CN102175875B - 一种诊断结核病的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诊断结核病的检测试剂盒，它包含重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白为通过连接肽将ESAT-6、CFP-10和MPB64以任意顺序连接后获得的融合蛋白，其中所述的连接肽为不影响ESAT-6、CFP-10和MPB64免疫原性的短肽。优选地，诊断结核病的检测试剂盒中重组抗原蛋白为氨基酸序列为SEQ ID：No.1的抗原蛋白。本发明提供的检测试剂盒在诊断结核病时诊断需时短、快速，且敏感性强、特异性高，对结核病的早期诊断有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种诊断结核病的检测试剂盒，尤其涉及一种快速、特异性地诊断结核病的检测试剂盒。
背景技术
结核病是主要经呼吸道传播的、严重危害我国和全世界的重要传染病之一。据世界卫生组织，全世界有17-20亿的结核杆菌感染者，每年至少200万人死于本病(谢建平，结核分枝杆菌功能基因组研究的方法学，微生物通报.2001.28(5)：92-97)。因此，准确筛检感染者的方法在结核病的防治甚至最终的消灭中扮演极其重要的作用。
现有的诊断技术对结核杆菌感染者的诊断非常难。近几十年来，临床上采用结核菌素试验(TST)来诊断结核杆菌感染者。但TST活性成份是纯蛋白衍生物(purifiedprotein derivative of tuberculin，PPD)，是结核分枝杆菌培养上清液的粗提物，含有200多种成分，与BCG接种和环境分枝杆菌感染存在交叉反应。TST检测结果可被现在临床广泛使用的疫苗-卡介苗免疫所干扰[P.Andersen，et al.Lancet356(2000)1099-1104.]。从1921年及明卡介苗到现在为止，全山界已有35亿人接种卡介苗。因此TST对感染者的诊断价值受到很大的影响，导致TST诊断的准确性较低，因此我们无法根据其结果判断是否真正存在结核分枝杆菌感染。
对结核病病人的诊断技术中痰涂片抗酸染色或痰菌培养，培养困难，耗时较长；肺部x射线检查肺部病理改变也仅在具有典型的临床症状后才能诊断；其他血清学诊断方法和分子诊断方法缺乏特异性，假阳性率较高。有关研究人员指出，不同诊断性检查方法的敏感性和特异性如下：分支杆菌培养(分别为73％和100％)；PCR(分别为42％和100％)；胸部X线(分别为67％～77％和66％～76％)；结核菌素试验(分别为94％和20％)；血清学(分别为33％和87％)。由此可见，现有的诊断性检查方法的敏感性和特异性无法同时达到最优。因此，必须尽快研究结核病和结核杆菌感染者的早期、快速、特异和敏感的诊断方法。
结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人体的免疫系统识别，激活机体的T细胞免疫应答，分泌产生IFN-γ，后者发挥抗结核感染作用。部分T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次与结核杆菌相遇后，会再次分泌产生IFN-γ，发挥抗结核感染作用。抗原特异的IFN-γ产生量与机体是否感染或发病密切相关。因此，如果采用结核杆菌特异的抗原在体外刺激感染者和患者的T细胞，可诱导这些T细胞产生高水平的结核杆苘抗原特异的IFN-γ，而非结核杆菌感染者或非结核病患者产生的IFN-γ的量与未用抗原刺激产生的量相近，从而实现诊断的目的。由此可见，寻找并发现结核杆菌特异性抗原，对发展新一代的诊断试剂具有重要价值和意义。
1996年，Stover等通过减数杂交的方法确定了BCG在体外传代过程中丢失的域，定义为缺失区(Region of Difference，RD)，RD区域存在于结核分枝杆菌中，而在BCG和大多数环境分枝杆菌中缺失[程渝，李茂全.结核分枝杆菌的实验室诊断进展.国外医学临床生物化学和检验学分册.2002；23(6)：342-343.]。其中，RD1区域编码的早期分抗原靶6KD(early secreting antigen target 6KD，ESAT-6)和培养滤液蛋白10KD(cultufiltrate protein 10KD，CFP-10)是两种小分子量分泌蛋白，它们是T细胞的最主要的抗原之一，可以诱导较强的细胞免疫反应。另外，MPB64蛋白是结核分枝杆菌在生长繁殖中分泌的24KDa分子量的蛋白质，是一个有特殊作用的分泌蛋白，可导致强烈的迟发型超敏反应。MPB64蛋白主要存在于结核分枝杆菌复合菌群，非结核分枝杆菌极少数出现阳性，M.flavescens为弱阳性[乐军，梁莉，李苏辉，等.酶联免疫斑点试验快速诊断结核分枝杆菌感染的临床应用价值[J].中华检验医学杂志，2006，29(11)：1005-1008.]。然而，由于这些结核病特异诊断蛋白质的分子量较小，从结核杆菌的培养物中直接分离纯化较为困难，而且生产成本很高；尽管可采用肽合成的方法来进行生产，但肽合成的成本非常高，由此建立的临床应用试剂盒的成本大大增加。另外，通过基因工程技术单独获得上述抗原的表位，由于体外和体内的差异，表达的产物如国内外已经报道的，也容易因为形成包涵休而失去蛋白质的活性。
发明内容
针对现有诊断试剂的不足，本发明的目的在于提供一种敏感性和特异性高的诊断结核病的检测试剂盒，该检测试剂盒可实现对结核病病人或早期感染者的快速、特异的诊断，在阻断结核病的传播和流行，以及对结核病的控制具有重大意义。
为了实现本发明的上述目的，发明人通过大量试验研究，最终获得如下技术方案：
一种诊断结核病的检测试剂盒，包含重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白为以下任一一种连接有生物标签的融合蛋白：ESAT-6-连接肽-CFP-10、CFP-10-连接肽-ESAT-6、ESAT-6-连接肽-MPB64、MPB64-连接肽-ESAT-6、CFP-10-连接肽-MPB64、MPB64-连接肽-CFP-10、ESAT-6-连接肽-CFP-10-连接肽-MPB64、ESAT-6-连接肽-MPB64-连接肽-CFP-10、CFP-10-连接肽-ESAT-6-连接肽-MPB64、CFP-10-连接肽-MPB64-连接肽-ESAT-6、MPB64-连接肽-CFP-10-连接肽-ESAT-6和MPB64-连接肽-ESAT-6-连接肽-CFP-10，其中所述的连接肽为不影响ESAT-6、CFP-10和MPB64免疫原性的短肽。
为了进一步方便重组蛋白质的大规模生产，在上述串联蛋白质的基础加入一些纯化用生物标签，如组氨酸标签、GST标签、Trx标签等常用生物标签，这些标签可于蛋白质的N端及C端，标签的使用可方便重组蛋白质的大规模生产，可大幅降低试剂盒成本，降低临床检测费用。
上述的诊断结核病的检测试剂盒，其中所述的短肽的氨基酸序列为SEQ ID：No.3。
上述的诊断结核病的检测试剂盒，其中重组抗原蛋白优选氨基酸序列为SEQ ID：No.1的抗原蛋白。
另外，编码氨基酸序列为SEQ ID：No.1的核苷酸序列是SEQ ID NO：2。
氨基酸序列为SEQ ID：No.1的抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：SEQ ID NO：2序列保存于DH5α中，用NcoI、XhoI内切酶分别酶切DH5α和pET28b表达载体，回收SEQ ID NO：2序列片断和pET28b表达载体，在T4DNA连接酶作用下进行连接，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，转化子在液体LB培养基中培养，加入终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素培养，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃，200rpm，诱导表达8小时，将所表达重组蛋白收集、纯化即得。
本发明提供的上述检测试剂盒能够快速、特异性的诊断结核病。
本发明进一步研究了全血INF-γ释放分析方法，最佳刺激时间为37℃，10小时-30小时，更优的刺激时间为16小时-24小时。
本发明提供的诊断结核病的检测试剂盒具有以下进步性；
(1)与传统结核杆菌诊断相比，利用本发明提供的诊断结核病的检测试剂盒诊断需时短，诊断快速。传统结核杆菌培养诊断需时间1-2月，TST检测需要3天，本发明全部检测时间在1-2天内能完成。
(2)对结核杆菌能进行早期诊断。由于结核杆菌一旦感染人体，首先就被机体的免疫系统所识别，激活体液和细胞免疫应答，发生时间在感染后1-2个月，因此，利用本发明提供的检测试剂盒可快速做出诊断。X光片诊断只有在感染名肺部出现明显的病理改变后才可做出诊断，这通常需要很长的时间。抗原抗体检测也只有在疾病症状处于活动期的情况下检测，但环境中分枝杆菌广泛存在，其与结核杆菌的共同抗原，可干扰实验的诊断结果。
(3)敏感性强、特异性高。由于采用的是结核杆菌特异性的抗原，只与结核杆菌感染人体后产的免疫记忆T细胞起反应，因而产生的干扰素是结核杆菌抗原特异性的IFN-γ。采用本发明的诊断结核病的检测试剂盒进行刺激后检测，结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断的敏感性为100％，特异性高达95.7％，具有良好的诊断符合率。
(4)方便大规模生产，大幅降低患者诊断费用。
因此，本发明提供的诊断结核病的检测试剂盒对结核病的早期诊断有重要意义，因而对结核病的控制和消灭具有积极的意义。
附图说明
图1：含有ESAT6-CFP10融合蛋白的表达载体pET28b结构示意图
图2：ESAT6-CFP10融合蛋白在大肠杆菌中高效表达和纯化SDS-PAGE电泳图
1、蛋白质分子量标准11、17、26、34、43、55、72、95、130、170Da
2、诱导前细菌
3、诱导后细菌
4、诱导超声后上清
5、诱导超声后沉淀
图3：ESAT6-CFP10融合蛋白在大肠杆菌中高效表达和纯化WB电泳图
1、蛋白质分子量标准11、17、26、34、43、55、72、95、130、170Da
2、诱导前细菌
3、诱导后细菌
4、诱导超声后上清
5、诱导超声后沉淀
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1ESAT6-CFP10融合蛋白的目的基因的合成及表达载体的构建
人工合成的ESAT6-CFP10的DNA序列保存于DH5α中，再用NcoI、XhoI内切酶分别酶切DH5α和pET28b表达载体，回收目的片断和表达载体，在T4DNA连接酶作用下4℃连接16小时，用热休克法转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃培养过夜。挑取在平板生长较好的，具有典型大肠杆菌特征的菌落在液体LB培养基中培养，同时在培养基中加入终浓度为30μg/ml的卡那霉素，37℃，220rpm，培养3小时，提取质粒进行酶切和测序鉴定，酶图及测序图谱和预期相符合。载体构建图见图1。
实施例2重组蛋白ESAT6-CFP10串联表达在大肠杆菌中高效表达
挑取在平板生长较好的，具有典型大肠杆菌特征的菌落在液体LB培养基中培养，加入终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素培养6小时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃，200rpm，诱导表达8小时，收集菌体，SDS-PAGE电泳鉴定结果见图2。
实施例3重组蛋白ESAT6-CFP10串联的纯化
蛋白质纯化按Ni-NTA标准操作规程进行，简要步骤如下，取50ml菌液离心收集诱导表达的工程菌，用超声波将大肠破细胞，离心取上清，上清于Tris(50mM，pH8.0)缓冲液中透析过夜，离心取上清，直接上样于已用Tris(50mM，pH8.0)缓冲液平衡的Ni-NTA树脂中，用Tris(50mM，pH8.0)缓冲液洗脱平衡后，再用0-1M的咪唑梯度洗脱，收集洗脱峰，将洗脱峰合并，于Tris(50mM，pH8.0)缓冲液中透析过夜，透析液于真空冷冻干燥机中冻干即为ESAT6-CFP10冻干粉，-20--40℃保存备用。纯化的重组ESAT6-CFP10的SDS-PAGE鉴定图2和3，重组ESAT6-CFP10的分子量为21.8Kda，纯度高达95％以上。经BCA检测，回收效率达到200mg/L。
实施例4全血INFγ检测试剂盒-酶联免疫法
本发明按标准单克隆抗体筛选方法筛选抗INFγ的单克隆抗体，获得了两株针对INFγ的不同抗原簇的单克隆抗体，将其中一个抗体按一定浓度包被酶标板，4℃过夜，再37℃1-2小时封闭后，将酶标板冷冻干燥后，即为商业用酶标板，另外一株抗体按照标准方法标记生物素。将干扰素γ标准(1μg/ml)按要求稀释成标准曲线对照。根据实验要求，取合适的酶标板条，不用的酶标板或放入酶标板袋中，4℃-8℃继续保存，在对应孔中加入标准、阳性对照(干扰素γ标准：1ng/ml)、空白对照及待检样品(新鲜血液培养后的上清)，每孔50μl，再加入生物素标记抗体，每孔50μl，混合均匀，贴上封口胶，于37℃孵育30分钟。将20倍浓缩洗涤液用纯化水或双蒸水20倍稀释成洗涤工作液。弃去各孔中液体，每孔加入洗涤工作液250μl，静置数秒后弃去，重复5次，拍干。每孔加入亲和素标记辣根过氧化物酶100μl，贴上封口胶，置37℃温育30分钟。重复洗板步骤。每孔加入底物液100μl，混匀，置37℃避光温育15分钟。显色完毕后，每孔加入终止液50μl，振荡混匀，立即置酶标仪波长450nm(以空白孔调零)或双波长450nm/630nm下测定OD值。灵敏度为1pg/ml。
实施例5全血INFγ检测试剂盒-化学发光法
本发明按标准单克隆抗体筛选方法筛选抗INFγ的单克隆抗体，获得了两株针对INFγ的不同抗原簇的单克隆抗体，将其中一个抗体按一定浓度包被酶标板，4℃过夜，再37℃1-2小时封闭后，将酶标板冷冻干燥后，即为商业用酶标板，另外一株抗体按照标准方法标记生物素。将干扰素γ标准(1μg/ml)按要求稀释成标准曲线对照。根据实验要求，取合适的酶标板条，不用的酶标板或放入酶标板袋中，4℃-8℃继续保存，在对应孔中加入标准、阳性对照(干扰素γ标准：1ng/ml)、空白对照及待检样品(新鲜血液培养后的上清)，每孔50μl，再加入生物素标记抗体，每孔50μl，混合均匀，贴上封口胶，于37℃孵育30分钟。将20倍浓缩洗涤液用纯化水或双蒸水20倍稀释成洗涤工作液。弃去各孔中液体，每孔加入洗涤工作液250μl，静置数秒后弃去，重复5次，拍干。每孔加入亲和素标记辣根过氧化物酶100μl，贴上封口胶，置37℃温育30分钟。重复洗板步骤。每孔加入化学发光底物液50μl，混匀，化学发光检测仪里面稳定2min，测425nm光强度，检测时间1s。灵敏度为0.1pg/ml。
实施例6全血INFγ检测试剂盒-放射免疫法
本发明按标准单克隆抗体筛选方法筛选抗INFγ的单克隆抗体，获得了两株针对INFγ的不同抗原簇的单克隆抗体，将其中一个抗体按一定浓度包被酶标板，4℃过夜，再37℃1-2小时封闭后，将酶标板冷冻干燥后，即为商业用酶标板，另外一株抗体按照标准方法标记I125。将干扰素γ标准(1μg/ml)按要求稀释成标准曲线对照。根据实验要求，取合适的酶标板条，不用的酶标板或放入酶标板袋中，4℃-8℃继续保存，在对应孔中加入标准、阳性对照(干扰素γ标准：1ng/ml)、空白对照及待检样品(新鲜血液培养后的上清)，每孔50μl，再加入I125标记抗体，每孔50μl，混合均匀，贴上封口胶，于适当时间孵育后。用γ计数器检测数据。灵敏度为0.1pg/ml。
实施例7试剂盒灵敏度和特异性检测
采集50例确诊为结核病患者及20例健康未结核感染者的新鲜肝素抗凝静脉血3ml，各取1ml全血于无菌培养板中培养，1孔中加入重组ESAT6-CFP10(浓度为1-50μg/ml进行INFγ刺激，另一孔对照，37℃孵育20小时，离心收集上清，上清可于4℃条件保存数周，-20℃可保存一年，将上取100μl加入本公司开发的人INFγ检测试剂盒(酶标法)中进行检测，数据显示诊断结核感染者的敏感性为100％，特异性高达95.7％，同临床诊断结果比较，本试剂盒显示良好的诊断一致性。因此，本发明提出的结核病早期诊断的方法，必将在结核病和结核杆菌感染者的诊断应用上具有重要意义，具有良好的社会效益。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>武汉海吉力生物科技有限公司
<120>全血INF-γ的特异性抗原蛋白、其制备方法及用途
<160>3
<210>1
<211>204
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
MHHHHHHTEQ QWNFAGIEAA ASAIQGNVTS IHSLLDEGKQ 40
SLTKLAAAWG GSGSEAYQGV QQKWDATATE LNNALQNLAR 80
TISEAGQAMA STEGNVTGMF ANVAMAEMKT DAATLAQEAG 120
NFERISGDLK TQIDQVESTA GSLQGQWRGA AGTAAQAAVV 160
RFQEAANKQK QELDEISTNI RQAGVQYSRA DEEQQQALSS 200
QMGF 204
<210>2
<211>615
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atgcatcacc atcatcatca tacagagcag caatggaatt ttgccggcat agaggctgcc 60
gcctcagcaa tacaaggaaa tgtgacgtcc attcattcgt tacttgacga ggggaaacaa 120
tcgctaacaa aacttgcagc tgcctgggga gggagtgggt cggaggccta ccaaggagta 180
caacaaaaat gggacgccac ggcgactgag cttaataacg ctctccaaaa tctagcacga 240
acaatatccg aggctggaca agcgatggcc agtacagagg ggaatgtaac aggaatgttt 300
gccaatgttg ctatggcgga gatgaagact gacgctgcaa ctctagcaca agaagccgga 360
aattttgagc ggatatcagg cgatcttaag acgcagatag accaggtaga gtcgacagcc 420
ggatcacttc aaggacaatg gaggggagcc gctggcacag cggcccaagc tgccgtagta 480
aggtttcaag aggctgccaa taagcagaag caagagctag atgagattag tacaaacatt 540
agacaagccg gagttcaata ctcacgagcc gacgaggagc aacaacaggc gctatcgagt 600
caaatgggat tttaa 615
<210>3
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
WDATATELNN ALQNLARTIS EAGQAMASTE GNVTGMFANV 40
AMAE 44
Claims (3)
1.一种诊断结核病的检测试剂盒，其特征在于：包含重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白为以下连接有生物标签的融合蛋白：ESAT-6－连接肽－CFP-10，其中所述的连接肽为不影响ESAT-6和CFP-10免疫原性的短肽，所述的连接肽的氨基酸序列为SEQ ID：No.3。
2.如权利要求1所述的诊断结核病的检测试剂盒，其特征在于：所述的生物标签为组氨酸标签、GST标签或Trx标签。
3.如权利要求1所述的诊断结核病的检测试剂盒，其特征在于：氨基酸序列为SEQ ID：No.1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Detection kit for diagnosing tuberculosis Effective date of registration: 20131231 Granted publication date: 20130605 Pledgee: Optics Valley Wuhan venture capital fund Co., Ltd. Pledgor: Wuhan Hygiea Bioscience Co., Ltd. Registration number: 2013420000025 |
|
| PLDC | Enforcement, change and cancellation of contracts on pledge of patent right or utility model | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Detection kit for diagnosing tuberculosis Effective date of registration: 20131231 Granted publication date: 20130605 Pledgee: Optics Valley Wuhan venture capital fund Co., Ltd. Pledgor: Wuhan Hygiea Bioscience Co., Ltd. Registration number: 2013420000025 |
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| PLDC | Enforcement, change and cancellation of contracts on pledge of patent right or utility model | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20141219 Granted publication date: 20130605 Pledgee: Optics Valley Wuhan venture capital fund Co., Ltd. Pledgor: Wuhan Hygiea Bioscience Co., Ltd. Registration number: 2013420000025 |
|
| PLDC | Enforcement, change and cancellation of contracts on pledge of patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yu Dehua Inventor after: Huang Jun Inventor after: Zhao Pingfeng Inventor after: Chen Yinfang Inventor before: Yu Dehua Inventor before: Huang Jun Inventor before: Zhao Pingfeng Inventor before: Chen Yinfang |
|
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 430205 Building A82-1, Phase II Biomedical Park, 858 High-tech Avenue, Donghu Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province Patentee after: Wuhan Hygiea Bioscience Co., Ltd. Address before: 430205 Room 408, Block B1, Guanggu Biological City, 666 High-tech Avenue, Donghu Development Zone, Wuhan City, Hubei Province Patentee before: Wuhan Hygiea Bioscience Co., Ltd. |