CN106279381B - 一种特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白，所述的蛋白来源与结核分枝杆菌，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，可以作为检测结核病的结核分枝杆菌标识物抗原，通过该抗原来体外检测特异性T细胞免疫反应，可以作为诊断结核病患者的参照，用于诊断患者是否被结核分枝杆菌感染。

Description

一种特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白
技术领域
本发明属于医疗产品技术领域，具体而言，涉及一种特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白。
背景技术
我国体外诊断产业现正处于快速增长时期。然而巨大的市场需求与我国诊断试剂行业相对落后的自主研发能力的存明显的差距。如何从源头上开展自主创新，如何在诊断试剂原材料供应上不受制于个别境外医药巨头，如何将现有的生物医药领域的科研成果转化为产品是我国政府、科研院所和医药行业在近年来都非常关注的热点。并且现今市场上对更灵敏、高效的诊断试剂提出了刚性需求，能够快速准确的确诊结核病患者对于医务工作者和病人本人都具有重要意义。
近年来数据调查结果显示，有结核病症状的患者76.6％接受过结核病病前相关检查，但是仅有35.8％被诊断为肺结核患者，提高病人发现率仍是当前结核病防治工作的重点也是难点。
利用抗原特异性T细胞的细胞免疫反应进行病原微生物感染的体外诊断，是今年发展起来的一种新的检测方法。我们通过分离新鲜全血中的外周血单核细胞并进行刺激培养，然后利用ELISPOT检测能够分泌IFN-γ的细胞的数量。该方法目前主要应用于结核分枝杆菌感染的诊断。目前临床普遍采用的结核诊断主要依赖于临床症状、影响学诊断和病原学诊断，对结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断不敏感。同时，在结核病筛查过程中，直接检测病原体或检测结核分枝杆菌抗体的灵敏度和特异性也不理想。
发明内容
针对上述临床实际工作情况，我们筛选了结核分枝杆菌来源的蛋白片段，提供了一种检测结核病的结核分枝杆菌标识物抗原，通过该抗原来体外检测特异性T细胞免疫反应，可以作为诊断结核病患者的参照，用于诊断患者是否被结核分枝杆菌感染。同时，进一步动物实验表明，该蛋白抗原能够诱导针对结核分枝杆菌的免疫反应，具有制备相应的疫苗的功能。
具体而言，本发明首先涉及一种结核分枝杆菌的特异性蛋白抗原Rv3710c，所述的抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列结构为：
编码所述蛋白抗原Rv3710c的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其DNA序列结构为：
本发明还涉及所述的蛋白抗原Rv3710c的制备方法，该方法包括如下步骤，
方法一：
步骤(1)以LREnzyme mix催化Rv3710c的入门载体(美国CraigVentor Institute下设的PFGRC所免费提供)和pDESTTM17载体重组生成Rv3710c的表达载体；
步骤(2)将步骤(1)所述Rv3710c的表达载体转化目标表达宿主，表达目标Rv3710c蛋白；
步骤(3)破碎细胞收集蛋白并复性目标蛋白。
所述的步骤(1)的具体方法是：
a.克隆反应体系：Rv3710c的入门载体1.5μL，pDESTTM17载体1μL，BPII Enzyme mix 2.5μL；反应条件：25℃，过夜反应；
b.转化方法：反应体系中加入100μL大肠杆菌DH5α感受态(自制)，冰浴30min后，42℃热激90s，体系冰上放置10min，加入200μL LB培养基复性后，涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的LB固体培养基上，37℃培养20h；
c.质粒提取：以N96高纯度质粒小提试剂盒(DP114)提取质粒，获得Rv3710c的表达载体；
所述的步骤(2)的具体方法是：
a.取1μL步骤(1)获得的质粒溶液加入100μl大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态，冰浴30min后，42℃热激90s；
b.体系冰上放置10min，加入200μL LB培养基复性后，涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的LB固体培养基上，37℃培养12h；
c.以0.75mM IPTG诱导Rv3710c蛋白表达；
所述的步骤(3)的具体方法是：
a.以重悬液：60mM tris PH 9.0，0.15M EDTA重悬细菌，在4℃条件下使用超声波破碎仪超声破碎细菌；
b.4℃，10000rpm离心15min收集沉淀即为固体形态包涵体，目标蛋白电泳结果如图2所示。
c.以溶解液(60mM Tris-HCl PH7.0，10M尿素，15mM DTT，1mM EDTA)溶解包涵体；第一次透析：以截留分子量为3K的透析袋过夜透析将蛋白透析，透析液成分为：20mM Tris-HCl PH 9.0，1M尿素，3mM L-Argine；
d.再透析第二次，透析液成分为：20mM Tris-HCl PH 9.0，10mM NaCl，第二次透析：以截留分子量为3K的透析袋过夜透析将蛋白透析至透析液，即可获得可直接用于免疫原筛选的蛋白；
方法二：
步骤(1)表达含有多聚组氨酸标签的目标融合蛋白并收集表达宿主菌体：
步骤(2)收集含有多聚组氨酸标签的目标融合蛋白：
步骤(3)纯化目标融合蛋白。
所述步骤(1)的具体方法为：
1)采用E.coli BL21菌株表达6*His-Nus.a-Rv3710c融合蛋白；
2)LB平板划线活化(加入相应抗生素)，37℃静置过夜(12h左右)；
3)接种于5ml液体LB培养基(加入相应抗生素)37℃200rpm，培养至OD大于0.6-0.8(大约3h)；
4)按接种量1-3％接种于300ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600≈0.6-0.8(大约3h)。降温到16℃，加入IPTG至终浓度0.1mM；
5)16℃，200rpm培养培养16h，4℃，4000rpm离心15min收集菌体。
所述步骤(2)的具体方法为：
1)菌体重悬：每1L培养基所收集的菌体用40ml左右lysis buffer重悬(如需加入蛋白酶抑制剂PMSF，则终浓度为0.5-1mM；)
2)菌体破碎：超声3s、间隔9s、功率为38％，超声30min。(悬浊液透亮为标准，酌情调整超声工作总时间)如使用高压细胞破碎仪破碎1-2次，所需时间10min左右；
3)去除细菌碎片：4℃，15000-18000rpm离心20分钟，
4)上样：上述上清液体与柱材料Ni-NTA树脂(Novagen Cat.NO 70691-5)4℃孵育1h-1.5h左右。
所述步骤(3)的具体方法为：
1)10倍柱体积左右的lysis buffer流过重力柱，重复2次(每次必须重力柱中液体流净才能进行下一次加液体)；
2)10倍柱体积左右的20mM咪唑的lysis buffer流过重力柱，重复3次(同上)；
3)收集洗脱混匀样品用于检测洗杂效果；
4)1-2倍柱体积左右的Elution buffer流过重力柱，重复3次(同上)，分管收集。用bradford试剂检测洗脱液，了解蛋白是否完全洗脱。如含有蛋白，则继续洗脱，直至完全；
5)检测：SDS-PAGE检测目的蛋白是否存在；
6)透析以截留分子量为3K的透析袋在4℃下过夜透析洗脱液，外围透析液为PBS，同时加入HRV3c蛋白酶限制性酶切融合蛋白，产生6*His-Nus.a片段和目的片段Rv3710c；
7)将酶切产物与Ni-NTA树脂4℃抚育30min，收集穿透样品获得目的片段Rv3710c，同时6*His-Nus.a，HRV3c以及未酶切完全的融合蛋白都将与Ni-NTA树脂结合从而被清除；
8)以HiTrap Q HP(GE Cat.NO 17-1154-01)纯化以上获取蛋白，获得高纯度样品。
本发明还涉及所述的Rv3710c蛋白抗原作为检测结核分枝杆菌的免疫原的应用，所述的应用包括，
(1)将该Rv3710c蛋白抗原单独用于检测结核分枝杆菌；
或(2)将该Rv3710c抗原与现有结核分枝杆菌检测抗原联用，用于检测结核分枝杆菌。
本发明还涉及所述的Rv3710c蛋白抗原在制备结核分枝杆菌检测试剂盒中的应用，所述的应用为，
(1)将所述的Rv3710c蛋白抗原单独作为检测抗原制备检测试剂盒；
或(2)将所述Rv3710c蛋白抗原和现有结核分枝杆菌检测抗原协同联用，增加现有抗原免疫检测准确度。
所述的现有结核分枝杆菌检测抗原为结核分枝杆菌来源的ESAT-6抗原、CFP10抗原、PPD抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。
本发明还涉及由所述的Rv3710c蛋白抗原制备的单一抗原型结核分枝杆菌检测试剂盒，所述试剂盒包含，
(1)检测有效量浓度(优选浓度为75ug/ml)的Rv3710c蛋白抗原；
(2)必要的检测试剂及显色试剂。
本发明还涉及包含所述的Rv3710c蛋白抗原的多抗原联用型结核分枝杆菌检测试剂盒，所述试剂盒包含，
(1)检测有效量浓度(优选浓度为75ug/ml)的Rv3710c蛋白抗原，以及检测有效量的其他抗原；
(2)必要的检测试剂及显色试剂。
本发明还涉及所述的单一型或联用型结核分枝杆菌检测试剂盒的应用，其特征在于，所述的检测方法为，
(1)检测样品为由待测患者血样制备得到的抗凝全血或PBMC细胞；
(2)Rv3710c蛋白抗原作为免疫原与抗凝全血或者PBMC细胞孵育20-30个小时，优选20-24个小时
(3)检测受到Rv3710c蛋白抗原刺激分泌的细胞因子，与阳性参照对比确定检测结果，所述的细胞因子为IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-10和IL-12，优选IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta，进一步优选IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13，最优选IFN-gamma。
本发明还涉及所述Rv3710c抗原在制备抗结核分枝杆菌的疫苗中的应用。
附图说明
图1.Pdest17-Rv3710c表达载体酶切验证结果，泳道E4为酶切后的条带。
图2.Rv3710c蛋白质SDS-PAGE检测图，左侧为Marker(单位Kd)，
具体实施方式
实施例1.Rv3710c-pDEST17表达载体构建及目标蛋白Rv3710c的表达及复性(方法一)
以LREnzyme mix催化Rv3710c的入门载体(美国Craig VentorInstitute下设的PFGRC所免费提供)和pDESTTM17载体重组生成Rv3710c的表达载体。
具体方法：
A.克隆反应体系：Rv3710c的入门载体1.5μL，pDESTTM17载体1μL，BPII Enzyme mix 2.5μL；反应条件：25℃，过夜反应。
B.转化方法：反应体系中加入100μL大肠杆菌DH5α感受态(自制)，冰浴30min后，42℃热激90s，体系冰上放置10min，加入200μL LB培养基复性后，涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的LB固体培养基上，37℃培养20h。
C.质粒提取：以N96高纯度质粒小提试剂盒(DP114)提取质粒，获得Rv3710c的表达载体。
D.酶切验证：以BsrG1酶切试剂盒(R0575S NEB)酶切质粒验证克隆是否完成，结果如图1所示
结果显示，酶切片段大小约为700bp，质粒构建成功。
将获得的Rv3710c的表达载体导入rosetta(DE3)表达载体中，具体方法为：
a.取1μL质粒溶液加入100μrosetta(DE3)感受态(自制)，冰浴30min后，42℃热激90s，
b.体系冰上放置10min，加入200μL LB培养基复性后，涂布在含氨苄青霉素(100mg/l)的LB固体培养基上，37℃培养12h；
c.以0.75mM IPTG诱导Rv047c蛋白表达。
2.超声破碎细菌后超速离心，获取包涵体固体沉淀并收集蛋白及复性步骤具体方法为：
a.以重悬液：PBS重悬细菌，在4℃条件下使用超声波破碎仪超声破碎细菌；
b.4℃，10000rpm离心20min收集沉淀即为固体形态包涵体，对收集的蛋白的电泳结果如图2所示。
c.以溶解液(PBS+10M尿素)溶解包涵体；第一次透析：以截留分子量为3.5K的透析袋过夜透析将蛋白透析，透析液成分为：PBS，1M尿素，3mM L-Argine；
d.再透析第二次，透析液为PBS，第二次透析：以截留分子量为3.5K的透析袋过夜透析将蛋白透析至透析液，即可获得可直接用于免疫原筛选的蛋白。
实施例2.含多聚组氨酸标签的Rv3710c表达载体构建及目标蛋白Rv3710c的表达及复性(方法二)
1.表达含有多聚组氨酸标签的目标融合蛋白并收集宿主菌体：
1)采用E.coli BL21菌株表达6*His-Nus.a-Rv3710c融合蛋白；
2)LB平板划线活化(加入相应抗生素)，37℃静置过夜(12h左右)；
3)接种于5ml液体LB培养基(加入相应抗生素)37℃200rpm，培养至OD大于0.6-0.8(大约3h)；
4)按接种量1-3％接种于300ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600≈0.6-0.8(大约3h)。降温到16℃，加入IPTG至终浓度0.1mM；
5)16℃，200rpm培养培养16h，4℃，4000rpm离心15min收集菌体；
2.收集含有多聚组氨酸标签的目标融合蛋白：
1)菌体重悬：每1L培养基所收集的菌体用40ml左右lysis buffer重悬(如需加入蛋白酶抑制剂PMSF，则终浓度为0.5-1mM；)
2)菌体破碎：超声3s、间隔9s、功率为38％，超声30min。(悬浊液透亮为标准，酌情调整超声工作总时间)如使用高压细胞破碎仪破碎1-2次，所需时间10min左右；
3)去除细菌碎片：4℃，15000-18000rpm离心20分钟，
4)上样：上述上清液体与柱材料Ni-NTA树脂(Novagen Cat.NO 70691-5)4℃孵育1h-1.5h左右；
3.纯化目标融合蛋白：
3.1洗杂蛋白：
1)10倍柱体积左右的lysis buffer流过重力柱，重复2次(每次必须重力柱中液体流净才能进行下一次加液体)；
2)10倍柱体积左右的20mM咪唑的lysis buffer流过重力柱，重复3次(同上)；
3)收集洗脱混匀样品用于检测洗杂效果；
3.2目的蛋白洗脱：
1)1-2倍柱体积左右的Elution buffer流过重力柱，重复3次(同上)，分管收集。用bradford试剂检测洗脱液，了解蛋白是否完全洗脱。如含有蛋白，则继续洗脱，直至完全；
2)检测：SDS-PAGE检测目的蛋白是否存在；
3)透析以截留分子量为3K的透析袋在4℃下过夜透析洗脱液，外围透析液为PBS，同时加入HRV3c蛋白酶限制性酶切融合蛋白，产生6*His-Nus.a片段和目的片段Rv3710c；
4)将酶切产物与Ni-NTA树脂4℃抚育30min，收集穿透样品获得目的片段Rv3710c，同时6*His-Nus.a，HRV3c以及未酶切完全的融合蛋白都将与Ni-NTA树脂结合从而被清除；
5)以HiTrap Q HP(GE Cat.NO 17-1154-01)纯化以上获取蛋白，获得高纯度样品。
实施例3.目标蛋白Rv3710c的免疫原性测试
为了检测Rv3710c的免疫原性及其对于现有抗原检测试剂盒的增强效果，对于来自北京胸科医院临床确诊的多个病例进行了进一步的抗原检测筛选。
测试血样：来自北京胸科医院就诊患者
阳性对照试剂与耗材：T-SPOT试剂盒(ESAT-6和CFP 10双抗原试剂盒)，Oxfordimmunotec(英国)产品，
阴性对照：Rv2327蛋白抗原，随机选取的另一段来源于结核分枝杆菌的已知蛋白片段Rv2327，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示
SEQ ID No.4
SEQ ID No.3
实验方法及评价方法如下：
1)肝素抗凝血，抗凝血样本按体积1:1与RPMI1640混匀；按2-3:1比例小心将血样加在Ficoll淋巴细胞分离液上层；
2)1000g离心22分钟；水平转子，缓升缓降；
3)将单核细胞层(位于离心管中间层，为一层较薄的白膜状)从Ficoll分离管中转移到已加10ml AIM-V培养液的无菌15ml离心管，轻轻混匀，室温600g离心7min；
4)小心去除上清，加入1ml AIM-V，轻缓重悬细胞，加入AIM-V培养液至10ml,350g离心7min；
5)小心弃上清，加入1ml AIM-V培养液重悬细胞；
6)细胞计数及稀释，取10μl细胞悬液加入40μl的1％trypan blue，制备1：5细胞稀释液，进行活细胞计数，计算细胞稀释需要的体积并加入相应的AIM-V无血清培养液制备细胞稀释液，试剂盒检测要求加入每孔(24孔PVDF膜板)细胞数量2.5×105；
7)将培养板从铝封袋中取出，按顺序加入：
50μl AIM V至阴性对照孔；50μl抗原ESAT-6至抗原A孔；50μl抗原CFP 10至抗原B孔；50μl阳性对照至阳性对照孔；在上述4孔中分别加入已制备细胞稀释工作液100μl。50μl实施例2制备获得的Sample protein(初始浓度为60ug/ml)加入到样品孔中，随后加入培养基和细胞，样品孔中Sample protein的终浓度为初始浓度的1/3。
8)将培养板放入37℃，5％CO2培养箱孵育16-20hrs。
9)用无菌PBS按1:200制备新鲜酶标抗体工作液。从培养箱取出培养板，弃去孔内液体。以200μl/well无菌PBS洗涤4遍。
10)加入50μl/well酶标抗体工作液，将培养板在2-8℃孵育1小时。用PBS洗涤4遍去除未结合酶标抗体。
11)每孔加入室温平衡过的底物工作液50μl，室温反应7分钟。以蒸馏水冲洗终止反应，在37℃2-3hrs或室温过夜干燥培养板。
免疫原测试结果和分析：
免疫原性测试在胸科医院分子生物学实验室进行，测试选用一定数量的已临床确诊的结核病患者，通过使用各种蛋白抗原检测上述已确诊患者的血样，并由此结果分析Rv3710c蛋白抗原的免疫原性及应用方向，具体的检测结果统计见下表1所示，
表1.Rv3710c抗原对住院已确诊结核病患者的结核分枝杆菌检测结果
- A B + Rv3710 diagnosis
0 10 76 155 9 腰椎结核
0 18 5 358 6 耐多药结核病
4 29 19 824 28 胸椎结核
4 110 96 842 7 初治菌阳肺结核
3 14 8 543 14 结核性胸膜炎胸壁结核
0 73 66 652 0 初治菌阳肺结核
0 7 147 263 0 结核性胸膜炎
0 4 110 861 10 浸润型肺结核
0 0 0 988 6 浸润型肺结核
0 8 533 840 9 粟粒性肺结核胸壁结核
0 3 104 207 4 复治肺结核
0 29 59 966 9 耐多药结核病
0 57 204 904 5 浸润型肺结核
0 35 531 990 2 复治肺结核
0 1 0 676 2 多发性浆膜腔积液
4 27 132 1084 16 浸润型肺结核
0 5 20 1182 10 肺部阴影 矽肺
0 74 142 136 5 肾结核 颈部淋巴结结核
0 52 7 1081 45 非霍奇金淋巴瘤 肺部感染
0 29 350 201 8 复治肺结核
1 178 32 600 18 复治肺结核
1 0 0 797 1 肺部阴影
0 1 0 502 2 浸润型肺结核
1 101 75 725 4 肺部阴影
1 71 368 997 24 复治肺结核
0 0 0 1085 1 腰椎结核
5 2 2 763 6 支气管囊肿 肺炎
2 0 2 423 18 胸壁肿物
0 18 6 577 8 胸椎结核 腰椎结核
10 50 57 138 44 腕关节结核 浸润型肺结核
7 15 16 433 48 颈椎结核 胸椎结核
1 0 0 722 0 腰椎结核 骶骨结核
0 69 15 360 7 耻骨结核
6 50 24 830 82 结核性胸膜炎
0 130 12 410 19 结核性胸膜炎
6 44 144 496 25 浸润型肺结核
3 38 15 693 18 初治菌阳肺结核
1 141 20 1095 8 浸润型肺结核
3 111 82 240 2 浸润型肺结核
5 17 0 723 7 浸润型肺结核
10 403 513 724 196 粟粒性肺结核/纵隔淋巴结结核
3 2 5 756 2 浸润型肺结核
0 52 558 27 2 初治菌阳肺结核
0 81 2 548 6 肺结核
0 2 0 365 13 气管结核
0 366 5 693 2 复治肺结核
0 10 231 294 8 浸润型肺结核
2 6 33 569 4 右肺恶肿/纵隔淋巴结炎继发恶肿
4 75 149 780 11 胸腔积液 心包积液
*注：无反应应答患者不同于T-spot试剂盒检测无应答对象。
表1.Rv3710c抗原对住院已确诊结核病患者的结核分枝杆菌检测结果
有11例是T-spot试剂盒检测没有结果，但是Rv3710c可以筛选出。Rv3710c的结果明显优于T-spot的检测结果。
检测结果表明，Rv3710c蛋白抗原的能够更有效的检测结核分枝杆菌，若与其他阳性抗原联用，能够更有效的提高检出率。更为重要的是Rv3710c能够检测出T-spot检测为阴性的结果。明显能够提高结核病初筛检出率。
最后需要说明的是，以上实施例仅供本领域技术人员理解本发明的实质，并不用作对本法保护范围的限定。

Claims (2)

1.包含如SEQ ID NO.2 所示的抗原的多抗原联用型结核分枝杆菌检测试剂盒，所述试剂盒包含，
（1）检测有效量浓度的SEQ ID NO.2 所示的抗原，以及检测有效量的现有结核分枝杆菌检测抗原；
（2）必要的检测试剂及显色试剂；
所述的现有结核分枝杆菌检测抗原为结核分枝杆菌来源的ESAT-6抗原和CFP10抗原。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测有效量浓度的SEQ ID NO.2所示的抗原浓度为75 μ g /ml。
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