CN101939419A - 用于诱导抗结核分枝杆菌免疫反应的重组bcg肺结核疫苗 - Google Patents

用于诱导抗结核分枝杆菌免疫反应的重组bcg肺结核疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗结核分枝杆菌Mtb的疫苗。所述疫苗为基于卡介苗BCG亚基重组体疫苗，其中，一种或多种Mtb抗原以及一种或多种Mtb复苏或再活化抗原超表达，且DosR调节子至少部分为上游调节。该疫苗能保护性抵抗前后接触Mtb二种情况引起的阳性Mtb感染，因此可以预防由潜伏Mtb感染再发引起的病症。

Description

用于诱导抗结核分枝杆菌免疫反应的重组BCG肺结核疫苗
技术领域
本发明涉及一种改进的，可以成功预防前后接触Mtb二种情况引起的肺结核症状发展的结核分枝杆菌Mtb(Mycobacterium tuberculosis)疫苗。特别的，本发明提供一种改进的基于卡介苗BCG亚基重组体疫苗，其中，一种或多种Mtb抗原以及一种或多种Mtb复苏或再活化抗原超表达，且DosR调节子至少部分被上游调节。
背景技术
现有的预防性(接触前)结核分枝杆菌Mtb疫苗牛结核杆菌(M.bovis)BCG，在超过60年前引入，有效地避免了数种疾病在儿童中的表现，但是未能防止潜伏肺结核的形成或疾病再活化在青少年和成人中的感染。此外，几乎所有处于临床试验阶段的新型Mtb疫苗，都设计为预防性的，而不是预防性和治疗性(接触后)的疫苗。
人们相信，Mtb在人体内感染过程中，要通过多个阶段的发展，以与人类的免疫反应相作用，且每一阶段由确定的遗传程序控制，遗传程序控制阶段特异性抗原的表达。如果这一观点是正确的，则真正广谱的结核菌苗应当包括代表每一阶段的抗原以及阶段无关抗原。潜伏性结核(LTBI/潜伏期)显示为是一个这样的阶段，现有证据表明Mtb在潜伏期具有一种独特的生理学表现型，其特征在于细菌停殖(非持续性复制)、从有氧转化为无氧呼吸、表达α型小伴侣蛋白(Acr/HspX)，以及对数种分支杆菌抗生素抗性的增强。
非持续复制阶段的维持，被认为是典型的处于潜伏期的Mtb，表现依赖于Th1细胞因子(IFNγ、IL-12和TNFα)和一氧化氮以及Mtb在稳定内芽瘤中的定位。然而，潜伏Mtb再活化感染，其特征在于细菌复制的恢复、炎症以及空化，可被免疫抑制剂(如强的松(corticosterioids)或TNFα拮抗剂)迅速沉淀，发生在5～10％的潜伏感染个体中，这可能与对环境的分枝杆菌后天耐受性、年龄，以及更突出的HIV有关。这种普通的临床方案和已被证明细胞免疫系统在潜伏维持中的作用，得到一个结论：非持续复制是一种不稳定的表现型，由3个相互影响的过程决定：潜伏期内的细菌复制被细胞免疫系统效应物抑制；潜伏期内的细菌监测免疫效应物的产量；免疫效应物产量的减少导致复制的恢复。
迄今为止，未开发出可免疫Mtb感染，以及可同时治疗或防止在接触Mtb后，或由于潜伏性感染再活化引起的TB症状发展的成功疫苗。一种重组卡介苗，人工设计以诱导这类免疫反应，可减少具有如由于衰老、糖尿病、HIV、环境中分枝杆菌后天耐受性或营养失调引起的免疫力低下的人体内的再活化率。因此，存在持续增长开发新型TB疫苗的需要，开发出一种可用于预防性和接触后治疗的疫苗尤为有用。
发明内容
本发明基础是用作疫苗的新型重组卡介苗rBCG的开发。疫苗可用于预防性治疗以防止初始个体感染Mtb。但是，该疫苗也可以有效地治疗已经接触和/或感染了Mtb的个体。该疫苗可防止已建立的感染，同样可以防止已感染过个体内潜伏Mtb的再活化。用于疫苗制备的rBCG是遗传工程化的，以表达“传统的”Mtb抗原以及与Mtb生命周期各阶段如潜伏、再活化和复苏相关的抗原。因此，由接种疫苗引起的免疫反应使接种个体，在接触Mtb的任意及全部阶段，免于发展为活跃的Mtb感染。特别的，rBCG超表达1)一种或多种编码结核分枝杆菌Mtb抗原的基因，该抗原已知可诱导有效的、保护性的Mtb免疫反应；以及2)一种或多种编码至少一个Mtb复苏或再活化抗原的基因。抗原编码序列位于染色体外遗传因子，或被整合到重组BCG的染色体中。此外，在新型rBCG中，所有或部分DosR调节子是上游调节的。
本发明抗原编码序列整合到染色体中的实施例图示在图1中。
附图说明
图1，本发明rBCG的示意图；
图2，整合质粒和表达框的示意图；
图3A～D，染色体整合抗原框表达的免疫印迹。A，源自AFV-102pRC108的AERAS-407或Rv0867c的表达，电泳带(Lane)1＝AFV-102pRC108，电泳带2＝AFV-102；B，源自AFV-102pRC108的AERAS-407的Ag85A和Ag85B的超表达；C，源自AFV-102pRC108的AERAS-407的Rv3407的表达，电泳带1＝AFV-102，电泳带2＝AFV-102pRC108；D，源自AFV-102pRC108的DosR(Rv3133c)的表达，电泳带1＝AFV-102，电泳带2＝AFV-102pRC108；
图4，第二整合质粒和表达框的示意图；
图5A和B，Rv3804c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：1)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：2)。
图6A和B，Rv1886c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：3)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：4)；
图7A和B，Rv0867c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：5)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：6)；
图8A和B，Rv1009c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：7)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：8)；
图9A和B，Rv1884c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：9)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：10)；
图10A和B，Rv2389c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：11)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：12)；
图11A和B，Rv2450c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：13)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：14)；
图12A和B，Rv2623c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：15)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：16)；
图13A和B，Rv0288c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：17)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：18)；
图14A和B，Rv2626c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：19)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：20)；
图15A和B，Rv2005c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：21)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：22)；
图16A和B，Rv1996c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：23)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：24)；
图17A和B，Rv0685c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：25)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：26)；
图18A和B，Rv0824c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：27)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：28)；
图19A和B，Rv2029c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：29)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：30)；
图20A和B，Rv2627c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：31)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：32)；
图21A和B，Rv2744c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：33)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：34)；
图22A和B，Rv3347c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：35)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：36)；
图23A和B，Rv1130c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：37)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：38)；
图24A和B，Rv1169c的氨基酸序列(A SEQ ID NO：39)和核苷酸序列(B SEQ ID NO：40)。
具体实施方式
本发明提供一种新型的用于Mtb疫苗制备的rBCG。该rBCG被遗传工程化以超表达1)一种或多种Mtb抗原，这些抗原可包括所谓“传统的”Mtb抗原，如Rv1886c-Ag85B(“85B”)和Rv3804c-Ag85A(“85A”)，以及其他的；以及2)至少一个Mtb复苏/再活化抗原。此外，在本发明的rBCG中，DosR调节子，或DosR调节子的一部分是上游调节的。DosR调节子，由48个基因组成，在Mtb中一般因为感染后处于O2应激(缺氧)而被激活。
被选定包含在本发明的rBCG中的Mtb抗原一般是那些已知的，或预知在接触抗原后，可在个体中诱导保护性免疫反应的。可以使用多种标准来选择适当的抗原，这些标准包括但不限于：观察个体对抗原的免疫反应，以确定能否控制Mtb感染，通过免疫信息学分析(如利用如可以在丹麦科技大学(Technical University of Denmark)的网址：cbs.dtu.dk/services/NetCTL上找到的程序，该程序通过识别蛋白体切割位点、内质网ER运输效率、1型主要组织相容性MHC亲和力等进行分析)；基于深度文献检索的实验证据的分析；根据多种参数如巨噬细胞幸存率/存活期的分类或分级结果；由二元系统MprAB控制的表达的上游调节；对缺氧的响应；与休眠状态的相关性；在肺组织的表达；与启动子共调节Rv2031(Acr)的基因；分泌的蛋白质(可更易进入免疫系统)；重复的存在(许多毒性相关蛋白具有氨基酸重复区)；作为B细胞免疫原的能力；细胞壁相关或细胞壁发生源(膜暴露/相关蛋白被认为更易于进入免疫系统)；疫苗效力持续数据；对Mtb的唯一性等判定抗原是否含有一种或多种T细胞抗原决定簇。因此，抗原可以根据证明其效力的试验数据而被选定，或作为替换(或补充)，这种抗原可以根据其预知的能力而被选定。本领域的技术人员熟知如何进行这样的分析，且随着分类或分组系统的发展，可以量化确定候选抗原比较得分。例如，每一个待考虑的属性都可以有一个量化分数，具仍最高累积值的抗原可以被选定应用。此外，其他考虑在决策程序也可起一定的作用，部分考虑实际上是很有实际意义(如抗原的可得性、抗原表达的解除、对抗原计量免疫反应的解除等)。
起始抗原库可以是任何或所有已知的Mtb开放阅读框ORF产物。本领域的技术人员熟知用于识别Mtb ORF产物的资源，如由巴斯德研究所(Pasteur Institute)创办的“Tuberculist”网站。在本发明的一个实施例中，抗原可以由包括但不限于如GenBank登陆号AL123456(NC000962)所标示的M.tuberculosis H37Rv的所有ORF产物中选定。
在本发明的优选实施例中，rBCG表达的抗原从但不限于表1所列的189个抗原的起始组中选定。
表1.选定的189个抗原清单
  编号   基因(名称)   大小   NCBI注释【更新的注释】(a)
  Rv0079   273   假定蛋白(hypothetical protein)
  Rv0101   nrp   2512   可能的肽合成酶(nrp)
  Rv0125   pepA   355   可能的丝氨酸蛋白酶pepA(MTB32A)[DegQ]
  Rv0170 mce1B 346   MCE家族蛋白mce1B【Ttg2C，周质元件ABC转运子】
 Rv0198c   663   可能的锌金属蛋白酶[PepO，预测的金属内肽酶]
  Rv0211   pckA   606   磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pckA(GTP)
 Rv0227c   421   可能的保守膜蛋白
  Rv0243   fadA2   440   乙酰辅酶A乙酰基转移酶[β酮硫解酶(keto-thiolase)]
 Rv0251c   hsp[acr2]   159   热休克蛋白hsp
  (热应激诱导的核糖体粘结合蛋白A)
  Rv0282   631   假定蛋白[AAA ATP酶]
  Rv0283   538   可能的保守膜蛋白
  [ATP/GTP-结合蛋白]
  Rv0284   [ftsk]   1330   可能的保守膜蛋白
  [染色体部(chromosome partition)ATP酶]
  Rv0285   PE5   102   PE家族蛋白(PE5)
  Rv0286   PPE4   513   PPE家族蛋白(PPE4)
  Rv0287   exsG   97   类ESAT-6蛋白esxG
  (保守假定蛋白TB9.8)
  Rv0288   esxH(TB10.4)   96   低分子量蛋白抗原7esxH(10kDa抗原)CFP-7，TB10.4)
  Rv0289   295   假定蛋白[转运子]
  Rv0290   472   可能的保守跨膜蛋白(mgcP3)[转运子]
  Rv0292   331   可能的保守跨膜蛋白
  Rv0350   dnaK   625   分子伴侣DnaK
  Rv0351   grpE   235   可能的grpE蛋白(HSP-70辅因子)
  Rv0383c   284   可能的保守分泌蛋白
Rv0384c clpB 848   可能的肽链内切酶ATP结合蛋白ClpB(链B)热休克蛋白F84.1
  Rv0450c   mmpl4   967   可能的保守跨膜mmpL4
  [药物输出]
  Rv0467   icl[aceA]   428   异柠檬酸盐裂解酶(icl)
  Rv0468   fadB2   268   3-羟基乙酰基辅酶A脱氢酶
Rv0503c cmaA2 302   环丙烷脂肪酸酰基磷脂合成酶2(环丙烷分枝菌酸合成酶2，CMAA2)
  Rv0569   88   假定蛋白
  Rv0572c   113   假定蛋白
  Rv0574c   [pgsA]   380   假定蛋白
  [pgsA聚γ-谷氨酰(glytamyl)生物合成]
Rv0588 yrbE2B 295   保守的假定成膜蛋白YrbE2B[假定(putative)为Ttg2B，与有机溶剂抗性相关的转运系统ABC型，通透酶元件)
  Rv0628c   383   假定蛋白
  Rv0685   Tuf   396   延伸因子Tu，tuf[铁调节]
  Rv0754   PE_PGRS11   584   PE-PGRS家族蛋白(PE_PGRS11)[磷酸甘油变位酶]
  Rv0798c   cfp29   265   29kDa抗原CFP-29[林肯霉素(linocin)M-18细菌素]
  Rv0824c   desA1   389   可能的酰基去饱和[酰基转运]酶desA1
  Rv0847   lpqS   130   可能的脂蛋白LPQS
Rv0867c rpfA 407   可能的保守跨膜蛋白[跨膜葡萄糖转运酶(transglycosylase)rpfA]
  Rv0885   340   假定蛋白
  Rv1006   567   假定蛋白
Rv1009 rpfB 362   可能的复苏促进因子rpfB[跨膜葡萄糖转运酶，C5结合区]
  Rv1057   393   假定蛋白
  Rv1094   desA2   271   可能的酰基去饱和酶[酰基转运蛋白](DESA2)
  Rv1124   ephC   316   可能的环氧化物水解酶EPHC(环氧化物水解酶)
  Rv1130   [prpD]   526   假定蛋白[2-甲基柠檬酸脱水酶]
  Rv1131   gltA1   393   柠檬酸合成酶(glaA1)
  Rv1169c   PE11   100   PE家族蛋白(PE11)[三酰基甘油脂肪酶]
  Rv1174c   [sak5]   110   低分子量T细胞抗原TB8.4
  [分泌抗原SA5K]
  Rv1182   papA3   472   可能的保守相关蛋白PAPA3
  Rv1186c   538   假定蛋白[多聚乙酰合成表达调节子]
  Rv1187   rocA   543   可能的脯氨酸-5-羧酸脱氢酶rocA
  Rv1188   329   可能的脯氨酸脱氢酶
  Rv1196   PPE18(mtb39a)   391   可能的脯氨酸脱氢酶PPE家族蛋白[MTB39a]
  Rv1221   sigE   257   RNA聚合酶σ-70因子(SigE)
  Rv1347c   210   假定蛋白[GCN5-相关的N-乙酰转移酶折叠]
Rv1348 [lrtA] 859   可能的药物转运跨膜ATP-结合蛋白ABC-转运子[MdlA/MsbA主要的ABC转运子，噬铁细胞交互蛋白]
Rv1349 [irtB] 579   可能的药物转运跨膜ATP-结合蛋白ABC-转运子[ATM1ABC铁载体铁转运子]
  Rv1411c   lprG   236   可能的保守脂蛋白lprG
  Rv1436   gap   339   甘油醛-3-磷酸脱氢酶
  Rv1461   [sufB]   846   假定蛋白[sufB，胞嘧啶脱硫酶激活子]
  Rv1462   [sufD]   397   假定蛋白[sufD，胞嘧啶脱硫酶激活子]
  Rv1464   csd[sufS]   417   可能的半胱氨酸脱硫酶csd[SufS]
  Rv1465   [nifU]   162   可能的氮固定相关蛋白[IscU]
  Rv1466   115   假定蛋白[PaaD，预测的金属-硫簇生化合成酶]
  Rv1477   ripA   427   假定的入侵(invasion)蛋白
  Rv1738   94   假定蛋白
  Rv1793   esxN   94   假定的类ESAT-6蛋白ESXN
  (类ESAT-6蛋白5)
  Rv1812c   [ndH]   400   可能的脱氢酶[Ndh，NADH脱氢酶，含FAD亚基]
  Rv1813c   143   假定蛋白
  Rv1876   bfrA   159   可能的细菌铁蛋白(bacterioferritin)bfrA
  Rv1884c   rpfC   176   可能的复苏促进因子rpfC[跨膜葡萄糖转运酶]
  Rv1886c   ftpB(Ag85B)   325   分泌的抗原85-BFBPB(85-B)
  Rv1926c   mpt63   159   免疫原蛋白MPT63(16kDa免疫保护胞外抗原)
  Rv1980c   mpb64   228   免疫原蛋白MPT64
  Rv1986   199   可能的保守成膜蛋白
  [赖氨酸外排通透酶]
  Rv1996   317   假定蛋白[USP]
  Rv1998c   258   假定蛋白
  Rv2004c   498   假定蛋白[预测的激酶]
  Rv2005c   295   假定蛋白[类USP]
  Rv2006   otsB1   1327   可能的海藻糖-6磷酸磷酸酶OSTB1
  Rv2007c   fdxA   114   可能的铁硫蛋白(ferrodoxin)fdxA
  Rv2008c   441   假定蛋白[预测的ATP酶]
  Rv2011c   143   假定蛋白[转录调节子]
  Rv2028c   279   假定蛋白[USP]
  Rv2029c   pfkB   339   可能的磷酸果糖激酶(pfkB)
  Rv2030c   681   假定蛋白[假定的酯酶/转移酶]
  Rv2031c   acr(α-晶状体球蛋白)   144   热休克蛋白HspX(α-晶状体球蛋白(crystallin)同族物)14kDa抗原Hsp16.3
  Rv2032   acg   331   保守的假定蛋白Acg
  Rv2110c   [prcB]   291   蛋白体(β亚基)PrcB[HslV蛋白酶]
  Rv2123   PPE37   473   PPE家族蛋白(PPE37)
  Rv2140c   TB 18.6[pepB]   176   假定蛋白(TB18.6)[PEBP，细菌/古细菌(archeal)磷脂酰乙醇胺结合蛋白]
  Rv2182c   [pslC]   247   1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶
  Rv2224c   [caeA]   520   可能的外排蛋白酶[cae，碳酸酵素A，类TAP蛋白]
  Rv2244   acpM   115   酰基转运蛋白(acpM)
  Rv2245   kasA   416   3-含氧酰基(oxoacyl-)(酰基转运蛋白)合成酶(kasA)
  Rv2246   kasB   438   3-氧酰基(酰基转运蛋白)合成酶(kasB)
  Rv2251   [glcD]   475   可能的黄素蛋白[GlcD，含FAD/FMN脱氢酶]
  Rv2377c   mbtH   71   假定的保守蛋白MBTH
  Rv2378c   mbtG   431   赖氨酸-N-加氧酶(oxygenase)MBTG[lucD]
  Rv2380c   mbtE   1682   肽合成酶MBTE[EntF]
  Rv2381c   mbtD   1004   多聚乙酰合成酶多聚乙酰合成酶MBTD[酰基转移酶，KR区]
  Rv2382c   mbtC   444   多聚乙酰合成酶MBTC
  Rv2383c   mbtB   1414   苯噁唑啉合成酶(MBTB)[EntF，GrsT]
  Rv2386c   mbtI   450   邻氨基苯甲酸合成酶元件I(MBTA)[水杨酸合成酶]
  Rv2389c   rpfD   154   可能的复苏促进因子rpfE[跨膜葡萄糖转运酶]
  Rv2428   ahpC   195   烷羟基过氧化还原酶C蛋白ahpC
  Rv2429   ahpD   177   烷羟基过氧化还原酶D蛋白ahpD
  Rv2430c   PPE41   194   PPE家族蛋白(PPE41)
  Rv2450c   rpfE   172   可能的复苏促进因子rpfE[跨膜葡萄糖转运酶]
  Rv2457c   clpX   426   ATP依赖蛋白酶ATP结合亚基(CplX)
  Rv2466c   207   假定蛋白[假定的DsbA_FrnE][硫醇氧化还原酶，多聚乙酰生化合成]
  Rv2510c   533   假定蛋白[ATP结合区]
  Rv2515c   415   假定蛋白[假定的锌肽酶]
  Rv2516c   250   假定蛋白
  Rv2557   224   假定蛋白
  Rv2590   fadD9   1168   可能的脂肪酸辅酶连接酶fadD9
  Rv2620c   141   可能的保守跨膜蛋白
  Rv2621c   224   可能的转录调节蛋白
  Rv2622   273   可能的甲基转移酶(甲基化酶)
  Rv2623   TB31.7   297   假定蛋白TB31.7[USP]
  Rv2625c   393   可能的保守跨膜富丙氨酸和富亮氨酸蛋白[锌蛋白酶M-50CBS区]
  Rv2626c   143   假定蛋白[CBS配对结合/调节(regul)，euk]
  Rv2627c   413   假定蛋白
  Rv2628   120   假定蛋白
  Rv2629   374   假定蛋白[肽链释放因子erF1]
  Rv2657c   86   可能的phiRv2原噬菌体(prophage)蛋白[MerR调节蛋白]
  Rv2659c   375   可能的phiRv2原噬菌体整合酶
  Rv2660   75   假定蛋白
  Rv2710   sigB   323   RNA聚合酶σ因子(SigB)
  Rv2744c   35kd-Ag[pspA]   270   保守的35kDa富丙氨酸蛋白[噬菌体休克蛋白IM30]
  Rv2780   ald   371   分泌的L-丙氨酸脱氢酶ald(40kDa抗原，TB43)
  Rv2833c   ugpB   436   可能的Sn-甘油-3-磷酸-结合脂蛋白UGPB
  Rv2856   nicT   372   可能的镍转运成膜蛋白nicT
  Rv2869c   404   可能的保守跨膜蛋白[假定的pdz膜相关锌金属蛋白酶]
  Rv2875   mpt70   193   主要的分泌免疫原蛋白MPT70
  Rv2930   fadD26   626   脂肪酸辅酶A连接酶FadD26
  Rv2986c   hupB   214   可能的DNA结合蛋白HU同族HupB(类组蛋白蛋白，21kDa层粘连蛋白(laminin)-2结合蛋白)
  Rv2999   lppY   321   可能的保守脂蛋白LPPY
  Rv3126c   104   假定蛋白
  Rv3127   344   假定蛋白[可能的硝基还原酶]
  Rv3129   110   假定蛋白
  Rv3130c   tgs1   463   假定蛋白[甘油二酯酰基转移酶]
  Rv3131   nfnB   332   假定蛋白[可能的硝基还原酶NfnB]
  Rv3132c   devS   578   二元组氨酸感应激酶DevS
  Rv3133c   devR   217   二元转录调节子蛋白DevR
  Rv3134c   268   假定蛋白[USP]
  Rv3139   fadE24   468   可能的酰基辅酶A脱氢酶FadE24
  Rv3140   fadE23   401   可能的酰基辅酶A脱氢酶FadE23
  Rv3173c   200   可能的转录调节蛋白(TetR/acRR家族)
  Rv3229c   desA3   427   可能的亚麻酰(linoleoyl)辅酶A去饱和酶(δ-(6)-去饱和酶)
  Rv3250c   rubB   495   可能的红素氧还蛋白(rubredoxin)rubB
  Rv3251c   rubA   55   可能的红素氧还蛋白rubA
  Rv3283   sseA   297  可能的硫代硫酸硫转移酶(thiosulfatesulfurtranserase)SSEA(硫氰酸酶)
  Rv3290c   lat   449   L-赖氨酸ε氨基转移酶
  Rv3347c   PPE55   3157   PPE家族蛋白(PE55)[8拷贝五肽重复]
  Rv3372   ostB2   391   可能的海藻糖-6-磷酸磷酸酶(OSTB2)
  Rv3515c   fadD19   548   AMP依赖脂肪酸辅酶A连接酶FadD19
  Rv3516   echA19   263   烯酰辅酶A水合酶/异构酶(echA19)
  Rv3546   fadA5   391   乙酰辅酶A酰基转移酶(FadA5)
  Rv3570c   [ncnH]   394   可能的氧化还原酶[NcnH，萘环菌色素(naphthocyclinone)羟化酶]
  Rv3593   lpqF[penP]   452   可能的保守脂蛋白LPQF[PenP，A类β-内酰胺酶]
  Rv3597c   lsr2   112   可能的铁调节LSR2蛋白前体
  Rv3616c   [espB]   392   保守的假定富丙氨酸和富甘氨酸蛋白[ESAT分泌系统元件]
  Rv3619c   esxV   94   假定的类ESAT-6蛋白ESXV(类ESAT-6蛋白1)
  Rv3660c   350   假定蛋白
  Rv3763   lpqH   159   19kDa脂蛋白抗原前体LPQH
  Rv3804c   fbpA(Ag85A)   338   分泌的抗原85-AFBPA(85-A)(分枝酰(mycolyl)转运酶85A)
  Rv3812   PE_PGRS62   504   PE-PGRS家族蛋白(PE_PGRS62)
  Rv3833   263   转录调节蛋白[可能的araC家族]
  Rv3839   258   假定蛋白
  Rv3840   137   可能的转录调节蛋白[细胞外壳相关转录衰减子]
  Rv3841   bfrB   181   可能的细菌铁蛋白bfrB
  Rv3871   [Ftsk]   591   假定蛋白[FtsK_SPOIIIE]
  Rv3873   PPE68   368   PPE家族蛋白[PPE68，RD1T/B免疫原]
  Rv3874   esxB   100   10kDa培养基滤过抗原ESXB(LHP，CFP-10)
  Rv3875   esxA   95   6kDa早期分泌抗原作用位点ESXA(ESAT-6)
  Rv3876   [Ftsk]   666   保守的假定脯氨酸和富丙氨酸蛋白[染色体部ATP酶]
  Rv3878   280   保守的假定富丙氨酸蛋白
  Rv3879c   729   假定的丙氨酸和富脯氨酸蛋白
(a).NCBI注释基于登陆号AL123456(NC_000962)；更新的注释基于生物信息学分析、源自MTB相关服务数据和实验证据。
在本发明的更优选实施例中，通过rBCG表达的抗原是列在表2和3中的45个抗原。
表2.顶级排序的抗原(根据分类/阶段)
Figure BPA00001182573500101
Figure BPA00001182573500111
  Rv1908c   katG   740   过氧化氢酶-过氧化物酶-过氧化亚硝酸酶(peroxinitritase)-T(KATG血红素依赖)   7   10
  Rv1174c   sak5   110   低分子量T细胞抗原TB8.4(分泌的)   7   9
  Rv1349   irtB   579   可能的药物转运ATP-结合蛋白ABC转运子[ATM1ABC噬铁细胞(siderophor)铁转运子]   7   9
  Rv2780   ald   371   分泌的L-丙氨酸脱氢酶ALD(40kDa抗原)(TB4.3，细胞相关嘧啶核苷酸转氢酶)   7   9
  Rv2620c   141   可能的保守跨膜蛋白   7   8
  Rv1793   esxN   94   假定的类ESAT-6蛋白(ESXN，类ESAT-6蛋白5)   6   9
(a).NCBI注释基于登陆号AL123456(NC_000962)；更新的注释基于生物信息学分析、源自MTB相关服务数据和实验证据。
表中的45个顶级排序的抗原根据以下类别被分类：
*DosR调节子基因(Voskuil et al.，2003，J.Exp Med 198(5)：705-713；Voskuil et al.2004，Tuberculosis 84，218-227)
*复苏基因
*再激活基因(主要依据为Talaat et al.，2007，Proc.Natl.Acad.Sci.189(21)：7877-7886)
*传统基因
*其他(主要与维持期与应激响应相关)
上述的出现在超过一个类一些抗原列于表3。
表3.根据质量和数量分值排序的顶级排序抗原
Figure BPA00001182573500131
  Rv2744c   35kd-Ag[pspA]   270   保守35kDa富丙氨酸蛋白[噬菌体休克蛋白IM30]   7   8   再激活
  Rv3875   esxA   95   6kDA早期分泌抗原靶标ESXA(ESAT-6)   6   11   传统的
  Rv1926c   mpt63   159   免疫原蛋白MPT63(16kDa免疫保护胞外蛋白)   6   10   传统的
  Rv2030c   681   假定蛋白[假定的酯酶/转移酶]   6   10   DosR
  Rv3132c   devs   578   二元组氨酸感应激酶DEVS   6   10   DosR
  Rv3347c   PPE55   3157   PPE家族蛋白(PE55)[8拷贝五肽重复]   6   10   再激活
  Rv0467   icl   428   异柠檬酸裂解酶(icl)[AceA]   6   9   传统的
  Rv1130   [prpD]   526   假定蛋白[2甲基柠檬酸脱水酶]   6   9   再激活
  Rv1169c   PE11   100   PE家族蛋白(PE11)[三酰基甘油脂肪酶]   6   9   再激活
  Rv1793   esxN   94   假定的类ESAT-6蛋白ESXN(类ESAT-6蛋白5)   6   9   其他
  Rv2629   374   假定蛋白[肽释放因子erF1]   6   9   DosR
(a).NCBI注释基于登陆号AL123456(NC_000962)；更新的注释基于生物信息学分析、源自MTB相关服务数据和实验证据。
列表中的45个顶级排序抗原首先根据质量分排序，然后根据本发明以及如例1中所论述数量分排序。这一方法得到如下3组：
组Ⅰ：质量分为9-8的抗原，且质量分为8的抗原中，其数量分的下限是12。
组Ⅱ：质量分为8-7的抗原，7的数量分下限为9。
组Ⅲ：质量分为7-6的抗原，6的数量分下限为9。
具有超过5个跨膜片断的抗原不列入本列表中。
一般来说，至少一个这种抗原将超表达，且数个不同的抗原可超表达。例如，大约1-20或更多的这种抗原，或作为替换，大约19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2，或仅1个这样的抗原将通过rBCG超表达。进一步，在rBCG中，可以编码和超表达一个或多个抗原的多个拷贝。选定抗原的氨基酸序列，及编码抗原的核酸序列，显示在图5A-B至25A-B中。
此外，该rBCG包含由一个或多个编码并超表达至少一个Mtb复苏/再活化抗原的基因构成的核酸序列。本领域的技术人员会认识到，“复苏”和“再活化”抗原的精确限定在各个领域内会有所不同，且在一些情况下，限定可能重叠。就本发明的发明目的，区别复苏和再活化抗原是不必要的，因为所有的抗原通过Mtb从潜伏期脱离的重要性得以识别。在最精确意义中，根据是否具有Micrococcus luteus复苏促进因子的重要序列或同功异形体来定义，复苏抗原(即复苏促进因子)是再活化抗原的子集(G Mukamolova et al，Archives of Microbiology，Volume 172，1999)。就本申请的目的，“再活化”抗原是由M.tuberculosis表达的，可在具有活跃性肺结核而非潜伏Mtb感染的人类中诱导免疫反应的蛋白质。它们也可以标识为由Wayne的潜伏性结核模型的非复制静止期的Mtb在脱离过程中表达的免疫原。这可能包括在Mtb从休眠潜伏期进入活跃结节核细菌过程中表达的分子。适当的再活化/复苏抗原的例子包括Rv0867c、Rv0288、Rv1009、Rv0685、Rv0824c、Rv2744c、Rv3347c、Rv1130、Rv1169c、Rv1009、Rv1884c、Rv2389c以及Rv2450c。在优选方案中，表达的再活化/复苏抗原是Rv0867c、Rv1884c和Rv2389c。
此外，在本发明的rBCG中，DosR(休眠存活调节子)调节子基因，或其部分，是上游调节和表达的。整个调节子，或其适当部分，可能是上游调节的。例如，通过具为潜伏TB个体识别的编码抗原的基因可能是最适合上游调节的。DosR上游调节抗原的例子包括Rv1738、Rv2623、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2005c、Rv3127、Rv1733c、Rv1996、Rv2628、Rv0079、Rv3130c、Rv3131、Rv1813c、Rv2006、Rv2029c、Rv2627c、Rv2030c、Rv3132c，以及Rv2629。显然，部分抗原重叠存在于潜伏和再活化抗原之间，这也许反应了在休眠生物再进入活跃生长期之前潜伏相关抗原的扩展存在，或其在哺乳动物寄主再活化后，在休眠和活跃复制期二者中都有功能。可能被认为在潜伏和再活化之间重叠的抗原列在表4中。
表4.潜伏和再活化重叠抗原
Figure BPA00001182573500171
“上游调节”，意味着调节子的单个基因的表达或其翻译的蛋白质，高于当调节子处于“抑制”态的表达水平。DosR调节子蛋白质正常以相当低的水平表达。在氧匮乏和/或存在氮氧化物存在的情况下，TB复合体的DosS和Dost蛋白自磷酸化，并转移这一磷酸至DosR。DosR然后结合到DosR调节基因的上游独立序列，以此激活其转录并上游调节这组基因及其组成DosR调节子的基因产物。在本发明的操作中，上游调节类似这种氧匮乏引起的DosR基因增强转录的效应。
本领域的技术人员熟悉对生物进行遗传工程改造以上游调节选定的目的基因，或选定的目的调节子。这些改造方法包括但不限于调节子的超表达、改变了组成型激活的调节子或感应子的突变体的引入、与上述调节子功能类似的调节子的引入、可激活感应子或调节子的激酶或反馈回路产物的引入、或类似可引起感应子或调节子激活的环境因素的基因/基因产物的引入。在优选方案中，DosR调节子通过DosRST的“二元”调节系统的响应调节子DosR(Rv3133)的超表达被上游调节。
在另一优选实施例中，疫苗包括Rv1908、Rv3873、Rv2780和Rv1349中一个或多个。这些是在芯片(in silico)和/或通过实验识别的有效免疫抗原。
此外本发明的rBCG可编码根据其他标准选定的抗原，比如在动物模型中显示有保护作用或抗原的表达是通过Mtb而非BCG(J Mattow et al.，Electrophoresis，22：2936-2946，2001，P.R.Jungblut，Molecular Microbiology，33：1103-1117，1999，H.J.Mollenkopf et al，Infection andImmunity，72：6471-6479，2004)。在优选实施例中，本发明的rBCG表达Rv3407，正常情况下Rv3407通过Mtb而非BCG表达，并已在鼠模型中显示有保护对抗肺结核的作用。在此描述的遗传工程化的BCG可以是任何认为合适的BCG株，包括但不限于BCG株BCG1331、巴斯德BCG、东京BCG、哥本哈根BCG、莫罗(Moreau)BCG或莫斯科BCG。
在一优选实施例中，菌株为BCG1331。此外rBCG可进一步遗传工程化以包括其他特性，如：产气荚膜梭菌溶血素(perfringolysin)O(pfo)基因(以便于核内逸出)；以表达各种选择性标记如抗生素抗性或营养缺陷选择标记，其中，一rBCG关键基因(如亮氨酸或赖氨酸合成基因)被敲除，且必须互补(如，通过染色体外元件编码缺失的关键基因)以保证细菌的存活；通过基因的敲除或抑制细胞凋亡的基因产物的功能的抑制等。
一般来说，本发明的rBCG是遗传工程化的，通过将编码抗原的目的基因引入处于高效活跃表达控制序列转录控制的rBCG的染色体中以超表达选定的抗原，抗原可包括在哺乳动物感染中最活跃的。但是，编码目的抗原的基因同样会从处于高效活跃表达控制序列转录控制的染色体外质粒表达。控制序列的表达包括但不限于启动子、核糖体进入位点等。
本发明进一步提供一种用于在和/或接种哺乳动物中诱导免疫反应的组合物。该组合物可被用作对抗Mtb的疫苗。本发明的组合物包括在此所述的遗传工程化的rBCG，以及可接受的药用载体。这种用作疫苗的组合物的制备是本领域技术人员所熟知的。一般的，这种组合物要么被制成液态溶液，要么被制成悬浮液，但是固态，如药片、药丸、粉末等同样是可以预见的。在使用前适用于溶解，或悬浮在液体中的固态形式也是可以制备的。制备方法还可以是乳化。活性成分可以与可接受的且不与活性成分相反应的药用辅料混合。适当的辅料是，如，水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等或其组合。此外，组合物还可以含有少量的辅剂，如润湿或乳化剂，pH缓冲剂等。此外，组合物可包含其他佐剂。如果要求使用口服形式的组合物，可增加各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂等。本发明的组合物可包含任何辅料以提供一种适合应用的组合物形式。制剂中rBCG的最终量是可变的。但是，一般的，制剂中的量将为大约1-99％。组合物可进一步包含辅助佐剂，其适当的例子包括但不限于Seppic、QuilA、氢氧化铝(Alhydrogel)等。
疫苗制剂同样包括确定整个制备过程中最大细菌活力和稳定性的研究。这包括培养过程中利用各种普遍使用的分枝杆菌用培养基最大生物活力(活的或死亡的)的确定，到包括甘油、糖、氨基酸以及洗涤剂或盐的添加量。在培养的细胞通过离心或切向过滤收获后，再悬浮于在冷冻或冷冻干燥过程中可以保护细胞稳定剂中。普遍使用的稳定剂包括谷氨酸钠、氨基酸、氨基酸衍生物、甘油、糖或普遍使用的盐。最终制剂将提供足够活性和稳定性的生物，以通过真皮内注射、经皮注射、输液或口服输入，以维持并提供足够的保质期用于配送和使用。
本发明的方法包括将一种包括存在于而言一可接受的药用载体的本发明的rBCG的组合物施用于一目的，通常为人类。本发明的疫苗制剂可以通过许多适当方法中的任何一种施用，这些方法是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于注射、经口、经鼻，通过包含抗原的食品摄取等。但是，在一优选方案中，施用方式为真皮内注射。此外，组合物可以单独施用或与其他药剂或免疫原组合物联合使用，如作为多元疫苗的一部分。进一步的，施用可以是单一事件，或可以以多个时间间隔施用多个加强剂量以加强免疫反应。在一个实施例中，本发明的疫苗制剂被用于初次免疫，接受初次疫苗个体然后使用一种或多种不同的疫苗组合物，如现有的稀释卡介苗“加强”。作为替换，个体可接种另一种疫苗制剂，并使用本发明的疫苗制剂加强一次或多次。在本发明的一些实施例中，加强组合物包括编码一种或多种Mtb抗原的核酸，例如：i)一种或多种抗原，比如Rv1738、Rv2623、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2005c、Rv3127、Rv1733c、Rv1996、Rv2628、Rv0079、Rv3130c、Rv3131、Rv1813c、Rv2006、Rv2029c、Rv2627c、Rv2030c、Rv2629、Rv2450c、Rv1009、Rv0867c、Rv2389c、Rv1884c、Rv0288、Rv0685、Rv0824c、Rv2744、Rv3347c、Rv1130、Rv1169c、Rv1886、Rv1980c、Rv3804c、Rv3875、Rv1926c、Rv0467、Rv3873、Rv1908c、Rv1174c、Rv2780、Rv2620c、Rv1793、Rv1349和Rv3132；ii)一种或多种抗原，比如Rv1996、Rv2005、Rv2029、Rv2623、Rv2626和Rv2727；iii)一种或多种抗原，比如Rv2626、Rv1738、Rv2623、Rv1733、Rv2032、Rv3131、Rv3127、Rv3130c、Rv3804c和Rv1886c；以及iv)包括dosR抗原、再活化抗原和/或复苏抗原中至少一个的一种或多种抗原，如M.tuberculosis生命周期的每一阶段(潜伏、再活化和复苏)的一个抗原。
本发明疫苗制剂的突出优势是其施用可以是预防性的，即在暴露于细菌发生之前，或怀疑已发生，或在发生之后，即在已知或怀疑暴露之后，或治疗性，如与细菌感染有关的症状发生之后。这是因为与Mtb生命周期或感染和疾病进展，如复苏和再活化相关的抗原都被引入了疫苗。因此，该疫苗不仅可用于防止Mtb感染的初始的形成，还可用于防止潜伏Mtb感染的再活化。
在作用一种疫苗施用于人类之前，本遗传工程化的rBCG菌株根据本领域技术人员所熟知的方法进行测试。例如，在适当的动物模型，如在老鼠、豚鼠等进行毒性、致病性、安全性等测试，部分动物是免疫功能缺陷的。疫苗制剂诱导免疫反应的能力，一般同样在适当的动物模型，如老鼠、豚鼠等进行测试。此外，与接种有关的保护性研究、加强，以及后续的活Mtb测试也可以使用适当的动物模型比如老鼠豚鼠，以及非人类灵长动物中进行。最后，本领域的技术人员熟知如何在人类的知情同意下安排进行临床试验，以测试疫苗制剂的效力。细节方面，请参考，如2006年6月8日公开美国专利申请20060121054(Sun等人)，及其引用的参考。
“诱导免疫反应”意味着施用本发明的疫苗制剂引起特定抗体的合成(使用效价在1到1x106之间，优选的1x103；更佳在约1x103到约1x106，最佳大于1x106)和/或细胞性增殖，根据检测，如通过细胞实验，确定其中IFN-γ的产生量，例如，通过引入3H胸腺嘧啶，或其他适当的途径。
在本发明的一个优选实施例中，免疫反应是一种保护性免疫反应，即免疫反应保护接种过的个体在以后免受Mtb的感染。但是，本领域的技术人员会认识到疫苗或免疫刺激制剂不必提供全面防护，以给患者带来好处。例如，制剂可诱导减缓或减轻疾病症状的进展的免疫反应，而不完全治愈。
以下是足以解释本发明操作非限制性例子。
实施例
实施例1.适当抗原的选择和根据这一选择的rBCG的设计
起始的一组Mtb蛋白(189个抗原，见表1)从可能的3989个Mtb ORF选出，依据的选择过程如下：
(1)所有3989个TB ORF产物现有数据的编辑：挖掘文献以进行整体分析(如各种条件下，如缺氧、休眠表达的上/下游调节，与巨噬细胞的相互作用，在肺组织的位置和持续性；铁调节；转录组学和蛋白组学框架；引起毒性降低的突变；潜在的高免疫反应等)。
(2)通过交叉配对积累的数据确定基因的子集：选择那些在起始于上述不同标准的两个独立研究中显示有阳性证据的抗原。
(3)反复修正上述子集，根据独立研究公开的效力程度，确定候选者初始组(表1，189个抗原)。
(4)进行生物信息学研究以：
a)通过区域分析、细胞定位的预测、基因组内容观察、重复蛋白的识别，以及未知/假设Ag推定功能的确定(通过使用BLAST对nr数据库、NCBI、区域/基序(motifs)数据库，以及Mtb相关服务和数据库：TB-sgc-TB Structural Genomics Consortium(网址为www.doe-mbi.ucla.edu/TB/)、Tuberculist-结核分枝杆菌遗传相关数据库(网址为genolist.pasteur.fr/Tuberculist/)、TBDB-一个用于TB药物开发的整合平台(网址为www.doe-mbi.ucla.edu/Services/MTBreg/)以及BioHealthBaseserver(网址为www.biohealthbase.org/GSearch)进行序列类似性搜索)进一步表征初始的189个候选基因。
b)进行免疫信息学分析，以预测人类白细胞抗原(HLA)的结合目标(通过NetCTL)和通过数据库(IEDB)及文献检索试验性证明的T细胞抗原决定簇。使用各种检测，用于推定为强结合子的抗原决定簇的确定，以及用于根据预测(如，阈值、父型的数目/总体覆盖率)得到的大部分有效候选者的选定。
(5)对文献进行深度检索以得到189个抗原(表1)和/或其真系同源基因(orthologs)与致病性和疫苗开发有关的数据。
(6)通过集合所有的文献和数据分析(上述步骤4、5)建立189个候选者(表1)知识库。
在初始组中选定的抗原列于表1中，包括现有的疫苗候选者，以及已知：与Mtb生命周期的多个阶段(休眠、再活化、复苏)有关；组织特异性抗原；受饥饿影响的抗原；以及起始存在于致使Mtb株的基因组序列的抗原。
189候选抗原按以下14个分析得到的可能的重要性进行排序：
1)巨噬细胞幸存/持续；
2)通过MprAB二元系统表达的上游调节；
3)对氧缺乏的响应；
4)与再活化的相关性；
5)与休眠的相关性
6)在肺组织的表达；
7)与Rv2031(Acr)的共调节；
8)蛋白是否是分泌的；
9)作为B细胞免疫原的能力；
10)铁调节基因；
11)细胞壁相关或细胞壁发生；
12)存活疫苗的效力数据；
13)重复区的存在；
14)T细胞响应，通过a)已知的实验证据(如源自文献)以及b)通过丹麦科技大学的免疫信息学程序(cbs.dtu.dk/services/NetCTL)判定抗原是否含有一个或多个T细胞抗原决定簇确定；
189个基因中的每一个，这些特征中每一个存在与否都被评分，得到质量分，质量分被用于对189个基因进行排序和选择最佳的45个的尺度。
45个候选基因然后进一步使用同样的13个标准，通过指定每一个标准的内部权重，根据结果的强度和/或与疫苗开发的相关度进行排序。顶级排序的45个抗原的清单列在表2中，一起的还有其根据感染的分类/阶段(潜伏/休眠、复苏/再活化、传统的以及其他)得到的次级分组；在这些组中，抗原依据其分值排序。表3中列出的45个抗原，主要根据其质量分，次要其数量分优化为3个子组。
根据这一分析，用在rBCG中的抗原的最终组得以确定，通常选择总分最高的抗原。此外，作为最终的选择，抗原根据“型”进行分组，在rBCG中包括至少
一种或多种Mtb抗原，包括所谓的“传统的”Mtb抗原，比如85A、85B和TB10.4；以及至少一个选自Rv0867c、Rv1009、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450c、Rv0867c、Rv0288、Rv1009、Rv0685、Rv0824c、Rv1349、Rv2744c、Rv3347c、Rv1130和Rv1169c的Mtb复苏/再活化抗原。
此外，基于其他标准如在动物模型中显示有保护效应、抗原的表达通过Mtb而非BCG或抗原在BCG的表达减少选择抗原(J Mattow et al.，Electrophoresis，22：2936-2946，2001，P.R.Jungblut，Molecular Microbiology，33：1103-1117，1999，H.J.Mollenkopf et al，Infection andImmunity，72：6471-6479)。这种Mtb特异性抗原包括Rv1511、Rv2520c、Rv3407、Rv2802c和Rv3710。
用于在rBCG中表达的抗原的优选组合包括以下：
1)传统抗原Rv1886c、Rv3804c；
2)复苏和再活化抗原Rv0867c、Rv1884c、Rv2389c；以及
3)Mtb特异性抗原Rv3407。
实施例2.构建遗传工程化的重组BCG，以表达至少一个传统的Mtb抗原、至少一个Mtb复苏/再活化且其中的DosR调节子是上游调节的。
材料和方法：基本
在下文描述的rBCG的构建中，限制性核酸内切酶(以下称为REs)(New England BiolabsBeverly，MA)，T4 DNA连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)以及Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据生产商的操作手册进行使用；质粒DNA使用少量(QiagenMiniprepR kit，Santa Clara，CA)或大量(Qiagen MaxiprepR kit，Santa Clara，CA)质粒DNA纯化套装根据生产商的操作手册制备(Qiagen Santa Clara，CA)；无核酸酶分子生物学级Milli-Q水、Tris-HCl(pH7.5)、EDTA pH8.0、1M MgCl2、100％(v/v)乙醇、超纯琼脂糖，以及琼脂糖凝胶电泳缓冲液购自Invitrogen，Carlsbad，CA。RE消化酶、PCR、DNA连接反应和琼脂糖凝胶电泳根据公知的程序进行(Sambrook，et al.，Molecular Cloning：一本实验手册1、2、3；1989)；(Straus，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.Mar；87(5)：1889-93；1990)。验证下文所述每一个重组质粒的DNA序列的核苷酸测序，通过使用Applied Biosystems 373A型自动测序仪进行传统的自动化DNA测序技术完成。
PCR引物购自商业化供应商如Sigma(St.Louis，MO)或使用Applied Biosystems DNA合成仪(373A型)。PCR引物以150-250μM的浓度使用，PCR反应的退火温度由Clonemanager
Figure BPA00001182573500231
4.1版软件(Scientific and Educational Software Inc.，Durham NC)确定。PCR在BioRad热循环仪(BioRad，Hercules，CA)进行。用于扩增的PCR引物由软件CloneManager
Figure BPA00001182573500232
4.1版(Scientific and Educational Software Inc.，Durham NC)设计。RE酶切和接着的PCR通过标准程序(Straus et al，supra 1990；以及Sambrook et al.，supra 1989)的琼脂糖凝胶电泳进行分析。阳性克隆定义为显示适当RE图谱和/或PCR图谱。通过这一程序识别的质粒进一步使用如上所述的标准DNA测序程序进行评价。
大肠杆菌菌株，如DH5α和Stable2R，购自Invitrogen(Carlsbad，CA)，作为重组质粒的初始寄主。通过使用高压电脉冲设备如Gene Pulser(BioRad Laboratories，Hercules，CA)，如(Strausetal，supra 1990)所述，设置为100-200Ω、15-25μF和1.0-2.5kV，制造电穿孔将重组质粒引入大肠杆菌菌株。最佳的电穿孔条件通过确定引起每微克DNA/细菌最大转换率得以确定。
大肠杆菌菌株一般培养在传统的大豆琼脂(Difco，Detroit，MI)或大豆肉汤(Difco，Detroit，MI)中，培养基根据制造商的指南配制。除非另有声明，所有的细菌的培养条件均为37℃，5％(v/v)CO2、慢搅。需要时，培养基添加有抗生素(Sigma，St.Louis，MO)。菌株一般以-80℃，悬浮在(Difco)含有30％(v/v)甘油(Sigma，St.Louis，MO)，大约109菌落形成单位(在此称为cfu)每毫升的条件保存。
分支杆菌菌株培养在液体培养基，如Middlebrook 7H9或Saulton合成培养基，优选在37℃培养。菌株可以静态或动态培养。此外，BCG的生长率可以通过添加油酸(0.06％v/v；研究诊断商品目录号：01257)和洗涤剂如Tyloxapol(0.05％v/v；研究诊断商品目录号：70400)提高。BCG的纯化培养可以通过将100微升在磷酸盐缓冲液(在此称为PBS)梯度稀释(如每步10倍至10-8)的BCG培养物的小份平均散布在含有25-30ml固体培养基的3.5英寸培养皿上进行评价，固体培养基可以是Middlebrook 7H10。此外，培养的纯化度可以进一步使用可购得的培养基如巯乙酸培养基(科学实验商品目录号1891)和大豆酪蛋白培养基(BD，商品目录号211768)。
为了将所需的抗原表达片断插入产气荚膜梭菌溶血素的染色体中，表达他处所述的BCG1331衍生物，质量在芯片中进行设计，由DNA2.0(Menlo Park，CA)合成。这一载体(pJFINT)的显著特点包括E.coli的colE1复制起点、通过转录终止剂rrnBT1分离得到的3个多克隆位点、pEX18gm的T2，以及噬菌体L5的attP噬菌体整合区，以及rnhA，噬菌体L5的attP噬菌体整合区和噬菌体L5的整合酶基因(GenBank#Z18946)。L5序列的起始上游，包括有一个由源自Tn10(GenBank#AAM97345)卡那霉素抗性等位基因aphA和sacB基因(GenBank#NP_391325)构成的选择性标记框。标记框侧接有源自Tn1000转座子的γΔ游离酶结合位点同向重复序列。这一质粒在分支杆菌属中不能复制，L5attP序列使得与分支杆菌染色体的attB区的高频重组得以实现，以利于将质粒序列整合入染色体中。标记框然后可以通过在含有10％的蔗糖的固体培养基中引入γΔ游离酶和无标记菌株的选择从整合的染色体中敲除。
在芯片中设计抗原表达框以表达编码Rv0867c、Rv1884c和Rv2389c，通过优化处于Mycobacterium bovis的hsp60启动子的转录控制下的核糖体位点将抗原基因间隔，表达框由DNA2.0(Carlsbad CA)合成。类似的设计和构建第二表达框以编码处于hsp60启动子的转录控制下的Rv1886c、Rv3804c和Rv3407c。最后，设计和构建编码处于hsp60启动子的转录控制下的Rv3133c(DosR)的第三框。这3个抗原表达框连接至pJFINT，这样每一个表达框都由一个转录终止子分隔(图2)。得到的质粒，pRC108，被电融合至E.coliStable2，质粒序列的卡那霉素抗性克隆也被检验。
质粒从100ml E.coli培养基中分离，并电融合至丹麦BCG1331的pfo表达衍生物中。在电融合之后，细胞在含有10％(v/v)OADC并补充有0.05％(v/v)Tyloxapol的7H9培养基中培养过夜，7H9琼脂的表面含有50ug/ml的卡那霉素。因为质粒并不编码分支杆菌复制起点，所有菌落的卡那霉素抗性测试通过质粒整合进BCG基因组的attB位点得到确认。个别菌落被选择用于PCR分析，以及接种至含有10％(v/v)OADC和0.05％(v/v)Tyloxapol的7H9培养基中以进行抗原表达分析。卡那霉素抗性克隆的PCR特征显示在重组BCG的染色体中存在整个质粒序列，具体为AFV-102pRC108。AFV-102pRC108培养物使用7H9清洗，并用于接种至无蛋白的7H9Tyloxapol培养基。AFV-102pRC108培养物的上清通过离心收获，使用兔多克隆抗血清免疫固定至Rpf蛋白的葡萄糖转移酶区。Rv1009，与所有Rpf的葡萄糖转移酶区或兔多克隆抗Rv0867c肽血清交叉反应。这显示了Rv0867c、Rv1884c和Rv2389c的产量提高了，高于这些蛋白的BCG同族体的背景(图3A)。这一上清被类似地使用兔多克隆抗Ag85复合体血清进行免疫印迹分析，观察到Rv1886c和Rv3804c的超表达(图3B)。使用兔多克隆抗Rv3407血清对细胞团进行免疫印迹分析，证实了Rv3407的表达，而其同族体在BCG正常是沉默的(图3C)。同样可以使用DosR特异性兔多克隆抗血清对细胞颗粒进行免疫印迹分析，以证实DosR本身的超表达，使用兔抗Rv1733c血清以证实DosR调节蛋白的上游调节作用(图3D)。
为了完成疫苗的构建，使其适用于人类使用，该整合质粒的标记框然后被敲除。可电融合的AFV-102prc108细胞与质粒pYUB870hyg电穿孔融合(electroporated)，质粒pYUB870hyg编码Tn1000的γΔ游离酶、一个sacB等位基因，以及潮霉素(hygromycin)抗性基因(GenBank#ABD64366)。卡那霉素和潮霉素双抗性转化体在7H10培养基中被筛选，并被接种至含有10％(v/v)OADC和0.05％(v/v)Tyloxapol并无抗生素的7H9液体培养基。生长七天后，液体培养物的稀释物涂布在含有10％蔗糖的7H10上，以选择其内的aphA-sacB标记已经消除且由于稀释以及抗sacB等位基因的选择而已遗失pYUB870hyg质粒的重组体。
蔗糖抗性转化体被选出，用于整合抗原框的PCR分析，并如前被接种至7H9液体培养基用于免疫印迹分析。PCR分析显示抗原表达框仍存在于染色体中，而潮霉素抗性标记和sacB基因已被消除。使用抗Rpf、Ag85复合体、Rv3407和DosR血清对上清和细胞团进行的免疫印迹分析证实从染色体切除标记框没有影响插入抗原框的表达。
菌株AERAS-407通过从AFV-102prc108移除抗生物抗性标记而被构建。
实施例3.免疫原性和通过在老鼠中接种AERAS-407诱导的防护的验证
为了显示由AERAS-407诱导的免疫反应以及验证其抗肺结核的保护效力，对4组10c57/BL老鼠皮下注射接种1)盐，2)BCG、3)BCG-PfoA或4)AERAS-407中的一种。组2、3和4中的老鼠获得5×105cfu的BCG或重组BCG。10周后，从每一组中取5只老鼠解剖用于免疫实验，其余的动物接种100cfu的雾化M.tuberculosis Erdman。
设计肽微阵列芯片以检测体液免疫反应。芯片固定有重复的50个氨基酸肽，这些肽源自Rv1886c、Rv3804c、Rv3407c、Rv0867c、Rv1884c、Rv2389c、Rv3133c的序列和所有BCG编码的DosR调节蛋白，DosR调节蛋白至少由超表达的DosR 2倍诱导(即有氧条件下，DosR调节的基因在BCG中组成表达DosR调节子的转录至少超过野生型母本2倍)。每一组的混合血清使用3个肽芯片在37℃下孵化1小时。芯片然后使用pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS清洗，并使用结合了羊抗鼠IgG血清(Abcam，Cambridge，MA)的异硫氰酸荧光素(FIFC)在37℃下孵化1小时。芯片然后再次使用PBS清洗，免疫荧光使用Genepix4000B阵列扫描仪(Molecular Devices，Sunnyvale，Sunnyvale，CA)读取。每一组3个芯片的每一个肽斑的值被平均。与未接种的老鼠或接种BCG或BCG-PfoA的老鼠相比，接种AERAS-407的老鼠对源自Rv1886c、Rv3804c、Rv3407c、Rv0867c、Rv1884c、Rv2389c的肽和DosR调节蛋白显示更强的抗体反应。
为检测由AERAS-407诱导的细胞免疫反应，摘取每一动物体的脾并均化。在多孔平板的R10培养基中，脾细胞浓度被调节至5x105个细胞/孔，并在37℃孵化3天，孔中添加有浓度为1μg/ml的纯化Rv1886c、Rv3804c、Rv3407c、Rv0867c、Rv1884c或Rv2389c。此外，每一老鼠的脾细胞孵化时添加有Rv2623和Rv3130，因为这些蛋白在DosR超表达菌株已知是高度上游调节的，且为常见的有效T细胞免疫原。培育3天后，从脾细胞培养物中收取上清，并通过ELISA确定分析在响应抗原刺激中产生的干扰素-γ。未刺激脾细胞的对照培养或PMA/PHA刺激的脾细胞被涵盖，分别用作阴性和阳性对照。
为量化接种AERAS-407提供的防护，在接种M.tuberculosis10周后，每一组中的5只剩余老鼠被解剖，并从每一动物体无菌收获肺和脾。肺和脾在PBS中被均化，稀释涂布在7H10琼脂上。培育4周后，计算每一动物肺和脾的M.tuberculosis菌斑数，并使用稀释因子矫正。这个值就是存在于每一动物的肺和脾中活结核菌的数量。与接种盐溶液相比，BCG接种一般会引起cfu/肺和脾数接近对数减少。接种AERAS-407引起存在于老鼠的肺和脾的Mtb更大的减少。
实施例4.第二遗传工程化的重组卡介苗的构建，以超表达选定的传统的肺结核抗原和DosR调节子
通过在attb位点整合至染色体，第二次组合的抗原(TB10.4、Ag85B、Ag85A和Rv3407)在rBCGAFV102菌株中同样超表达。这一构建与实施例2描述的构建Aeras407的方法类似。为整合这第二组抗原，如实施例2所描述的pJFINT的构建方法构建整合质粒pAF707(示意性描述在图4中)，其不同之处在于：潮霉素抗性基因用于取代卡那霉素抗性基因，且PBlaf启动子被用于驱动抗原TB10.4、Ag85B、Ag85A和Rv3407以超表达所需抗原。所有其它的常规材料和方法与实施例2描述的类似。得到的菌株标记为Aeras406。最终菌株进一步通过PCR，接着测序分析进行研究，以证实具有所需的基因型。菌株进一步通过SDS-PAGE分析和如实施例2(数据未显示)所述的免疫印迹测试，被证实超表达选定的抗原。
实施例5.非人类灵长类动物接种AERAS-407对肺结核的防护
AERAS-407的保护效力，特别是与防止潜伏性感染和疾病再活化相关的增强的能力，最好在恒河猴中测试，因为老鼠不会引起肉芽肿潜伏点，而人类和其它灵长类动物会。为评价AERAS-407在NHP的保护效力，4组6只重量和性别相当的恒河猴接种1)盐溶液，2)BCG1331，3BCG-Pfo，或4)AERAS-407。组2-4的每一动物分别通过真皮内注射接种5x105cfu的BCG或rBCG。接种15周后，所有动物通过呼吸道吸入接种大约300cfu的M.tuberculosisErdman。每月通过胸X光、体重、饮食、咳嗽、昏睡和对TB特异性蛋白的免疫反应评价所有动物的肺结核临床症状，连续评价6个月。所有在6个月的观察期中死亡的动物进行尸检，组织病理学和器官的Mtb量如实施例3所述进行测量。所有垂死的动物被人道地处死并类似的检测。接种6个月后，所有存活的动物被安乐死并进行尸检，用于确定其组织病理学和肺、肝和脾中的Mtb量。接种AERAS-407引起死亡、组织损伤的减少，在试验性的感染动物的肺中，活Mtb体的数量更低。
本发明已经通过其优选实施例进行了描述，本领域的技术人员将认识到，本发明可以在附加权利要求的精神和范围内进行修改实施。相应地，本发明不应当限定于上述的实施例，而应当进一步包括在本文提供的描述的精神和范围内的所有修改及其等同替换。

Claims (21)

1.一种重组卡介苗(BCG)，含有至少两条互不相同的核酸序列，每一核酸序列编码一种或多种超表达的基因，所述至少两条核酸序列包括
i)至少一个结核分枝杆菌(Mtb)抗原的第一核酸序列；以及
ii)编码至少一个不是DosR抗原的Mtb复苏或Mtb再活化抗原的第二核酸序列；且其中DosR调节子的至少一部分是上游调节的。
2.根据权利要求1所述的重组BCG，其中所述的2条核酸序列的一条或多条被整合至所述rBCG的染色体中。
3.根据权利要求1所述的重组BCG，其中所述至少2条核酸序列的一条或多条是染色体外核酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组BCG，其中所述至少一个Mtb抗原是85A。
5.根据权利要求1所述的重组BCG，其中所述至少一个Mtb抗原是85B。
6.根据权利要求1所述的重组BCG，其中所述至少一个Mtb复苏或再活化抗原选自Rv0867c、Rv1009、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450c、Rv0288、Rv0685、Rv0824c、Rv2744c、Rv3347c、Rv1130和Rv1169c。
7.根据权利要求1所述的重组BCG，其中所述至少一个结核分枝杆菌Mtb抗原选自Rv2623，Rv2626c，Rv2005c，Rv1996，Rv2029c，Rv2627c，Rv1908，Rv3837，Rv2780和Rv1349。
8.根据权利要求1所述的重组BCG，其中所述DosR调节子的表达是通过增强启动子活性而被上游调节的。
9.一种免疫目标对抗结核分枝杆菌Mtb感染或在所述目标诱导产生抗Mtb免疫反应的方法，包括括
给所述目标施用疫苗组合物，疫苗组合物含有
一种含有至少两条互不相同的核酸序列的重组卡介苗(BCG)，每一核酸序列编码一种或多种超表达的基因，所述至少两条核酸序列包括
i)至少一个结核分枝杆菌(Mtb)抗原的第一核酸序列；以及
ii)编码至少一个不是DosR抗原的Mtb复苏或Mtb再活化抗原的第二核酸序列；且
其中所述重组BCG中的DosR调节子至少一部分是上游调节的；
其中所述疫苗组合物以足够免疫所述目标对抗Mtb感染或在所述目标诱导产生抗Mtb免疫反应的量施用。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括施用含有一种或多种Mtb抗原的加强组合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种抗原选自Rv1738、Rv2623、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2005c、Rv3127、Rv1733c、Rv1996、Rv2628、Rv0079、Rv3130c、Rv3131、Rv1813c、Rv2006、Rv2029c、Rv2627c、Rv2030c、Rv2629、Rv2450c、Rv1009、Rv0867c、Rv2389c、Rv1884c、Rv0288、Rv0685、Rv0824c、Rv2744、Rv3347c、Rv1130、Rv1169c、Rv1886、Rv1980c、Rv3804c、Rv3875、Rv1926c、Rv0467、Rv3873、Rv1908c、Rv1174c、Rv2780、Rv2620c、Rv1793、Rv1349和Rv3132。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种抗原选自Rv1996、Rv2005、Rv2029、Rv2623、Rv2626和Rv2727。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种抗原选自Rv2626、Rv1738、Rv2623、Rv1733、Rv2032、Rv3131、Rv3127、Rv3130c、Rv3804c和Rv1886c。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种抗原包括至少一个Mtb生命周期每一阶段的抗原。
15.一种防止潜伏结核分枝杆菌Mtb感染患者体内肺结核症状复发的方法，包括给所述患者施用疫苗组合物，疫苗组合物含有
一种含有至少两条互不相同的核酸序列的重组卡介苗(BCG)，每一核酸序列编码一种或多种超表达的基因，所述至少两条核酸序列包括
i)至少一个结核分枝杆菌(Mtb)抗原的第一核酸序列；以及
ii)编码至少一个不是DosR抗原的Mtb复苏或Mtb再活化抗原的第二核酸序列；且
其中所述重组BCG中的DosR调节子至少一部分是上游调节的；
其中所述疫苗组合物以足以所述患者体内肺结核症状复发的量施用。
16.根据权利要求15所述的方法，进一步包括施用含有编码一种或多种Mtb抗原核酸序列的加强组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种抗原选自Rv1738、Rv2623、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2005c、Rv3127、Rv1733c、Rv1996、Rv2628、Rv0079、Rv3130c、Rv3131、Rv1813c、Rv2006、Rv2029c、Rv2627c、Rv2030c、Rv2629、Rv2450c、Rv1009、Rv0867c、Rv2389c、Rv1884c、Rv0288、Rv0685、Rv0824c、Rv2744、Rv3347c、Rv1130、Rv1169c、Rv1886、Rv1980c、Rv3804c、Rv3875、Rv1926c、Rv0467、Rv3873、Rv1908c、Rv1174c、Rv2780、Rv2620c、Rv1793、Rv1349和Rv3132。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种抗原选自Rv1996、Rv2005、Rv2029、Rv2623、Rv2626和Rv2727。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种抗原选自Rv2626、Rv1738、Rv2623、Rv1733、Rv2032、Rv3131、Rv3127、Rv3130c、Rv3804c和Rv1886c。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种抗原包括至少一个Mtb生命周期每一阶段的抗原。
21.一种重组卡介苗BCG，包括至少2条互不相同的核酸序列，每一条核酸序列编码一个或多个超表达的基因，
其中至少第一核酸序列选自Rv2450c、Rv1009、Rv0867c、Rv2389c、Rv1884c、Rv0288、Rv0685、Rv0824c、Rv2744、Rv3347c、Rv1130、Rv1169c；以及
其中至少第二核酸序列选自Rv1738、Rv2623、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2005c、Rv3127、Rv1733c、Rv1996、Rv2628、Rv0079、Rv3130c、Rv3131、Rv1813c、Rv2006、Rv2029c、Rv2627c、Rv2030c、Rv2629、Rv2450c、Rv1009、Rv0867c、Rv2389c、Rv1884c、Rv0288、Rv0685、Rv0824c、Rv2744、Rv3347c、Rv1130、Rv1169c、Rv1886、Rv1980c、Rv3804c、Rv3875、Rv1926c、Rv0467、Rv3873、Rv1908c、Rv1174c、Rv2780、Rv2620c、Rv1793、Rv1349和Rv3132；以及
其中DosR调节子的至少一部分是上游调节的。
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