胶体金结合物喷点量为60.0μL/cm²。兔抗MP抗体包被量为1.0μl/cm，包被浓度为5.0mg/ml。

以下将更详细的描述本发明的技术方案：

本发明提供了一种编码肺炎支原体蛋白的如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，利用该核苷酸序列制备肺炎支原体蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQIDNO.2所示氨基酸序列的肺炎支原体蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测肺炎支原体感染的应用。

SEQIDNO.1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，选择其强抗原表位即肺炎支原体MP129-B7基因组（GenBank:NP_109974.1）中DNA序列为模板，设计两对PCR引物（P1，P2）和（P3，P4）。p1和p2用于扩增p116中第31位到第912位核苷酸，p3和p4用于扩增p116第1015位到第1395核苷酸；引物p1和p4分别带有BamH1和XhoI的酶切位点，引物p2和p3顺序互补；利用P2中的连接引物将中间部分疏水片断去除，并根据大肠杆菌的表达子偏爱性对基因序列进行了部分点突变。

引物序列如下：

P1：ATAGGATCCGGGCACAGATATGGGAATGACCAC

P2：

GAATCTTCCAAAGCCACCCTGATCTTAATCAAACCCCGGTCGGGTTAC

P3：CCGAGGTAACCCGACCGGGGTTTGATTAAGATCAGGGTGGCTTTGG

P4:

TATCTCGAGTTAATGATGGTGATGGTGATGCCAGAGGAACCTACTTTTTTCCC

以肺炎支原体培养物为模板，以引物P1和P2扩增p116第11位到第304位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增p116第389位到第465核苷酸片段；再以第一轮PCR扩增得到的两片段为模板，加入引物P1和P4，扩增p116片段；得到串联的目的基因重组片段p116。

本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。

本发明还提供应用如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列制备肺炎支原体蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码肺炎支原体蛋白的如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。

编码本发明蛋白的核酸与pET-28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。

在本发明的一个实施方案中，如图2所示，制备含有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-28a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21（DE3），经IPTG诱导培养后，收集菌体，得到大肠埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-28a-rMP-p116。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。

本发明还提供用上述方法制备、纯化的肺炎支原体蛋白，该蛋白具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列。

本发明还提供包含本发明肺炎支原体蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测人肺炎支原体感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的检测肺炎支原体感染。任何生物学样品，只要它们含有肺炎支原体抗体，就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。

本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成肺炎支原体感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断肺炎支原体感染。在用于肺炎支原体感染检测的试剂盒中，本发明的肺炎支原体蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。

目前市场上只有日本富士瑞必欧株式公社生产的“肺炎支原体抗体检测试剂盒（被动凝集法）”是对肺炎支原体抗体进行检测的。

而采用本发明提供的重组肺炎支原体蛋白制备的诊断试剂盒，与该试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，很好的满足了肺炎支原体感染临床诊断的需要。

本发明涉及的表达肺炎支原体蛋白的工程菌株为大肠埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-28a-rMP-p116，其保藏编号为CGMCCNo.8895，于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

附图说明

图1 PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中M表示Marker，1表示扩增产物；

图2是表达质粒pET-28a-rMP-p116的构建流程图；

图3是诱导后菌体12％SDS－PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1肺炎支原体蛋白的制备

1.1肺炎支原体蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆

通过计算机分析肺炎支原体的全部氨基酸序列筛选出肺炎支原体蛋白的强抗原表位，所述的重组蛋白质从N-末端到C-末端依次含有MP129-B7基因组中p116从N-末端第11位到第289位核苷酸，和第339位到第421位核苷酸的421个氨基酸。其中上述重组蛋白质的DNA序列如SEQIDNo.2所示。

根据肺炎支原体MP129-B7基因组中目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物（P1，P2）和（P3，P4）。p1和p2用于扩增p116中第11位到第304位核苷酸，p3和p4用于扩增p116第389位到第465核苷酸；引物p1和p4分别带有BamHI和XhoI的酶切位点，引物p2和p3部分核苷酸序列互补。

引物序列如下：

P1：ATAGGATCCGGGCACAGATATGGGAATGACCAC

P2：CAGGGTGGCTTTGGAAGATTCCGAGTCCGTGGAGGGTAA

P3：TCGGAATCTTCCAAAGCCACCCTGATCTTAATCAAACCC

P4：

TATCTCGAGTTAATGATGGTGATGGTGATGCCAGAGGAACCTACTTTTTTCCC

上述引物由（华美生物技术有限公司）合成。

以肺炎支原体培养物（中国预防医学科学院病毒研究所赠）为模板，以引物P1和P2扩增p116第11位到第304位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增p116第389位到第465核苷酸片段；再以第一轮PCR扩增得到的两片段为模板，加入引物P1和P4，扩增p116片段；得到串联的目的基因重组片段p116；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARAMiniBESTPlasmidpurification)回收目的DNA，操作按产品说明书进行。

1.2表达载体pET-28a-rMP-p116的构建及鉴定

pET-28a载体（购自华美生物技术有限公司）与PCR扩增产物目的DNA片段经BamHI和XhoI双酶切，产物纯化（采用TAKARAMiniBESTPlasmidpurification试剂盒，购自六合通-北京TAKARA公司）后经T₄DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态（购自华美生物技术有限公司），涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶BamHI和XhoI双酶切、鉴定，其中有3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-28a-rMP-p116。

1.3表达肺炎支原体蛋白的工程菌的构建

将表达质粒pET-28a-rMP-p116用化学转化法（(美)J.萨姆布鲁克(JosephSambrook),(美)D.W.拉塞尔(DavidW.Russell)著,黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社,2002.）转入大肠埃希氏菌BL21（DE3）菌株（购自华美生物技术有限公司），涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导后的菌体用12％SDS－PAGE分析（同上文献），结果如附图3所示，确定表达肺炎支原体蛋白的菌株即为所需的工程菌株大肠埃希氏菌Escherichiacoli YNTpET-28a-rMP-p116（CGMCCNo.8895），用甘油冷冻保存。

1.4重组肺炎支原体蛋白的表达制备及纯化

诱导培养已构建的表达肺炎支原体蛋白的大肠埃希氏菌，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1:10（W/V）加入菌体裂解液（50mmpH8.0Tris-Cl，50mmNaCl，50%甘油），加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌（冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80次）、组氨酸亲和柱（300ml200mm的NiCl₂过柱，流速5ml/min；500ml平衡缓冲液洗注，流速10ml/min；超声离心后的沉淀用200ml平衡缓冲液稀释后上样，流速3ml/min，500ml平衡缓冲液洗注，流速5ml/min；用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测仪280nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS－PAGE电泳检测纯化组分）得到纯化的重组蛋白。1.5肺炎支原体重组融合蛋白鉴定

1.5.1纯度和分子量的测定：经SDS－PAGE电泳检测（蛋白上样量10μg），为单一区带，薄层扫描鉴定纯度为95.8%。分子量约为49Kd，检测结果见附图3。

1.4.2浓度测定：经Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白作为标准参比品，抗原蛋白浓度为5.0±0.5mg/mL。

1.4.3重组蛋白Western-blot验证

为验证重组rMP-p116型蛋白质与抗MP抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为：10份兔抗MP抗体阳性血清（购自北京百安天地医药科技有限公司）和30份人抗MP抗体阳性血清（经ELISA法检测证实）。阴性血清为：10份对照正常兔血清和30份人抗MP抗体阴性血清（经ELISA法检测证实）。结果如表1。

表1重组蛋白Western-blot验证结果

结果显示，用肺炎支原体培养物免疫兔子所得的10份兔抗MP抗体阳性血清和30份人抗MP抗体阳性血清全部与表达抗原产生阳性反应，10份对照正常兔血清和30份人抗MP抗体阴性血清与表达抗原均产生阴性反应。结果提示重组目的基因获得表达，重组rMP-p116蛋白质与全病毒蛋白质有明显的交叉反应性，并具有很强的特异性，具有实际应用意义。

实施例2肺炎支原体抗体胶体金检测试剂盒的制备和性能检定

2.1肺炎支原体抗体胶体金检测试剂盒的制备

将以上制得的重组rMP-p116蛋白用作试剂盒标记抗原，用胶体金法测定MP抗体。该试剂盒的研制和使用如下：

（1）试剂盒原理本发明根据双抗原夹心法原理，用rMP-p116重组抗原包被硝酸纤维素膜，胶体金标记基因工程重组肺炎支原体（rMP-p116）抗原为示踪物。使用时加入待检血清，如样品中含有抗MP特异性抗体，则可与膜表面的rMP-p116重组抗原结合形成复合物，该复合物与胶体金标记的rMP-p116抗原结合而呈现紫红色条带。

（2）试剂盒性能优化以阳性和阴性质控品（收集多家医院经临床验证的抗肺炎支原体抗体阳性、阴性血清，用日本富士瑞必欧株式公社生产的“肺炎支原体抗体检测试剂盒（被动凝集法）”进行复检筛选，得到的抗肺炎支原体阳性、阴性血清建立为阳性和阴性质控品）为测试样品，采用交叉配比法确定rMP-p116重组抗原和rMP-p116抗原胶体金（rMP-p116-Ag.G）结合物的最佳工作浓度，结果如表2，由结果得出，若划线包被浓度高于2.0mg/ml则可能导致假阳性结果，低于2.0mg/ml则可能导致假阴性结果；若稀释到一倍以上则可能导致假阴性结果。所以，综合考虑后选择rMP-p116重组抗原划线包被浓度为2.0mg/ml、rMP-p116-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间

包被载金垫。

表2最佳rMP-r116重组抗原和rMP-p116-Ag.G结合物工作浓度的

选择

－：阴性反应（无检测线）；±：可疑阳性（检测线隐约可见）；＋：阳性反应（出现检测线）；＋＋：较强阳性反应（检测线清晰）；＋＋＋强阳性反应（检测线颜色深）（以下解释同）

在已确定rMP-p116重组抗原划线包被浓度为2.0mg/ml、rMP-p116-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫的基础上，以阳性和阴性质控品（来源和标准同上）为测试样品，选择最佳rMP-p116重组抗原划线量。从表3可以看出，当划线量高于1.5μl/cm则会导致非特异性反应（假阳性），而低于1.0μl/cm则会导致假阴性结果。所以结合生产成本的考虑，最终选择最佳rMP-p116重组抗原划线量（喷金量为60.0μL/cm²）为1.0μl/cm。结果见表3。

表3最佳rMP-p116重组抗原划线量的确定

－：阴性反应；±：可疑阳性；＋：阳性反应；＋＋：较强阳性反应；＋＋＋强阳性反应

在已确定rMP-p116重组抗原划线浓度为2.0mg/ml，划线量为1.0μl/cm和肺炎支原体抗原胶体金复合物喷点浓度为浓缩原液到稀释一倍之间的基础上，以阳性和阴性质控品（来源和标准同上）为测试样品，采用方阵滴定选择最佳胶体金结合物喷点量。从表4可以看出，若喷点量低于60.0μL/cm²则会导致假阴性结果，高于70.0μL/cm²则导致假阳性结果，所以结合生产成本的考虑，最终选择最佳胶体金结合物喷点量为60.0μL/cm²。结果见表4。

表4最佳抗原胶体金复合物喷点量的确定

－：阴性反应；±：可疑阳性；＋：阳性反应；＋＋：较强阳性反应；＋＋＋强阳性反应

在已确定抗原胶体金复合物包被量的基础上来选择质控线兔抗肺炎支原体抗体的包被浓度。兔抗肺炎支原体抗体包被量为1.0μl/cm，包被浓度为5.0mg/ml。结果见表5。

表5质控线兔抗肺炎支原体抗体包被浓度的选择

±：质控线隐约可见；＋：出现质控线；＋＋：质控线清晰；＋＋＋：质控线清晰粗大

以上显示，兔抗肺炎支原体抗体与本试验中所用肺炎支原体抗原胶体金复合物有较好的反应性。兔抗肺炎支原体抗体包被浓度低，反应强度相对较弱。4.0-5.0mg/mL浓度包被基本上能够较好地显示质控效果。因而选择5.0mg/mL浓度作为质控线包被浓度。

rMP-p116重组抗原划线包被后，分别用下述缓冲系统进行封闭，比较封闭效果，结果表明含PEG₂₀₀₀₀的封闭系统封闭后灵敏度和特异性都有所下降，其他封闭和不封闭的结果没有区别，所以选择不封闭硝酸纤维素膜。结果见表6。

表6不同封闭系统的反应板比较

－：阴性反应；±：可疑阳性；＋：阳性反应；＋＋：较强阳性反应；＋＋＋强阳性反应

（3）试剂盒的制备

1）取1.0g的HAuCl₄.H₂O溶解于100ml纯化水中，配成1%氯金酸溶液；取1ml的1%氯金酸溶液入100ml沸水中，加入2ml、1%的柠檬酸三钠，继续煮沸30min，合成胶体金；取6ml合成的胶体金溶液，在400-700nm处进行扫描检验；取合成的约30nm胶体金406ml，用0.1MK₂CO₃调PH至7，量取5mg/ml2.65mlrMP-p116抗原用PH8.2的20mMTris-Cl稀释至40ml，边搅拌边加入胶体金溶液，继续搅拌10min，量取1%BSA40ml，边搅拌边加入前述溶液，继续搅拌10min，3000r/min4℃离心10min，去沉淀，上清重新平衡后，12000r/min4℃离心45min,去上清，重复2次；用内部质控血清对胶体金复合物进行检验，检验合格后，按前述浓度喷点包被抗原胶体金复合物，然后在37℃、相对湿度30%以下通风干燥16-22小时（过夜）后切割。

2）预切割NC膜，粘贴背板，按前面确定的浓度和划线量包被rMP-r116重组抗原和兔抗肺炎支原体抗体划线包被于NC膜上，在37℃、相对湿度30%以下的条件下干燥1.0小时。

3）撕掉包被检测线和质控线的NC膜（带背板）检测线端的纸膜，将抗原胶体金结合物垫粘贴在NC膜的质控线端，交叉约1mm，压实，将裁好的载样垫粘贴在抗原胶体金结合物垫的下端，压实，将裁好的吸水垫粘贴在NC膜的质控线端，将贴好的检测板两端裁切去掉1cm，用切条机切成4mm宽。抽取18条，用内部质控血清检测半成品检测卡。

4）将每个检测卡单独封装，每个独立包装为1人份，20人份封装成1盒。抽样检验。

各缓冲液配方如下：

1）rMP-p116重组抗原包被缓冲液配方：20mMTris-Cl缓冲液（pH8.2）见表7。

表7

内容	500ml
		Tris	1.2g
2MHCl	按需要
		纯化水	定容到500ml
0.45μm过滤膜	按需要

2）兔抗肺炎支原体抗体包被缓冲液配方：20mMTris-Cl缓冲液（pH8.2）见表8。

表8

内容	500ml
		Tris	1.2g
2MHCl	按需要
		纯化水	定容到500ml
0.45μm过滤膜	按需要

3）抗原胶体金复合物包被缓冲液配方：20mMTBS缓冲液（pH8.2）见表9。

表9

内容	1000ml
		Tris	2.4g
0.15M氯化钠	8.8g
		2MHCl	按需要
1→100BSA	10g
		纯化水	定容到1000ml
0.45μm过滤膜	按需要

（4）试剂盒使用操作方法：

1）打开检测卡的铝箔袋包装，取出检测卡。

2）将检测卡倾斜成加样孔端低于另一端不少于1.0cm。

3）取100μl待检血清加入到圆形样品孔中，室温（15℃～30℃）放置25分钟观察并记录结果。

4）检验结果判定：

阳性：判读窗口出现两条紫红色线条带。

阴性：判读窗口仅质控线位置出现一条紫红色线条带。

无效：判读窗口质控线位置无紫红色线条带。

2.2试剂盒性能检测实验

（1）特异性（准确性）测定：按前述实验确定的胶体金测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清（临床已确定），符合率为100％；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份肺炎衣原体阳性血清标本、50份沙眼衣原体阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

（2）灵敏度测定：按前述实验确定的胶体金测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清（临床已确定），符合率为100％。

（3）与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与日本富士瑞必欧株式公社生产的“肺炎支原体抗体检测试剂盒（被动凝集法）检测260份血清样本的比较实验结果如表10。

表10与日本富士公社肺炎支原体抗体试剂盒的比较测试结果

检测总符合率：（49+206）/260=98.1%，初步表明本试剂盒达到进口试剂盒的标准。

Claims (9)

1.一种编码肺炎支原体蛋白核酸，如SEQ ID NO.1所示。

2.一种肺炎支原体蛋白，其特征在于它由权利要求1所述的核酸编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包含权利要求1所述核酸的肺炎支原体蛋白的表达载体，其特征在于它是将权利要求1所述的核酸插入到质粒pET-28a上得到的重组pET-28a- rMP-p116质粒。

4.一株表达肺炎支原体蛋白的工程菌株，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体pET-28a-rMP-p116，宿主菌为大肠杆菌，保藏编号为CGMCC No. 8895。

5.一种重组肺炎支原体蛋白的制备方法，其特征在于1）获得具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2）将该核苷酸序列导入质粒，所述质粒是pET-28a质粒；

3）将该质粒导入原核宿主细胞，所述宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞；

4）培养所述宿主细胞；

5）回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述宿主细胞是BL21（DE3）菌株中。

7.一种检测肺炎支原体感染的试剂盒，其特征在于其组分中的抗原是根据权利要求2所述的肺炎支原体蛋白；所述肺炎支原体抗原划线包被浓度为1.0mg/ml，胶体金结合物喷点量为60.0μL/cm²，兔抗肺炎支原体抗体包被量为1.0μl/cm，包被浓度为5.0 mg/ml。

8.根据权利要求7所述的检测肺炎支原体感染的试剂盒，其特征在于所述抗原是以胶体金标记的。

9.根据权利要求7所述的肺炎支原体蛋白在制备检测试剂盒中的应用。