CN110724182B - 提高菌阴结核感染检测敏感性的标志物组合及应用 - Google Patents

提高菌阴结核感染检测敏感性的标志物组合及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了提高菌阴结核感染检测敏感性的标志物组合及应用，具体地，本发明提供了两种蛋白组合物，所述的蛋白组合物可以用于检测结核分枝杆菌感染，一种用于检测结核分支杆菌和非结核分支杆菌的低负荷感染和菌体检测阴性的人群和高风险人群筛查的敏感性，另一种用于临床诊断结核分支杆菌所需的特异性。两种指标蛋白组合可以满足不同应用场景下对结核分支杆菌和非结核分支杆菌敏感性和特异性的不同需求。本发明还提供了现场快速检测的方法，可用于疾病控制机构、偏远欠发达地区卫生机构、和家庭对疑似结核感染的现场快速发现。

Description

提高菌阴结核感染检测敏感性的标志物组合及应用
技术领域
本发明属于健康医疗领域，具体地，本发明涉及一种提高菌阴结核感染检测敏感性的标志物组合及应用，更具体地，本发明涉及一种提高菌阴结核感染检测敏感性和临床诊断特异性的标志物组合及应用。
背景技术
根据世界卫生组织数据,结核病仍然是世界上最致命的传染病杀手，在所有死因中排名位于前10位。估算全球结核病死亡数约为157万人，中国约3.7万人。中国仍属于全球30个结核病高负担国家之一，每年新发患者数为88.9万，发病率为63/10万。全球2017年结核病潜伏感染人群约为17亿，占人口比例23％；。用结核菌素皮试检测技术我国约有3.6亿人感染结核分枝杆菌，近三分之一人口处于结核病威胁之下；用结核分枝杆菌RD区特异性抗原刺激T细胞产生γ-干扰素为检测普查结论是18.8％[李相威,金奇,高磊,我国结核分枝杆菌潜伏感染流行现状,《新发传染病电子杂志》2017年3期，146-15]。由于潜伏感染人群是一个庞大的潜在患者库，5％～10％的潜伏感染者会在一生中发生结核病。此外，潜伏感染人群体内的结核分枝杆菌是流动传染源。
临床检测最常用的结核分枝杆菌(MTB)分析方法有涂片法、培养法、T-SPOT、DNA和RNA检测方法。痰涂片快速低廉、操作简便，检测敏感性不高(>103CFU/ml),仅能检出50-75％活动性结核患者，漏检率高达25-50％，也无法区分死活菌，无法区分结核分枝杆菌(MTB)和非结核分枝杆菌(NTM)。培养法可提高检测敏感性，但检测周期长达2-8周，贻误治疗时间窗。对结核分枝杆菌(潜伏)感染人群的漏检，以及检测周期长，都增加了患者传播结核分枝杆菌给接触者的机会。T-SPOT、DNA和RNA检测方法都需要复杂的仪器和专业操作人员，在偏远地区使用存在多种困难。此外，现有检测方法难以兼顾检测灵敏性和特异性的矛盾。
因此,本领域急需一种快速便捷的对于结核分支杆菌和非结核分支杆菌低负荷和菌阴患者感染检测灵敏性高，和临床诊断结核分支杆菌感染检测特异性高的结核分枝杆菌感染检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速便捷的对于结核分支杆菌和非结核分支杆菌低负荷和菌阴患者感染检测灵敏性高，和临床诊断结核分支杆菌感染检测特异性高的结核分枝杆菌感染检测方法。
在本发明的第一方面，提供一种蛋白组合物，其特征在于，所述蛋白组合物包含以下蛋白：
(a1)1种及以上蛋白，所述蛋白选自以下蛋白组成的组：Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv1468c、Rv2031c、Rv2831、Rv3048；
(a2)1种及以上衍生蛋白，所述蛋白选自以下蛋白组成的组：序列为选自(a1)中任一蛋白的1个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加的蛋白；
(a3)1种及以上特异性结合配体蛋白，所述蛋白选自以下蛋白组成的组：与(a1)和(a2)中任一蛋白特异性结合的1种及以上蛋白；和/或
(a4)1种及以上特定的氨基酸序列，所述蛋白选自以下蛋白组成的组：含有(a1)、(a2)和(a3)中任一蛋白的全部序列或部分序列的1种及以上氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物(a1)为结核分支杆菌和非结核分支杆菌蛋白。
在另一优选例中，所述蛋白组合物用作评价结核分枝杆菌和非结核分支杆菌感染时敏感性的标志物。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包含3、4、5、6、7、或8种蛋白。
在另一优选例中，所述多种蛋白包含3、4、5、6、7、或8种选自(a1)的蛋白。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括蛋白Rv0577和Rv2831和Rv3048，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv0577和Rv1094和Rv2831，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv2031c和Rv1094和Rv3048，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv0440和Rv2831和Rv3048，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv0577和Rv1094和Rv3048和R0440，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv0577和Rv2831和R0440和Rv2031c，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv0440和Rv0577和Rv0685和Rv1094，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括蛋白Rv0440和Rv0577和Rv1094和Rv2831，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括蛋白Rv0577和Rv1094和Rv2031c和Rv3048，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括蛋白Rv0440和Rv0577和Rv1094和Rv2031c。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括蛋白Rv0440和Rv2831和Rv3048和Rv0577和Rv2031c和Rv1094，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供一种蛋白组合物，其特征在于，所述蛋白组合物包含以下蛋白：
(b1)1种及以上蛋白，所述蛋白选自以下蛋白组成的组：Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c，Rv3117、Rv3400、Rv3874、和Rv3875、Rv1514c、Rv1964、Rv1985c、Rv2649、Rv3872、Rv3878和Rv3402c中的三种及以上结核分支杆菌蛋白；
(b2)1种及以上衍生蛋白，所述蛋白选自以下蛋白组成的组：序列为选自(b1)中任一蛋白的1个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加的蛋白；
(b3)1种及以上特异性结合配体蛋白，所述蛋白选自以下蛋白组成的组：与(b1)和(b2)中任一蛋白特异性结合的1种及以上蛋白；和/或
(b4)1种及以上特定的氨基酸序列，所述蛋白选自以下蛋白组成的组：含有(b1)、(b2)和(b3)中任一蛋白的全部序列或部分序列的1种及以上氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物(b1)为结核分支杆菌蛋白。
在另一优选例中，所述蛋白组合物用作评价结核分枝杆菌特异性的标志物。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个蛋白。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个选自(b1)的蛋白。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包含3、4、5、6、7、或8个选自(b1)的蛋白。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包含蛋白Rv1773c和Rv1980和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1575和Rv1773c和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1514c和Rv1964和Rv1985c和Rv2649和Rv3402c和Rv3874，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1575和Rv1773c和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1980和Rv3117和Rv3874和Rv3878，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv2073c和Rv3402c和Rv3874和Rv3878，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv2073c和Rv3400和Rv3874和Rv3878，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv3117和Rv3400和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括蛋白Rv3872和Rv3874和Rv3875和Rv3878，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1985c和Rv3402c和Rv3874和Rv3878，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1980和Rv3872和Rv3874和Rv3878，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1773c和Rv3117和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1980和Rv1985c和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1773c和Rv3400和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1575和Rv3117和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1575和Rv1773c和Rv1980和Rv3400和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述蛋白组合物包括Rv1773c和Rv1980和Rv2073c和Rv3117和Rv3400和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列。
本发明的第三方面，提供一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含三种及以上标志物和任选的分离标签，所述标志物选自：
(a)如本发明第一方面所述的结核分支杆菌和非结核分支杆菌蛋白组合物；和
(b)如本发明第二方面所述的结核分支杆菌蛋白组合物。
在另一优选例中，所述标志物为Rv0440和Rv0577和Rv0685和Rv1094；以及Rv3872和Rv3874和Rv3875和Rv3878，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列的组合。
在另一优选例中，所述标志物为Rv0577和Rv1094和Rv2831和Rv3048；以及Rv1980和Rv1985c和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列的组合。
在另一优选例中，所述标志物为Rv0440和Rv0577和Rv1094和Rv2831；以及Rv1575和Rv1773c和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列的组合。
在另一优选例中，所述标志物为Rv0577和Rv1094和Rv2031c和Rv3048；以及Rv1773c和Rv3400和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列的组合。
在另一优选例中，所述标志物为Rv0440和Rv0577和Rv1094和Rv2031c和Rv1575和Rv3117和Rv3874和Rv3875，和/或其对应的衍生蛋白、特异性结合配体蛋白、特定的氨基酸序列的组合。
在另一优选例中，所述分离标签能特异性结合一种或多种试剂盒中的标记物。
在另一优选例中，所述分离标签预先或使用时与对应标记物结合。
在另一优选例中，所述试剂盒用于评估结核病的敏感程度和特异程度。
在另一优选例中，所述试剂盒的种类包括ELISA免疫检测试剂盒、和半干式层析试剂盒。
本发明的第四方面，提供一种检测结核分枝杆菌蛋白的方法，包括步骤：
(I)提供一待测的离体组织样品，使其与如本发明第三方面所述的试剂盒至于同一体系中，进行充分反应；
(II)利用与所述试剂盒中的分离标签，将带有分离标签的蛋白结合片段从检测体系中分离；和
(III)对分离出带有分离标签的蛋白结合片段的检测体系进行荧光信号的测定。
在另一优选例中，所述方法的检测包括：定性检测和定量检测。
在另一优选例中，所述方法还包括进行空白样品的平行对照实验，所述空白样品中不包含结核分枝杆菌蛋白，且测得的荧光信号为A0；若步骤(III)测得的信号A1/A0>1，则认为待检测样品中有结核分枝杆菌蛋白；若步骤(III)测得的信号A1/A0≤1，则认为待检测样品中没有结核分枝杆菌蛋白。
在另一优选例中，所述步骤(III)的荧光信号的测定中，所述测定通过酶标仪进行。
本发明的第五方面，提供本发明第三方面所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于结核分枝杆菌感染的检测。
在另一优选例中，所述结核分枝杆菌感染包括肺部感染、和/或肺外感染。
在另一优选例中，所述用途还包括：对疑似结核分枝杆菌感染检测，非医疗机构的的预防性结核分枝杆菌感染筛查，和/或家庭预防结核分枝杆菌感染自查。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现健康人群、结核分枝杆菌不同感染程度的人体和动物血液中的2组特异抗体蛋白存在水平差异，利用所述2组蛋白指标在敏感性和特异性方面具有相对独立的性质，制备检测ELISA试剂盒和现场快速检测试剂盒，能够克服现有结核检测试剂在高风险人群感染筛查中敏感性不够高，不能兼顾灵敏性和特异性的缺陷。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“蛋白”指在本发明的从结核分枝杆菌培养的上清液和菌体中提取纯化的蛋白，或和用重组基因技术制备的重组蛋白。
分支杆菌
分支杆菌包括结核分枝杆菌(tuberculosis mycobacteria)和非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria)。非结核分枝杆菌是指结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，还称为非典型分枝杆菌(atypical mycobacteria)，其特性有别于结核分枝杆菌，如对酸、碱比较敏感；对常用的抗结核菌药物较耐受；生长温度不如结核分枝杆菌严格；多存在于环境中，为条件致病菌，可引起结核样病变；对常用结核药物包括异烟肼、链霉素等耐药，治疗后常出现L型，耐药性增高，有的经多年治疗不愈。L型往往因细胞壁脂质缺失不易致敏淋巴细胞，结核菌素试验可呈阴性。因此对非结核分支杆菌感染检测也具有重要临床价值。
基因座
如本文所用，术语“Rv0440”、“Rv0577”、“Rv0685”、“Rv1094”、“Rv1468c”、“Rv1575”、“Rv1773c”、“Rv1980”、“Rv2031c”、“Rv2073c”“Rv2831”、“Rv3048”、“Rv3117”、“Rv3400”、“Rv3874”、“Rv3875”、“Rv1514c”、“Rv1964”、“Rv1985c”、“Rv2649”、“Rv3402c”、“Rv3872”、“Rv3878”是结核分枝杆菌标准株Mycobacterium tuberculosis(strainATCC27294/H37Rv)全基因组的顺序基因座名称(Ordered Locus Names,https://mycobrowser.epfl.ch/)。本文中提到的克隆基因，均来自结核分枝杆菌标准株Mycobacterium tuberculosis(strain ATCC27294/H37Rv)。所有氨基酸序列来源于UNIPROT蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)，基因序列来源于基因数据库GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)。
本文中的各基因座简要信息如下，序列信息如表1所示：
Rv0440，60kDa分子伴侣2，别称包括65kDa抗原，抗原A，GroEL蛋白2，热休克蛋白65，蛋白Cpn60-2；基因名称：groEL2，groEL-2，groL2,hsp65，mtc28；参与结核分枝杆菌在压力条件下维持其它功能蛋白构象。氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示。
Rv0577，乙二醛酶glyoxylase CFP32，别名27kDa抗原Cfp32，基因名称：cfp32，cfp30B，TB27.3。参与丙酮醛脱毒代谢途径，诱导树突状细胞成熟，增加细胞表面分子标志物CD80,CD86,MHC I和II的表达量和炎症细胞因子(TNF-alpha,IL-6,IL-1beta和IL-12p70)的合成分泌。氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示。
Rv0685，延长因子Tu，简称EF-Tu，基因名tuf；在蛋白质合成过程中促进GTP-依赖的氨酰-tRNA与核糖体A位点结合。氨基酸序列如SEQ ID No.:3所示。
Rv1094酰基脱氢酶DesA2，基因名称：desA2；参与分枝杆菌脂肪酸和脂质的代谢。氨基酸序列如SEQ ID No.:4所示。
Rv1468c，PE-PGRS家族蛋白PE_PGRS29，基因名称：PE_PGRS29，氨基酸序列如SEQID No.:5所示。
Rv1575，推测是PhiRv1噬菌体蛋白，基因名称：Rv1575。氨基酸序列如SEQ ID No.:6所示。
Rv1773c，推测是转录调节蛋白，基因名称：Rv1773c，氨基酸序列如SEQ ID No.:7所示。
Rv1980，免疫原性蛋白MPT64，基因名称：mpt64，氨基酸序列如SEQ ID No.:8所示。
Rv2031c，Alpha-晶体蛋白Acr，别名：14kDa抗原，16kDa抗原，HSP 16.3，Nox16；基因名称：hspX；具有分子伴侣功能，强力抑制乙醇脱氢酶热变性。氨基酸序列如SEQ ID No.:9所示。
Rv2073c,氧化还原蛋白，基因名称：Rv2073c。氨基酸序列如SEQ ID No.:10所示。
Rv2831，酰基CoA脱氢酶Crotonase，EchA16,基因名称：echA16。参与分枝杆菌脂肪酸和脂质的代谢。氨基酸序列如SEQ ID No.:11所示。
Rv3048，核苷二磷酸还原酶beta亚基nrdF2，别名：核苷酸还原酶R2-2小亚基；基因名称：nrdF2。催化以核苷为原料合成脱氧核苷的反应，参与DNA复制生物途径。氨基酸序列如SEQ ID No.:12所示。
Rv3117,推测是硫代硫酸盐硫转移酶，别名：类硫氰酸酶蛋白；基因名称：cysA1，cysA。氨基酸序列如SEQ ID No.:13所示。
Rv3400，一种未鉴定蛋白，基因名称：Rv3400；氨基酸序列如SEQ ID No.:14所示。
Rv3874，类ESAT-6早期蛋白EsxB，别名10kDa培养滤液蛋白CFP-10,分泌抗原蛋白MTSA-10；基因名称：esxB，氨基酸序列如SEQ ID No.:15所示。
Rv3875，6kd早期分泌抗原蛋白，别名ESAT-6；基因名称：esxA，氨基酸序列如SEQID No.:16所示。
Rv1514c，一种糖基转移酶，基因名称：Rv1514c，氨基酸序列如SEQ ID No.:17所示。
Rv1964，一种保守的膜蛋白，具有磷脂转移活性，基因名称：yrbE3A，氨基酸序列如SEQ ID No.:18所示。
Rv1985c，一种HTH-型转录调节因子，基因名称：Rv1985c，氨基酸序列如SEQ IDNo.:19所示。
Rv2649，一种转座酶，转座元件IS6110的转座必需。氨基酸序列如SEQ ID No.:20所示。
Rv3402c，一种转氨酶，基因名称：Rv3402c，氨基酸序列如SEQ ID No.:21所示。
Rv3872，PE家族免疫调节蛋白PE35,基因名称：PE35，氨基酸序列如SEQ ID No.:22所示。
Rv3878，ESX-1分泌相关蛋白EspJ，基因名称：espJ，氨基酸序列如SEQ ID No.:23所示。
表1
Figure BDA0002275736690000101
Figure BDA0002275736690000111
本文所述的如表1所述蛋白的变异形式，所述的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“衍生蛋白，其序列为(i)中所述蛋白的一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加”指与本发明表1所述蛋白的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些氨基酸所替换而形成的多肽最好根据表2进行氨基酸替换而产生。
表2
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
敏感性与特异性
敏感性是指试验检出有病的人数占患者总数的比例(真阳性率)，用指该指标在诊断疾病的时候不漏诊的机会有多大小。
特异性是指试验检出有病的人数占未患病人总数的比例(假阳性率)，用指该指标在诊断某疾病时，不误诊的机会有多大小。
理想的临床检测指标应该具有100％的诊断特异性和100％的敏感性，实际上不存在。当用单一指标诊断疾病时，敏感性与特异性的关系可用ROC曲线表示：提高检测敏感性，特异性必然降低，反之亦然。用ROC曲线下面积确定指标的诊断效力。需要根据具体疾病漏诊和误诊对患者和社会公众的生命健康的意义和价值，平衡敏感性与特异性，确定最佳的诊断值。
以SARS和感冒为例说明。SARS是传播感染极强的疾病，漏诊一人存在传染数十人的机会，而且任何人一旦被感染，治愈率较低，生存机会较小。因此漏诊对患者个人生命和社会公众生命都存在极大风险，敏感性就需要达到100％，宁可误诊100也不能漏诊一位,特异性就不强求。感冒这类疾病，尽管传播感染也较强，但即使被感染，一般1周左右也可自愈，漏诊对患者个人生命和他人生命威胁不大，对敏感性要求就可以适当降低些。
常见实验技术与实验方法
酶联免疫检测(ELISA)显色技术
用0.05mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)配制本发明的结核分枝杆菌蛋白浓度至1～5μg/mL，按每孔100μL包被96孔板，4℃过夜；次日用1×PBST洗涤缓冲液在洗板机上洗涤5次；每孔加入300μL的含3％脱脂奶粉的封闭液37℃封闭2h，PBST洗板6次，拍干；用排枪每孔加入100μL的封闭液，每孔加入50μl样品处理液，然后分别加入50μl待测血浆样品。37℃孵育1h，洗涤96孔板6次；每孔中加入提前配制的用PBST按照5,000～10,000倍稀释的HRP标记的山羊抗人IgG多抗100μL，37℃孵育1h，洗涤96孔板6次；每孔加入100μL的TMB底物缓冲液，37℃孵育10～30min；每孔加入50μL的浓度为2mol/L的H2SO4溶液，终止反应；酶标仪450nm波长处测定Abs值，判定实验结果(待测样本的OD450值大于阴性对照样本OD450均值与其3倍标准差的总和，则判定待测样本为阳性，低于此值则判定为阴性；
酶联免疫检测(ELISA)化学发光技术
分别用0.05mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)配置本发明结核分枝杆菌蛋白至5μg/mL浓度，包在每块96孔板加入一种蛋白，每孔加入100μL，4℃过夜，次日用1×PBST洗涤缓冲液在洗板机上洗涤5次；每孔加入300μL的含3％脱脂奶粉的封闭液37℃封闭2h，PBST洗板6次，拍干；用排枪每孔加入100μL的封闭液，4℃孵育16h；干燥：在温度18～26℃、湿度＜20％条件下干燥过夜；用铝箔袋抽真空封装包被板2～8℃保存。
在96孔酶标板中每孔加入50μl样品处理液，然后分别加入50μl待测血浆样品，37℃孵育60min。用洗板机以洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干。配制的用PBST按照5,000～10,000倍稀释的HRP标记的山羊抗人IgG多抗，每孔中加入100μl，37℃孵育1h；用洗板机以洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干。每孔加入100μL的TMB底物缓冲液，37℃孵育10～30min；每孔再加入50μL的浓度为2mol/L的H2SO4溶液，终止反应；酶标仪450nm波长处测定光吸收值，记录。判定实验结果(待测样本的OD450值大于阴性对照样本OD450均值与其3倍标准差的总和，则判定待测样本为阳性，低于此值则判定为阴性；
半干式微层析快速检测试纸
以试纸的底层为支撑板，该支撑板上依次黏附有紧密相连的样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫，所述结合垫上吸附有胶体金标记或荧光标记的抗人抗体的单克隆抗体，所述NC膜上喷涂本发明所述的结核分枝杆菌蛋白作为检测线和喷涂人抗体(IgG、IgM、IgA、IgE)作为质控线，所述天然结核分枝杆菌蛋白的氨基酸序列如表1所示。
上述半干式微层析快速检测试纸(测试卡)的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)胶体金和荧光标记的抗体的制备
胶体金材料(颗粒直径为25～30nm)，用pH8.2，0.01M PBS缓冲液分别将兔抗人IgG、IgM、IgA、IgE单克隆抗体稀释，并加入胶体金溶液中，使抗体的终浓度为15μg/mL，经离心纯化去除上清，再用1％牛血清白蛋白BSA作为稳定剂，即得到胶体金标记的兔抗人IgG、IgM、IgA、IgE抗体的单克隆抗体，置于4℃保存备用；
纳米荧光材料(颗粒直径<200nm)，用pH8.2，0.01M PBS缓冲液分别将兔抗人IgG、IgM、IgA、IgE单克隆抗体稀释，并加入胶体金溶液中，使抗体的终浓度为15μg/mL，经离心纯化去除上清，再用1％牛血清白蛋白BSA作为稳定剂，即得到纳米荧光标记的兔抗人IgG、IgM、IgA、IgE抗体的单克隆抗体，置于4℃保存备用；
(2)NC膜的制备
将天然结核分枝杆菌蛋白和人抗体(IgG、IgM、IgA、IgE)分别均匀喷涂到NC膜上作为检测线和质控线，检测线和质控线的线宽为1mm，检测线和质控线相距2-5mm，位于NC膜的中心，然后置于37℃干燥，封装后保存备用；
(3)试剂条或测试卡的制备
将胶体金标记或荧光标记的单克隆抗体吸附于结合垫上，再将样品垫、金标抗体结合垫、NC膜和吸收垫按次序保持2mm的重叠宽度后粘贴至支撑板上，得到试剂板，然后将试剂板切成50mm×10mm，即得到试剂条，立即放入有干燥剂的铝箔袋内，封口；或将试剂板切成30mm×10mm，再将其放入测试卡盒内，即得到测试卡，立即放入铝箔袋内封口。
(4)快速检测免疫试纸的使用方法
将适量样品溶液滴加到样品垫上，静止5～10min，根据检测线和质控线的显色情况，判断样品中是否含有结核分枝杆菌特异抗体，若检测线和质控线均显现，则为阳性结果，样品中含有结核分枝杆菌特异抗体；若检测线不显现，质控线显现，则为阴性结果，样品中结核分枝杆菌特异抗体低于试纸条检测限；若质控线不显现，则试纸条失效。
本发明的技术方案，具有如下有益效果：
1.本发明把检测结核分枝杆菌感染的敏感性和特异性拆分成2组蛋白标志物组合，在检测低负荷感染和菌体检测阴性的人群和高风险人群筛查时，可主要参考敏感性指标数据，而在临床诊断时主要参考特异性指标数据，从而满足不同应用场景下对敏感性和特异性的不同需求。
2.本发明所用结核分枝杆菌蛋白组合检测血样抗体，对人群感染结核分枝杆菌的抗体反应具有良好的互补性，可以克服现有结核检测试剂盒敏感性不足，不能及时发现结核感染，有效治疗和控制感染的不足。既提高了对无结核病症状人群到菌阴感染人群检测的敏感性；同时，也保证了临床治疗时需要准确判断时需要的结核分枝杆菌感染的特异性。
3.本发明制备的检测试纸，使用时具有样品用量少，该方法操作简单，现场5～10min出结果，检测速度快，不需要专用仪器设备，检测成本低，从而解决了缺少专业医务人员的偏远欠发达地区需要尽快确认疑似结核感染人员。
4.本发明检测试纸的检测结果，除了操作者现场目视检测外，可以上传远程专家系统，半定量数据处理，检测结果更专业，将在偏远欠发达地区防控结核病中发挥重要作用，具有潜在推广应用价值。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1重组结核分枝杆菌蛋白的制备
1.1直接合成全长人工基因
从基因数据库GeneBank中，调取Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c，Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875基因的mRNA开放阅读框序列，设计各基因引物，并在头尾引入酶切位点BamHI和XhoI，引入3个保护碱基。引物合成后，以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，strain ATCC27294/H37Rv)基因组DNA为模板，通过PCR克隆全长基因。同时，为了提高在宿主菌中的表达效率，用Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c，Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875的氨基酸，选表达宿主的偏好密码子，翻译成更适合宿主表达的基因序列，直接合成全长人工基因。
1.2获得表达人工基因的单菌落
上述步骤得到的全长(人工)基因用BamH I和Xho I酶切后，分别连接到质粒pGEX6p-1，得到表达质粒pGEX-Rv0440、pGEX-Rv0577、pGEX-Rv0685、pGEX-Rv1094、pGEX-Rv1468c、pGEX-Rv1575、pGEX-Rv1773c、pGEX-Rv1980、pGEX-Rv2031c、pGEX-Rv2073c、pGEX-Rv2831、pGEX-Rv3048、pGEX-Rv3117、pGEX-Rv3400、pGEX-Rv3874、pGEX-Rv3875，测序，比对序列，确认序列正确性后，分别转化到BL21codon plus(DE3)-RIPL感受态细胞中，每种质粒挑20个单菌落，接种到20ml LB培养基中，160rpm，37℃培养8～12h(具体情况根据菌的生长状态决定)，取0.2ml培养液煮5min，用上述各基因引物进行PCR扩增，电泳检测每个基因的目标条带大小与理论值符合度。
1.3得到重组表达的质粒蛋白
分别将含有每种重组表达质粒蛋白的大肠杆菌单菌落接种到5mL LB培养基，37℃培养过夜。然后以1:50稀释到含有50ng/L Amp、LB培养基50mL中，培养约4小时使其OD600值约为0.6，加IPTG至终浓度为1mM，在37℃诱导4小时时取出鉴定表达情况。取50mL诱导的培养物，冰上放置30min，12000rpm离心8min，收集菌体，弃上清；沉淀用1×PBS(5mL/100mL培养物)加等体积冰冷的无菌水打散重悬；加入300μg/mL的溶菌酶，冰上轻摇30min后，置-70℃冻存12h；把样品用流动的水融化后加入蛋白酶抑制剂，冰浴中超声破碎(200W功率)，间歇破碎，每破碎5s，间隔5s，反复破碎共8min，(可在显微镜下观察破碎结果)。混合物在4℃用12,000g的转速离心12min；取混合、上清、沉淀样品保存4℃备用。
1.4筛选符合设计的菌种
分别取混合，上清，沉淀样品分别用考马斯亮蓝法定量测定蛋白含量并稀释到一定浓度后取200uL加入50uL 5×上样缓冲液,煮沸5min，取出冷却后12,000rpm离心8min并加样。用微量进样器取20μL上述混合液，用SDS-PAGE电泳分析诱导表达的蛋白分子量和表达量，判断与理论分子量一致性。保存符合设计的菌种待用。不一致的菌种舍弃，重新构建、鉴定未成功的基因。
1.5分离和纯化重组蛋白
分别取上述成功的菌种200μl，接种于50mL选择性Amp LB液体培养基中，37℃，200rpm/min振摇过夜，第二天取1mL接种到1L LB液体培养基中，同样的操作一共4瓶，37℃，180rpm培养4h后，取一管不加IPTG样本作为对照，其余加入1mol/L IPTG于菌液中至终浓度为1mM，继续培养10小时。全部诱导后菌液6000rpm离心8min收集菌体沉淀，用1mL PBS(pH＝7.3)重悬洗涤一次离心收集菌体，加入体积250mL PBS(pH＝7.3)重悬后超声破碎，15min，脉冲破碎后用50mL离心管离心，15000rpm，40min后，小心取上清，4℃存放备用。
GE 5mL镍亲和预装柱先1×PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4)平衡，流速设为4mL/min左右，平衡5个柱体积，将上述处理好的蛋白上样，流速1mL/min；上样结束后，用1×PBS洗杂，流速为4mL/min，洗脱至少10个柱体积；之后用1×PSPbuffer平衡柱子至少5个体积后，用洗脱液(50mM Tris-HCl，500mM咪唑，pH7.0)，线性梯度洗脱蛋白20个柱体积，洗脱流速为2mL/min，用过的柱子用20％乙醇冲洗柱子和仪器。之后将蛋白透析到生理盐水中，定量后将蛋白稀释成0.5mg/mL，Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c，Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875总蛋白10mg以上，电泳检测纯度,结果蛋白纯度都在95％以上，-20℃冰箱保存备用。
实施例2天然结核分枝杆菌蛋白的制备
2.1获得兔源各种蛋白的抗血浆
提供实验级新西兰大白兔14只,体重2.0-2.5kg,雌雄不限,无免疫接种史，适应性饲养5天；取Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c，Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875总蛋白各6mg，分别与不完全福氏完全佐剂12mL,充分混匀，每种蛋白2只，每间隔1周注射/只次,免疫3次。于末次免疫后一周用注射器进行心脏穿刺采血,加入15g/L的EDTA-K混匀抗凝。设离心机温度18-20℃,用2000rpm离心20min。收集上清中血浆，合并每种蛋白的抗血浆待用。
2.2纯化和固定抗血浆中的天然抗体
购买BrCN活化的Sepharose介质，按照供应商推荐方法分别与Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c、Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875总蛋白5mg偶联，制备抗原亲和介质，装柱后，从某种蛋白的抗血浆中纯化抗体，得Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c、Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875总蛋白的抗体3-6mg。再分别与BrCN活化的Sepharose介质2ml，按照供应商推荐方法分别偶联，制备固定化抗体亲和介质，装柱待用。
2.3 MTB菌株培养及培养滤液蛋白
在符合生物安全实验室取结核分枝杆菌H37Rv菌种，在生物安全柜中接种于7H9罗氏固体培养基,37℃培养～14天，待固体培养基斜面上形成了菜花状的菌落；取出用生理盐水洗涤菌体，收集至离心管内，室温下4,000rpm，离心10min；弃上清(高压灭菌后再处理)，收集菌体。取苏通培养液重悬洗涤后的菌体。将2.5mL的～1×108个/mL细胞接种于400mL液体苏通培养基的蓝口瓶中，37℃静置培养；约1周后就可看到苏童培养液表层的大量MTB-H37Rv生长。约～3周，在生物安全柜中，转入500mL的0.22μm的PES细菌瓶(Corning,NY,USA)后用负压泵抽滤，获得MTB-CFP；将除菌过滤后的培养上清置于超滤离心管中进行超滤离心，4℃，4,000rpm，控制离心时间使培养上清浓缩100倍；然后用10mM PBS缓冲液置换体系(重复3次)，浓缩后溶液即为早期培养滤液蛋白。最后用BCA蛋白定量试剂盒测定MTB-CFP的浓度，使其终浓度为4-5mg/mL，100ml。
2.4分离和纯化MTB细胞浆蛋白
收集负压抽滤获得的MTB-H37Rv菌体，62℃，30分钟，重复3次；将灭活后的MTB采用超声破碎(冰浴)的方法使MTB细胞浆蛋白释放出来；其程序设定为：超声5s，间歇5s，超声功率15％，超声工作时间10min，30min后再次重复上述操作3次。最后将破壁后的菌液12,000rpm，4℃离心30min后取收集上清，用0.22μm的滤膜过滤。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，使其终浓度为5mg/mL，得MTB-H37Rv菌体胞浆100ml。
2.5分离和纯化兔天然抗体
取Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c，Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875总蛋白的兔抗体亲和柱，分别从MTB-CFP和MTB-H37Rv菌体胞浆蛋白的10ml，按照免疫亲和纯化抗原方法进行操作，收集洗脱组分，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，挑整浓度为1mg/mL，得天然Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c、Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875总蛋白各5ml。
实施例3志愿者病例筛选血样制备
3.1病例筛选标准
本发明所涉及结核病志愿者病例筛选标准为:(1)临床主治医生根据志愿者临床表现确诊为肺结核；(2)影像学显示肺部有阴影；(3)结核菌培养阳性或者阴性。健康志愿者筛选标准为:(1)无结核临床症状；(2)无其他疾病或感染。入选的结核病例及健康志愿者年龄在18-60岁之间，性别按照1:1随机挑选。经过筛选的个体经主治医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液的数量，经志愿者同意并签署知情同意书，由临床护士对志愿者进行采血。最终筛选了212例结核病志愿者，其中75人痰培养阳性，137人痰培养阴性；排除身体虚弱、有结核病史者后，筛选了164例健康志愿者，PPD阳性者53人，PPD阴性者111人。
3.2外周血样品制备
采血时适用含有肝素锂抗凝的一次性真空采血管，每名志愿者采血约5ml。之后I)、先将新鲜采集的外周血用121℃高压灭菌冷却后的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)稀释一倍，即8ml外周血加入到8ml的PBS中混匀，将稀释的血样小心于4℃，12,000rpm转速，离心30min，取上清。
实施例4酶联免疫吸附法评价血液中结核分枝杆菌抗体
取用铝箔袋抽真空封装包被板保存于2～8℃的Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c、Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875总蛋白包被的96孔显色酶标板，每孔加入50μL样品处理液，然后分别加入50μL待测血浆样品，37℃孵育60min。用洗板机以洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干。配制的用PBST按照5,000～10,000倍稀释的HRP标记的山羊抗人IgG多抗，每孔中加入100μL，37℃孵育1h；用洗板机以洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干。每孔加入100μL的TMB底物缓冲液，37℃孵育10～30min；每孔再加入50μL的浓度为2mol/L的H2SO4溶液，终止反应；酶标仪450nm波长处测定光吸收值，记录。判定实验结果(待测样本的OD 450值大于阴性对照样本OD 450均值与其3倍标准差的总和，则判定待测样本为阳性，低于此值则判定为阴性。
结果：
第一组蛋白检测结果列在表3中，单一蛋白检测健康人群的特异性在91％至93.2％之间，检测结核病患者的敏感性在39％至47.2％之间。
表3
Figure BDA0002275736690000191
Figure BDA0002275736690000201
第二组蛋白检测结果列在表4中，单一蛋白检测健康人群的特异性在96％至98％之间，检测结核病患者的敏感性在32％至40.9％之间。
表4
Figure BDA0002275736690000202
第一组蛋白组合示例的判定结果列在表5中，蛋白组合检测健康人群的特异性在89％至90.7％之间，检测结核病患者的敏感性在88％至95％之间。
第二组蛋白组合示例判定结果列在表5中，蛋白组合检测健康人群的特异性在97％至98％之间，检测结核病患者的敏感性在89％至94％之间。
第一组蛋白组合和第二组蛋白组合的联合示例判定结果列在5中，检测健康人群的特异性在88％至89％之间，检测结核病患者的敏感性在93％至99％之间。
表5
Figure BDA0002275736690000203
Figure BDA0002275736690000211
Figure BDA0002275736690000221
Figure BDA0002275736690000231
实施例5酶联免疫化学发光法(ELISA)检测人血浆中结核分枝杆菌抗体
取用铝箔袋抽真空封装包被板保存于2～8℃的Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c、Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875蛋白包被的96孔化学发光酶标板，每孔加入50μl样品处理液，然后分别加入50μl待测样品，37℃孵育60min。用洗板机以洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干。每孔中加入100μl兔抗人IgG抗体-酶结合物，37℃孵育45分钟。用洗板机以洗涤液洗板5次，在吸水纸上拍干。每孔中先后加入化学发光底物液A、化学发光底物液B各50μl，使用化学发光检测仪检测发光信号值＜5分钟，并记录。以阴性对照发光度(RLU)的平均值2000均值与其3倍标准差的总和为临界值(CUTOFF)；待检样品的RLU值＞临界值(CUTOFF)以上为阳性，待检样品RLU值＜临界值(CUTOFF)为阴性。
结果：
第一组蛋白检测结果列在表6中，单一蛋白检测健康人群的特异性在92％至93％之间，检测结核病患者的敏感性在38％至46.5％之间。
表6
Figure BDA0002275736690000232
第二组蛋白检测结果列在表7中，单一蛋白检测健康人群的特异性在96％至98％之间，检测结核病患者的敏感性在32％至39％之间。
表7
Figure BDA0002275736690000241
第一组蛋白组合示例的判定结果列在表8中，蛋白组合检测健康人群的特异性在89％至91％之间，检测结核病患者的敏感性在89％至97％之间。
第二组蛋白组合示例判定结果列在表8中，蛋白组合检测健康人群的特异性在97％至98％之间，检测结核病患者的敏感性在89％至95％之间。
第一组蛋白组合和第二组蛋白组合的联合示例判定结果列在表8中，检测健康人群的特异性在88％至90％之间，检测结核病患者的敏感性在94％至99％之间。
表8
Figure BDA0002275736690000242
Figure BDA0002275736690000251
Figure BDA0002275736690000261
Figure BDA0002275736690000271
实施例5半干式层析条制备与检测
取测Rv0440、Rv0577、Rv0685、Rv1094、Rv2031c、Rv2831、Rv3048、Rv1468c、Rv1575、Rv1773c、Rv1980、Rv2073c、Rv3117、Rv3400、Rv3874、Rv3875蛋白特异蛋白的荧光标记测试卡，将适量待测血浆样品滴加到样品垫上，静止5～10min，根据检测线和质控线的显色情况，判断样品中是否含有结核分枝杆菌特异抗体，若检测线和质控线均显现，则为阳性结果，样品中含有结核分枝杆菌特异抗体；若检测线不显现，质控线显现，则为阴性结果，样品中结核分枝杆菌特异抗体低于试纸条检测限；若质控线不显现，则试纸条失效。
结果：
第一组蛋白检测结果列在表9中，单一蛋白检测健康人群的特异性在92％至93％之间，检测结核病患者的敏感性在38％至45％之间。
表9
Figure BDA0002275736690000272
第二组蛋白检测结果列在表10中，单一蛋白检测健康人群的特异性在96％至98％之间，检测结核病患者的敏感性在31％至39％之间。
表10
Figure BDA0002275736690000273
Figure BDA0002275736690000281
第一组蛋白组合示例的判定结果列在表11中，蛋白组合检测健康人群的特异性在89％至91％之间，检测结核病患者的敏感性在89％至97％之间。
第二组蛋白组合示例判定结果列在表11中，蛋白组合检测健康人群的特异性在97％至98％之间，检测结核病患者的敏感性在88％至96％之间。
第一组蛋白组合和第二组蛋白组合的联合示例判定结果列在表11中，检测健康人群的特异性在88％至89％之间，检测结核病患者的敏感性在93％至99％之间。
表11
Figure BDA0002275736690000282
Figure BDA0002275736690000291
Figure BDA0002275736690000301
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 提高菌阴结核感染检测灵敏度的标志物组合及应用
<130> P2019-1177
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 540
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
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65 70 75 80
Pro Arg Trp Pro Ala Met Thr Lys Pro Val Ile Gly Ala Ile Asn Gly
85 90 95
Ala Ala Val Thr Gly Gly Leu Glu Leu Ala Leu Tyr Cys Asp Ile Leu
100 105 110
Ile Ala Ser Glu His Ala Arg Phe Ala Asp Thr His Ala Arg Val Gly
115 120 125
Leu Leu Pro Thr Trp Gly Leu Ser Val Arg Leu Pro Gln Lys Val Gly
130 135 140
Ile Gly Leu Ala Arg Arg Met Ser Leu Thr Gly Asp Tyr Leu Ser Ala
145 150 155 160
Thr Asp Ala Leu Arg Ala Gly Leu Val Thr Glu Val Val Ala His Asp
165 170 175
Gln Leu Leu Pro Thr Ala Arg Arg Val Ala Ala Ser Ile Val Gly Asn
180 185 190
Asn Gln Asn Ala Val Arg Ala Leu Leu Ala Ser Tyr His Arg Ile Asp
195 200 205
Glu Ser Gln Thr Ala Ala Gly Leu Trp Leu Glu Ala Cys Ala Ala Lys
210 215 220
Gln Phe Arg Thr Ser Gly Asp Thr Ile Ala Ala Asn Arg Glu Ala Val
225 230 235 240
Leu Gln Arg Gly Arg Ala Gln Val Arg
245
<210> 12
<211> 324
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 12
Met Thr Gly Asn Ala Lys Leu Ile Asp Arg Val Ser Ala Ile Asn Trp
1 5 10 15
Asn Arg Leu Gln Asp Glu Lys Asp Ala Glu Val Trp Asp Arg Leu Thr
20 25 30
Gly Asn Phe Trp Leu Pro Glu Lys Val Pro Val Ser Asn Asp Ile Pro
35 40 45
Ser Trp Gly Thr Leu Thr Ala Gly Glu Lys Gln Leu Thr Met Arg Val
50 55 60
Phe Thr Gly Leu Thr Met Leu Asp Thr Ile Gln Gly Thr Val Gly Ala
65 70 75 80
Val Ser Leu Ile Pro Asp Ala Leu Thr Pro His Glu Glu Ala Val Leu
85 90 95
Thr Asn Ile Ala Phe Met Glu Ser Val His Ala Lys Ser Tyr Ser Gln
100 105 110
Ile Phe Ser Thr Leu Cys Ser Thr Ala Glu Ile Asp Asp Ala Phe Arg
115 120 125
Trp Ser Glu Glu Asn Arg Asn Leu Gln Arg Lys Ala Glu Ile Val Leu
130 135 140
Gln Tyr Tyr Arg Gly Asp Glu Pro Leu Lys Arg Lys Val Ala Ser Thr
145 150 155 160
Leu Leu Glu Ser Phe Leu Phe Tyr Ser Gly Phe Tyr Leu Pro Met Tyr
165 170 175
Trp Ser Ser Arg Ala Lys Leu Thr Asn Thr Ala Asp Met Ile Arg Leu
180 185 190
Ile Ile Arg Asp Glu Ala Val His Gly Tyr Tyr Ile Gly Tyr Lys Phe
195 200 205
Gln Arg Gly Leu Ala Leu Val Asp Asp Val Thr Arg Ala Glu Leu Lys
210 215 220
Asp Tyr Thr Tyr Glu Leu Leu Phe Glu Leu Tyr Asp Asn Glu Val Glu
225 230 235 240
Tyr Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Glu Val Gly Leu Thr Glu Asp Val Lys
245 250 255
Lys Phe Leu Arg Tyr Asn Ala Asn Lys Ala Leu Met Asn Leu Gly Tyr
260 265 270
Glu Ala Leu Phe Pro Arg Asp Glu Thr Asp Val Asn Pro Ala Ile Leu
275 280 285
Ser Ala Leu Ser Pro Asn Ala Asp Glu Asn His Asp Phe Phe Ser Gly
290 295 300
Ser Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gly Lys Ala Val Val Thr Glu Asp Asp
305 310 315 320
Asp Trp Asp Phe
<210> 13
<211> 277
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 13
Met Ala Arg Cys Asp Val Leu Val Ser Ala Asp Trp Ala Glu Ser Asn
1 5 10 15
Leu His Ala Pro Lys Val Val Phe Val Glu Val Asp Glu Asp Thr Ser
20 25 30
Ala Tyr Asp Arg Asp His Ile Ala Gly Ala Ile Lys Leu Asp Trp Arg
35 40 45
Thr Asp Leu Gln Asp Pro Val Lys Arg Asp Phe Val Asp Ala Gln Gln
50 55 60
Phe Ser Lys Leu Leu Ser Glu Arg Gly Ile Ala Asn Glu Asp Thr Val
65 70 75 80
Ile Leu Tyr Gly Gly Asn Asn Asn Trp Phe Ala Ala Tyr Ala Tyr Trp
85 90 95
Tyr Phe Lys Leu Tyr Gly His Glu Lys Val Lys Leu Leu Asp Gly Gly
100 105 110
Arg Lys Lys Trp Glu Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Ser Asp Pro Val
115 120 125
Ser Arg Pro Val Thr Ser Tyr Thr Ala Ser Pro Pro Asp Asn Thr Ile
130 135 140
Arg Ala Phe Arg Asp Glu Val Leu Ala Ala Ile Asn Val Lys Asn Leu
145 150 155 160
Ile Asp Val Arg Ser Pro Asp Glu Phe Ser Gly Lys Ile Leu Ala Pro
165 170 175
Ala His Leu Pro Gln Glu Gln Ser Gln Arg Pro Gly His Ile Pro Gly
180 185 190
Ala Ile Asn Val Pro Trp Ser Arg Ala Ala Asn Glu Asp Gly Thr Phe
195 200 205
Lys Ser Asp Glu Glu Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Ala Gly Leu Asp
210 215 220
Asn Ser Lys Glu Thr Ile Ala Tyr Cys Arg Ile Gly Glu Arg Ser Ser
225 230 235 240
His Thr Trp Phe Val Leu Arg Glu Leu Leu Gly His Gln Asn Val Lys
245 250 255
Asn Tyr Asp Gly Ser Trp Thr Glu Tyr Gly Ser Leu Val Gly Ala Pro
260 265 270
Ile Glu Leu Gly Ser
275
<210> 14
<211> 262
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 14
Met Ala Asn Trp Tyr Arg Pro Asn Tyr Pro Glu Val Arg Ser Arg Val
1 5 10 15
Leu Gly Leu Pro Glu Lys Val Arg Ala Cys Leu Phe Asp Leu Asp Gly
20 25 30
Val Leu Thr Asp Thr Ala Ser Leu His Thr Lys Ala Trp Lys Ala Met
35 40 45
Phe Asp Ala Tyr Leu Ala Glu Arg Ala Glu Arg Thr Gly Glu Lys Phe
50 55 60
Val Pro Phe Asp Pro Ala Ala Asp Tyr His Thr Tyr Val Asp Gly Lys
65 70 75 80
Lys Arg Glu Asp Gly Val Arg Ser Phe Leu Ser Ser Arg Ala Ile Glu
85 90 95
Ile Pro Asp Gly Ser Pro Asp Asp Pro Gly Ala Ala Glu Thr Val Tyr
100 105 110
Gly Leu Gly Asn Arg Lys Asn Asp Met Leu His Lys Leu Leu Arg Asp
115 120 125
Asp Gly Ala Gln Val Phe Asp Gly Ser Arg Arg Tyr Leu Glu Ala Val
130 135 140
Thr Ala Ala Gly Leu Gly Val Ala Val Val Ser Ser Ser Ala Asn Thr
145 150 155 160
Arg Asp Val Leu Ala Thr Thr Gly Leu Asp Arg Phe Val Gln Gln Arg
165 170 175
Val Asp Gly Val Thr Leu Arg Glu Glu His Ile Ala Gly Lys Pro Ala
180 185 190
Pro Asp Ser Phe Leu Arg Ala Ala Glu Leu Leu Gly Val Thr Pro Asp
195 200 205
Ala Ala Ala Val Phe Glu Asp Ala Leu Ser Gly Val Ala Ala Gly Arg
210 215 220
Ala Gly Asn Phe Ala Val Val Val Gly Ile Asn Arg Thr Gly Arg Ala
225 230 235 240
Ala Gln Ala Ala Gln Leu Arg Arg His Gly Ala Asp Val Val Val Thr
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Leu Leu
260
<210> 15
<211> 100
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 15
Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val
20 25 30
Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly
35 40 45
Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys
50 55 60
Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly
65 70 75 80
Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser
85 90 95
Gln Met Gly Phe
100
<210> 16
<211> 95
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 16
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
85 90 95
<210> 17
<211> 262
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 17
Met Thr Ser Ala Pro Thr Val Ser Val Ile Thr Ile Ser Phe Asn Asp
1 5 10 15
Leu Asp Gly Leu Gln Arg Thr Val Lys Ser Val Arg Ala Gln Arg Tyr
20 25 30
Arg Gly Arg Ile Glu His Ile Val Ile Asp Gly Gly Ser Gly Asp Asp
35 40 45
Val Val Ala Tyr Leu Ser Gly Cys Glu Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gln
50 55 60
Ser Glu Pro Asp Gly Gly Arg Tyr Asp Ala Met Asn Gln Gly Ile Ala
65 70 75 80
His Ala Ser Gly Asp Leu Leu Trp Phe Leu His Ser Ala Asp Arg Phe
85 90 95
Ser Gly Pro Asp Val Val Ala Gln Ala Val Glu Ala Leu Ser Gly Lys
100 105 110
Gly Pro Val Ser Glu Leu Trp Gly Phe Gly Met Asp Arg Leu Val Gly
115 120 125
Leu Asp Arg Val Arg Gly Pro Ile Pro Phe Ser Leu Arg Lys Phe Leu
130 135 140
Ala Gly Lys Gln Val Val Pro His Gln Ala Ser Phe Phe Gly Ser Ser
145 150 155 160
Leu Val Ala Lys Ile Gly Gly Tyr Asp Leu Asp Phe Gly Ile Ala Ala
165 170 175
Asp Gln Glu Phe Ile Leu Arg Ala Ala Leu Val Cys Glu Pro Val Thr
180 185 190
Ile Arg Cys Val Leu Cys Glu Phe Asp Thr Thr Gly Val Gly Ser His
195 200 205
Arg Glu Pro Ser Ala Val Phe Gly Asp Leu Arg Arg Met Gly Asp Leu
210 215 220
His Arg Arg Tyr Pro Phe Gly Gly Arg Arg Ile Ser His Ala Tyr Leu
225 230 235 240
Arg Gly Arg Glu Phe Tyr Ala Tyr Asn Ser Arg Phe Trp Glu Asn Val
245 250 255
Phe Thr Arg Met Ser Lys
260
<210> 18
<211> 265
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 18
Met Val Ile Val Ala Asp Lys Ala Ala Gly Arg Val Ala Asp Pro Val
1 5 10 15
Leu Arg Pro Val Gly Ala Leu Gly Asp Phe Phe Ala Met Thr Leu Asp
20 25 30
Thr Ser Val Cys Met Phe Lys Pro Pro Phe Ala Trp Arg Glu Tyr Leu
35 40 45
Leu Gln Cys Trp Phe Val Ala Arg Val Ser Thr Leu Pro Gly Val Leu
50 55 60
Met Thr Ile Pro Trp Ala Val Ile Ser Gly Phe Leu Phe Asn Val Leu
65 70 75 80
Leu Thr Asp Ile Gly Ala Ala Asp Phe Ser Gly Thr Gly Cys Ala Ile
85 90 95
Phe Thr Val Asn Gln Ser Ala Pro Ile Val Thr Val Leu Val Val Ala
100 105 110
Gly Ala Gly Ala Thr Ala Met Cys Ala Asp Leu Gly Ala Arg Thr Ile
115 120 125
Arg Glu Glu Leu Asp Ala Leu Arg Val Met Gly Ile Asn Pro Ile Gln
130 135 140
Ala Leu Ala Ala Pro Arg Val Leu Ala Ala Thr Thr Val Ser Leu Ala
145 150 155 160
Leu Asn Ser Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ile Gly Ala Phe Phe Cys
165 170 175
Ser Val Phe Leu Met His Val Ser Ala Gly Ala Trp Val Thr Gly Leu
180 185 190
Thr Thr Leu Thr His Thr Val Asp Val Val Ile Ser Met Ile Lys Ala
195 200 205
Thr Leu Phe Gly Leu Met Ala Gly Leu Ile Ala Cys Tyr Lys Gly Met
210 215 220
Ser Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Val Gly Arg Ala Val Asn Glu Thr
225 230 235 240
Val Val Phe Ala Phe Ile Val Leu Phe Val Ile Asn Ile Val Val Thr
245 250 255
Ala Val Gly Ile Pro Phe Met Val Ser
260 265
<210> 19
<211> 303
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 19
Met Val Asp Pro Gln Leu Asp Gly Pro Gln Leu Ala Ala Leu Ala Ala
1 5 10 15
Val Val Glu Leu Gly Ser Phe Asp Ala Ala Ala Glu Arg Leu His Val
20 25 30
Thr Pro Ser Ala Val Ser Gln Arg Ile Lys Ser Leu Glu Gln Gln Val
35 40 45
Gly Gln Val Leu Val Val Arg Glu Lys Pro Cys Arg Ala Thr Thr Ala
50 55 60
Gly Ile Pro Leu Leu Arg Leu Ala Ala Gln Thr Ala Leu Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Ala Leu Ala Glu Met Gly Gly Asn Ala Ser Leu Lys Arg Thr Arg
85 90 95
Ile Thr Ile Ala Val Asn Ala Asp Ser Met Ala Thr Trp Phe Ser Ala
100 105 110
Val Phe Asp Gly Leu Gly Asp Val Leu Leu Asp Val Arg Ile Glu Asp
115 120 125
Gln Asp His Ser Ala Arg Leu Leu Arg Glu Gly Val Ala Met Gly Ala
130 135 140
Val Thr Thr Glu Arg Asn Pro Val Pro Gly Cys Arg Val His Pro Leu
145 150 155 160
Gly Glu Met Arg Tyr Leu Pro Val Ala Ser Arg Pro Phe Val Gln Arg
165 170 175
His Leu Ser Asp Gly Phe Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Pro Ser
180 185 190
Leu Ala Trp Asn Arg Asp Asp Gly Leu Gln Asp Met Leu Val Arg Lys
195 200 205
Ala Phe Arg Arg Ala Ile Thr Arg Pro Thr His Phe Val Pro Thr Thr
210 215 220
Glu Gly Phe Thr Ala Ala Ala Arg Ala Gly Leu Gly Trp Gly Met Phe
225 230 235 240
Pro Glu Lys Leu Ala Ala Ser Pro Leu Ala Asp Gly Ser Phe Val Arg
245 250 255
Val Cys Asp Ile His Leu Asp Val Pro Leu Tyr Trp Gln Cys Trp Lys
260 265 270
Leu Asp Ser Pro Ile Ile Ala Arg Ile Thr Asp Thr Val Arg Ala Ala
275 280 285
Ala Ser Gly Leu Tyr Arg Gly Gln Gln Arg Arg Arg Arg Pro Gly
290 295 300
<210> 20
<211> 328
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 20
Lys Asp Arg Val Gly Phe Leu Arg Gly Arg Ala Arg Pro Ala Ser Thr
1 5 10 15
Leu Ile Thr Arg Phe Ile Ala Asp His Gln Gly His Arg Glu Gly Pro
20 25 30
Asp Gly Leu Arg Trp Gly Val Glu Ser Ile Cys Thr Gln Leu Thr Glu
35 40 45
Leu Gly Val Pro Ile Ala Pro Ser Thr Tyr Tyr Asp His Ile Asn Arg
50 55 60
Glu Pro Ser Arg Arg Glu Leu Arg Asp Gly Glu Leu Lys Glu His Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val His Ala Ala Asn Tyr Gly Val Tyr Gly Ala Arg Lys Val
85 90 95
Trp Leu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Ile Glu Val Ala Arg Cys Thr Val
100 105 110
Glu Arg Leu Met Thr Lys Leu Gly Leu Ser Gly Thr Thr Arg Gly Lys
115 120 125
Ala Arg Arg Thr Thr Ile Ala Asp Pro Ala Thr Ala Arg Pro Ala Asp
130 135 140
Leu Val Gln Arg Arg Phe Gly Pro Pro Ala Pro Asn Arg Leu Trp Val
145 150 155 160
Ala Asp Leu Thr Tyr Val Ser Thr Trp Ala Gly Phe Ala Tyr Val Ala
165 170 175
Phe Val Thr Asp Ala Tyr Ala Arg Arg Ile Leu Gly Trp Arg Val Ala
180 185 190
Ser Thr Met Ala Thr Ser Met Val Leu Asp Ala Ile Glu Gln Ala Ile
195 200 205
Trp Thr Arg Gln Gln Glu Gly Val Leu Asp Leu Lys Asp Val Ile His
210 215 220
His Thr Asp Arg Gly Ser Gln Tyr Thr Ser Ile Arg Phe Ser Glu Arg
225 230 235 240
Leu Ala Glu Ala Gly Ile Gln Pro Ser Val Gly Ala Val Gly Ser Ser
245 250 255
Tyr Asp Asn Ala Leu Ala Glu Thr Ile Asn Gly Leu Tyr Lys Thr Glu
260 265 270
Leu Ile Lys Pro Gly Lys Pro Trp Arg Ser Ile Glu Asp Val Glu Leu
275 280 285
Ala Thr Ala Arg Trp Val Asp Trp Phe Asn His Arg Arg Leu Tyr Gln
290 295 300
Tyr Cys Gly Asp Val Pro Pro Val Glu Leu Glu Ala Ala Tyr Tyr Ala
305 310 315 320
Gln Arg Gln Arg Pro Ala Ala Gly
325
<210> 21
<211> 412
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 21
Met Lys Ile Arg Thr Leu Ser Gly Ser Val Leu Glu Pro Pro Ser Ala
1 5 10 15
Val Arg Ala Thr Pro Gly Thr Ser Met Leu Lys Leu Glu Pro Gly Gly
20 25 30
Ser Thr Ile Pro Lys Ile Pro Phe Ile Arg Pro Ser Phe Pro Gly Pro
35 40 45
Ala Glu Leu Ala Glu Asp Phe Val Gln Ile Ala Gln Ala Asn Trp Tyr
50 55 60
Thr Asn Phe Gly Pro Asn Glu Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Arg Asp
65 70 75 80
Tyr Leu Gly Pro His Leu His Val Ala Thr Leu Ala Asn Gly Thr Leu
85 90 95
Ala Leu Leu Ala Ala Leu His Val Ser Phe Gly Ala Gly Thr Arg Asp
100 105 110
Arg Tyr Leu Leu Met Pro Ser Phe Thr Phe Val Gly Val Ala Gln Ala
115 120 125
Ala Leu Trp Thr Gly Tyr Arg Pro Trp Phe Ile Asp Ile Asp Ala Asn
130 135 140
Thr Trp Gln Pro Cys Val His Ser Ala Arg Ala Val Ile Glu Arg Phe
145 150 155 160
Arg Asp Arg Ile Ala Gly Ile Leu Leu Ala Asn Val Phe Gly Val Gly
165 170 175
Asn Pro Gln Ile Ser Val Trp Glu Glu Leu Ala Ala Glu Trp Glu Leu
180 185 190
Pro Ile Val Leu Asp Ser Ala Ala Gly Phe Gly Ser Thr Tyr Ala Asp
195 200 205
Gly Glu Arg Leu Gly Gly Arg Gly Ala Cys Glu Ile Phe Ser Phe His
210 215 220
Ala Thr Lys Pro Phe Ala Val Gly Glu Gly Gly Ala Leu Val Ser Arg
225 230 235 240
Asp Pro Arg Leu Val Glu His Ala Tyr Lys Phe Gln Asn Phe Gly Leu
245 250 255
Val Gln Thr Arg Glu Ser Ile Gln Leu Gly Met Asn Gly Lys Leu Ser
260 265 270
Glu Ile Ser Ala Ala Ile Gly Leu Arg Gln Leu Val Gly Leu Asp Arg
275 280 285
Arg Leu Ala Ser Arg Arg Lys Val Leu Glu Cys Tyr Arg Thr Gly Met
290 295 300
Ala Asp Ala Gly Val Arg Phe Gln Asp Asn Ala Asn Val Ala Ser Leu
305 310 315 320
Cys Phe Ala Ser Ala Cys Cys Thr Ser Ala Asp His Lys Ala Ala Val
325 330 335
Leu Gly Ser Leu Arg Arg His Ala Ile Glu Ala Arg Asp Tyr Tyr Asn
340 345 350
Pro Pro Gln His Arg His Pro Tyr Phe Val Thr Asn Ala Glu Leu Val
355 360 365
Glu Ser Thr Asp Leu Ala Val Thr Ala Asp Ile Cys Ser Arg Ile Val
370 375 380
Ser Leu Pro Val His Asp His Met Ala Pro Asp Asp Val Ala Arg Val
385 390 395 400
Val Ala Ala Val Gln Glu Ala Glu Val Arg Gly Glu
405 410
<210> 22
<211> 99
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 22
Met Glu Lys Met Ser His Asp Pro Ile Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gln
1 5 10 15
Val Ser Asp Asn Ala Leu His Gly Val Thr Ala Gly Ser Thr Ala Leu
20 25 30
Thr Ser Val Thr Gly Leu Val Pro Ala Gly Ala Asp Glu Val Ser Ala
35 40 45
Gln Ala Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Gly Ile Gln Leu Leu Ala Ser
50 55 60
Asn Ala Ser Ala Gln Asp Gln Leu His Arg Ala Gly Glu Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Val Ala Arg Thr Tyr Ser Gln Ile Asp Asp Gly Ala Ala Gly Val
85 90 95
Phe Ala Glu
<210> 23
<211> 280
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 23
Met Ala Glu Pro Leu Ala Val Asp Pro Thr Gly Leu Ser Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys Leu Ala Gly Leu Val Phe Pro Gln Pro Pro Ala Pro Ile Ala
20 25 30
Val Ser Gly Thr Asp Ser Val Val Ala Ala Ile Asn Glu Thr Met Pro
35 40 45
Ser Ile Glu Ser Leu Val Ser Asp Gly Leu Pro Gly Val Lys Ala Ala
50 55 60
Leu Thr Arg Thr Ala Ser Asn Met Asn Ala Ala Ala Asp Val Tyr Ala
65 70 75 80
Lys Thr Asp Gln Ser Leu Gly Thr Ser Leu Ser Gln Tyr Ala Phe Gly
85 90 95
Ser Ser Gly Glu Gly Leu Ala Gly Val Ala Ser Val Gly Gly Gln Pro
100 105 110
Ser Gln Ala Thr Gln Leu Leu Ser Thr Pro Val Ser Gln Val Thr Thr
115 120 125
Gln Leu Gly Glu Thr Ala Ala Glu Leu Ala Pro Arg Val Val Ala Thr
130 135 140
Val Pro Gln Leu Val Gln Leu Ala Pro His Ala Val Gln Met Ser Gln
145 150 155 160
Asn Ala Ser Pro Ile Ala Gln Thr Ile Ser Gln Thr Ala Gln Gln Ala
165 170 175
Ala Gln Ser Ala Gln Gly Gly Ser Gly Pro Met Pro Ala Gln Leu Ala
180 185 190
Ser Ala Glu Lys Pro Ala Thr Glu Gln Ala Glu Pro Val His Glu Val
195 200 205
Thr Asn Asp Asp Gln Gly Asp Gln Gly Asp Val Gln Pro Ala Glu Val
210 215 220
Val Ala Ala Ala Arg Asp Glu Gly Ala Gly Ala Ser Pro Gly Gln Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Gly Val Pro Ala Gln Ala Met Asp Thr Gly Ala Gly Ala
245 250 255
Arg Pro Ala Ala Ser Pro Leu Ala Ala Pro Val Asp Pro Ser Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Ser Thr Thr Thr Thr Leu
275 280

Claims (4)

1.一种蛋白组合物，其特征在于，所述蛋白组合物包含以下蛋白：
(a1) Rv0440和Rv0577和Rv0685和Rv1094蛋白的组合；
(a2) Rv0577和Rv1094和Rv2831蛋白的组合；或
(a3) Rv2031c和Rv1094和Rv3048蛋白的组合；
所述Rv3048蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.:12所示。
2.如权利要求1所述的蛋白组合物，所述蛋白组合物作为评价结核分枝杆菌感染时敏感性的标志物。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含标志物和任选的分离标签，所述标志物为如权利要求1所述的蛋白组合物。
4.一种权利要求1所述的蛋白组合物的用途，其特征在于，用于制备结核分枝杆菌感染的检测的试剂盒。
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