CN103122033B - 一种嵌合重组抗原及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学、免疫学以及疾病诊断等领域。特别地，本发明涉及一种嵌合重组抗原，其包含分别衍生自结核分枝杆菌特异性蛋白Rv3875、Rv3874和TB7.7的3个抗原区，并且还涉及包含所述嵌合重组抗原的组合物以及所述嵌合重组抗原的用途。本发明还提供了使用所述嵌合重组抗原来体外检测特异性T细胞免疫反应的方法。本发明还提供了诊断患者是否被结核分枝杆菌感染的方法，其包括使用本发明的嵌合重组抗原。

Description

一种嵌合重组抗原及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学、免疫学以及疾病诊断等领域。特别地，本发明涉及一种嵌合重组抗原，其包含分别衍生自结核分枝杆菌特异性蛋白Rv3875、Rv3874和TB7.7的3个抗原区，并且还涉及包含所述嵌合重组抗原的组合物以及所述嵌合重组抗原的用途。本发明还提供了使用所述嵌合重组抗原来体外检测特异性T细胞免疫反应的方法。本发明还提供了诊断患者是否被结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染的方法，其包括使用本发明的嵌合重组抗原。
背景技术
利用抗原特异性T细胞的细胞免疫反应进行病原微生物感染的体外诊断，是近年来发展起来的一种新的检测方法。其实现方式主要有两种：一种是采集新鲜外周全血并直接进行刺激培养，然后利用ELISA检测血浆中的IFN-γ含量；另一种是分离新鲜全血中的外周血单核细胞(PBMC)并进行刺激培养，然后利用ELISPOT检测能够分泌IFN-γ的细胞的数量。
该方法目前主要应用于结核分枝杆菌感染的诊断。目前临床普遍采用的结核诊断主要依赖于临床症状、影像学诊断和病原学诊断，对结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断不敏感；同时，在结核筛查过程中，直接检测病原体或检测结核分枝杆菌抗体的灵敏度和特异性也不甚理想。
结核分枝杆菌潜伏感染者体内的初始T淋巴细胞在经过抗原刺激和活化之后，发生扩增与分化。初始T淋巴细胞主要分化为效应T细胞(effector T cell)和记忆T细胞(memory T cell)。特别地，当记忆T细胞再次接受APC递呈上来的相同抗原时，其能发生快速的增殖，并分泌细胞因子，其中就包含大量的IFN-γ等细胞因子。因此，通过利用这个过程在体外刺激T细胞，并观察细胞因子IFN-γ的分泌情况，可以确定受试者体内是否含有已致敏的T淋巴细胞，从而诊断受试者是否感染了结核分枝杆菌。
因此，通过用结核分枝杆菌特异性蛋白体外刺激受试者的外周血全血，然后测量细胞因子例如IFN-γ的水平，不仅能有效诊断出受试者的结核分枝杆菌感染情况，而且该方法不会受卡介苗(BCG)等影响，具有很高的特异性。
目前，国内外市场上以该方法为基础的诊断试剂盒主要有两种，分别是采用全血培养方式的Quanti-FERON Gold(Cellestis Limited；Carnegie，Australia)和采用PBMC分离刺激方式的T-Spot.TBELISpot(T-Spot；Oxford Immunotec；Abingdon，UK)。这两种方法所使用的刺激抗原都是CFP-10和esat6的肽段库。使用重叠肽段的库的优势在于抗原内毒素的含量易于控制，缺点在于肽段库中的表位不连续，且不同肽段的溶解性存在显著差异。另外，Quanti-FERON Gold利用采血管直接进行全血的刺激和培养，其优势是操作方便，缺点是采血时不能精确控制采血的量，这会对刺激效果产生较大影响，从而影响诊断结果的精确度和可靠性；T-Spot.TBELISpot则需要对PBMC进行分离培养，这对操作人员、设备和环境的要求比较高，不适合于在基层单位进行推广。
因此，本领域需要简单、方便并且具有高准确性和特异性的改进的诊断结核分枝杆菌感染的方法。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子生物学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“嵌合重组抗原”是指，通过将不同的蛋白或其片段(特别是包含表位的片段)融合而获得的重组蛋白。此类重组蛋白可以通过基因工程产生，也可以通过化学合成产生。
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“融合”可以是直接融合(即，将一个氨基酸序列的C末端通过简单的共价键与另一个氨基酸序列的N末端连接)，也可以是使用接头的融合(即，将一个氨基酸序列的C末端通过接头与另一个氨基酸序列的N末端连接)。根据本发明，术语“接头”是指用于连接两个分子(例如蛋白)的短肽。此类接头是本领域技术人员熟知的，例如IgG的绞链区，或由小氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸以各种长度和组合组成的多肽接头。例如，接头可以是以一定间隔被丝氨酸或苏氨酸间断的聚甘氨酸重复。例如，接头可以是Ser-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Ser-Ser，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。
如本文中所使用的，术语衍生自蛋白的“抗原区”是指，该蛋白中具有抗原性(即，能够引发免疫反应和/或被抗体识别)的片段，其通常是包含表位的片段。
如本文中所使用的，术语“结核分枝杆菌特异性蛋白Rv3875”或“Rv3875”是指来源于结核分枝杆菌的早期分泌抗原-6(ESAT-6)，其是本领域技术人员公知的，参见例如Andersen，P.，et al.，Lancet，2000.356(9235)：p.1099-104(其通过引用并入本文)，以及GENBANK登录号YP_178023。
如本文中所使用的，术语“结核分枝杆菌特异性蛋白Rv3874”或“Rv3874”是指来源于结核分枝杆菌的培养基滤过蛋白-10(CFP-10)，其是本领域技术人员公知的，参见例如Andersen，P.，et al.，Lancet，2000.356(9235)：p.1099-104(其通过引用并入本文)，以及GENBANK登录号NP_218391。
如本文中所使用的，术语“结核分枝杆菌特异性蛋白TB7.7”或“TB7.7”是指Ruhwald M，et al.，2007 Jun；9(7)：806-12(其通过引用并入本文)报导的能特异性刺激T细胞产生细胞因子的结核分枝杆菌特异性抗原Rv2654C，其GENBANK登录号参见例如P71951。
如本文中所使用的，术语“表达控制序列”是指实现基因表达所需要的控制序列，其是本领域公知的。表达控制序列包括但不限于，启动子序列，转录终止序列和增强子序列。
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预期的功能。例如，表达控制序列与基因编码序列的可操作的连接可实现表达控制序列对基因编码序列的表达的控制作用。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得扩增和/或表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
如本文中所使用的，术语“药学可接受的载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者或细胞以及活性成分相容的载体，其是本领域公知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences.Edited byGennaro AR，19th ed.Pennsylvania：Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于，pH调节剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如啮齿类动物(例如小鼠，大鼠)和灵长类动物(例如人)。
如本文中所使用的，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其通过引用合并入本文。
由于结核疫苗BCG的推广使用，以及环境中存在许多种属的分枝杆菌，因此，当在体外对全血或PBMC进行抗原刺激时，所选择的抗原的特异性决定了检测结果的特异性。在21世纪之前，研究者们普遍使用来自结核分枝杆菌的经纯化的蛋白衍生物(purified proteinderivation，PPD)进行体外刺激。PPD是一种来自结核分枝杆菌培养上清液的粗提物，其包含多种抗原，并且在不同种属的分枝杆菌间存在交叉反应性。因此，使用PPD进行体外刺激时，所获得的检测结果不能区分卡介苗接种者和结核分枝杆菌感染者。
在上世纪90年代后期，研究者们通过比较基因组学发现了结核分枝杆菌具备而卡介苗和其他分枝杆菌不具备的基因区域，并发现位于此区域的两个蛋白--早期分泌抗原-6(ESAT-6、Rv3875)和培养基滤过蛋白-10(CFP-10、Rv3874)--具有较强的T细胞表位(Andersen，P.，et al.，Lancet，2000.356(9235)：p.1099-104)。TB7.7(Rv2654C)是近年报导的能特异性刺激T细胞产生细胞因子的结核分枝杆菌蛋白(Ruhwald M，et al.，2007 Jun；9(7)：806-12)。这三种抗原都具有良好的T细胞表位，可以用于结核分枝杆菌抗原特异性T细胞体外检测。但在这三种抗原中，TB7.7的疏水性太强，其单独表达时溶解度不高，稳定性不好；而CFP-10抗原结合的内毒素不易去除，容易引起较高的本底刺激，影响检测结果的可靠性。
在本申请中，发明人创造性地将上述三种抗原(Rv3875、Rv3874和TB7.7)组合使用，利用衍生自这3种抗原的具有较强T细胞表位且序列保守性较强的区段构建了嵌合重组抗原。该嵌合重组抗原对结核分枝杆菌具有高度特异性，可用于体外检测结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应，从而可用于诊断受试者是否被结核分枝杆菌感染。
因此，在一个方面，本发明提供了一种嵌合重组抗原，其包含分别衍生自Rv3875、Rv3874和TB7.7的3个抗原区。
在一个优选的实施方案中，衍生自Rv3875的抗原区是包含Rv3875的第1-80位氨基酸残基(aa 1-80)的Rv3875蛋白片段。在一个优选的实施方案中，衍生自Rv3874的抗原区是包含Rv3874的第1-100位氨基酸残基(aa 1-100)的Rv3874蛋白片段。在一个优选的实施方案中，衍生自TB7.7的抗原区是包含TB7.7的第37-81位氨基酸残基(aa37-81)的TB7.7蛋白片段。
在另一个优选的实施方案中，本发明的嵌合重组抗原包含Rv3875的第1-80位氨基酸残基(aa 1-80)，Rv3874的第1-100位氨基酸残基(aa 1-100)以及TB7.7的第37-81位氨基酸残基(aa 37-81)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的嵌合重组抗原所包含的3个抗原区通过直接融合的方式连接在一起。
在另一个优选的实施方案中，本发明的嵌合重组抗原所包含的3个抗原区通过接头进行连接。此类接头是本领域技术人员熟知的，例如IgG的绞链区，或由小氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸)以各种长度和组合组成的多肽接头，例如，Ser-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Ser-Ser，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。此类接头的选择完全在本领域技术人员的能力范围之内。
在另一个优选的实施方案中，本发明的嵌合重组抗原还在其N末端和/或C末端包含标签。此类标签是本领域技术人员熟知的，例如，6×His标签、Myc标签、Flag标签、荧光蛋白标签等等。此类标签的使用使得嵌合重组抗原能够容易地被检测和纯化。例如，可使用金属螯合型色谱(例如，镍柱)对携带6×His标签的嵌合重组抗原进行快速纯化；可使用亲和色谱(例如，抗体)对携带Myc标签或Flag标签的嵌合重组抗原进行快速纯化；还可使用荧光显微镜对携带荧光蛋白标签的嵌合重组抗原进行方便地检测。此类标签的选择完全在本领域技术人员的能力范围之内。
在另一个优选的实施方案中，本发明的嵌合重组抗原是重组蛋白EC5，其具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了编码如上所定义的嵌合重组抗原的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸具有如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。
在另一个方面，还提供的是包含此类多核苷酸的构建体。任选地，此类构建体还包含限制性内切酶位点，以便于进行基因工程操作。任选地，此类构建体还包含与编码序列可操作地连接的表达控制序列。
在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含编码如上所定义的嵌合重组抗原的多核苷酸或者含有此类多核苷酸的构建体。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。
在另一个方面，还提供了包含本发明的多核苷酸或构建体或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含如上所定义的嵌合重组抗原，任选地还包含药学可接受的载体，例如缓冲剂。
在另一个方面，本发明涉及体外检测样品中的结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应的方法，其包括下述步骤：
1)用如上所定义的嵌合重组抗原刺激所述样品；和
2)检测经刺激后的所述样品中细胞因子的水平；
其中，与对照相比，经刺激后的样品中所述细胞因子的水平的升高表明，该样品中存在结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应，并且，所述细胞因子的水平的高低反映所述样品中结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应的水平的高低，
其中，所述样品是抗凝全血或外周血单核细胞(PBMC)。
在一个优选的实施方案中，所述细胞因子是IFN-γ和/或IL-2。
在一个优选的实施方案中，所述对照是未用所述嵌合重组抗原刺激的所述待检测的样品，和/或用所述嵌合重组抗原刺激的未感染结核分枝杆菌的样品或样品群体。
在一个优选的实施方案中，所述抗凝全血是用抗凝剂(例如肝素)抗凝的全血。在另一个优选的实施方案中，所述抗凝全血是新鲜采集的抗凝全血，例如，在采集后室温放置不超过12个小时，优选不超过10、8、6、4或2个小时的抗凝全血。在另一个优选的实施方案中，在进行步骤1)之前，用培养基(例如但不限于，RPMI-1640培养基和DMEM培养基)稀释抗凝全血。
在一个优选的实施方案中，所述嵌合重组抗原已去除了内毒素。在另一个优选的实施方案中，所述嵌合重组抗原包含在培养基(例如但不限于，RPMI-1640培养基和DMEM培养基)中。
在一个优选的实施方案中，在静置或非静置条件下，优选在静置条件下进行步骤1)的刺激。在另一个优选的实施方案中，在30℃-39℃，优选35℃-37℃，更优选37℃下进行步骤1)的刺激。在另一个优选的实施方案中，在可提供恒定温度的设备(例如但不限于，CO2恒温培养箱和恒温水浴箱)中进行步骤1)的刺激。在另一个优选的实施方案中，步骤1)的刺激进行11-39个小时，优选15-35个小时，优选20-30个小时，更优选20-24个小时。
在一个优选的实施方案中，所述方法还设置了阳性对照，其是用非特异性T细胞刺激原刺激的待检测的样品。在一个优选的实施方案中，所述非特异性T细胞刺激原是指能非特异性激活T淋巴细胞，使其增殖并释放细胞因子的化合物，包括但不限于，植物凝集素(PHA)和刀豆球蛋白A。在另一个优选的实施方案中，所述非特异性T细胞刺激原包含在培养基(例如但不限于，RPMI-1640培养基和DMEM培养基)中。
本发明的方法可用于非诊断和治疗目的。例如，本发明的方法可用于研究结核分枝杆菌的感染机制，机体抵抗结核分枝杆菌感染的免疫机制，机体抵抗结核分枝杆菌与其它传染性细菌/病毒的共感染的免疫机制，机体抵抗结核病与其它非传染性疾病的共患的免疫机制等。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否被结核分枝杆菌感染的方法，其包括使用如上所定义的嵌合重组抗原来检测获自所述受试者的测试样品中是否存在结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应，其中所述样品是抗凝全血或外周血单核细胞(PBMC)。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括下述步骤：
1)提供所述受试者的测试样品；
2)用如上所定义的嵌合重组抗原刺激所述样品；和
3)检测经刺激后的所述样品中细胞因子的水平；
其中，与对照相比，经刺激后的样品中所述细胞因子的水平的升高表明，该受试者被结核分枝杆菌感染。
在一个优选的实施方案中，所述细胞因子是IFN-γ和/或IL-2。
在一个优选的实施方案中，所述对照是未用所述嵌合重组抗原刺激的所述测试样品，和/或用所述嵌合重组抗原刺激的未感染结核分枝杆菌的样品或样品群体。
在一个优选的实施方案中，所述抗凝全血是用抗凝剂(例如肝素)抗凝的全血。在另一个优选的实施方案中，所述抗凝全血是新鲜采集的抗凝全血，例如，在采集后室温放置不超过12个小时，优选不超过10、8、6、4或2个小时的抗凝全血。在另一个优选的实施方案中，在进行步骤2)之前，用培养基(例如但不限于，RPMI-1640培养基和DMEM培养基)稀释抗凝全血。
在一个优选的实施方案中，所述嵌合重组抗原已去除了内毒素。在另一个优选的实施方案中，所述嵌合重组抗原包含在培养基(例如但不限于，RPMI-1640培养基和DMEM培养基)中。
在一个优选的实施方案中，在静置或非静置条件下，优选在静置条件下进行步骤2)的刺激。在另一个优选的实施方案中，在30℃-39℃，优选35℃-37℃，更优选37℃下进行步骤2)的刺激。在另一个优选的实施方案中，在可提供恒定温度的设备(例如但不限于，CO2恒温培养箱和恒温水浴箱)中进行步骤2)的刺激。在另一个优选的实施方案中，步骤2)的刺激进行11-39个小时，优选15-35个小时，优选20-30个小时，更优选20-24个小时。
在一个优选的实施方案中，所述方法还设置了阳性对照，其是用非特异性T细胞刺激原刺激的所述测试样品。在一个优选的实施方案中，所述非特异性T细胞刺激原是指能非特异性激活T淋巴细胞，使其增殖并释放细胞因子的化合物，包括但不限于，植物凝集素和刀豆球蛋白A。在另一个优选的实施方案中，所述非特异性T细胞刺激原包含在培养基(例如但不限于，RPMI-1640培养基和DMEM培养基)中。
在另一个方面，本发明提供了评价抗结核治疗效果的方法，其包括：
使用本发明提供的上述方法检测治疗前后和/或治疗期间，接受所述抗结核治疗的受试者全血中的结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应；
其中，与治疗前的结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应水平相比，治疗后和/或治疗期间的结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应水平的下降表明，所述抗结核治疗是有效的。
在另一个方面，本发明提供了如上所定义的嵌合重组抗原，其用于体外检测样品中的结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应，或用于诊断受试者是否被结核分枝杆菌感染。
在另一个方面，本发明提供了如上所定义的嵌合重组抗原或组合物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于体外检测样品中的结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应，或用于诊断受试者是否被结核分枝杆菌感染，或用于评价抗结核治疗效果。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含如上所定义的嵌合重组抗原或组合物。
在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还任选地包含一种或多种以下试剂：
1)用于检测细胞因子(例如，IFN-γ和/或IL-2)的水平的试剂；
2)采血装置，例如无热原真空采血管；
3)抗凝剂，例如肝素；
4)培养基，例如但不限于RPMI-1640培养基和DMEM培养基；和
5)非特异性T细胞刺激原，例如但不限于植物凝集素和刀豆球蛋白A。
发明的有益效果
本发明的特点在于建立了一套简单、实用的方法，其利用嵌合重组抗原体外特异性刺激外周血淋巴细胞以使其增殖和释放细胞因子，然后利用细胞因子定量检测试剂对释放的细胞因子进行定量，从而判断受试样品是否感染结核分枝杆菌感染。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)所涉及的操作简单、方便：例如，通过采集全血，将其分装至可密闭离心管并添加嵌合重组抗原，然后置于恒温培养箱中培养，即可完成对全血的刺激；
(2)对实验室条件、人员的技术能力、设备和环境的要求不高：无需分离PBMC，无需使用特定的CO2培养箱；
(3)对结核分枝杆菌的活动性感染和潜伏性感染都有良好的检出率，与传统的结核诊断手段(如TST、菌培、痰涂等)相比，具有较高的灵敏度和特异性，而且大大缩短了诊断所需的时间；和
(4)成本不高，适用范围较广。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1是包含重组蛋白EC5的编码序列的表达载体pTO-T7-EC5的结构示意图。
图2显示了SDS-PAGE分析的结果，其显示在大肠杆菌(E coil)er2566中高效表达后的经Ni-NTA柱纯化的重组蛋白EC5和经两步(Ni-NTA柱纯化和HPLC层析纯化)纯化的重组蛋白EC5。其中，泳道1代表蛋白质分子量标准，泳道2代表经Ni-NTA柱纯化的EC5蛋白，泳道3代表经两步纯化后的EC5蛋白。
图3显示不同用量的PHA刺激后细胞免疫水平的变化情况。其中，S1-S4为随机选取的4个健康人。
图4显示全血采集后在室温下静置的时间对特异性刺激的水平的影响。其中，S5和S6为随机选取的2个结核患者。
图5显示不同培养方式对特异性刺激的水平的影响。结果显示，静置培养下的刺激强度显著高于震荡培养下的刺激强度。
图6显示不同培养温度对特异性刺激的水平的影响。结果显示，培养温度为37℃时，刺激效果达到最佳。其中，S7和S8为随机选取的另外2个结核患者。
图7显示不同培养时间对特异性刺激的水平的影响。结果显示，在开始刺激后20-22小时(h)左右，刺激效果基本达到平台。
序列信息
本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列信息
序列1(SEQ ID NO 1)：
ATGCACCACCACCACCACCACATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAAT
CCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCT
GGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAAC
GCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTGGATCCATGGCAGAGATGAGAGCCGATGCCGCTAC
CCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGA
CGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAA
GAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATATTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTC
GAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGTCCTCGCAAATGGGCTTCGAATTCGGCGCATGGCGGACCGCGG
CCGTCGAGCTTGCGCGAGCGTTGGTCCGCGCTGTGGCGGAGTCGCACGGCGTCGCGGCCGTTTTGTTCGCCGCG
ACGGCCGCCGCGGCGGCGGCCGTCGACCGGGGTGATCCGCCGTAA
序列2(SEQ ID NO：2)：
MHHHHHHMTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNN
ALQNLARTISEAGGSMAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQ
EAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGFEFGAWRTAAVELARALVRAVAESHGVAAVLFAA
TAAAAAAVDRGDPP
序列3(SEQ ID NO：3)：
ttttCATATgCACCACCACCACCACCACATGACAGAGCAGCAGTG
序列4(SEQ ID NO：4)：
ttttGGATCCACCGGCTTCGCTGAT
序列5(SEQ ID NO：5)：
ttttCTGGGATCCATGGCAGAGATGAAGACC
序列6(SEQ ID NO：6)：
ttttGAATTCGAAGCCCATTTGCGAG
序列7(SEQ ID NO：7)：
ttttGAATTCATGAGCGGCCACGCGTTG
序列8(SEQ ID NO：8)：
ttttAAGCTTTTACGGCGGATCACCCCGGTC
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法(例如，分子生物学实验方法和免疫检测法)。参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates(1992)，其全部通过引用合并入本文。按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如在本领域内通常使用的或如本文描述的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.重组蛋白EC5的克隆、表达和去内毒素纯化
1、包含重组蛋白EC5的编码序列的表达载体的构建
a、目的基因片段的扩增
以结核分枝杆菌实验室标准毒株H37Rv的基因组DNA(香港大学吴文翰教授馈赠)为模板，分别使用下列引物PCR扩增目的基因片段：
对于编码Rv3875 aa 1-80的目的基因片段1，使用下列引物：
F：5′-ttttCATATgCACCACCACCACCACCACATGACAGAGCAGCAGAG-3′(SEQ ID NO：3)，
R：5′-ttttGGATCCACCGGCTTCGCTGAT-3′(SEQ ID NO：4)；
对于编码Rv3874 aa 1-100的目的基因片段2，使用下列引物：
F：5′-ttttCTGGGATCCATGGCAGAGATGAAGACC-3′(SEQ ID NO：5)，
R：5′-ttttGAATTCGAAGCCCATTTGCGAG-3′(SEQ ID NO：6)；
对于编码TB7.7 aa 37-81的目的基因片段3，使用下列引物：
F：5′-ttttGAATTCATGAGCGGCCACGCGTTG-3′(SEQ ID NO：7)，
R：5′-ttttAAGCTTTTACGGCGGATCACCCCGGTC-3′(SEQ ID NO：8)。
PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟(min)；94℃变性50秒(sec)，57℃退火50sec，72℃延伸1min，共扩增25个循环；最后再72℃延伸10min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳确认和分离，并利用试剂盒(Universal DNA Purification kit，TianGen)回收和纯化。
b、目的基因片段的融合和表达载体的构建
i、使用NdeI/BamHI分别双酶切pT0-T7载体(参见罗文新等，一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用，生物工程学报，(2000))和编码Rv3875 aa 1-80的PCR产物，将经酶切的PCR产物连接入经酶切的载体，获得含有目的基因片段1的载体；
ii、使用BamHI/EcoRI分别双酶切上一步获得的载体和编码Rv3874 aa 1-100的PCR产物，将经酶切的PCR产物连接入经酶切的载体，获得含有目的基因片段1和目的基因片段2的载体；
iii、使用EcoRI/HindIII分别双酶切上一步获得的载体和编码TB7.7 aa 37-81的PCR产物，将经酶切的PCR产物连接入经酶切的载体，获得目的表达载体pT0-T7-EC5。表达载体pT0-T7-EC5的结构示意图示于图1中。
2、重组蛋白EC5的表达与去内毒素纯化
将构建好的pT0-T7-EC5表达载体转化入大肠杆菌ER2566，将其涂布于含卡那霉素(Kan，终浓度100μg/ml)的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)上，并在37℃下静置培养至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至液体LB培养基(含100μg/ml卡那霉素)中，在37℃，180rpm下振荡培养8小时。然后将菌液转接至含500ml液体LB培养基(含100μg/ml卡那霉素)的培养瓶中，在37℃，180rpm下振荡培养。当培养瓶中菌液的OD600达0.6-0.8时，加入IPTG至0.2mM/L的终浓度并在37℃，180rpm下继续诱导培养4小时。然后以5000rpm离心培养物10min，收集菌体。
由于重组蛋白EC5用于刺激全血，因此需要去除蛋白产物中的内毒素。从菌体中纯化重组蛋白并去除内毒素的方法是本领域技术人员已知的。在本实施例中，使用下列示例性方法。
将收集到的菌体(获自20瓶×500ml/培养瓶)用200ml含20mMPB6.0(磷酸盐缓冲液，pH6.0，下同)，500mM NaCl的缓冲液悬浮，置于冰浴中并通过超声波进行破碎，然后以12000rpm离心10min，收集沉淀。
Ni-NTA柱纯化：将沉淀溶解至200ml 0.2％脱氧胆酸钠，PBS(磷酸盐缓冲液，150mM NaCl，pH7.4，下同)中，并利用Ni-NTA柱(Qiagen)进行纯化。简言之，将样品加载至Ni-NTA柱，用100ml的0.2％脱氧胆酸钠，20mM PBS洗涤，以去除部分内毒素；然后用200ml PBS洗涤，以去除脱氧胆酸钠；最后用100ml洗脱液(150mM咪唑，20mM PBS)洗脱目的蛋白。将洗脱后的目的蛋白透析至等体积的20mM PB7.0(磷酸盐缓冲液，pH7.0，下同)。
HPLC层析纯化：利用TSKGel DEAE-5PW柱(日本TOSOH公司)进行纯化。上柱缓冲液为20mM PB7.0，洗脱液为20mM NaCl，20mM PB7.0。将洗脱后的目的蛋白透析复性至PBS中。
在上述蛋白纯化过程中，所使用的缓冲液均由注射用水配制，所用实验容器均经200℃高温干烤2h以上。
利用SDS-PAGE检测经纯化的重组蛋白EC5，结果示于图2中。结果显示，重组蛋白EC5的分子量为约26KD，并且经过上述两步纯化后，重组蛋白EC5的纯度达95％以上。
使用鲎试剂检测经纯化的重组蛋白EC5中的内毒素。结果显示，经过上述两步纯化后，重组蛋白EC5中的内毒素已基本上被去除，其含量低于30EU/mg。
实施例2.非特异性T细胞刺激原的选择及其使用浓度的确定
在抗凝全血体外刺激培养过程中，存在某些因素(例如操作失误，受试者的细胞免疫水平较低等)，可导致在抗原刺激后细胞因子水平无变化，并且存在某些因素(例如，过高的刺激原浓度)，可导致免疫耐受的淋巴细胞也发生反应。因此，为了确保本发明方法的结果的准确性和可靠性，优选在实验过程中设置阳性对照。此类对照可以是用非特异性刺激原刺激的全血。
植物凝集素(PHA)和刀豆球蛋白A都具有较强的促进淋巴细胞转化的能力，能有效的刺激外周血中的T细胞并使其产生应答。因此，植物凝集素(PHA)和刀豆球蛋白A都可以用作非特异性刺激原，用于反映机体外周血T细胞的反应能力。
在本实施例中，示例性地将植物凝集素(PHA)用作非特异性刺激原，并确定了其使用浓度。简言之，使用不同浓度(在1ml全血中的浓度：5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的植物凝集素来刺激1ml全血(来自四个健康受试者，S1-S4)，并在37℃下静置培养22小时。然后，离心收集刺激后的全血血浆。然后，根据制造商的说明书，使用商购可得的HumanIFN-γ Elisa kit(BD公司)检测全血中的IFN-γ的水平。
将用植物凝集素刺激全血后产生的IFN-γ的水平对植物凝集素的浓度(用量)进行作图，结果示于图3中。结果显示，刺激水平(即，IFN-γ的水平)随刺激原浓度的升高而升高，并且仅在一定的刺激原浓度范围内线性变化。选取刺激水平在线性范围内且约为最大反应值的30％时的刺激原浓度为非特异性抗原PHA的使用浓度(参见图3)。
实施例3.采血管的选择
为了确保实验结果的准确性和可靠性，用于获得抗凝全血的采血管应包含抗凝剂，且内毒素含量低。多种市售可得的采血管可用于采集抗凝全血，例如BD公司生产的肝素锂真空采血管。
在本实施例中，使用BD公司生产的肝素锂真空采血管来采集健康受试者(N1)和肺结核患者(T1)的全血。然后，分别使用重组蛋白EC5来刺激上述2种全血样品(各1ml，重组蛋白EC5的终浓度为2μg/ml)，并在37℃下静置培养22小时。未经刺激原刺激的全血用作阴性对照。然后离心收集各样品(包括阴性对照)的全血血浆，并根据制造商的说明书，使用商购可得的Human IFN-γ Elisa kit(BD公司)检测全血血浆中的IFN-γ的水平。
结果示于表2中。结果显示，使用肝素锂真空采血管采集的全血可用于本发明的方法中。
表2
实施例4.全血采集后的放置时间的影响
分别从2个肺结核患者(S5和S6)采集新鲜外周全血。将采集的全血各自分成8个等分，并分别于室温下静置不同时间(0，1，2，4，6，8，10和12小时)；然后，分别使用重组蛋白EC5进行刺激(重组蛋白EC5的终浓度为2μg/ml)，并于37℃静置培养22h；室温静置对应时间的未经刺激原刺激的全血用作阴性对照；然后，离心收集各样品(包括阴性对照)的全血血浆；然后，根据制造商的说明书，使用商购可得的Human IFN-γ Elisa kit(BD公司)检测全血血浆中的IFN-γ的水平。
将全血中的IFN-γ的水平对全血采集后的放置时间进行作图，结果示于图4中。结果显示，随着放置时间的延长，全血特异性刺激水平(即，IFN-γ的水平)持续下降。当全血在室温下放置2小时以内时，刺激水平可以维持在未经室温放置(即，放置0小时)情况下的刺激水平(最高刺激水平)的80％左右；而当室温放置超过2小时时，刺激水平的下降速度显著加快，低于最高刺激水平的60％(见图4)。因此，为了确保实验结果的准确性和可靠性，并考虑到临床实际操作的问题，应优选在全血采集后2小时内，对全血进行刺激培养。并且，在本申请中，除非明确说明，否则所使用的全血样品均为采集后2小时内的全血样品。
实施例5.培养方式的选择
在本实施例中，使用来自肺结核患者的新鲜外周全血，比较不同培养方式(37℃震荡培养与37℃静置培养)对最终的刺激水平的影响。
简言之，分别从3个肺结核患者采集新鲜外周全血。将采集的全血各自分成2个等分，使用重组蛋白EC5进行刺激(重组蛋白EC5的终浓度为2μg/ml)；然后，在37℃下，将其中一份全血静置培养22小时，而将另一份全血震荡培养22小时；未经刺激原刺激的使用对应培养方式的全血用作阴性对照；然后，离心收集各样品(包括阴性对照)的全血血浆；然后，根据制造商的说明书，使用商购可得的Human IFN-γ Elisa kit(BD公司)检测各血浆样品中的IFN-γ的水平。
结果示于图5中。结果显示，对于获自3个肺结核患者的全血样品(各自2个等分)，在用重组蛋白EC5刺激后，经历震荡培养的全血样品的IFN-γ的水平为138.9±54.5pg/ml，而经历静置培养的全血样品的IFN-γ的水平为652.3±206.2pg/ml，震荡培养的效果显著差于静置培养的效果(p＝0.034，图5)。因此，在本发明的方法中，静置培养的方式是优选的。因此，在本申请中，除非明确说明，否则所使用的培养方式均为静置培养。
实施例6.培养温度的选择
在本实施例中，使用来自肺结核患者的新鲜外周全血，比较不同培养温度(30℃，35℃，37℃和39℃)对最终的刺激水平(即，IFN-γ的水平)的影响。
简言之，分别从2个肺结核患者(S7和S8)采集新鲜外周全血。将采集的2个全血样品各自分成4个等分，使用重组蛋白EC5进行刺激(重组蛋白EC5的终浓度为2μg/ml)；然后，将4个等分分别在30℃，35℃，37℃和39℃静置培养22小时；未经刺激原刺激的使用对应培养温度的全血用作阴性对照；然后，离心收集各样品等分(包括阴性对照)的全血血浆；然后，根据制造商的说明书，使用商购可得的HumanIFN-γ Elisa kit(BD公司)检测各血浆样品中IFN-γ的水平。
结果示于图6中。结果显示，培养温度为37℃时，刺激后的IFN-γ的水平最高，刺激效果最佳。因此，在本发明的方法中，优选的培养温度为37℃。
实施例7.培养时间的选择
在本实施例中，使用来自肺结核患者的新鲜外周全血，比较不同培养时间(11，14，18，20，22，24，32，36，39小时)对最终的刺激水平(即，IFN-γ的水平)的影响。
简言之，分别从3个肺结核患者采集新鲜外周全血。将采集的3个全血样品各自分成9个等分，使用重组蛋白EC5进行刺激(重组蛋白EC5的终浓度为2μg/ml)；然后，将9个等分分别在37℃静置培养11，14，18，20，22，24，32，36和39小时；未经刺激原刺激的使用对应培养时间的全血用作阴性对照；然后，离心收集各样品等分(包括阴性对照)的全血血浆；然后，根据制造商的说明书，使用商购可得的Human IFN-γ Elisa kit(BD公司)检测各血浆样品中IFN-γ的水平。
结果示于图7中。图7显示的是3个独立实验(即，来自3个患者的外周血样品)的结果的平均值。结果显示，刺激水平(即，IFN-γ的水平)在培养20小时后基本上达到平台。因此，在本发明的方法中，优选的培养时间为至少20小时，例如20-24小时。
实施例8.细胞因子IL-2的诊断价值
在结核分枝杆菌诱发的皮肤局部反应中，研究者们通过原位杂交方法在Th1细胞中观察到IL-2和IFN-γ mRNA的高表达，并且观察到IL-2和IFN-γ分泌增多。因此，在本发明的方法中，除了IFN-γ外，IL-2的水平也可用于反映全血中的特异性T细胞免疫反应。
在本实施例中，使用6份来自不同的结核分枝杆菌感染者的新鲜全血(T2-T7)和3份来自不同的健康受试者的新鲜全血(N2-N4)，证实了IL-2具有与IFN-γ相同的诊断价值。
简言之，采集受试者的新鲜外周全血。将采集的全血分别使用重组蛋白EC5进行刺激(重组蛋白EC5的终浓度为2μg/ml)，并在37℃下静置培养22小时；未经刺激原刺激的全血用作阴性对照。然后，离心收集各样品(包括阴性对照)的全血血浆；然后，根据制造商的说明书，使用BD公司的Human IFN-γ Elisa kit及Human IL-2Elisakit检测各血浆样品中的IFN-γ及IL-2的水平。
结果示于表3中。
表3：细胞因子IL-2与IFN-γ的比较
从表3的结果可以看出，经刺激培养后，6份结核分枝杆菌感染者的全血中IL-2的水平显著区别于3份健康受试者的全血中IL-2的水平，该结果与IFN-γ完全一致。因此，与IFN-γ一样，IL-2也可用作诊断结核分枝杆菌感染的指示细胞因子，可用于区分结核分枝杆菌感染者和健康受试者。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (41)

1.一种嵌合重组抗原，其由分别衍生自结核分枝杆菌特异性蛋白Rv3875、结核分枝杆菌特异性蛋白Rv3874和结核分枝杆菌特异性蛋白TB7.7的3个抗原区，以及任选的接头和任选的标签组成，其中衍生自结核分枝杆菌特异性蛋白Rv3875的抗原区为Rv3875的第1-80位氨基酸残基；衍生自结核分枝杆菌特异性蛋白Rv3874的抗原区为Rv3874的第1-100位氨基酸残基；并且，衍生自结核分枝杆菌特异性蛋白TB7.7的抗原区为TB7.7的第37-81位氨基酸残基。
2.权利要求1的嵌合重组抗原，其中所述嵌合重组抗原所包含的3个抗原区通过直接融合的方式或通过接头进行连接。
3.权利要求1的嵌合重组抗原，其中所述嵌合重组抗原还在其N末端和/或C末端包含标签。
4.权利要求1的嵌合重组抗原，其中所述嵌合重组抗原具有如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
5.多核苷酸，其编码权利要求1-4任一项的嵌合重组抗原。
6.权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
7.包含权利要求5或6的多核苷酸的构建体。
8.载体，其包含权利要求5或6的多核苷酸或者权利要求7的构建体。
9.宿主细胞，其包含权利要求5或6的多核苷酸或者权利要求7的构建体或者权利要求8的载体。
10.组合物，其包含权利要求1-4任一项的嵌合重组抗原，任选地还包含药学可接受的载体。
11.权利要求10的组合物，其中所述药学可接受的载体为缓冲剂。
12.体外检测样品中的结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应的方法，所述方法用于非诊断和治疗目的，其包括下述步骤：
1)用权利要求1-4任一项的嵌合重组抗原刺激所述样品；和
2)检测经刺激后的所述样品中细胞因子的水平；
其中，与对照相比，经刺激后的样品中所述细胞因子的水平的升高表明，该样品中存在结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应，并且，所述细胞因子的水平的高低反映所述样品中结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应的水平的高低，
其中，所述样品是抗凝全血或外周血单核细胞；并且
其中，所述细胞因子是IFN-γ和/或IL-2。
13.权利要求12的方法，其中所述对照是未用所述嵌合重组抗原刺激的所述待检测的样品，和/或用所述嵌合重组抗原刺激的未感染结核分枝杆菌的样品或样品群体。
14.权利要求12的方法，其中所述抗凝全血是用抗凝剂抗凝的全血。
15.权利要求14的方法，其中所述抗凝剂是肝素。
16.权利要求12的方法，其中所述抗凝全血是新鲜采集的抗凝全血。
17.权利要求16的方法，其中所述抗凝全血是在采集后室温放置不超过12个小时的抗凝全血。
18.权利要求16的方法，其中所述抗凝全血是在采集后室温放置不超过10个小时的抗凝全血。
19.权利要求16的方法，其中所述抗凝全血是在采集后室温放置不超过8个小时的抗凝全血。
20.权利要求16的方法，其中所述抗凝全血是在采集后室温放置不超过6个小时的抗凝全血。
21.权利要求16的方法，其中所述抗凝全血是在采集后室温放置不超过4个小时的抗凝全血。
22.权利要求16的方法，其中所述抗凝全血是在采集后室温放置不超过2个小时的抗凝全血。
23.权利要求12的方法，其中所述嵌合重组抗原包含在培养基中。
24.权利要求23的方法，其中所述培养基选自RPMI-1640培养基和DMEM培养基。
25.权利要求12的方法，其中在静置或非静置条件下进行步骤1)的刺激。
26.权利要求12的方法，其中在静置条件下进行步骤1)的刺激。
27.权利要求12的方法，其中在30℃-39℃下进行步骤1)的刺激。
28.权利要求12的方法，其中在35℃-37℃下进行步骤1)的刺激。
29.权利要求12的方法，其中在37℃下进行步骤1)的刺激。
30.权利要求12的方法，其中步骤1)的刺激进行11-39个小时。
31.权利要求12的方法，其中步骤1)的刺激进行15-35个小时。
32.权利要求12的方法，其中步骤1)的刺激进行20-30个小时。
33.权利要求12的方法，其中步骤1)的刺激进行20-24个小时。
34.权利要求12的方法，其中所述方法还设置了阳性对照，其是用非特异性T细胞刺激原刺激的待检测的样品。
35.权利要求34的方法，其中所述非特异性T细胞刺激原选自植物凝集素和刀豆球蛋白A。
36.权利要求1-4任一项的嵌合重组抗原或权利要求10或11的组合物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于体外检测样品中的结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应，或用于诊断受试者是否被结核分枝杆菌感染，或用于评价抗结核治疗效果。
37.一种试剂盒，其包含权利要求1-4任一项的嵌合重组抗原或权利要求10或11的组合物，所述试剂盒任选地还包含一种或多种以下试剂：
1)用于检测细胞因子的水平的试剂，所述细胞因子是IFN-γ和/或IL-2；
2)采血装置；
3)抗凝剂；
4)培养基；和
5)非特异性T细胞刺激原。
38.权利要求37的试剂盒，其中所述采血装置是无热原真空采血管。
39.权利要求37的试剂盒，其中所述抗凝剂是肝素。
40.权利要求37的试剂盒，其中所述培养基选自RPMI-1640培养基和DMEM培养基。
41.权利要求37的试剂盒，其中所述非特异性T细胞刺激原选自植物凝集素和刀豆球蛋白A。
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