CN101294964A - 一种检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物医学检验领域，具体涉及一种检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂和方法。本发明基于基因组原理，公开了一种新型的结核杆菌检测试剂，其含有SEQ ID 1－2，4－5，8－28代表的蛋白或多肽。本方法使用单个或多个SEQ ID 1－28蛋白或多肽与结核杆菌宿主的T细胞相接触，检测从T细胞释放的细胞因子。它能有效地检测结核病和潜伏感染，同时它不受BCG疫苗的干扰。本发明还公开了基于上述蛋白或多肽及方法的诊断试剂盒和其他应用。本发明与现有技术T－SPOT比较，在没有降低特异性的情况下，能明显提高检出率，本试剂盒价廉，成本仅为T－SPOT试剂的1/5到1/10，有利于在发展中国家和贫困地区普及。

Description

一种检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂和方法

技术领域

本发明属生物医学检验领域，涉及微生物分子生物学检测方法，具体涉及一种检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂和方法。

背景技术

结核病的病原体是结核杆菌，属于分枝杆菌属。结核病已成为当今的一个主要的公共健康问题。据有关报道，全世界每年大约有800-1000万新发结核病例，每年有200-300万人因此而失去生命，结核病是引起成年人死亡的头号传染病。据WHO报道，全球三分之一的人口(约20亿)已感染了结核杆菌，如不采取措施，近10年内还将有约3亿人受结核杆菌感染。据第四次全国流行病学调查显示，我国受结核杆菌感染人数超过4亿，每年有13万人死于结核病，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二。

在全面实施直接督导治疗(DOTS)策略后，中国的结核发病率并没有如预期地出现下降，这与潜在的大量未被诊断的潜伏感染以及痰菌阴性结核病人未被及时诊断有关，这些感染者成为一个巨大的结核病源库，DOTS计划只能针对发病的肺结核患者，而对于控制潜伏感染的病人或者痰菌阴性的症状不典型的患者没有贡献。目前，发达国家已经充分注意到这一现象，在7年前甚至更早已经启动对潜伏感染患者的干预。在美国，对高危人群进行结核潜伏感染的筛查是控制结核的关键措施，自1993年以来结核发病率的下降和目前控制的水平都显示了公共卫生工作的巨大成就，美国要达到在2010年消灭结核这一目标的前景也更为乐观。美国的经验对于全球控制结核病是个有益的启示，特别是在DOTS计划得到较好实施的中国，新的控制策略意义更为重大。全球结核控制的一项策略是在高危人群中实施有效的筛查计划，这样可以鉴别出那些有潜伏感染的病人，通过治疗他们来预防结核。而其中最突出的问题是如何准确迅速地发现潜伏感染者和高危人群并加以控制。

目前诊断结核患者中主要采用的方法有：胸部X光片、涂片镜检、培养法、TST皮试等。其中X光片无法早期及时发现；涂片法敏感性特异性差；培养法耗时长，需要4-8周时间；TST皮试实验则特异性差，无法准确区分卡介苗(BCG)接种者和结核病患者。

特异性抗原诊断一直是确认和评估病原体感染及感染状况较为可靠的方法，且有早期诊断价值，已经在HBV、HCV、HIV等疾病的诊断方面获得了广泛的应用。由于人体在对抗结核杆菌的感染中，细胞免疫起到了关键性的作用，所以寻找结核杆菌特异性的T细胞抗原和检测T细胞免疫反应已经成为近年来研究的热点。国际上已有报道的T-SPOT试剂正是使用结核杆菌的特异性抗原ESAT-6和CFP-10，以Elispot方法诊断结核早期感染(专利号CN 1350546A)。

但是上述ESAT-6、Cfp-10抗原属于结核杆菌早期分泌蛋白，在结核持续感染中分泌量减少，导致检测的敏感性不足，局限了该试剂的推广。另有研究显示T-SPOT试剂在发展中国家的效果并不理想，推测可能与发展中国家非结核分枝杆菌感染率高有关。另外，T-SPOT试剂价格昂贵，每一人份约合80美金，在发展中国家难以推广。

随着结核杆菌全基因组测序的完成(S.T.Cole等Deciphering the biologyof Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence[J].Nature.1998，393：537-544)，和结核分枝杆菌与BCG基因组的差异被揭示(Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovisBCG and virulent M-bovis JOURNAL OF BACTERIOLOGY 178(5)：1274-1282 MAR1996)，基于基因组原理寻找结核杆菌特异抗原成为了现实。寻找新的结核杆菌特异性抗原，并通过研究将其应用到结核感染的诊断中，引起了本领域研究人员的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂。本发明公开了一种新型的结核杆菌检测试剂，其含有SEQ ID 1-2，4-5，8-28代表的蛋白或多肽。它能有效地检测结核病和潜伏感染，同时它不受BCG疫苗的干扰。

本发明的另一个目的是提供一种新型的检测分枝杆菌感染的方法，本方法使用单个或多个SEQ ID 1-28蛋白或多肽(不单独为3，6)与结核杆菌宿主的T细胞相接触，检测从T细胞释放的细胞因子。

本发明的再一个目的是提供上述蛋白或多肽的制备方法。

本发明的进一步目的是提供基于上述蛋白或多肽及方法的诊断试剂盒和其他应用。

本发明的一个方面，提供了一组新的蛋白和多肽，是由SEQ ID 1-2，4-5，8-28所代表的氨基酸序列。它们来自于卡介苗相对结核分枝杆菌缺失的区域(RD区)，可用于检测活动性结核病和结核潜伏感染。它们完整或部分地来自于结核分枝杆菌基因Rv1978，Rv1981c，Rv1984，Rv1985c，Rv3429，Rv3425所编码的蛋白。

SEQ ID序列如下：

其中，序列1-7(见序列表)所代表的蛋白为：

1.Rv1978蛋白；

2.Rv1981c蛋白(nrdF1)；

3.Rv1984(cfp21)蛋白；

4.Rv1985c蛋白；

5.Rv3429(PPE59)蛋白；

6.Rv1980c(MPT64)蛋白；

7.Rv3425(PPE57)蛋白；

8.多肽，选自mpt64

IQMSDPAYNINISLPSYYPDQKSLE

9.多肽，选自mpt64

YIAQTRDKFLSAATSST

10.多肽，选自mpt64

YELNITSATYQSAIPPRGTQAVVLKVYQNAGG

11.多肽，选自mpt64

LPVVFPIVQGELSKQ

12.多肽，选自mpt64

YQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPE

13.多肽，选自mpt64

LVPRSAIDS

14.多肽，选自cfp21

LVRIVGVVVATTLAL

15.多肽，选自cfp21

VVFARGTHQAS

16.多肽，选自cfp21

FVDSLTSQVGGRSIGVYAVNYPASD

17.多肽，选自cfp21

YRASASNGS

18.多肽，选自cfp21

WGGGSLPTIGPLYSSKTINLC

19.多肽，选自cfp21

IMAHVSYVQSGMTSQA

20.多肽，选自Rv1985c

VVELGSFDAAAERLHVTPSAVS

21.多肽，选自Rv1985c

VGQVLVVREKPCRAT

22.多肽，选自Rv1985c

IPLLRLAAQTAL

23.多肽，选自Rv1985c

ITIAVNADS

24.多肽，选自Rv1985c

VLLDVRIEDQDHSARLLREGVAMGA

25.多肽，选自Rv1985c

MRYLPVASRPFVQRHLSDGF

26.多肽，选自Rv1985c

LQDMLVRKAFRRAITRPT

27.多肽，选自Rv1985c

FVRVCDIHLDVPLYWQCWKLDSPIIA

28.多肽，选自Rv1985c

VRAAASGLYRGQQRRRR

本发明中涉及所有氨基酸序列都是从N端到C端的。

其中Seq ID 1-4，6，8-28属于RD2区，Seq ID 5，7属于RD11区。由于BCG不具有上述基因，从而保证该试剂可以避免BCG干扰。本发明与现有技术有明显的区别，有关研究论文PPE protein(Rv3425)from DNA segment RD11 ofMycobacterium tuberculosis：a potential B-cell antigen used forserological diagnosis to distinguish vaccinated controls fromtuberculosis patients Clinical Microbiology and Infection，Volume 13Number 2，February 2007中已经公开了Rv3425蛋白的血清学方法检测人类结核感染。本领域公知，血清学方法是基于B细胞免疫反应，与T细胞免疫反应从原理上大相径庭，其是否能被人类T细胞所识别并应用于人类活动性结核病和结核潜伏感染方面未见报道。

本发明的另一个方面，提供一种新的检测结核杆菌感染的方法，通过使SEQID 1-28蛋白或多肽(不单独为3，6)其中至少使用1条以上大于9个氨基酸的多肽或其类似物，与结核杆菌宿主的T细胞相接触，确定T细胞是否识别这些蛋白或肽或类似物。

所述宿主通常指人，也可以是其他哺乳动物，如牛、羊、猪、啮齿动物等。

所述结核杆菌感染，通常指的是患有活动性或潜伏性结核杆菌的人群。也可以是健康的接触者，其已暴露于结核杆菌中。因此此方法可用于调查健康接触人群受结核感染情况。

上述方法中所述的T细胞通常在体内被来自结核杆菌的抗原预先致敏，这些T细胞可在宿主的外周血液、肺泡灌洗液、淋巴结及其它包含T细胞组织中被检出。此T细胞可以是CD4⁺T或CD8⁺T细胞，也可以是γδT细胞。

方法中所述的识别，通常是通过测定T细胞与蛋白或多肽接触后两者的结合或状态的变化来确定的。状态变化主要由于MHC/肽复合物与TCR(T细胞受体)特异的结合而诱发的T细胞的激活，它可以是T细胞开始分泌细胞因子或分泌量的增加，可以是T细胞摄入物质量的增加，也可以是T细胞大小、数量(增殖)或表面标志的改变。所述T细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α等。

具有代表性的是采用预先加入的抗体与分泌的细胞因子相结合，通过测定抗体或抗体复合物的存在来检测所述的因子。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是商品化购买的或者使用标准技术制备的。测定细胞因子的方法通常是领域内常用的方法，如Elisa，Elispot，Immunoblotting，T细胞增殖试验等。

在一个实施方案中，使用的检测系统是体外Elispot分析，其被述于WO98/23960。本方案中，检测的是T细胞分泌的IFN-γ。IFN-γ与固定在固相载体上的第一IFN-γ抗体特异结合，然后是用酶联标记第二IFN-γ抗体特异结合一抗复合物。也使用生物素偶联的第二IFN-γ抗体结合一抗复合物，然后使用酶联的抗生物素蛋白链菌素与生物素特异结合。最后通过酶的显色底物在固相载体上形成“斑点”，每个斑点代表一个分泌IFN-γ的T细胞，斑点的数量可以代表性的显示被激活的T细胞的数量。

检测蛋白/多肽与T细胞的结合也可以通过FACS仪器来进行。通常在已接触抗原的T细胞的出现频率是10^-3-10^-6，如果被分选细胞的频率高于正常对照值，则可定量确定细胞已接触此抗原。

方法中所述T细胞可以是体外分离的，也可以是未加工过的或者是体内的。在一个实施方案中，从血液或其他样本中分离单核细胞(PBMC)，其中将包括T细胞和抗原递呈细胞(APC)。APC可将抗原肽递呈给T细胞。APC可以是天然生成的或者是人工APC。典型的APC是在体外新分离的细胞或经过培养的细胞。

在一个实施方案中，将蛋白加入包含了T细胞和APC的实验中一同孵育。此处APC参与了递呈抗原多肽到T细胞的过程。如使用可以被T细胞识别而无需由APC递呈的肽时，APC不是必需的，如前一种肽的类似物——MHC/肽的四聚体。

蛋白或多肽与T细胞接触的时间长短可以根据所测定的识别方法有所变化。具有代表性的是，实验中加入10⁴-10⁷的PBMC或20-500ul的全血。加入蛋白或多肽的浓度是0.1-100ug/ml。T细胞与蛋白或多肽一起孵育的典型时间是6-36小时。在一个实施方案中，将5*10⁵体外分离的PBMC与终浓度10ug/ml蛋白在37度5％CO₂培养箱中孵育22小时。

也可以在体内检查以确定T细胞对蛋白或多肽的识别。具有代表性的是，体内注射此抗原物质或施给表达此抗原物质的多核苷酸。可以通过DTH反应的出现来指示肽在体内的识别，例如检查硬化、红斑或水肿等。

上下文中所述“蛋白”和“肽”除了通常所指的一种氨基酸聚合物，还应该包括其类似物。

所述类似物，是指其特性与所述蛋白或多肽相同，包括其同样可以特异性的与T细胞或抗体结合。具有代表性的是所述类似物具有相同的形状、大小、柔韧性、电子排布等。

典型的类似物是肽。它可与SEQ ID 1-28所代表的氨基酸序列同源。与另一肽同源的肽通常具有至少75％的同源性，优选至少90％、95％的同源性。一般，同源肽的不同来自于氨基酸残基的替换、插入、缺失和修饰。其可发生在序列的N端、C端或其他任何位置上。具有代表性的是类似物可以结合到相同的MHC分子上，且类似物中处于等价位置上的氨基酸与原始肽中的那些是相同的或保守的。

所述的修饰，通常指的是天然的转录后修饰或人工修饰。修饰可提供化学部分的改变，包括氨基、乙酰基、羟基、卤素基团和碳水化合物基团。具有代表性的是一种是氨基酸侧链的修饰，即形成一个或多个非天然氨基酸。

另一种有代表性的类似物是一种通过生物素/抗生物素蛋白链菌素系统将多个结合原始肽或类似肽的MHC II分子聚合在一起的一种聚合分子。此类似物典型地抑制肽/MHC II类复合物与T细胞受体的结合，或能与此复合物特异的抗体结合。

本发明的再一个方面，提供了用于上述方法的Rv1978，Rv1981c，Rv1985c，Rv3429蛋白和多肽的制备方法。

所述的蛋白和多肽可以是天然分离的，也可以是人工合成的。一种具有代表性的方法是，由较长的融合蛋白制备所述肽，此融合蛋白代表性的包含此述肽。所述肽也可由多肽经过物理或化学裂解所产生。

在一个实施方案中，所用的多肽是由固相甲酰基化合成仪合成的。所用的蛋白是经大肠杆菌重组蛋白，在每个蛋白的N端添加一小段His-tag以方便纯化。

具体包括以下步骤：

1)Rv1978，Rv1981c，Rv1985c，Rv3429基因扩增和克隆

2)构建pET30重组载体

3)Rv1978，Rv1981c，Rv1985c，Rv3429蛋白的原核诱导表达

4)Rv1978，Rv1981c，Rv1985c，Rv3429蛋白的纯化。

方法中所述的扩增可以使用PCR、重组法或人工合成方法获得。在实施例1中所用的是PCR方法，模板是结核杆菌基因组，也可以是市售的cDNA库或其他包含目的基因的序列。所用的表达载体是原核表达载体pET30a和pET32a(Novagen)，也可以是其它真核或原核表达载体，如耻垢杆菌和酵母表达系统。

本发明的再一个方面，提供了实施此方法的试剂盒，所述的试剂盒其包括序列为ID 1-28的一种或多种蛋白或多肽或其类似物，以及一种检测T细胞对蛋白或多肽识别的工具。所述的试剂盒中的多种蛋白或多肽可以是单独使用(不单独使用3，6)，也可以混合、连续使用，以提高检测的敏感性。如实施例中联合使用多肽8-28，其检测敏感性为82％。

试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照所选用的抗原对绝大多数个体的T细胞均能产生应答，如市售的PHA(植物血凝素)。阴性对照通常不加入抗原成分，选用培养基或其他缓冲液。

本发明还提供所述蛋白或多肽的应用，用以产生对所述蛋白或多肽特异的抗体。此抗体可通过抗原对宿主动物免疫，经纯化产生的抗体。该抗体能够特异地与抗原物质结合，通常可根据来源分为单克隆抗体或多克隆抗体。产生抗体的方法是本领域内公知的，多克隆抗体通常包括使用抗原(蛋白或多肽)免疫宿主动物，一段时间后从血清中分离免疫球蛋白，如IgG等；产生单克隆抗体的方法包括无限增殖产生目的抗体的细胞，通常将来自被接种实验动物的脾细胞与肿瘤细胞融合，来产生杂交瘤细胞(具体参见Kohler and Milstein，1975 Nature256，495-497)。适用于产生单克隆或多克隆抗体的实验动物包括山羊、兔、大鼠或小鼠等。

本发明能有效地检测结核病和潜伏感染，同时它不受BCG疫苗的干扰。与现有技术T-SPOT比较，在没有降低特异性的情况下，能明显提高检出率，本试剂盒相比T-SPOT试剂的另一个优点是价廉。成本仅为T-SPOT试剂的1/5到1/10，有利于在发展中国家和贫困地区普及。

附图说明

图1：是ELISPOT结果判定实例，其中，

左为阴性结果，斑点数为零；右为阳性结果，斑点数远大于6个，且大于2倍阴性对照孔斑点数。

具体实施方式

实施例1：

Rv1978，Rv1981c，Rv1985c，Rv3429基因的克隆表达和蛋白纯化

3、PCR扩增和基因克隆

表1：引物设计

引物名称	引物序列
		Rv1978-F	ATTCATATGGGAGAGGCGAACATCCGCGAGCAG
Rv1978-R	TATGTCGACTTTGCCGGGTTGGCGATCGG
		Rv1981-F	ATTCATATGACCGGCAAGCTCGTTGAGC
Rv1981-R	TATCTCGAGGAAGTCCCAGTCGGTGTCGGT
		Rv3429-F	GACAAGCTTCTACCCGCCCCCGCCCCCGTAG
Rv3429-R	GACGGATCCATGCATCCAATGATACCAGCGGAG
		Rv1985-F	ATCCATATGGTGGATCCGCAGCTTGACGGT
Rv1985-R	TATGTCGACACCCGGTCGGCGGCG

注：带下划线表示为引入的酶切位点。F：前端引物，R：末端引物。

以H37Rv株基因组DNA为模板，表1序列为引物，分别使用ExTaq酶(Takara公司)PCR扩增上述基因。PCR反应条件如表2。PCR产物经纯化(华舜PCR产物纯化试剂盒)后直接连接到pMD-19T(Takara公司)质粒中，并转化入大肠杆菌DH5a感受态。挑取重组菌落，37℃ 5ml LB培养基培养过夜。然后使用质粒抽提试剂盒(华舜)抽取pMD19T重组质粒。

表2：PCR反应条件

目的基因	PCR反应条件
		Rv1978	95℃预变性5分钟，1个循环；94℃1分钟，66℃30秒，72℃90秒，30个循环；72℃5分钟，1个循环。
Rv1981c	95℃预变性5分钟，1个循环；94℃1分钟，63℃30秒，72℃90秒，30个循环；72℃5分钟，1个循环。
		Rv1985c	95℃预变性5分钟，1个循环；94℃1分钟，66℃30秒，72℃90秒，30个循环；72℃5分钟，1个循环。
Rv3429	95℃预变性5分钟，1个循环；94℃1分钟，67℃1分钟，72℃45秒，30个循环；72℃5分钟，1个循环。

2、表达重组载体的构建

所得克隆pMD-19T::Rv1978，pMD-19T::Rv1985c经NdeI，SalI双酶切后，割胶回收基因片段，然后连接入(T4连接酶)pET30a质粒NdeI，XhoI双酶切位点中。克隆pMD-19T::Rv1981c，经NdeI，XhoI双酶切后，割胶回收基因片段，然后连接入(T4连接酶)pET30a质粒NdeI，XhoI双酶切位点中。克隆pMD-19T::Rv3429经HindIII，BamhI双酶切后，割胶回收基因片段，然后连接入(T4连接酶)pET32a质粒HindIII，BamhI双酶切位点中。

测序表明所插入序列与Gene Bank中H37Rv结核全基因组对应基因序列完全一致(Rv1978基因号为885928，蛋白登陆号：NP_216494.1；Rv1981c基因号为885923，蛋白登陆号：YP_177853.1；Rv1985c基因号为885918，蛋白登陆号：NP_216501.1；Rv3429基因号为887630，蛋白登陆号：YP_177973.1)。

3、Rv1978，Rv1981c，Rv1985c，Rv3429蛋白的诱导表达

分别将5株pET重组质粒转化到大肠杆菌BL21的感受态细胞中。挑取培养菌落，按1％接种LB培养基中，37℃，220rpm培养至600nm OD 0.6左右，加0.1％IPTG(BBI)，37℃，220rpm诱导培养4小时，离心收集菌体。菌体沸水浴5分钟，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白表达量。

4、重组Rv1978，Rv1981c，Rv1985c，Rv3429蛋白的纯化

通过预实验得知蛋白以包涵体形式表达。

以1×Binding Buffer(0.5M NaCl，20mM Tris，5mM咪唑，pH7.9)重悬诱导后菌体，超声破碎。包涵体溶于含8M尿素的1×Binding Buffer，37℃搅拌1小时充分溶解蛋白质。16000rpm离心1小时，收集上清。

His-Bind离子亲和柱(Novagen)纯化蛋白：

a.10倍介质体积(10V)无菌水冲洗柱子；

b.5V 1×Charge Buffer(500mM NiSO4)洗柱；

c.10V含8M尿素的1×Binding Buffer冲洗；

d.2V含目标蛋白上清上样；

e.10V 1×Binding Buffer冲洗；

f.10V含8M尿素的Wash buffer(0.5M NaCl，20mM Tris，20mM咪唑，pH7.9)冲洗；

g.3V 8M尿素的Elute buffer(0.5M NaCl，500mM Tris，20mM咪唑，pH7.9)洗脱；

收集过柱后的目的蛋白。

5、蛋白的透析和保存

分别对上述收集的目标蛋白透析复性12小时(0.5M NaCl，5mM Tris，pH7.4)，16000rpm离心除去沉淀物。

上清蛋白分别过Sephordex G25(GE Healthcare)更换介质，用储存液(10％甘油，25mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)洗脱目的蛋白。使用Bradford方法检测蛋白浓度及高效液相色谱(HPLC)、质谱分析蛋白纯度和分子量。

实施例2

从外周血中分离单核细胞(PBMC)

1)采取静脉血5ml至10ml至采血管中(BD公司)

2)将采血管室温下3000rpm离心10min，吸取中间层白色细胞，重悬于8ml细胞培养基RPMI1640(Gibco)中。

3)在15ml离心管(BD公司)中加入4ml Ficoll(Amresco)淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液轻轻加入淋巴细胞分离液上层。3000rpm室温离心20min。

4)吸取离心后的中间层细胞于新离心管中，加入RPMI1640重悬，混匀，2000rpm离心5min。

5)弃上清，加入5ml红细胞裂解液(Invitrogen)，室温孵育10min。

6)加入RPMI1640重悬，混匀，2000rpm离心5min，弃上清。

7)重悬细胞于1ml AIV-M培养基中(Gibco)，取细胞与typan blue 1∶1混合，加入血细胞计数板进行计数。

8)根据计数结果，用培养基稀释细胞

实施例3：

ELISPOT方法检测IFN-γ的分泌

●方法一

1)在96孔PVDF板(Millipore)上使用10ug/ml IFN-γmAB预包被过夜

2)用培养基RPMI 1640洗涤2遍，使用RPMI 1640+10％FBS 4℃封闭1小时

3)每孔中加入100ul浓度为5×10⁵个/ml的PBMC细胞。实验组中分别将蛋白或多肽分别加入孔中，终浓度为10ug/ml；阳性对照孔中加入终浓度为5ug/ml的PHA；阴性对照孔中加入100ul AIV-M。

4)37℃、5％CO2培养箱中孵育22小时。

5)弃细胞液，用含0.05％Tween20 PBS洗涤平板5次，每次250ul/孔。

6)加入新鲜配制的1∶200碱性磷酸酶标记抗IFN-γ mAB 50ul，4℃下孵育1小时。

7)再用含0.05％Tween20 PBS缓冲液洗板5次，甩干。

8)最后加入显色底物溶液BCIP/NBT 50ul/孔，室温下静置反应2-10min。然后用蒸馏水洗涤2遍，晾干

9)肉眼或显微镜下计斑点数，精确的斑点阅读与计数建议采用计算机辅助成像分析系统进行。

●判定标准

阳性结果：斑点数≥6个，且大于2倍阴性对照孔斑点数。

阴性结果：斑点数≤6个，或小于2倍阴性对照孔斑点数。

通常，在精确计数前用肉眼或放大镜观察，可通过斑点数直接判断阳性或阴性结果(图1)。

研究人群的资料特征：

结核患者、健康者和潜伏感染者是从2007年5月起在济南的山东省肺科医院、重庆的肺科医院和上海的华山医院组织招募的。从受测者中抽取的血液样品经过肝素或EDTA抗凝处理。

17例肺结核患者：临床结核分枝杆菌培养阳性，临床检查与X射线检查结果相符，且接受治疗的时程少于三周。HIV检测阴性。

10例健康者：接种过BCG疫苗，无发热，近期无结核病人接触史的健康人群。HIV检测阴性。

13例潜伏感染者(高危人群)：无发烧、咳嗽等明显症状，胸片提示为阴性，近期与临床诊断肺结核病人有着密切接触，如共同生活等，且T-SPOT试验阳性人群。HIV检测阴性。

表3是结核患者、结核感染者和健康者的人口统计特征。

表3

	结核患者	潜伏感染者	健康对照者
				总人数	17	13	10
年龄：平均(范围)	35(19-76)	36(14-61)	34(21-53)
				性别(男/女)	9/8	8/5	7/3

六种蛋白的ELISpot临床试验：

分别以终浓度为10ug/ml的Rv1978，Rv1981c，Rv1984，Rv1985c，Rv3429，MPT64，Rv3425蛋白对上述三组人群进行ELISpot检测。

结果显示：

ELISpot实验中，分别有7/15(47％)，12/16(75％)，14/15(93％)，9/17(53％)，9/15(60％)，12/16(75％)，9/14(64％)的结核患者对Rv1978，MPT64，Rv1985c，Rv1984，Rv1981c，Rv3425，Rv3429蛋白产生应答(表4)，17/17(100％)的患者对上述至少一种蛋白有应答；

其中，蛋白MPT64，Rv1985c，Rv3425特异的IFN-γ分泌T细胞出现频率较高，中位数分别为180，141，115每10⁶PBMC；

在结核潜伏感染人群中，分别有5/12(42％)，12/13(92％)，7/13(54％)，9/13(69％)，8/13(62％)，9/13(69％)，4/10(40％)的人群对Rv1978，MPT64，Rv1985c，Rv1984，Rv1981c，Rv3425，Rv3429蛋白产生应答(表4)。

无一健康对照者(0/10)对任一抗原蛋白产生阳性应答，即上述六种蛋白在此次临床实验中的特异性均为100％。

表4是三组人群T细胞对Rv1978，Rv1981c，Rv1984，Rv1985c，Rv3429，MPT64，Rv3425蛋白的应答。

表4

编号	Rv1978  MPT64   Rv1985c  Rv1984  Rv1981c  Rv3425  Rv3429
		患者(阳性人数/总人数)阳性率	7/15    12/16   14/15    9/17    9/15     12/16   9/1447％    75％    93％     53％     60％     75％    64％
潜伏感染者(阳性人数/总人数)	5/12    12/13   7/13     9/13    8/13     9/13    4/10
		阳性率	42％    92％    54％     69％     62％     69％    40％
健康人(阳性人数/总人数)	0/10    0/10    0/10     0/10    0/10     0/10    0/10

基于Rv1985c，Rv1984，MPT64混合多肽的ELISpot临床试验：

以混合多肽组ID No 8-28(每条终浓度为10ug/ml)对上述三组人群进行ELISpot检测。

结果显示：

有82％(14/17)的结核患者对混合多肽有阳性应答，同时有85％(11/13)的潜伏感染者有阳性应答，而在健康人群中无一人有应答。即该诊断试验在结核患者和潜伏感染者中敏感性分别为82％和85％，特异性均为100％。

表5是三组人群T细胞对多肽组IDNo 8-28的应答。

表5

编号	混合多肽
		患者(阳性人数/总人数)	14/17
阳性率	82％
		潜伏感染者(阳性人数/总人数)	11/13
阳性率	85％
		健康人(阳性人数/总人数)	0/10

与T-SPOT试剂比较

作为对照，结核患者同时进行了T-SPOT，检出率为94％。其中6％病人T-SPOT检测为阴性，但使用本方法Rv1978，Rv1981c，Rv1984，Rv1985c，Rv3429，MPT64，Rv3425六种蛋白及混合多肽组均检测为阳性。

本方法的六种抗原与T-SPOT比较，合并考虑多种抗原，在没有降低特异性的情况下，能明显提高检出率，超过T-SPOT的检出率(94％)。如合并考虑Rv1985c，MPT64，Rv3425三种抗原，可以提高试验的检出率到100％，超过了T-SPOT的检出率。

另外，本试剂盒相比T-SPOT试剂的另一个优点是价廉。成本仅为T-SPOT试剂的1/5到1/10，有利于在发展中国家和贫困地区普及。

●实施例4

ELISPOT方法检测IFN-γ的分泌(方法二)

步骤1-5与实施例3方法一相同

6)加入100ul 1ug/ml的生物素化抗IFN-γmAB，室温孵育2小时。

7)再用含0.05％Tween20 PBS缓冲液洗板5次，加入1∶1000的抗生物素蛋白酶链素-辣根过氧化物酶偶联物，37℃孵育1小时。

8)再用PBS缓冲液洗板5次，甩干。

9)最后加入HRP底物溶液(BD公司)50ul/孔，室温下静置反应5-25min。蒸馏水洗涤2遍，晾干。

10)显微镜下计斑点数，精确的斑点阅读与计数建议采用计算机辅助成像分析系统进行。

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学附属华山医院复旦大学

<120>一种检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂和方法

<130>11

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>282

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌

<400>1

Met Gly Glu Ala Asn Ile Arg Glu Gln Ala Ile Ala Thr Met Pro Arg

1               5                       10              15

Gly Gly Pro Asp Ala Ser Trp Leu Asp Arg Arg Phe Gln Thr Asp Ala

            20                      25              30

Leu Glu Tyr Leu Asp Arg Asp Asp Val Pro Asp Glu Val Lys Gln Lys

        35                      40              45

Ile Ile Gly Val Leu Asp Arg Val Gly Thr Leu Thr Asn Leu His Glu

    50                  55                  60

Lys Tyr Ala Arg Ile Ala Leu Lys Leu Val Ser Asp Ile Pro Asn Pro

65                  70                  75                  80

Arg Ile Leu Glu Leu Gly Ala Gly His Gly Lys Leu Ser Ala Lys Ile

                85                  90                  95

Leu Glu Leu His Pro Thr Ala Thr Val Thr Ile Ser Asp Leu Asp Pro

            100                 105                 110

Thr Ser Val Ala Asn Ile Ala Ala Gly Glu Leu Gly Thr His Pro Arg

        115                 120                 125

Ala Arg Thr Gln Val Ile Asp Ala Thr Ala Ile Asp Gly His Asp His

    130                 135                 140

Ser Tyr Asp Leu Ala Val Phe Ala Leu Ala Phe His His Leu Pro Pro

145                 150                 155                 160

Thr Val Ala Cys Lys Ala Ile Ala Glu Ala Thr Arg Val Gly Lys Arg

                165                 170                 175

Phe Leu Ile Ile Asp Leu Lys Arg Gln Lys Pro Leu Ser Phe Thr Leu

            180                 185                 190

Ser Ser Val Leu Leu Leu Pro Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Trp Ser

        195                 200                 205

Ser Met Arg Ser Ser Met His Asp Gly Phe Ile Ser Ala Leu Arg Ala

    210                 215                 220

Tyr Ser Pro Ser Ala Leu Gln Thr Leu Ala Arg Ala Ala Asp Pro Gly

225                 230                 235                 240

Met Gln Val Glu Ile Leu Pro Ala Pro Thr Arg Leu Phe Pro Pro Ser

            245                 250                 255

Leu Ala Val Val Phe Ser Arg Ser Ser Ser Ala Pro Thr Glu Ser Ser

        260                 265                 270

Glu Cys Ser Ala Asp Arg Gln Pro Gly Glu

    275                 280

<210>2

<211>322

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌

<400>2

Met Thr Gly Lys Leu Val Glu Arg Val His Ala Ile Asn Trp Asn Arg

1               5                   10                  15

Leu Leu Asp Ala Lys Asp Leu Gln Val Trp Glu Arg Leu Thr Gly Asn

            20                  25                  30

Phe Trp Leu Pro Glu Lys Ile Pro Leu Ser Asn Asp Leu Ala Ser Trp

        35                  40                  45

Gln Thr Leu Ser Ser Thr Glu Gln Gln Thr Thr Ile Arg Val Phe Thr

    50                  55                  60

Gly Leu Thr Leu Leu Asp Thr Ala Gln Ala Thr Val Gly Ala Val Ala

65                  70                  75                  80

Met Ile Asp Asp Ala Val Thr Pro His Glu Glu Ala Val Leu Thr Asn

                85                  90                  95

Met Ala Phe Met Glu Ser Val His Ala Lys Ser Tyr Ser Ser Ile Phe

            100                 105                 110

Ser Thr Leu Cys Ser Thr Lys Gln Ile Asp Asp Ala Phe Asp Trp Ser

        115                 120                 125

Glu Gln Asn Pro Tyr Leu Gln Arg Lys Ala Gln Ile Ile Val Asp Tyr

    130                 135                 140

Tyr Arg Gly Asp Asp Ala Leu Lys Arg Lys Ala Ser Ser Val Met Leu

145                 150                 155                 160

Glu Ser Phe Leu Phe Tyr Ser Gly Phe Tyr Leu Pro Met Tyr Trp Ser

                165                 170                 175

Ser Arg Gly Lys Leu Thr Asn Thr Ala Asp Leu Ile Arg Leu Ile Ile

            180                 185                 190

Arg Asp Glu Ala Val His Gly Tyr Tyr Ile Gly Tyr Lys Cys Gln Arg

        195                 200                 205

Gly Leu Ala Asp Leu Thr Asp Ala Glu Arg Ala Asp His Arg Glu Tyr

    210                 215                 220

Thr Cys Glu Leu Leu His Thr Leu Tyr Ala Asn Glu Ile Asp Tyr Ala

225                 230                 235                 240

His Asp Leu Tyr Asp Glu Leu Gly Trp Thr Asp Asp Val Leu Pro Tyr

                245                 250                 255

Met Arg Tyr Asn Ala Asn Lys Ala Leu Ala Asn Leu Gly Tyr Gln Pro

            260                 265                 270

Ala Phe Asp Arg Asp Thr Cys Gln Val Asn Pro Ala Val Arg Ala Ala

        275                 280                 285

Leu Asp Pro Gly Ala Gly Glu Asn His Asp Phe Phe Ser Gly Ser Gly

    290                 295                 300

Ser Ser Tyr Val Met Gly Thr His Gln Pro Thr Thr Asp Thr Asp Trp

305                 310                 315                 320

Asp Phe

<210>3

<211>217

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌

<400>3

Met Thr Pro Arg Ser Leu Val Arg Ile Val Gly Val Val Val Ala Thr

1               5                   10                  15

Thr Leu Ala Leu Val Ser Ala Pro Ala Gly Gly Arg Ala Ala His Ala

            20                  25                  30

Asp Pro Cys Ser Asp Ile Ala Val Val Phe Ala Arg Gly Thr His Gln

        35                  40                  45

Ala Ser Gly Leu Gly Asp Val Gly Glu Ala Phe Val Asp Ser Leu Thr

    50                  55                  60

Ser Gln Val Gly Gly Arg Ser Ile Gly Val Tyr Ala Val Asn Tyr Pro

65                  70                  75                  80

Ala Ser Asp Asp Tyr Arg Ala Ser Ala Ser Asn Gly Ser Asp Asp Ala

                85                  90                  95

Ser Ala His Ile Gln Arg Thr Val Ala Ser Cys Pro Asn Thr Arg Ile

            100                 105                 110

Val Leu Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Thr Val Ile Asp Leu Ser Thr

        115                 120                 125

Ser Ala Met Pro Pro Ala Val Ala Asp His Val Ala Ala Val Ala Leu

    130                 135                 140

Phe Gly Glu Pro Ser Ser Gly Phe Ser Ser Met Leu Trp Gly Gly Gly

145                 150                 155                 160

Ser Leu Pro Thr Ile Gly Pro Leu Tyr Ser Ser Lys Thr Ile Asn Leu

                165                 170                 175

Cys Ala Pro Asp Asp Pro Ile Cys Thr Gly Gly Gly Asn Ile Met Ala

            180                 185                 190

His Val Ser Tyr Val Gln Ser Gly Met Thr Ser Gln Ala Ala Thr Phe

        195                 200                 205

Ala Ala Asn Arg Leu Asp His Ala Gly

    210                 215

<210>4

<211>303

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌

<400>4

Met Val Asp Pro Gln Leu Asp Gly Pro Gln Leu Ala Ala Leu Ala Ala

1               5                   10                  15

Val Val Glu Leu Gly Ser Phe Asp Ala Ala Ala Glu Arg Leu His Val

            20                  25                  30

Thr Pro Ser Ala Val Ser Gln Arg Ile Lys Ser Leu Glu Gln Gln Val

        35                  40                  45

Gly Gln Val Leu Val Val Arg Glu Lys Pro Cys Arg Ala Thr Thr Ala

    50                  55                  60

Gly Ile Pro Leu Leu Arg Leu Ala Ala Gln Thr Ala Leu Leu Glu Ser

65                  70                  75                  80

Glu Ala Leu Ala Glu Met Gly Gly Asn Ala Ser Leu Lys Arg Thr Arg

                85                  90                  95

Ile Thr Ile Ala Val Asn Ala Asp Ser Met Ala Thr Trp Phe Ser Ala

            100                 105                 110

Val Phe Asp Gly Leu Gly Asp Val Leu Leu Asp Val Arg Ile Glu Asp

        115                 120                 125

Gln Asp His Ser Ala Arg Leu Leu Arg Glu Gly Val Ala Met Gly Ala

    130                 135                 140

Val Thr Thr Glu Arg Asn Pro Val Pro Gly Cys Arg Val His Pro Leu

145                 150                 155                 160

Gly Glu Met Arg Tyr Leu Pro Val Ala Ser Arg Pro Phe Val Gln Arg

                165                 170                 175

His Leu Ser Asp Gly Phe Thr Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Pro Ser

            180                 185                 190

Leu Ala Trp Asn Arg Asp Asp Gly Leu Gln Asp Met Leu Val Arg Lys

        195                 200                 205

Ala Phe Arg Arg Ala Ile Thr Arg Pro Thr His Phe Val Pro Thr Thr

    210                 215                 220

Glu Gly Phe Thr Ala Ala Ala Arg Ala Gly Leu Gly Trp Gly Met Phe

225                 230                 235                 240

Pro Glu Lys Leu Ala Ala Ser Pro Leu Ala Asp Gly Ser Phe Val Arg

                245                 250                 255

Val Cys Asp Ile His Leu Asp Val Pro Leu Tyr Trp Gln Cys Trp Lys

            260                 265                 270

Leu Asp Ser Pro Ile Ile Ala Arg Ile Thr Asp Thr Val Arg Ala Ala

        275                 280                 285

Ala Ser Gly Leu Tyr Arg Gly Gln Gln Arg Arg Arg Arg Pro Gly

    290                 295                 300

<210>5

<211>178

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌

<400>5

Met His Pro Met Ile Pro Ala Glu Tyr Ile Ser Asn Ile Ile Tyr Glu

1               5                   10                  15

Gly Pro Gly Ala Asp Ser Leu Ser Ala Ala Ala Glu Gln Leu Arg Leu

            20                  25                  30

Met Tyr Asn Ser Ala Asn Met Thr Ala Lys Ser Leu Thr Asp Arg Leu

        35                  40                  45

Gly Glu Leu Gln Glu Asn Trp Lys Gly Ser Ser Ser Asp Leu Met Ala

    50                  55                  60

Asp Ala Ala Gly Arg Tyr Leu Asp Trp Leu Thr Lys His Ser Arg Gln

65                  70                  75                  80

Ile Leu Glu Thr Ala Tyr Val Ile Asp Phe Leu Ala Tyr Val Tyr Glu

                85                  90                  95

Glu Thr Arg His Lys Val Val Pro Pro Ala Thr Ile Ala Asn Asn Arg

            100                 105                 110

Glu Glu Val His Arg Leu Ile Ala Ser Asn Val Ala Gly Val Asn Thr

        115                 120                 125

Pro Ala Ile Ala Gly Leu Asp Ala Gln Tyr Gln Gln Tyr Arg Ala Gln

   130                 135                 140

Asn Ile Ala Val Met Asn Asp Tyr Gln Ser Thr Ala Arg Phe Ile Leu

145                 150                 155                 160

Ala Tyr Leu Pro Arg Trp Gln Glu Pro Pro Gln Ile Tyr Gly Gly Gly

                165                 170                 175

Gly Gly

<210>6

<211>228

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌

<400>6

Val Arg Ile Lys Ile Phe Met Leu Val Thr Ala Val Val Leu Leu Cys

1               5                   10                  15

Cys Ser Gly Val Ala Thr Ala Ala Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu

            20                  25                  30

Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gln Ala Cys Gln Ile Gln Met Ser Asp Pro

        35                  40                  45

Ala Tyr Asn Ile Asn Ile Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Lys

    50                  55                  60

Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala

65                  70                  75                  80

Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn Ile Thr

                85                  90                  95

Ser Ala Thr Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val

            100                 105                 110

Val Leu Lys Val Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr

        115                 120                 125

Tyr Lys Ala Phe Asp Trp Asp Gln Ala Tyr Arg Lys Pro Ile Thr Tyr

    130                 135                 140

Asp Thr Leu Trp Gln Ala Asp Thr Asp Pro Leu Pro Val Val Phe Pro

145                 150                 155                 160

Ile Val Gln Gly Glu Leu Ser Lys Gln Thr Gly Gln Gln Val Ser Ile

                165                 170                 175

Ala Pro Asn Ala Gly Leu Asp Pro Val Asn Tyr Gln Asn Phe Ala Val

            180                 185                 190

Thr Asn Asp Gly Val Ile Phe Phe Phe Asn Pro Gly Glu Leu Leu Pro

        195                 200                 205

Glu Ala Ala Gly Pro Thr Gln Val Leu Val Pro Arg Ser Ala Ile Asp

    210                 215                 220

Ser Met Leu Ala

225

<210>7

<211>176

<212>PRT

<213>结核分枝杆菌

<400>7

Met His Pro Met Ile Pro Ala Glu Tyr Ile Ser Asn Ile Ile Tyr Glu

1               5                   10                  15

Gly Pro Gly Ala Asp Ser Leu Phe Phe Ala Ser Gly Gln Leu Arg Glu

            20                  25                  30

Leu Ala Tyr Ser Val Glu Thr Thr Ala Glu Ser Leu Glu Asp Glu Leu

        35                  40                  45

Asp Glu Leu Asp Glu Asn Trp Lys Gly Ser Ser Ser Asp Leu Leu Ala

    50                  55                  60

Asp Ala Val Glu Arg Tyr Leu Gln Trp Leu Ser Lys His Ser Ser Gln

65                  70                  75                  80

Leu Lys His Ala Ala Trp Val Ile Asn Gly Leu Ala Asn Ala Tyr Asn

                85                  90                  95

Asp Thr Arg Arg Lys Val Val Pro Pro Glu Glu Ile Ala Ala Asn Arg

            100                 105                 110

Glu Glu Arg Arg Arg Leu Ile Ala Ser Asn Val Ala Gly Val Asn Thr

        115                 120                 125

Pro Ala Ile Ala Asp Leu Asp Ala Gln Tyr Asp Gln Tyr Arg Ala Arg

    130                 135                 140

Asn Val Ala Val Met Asn Ala Tyr Val Ser Trp Thr Arg Ser Ala Leu

145                 150                 155                 160

Ser Asp Leu Pro Arg Trp Arg Glu Pro Pro Gln Ile Tyr Arg Gly Gly

                165                 170                 175

Claims (14)

1.一种检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂，其特征在于，包含SEQ ID1-2，4-5，8-28所代表的蛋白或多肽或其类似物。

2.按权利要求1所述的检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂，其特征在于，所述的蛋白或多肽基因序列属于牛结核分枝杆菌的缺失区域。

3.按权利要求1所述的检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂，其特征在于，所述的蛋白或多肽或其类似物，是人工合成的或是天然分离的。

4、按权利要求1的检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂，其特征在于，所述的蛋白通过下述方法和步骤制备：

a.克隆所述基因至表达载体上；

b.然后转化至相应宿主细胞中；

c.通过诱导表达所述蛋白；

d.分离纯化c的产物，得到蛋白。

5、按权利要求4所述的检测活动性结核病和结核潜伏感染的试剂，其特征在于，所述的载体是原核表达载体或分枝杆菌表达载体或真核表达载体。

6、、一种检测活动性和潜伏感染结核杆菌的方法，其特征是通过下述步骤：

1)使宿主T细胞群与一种或多种蛋白或多肽或其类似物接触，使与任何所述氨基酸序列的T细胞受体结合；

2)在体外确定所述T细胞群是否识别所述的氨基酸序列或类似物。

7、按权利要求3的方法，其特征是其中至少使用1条以上大于9个氨基酸的多肽或其类似物，其氨基酸序列为SEQ ID NO 1-28，不单独为3，6。

8、按权利要求3的方法，其特征是所述的识别是通过检测所述T细胞分泌的细胞因子来确定T细胞对肽的识别。

9、一种基于上述方法的检测活动性和潜伏感染结核杆菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多种蛋白或多肽或其类似物、以及一种可视情况而使用的T细胞识别肽或蛋白的检测工具。

10、按权利要求7所述的试剂盒，其中的检测识别的工具包含IFN-r抗体。

11、按权利要求7所述的试剂盒，其中的检测方法包括ELISA、T细胞增殖试验、ELISPOT和/或Immunoblotting。

12、按权利要求7所述的试剂盒，其中的T细胞来源于血液、肺泡灌洗液、淋巴结或其他包含T细胞组织。

13、SEQ ID 1-2，4-5，8-28所代表的蛋白或多肽在制备该蛋白或多肽的特异抗体中的应用。

14、一种或多种多核苷酸，其特征在于，能在体内表达如权利要求1所述蛋白或多肽。

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