CN103360480A

CN103360480A - 一种结核蛋白及其制备和应用

Info

Publication number: CN103360480A
Application number: CN2013103351838A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 殷月兰; 高云飞; 付红; 徐正中; 陈祥; 潘志明; 孙林
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明公开了一种针对牛结核病具有免疫原性的蛋白及其应用，本发明的针对牛结核病具有免疫原性的蛋白，为含有分枝杆菌BCG_2653c的重组蛋白，BCG_2653c的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明的重组蛋白可用于牛结核病检测试剂。

Description

一种结核蛋白及其制备和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种牛分枝杆菌抗原蛋白的制备方法。

背景技术

牛结核病（Bovine tuberculosis,BTB）主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人畜共患的慢性传染病，以病牛食欲下降，日渐消瘦，贫血，产奶减少等为特征。至今，牛结核病所造成的损失大于牛的其他各种疾病所造成损失的总和。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。每年，世界上大约有3百万人感染牛结核杆菌造成结核病。因此，世界卫生组织WHO就指出：“在那些还存在牛结核的国家中,人类始终受到它的威胁,除非着手消灭牛结核病,否则人类结核病的防制是不会成功的。”

目前为止，消灭牛结核的唯一方法是通过“检疫→扑杀”措施淘汰阳性牛，因此，准确而及时的诊断方法对该病的控制显得尤为重要。目前，用于牛结核病的检测方法，大体上可以归为三大类：（1）细菌学检测方法，如涂片镜检、细菌培养、动物试验等；（2）免疫学检测方法，如结核菌素皮内变态反应（TST）、IFN-γ释放试验等；（3）分子生物学检测方法，如PCR法、基因探针技术等。其中，TST是OIE唯一推荐并被世界各国广泛使用的牛结核病诊断方法。

当牛感染牛分枝杆菌时，少部分的牛会形成活动性牛结核病，而大部分的牛由于自身的免疫反应，迫使细菌进入一种休眠状态，从而控制疾病的进一步发展。但是当处于潜伏感染状态的牛年老或者免疫能力下降时，细菌就会活化，从而发展为活动性牛结核病。而到目前为止，还没有一种方法能够很好的区分活动性牛结核病以及潜伏期的牛结核病。因为与活动性牛结核病相比，潜伏期的牛结核病结核菌素皮内变态反应（TST）与IFN-γ释放试验都呈阳性，但是不表现出其他明显的临床症状。因此传统的检测方法不能很好的检测出处于潜伏感染状态的牛。

根据数篇文献的研究表明，DosR（Dormancy Survival Regulator）调控功能被认为是牛分枝杆菌在潜伏期的存活过程中起到了至关重要的作用。它能够控制48个基因的诱导活化，而这些基因是牛分枝杆菌在面对低氧、CO、NO等条件时，在体内适应并持留所必须的，BCG_2653c就是DosR调控编码的潜伏期抗原。根据相关文献表明，DosR调控编码的潜伏期抗原能够诱导潜伏期感染的患者产生比活动性结核病患者更强的特异性免疫应答，但是RD1区相关抗原则不明显。因此我们推论，BCG_2653c能够较好的区分活动性牛结核病以及潜伏期的牛结核病。

目前，国内尚未见到有关牛分枝杆菌BCG_2653c蛋白的研究及应用的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供克隆和表达牛分枝杆菌BCG_2653c蛋白的方法，以期能够提供一种较好的区分活动性牛结核病以及潜伏期的牛结核病的检测抗原蛋白。

一种针对牛结核病具有免疫原性的重组蛋白，为含有分枝杆菌BCG_2653c的蛋白。所述的的BCG_2653c的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明制备含有分枝杆菌BCG_2653c的重组蛋白的方法是：

从BCG的基因组中扩增出BCG_2653c片段，将胶回收后得到的BCG_2653c片段与pMD-20T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR与双酶切验证正确的阳性克隆测序；将测序正确的阳性克隆进行提取质粒，进而双酶切，回收目的片段，再与表达载体pET-30a连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR与双酶切验证正确，将阳性质粒转化至大肠杆菌DE3感受态细胞，通过IPTG诱导表达，得到包涵体蛋白，经蛋白变复性后，得到有活性的BCG_2653c蛋白。

本发明的重组蛋白可用于牛结核病检测试剂。

附图说明

图1是BCG_2653c的PCR扩增图；M.DL2000Marker，1.PCR产物BCG_2653c。

图2是pMD-20T-BCG_2653c的Kpn I与Hind III双酶切电泳图；M.DL2000Marker

1.PCR产物BCG_2653c，2.pMD20-T-BCG_2653c双酶切产物，m.λ-EcoT14Marker。

图3pET-30a-BCG_2653c双酶切结果；

M.λ-EcoT14Marker，1.pET-30a-BCG_2653c双酶切产物。

图4BCG_2653c蛋白SDS-PAGE分析；

M:蛋白Marker

1:IPTG诱导后的BL21(DE3)-pET30a空载体菌

2:IPTG诱导后的BL21(DE3)-pET30a-BCG_2653c裂解上清

3:IPTG诱导后的BL21(DE3)-pET-30a-BCG_2653c裂解沉淀。

图5是BCG_2653c Western blotting的DAB显色图；

M:蛋白Marker

1:BCG_2653c蛋白

2:IPTG诱导后的BL21(DE3)-pET30a空载体菌。

图6牛外周血淋巴中分泌特异性IFN-γ的细胞数。

具体实施方式

高保真Taq酶、限制性内切酶Kpn I、Hind III和T4 DNA连接酶购自Takara公司；氨苄青霉素购自上海华舜生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自Sigma公司；牛淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。

实施例1 基因工程菌的构建

1.1引物的设计

根据GenBank中BCG巴斯德株基因组DNA的BCG_2653c序列设计一对特异性的引物，引物由北京六合华大基因合成，采用引物如下：

BCG_2653c-F：5’-TTAATCGGTACCATGACCACCGCACGCGA-3’（SEQ ID NO:3）；下划线代表Kpn I酶切位点；

BCG_2653c-R：5’- ATAACCAAGCTTGATGATCCGAGGTCGCTAG-3’（SEQ ID NO:4）；下划线代表Hind III酶切位点。

1.2目的基因的PCR扩增、产物回收以及克隆载体的构建

采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取BCG巴斯德株基因组DNA，以其为模板，以BCG_2653c-F，BCG_2653c-R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL:

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，61℃退火40s，72℃延伸30s，30个循环，72℃再延伸10min。PCR产物用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳分离，如图1所示。以百泰克多功能DNA纯化回收试剂盒回收432bp的DNA片段后，与pMD20-T载体（购自大连宝生物工程有限公司）在16℃金属浴条件下连接过夜，转化DH5α感受态细胞，通过PCR与双酶切验证来筛选阳性克隆，结果见图2。将得到的阳性克隆送至南京金斯瑞测续，测续正确的质粒命名为pMD20-T-BCG_2653c。

1.3表达载体的构建与鉴定

pMD20-T-BCG_2653c经Kpn I与Hind III双酶切后，酶切产物用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳分离，用百泰克多功能DNA纯化回收试剂盒回收432bp的DNA片段后，与pET-30a载体（购自Novagen公司）在16℃金属浴条件下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过PCR与双酶切验证来筛选阳性克隆，结果见图3。将得到的阳性克隆送至南京金斯瑞测续，测序结果与SEQ ID NO:1相一致，其翻译的氨基酸序列也与SEQ ID NO:2一致。验证正确的质粒命名为pET-30a-BCG_2653c。

实施例2.BCG_2653c蛋白的表达、纯化及验证

2.1重组蛋白的表达及纯化

将实施例1构建的重组质粒pET-30a-BCG_2653c转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，通过PCR验证正确后，挑取阳性菌落（DE3-pET-30a-BCG_2653c）至卡那抗性的LB培养基中，37℃，180rpm过夜培养。第二天按1:100的比例接种至400mL新鲜的氨苄抗性的LB培养基中。待细菌生长至OD₆₀₀0.5时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，37℃诱导6h后，9000rpm离心10min收集细菌，菌体用100mL的PBS重悬，以此方法洗两遍，最后用40mL的PBS重悬，在冰浴条件下，充分超声波破碎后，于4℃条件下，10000rpm，15min收集上清与沉淀，以12%的SDS-PAGE检测，结果见图4，从图中可看出，在24kDa出现特异的，大量表达的蛋白条带。

可直接取细菌裂解上清液进行离子亲和层析纯化，具体操作步骤可参照NOVAGEN公司的Ni-NTA His Bind purification kit说明书进行操作，主要步骤为：吸取5ml的树脂填料装入蛋白纯化柱中，于4℃条件下自然沉降过夜。依次加入7.5ml的灭菌超纯水，12.5ml的1×ChargeBuffer，7.5ml的1×Binding Buffer，此时纯化柱的前处理已完成。将裂解上清液通过0.45mm滤膜以去除杂质，加入蛋白纯化柱中。上样结束后，再依次加入25ml的1×Binding Buffer，15ml的1×Wash Buffer，15ml的1×Elute Buffer，封住出口并静置20min，之后将蛋白收集到已编号的指行管内，并对每一管内的蛋白进行SDS-PAGE验证，确定每管蛋白的含量。以上步骤中，每一种试剂都要在上一试剂流到与株床相切的位置才可加入。2.2Western bloting鉴定

将复性好的蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，取出凝胶，量出长与宽，并剪出比胶的长与宽各短0.5cm的NC膜，剪出比胶的长与宽各短1cm的滤纸，将它们浸泡于转移缓冲液中，按滤纸—滤纸—凝胶—NC膜—滤纸—滤纸的结构，转移到电转仪中，转印结束后，取出NC膜，置于1%BSA—PBS封闭液中，封闭过夜。用含0.05%Tween20的PBS（PBST）室温振荡洗3次，用封闭液按1:1000稀释兔抗牛分枝杆菌阳性血清作为一抗，室温振摇3h；用PBST洗5次，每次5min；用封闭液按1:3000稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为二抗，室温振摇1h；用PBST洗5次，每次5min；最后将NC膜浸于DAB（3,3—二氨基联苯胺）溶液中显色，用蒸馏水冲洗终止反应，结果见图5。

实施例3牛IFN-γ的ELISA与ELISPOT检测

3.1牛IFN-γ的ELISA试验

去江苏某奶牛场，采集待检测牛的5ml肝素抗凝全血，室温运抵实验室。根据Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for Cattle试剂盒说明书进行试验：具体步骤为：首先将血液样品按每孔1.5ml加入24孔组织培养板，每份血样分装5个孔，分别加入PBS，禽PPD，牛PPD进行刺激，37℃培养箱孵育24h。吸取上清至预处理过的96孔板中，加入酶标显色抗体室温孵育1h；洗涤6次后加入TMB显色底物，室温避光孵育30min，加入终止液；终止后5min内，以OD₄₅₀读出结果。

3.2牛的外周血单核细胞的分离

首先在无菌条件下，将牛的抗凝全血与等量的PBS混合。将倍比稀释后的牛的抗凝全血缓慢的与牛淋巴细胞分离液按1:1稀释，2000rpm常温离心30min。离心后，离心管中细胞由上而下分为4层，第一层为胎牛血清层，第二层即为我们所需要的乳白色的淋巴细胞层，第三层为分离液层，第四层为红细胞层，小心吸取淋巴细胞层至新的离心管中，在4℃条件下1000rpm离心10min。去除上清，加入适量的PBS重悬细胞，在4℃条件下1000rpm离心10min。加入适量的红细胞裂解液，作用2min左右，再加入3倍体积的PBS终止反应，在4℃条件下1000rpm离心10min。用PBS洗两遍后，最后用1mL的PBS重悬。于细胞计数仪（BD）下计数，计算后得出细胞数。

3.3牛IFN-γ的ELISPOT试验

按照牛IFN-γELISPOT检测试剂盒（购自瑞典Mabtech AB公司）说明书进行，包括下列步骤：首先用灭菌的PBS将包被抗体稀释至浓度为7.5μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜。次日，弃去孔内的溶液，每孔加入200μL灭菌的PBS溶液，洗板5次，每次5min。然后每孔加入含有10%小牛血清的DMEM培养基200μL，37℃封闭2h。弃去孔内的培养基，每孔加入200μL的灭菌PBS，洗板3次，每次5min。每孔分别加入不同的刺激剂：阳性对照为禽PPD（10μg/mL），牛PPD(10μg/mL)；CFP-10-ESAT-6（5μg/mL），以及通过上述实例获得的BCG_2653c（10μg/mL），同时设立阴性对照与空白对照孔，每孔加入2.5×10⁵个细胞，混匀，37℃刺激48h。弃去细胞，每孔加入200μL PBS，洗板5次。用含有0.5%小牛血清的PBS溶液稀释检测抗体至0.25μg/mL，每孔加100μL，室温孵育2h。每孔加入200μL PBS，洗板5次。用含有0.5%小牛血清的PBS溶液按1:1000稀释链亲和素-ALP，每孔加100μL，室温孵育1h。每孔加入200μL PBS，洗板5次。每孔加100μL的BCIP/NBT显色液，待孔里有斑点出现时，加入蒸馏水终止反应。加ELISPOT板放入读板仪（Biosys）中，读出每孔的斑点数。

我们对相关的数据进行了比较分析，结果如图6所示：将结果分为了3种情况。由于目前还没有牛IFN-γELISPOT方法对于牛结核病的判定标准，因此，本研究根据检查人IFN-γELISPOT方法对于结核病的判定标准，即阳性标准为刺激组斑点数－阴性对照组斑点数≥6个，根据这个标准来判定牛结核的感染情况。由A图可以得知，IFN-γ释放试验为阴性，以CE蛋白和BCG_2653c蛋白刺激的ELISPOT试验也为阴性，因此，推断这批牛为阴性牛。由B图可以看出，IFN-γ释放试验为阳性，以CE蛋白刺激的ELISPOT试验也为阳性，而BCG_2653c蛋白刺激的ELISPOT试验则为阴性，由于BCG_2653c蛋白属于潜伏期大量表达蛋白，在活动性结核病中表达量低，因此推断这批牛为活动性牛结核感染。由C图可以看出，IFN-γ释放试验为阳性，以CE蛋白和BCG_2653c蛋白刺激的ELISPOT试验也为阳性，并且CE蛋白刺激的斑点数要多于BCG_2653c蛋白刺激的斑点数，根据相关文献报道，以RD1区抗原刺激的斑点数多于潜伏期抗原刺激的斑点数，因此，推断这批牛处于潜伏感染状态。将上述结果进行统计并归纳，如表1所示。

表1.IFN-γ释放试验与ELISPOT判定结果总结

注：Rv2626c即为BCG_2653c。

本发明应用基因工程技术，构建了一种可高效表达BCG_2653c蛋白的基因工程菌Esherichia coli（DE3-pET30a-BCG_2653c）。该菌可在IPTG的诱导下能够大量表达BCG_2653c蛋白，并创建了对该蛋白纯化，复性的方法。

本发明还将获得的BCG_2653c蛋白进行Western-blotting实验。一抗为兔抗结核分枝杆菌阳性血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，显色剂为DAB，结果显示BCG_2653c蛋白能够与结核分枝杆菌的阳性血清发生特异性的血清学反应。

本发明以BCG_2653c蛋白作为刺激源，通过与CFP-10-ESAT-6蛋白的测定结果比较，BCG_2653c蛋白可以较好的区分活动性牛结核，潜伏感染状态的牛和阴性牛，说明BCG_2653c蛋白在牛结核病检测方面具有较好的应用前景。

Claims

1.一种针对牛结核病具有免疫原性的重组蛋白，为含有分枝杆菌BCG_2653c的蛋白。

2.如权利要求1所述重组蛋白，其特征在于，BCG_2653c的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，通过下述方法得到：从BCG的基因组中扩增出BCG_2653c片段，将胶回收后得到的BCG_2653c片段与pMD-20T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR与双酶切验证正确的阳性克隆测序；将测序正确的阳性克隆进行提取质粒，进而双酶切，回收目的片段，再与表达载体pET-30a连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR与双酶切验证正确，将阳性质粒转化至大肠杆菌DE3感受态细胞，通过IPTG诱导表达，得到包涵体蛋白，经蛋白变复性后，得到有活性的BCG_2653c蛋白。

4.权利要求1所述重组蛋白的制备方法，是：从BCG的基因组中扩增出BCG_2653c片段，将胶回收后得到的BCG_2653c片段与pMD-20T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR与双酶切验证正确的阳性克隆测序；将测序正确的阳性克隆进行提取质粒，进而双酶切，回收目的片段，再与表达载体pET-30a连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经PCR与双酶切验证正确，将阳性质粒转化至大肠杆菌DE3感受态细胞，通过IPTG诱导表达，得到包涵体蛋白，经蛋白变复性后，得到有活性的BCG_2653c蛋白。

5.权利要求1-3之一所述的重组蛋白在制备牛结核病检测试剂中的应用。