CN102590502B - 辅助诊断结核病患者的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助诊断结核病患者的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括结核分枝杆菌总蛋白和用于检测白细胞介素-8的物质。将待测患者的外周血用结核分枝杆菌总蛋白诱导后，结核病患者和健康者之间，不同严重程度的结核病患者之间，同一结核病患者的不同病程阶段之间，白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)的表达量均有显著差异，可以通过该表达量差异辅助诊断结核病患者(该诊断包括诊断不同严重程度的结核病患者，诊断同一结核病患者的不同病程阶段以及诊断该患者的结核病是否治愈)。
Description
技术领域
本发明涉及一种辅助诊断结核病患者的试剂盒。
背景技术
结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病，全球有1/3的人口感染了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，每年有200万人死于结核病，其死亡率在传染性疾病中仅低于艾滋病排第二。
结核病的治疗周期很长，一般在6个月以上，而且抗结核化疗过程经常出现药物副作用，使得患者依从性不容乐观。尤其，治疗期间病情进展以及治疗后治愈状态的评估没有很好的指标。目前临床常用的细菌学及影像学检查方法存在很多缺点。细菌学检查最常见的痰涂片和痰培养敏感性在50％左右，如果患者不排菌或排菌量少，就很难作为可信性指标。而且痰培养一般都在1个月后才能出结果，所以不能及时反映患者病情转归状态。而影像学检查结果受主观性因素影响比较大，不同医生、不同医院诊断结果差异较大。如果对病情进展的判断出现偏差，不仅延误治疗，还会增加耐多药患者出现的可能性。因此，结核病治疗急需一种能客观准确反映结核病转归以及治疗效果的新型指标。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助诊断结核病患者的试剂盒。
本发明提供的辅助诊断结核病患者的试剂盒，包括结核分枝杆菌总蛋白和用于检测白细胞介素-8的物质。
所述结核分枝杆菌总蛋白是将结核分枝杆菌进行总蛋白提取得到的。所述结核分枝杆菌总蛋白可按如下方法制备：将结核分枝杆菌破碎菌体并收集上清液，然后用0.22μm无菌滤器进行过滤，获得无菌的结核分枝杆菌总蛋白溶液。所述结核分枝杆菌总蛋白具体可按如下方法制备：取100mL OD600＝1的结核分枝杆菌菌液，4℃、3000g离心10min，收集菌体，洗涤后用1mL 4℃预冷的PBS缓冲液重悬；然后加入0.1mm二氧化硅珠子，在FastPrep-24仪器上以6.5m/s(米/秒)的振荡速度破碎1分钟，4℃、10000g离心10min，取上清液；将上清液用0.22μm无菌滤器进行过滤，获得无菌的结核分枝杆菌总蛋白溶液。
所述结核分枝杆菌具体可为H37Rv标准株。
所述用于检测白细胞介素-8的物质为白细胞介素-8的抗体，如单克隆抗体或多克隆抗体，也可直接商购用于检测白细胞介素-8的试剂盒。
所述试剂盒的使用方法如下：取1mL待测患者的外周血于细胞培养板，加入10μL结核分枝杆菌总蛋白标准液，混匀，在37℃、5％CO2条件下放置24h；然后将血液样品全部转移至新的1.5mL离心管，室温下3000rpm离心10分钟，收集上清液，用PBS缓冲液稀释至200倍体积，作为待测溶液，检测其中的白细胞介素-8含量。所述结核分枝杆菌总蛋白标准液的具体制备方法如下：将无菌的结核分枝杆菌总蛋白溶液用无菌PBS缓冲液稀释至蛋白浓度为1mg/mL，即为结核分枝杆菌总蛋白标准液。
所述辅助诊断结核病患者具体指的是辅助诊断结核病患者是否治愈、辅助诊断待测患者是否为结核病患者或辅助诊断结核病患者的严重程度(如细菌载荷量和肺部病理损伤程度)。
本发明还保护以上任一所述结核分枝杆菌总蛋白和用于检测白细胞介素-8的物质在制备辅助诊断结核病患者的试剂盒中的应用。所述结核分枝杆菌具体可为H37Rv标准株。所述用于检测白细胞介素-8的物质为白细胞介素-8的抗体，如单克隆抗体或多克隆抗体，也可直接商购用于检测白细胞介素-8的试剂盒。所述辅助诊断结核病患者具体指的是辅助诊断结核病患者是否治愈、辅助诊断待测患者是否为结核病患者或辅助诊断结核病患者的严重程度(如细菌载荷量和肺部病理损伤程度)。
本发明还保护一种辅助诊断结核病患者的试剂盒，包括结核分枝杆菌和用于检测白细胞介素-8的物质。
所述结核分枝杆菌具体可为H37Rv标准株。
所述用于检测白细胞介素-8的物质为白细胞介素-8的抗体，如单克隆抗体或多克隆抗体，也可直接商购用于检测白细胞介素-8的试剂盒。
所述试剂盒的使用方法如下：取1mL待测患者的外周血于细胞培养板，加入10μL结核分枝杆菌总蛋白标准液，混匀，在37℃、5％CO2条件下放置24h；然后将血液样品全部转移至新的1.5mL离心管，室温下3000rpm离心10分钟，收集上清液，用PBS缓冲液稀释至200倍体积，作为待测溶液，检测其中的白细胞介素-8含量。所述结核分枝杆菌总蛋白标准液的具体制备方法如下：将无菌的结核分枝杆菌总蛋白溶液用无菌PBS缓冲液稀释至蛋白浓度为1mg/mL，即为结核分枝杆菌总蛋白标准液。所述结核分枝杆菌总蛋白是将结核分枝杆菌进行总蛋白提取得到的。所述结核分枝杆菌总蛋白可按如下方法制备：将结核分枝杆菌破碎菌体并收集上清液，然后用0.22μm无菌滤器进行过滤，获得无菌的结核分枝杆菌总蛋白溶液。所述结核分枝杆菌总蛋白具体可按如下方法制备：取100mL OD600＝1的结核分枝杆菌菌液，4℃、3000g离心10min，收集菌体，洗涤后用1mL 4℃预冷的PBS缓冲液重悬；然后加入0.1mm二氧化硅珠子，在FastPrep-24仪器上以6.5m/s(米/秒)的振荡速度破碎1分钟，4℃、10000g离心10min，取上清液；将上清液用0.22μm无菌滤器进行过滤，获得无菌的结核分枝杆菌总蛋白溶液。
所述辅助诊断结核病患者具体指的是辅助诊断结核病患者是否治愈、辅助诊断待测患者是否为结核病患者或辅助诊断结核病患者的严重程度(如细菌载荷量和肺部病理损伤程度)。
本发明还保护结核分枝杆菌和用于检测白细胞介素-8的物质在制备辅助诊断结核病患者的试剂盒中的应用。所述结核分枝杆菌具体可为H37Rv标准株。所述用于检测白细胞介素-8的物质为白细胞介素-8的抗体，如单克隆抗体或多克隆抗体，也可直接商购用于检测白细胞介素-8的试剂盒。所述辅助诊断结核病患者具体指的是辅助诊断结核病患者是否治愈、辅助诊断待测患者是否为结核病患者或辅助诊断结核病患者的严重程度(如细菌载荷量和肺部病理损伤程度)。
本发明的发明人发现：将待测患者的外周血用结核分枝杆菌总蛋白诱导后，结核病患者和健康者之间，不同严重程度的结核病患者之间(临床上，结核病诊断及病情转归评估的主要依据是细菌学检测及影像学检测结果，因此，本发明分析了IL-8含量与细菌学检测及影像学检测结果之间的相关性)，同一结核病患者的不同病程阶段之间，白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)的表达量均有显著差异，可以通过该表达量差异辅助诊断结核病患者(该诊断包括诊断不同严重程度的结核病患者，诊断同一结核病患者的不同病程阶段以及诊断该患者的结核病是否治愈)。
应用本发明的试剂盒辅助诊断结核病患者，不涉及传染性痰样品，具有良好的安全性和实用性，同时可以在2天内给出结果，具有快速、简便等特点。
附图说明
图1为实施例2的标准曲线。
图2为痰菌阳性的结核病患者、痰菌阴性的结核病患者及健康人的IL-8含量(*表示p＜0.01)。
图3为实施例3的标准曲线。
图4为肺部有空洞的结核病患者、肺部以结核结节为主的结核病患者及健康人健康人的IL-8含量(*表示p＜0.01)。
图5为实施例4的标准曲线。
图6为10名患者在不同阶段的IL-8含量。
图7为发病(治疗前)、治疗中、治疗最后一个月、治愈停药3个月的患者的IL-8含量(*表示p＜0.01)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Difco Middlebrook 7H9培养基(又称Middlebrook 7H9液体培养基)购自BD公司。结核分枝杆菌H37Rv标准株：ATCC编号为27294，可从国家参比实验室菌株库获取。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.1M的PBS缓冲液。实施例中的各个患者均为知情同意的志愿者。
实施例1、结核分枝杆菌总蛋白(MTB总蛋白)的制备
1、用Middl ebrook 7H9液体培养基震荡培养H37Rv标准株至OD600＝1。
2、取100mL菌液，4℃、3000g离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗2次，然后用1mL 4℃预冷的PBS缓冲液重悬。
3、加入1管0.1mm二氧化硅珠子(购自MP Biochemicals)，在FastPrep-24仪器(购自MP Biochemicals)上以6.5m/s(米/秒)的振荡速度破碎1分钟，4℃、10000g离心10min，取上清液。
4、将上清液用0.22μm无菌滤器进行过滤，获得无菌的MTB总蛋白溶液。
5、将无菌的MTB总蛋白溶液用BCA法进行蛋白浓度定量，并用无菌PBS缓冲液稀释至蛋白浓度为1mg/mL，即为MTB总蛋白标准液，分装并保存于-70℃。
实施例2、细菌学检查严重程度不同的患者血清中IL-8含量的差异
一般认为，痰菌阳性表明患者向外排菌，具有传染性，而且病情较为严重，而痰菌阴性表明患者不排菌，没有传染性，且病情较为缓和。实验样本分别为：17名痰菌阳性的结核病患者(第一组)、32名痰菌阴性的结核病患者(第二组)和22名健康人(未患结核病；第三组)。第一组和第二组均是医院确诊的结核病患者，痰菌阳性和痰菌阴性的划分标准如下：从患者痰液样本中进行结核分枝杆菌的分离培养，如果能获得结核分枝杆菌为痰菌阳性，如果不能获得结核分枝杆菌为痰菌阴性。
将各个实验样本分别进行如下步骤：
一、采血及抗原刺激
1、用EDTA抗凝真空抽血管抽取2mL外周血，上下颠倒混匀。
2、取1mL外周血于细胞培养板，加入10μL MTB总蛋白标准液，轻摇混匀，在37℃、5％CO2条件下放置24h。
3、将完成步骤2的血液样品全部转移至干净的1.5mL离心管，室温下，3000rpm离心10分钟，收集上清液，用PBS缓冲液稀释至200倍体积，作为待测溶液。
二、检测IL-8含量
利用人IL-8双抗夹心ELISA试剂盒(购自Raybio公司，型号为ELH-IL-8-001；包括如下组件：将IL-8标准品、IL-8单抗预包被酶标板、Wash Buffer、生物素标记的IL-8多克隆抗体、HRP标记抗生物素抗体、TMB底物、终止液)检测步骤一得到的上清液中的IL-8含量，具体步骤如下：
1、取IL-8单抗预包被酶标板；将IL-8标准品用PBS缓冲液梯度稀释，每个浓度设置三个复孔，每孔加入100μL；在其它孔中加入步骤一得到的待测溶液，设置三个复孔，每孔加入100μL。
2、将步骤1的酶标板室温轻摇反应3小时，用300μL Wash Buffer洗板，重复4次。
3、将步骤2的酶标板加入生物素标记的IL-8多克隆抗体，每孔加入100μL，室温轻摇反应2小时，用300μL Wash Buffer洗板，重复4次。
4、将步骤3的酶标板加入HRP标记抗生物素抗体，每孔加入100μL，室温轻摇反应1小时，用300μL Wash Buffer洗板，重复4次。
5、将步骤4的酶标板加入TMB底物，每孔加入100μL，室温轻摇反应15分钟。
6、将步骤5的酶标板加入终止液，每孔加入50μL，然后立即在450nm波长下检测吸光值。
根据标准品的吸光值绘制标准曲线，见图1，标准曲线方程为：y＝111.57x-12.223(R2＝0.9988)。
根据标准曲线方程计算各组实验样本每毫升外周血中的IL-8检测值(IL-8含量)平均值见表1和图2。
表1各组的IL-8检测值(pg/mL)
三组之间IL-8含量差异非常显著。痰菌阳性的结核病患者显著高于痰菌阴性的结核病患者(P＜0.01)，痰菌阴性的结核病患者则显著高于健康人(P＜0.01)。结果表明，用MTB总蛋白刺激后，待测病人的外周血中的IL-8含量与痰中细菌含量是正相关的，即IL-8含量检测值越高，痰中结核菌含量越高。如果待测患者的IL-8检测值高于10000pg/mL，该患者可以初步诊断为处于结核病活动期，检测值越高表明病情越严重。
实施例3、影像学检查严重程度不同的患者血清中IL-8含量的差异
一般认为，肺部病变出现空洞的患者病情较为严重，肺部病变以结节为主的患者病情较为缓和。实验样本分别为：23名肺部有空洞的结核病患者(第一组，简称肺部空洞患者)、29名肺部以结核结节为主的结核病患者(第二组，简称肺部结节患者)和22名健康人(未患结核病；第三组)。
将各个实验样本分别进行如下步骤：
一、采血及抗原刺激
同实施例2的步骤一。
二、检测IL-8含量
同实施例2的步骤二。
标准曲线见图3，标准曲线方程为：y＝112.99x-5.9424(R2＝0.9992)。
根据标准曲线方程计算各组实验样本每毫升外周血中的IL-8检测值(IL-8含量)平均值见表2和图4。
表2各组的IL-8检测值(pg/mL)
三组之间IL-8含量差异非常显著。肺部有空洞的结核病患者显著高于肺部以结核结节为主的结核病患者(P＜0.01)，肺部以结核结节为主的结核病患者则显著高于健康人(P＜0.01)。结果表明，用MTB总蛋白刺激后，待测病人的外周血中的IL-8含量与结核病患者肺部病变严重程度是正相关的，即IL-8检测值越高，肺部病变越严重。如果待测患者的IL-8检测值高于10000pg/mL，该患者可以初步诊断为处于结核病活动期，检测值越高表明病情越严重。
实施例4、结核病治愈状态不同的患者血清中IL-8含量的差异
结核病的治疗周期很长，最短6个月，因此在治疗末期对病情转归的评估非常重要。治疗时间不足，容易导致病情复发；治疗时间过长，由于结核药物普遍存在副作用，对人体器官的损害加大。实验样本为10名通过抗结核治疗已确认治愈的结核病患者。对各个患者进行全程跟踪。
将各个实验样本分别进行如下步骤：
一、采血及抗原刺激
分别在如下各个阶段进行采血：发病(治疗前)、治疗中、治疗最后一个月、治愈停药3个月。
采血及抗原刺激的方法同实施例2的步骤一。
二、检测IL-8含量
同实施例2的步骤二。
标准曲线见图5，标准曲线方程为：y＝68.677x-6.7501(R2＝0.9967)。
根据标准曲线方程计算各实验样本每毫升外周血中的IL-8检测值(IL-8含量)，见表3和图6，各组实验样本每毫升外周血中的IL-8检测值(IL-8含量)平均值见表4和图7。
表3各患者在各个阶段的IL-8检测值(pg/mL)
| 治疗前 | 治疗中 | 治疗最后一个月 | 治愈停药3个月 | |
| 患者1 | 7650 | 37450 | 9000 | 7000 |
| 患者2 | 14050 | 70655 | 1425 | 3110 |
| 患者3 | 14800 | 49600 | 10300 | 700 |
| 患者4 | 5050 | 70800 | 9150 | 1600 |
| 患者5 | 10900 | 17100 | 7329 | 950 |
| 患者6 | 21730 | 2530 | 235 | 665 |
| 患者7 | 145950 | 59850 | 4650 | 600 |
| 患者8 | 77970 | 25890 | 3985 | 435 |
| 患者9 | 92895 | 119165 | 895 | 970 |
| 患者10 | 45805 | 22730 | 5090 | 665 |
表4所有患者在各个阶段的IL-8检测值平均值(pg/mL)
| 治疗前 | 43680±47282 |
| 治疗中 | 47577±34156 |
| 治疗最后一个月 | 5206±3649 |
| 治愈停药3个月 | 1670±2031 |
结果表明，用MTB总蛋白刺激后，结核病患者发病期外周血的IL-8含量显著高于治疗最后一个月以及治愈停药后3个月。治愈后3个月10名患者的IL-8含量依旧稳定在低位，这与患者的病情稳定无复发情况吻合。如果待测患者的IL-8检测值低于10000pg/mL，该患者可以初步诊断为结核病已治愈。如果待测患者的IL-8检测值高于10000pg/mL，该患者可以初步诊断为处于结核病活动期，检测值越高表明病情越严重。
Claims (1)
1.结核分枝杆菌总蛋白和用于检测白细胞介素-8的物质在制备辅助诊断结核病患者的试剂盒中的应用；所述结核分枝杆菌总蛋白是将结核分枝杆菌进行总蛋白提取得到的；所述结核分枝杆菌为H37Rv标准株；其中，诊断的样本为结核病患者的外周血。
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