CN101203239A - 诊断、预防和治疗分枝杆菌感染和结核疾病的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明鉴定了分枝杆菌潜伏期相关的能够引起哺乳动物体内和体外免疫应答的抗原和/或表位的狭窄亚群。本发明提供了对潜伏分枝杆菌感染检测和免疫的方法和组合物。这些组合物包含的那些分枝杆菌潜伏期抗原确实能够引起经历潜伏分枝杆菌感染的哺乳动物的体内免疫应答。该组合物更优选包含那些被潜伏感染个体优选识别的抗原，该抗原不或更较少被具有活动型分枝杆菌感染的个体或具有分枝杆菌诱导症状或疾病的个体例如患有结核疾病(TB)的分枝杆菌感染的病人识别的抗原。

Description

诊断、预防和治疗分枝杆菌感染和结核疾病的方法和装置
发明领域
本发明涉及药物领域，特别是分枝杆菌疾病，更具体的是涉及那些由结核分枝杆菌引起的感染的诊断、预防和治疗。本发明还涉及疫苗领域。
发明背景
结核(TB)是全球健康的主要威胁，保守估计每分钟四人死于TB，相当于每年两百万。估计世界人口的三分之一被结核分枝杆菌潜伏感染。大多数活性TB病例来自于这一巨大的潜在结核病病源库，这是实现TB控制的主要障碍。
为什么潜伏结核分枝杆菌感染使消灭TB的努力难以实现有多种原因。首先，对潜伏感染的接触追踪和治疗仅在绝大多数人的结核菌素皮肤试验呈阴性的地方才能实现，这种情况出现在TB发病率已经很低的工业化国家。即使在这些地方，目前可用的治疗潜伏结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的方案的有效性也是有限的。除了低治疗效果和抗生素抗性株的流行这些明显问题外，可能与发现休眠结核分枝杆菌有机体对常用药物例如仅对复制的杆菌具有杀菌能力的利福平和异烟肼适度地高度耐药有关，正如已经被体外所证实的(1，2)。结核分枝杆菌的基因型在潜伏期的许多年中几乎不改变而DNA模式的变化程度在疾病活动期较高这一发现支持了结核分枝杆菌在潜伏期期间一直不进行复制的观点(3，4)。其次，当前唯一对TB有效的疫苗牛分枝杆菌卡介苗(BCG)不能阻止潜伏期结核分枝杆菌感染的建立。BCG防止TB再活化的保护作用有很大不同，在地理区域之间是不同的，并且这可能取决于暴露在环境中的分枝杆菌的水平(5)。近来对发展改良疫苗的努力主要集中在预计在结核分枝杆菌感染发生前施用的预防疫苗，并且已经进行了急性初次感染的动物模型的评价。当使用动物模型模拟慢性或潜伏感染而在暴露后的情况下使用时(6-8)，这些预防疫苗候选者是无效的或甚至是有害的。相反，能够安全给药于已潜伏感染个体的和预防TB复活的暴露后疫苗将具有能应用于人群中的多数出现结核分枝杆菌潜伏感染的高病区的直接优点。此疫苗中包括的抗原能在潜伏性感染期间增强能识别和消灭结核分枝杆菌的保护免疫应答。
CD4 T细胞在控制和维持结核分枝杆菌感染中起重要作用，然而潜伏性TB期间有关的精确机制和抗原识别的靶还大多未知(9)。直到最近，几乎没有关于潜伏期间差别基因表达和结核分枝杆菌机制变化的研究。甚至更没有分析与潜伏期持续有关的特异性人宿主免疫应答的研究。直到现在仅鉴定了一个具有良好特征的结核分枝杆菌蛋白质，该蛋白质在潜伏期似乎是具有重要性(10)。这个蛋白质是HspX(Rv2031c或Acr)，它在低氧下被强烈的正调节，低氧条件是可被作为替代与人肉芽肿的潜伏性感染有关的环境应激的体外条件(11)。对此热休克蛋白的细胞免疫应答在潜伏期感染的个体中可见，因此与保护状态有关，而此抗原的抗体发现于具有活跃TB疾病的人中(12，13)。
其它潜伏期相关抗原的鉴别有益于成功开发暴露后的疫苗。一些研究集中在结核分枝杆菌感染的持续状态，使用设计为模拟潜伏期的天然状态的体外和体内模型。首先，通过在逐渐减少氧压力下培养结核分枝杆菌，Wayne等人建立了潜伏期的体外模型，逐渐减少氧压力会导致该杆菌的可逆的生长阻止，命名为非复制持续(NRP)(14)。其他人使用恒定的含氧量低的培养条件来研究结核分枝杆菌的代谢变化(11，15，16)。此外，Voskuil等人研究了在低剂量氧化氮条件下培养时结核分枝杆菌的表达图谱，低剂量氧化氮是杆菌在潜伏期遇到的另一个体外条件和与Th1免疫一致(开始)(19)。使用全部基因组DNA微阵列，Voskuil等人观察到结核分枝杆菌的一套48个基因始终正调节，在潜伏期的所有三个体外模型即在NRP、恒定低氧和低剂量氧化氮暴露下都观察到这一事实(17)。当M.tuberculosis在活化鼠巨噬细胞中体外生长时，所谓休眠调节子(DosR)的基因也发现是正调节的(18)。此外在慢性感染的小鼠和TB病人的肺中，M.tuberculosis的转录模式显示了NRP的特征(19，20)。这说明在TB疾病过程中很可能一杆菌亚群碰上低氧的条件和低浓度氧化氮，并且适合于非复制状态。这显示在向潜伏期感染的转变过程中休眠相关蛋白质被诱导且在潜伏期间很可能结核杆菌表达休眠相关蛋白质。大多数被此调节子编码的假设蛋白质的功能还未知。在此专利说明书中，我们将由休眠调节子的基因编码的蛋白质称为潜伏期抗原。
基于休眠(DosR)调节子基因的发现，将被编码的蛋白质作为用于检测目的和防护性或治疗性免疫接种和/或接种疫苗目的的潜在抗原可见于GB0116385.6/US2004/0241826。此外，WO 0179274和US2004/0057963提供了使用在分枝杆菌感染潜伏阶段中被特异性诱导的多肽针对潜伏结核分枝杆菌感染诱导的免疫应答的方法和组合物。其中的多肽选自在前述体外模型的潜伏期中是正调节的45个休眠调节子基因的库。促进免疫接种目的的抗原之一是编码一个α晶体蛋白同源体的HspX(Rv2031c或Acr)，US2004/0146933中描述了其对诊断和免疫接种目的用途。
目前还不清楚NRP/休眠(DosR)调节子编码蛋白质是否确实在人的M.tuberculosis感染潜伏期中表达非常高水平以诱导显著的免疫应答，因为现有技术使用潜伏期的体外模型和小鼠模型。也不清楚来自于潜伏期或休眠调节子的假设抗原是否是足够免疫原性的以及这些假设的潜伏期抗原和/或表位的免疫性是否确实与提供针对潜伏或新获得的哺乳动物分枝杆菌感染的保护相关。尤其现在还不清楚48个休眠/潜伏期调节子编码的假设蛋白质中的哪个在实际人结核分枝杆菌潜伏感染中可能是最相关的。
为了在具有潜伏分枝杆菌感染的个体中引起免疫应答而组合所有48个假设潜伏期抗原在例如一个药学组合物或疫苗之中既不可实行或预期也无效。许多鉴定出的假设潜伏期抗原不能有效引起免疫应答，因为它们没有表达到足够水平或它们不含有足够的(显性的)识别潜伏感染的哺乳动物的免疫系统的细胞毒性T细胞(CTL)或T辅助细胞(Th)表位。
发明概述
本发明要解决的问题是从48个已知的假设潜伏期抗原中提供一种最佳选择以及仅选择那些确实能够引起潜伏分枝杆菌感染的健康个体体内免疫应答的抗原。本发明通过体内对分枝杆菌潜伏期相关抗原和/或表位的显性人免疫应答的离体鉴别解决了上述讨论的问题从而提供了针对潜伏分枝杆菌感染的检测和免疫接种的新方法和组合物。这些组合物仅包含那些确实能够在处于潜伏分枝杆菌感染的哺乳动物体内引起免疫应答的潜伏期抗原，更优选仅包含那些被潜伏感染个体优选识别的抗原，并且这些抗原不被或更较少程度的被具有活跃分枝杆菌感染的个体或具有分枝杆菌诱导的疾病或症状的个体例如患有肺结核(TB)的病人识别。本发明通过从至少48个本领域公知的结核分枝杆菌潜伏期抗原的组中鉴别出显性抗原和/或表位的狭窄亚群来实现此目标。
令人惊讶的是，本发明鉴别出的最优选抗原与那些到目前为止在现有技术中研究和应用最多的假设潜伏期抗原不一致；主要是Rv2031c(HspX/acr)和Rv0569。本发明远离现有技术出版物、专利和专利申请选择和应用的优选假设潜伏期抗原，说明本发明的狭窄亚群与已知实例远远不同。根据本公开发明，该不同的小亚群的潜伏期抗原有目的地选自假设潜伏期抗原的已知组。本发明的抗原和/或表位是广泛分析假设抗原组后选择的。尽管现有技术中的假设抗原已在在实验室条件下进行了体外模型和小鼠模型的鉴别，然而本发明公开了那些抗原中确实能够在潜伏分枝杆菌感染的正常环境下引起体内不同免疫应答的抗原部分，并且它们在健康个体或患有TB疾病的病人中不引起或以更少的程度引起体内免疫应答。
发明详述
本发明提供了在脊椎动物优选哺乳动物中对分枝杆菌感染尤其是潜伏分枝杆菌感染诱导免疫应答的方法和组合物，该方法包含对脊椎动物施用组合物的步骤，该组合物包含一种或多种多肽或其片段，所述的多肽或其片段选自包含能够引起具有分枝杆菌感染的脊椎动物的体内免疫应答的分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子编码蛋白质的多肽的组。
如本文所用的术语分枝杆菌感染意为包含潜伏感染的哺乳动物，即新近感染还没有显示症状的哺乳动物和患有分枝杆菌诱导疾病和症状例如活动性肺结核的脊椎动物。为了防止肺结核疾病的发展，根据本发明治疗的分枝杆菌感染优选潜伏感染。根据本发明的方法还可方便地作为辅助治疗在抗生素治疗之中或之后应用于有或没有(多重)耐药性TB的TB病人；对于健康但是暴露于TB之中的人，优选但是不仅是TB流行国家已预先接种过BCG的儿童。
本发明提供了可针对潜伏分枝杆菌感染的方法和组合物，还可容易地由技术人员将其与包含表位的多肽或组合物例如针对分枝杆菌的预防疫苗和/或多相疫苗的组合，所述的表位目的是引起非潜伏感染的免疫应答。
潜伏分枝杆菌感染在本文中理解为涉及感染中的阶段，其中杆菌保持活性但缓慢复制或维持在非复制状态且可被器官或组织内的局部损害包围而不引起活性坏死性疾病，正如通常在TB中观察到的一样。潜伏期可存在于宿主的剩余生命，或者感染可在例如宿主免疫降低或应答其它应激物例如其它(分枝)杆菌或病毒像HIV-1感染或癌症治疗和其它免疫抑制病症或治疗的时期内再活化。
本发明提供了适合用于以下情况的方法和组合物，1)预防性的(保护性的)，2)暴露后/感染或3)针对潜伏分枝杆菌感染和相关疾病的治疗性/治愈性疫苗，例如但是不限于(减毒活和/或重组)结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(包括卡介苗(BCG))(M.bovis(including Bacillus Calmette-Guerin(BCG))、非洲分枝杆菌(M.africanum)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、麻疯分枝杆菌(M.leprae)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、禽分枝杆菌(包括类结核亚种)(M.avium(including subsp.paratuberculosis))、M.canettii、麻疯分枝杆菌(M.leprae)、田鼠分枝杆菌(M.microti)和溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)。
结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(包括BCG株)、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌和M.canettii(例如属于TB复合群的分枝杆菌属和株)是根据本发明所使用的潜伏期诱导的多肽或其片段的最优选来源。
对于本发明的方法和组合物，待治疗或诊断的脊椎动物优选人，但也可包含所有实验室和农场动物，例如但是不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、绵羊、山羊、奶牛、马、骆驼和家禽例如鸡、鸭、火鸡和鹅。
多肽的来源可以是蛋白质、蛋白质的消化物和/或其片段，它们可以是纯化形式或可包含于粗制组合物中，优选生物来源，例如细菌溶菌产物、超声处理物或固定物。或者，(多)肽可以由化学合成或体外酶生成。多肽或其片段的来源还可以是由RNA或DNA模板的核酸编码的多肽或其片段。此RNA或DNA分子可以是“裸露”DNA，优选包含于小囊泡或脂质体中，或可以包含于载体中。载体可以是本领域公知的任何(重组)DNA或RNA载体，优选其基因编码的潜伏期抗原可操作性的连接于使编码的信使进行表达和翻译的调控序列的质粒。载体还可以是任何的DNA或RNA病毒，例如但是不限于腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、改良安卡拉痘病毒(modifiedVaccinia Ankara virus)(MVA)或禽痘病毒，或其它任何能够使包含宿主潜伏期表位的多肽进行表达的病毒载体。DNA载体可以是不完整的，例如附加型复制载体或者可以是在宿主基因组中随机整合或同源重组整合的载体。
根据本发明包含编码多肽或其片段的基因，任选植入载体例如病毒或质粒中，可以整合入宿主基因组中。在本发明的一个优选实施方案中，这种宿主可以是微生物。这一重组微生物优选分枝杆菌，例如结核分枝杆菌种或牛分枝杆菌种且最优选牛分枝杆菌卡介苗(BCG)，根据本发明它们能够将多肽或其片段传递到宿主中。重组BCG和重组方法是本领域公知的，例如WO2004094469。这一重组微生物可以制成重组活和/或减毒活疫苗，例如Jacobs等人，1987，Nature，327(6122)：532-5。载体还可包含于细菌来源的宿主中，例如但是不限于减毒活和/或重组志贺氏杆菌或沙门氏菌。
在一个实施方案中，本发明提供了诱导对哺乳动物分枝杆菌感染的免疫应答的方法，该方法包含对哺乳动物施用一种或多种多肽或其片段源的步骤，所述的多肽或其片段选自包含分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子编码蛋白质的多肽的组，所述蛋白质能够引起人T细胞系的IFN-γ应答，由Rv079、Rv0569、Rv0572c、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、16-kDaα晶体蛋白同系物)、Rv2032、Rv2623、Rv2624c、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、Rv3127、Rv3129、Rv3130c、Rv3131、Rv3132c、Rv3133c(DosR)、Rv3134c、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)以及它们的同型物或同系物，并且任选一种或多种佐剂。
所述抗原被产自感染个体的短期T细胞系识别且使之与结核分枝杆菌超声处理物接触。在如实施例1和2所描述的方法中T细胞系显示了优选至少＞50pg IFNγ/ml的干扰素γ(IFN-γ)应答。分枝杆菌抗原的术语Rv和NRP/休眠(DosR)调节子的DNA和蛋白质序列在本领域内众所周知且可以例如发现于http://genolist.pasteur.ff/TubercuList/或http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez(Accession number AL123456)。如本文所用的术语Rv既可涉及抗原的氨基酸序列或编码抗原的核苷酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，诱导对脊椎动物分枝杆菌感染的免疫应答的方法包含施用选自分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列的组的多肽或其片段来源，所述的分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列含有能够在具有潜伏分枝杆菌感染的脊椎动物中引起免疫应答的潜伏期抗原，包括Rv0079、Rv0569、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、16-kDaα晶体蛋白同系物)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、Rv3129、Rv3130c、Rv3132c、Rv3133c(DosR)、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)以及它们的同型物或同系物。这些潜伏期抗原的特殊亚群能够在具有潜伏分枝杆菌感染的个体的外周血单核细胞(PBMC’s)中诱导超过100＞pg IFNγ/ml的干扰素γ(IFN-γ)应答，并且至少是所有分枝杆菌感染个体的5、10、20、30、40或50％。
在本发明的一个最优选实施方案中，提供了在脊椎动物优选患有或有危险获得潜伏分枝杆菌感染的个体中诱导免疫应答的方法，包含施用选自分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列的组的多肽或其片段来源，所述分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列能够在具有潜伏分枝杆菌感染的个体中优选引起免疫应答，包括抗原Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)。所述八种抗原包含优选在潜伏感染个体中识别和不能或更较少在非感染个体或具有活动性分枝杆菌感染导致的疾病症状的个体中诱导IFN-γ应答的显性表位。所述抗原在检测的48个潜伏期抗原中在外周血单核细胞(PBMC’s)中诱导最高水平IFN-γ。此外，这八个抗原能够在潜伏感染个体的PBMC’s中诱导IL-10的显著生成，但不在患有活动性结核分枝杆菌感染相关症状的病人的PBMC’s中诱导生成。
根据本发明的方法中使用的三个最优选多肽是分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列Rv1733c和Rv2029c(PfkB)和Rv2627c。在检测的所有48个多肽中Rv1733c和Rv2029c(PfkB)和Rv0080是最常在潜伏分枝杆菌感染的个体中检测到引起免疫应答的，通过从这些个体获得的PBMC’s中的IFN-γ和/或IL-10的诱导来确定。
在本发明的另一方面，本发明提供了包含分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列的多肽或其片段来源的组合物，所述分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列能够在具有潜伏分枝杆菌感染的个体中引起免疫应答。根据本发明针对分枝杆菌感染和诱导的疾病而免疫接种的组合物优选选自包含分枝杆菌NRP/(DosR)调节子编码蛋白质的多肽的组的一种或多种多肽或其片段来源，其中所述分枝杆菌NRP/(DosR)调节子编码的蛋白质能够在人T细胞系中引起IFNγ应答，包括Rv0079、Rv0569、Rv0572c、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、16-kDa α晶体蛋白同系物)、Rv2032、Rv2623、Rv2624c、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、Rv3127、Rv3129、Rv3130c、Rv3131、Rv3132c、Rv3133c(DosR)、Rv3134c、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)以及它们的同型物或同系物，并且任选包含至少一种佐剂。
如本文所用的同系物或同型物理解为包含具有与上述天然结核分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子编码多肽至少70％、80、90、95、98或99％氨基酸序列相同的多肽且仍能够引起至少来自结核分枝杆菌多肽的免疫应答。同系物或同型物可包含取代、插入、缺失和添加N-或C-末端氨基酸或化学部分来增强稳定性、溶解性和免疫原性。
本发明的多肽抗原的片段理解为包含至少一个表位的片段。因此该片段至少包含多肽抗原序列上的4、5、6、7或8个相邻氨基酸。该片段更优选包含至少一个T细胞表位，例如至少8、9、10、11、12、13或14个多肽抗原序列上的相邻氨基酸。该片段还更优选包含CTL和T辅助细胞表位。但是最优选的片段是需要由抗原递呈细胞加工的肽，例如片段长度为至少大约18个氨基酸，而这18个氨基酸不必是所述多肽抗原的连续序列。
本发明的组合物更优选包含选自包含能够在分枝杆菌潜伏感染的个体中引起免疫应答的潜伏期抗原的分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列的组的多肽或其片段，包括Rv0079、Rv0569、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、16-kDa α晶体蛋白同系物)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、Rv3129、Rv3130c、Rv3132c、Rv3133c(DosR)、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)。所述抗原和组合物能够在具有分枝杆菌感染的个体的外周血单核细胞(PBMC’s)中诱导IFNγ应答。
在一个更优选实施方案中，根据本发明，组合物包含能够在具有潜伏分枝杆菌感染的个体中优选引起免疫应答的分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列来源，其中抗原选自下列的一种或多种：Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)。与检测的其它48个分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子多肽相比，Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)多肽能够在潜伏感染的个体中诱导出最强的应答，以PBMC’s中生成IFNγ表示。所述抗原还能够在潜伏感染病人的PBMC’s中刺激IL-10的生成。而IL-10诱导作用不能或较少在具有活动性分枝杆菌感染和/或TB疾病症状的病人的PBMC’s中观察到。
在另一个实施方案中，本发明的组合物包含至少从分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列Rv1733c和/或Rv2029c和/或Rv2627c中获得的多肽或其片段来源，它们是所有检测的NRP/休眠(DosR)调节子编码的多肽中潜伏感染个体最常识别的抗原。
根据本发明用于免疫接种的包含NRP/休眠(DosR)调节子编码多肽或其片段的组合物优选包含至少一种赋形剂。赋形剂是药学领域公知的且可以例如见于教科书例如Remmington’s pharmaceutical sciences，Mack Publishing，1995。根据本发明用于免疫接种的组合物可优选包含至少一种佐剂。佐剂可包含任何疫苗领域公知的佐剂且可选自教科书例如Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，2004。
佐剂最有选选自以下佐剂列表：阳离子(抗菌)肽和Toll样受体(TLR)配体，例如但是不限于：ploy(I：C)、CpG序列、LPS、脂质A、脂肽Pam3Cys和细菌鞭毛蛋白或其部分，以及它们的具有化学修饰的衍生物。其它本方法中和本发明的组合物中使用的优选佐剂是：活或灭活BCG的混合物、所述潜伏抗原或其部分的免疫球蛋白复合物、IC31(来自WWW.intercell.com；见于W003047602)、QS21/MPL(US2003095974)、DDA/MPL(WO2005004911)、DA/TDB(WO2005004911；Holten-Andersen等人，2004 InfectImmun.2004 Mar；72(3)：1608-17)和可溶性LAG3(CD223)(来自www.Immunotep.com；US2002192195)。
根据本发明用于免疫接种的方法和组合物还可包含CD40结合分子的使用和/或添加以增强CTL应答从而增强本发明的方法和组合物的治疗效果。CD40结合分子的使用描述于WO 99/61065中，引入本文作为参考。CD40结合分子优选是抗体或其片段或CD40配体或其变异体，并且还可单独加入或可包含于根据本发明的组合物之中。
根据本发明用于免疫接种的方法和组合物还可包含竞争性抗-4-1BB抗体或其片段或另一能够与4-1BB受体相互作用的分子的使用和/或添加。4-1BB受体竞争性抗体和分子的使用描述于WO 03/084999中，引入本文作为参考。4-1BB竞争性抗体可在添加或不添加CD40结合分子时使用，通过触发/激4-1BB和/或CD40受体来增强CTL免疫性。4-1BB结合分子或抗体可单独加入或可包含于根据本发明的组合物之中。
根据本发明用于免疫接种目的的多肽可与蛋白质例如但是不限于破伤风毒素/类毒素、白喉毒素/类毒素或其它载体分子融合。根据本发明的多肽还可方便地与热休克蛋白融合，例如重组内源(鼠)gp96(GRP94)作为免疫显性的肽的载体，这描述在(参考文献：Rapp UK和Kaufmann SH，Int Immunol.2004 Apr；16(4)：597-605；Zugel U，Infect Immun.2001 Jun；69(6)：4164-7)中或与Hsp70的融合蛋白(Triebel等人；WO9954464)。
根据本发明用于免疫接种的方法和组合物优选包含使用从本发明的多肽中获得的多肽片段，它包含显性CTL或Th表位，并且所述肽的长度在18-45个氨基酸间。CTL或Th表位序列的存在可由技术人员使用常用已知生物信息学工具例如HLA_BIND、SYFPEITHI、NetMHC和TEPITOPE 2000(参考文献43、44、45、46、47和48)或实验中使用标准实验法(Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience 2004)来确定。
根据本发明具有18-45个氨基酸之间长度的肽正如WO 02/070006中所描述的已观察到提供了优秀的免疫原性质。肽可以方便地化学合成且可任选(部分)重叠和/或还可与其它分子例如TLR配体、肽或蛋白质连接。肽还可以融合形成合成的蛋白质，见PCT/NL03/00929和Welters等人(Vaccine.2004 Dec 2；23(3)：305-11)。还可以方便地加入到肽化学分子的氨基或羧基末端或额外的(修饰或D-)氨基酸来增加该肽的稳定性和/或降低其生物降解能力。为了提高免疫原性，可以连接免疫刺激分子例如脂化。为了增强肽的溶解性，可以添加带电荷或极性氨基酸来增强溶解性和体内稳定性。
在另一个实施方案中，根据本发明引起免疫应答或免疫接种的组合物还包含不特异针对潜伏期阶段的分枝杆菌抗原。这些抗原可能对感染过程的其它阶段具有高度特异性。提供不仅只对潜伏分枝杆菌感染引起免疫应答还能够对在感染的哺乳动物中引起疾病症状的活动性分枝杆菌感染引起免疫应答的组合物可能对免疫接种的目的是有益的。在这些方法中和用该组合物将在感染过程中多个时期的针对分枝杆菌的保护性免疫组合起来从而提供更好的全面保护是有效的。因此根据本发明包含能够引起免疫应答的潜伏期特异性抗原的组合物可与已知在活动性感染中引起免疫应答的分枝杆菌抗原组合使用，所述活动性感染例如但是不限于：结核分枝杆菌抗原ESAT-6(Rv3875)、Ag85A(FbpA/MPT59、Rv3804c)、Ag85B(Rv1886c)、Ag85C(Rv3803c)、CFP10(Rv3874)、TB10.3(Rv3019c)、TB10.4(Rv0288)、MPT64(Rv1980c)、MPT32(Rv1860)和MPT57(Rv3418c)。
在另一个实施方案中，根据本发明的潜伏期特异性抗原和组合物用于提供诊断潜伏分枝杆菌感染的方法和试剂。根据本发明一种诊断受试者潜伏或持续分枝杆菌感染特别是潜伏感染的方法包含以下步骤：
a)任选分离的受试者的体液和/或细胞(特别是白细胞)样品与一个或多个多肽或其片段接触，所述肽选自由Rv0079、Rv0569、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、Rv2007c(FdxA)、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX、Acr、16-kDaα晶体蛋白同系物)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、Rv3129、Rv3130c、Rv3132c、Rv3133c(DosR)、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)组成的分枝杆菌NRP/休眠(DosR)调节子序列的组；和
b)通过测量指示分枝杆菌感染的增殖或细胞因子生成来检测对所述多肽的免疫应答。
诊断方法最优选包含多肽Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)中的至少一个或多个。在另一个优选实施方案中诊断方法包含检测针对Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c和Rv0080多肽或其片段的免疫应答，它们是如本文检测的潜伏分枝杆菌感染的所有潜伏期抗原中最常检测到的抗原。
如本文所用的体液意为包含尿、唾液、精液、眼泪、淋巴液和最优选的血包括血细胞。PBMC’s可使用已知常规技术自血样中获得和培养。为了增加诊断方法的灵敏性和特异性，高度优选组合检测数个潜伏期特异性抗原，在一个特别优选的实施方案中方法包含检测针对Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、和Rv0080抗原的免疫应答。该方法还可与本领域公知的非特异于分枝杆菌感染的潜伏期例如那些特异于感染过程中活动期的其它抗原的检测组合。这些关于结核分枝杆菌的抗原可包含但是不限于：ESAT-6(Rv3875)、Ag85A(FbpA/MPT59、Rv3804c)、Ag85B(Rv1886c)、Ag85C(Rv3803c)、CFP10(Rv3874)、TB10.3(Rv3019c)、TB10.4(Rv0288)、MPT64(Rv1980c)、MPT32(Rv1860)和MPT57(Rv3418c)。
本发明还提供了实施前述诊断方法的诊断试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的一个或多个多肽或其片段且任选包含检测和定量结合于所述多肽的抗体或测量细胞免疫应答的试剂。这些试剂可优选包含检测抗原结合例如但是不限于ELISA或多重CBA检测所需的试剂，或检测IFN-γ和/或IL-10应答的试剂，例如那些用于本文提供的实施例中的试剂。检测分枝杆菌感染的多肽或其片段可方便地与固相载体例如蛋白质/肽(微)芯片或微滴/孔板连接。
本发明还包含来自潜伏期特异性抗原和/或表位的优选片段，包含多肽Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)。这些肽优选用于根据本发明引起免疫应答和诊断目的的方法和组合物并且优选长度为18-45个氨基酸且包含以下序列或由以下序列组成：VEDPAPPARAIADAALAALG(SEQID No.1)或图13、14、15和16中本发明鉴定和描述的B和T细胞表位中的一种。
定义
氨基酸序列相同表示两个(多)肽序列被例如GAP或BESTFIT程序使用默认参数最佳排比时如本文其它部分定义的那样具有至少一定百分比的相同序列。GAP使用Needleman和Wunsch全序列排比算法来排比两个序列全长，最大化匹配的数量且最小化裂隙(gaps)的数量。一般而言，使用GAP默认参数，1个裂隙插入扣分＝8和1个gap延伸扣分＝2。对于蛋白质默认打分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。百分比序列相同的序列排比和打分可使用计算机软件例如GCG WisconsinPackage，Version 10.3，可购于Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA92121-3752，USA来确定。或者百分比相似或相同可通过在例如FASTA、BLAST等等数据库中搜索来确定。
调节子是真核生物中的遗传单位，由单个调节基因控制的基因非连续的组组成。在细菌中，调节子是涉及多效调节域的相互作用的整体调节系统且可由一个或数个操纵子组成。结核分枝杆菌的NRP/休眠(DosR)调节子是由DosR转录调节子-(Rv3133c)控制的且包含至少48个表2中所列的Voskuil等人(J.Exp.Med.2003，198(5)：705-13)描述的序列。
如本文所用的术语受试者涉及活的多细胞脊椎生物体，范畴包括人和非人哺乳动物。术语受试者包括人和兽医或实验室受试者。
本文的抗原是能够诱导哺乳动物免疫应答的大量分子或其片段。该术语包括对抗原性或抗原决定簇或表位负责的免疫原和区域。抗原是一种化学或生物化学结构，其中起决定性作用的抗原或其部分能够诱导细胞(T细胞)或体液(抗体)免疫应答的形成。
体内或体外免疫应答可通过本说明书提供的一种方法来确定和/或监测，还可通过许多本领域技术人员公知的和显而易见的其它方法例如见于Current Protocols inImmunology，Wiley Interscience 2004的方法来进行。细胞免疫应答能够通过诱导取自当前或之前感染(有毒地)分枝杆菌的或用不限于多肽免疫的哺乳动物的淋巴细胞中的相关细胞因子例如IFN-γ或IL-10的释放(或诱导细胞增殖)来确定。为了检测细胞增殖，细胞可用放射性标记的胸苷脉冲或(流式)细胞计数仪或显微镜下计数。细胞因子的诱导可通过多种免疫化学方法例如但是不限于ELISA或Elispot检测法来检测。体外细胞应答还可通过来自健康个体或分枝杆菌感染的哺乳动物的T细胞系的使用来确定，其中T细胞系取自活和/或灭活、减毒或重组分枝杆菌、潜伏分枝杆菌或由其衍生或从中获得的选择抗原。
术语疫苗或免疫原性组合物本文用于描述对刺激哺乳动物特异性免疫应答有效的组合物，任选包含佐剂或其它活性成分来增强或直接引起特殊类型的免疫应答，优选CTL或Th应答。
分枝杆菌在其休眠期或静止期表达的潜伏期特异性多肽或抗原比在其活动或对数生长期水平更高(或唯一)，因为结核分枝杆菌可由NRP/休眠(DosR)调节子编码(Voskuil等人，2003)。
应将TST阳性个体理解为包含显示阳性曼塔斯试验(＞5mm硬结)的哺乳动物或其纯蛋白衍生物PPD(＝结核菌素)诱导阳性体外响应应答的个体，应答通过IFN-γ的释放来确定，并且因此可能具有潜伏分枝杆菌感染，例如已被(有毒力的)分枝杆菌例如结核分枝杆菌感染的个体没有显示(活动性)疾病例如肺结核(TB)的信号。TB患者是培养或显微镜证明(有毒力的)分枝杆菌感染的个体和/或临床诊断TB和对抗TB化学疗法有效的个体。TB的培养、显微镜检查和临床诊断是任何本领域医生公知的。
当第一个核酸序列与第二个核酸序列功能相关时，核酸序列可操作性的选连接于第二个核酸序列上。例如如果启动子影响了编码序列的转录和表达，可将启动子操作性的选连接于编码序列上。一般而言，可操作链接的DNA序列是连续的且必要时在同样的阅读框中连接两个蛋白质编码区域。
如本文所用的载体涉及引入宿主细胞从而生成转化宿主细胞的核酸分子。载体可包括允许在宿主细胞中复制的核酸序列例如复制起点。载体可以例如是质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒、病毒、逆转录病毒、游离基因或转座因子。载体还可包括一种或多种可选(抗生素抗性)或外观可见(例如GFP、免疫标记)标记基因和其它本领域公知的遗传元件。蛋白质、肽和多肽是氨基酸(通常是L-氨基酸)的线性聚合链，其中α碳是通过一个氨基酸的α碳的羧基和另一个氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应形成的肽键连接的。链的一个末端的末端氨基酸(例如氨基末端)具有游离氨基，而链的另一个末端的末端氨基酸(例如羧基末端)具有游离羧基。因此，术语氨基末端(N-末端)涉及肽的氨基末端的氨基酸的游离α-氨基或肽的其它任何位置的氨基酸的α氨基(当参与另一个肽键时为亚氨基)。术语羧基末端(C-末端)涉及肽的羧基末端的氨基酸的游离羧基或肽任何其它位置的氨基酸的羧基。
合成多肽涉及用有机化学工具形成肽键通过特定顺序连接氨基酸在体外形成的多肽。通常形成肽的氨基酸依次计数，开始于肽的氨基末端且朝向羧基末端增加。
附图说明
图1.应答结核分枝杆菌潜伏期抗原、低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物和培养滤液(CF)的长期T细胞系的数量(n＝12)。≥50pg/ml的IFN-γ应答认为是阳性。用在低含氧量条件下生长的结核分枝杆菌培养液的溶菌产物(n＝4)□或CF(n＝4)■或用在标准含氧条件下生长的结核分枝杆菌培养液的溶菌产物(n＝4)■刺激从TST+个体(n＝2)或TB病人(n＝4)的得到的PBMC获得细胞系。条带指示了对每个潜伏期抗原的应答的细胞系的数量且每个条带顶部的数字说明了这些应答细胞系生成IFN-γ的平均值。
图2.TST阳性个体(TST+)和TB病人识别的潜伏期抗原的数量。来自23个TST+个体和20个TB病人的PBMC’s用25个结核分枝杆菌潜伏期抗原刺激。当潜伏期抗原诱导≥50 pg/ml的IFN-γ应答时认为其被识别。计算每个个体识别潜伏期抗原的数量。条带显示了识别特定数目的潜伏期抗原的个体的数量。(a)TST+个体。白色条带指示了新近TST转化者的数量(总数n＝12)而黑色条带指示了遥远TST转化者(总数n＝11)的数量。(a)TB病人。白色条带指示了活动性TB病人的数量(总数n＝11)而黑色条带指示了治愈TB病人的数量(总数n＝9)。
图3.对四个最佳识别的结核分枝杆菌潜伏期抗原的应答曲线。来自健康对照(HC)、TB病人(TB)和TST阳性个体(TST+)的应答四个结核分枝杆菌潜伏期抗原即Rv1733c(a)、Rv2029c(b)、Rv2627c(c)、Rv2628(d)的PBMC’s的IFN-γ生成。还评价了PBMC对低含氧量条件下生长的结核分枝杆菌的溶菌产物(e)或培养滤液(f)的应答性。受试组的平均值用水平线表示。*，P＜.05；**，P＜.01；***，P＜.001。
图4.对结核分枝杆菌潜伏期抗原的健康对照(HC)的应答。(a)健康非结核分枝杆菌感染对照基于其对低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物的应答分为两组。具有＜100pg/ml的IFN-γ应答的HC分类为HClow(n＝11)(○)，而具有＞100pg/ml的IFN-γ水平的HC分类为HChigh(n＝10)(●)。平均值显示为水平线。(b)对25个潜伏期抗原的IFN-γ应答平均值计算为HChigh组(黑色条带)和HClow组(白色条带)。正如显示的那样，对潜伏期抗原的IFN-γ应答几乎只在HChigh组(黑色条带)中观察到(b)。这组中的个体大多可能暴露于环境中的分枝杆菌中，正如它们对低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物的强烈应答所显示的那样。
图5.被结核分枝杆菌Rv1733c的肽池刺激后的CFSE标记的CD4淋巴细胞的增殖。已知对Rv1733c重组蛋白质进行应答的TST+个体的PBMC用羧基醋酸荧光素琥珀酰亚氨酯(CFSE)标记且用培养基(a)、PPD(b)、Rv1733c重组蛋白质(c)或Rv1733c肽池(d-f)刺激。CD4细胞染色，随后通过使用流式细胞仪测量CFSE的稀释液来评价CD4阳性细胞的增殖。
图6.应答潜伏期抗原的细胞因子曲线。TB病人(n＝10)和TST阳性个体(n＝10)的PBMC用显示的潜伏期抗原和低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物刺激。六天后收集上清液且使用FACSCalibur流式细胞仪根据微量样本多指标流式蛋白定量技术(BD)来确定细胞因子曲线。评价以下细胞因子：TNFα(红色)、IL-10(橙色)、IL-5(黄色)、IL-4(绿色)和IL-2(蓝色)；每组中显示的是每个抗原的细胞因子水平平均值。与TB病人相比，TST阳性中观察到显著的IL-10应答，特别是对于Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628和Rv3129中。
图7.所有48个DosR潜伏期抗原的免疫原性检查。
图8.优选TB潜伏期抗原的识别频数。
图9.显示了参与的对TB潜伏期抗原应答的欧拉图。
图10.图D.人接种BCG后的免疫应答。BCG接种的个体对TB潜伏期抗原的单独(i)IFNγ应答和平均值(ii)。不暴露在任何结核分枝杆菌下的BCG接种的个体显示了对TB潜伏期抗原的弱IFNγ生成(左)，而有证据暴露于TB(例如对TB特异性抗原ESAT6或CFP10的体外应答阳性)的BCG接种的个体对TB潜伏期抗原具有显著的IFNγ生成(右)。
图11.(上层条带I)BCG接种的HLA-DR3转基因小鼠对TB潜伏期抗原HspX及其HLA-DR3限制性T细胞表位诱导弱免疫应答，而对Hsp65和Ag85重组蛋白质及其HLA-DR3限制性肽观察到显著应答(如Geluk等人，PNAS 95：10797-802所描述)。
(下层条带ii)BALB/c小鼠对潜伏期TB潜伏期抗原的IFNγ应答。体外用TB潜伏期抗原刺激的BCG接种鼠脾细胞生成低水平IFNγ。相反，分泌抗原Ag85A刺激的细胞生成显著数量的IFNγ(A)。然而，小鼠能够对检测的TB潜伏期抗原产生免疫应答：在用质粒DNA编码单独TB潜伏期抗原3×免疫接种后，脾细胞产生显著数量的IFNγ(B)。
图12.TB抗原的TMHMM(跨膜)后概率分析。
实施例
材料和方法
研究对象
研究包括20个TB病人、23个健康结核菌素皮肤试验(TST)阳性个体和21个健康未感染对照。因为我们的主要目标是检查对新潜伏期抗原的T细胞应答而没有做关于结核分枝杆菌感染哪个时期中最易发生识别的假设。因此选择了复杂背景的TB病人和TST转化者作为研究对象。
20个TB病人中11个病人患有治疗了2周-6个月(平均2.5个月)的活动性TB疾病而9人患有在取血样前治疗了4-63年(平均间隔29年)的已治愈TB。11个病人患有肺而9人患有肺外TB。取血样时的平均年龄为46岁(范围是17-75)，14人是男性。9个病人来自荷兰、3人北非、6人非洲和3人是亚洲血统。这些病人都没有HIV的危险因素。
23名TST阳性者全部健康、他们都没有经过BCG接种且TST结果证实他们都有≥10mm的硬结，绝大多数在接触肺TB涂布呈阳性的案例后(n＝14)。平均年龄是37岁(范围是21-63)，14人是男性。所有均为荷兰人。12人在TST转化后6个月内取血，其中只有5人用异烟肼治疗了潜伏TB感染。剩下的11个TST阳性者，转化和取血间的平均间隔是6年(范围是2-12年)。这些遥远TST转化者中仅有2人曾接受过异烟肼。直到撰写本发明时，没有TST阳性者在TST转化后平均4.9年的时期后患有活动性TB疾病。此组中的大多数个体可认为是潜伏感染个体，显示了对活动性TB疾病发生的一定程度的天然保护。
作为对照组，21个健康、未经BCG接种的个体接受研究。在这些健康对照中没有人曾暴露于TB中。他们是TST阴性(n＝18；其他人没有进行TST)和或用ELISPOT进行的对结核分枝杆菌特异性蛋白质、ESAT-6和CFP-10检测IFN-γ的试验呈阴性(21)。所有对照者是平均年龄30岁(范围是22-44岁)的荷兰人，7人是男性。
血样通过使用肝素化导管标准静脉穿刺获得自所有的写有知情同意书的研究对象。随后如前描述的使用Ficoll密度梯度法分离PBMC且储存于液氮中(22)。研究计划(P207/99)由Leiden University Medical Center的机构审查委员会批准。
结核分枝杆菌抗原和肽
为此研究，结核分枝杆菌H37Rv在螺旋瓶盖盖紧的试管中生长24小时，如前述收集并裂解(16)。该裂解液还被称为低含氧量裂解液，将其用丙酮沉淀和PBS透析。此低氧培养的培养滤液用centriprep离心超滤器浓缩。获得制品的蛋白质浓度用BCA试验确定(Pierce，Rockford，Ilinois)。低含氧量裂解液和低含氧量培养滤液由Statens SerumInstitute(Copenhagen，Denmark)惠赠。标准充氧实验室条件下培养结核分枝杆菌的溶菌产物由Natinoal Institute of Public Health and Environment(Bilt ho ven，the Netherlands)提供。
重组蛋白质由来自结核分枝杆菌休眠调节子的25个最正调节的基因组成(表1)。用PCR扩增基因和在含有N-末端组氨酸标签的细菌表达载体中用Gateway技术克隆(Invitrogen，San Diego，CA)。蛋白质在大肠杆菌B株BL21(DE3)中过表达且如前述纯化(23)。为了证实表达了正确的序列，测序所有嵌入物。通过凝胶电泳和抗-His抗体的免疫印迹法检查大小和纯度。通过鲎变形细胞溶解物试验评价残余内毒素的浓度低于50I.U./mg蛋白质(BioWhittaker，Walkersville，MD)。
来自潜伏期抗原Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c和Rv2628的20个合成肽每个是带有10个氨基酸重叠的20个氨基酸(aa)长且跨越所述潜伏期抗原的全部氨基酸序列(22)。所有肽的序列在C-末端用两个赖氨酸残基延长以提高溶解性。为了最佳使用PBMC’s，我们选择生成9个肽池，每个具有4-5个肽且每个单独的肽存在于两个不同的池中。此方法能够鉴定被抗原特异性T细胞识别的一个池中的特异性肽。
T细胞系
针对生长于低氧条件下的结核分枝杆菌的裂解液(n＝4)或培养滤液(n＝4)使用获得自两个TB病人和两个已知应答HspX的TST阳性个体的PBMC生成八个长期T细胞系。为了比较，用在标准充氧实验室条件下培养的结核分枝杆菌的裂解液刺激来自三个TB病人和一个TST阳性个体的PBMC制备了另外4个结核分枝杆菌特异性T细胞系。T细胞系如前述制备(24)。简言之，PBMC在24孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)中以1×106细胞/孔浓度在5μg/ml上述详细说明的抗原的存在下培养。6天后，加入25U/ml白细胞介素-2(Cetus，Amsterdam，The Netherlands)且继续培养2-3周。T细胞冻存于液氮中直至使用。
T细胞增殖检测
将单独的T细胞(5×104/孔)或将T细胞(5×104/孔)与作为抗原递呈细胞(1.5×104/孔)的HLA-DR匹配的辐射PBMC三份在抗原存在或不存在下于96孔平底微量滴定板(NUNC)中培养。补充10％混合人血清、40U/ml青霉素和40μg/ml链霉素的Iscoves改良DMEM(Gibco，Paisley，Scotland)用做标准培养基。如表1所示的所有25个重组潜伏期抗原在终浓度0.33μm下及标准结核分枝杆菌裂解液、低含氧量-裂解液和-培养滤液在1μg/ml浓度下检测。有丝分裂原PHA(2μg/ml)用作阳性对照。37℃和5％CO2培养三天后，收集上清液(50μl/孔，每三份混合)进行IFN-γ检测且T细胞增殖通过[3H]胸苷掺入如前述测定(22)。增殖表示为刺激指数，计算为刺激孔中每分钟计数除以未刺激孔中每分钟计数。刺激指数＞4预先定义为阳性应答。
淋巴细胞刺激测定
三份PBMC(1.5×105/孔)在标准培养基中于96孔平底微量滴定板37℃、5％CO2在潜伏期抗原存在或不存在下培养。相同抗原和相同量在所有实验室中使用。由于Rv1737c量的不足，对此抗原的研究对象的数量限制为17个健康对照、18个TST+者和16个TB病人。在第六天，收集上清液(75μl/孔，每三份混合)进行IFN-γ检测且如前述测定T细胞增殖(22)。
IFN-γ检测
上清液中IFN-γ浓度通过ELISA(U-CyTech，Utrecht，The Netherlands)测定。此方法的检出限是20pg IFN-γ/ml。ELISA样品重复两次检测。刺激培养基的平均值减去未刺激培养基的平均值。阳性应答预先定义为在刺激T细胞系的上清液中IFN-γ浓度＞50pg/ml和PBMC培养基中＞100pg/ml。
多重细胞因子检测
IFNγ、TNFα、IL-10、IL-5、IL-4和IL-2在培养基上清液中的浓度用人Th1/Th2细胞因子(BD Biosciences)微量样本多指标流式蛋白定量(CBA)试剂盒来确定，允许在一个样品中同时检测多重细胞因子。检测根据厂家说明书进行。
CFSE标记的PBMC’s的增殖
将PBMC融化并以10×106细胞/ml重悬于PBS/0.5％BSA(37℃)中。CFSE以终浓度5μM加入且37℃黑暗培养10分钟。培养后，加入FCS(10％)且用PBS/0.5％BSA洗细胞两次。标记的PBMC(1×106细胞/孔)在标准培养基中在PPD(5μg/ml)、Rv1733c重组蛋白质(20μg/ml)、Rv1733c肽池(每个肽10μg/ml)、PHA(2μg/ml)或单独培养基存在下于24孔板中培养。6天后，细胞用PBS/0.1％BSA清洗且对CD4染色，随后通过使用流式细胞仪测量CFSE的稀释液来评价CD4阳性细胞的增殖。
统计分析
为了比较每个研究组中应答者的比例，使用卡方检验。IFN-γ应答平均值用克-瓦二氏检验非参数计算以比较所有三个研究组而曼-惠特尼U检验用作两组对比时的事后检定。由于此研究的主要目的是初步筛选有潜力的免疫原性潜伏期抗原，所以不适用Bonferroni校正。非参数弗里德曼检验(等级方差)用于检测TST阳性个体一般识别25个潜伏期抗原好于TB病人的假说。P值＜0.05认为在统计学上是显著的。用于Windows的SPSS10.0用于统计分析。
实施例1
免疫原性的潜伏期抗原的选择
抗原选自最近鉴定的结核分枝杆菌的休眠调节子，它由48个基因(表2)组成，发现这48个基因在NRP、氧限制和暴露在低剂量氧化氮的条件下能被诱导(17)。由于这些基因中的大多数是具有未知功能的假设开放阅读框，因此对此后基因组抗原发现计划的基因选择不能基于蛋白质功能。因此我们根据其诱导的浓度选择基因。为此目的，计算每个单独基因的平均诱导倍数，基于Voskuil等人在三个不同体外潜伏期模型中观察到的诱导倍数(17)。在48个候选基因的数据中，选择25个诱导最强的基因进行克隆和表达为重组蛋白质(表1；图7i和8i)。这些假设蛋白质随后在相同摩尔浓度下检测以能够进行大小上非常不同(9-74kDa)的潜伏期抗原之间的直接比较。这25个抗原全部被结核分枝杆菌超声处理物生成的短期T细胞系识别。
对于这些假设潜伏期抗原的免疫原性的最初评价，在低氧条件下或在标准充氧条件下(n＝4)培养的的结核分枝杆菌的裂解液(n＝4)或培养滤液(n＝4)中制备长期T细胞系且特异性通过T细胞增殖检测证实。重要的是，所有25个潜伏期抗原都被12个T细胞系中的至少1个识别(IFN-γ＞50pg/ml)而20个抗原被至少4个T细胞系识别(图1)。潜伏期抗原HspX(Rv2031c)和Rv2032是最常被识别的，被检测的T细胞系的75％识别，IFN-γ在应答系中的浓度平均值分别是507和129pg/ml。大多数潜伏期抗原被低含氧量溶菌产物和低含氧量培养滤液培养的T细胞系识别，说明潜伏期抗原还能在培养滤液细胞外中发现。这证实了之前显示Rv0569、Rv2623和Rv2626c蛋白质存在于生长在低含氧量条件下的结核分枝杆菌的培养滤液中的研究(16)。标准溶菌产物特异性T细胞系对潜伏期抗原的应答与低含氧量溶菌产物特异性T细胞系一样好(图1)。这一发现支持了最近的观察结果，即在静止生长期收获细菌时潜伏期抗原还被标准充氧培养的结核分枝杆菌表达，虽然其表达的程度比在所定义的低含氧量条件下培养的结核分枝杆菌(25)更低。我们用于生成T细胞系的标准充氧的结核分枝杆菌溶菌产物的免疫印迹分析证实了潜伏期抗原HspX在此制品中的存在(数据没有显示)。增殖数据(数据没有显示)的类似结果证实了T细胞系对潜伏期抗原的应答性。这一首次探索筛选说明所有25个新分枝杆菌潜伏期抗原具有能引起细胞免疫应答的可能。
实施例2
应答结核分枝杆菌潜伏期抗原的PBMC中干扰素γ的生成
随后，用20个TB病人、23个TST阳性健康个体和21个未感染对照对象的PBMC研究了25个潜伏期抗原诱导IFN-γ的生成。对每个单独潜伏期抗原，计算每组研究对象的应答(IFN-γ≥100pg/ml)比例(表1)。我们还计算了所有43个结核分枝杆菌感染个体中应答者的比例，其中共20个TB病人和23个TST阳性个体。后一个分析显示19个潜伏期抗原被结核分枝杆菌感染个体的至少5％识别，Rv1733c被大部分(56％)感染个体识别。剩余6个检测的抗原，Rv0572c、Rv2623、Rv2624c、Rv3127、Rv3131、Rv3134c不或很少被结核分枝杆菌感染个体识别。当分析增殖数据时(未显示)发现类似识别曲线。
表1.潜伏期抗原的免疫原性a
Rv编号 基因 产品   应答者(％)b
    HC(n＝21)     TB(n＝20)     TST+(n＝23)
  Rv0079Rv0569Rv0572cRv1733cRv1738Rv1813cRv1996Rv2007cRv2029cRv2030cRv2031cRv2032Rv2623Rv2624cRv2626cRv2627cRv2628Rv3126cRv3127Rv3129Rv3130cRv3131Rv3132cRv3133cRv3134c fdxApfkBhspXacgTB31.7devSdosR   HPCHPHP可能是跨膜蛋白CHPCHPCHP可能是铁氧环蛋白A可能是磷酸果糖激酶BCHP热休克蛋白HspXCHPAcgCHP TB31.7CHPCHPCHPHPHPCHPCHPCHPCHP传感组氨酸激酶转录调节蛋白CHP     14-1041-1414-2914514--14381019-19--2414-     105550111511-25152020--10301610-21--1532-     1622-6113174961*26-*30--3052353043513417304
a缩写：HC，健康对照；TB，TB病人；TST+，结核菌素皮肤试验阳性个体；HP，假设蛋白质；CHP，转化假设蛋白质。
注释来自http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/
bIFN-γ应答≥100pg/ml认为阳性。-，受试者都没有应答。
*P＜.05，比较TB病人与TST+个体的卡方检测。
除了25个最强诱导的DosR基因，再次检测了48个DosR基因整组的INFγ生成，包括剩余的23个未检测的TB潜伏期抗原。所有DosR基因在如前述的类似形式下检测，结果在图7ii和8ii中显示。从下条带中清楚地看出除了Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c和Rv2628外，另外4个抗原Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark)获得了强INFγ生成，能选择为潜在疫苗候选者。
实施例3
TB病人和TST阳性个体对潜伏期抗原的不同应答
检测TB病人和TST转化者的组中对每个潜伏期抗原的IFN-γ应答平均值。将25个潜伏期抗原作为一组，IFN-γ应答平均值在被认为是结核分枝杆菌潜伏感染的TST阳性个体中始终和显著地高于TB病人(P＜0.01；弗里德曼检验)。为了深入分析此抗原识别的不同，我们计算了对每个潜伏期抗原的IFN-γ应答和相同个体中对低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物的全部应答间的比率。此分析校正了T细胞的一般应答性中可能的个体间变异。当重复上述弗里德曼分析时，比较这些比率的平均值，证实了潜伏期抗原优选被TST阳性个体所识别(P＜0.01)。
当比较TST阳性个体组和TB病人组中对每个单独潜伏期抗原的应答者的比率时，发现几乎所有潜伏期抗原相比TB病人被TST阳性个体组较大比率识别(表I)。但是这种倾向仅对Rv2029c显著(P＝0.02)，其被61％TST阳性个体和25％TB病人识别。
个体间的应答曲线不同，这潜伏期抗原的数量和被识别的特异性抗原有关(图2)。TST阳性者平均识别检测的25个潜伏期抗原中的4个，而相反TB病人平均识别仅1个潜伏期抗原。
图8中概括了Mantoux阳性个体识别TB潜伏期抗原的频数。对第一系列25个TB潜伏期抗原来说，显然不是所有抗原都相同地被识别(Cochran’s Q检验，P＜.001)。基于此想法，我们选择了第一系列中至少50％识别的潜伏期抗原：Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c和Rv2628且选择了第二系列23个TB潜伏期抗原中具有相同特点的：Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark)。这8个抗原提供了最适于诊断和免疫接种目的的TB潜伏期抗原的特异性亚群，作为单独抗原或其片段，但是最优选使用选自由Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark)组成的组中的1、2、3、4、5、6、7或所有8个DosR基因产物的组合。
实施例4
常被识别的潜伏期抗原的干扰素-γ应答
4个潜伏期抗原即Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c和Rv2628被大部分潜伏感染个体广泛识别且如IFN-γ生成所测量的那样诱导最强的Th1应答。每个研究组对这4个抗原的IFN-γ应答显示于图3。TST阳性者的组对Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c和Rv2628应答而生成IFN-γ的平均值分别是213、281、107和51pg/ml。相反，TB病人对这4个抗原的IFN-γ应答则低得多，平均值分别是98、16、＜10和＜10pg/ml。抗原Rv2029c的IFN-γ应答的区别在统计学上呈显著性(P＝0.03)(图3)。
令人惊奇的是，潜伏期抗原Rv2031c相比TST转化者更常被TB病人显著识别(IFN-g＞100pg/ml)(P＝0.02)(表I)。但是当进行定量分析时，直接比较两组间的IFN-γ生成未发现统计学上显著的区别。有趣的是，对Rv2031c至少显示了一些应答(IFN-γ浓度在20-100pg/ml间)的TST转化者全部是最近TST转化者(＜6个月)，因此仅在最近暴露于结核分枝杆菌中。
我们研究的另一个有趣的潜伏期抗原是Rv3133c/dosR，显示其充当了介导结核分枝杆菌的低含氧量应答的转录因子。最近研究了Rv3133c/dosR的一个突变株；在豚鼠显示它的病理变化和细菌负载减少但是没有改变体外结核分枝杆菌在人单核细胞中的进入、存活和繁殖(28)。在我们的研究中，Rv3133c被大约三分之一TST阳性个体和TB病人识别，应答者中的IFN-γ应答平均值分别是227和145pg/ml。
在图9(欧拉图)中IFN-γ应答的重叠代表了第一系列受试者中最好的4个TB潜伏期抗原，其中，评价了所有单独抗原：82.4％Mantoux阳性个体对一个或多个以下潜伏期抗原有应答：Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c和Rv2628。Rv1733c和Rv2627c的组合是最常被识别的，且只对此现象负责；没有Rv2029c(PfkB)和/或Rv2628的附加值。Rv2029c(PfkB)是Mantoux阳性者中最常识别(70.6％)的TB潜伏期抗原。这些抗原的组合，优选与Rv0080、Rv1735c、Rv1736c和/或Rv1737c组合将高度适合且优选用于诊断试验和潜伏期和/或多级疫苗的组合物。
图12中显示了TB潜伏期抗原Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark)的跨膜螺旋的预测。用TMHMM 2.0 Server进行预测.Krogh A，Larsson B，von Heijne G，Sonnhammer EL.Predicting transmembraneprotein topology with a hidden Markov model：application to complete genomes.2001.J MolBiol.305(3)：567-80(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)。表3和4中MHC I类和II类表位与预测数据组合而表5中与体外数据组合，此分析表明能检测到CD8 T细胞对TB抗原的应答，这与这些抗原是分泌的或膜结合的事实无关(Klein MR等人，HLA-B*35-restricted CD8 T cell epitope in Mycobacterium tuberculosis Rv2903c.2002Infect Immun.70(2)：981-4)。
实施例5
健康对照对潜伏期抗原的识别
多少出乎意料的是，25个潜伏期抗原中的16个被少数健康个体的T细胞识别(表I)，虽然免疫应答强度通常低于结核分枝杆菌感染个体。因为所有健康未接种BCG的对照是TST阴性的且此组对结核分枝杆菌特异性免疫显性抗原ESAT6和CFP10的体外应答也是阴性的(数据未显示)，我们推断观察到的潜伏期抗原应答不是由结核分枝杆菌复合种感染引起的。但是，21个健康对照中的10个(48％)确实对低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物有显著应答，应答者的IFN-γ应答平均值是563pg/ml(图3和4)。此发现与对获得自先前暴露于环境分枝杆菌的分支杆菌抗原的T细胞交叉反应性是一致的。由于对潜伏期抗原的应答大多在强烈应答低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物的健康对照组中观察到(图4)，这些应答很可能还在反应先前暴露于交叉反应性环境分枝杆菌。只有Rv1733c有时还被不强烈应答低含氧量结核分枝杆菌溶菌产物的健康对照识别，IFN-γ平均值41pg/ml，说明了对除了分枝杆菌抗原的其他抗原的可能的交叉反应性。
实施例6
对Rv1733c的肽应答的CFSE标记的PBMC的增殖
为了证实潜伏期抗原的蛋白质特异性激活作用，我们检测了作为最常被识别的抗原Rv1733c的肽特异性增殖。来自已知对Rv1733c有应答的TST阳性个体和健康对照的PBMC用CFSE标记且用Rv1733c的重组蛋白质或肽池刺激。6天后细胞进行CD4染色且用流式细胞仪评价CD4 T细胞的增殖。PPD和Rv1733c重组蛋白质的刺激都诱导CD4+T细胞的强烈增殖。Rv1733c的数个肽池，特别是含有肽16的肽池也能够诱导CD4+T细胞的增殖。图5中显示了来自TST阳性个体的PBMC。计算机预测对此供体(DRB1*15)的HLA类型的Rv1733c表位导致发现了数个可能的表位，其中两个位于肽16(VDEPAPPARPIADAALAALG和VDEPAPPARAIADAALAALG)，这与观察到的应答肽16的CD4 T细胞的增殖一致。使用来自健康对照的PBMCRv1733c的肽还诱导CD4细胞的增殖，这些健康对照对Rv1733c的重组蛋白质进行诱导，这说明此应答是抗原特异性的。
除了原始申请中提到的含有T细胞表位序列的来自Rv1733c的肽16，现已确定在选择的TB潜伏期抗原中还有以下其它T和B细胞表位和肽：在表3和表4中所有预测的HLAI类和II类限制性T细胞表位分别代表了第一系列(例如Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c和Rv2628)和第二系列(例如Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark))中最好的4个TB潜伏期抗原。
表4中列出了9个氨基酸构成的序列，代表被所有已知HLA I类超型：A1、A2、A3、A24、B7、B8、B27、B44、B58和B62限制的预测的CD8 T细胞表位。
使用NetCTL 1.0 Server进行预测，预测了蛋白质序列中的CD8 T表位。此方法将肽MHC结合、蛋白酶体C末端断裂和TAP转运效率的预测结合起来。该软件允许预测限制于10个HLA超型的CTL表位。MHC结合和蛋白酶体断裂使用人工神经网络来进行。TAP转运效率使用重量矩阵来预测。参考文献：Larsen MV等人，2005.Eur J Immunol35(8)：2295-303(www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL)。
(表4)列出了由20个氨基酸构成的序列，它们代表预测的被25个HLA II类等位基因限制的CD4 T细胞表位：DR1(DRB1*0101、*0102)、DR3(DRB1*0301)、DR4、(DRB1*0401、*0402、*0404、*0405、*0410、*0421)、DR7(DRB1*0701)、DR8(DRB1*0801、*0802、*0804、*0806)、DR11(5)(DRB1*1101、*1104、*1106、*1107)、DR13(6)(DRB1*1305、*1307、*1321)、DR15(2)(DRB1*1501、*1502)和DRB5*0101。使用TEPITOPE2000(Vaccinome)进行预测。TEPITOPE是基于HLA II类肽结合的T细胞表位预测模型且允许从大量蛋白质序列中快速鉴别混那杂的HLA II类配体和表位。参考文献：Bian H，Hammer J.Discovery of promiscuous HLA-II-restricted T cell epitopes with TEPITOPE.2004.Methods.34(4)：468-75。
表5中列出了从Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c和Rv2628获得的所有由20个氨基酸构成的肽，已测定在20个PPD阳性供体中对Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c和Rv2628识别。细胞用CFSE标记，用肽、重组蛋白质或对照抗原刺激。CD4和CD8T细胞的增殖用流式细胞仪测定且收集上清液用多重细胞因子检测法分析。
红色显示了引起多种供体中的CD4或CD8 T细胞的强烈增殖(＞75％)的肽，绿色肽＞50-75％增殖，而浅绿色肽＞20-50％增殖(表5)。其它TB潜伏期抗原(例如Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark))期望得到类似数据。
表6中列出了Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(Nark)的氨基酸序列且粗体和下划线分别显示了线性和构象的预测的B细胞表位。使用BepiPred 1.0 Server进行预测，它使用隐马尔可夫模型(hiddenMarkovmodel)和倾向标度法的组合预测了线性B细胞表位的位置。仅预测了与其它可获得结构和功能数据的已知蛋白质具有序列同源性的TB潜伏期抗原的B细胞表位构象(例如Rv2029c(PfkB)、Rv1736c(Nark)和Rv1737c(NarK2))。(参考文献：Larsen，JEP，LundO，Nielsen M.2006，Improved method for predicting linear B-cellepitopes(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred))。
实施例7
应答潜伏期抗原的其它细胞因子的生成
除了ELISA的IFNγ(实施例1-6)，在用重组抗原刺激PBMC第6天的上清液中测量了一系列的其它细胞因子。TB病人(n＝10)和Mantoux阳性个体(n＝10)的PBMC用重组蛋白质Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、HspX(Rv2031c)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3129、ESAT-6和CFP10刺激，且结核分枝杆菌的低含氧量溶菌产物作为阳性对照(图6)。IFNγ的CBA数据证实了ELISA的观察结果。TNFα和IL-5应答在两组中均发现没有明显偏移。IL-2和IL-4检测到非常弱的应答；且如果有任何可检测到的应答，在TB病人中也观察到这些应答。有趣的是，我们在Mantoux阳性者而不是TB病人中观察到大量潜伏期抗原显著的IL-10应答(图6)。
表2：
    结核分枝杆菌DosR调节子(AL123456)
    H37Rv   基因     大小(aa.)    说明
    Rv0079     273    假设蛋白质
    Rv0080     152    转化假设蛋白质
    Rv0081     114    可能的转录调节蛋白质
    Rv0569     88    转化假设蛋白质
    Rv0570   nrdZ     692    可能的核糖核苷二磷酸还原酶
    Rv0571c     443    转化假设蛋白质
    Rv0572c     113    假设蛋白质
    Rv0573c     463    转化假设蛋白质
    Rv574c     380    转化假设蛋白质
    Rv1733c     210    可能的转化跨膜蛋白质
    Rv1734c     80    转化假设蛋白质
    Rv1735c     165    假设膜蛋白
    Rv1736c   narX     652    可能的硝酸盐还原酶
    Rv1737c   NarK2     395    可能的硝酸/亚硝酸盐转运蛋白
    Rv1738     94    转化假设蛋白质
    Rv1812c     400    可能的脱氢酶
    Rv1813c     143    转化假设蛋白质
    Rv1996     317    转化假设蛋白质-USPA
    Rv1997   ctpF     905    可能的金属阳离子转运蛋白P型三磷酸腺苷酶A
    Rv1998     258    转化假设蛋白质
    Rv2003c     285     转化假设蛋白质
    Rv2004c     498     转化假设蛋白质
    Rv2005c     295     转化假设蛋白质-USPA
    Rv2006     otsB1     1327     可能的海藻糖-6-磷酸酯磷酸酯酶
    Rv2007c     fdxA     114     可能的铁还蛋白
    Rv2028c     279     转化假设蛋白质-USPA
    Rv2029c     pfkB     339     可能的磷酸己糖激酶
    Rv2030c     681     转化假设蛋白质
    Rv2031c     acr     144     热休克蛋白质X(α-晶体蛋白同系物)
    Rv2032     acg     331     转化假设蛋白质
    Rv2623     TB31.7     297     转化假设蛋白质-USPA
    Rv2624c     272     转化假设蛋白质-USPA
    Rv2625c     393     可能的转化跨膜蛋白
    Rv2626c     143     转化假设蛋白质
    Rv2627c     413     转化假设蛋白质
    Rv2628     120     假设蛋白质
    Rv2629     374     转化假设蛋白质
    Rv2630     179     假设蛋白质
    Rv2631     432     转化假设蛋白质
    Rv3126c     104     假设蛋白质
    Rv3127     344     转化假设蛋白质
    Rv3128c     337     转化假设蛋白质
    Rv3129     110     转化假设蛋白质
    Rv3130c     463     转化假设蛋白质
    Rv3131     332     转化假设蛋白质
    Rv3132c     578     两个组分传感组氨酸激酶
    Rv3133c   dosR   217   两个组分转录调节蛋白质
    Rv3134c   267   转化假设蛋白质-USPA
实施例8
对暴露前(例如预防性)TB疫苗来说，它普遍应用于TB领域中，临床前的TB疫苗研究应当包括在相关小鼠、豚鼠和非人灵长类动物模型中逐步筛选和检测(Brandt等人，Infect.Immun.2000；68(2)：791-795；Olsen等人，Infect.Immun.2004；72(10)：6148-50；Langermans等人，Vaccine 2005；23(21)：2740-50)，包括低剂量气溶胶感染激发模型(Williams等人，2005，Tuberculosis(Edinb).2005；85(1-2)：29-38)。对于暴露后(例如治疗性)TB疫苗来说，现有动物模型仅部分模拟人TB疾病(McMurray，Clin.Infect.Dis.2000；30 Suppl 3：S210-2)且外推至人还不清楚。TB疫苗发展领域的当前想法是增强新TB疫苗BCG诱导的免疫应答(例如McShane等人，Nat Med.2004；10(11)：1240-4；OrmeTuberculosis(Edinb).2005；85(1-2)：13-7)。但是增强免疫应答仅能在BCG首先开始应答时奏效。
当前应用的TB疫苗是牛分枝杆菌BCG。BCG针对散布和严重形式的TB疾病保护幼儿，但是不能保护成人中最流行和传染形式的肺TB。许多假说对BCG的这种失效进行了解释，特别是BCG的免疫应答被暴露于环境的分枝杆菌所影响(Fine PE，1995Lancet.346：1339-45)。本发明提供了一种更好的选择。免疫接种时BCG接触皮肤的情况不同于结核杆菌存活时接触免疫能力活性的宿主的情况，主要在肺的免疫肉芽肿中。随后抗原表达曲线也不同，包括相应的免疫识别曲线。我们发现BCG接种不能诱导对TB潜伏期抗原的免疫应答：当接种BCG至健康受试者的血样(PBMC)体外检测时，与已暴露于TB的个体(体外应答ESAT-6和CFP10呈阳性)相比观察到非常弱的对TB潜伏期抗原的免疫应答(图10)。这种横向比较的观察结果在(HLA-A2和-DR3转基因)小鼠中的HspX和在普通同系繁殖的BCG接种小鼠中的其它TB潜伏期抗原得到确证(图11)。
由于免疫显性的TB潜伏期抗原以人TB的部分天然免疫性为靶，且不是现有BCG接种过程的靶，因此它们代表了治疗性TB疫苗的最有希望的候选者(注意：TB潜伏性抗原都不在BCG中缺乏的RD抗原中)(Behr等人，1999)。BCG的体外表达曲线显示其能够表达所有TB潜伏期抗原，除了NarX/K2。因此，尽管BCG大体上能够体外表达TB潜伏期抗原，显然它不能遇到表达DosR调节子编码的抗原的合适的条件。本发明提供了在体内更有效的DosR潜伏期抗原，选自由Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)组成的组，更优选选自Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c和Rv0080，用于组合物和/或疫苗或者在重组体(BCG)分枝杆菌中表达和/或显示。本发明还提供了这些DosR抗原中对T和B细胞的表位。
表3-1.Rv1733c中预测的超型HLA I类表位
Figure A20068001885600341
表3-2.Rv2029c中预测的超型HLA I类表位
Figure A20068001885600342
Figure A20068001885600351
表3-3.Rv2627c中预测的超型HLA I类表位
Figure A20068001885600352
Figure A20068001885600352
Figure A20068001885600361
Figure A20068001885600371
Figure A20068001885600381
表3-4.Rv2628中预测的超型HLA I类表位
Figure A20068001885600382
表3-5.Rv0080c中预测的超型HLA I类表位
Figure A20068001885600391
表3-6.Rv1735c中预测的超型HLA I类表位
Figure A20068001885600392
Figure A20068001885600401
3-7.Rv1736c(NarX)中预测的超型HLA I类表位
Figure A20068001885600411
Figure A20068001885600421
Figure A20068001885600431
Figure A20068001885600441
Figure A20068001885600451
3-8.Rv1737c(NarK2)中预测的超型HLA I类表位
Figure A20068001885600461
Figure A20068001885600471
Figure A20068001885600481
Figure A20068001885600491
表4-1.免疫显性的TB潜伏期抗原中预测的HLA II类限制性T细胞表位
Figure A20068001885600492
Figure A20068001885600502
注：结果用TEPITOPE 2000生成，Vaccinome(Bian H，Hammer J.2004，Discovery ofpromiscuous HLA-II-restricted T cell epitopes withTEPITOPE.Methods，34(4)：468-75)。
表4-2.免疫显性的TB潜伏期抗原中预测的HLA II类限制性T细胞表位
Figure A20068001885600503
Figure A20068001885600511
注：结果用TEPITOPE 2000生成，Vaccinome(Bian H，Hammer J.2004，Discovery ofpromiscuous HLA-II-restricted T cell epitopes withTEPITOPE.Methods，34(4)：468-75)。
表5.TB潜伏期抗原的20个氨基酸肽的识别
Figure A20068001885600521
Figure A20068001885600522
Figure A20068001885600531
表6.TB潜伏期抗原中预测的线性和构象B细胞表位
Rv1733c
  1  -MTATTFEFFG  ATMITFFIFI  FCFTTIFVF9  FNFIVFGTIF  IFAVVMIIAV  TVSIITTFFA
 61  -AAAGTAVQES  FSEVYAEQAQ  TFEFATATVT  IHEGVTESNT  TATSAFFFTF  ITVFAFWVVN
121  -GTEFSGEVNA  REGTFSGEFV  GTWVISAGQI  VEFFAFFAFA  TAIAAIAAIG  IWISVAAVAG
181  -AIIAITFAII  IFVFNASWQF  IIISIFCTQF
Rv2029c   (EfkE)
  1  -MTFFAAWIEG  FFFIITITMN  FAIITTTSVI  VVFFTFFMFG  GAFFYIFGGG  GINVAFIVHV
 61  -IGGCSTAIFE  AGGSTGSIIM  AIIGIAGVFF  FVIFIAASTF  ESFTVNFSFT  AFQYFFVIFG
121  -FSITVAFQFQ  CIEFIFGAAA  SAAFVVASGS  IFFGVAAIYY  QFVAIIGFFS  STFIIIITSG
181  -GGIQIISSGV  FIIFASVFEI  FFCVGSEIIT  FFFQIAAAEF  IIIFGFAFVV  VVSIGSQGAI
241  -IAIFHASFFF  SSIFMTAVSG  VGAGIAMVAA  ITVGISFGWS  IIFSVFIGNA  AGAAMIITFG
301  -TAACNFIIVF  FFFFIAAFFT  EVGQIQYVWF  FIVNFFASF
Rv2627c
  1  -MASSASEGTE  FFSAFFISFF  VISGAMGEFM  HTGIYVAQSW  FIYIGQQFIF  IFTAFFTIAI
 61  -AAQAFFIEIV  IIGIFAFFFV  SNEFVFEFIS  QEVAAGIEFY  GNFFWIEFES  GEFAQEEEIT
121  -EVAVFFVFIF  FFSFYFTFFE  SGFTFFFGEF  GSQFWISYTA  NNFFYAIIIF  HFFFFFWIVG
181  -VFGTFNGFAF  IIIAVFFAWF  IFIFIGINIV  MFVIFMFGFF  GQGIFFGAVF  FGFIVIEEVF
241  -GTAQAVWIIF  FIISWIFSQF  EESIIGINGI  SIGGYIASIV  ASIFFGIACA  IIGVFVAIII
301  -FIIGFFCGIF  EFIFFFFIVF  MAFFIGFMIS  FISITFIVFM  FGFFIYAGIA  IFIVFFFFQV
361  -TFIWFHWGFF  FTVWYFGGFT  GFFQSFFVFF  FVQAAIFQSG  IIEAFFTQFE  FSA
Rv2628
  1  -MSTQFFFFSG  IFAVGFYAWA  GFCGFIGFWG  VHQFAMMNIA  IWFFFFVQSA  IIYQVTEFSF
 61  -EGFTAFVFGE  FITSTVSGWI  SFIGTQSEIA  EFIAFAVFIG  IWFAAYAIGF  FISVETAVAV
Rv0080
  1  -MSFGSFFASF  QSAFFVVFII  FIFAMFIIAS  VEFGFVVFTF  AAIFAIFFVN  HIVVIGFV1G
 61  -FTFITAFVSV  AVFSSAEAGV  VVAYFAEEIE  FFFFTGWSVV  VTGIATFVSI  FEQVAFYQFI
121  -IFEWVNMAMI  TVVATFFFTV  TGTFIVAISF  TF
Rv1735c
  1  -MGATATTVIA  GAHIVEMAIA  FMATVTSGIV  AGASVVFWAF  GFWITFFIVA  ASTWFHVVFF
 61  -VFIFYFATIW  SVVFFIGMYG  VGAYFIGIAA  EIFIVFSTGF  FFGWVAIAVW  TTTFVAMIHH
121  -IAATTGFSGF  SSFAIGAAII  THAIICFFFF  SFIHQVFAFF  FNQFM
Rv1736c  (NarX)
  1  -VTVTFFTGSF  TFFIIAFSGF  FFTFGFTSAI  IFTVTFFGGF  EGEVFYFEFW  SFEFVVFSTE
 61  -GVNCTGSGSW  FTYVFEETTT  WFTQFTEYFS  VGFEFFEYFF  FGGFFGAAFS  WYTYSFTFVF
121  -FEYAFGVIVE  MYFFAFAFIG  EFVAAWAEIQ  AEFFFFFFYQ  FAFGKGGIVF  VSWAFATFMT
181  -AAAHVHTIST  YGFIFVAGFS  FIFAMSMVSF  AAGSFFVFII  GGVMISFYIW  YAIIFVASFQ
241  -VFGEQTEVEF  SGEWWEVVWQ  CASVIITYFN  SFQIGTAFFI  IAHIEGFAAI  IIGFTVSFIF
301  -FAEFITAATF  YVETFEIFGF  ATIYITYWTA  GITFNFGFFM  IAFAQTYFST  EVAFFFGETF
361  -EFIFVVIFFA  ATVEFEAGFF  IISGYFVFIA  AIQNAITFAA  IFYAFTVAAV  GFTGIMMGFI
421  -  FWIVVFYVIM  TTVAVGSWWF  YFYIFFGWTT  FSSGIYFSFI  IFTASFMFFF  GTIVVIVGFG
481  -  TGIVTFQSWT  QAAGISEGAY  HVQAVVIGST  AGTTTIAGVT  IITYFFFTFG  FVFMATTVNI
541  -  FVMYIVIVAA  TVAGIGATAI  GSGVVGFAYN  YFFTVSVWFF  SVWVIQFFGI  IMAFAFIYYQ
601  -  THVITGIAIF  AIWFFTFIVF  AFSAFIGYIF  FFYTIYFSFF  FIVITFFFFF  GW
Rv1737c    (NarX2)
  1  -  MFGQAANIVI  ATWTSVVNFW  AWNIIGFIST  SYAFIMSISS  AFASIIVATF  IIVGAIGFTV
 61  -  TGFITEFFGG  FAMIIAVTIA  SIIFVIAVGV  AAIMGSYAII  VFFGIFIGVA  GTTFAVGIFF
121  -  ANNWYQFAFF  GFSTGVFGMG  MVGTAISAFF  TFFFVFWFGI  FTTHATVAAA  IASTAVVAMV
181  -  VIFIAFYFFE  NAEEVIFFIB  AAAFIFVTWE  MSFIYATVFG  GFVAFSNYIF  TYTTTIYGFS
241  -  TVEAGAFTAG  FAIAAVIAFF  VGGWISIFIA  FFHVVIASIA  GTAIIAFAAA  IQEEEEVWSA
301  -  ATFTTIAVCI  GVGTGGVFAW  VAFFAFAASV  GSVTGTVAAA  GGIGGYFFFI  VMGATYEFVE
361  -  NEYTVGIIII  VATAIVAGTY  TAIHAFFFVS  EFASF
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Claims (19)

1.一种诱导脊椎动物体内免疫应答分枝杆菌感染的方法，该方法包含给所述脊椎动物施用包含一种或多种多肽源、和其同型物、同系物或其片段的组合物的步骤，所述的多肽选自包括下列结核分枝杆菌休眠调节子(DosR)序列的组：Rv0079、Rv0569、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、Rv2007c、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、Rv3129、Rv3130c、Rv3132c、Rv3133c(DosR)、Rv0080、Rv1737c(NarX)、Rv1735c和Rv1736c(NarK2)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的多肽选自包含Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)的组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的多肽选自包含Rv1733c、Rv2029c和Rv2627c的组。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述的多肽是从TB休眠调节子(DosR)序列Rv1733c、Rv2029c(PfkB)和Rv0080获得的。
5.用于对分枝杆菌感染进行免疫的组合物，包含一种或多种多肽源、和其同型物、同系物或其片段，所述的多肽选自包括下列TB休眠(DosR)调节子序列的组：Rv0079、Rv0569、Rv1733c、Rv1738、Rv1813c、Rv1996、Rv2007c、Rv2029c(PfkB)、Rv2030c、Rv2031c(HspX)、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv3126c、Rv3129、Rv3130c、Rv3132c和Rv3133c(DosR)、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)；并且该组合物任选包含一种佐剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述的多肽选自包含Rv1 733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)的组。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述的多肽选自包含Rv1733c、Rv2029c和Rv2627c的组。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述的多肽是从TB休眠调节子(DosR)序列Rv1733c、Rv2029c(PfkB)和Rv0080获得的。
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的用于免疫的组合物，其中所述的佐剂选自包含polyI：C、CpG、LPS、脂质A和其衍生物、IC31、QS21、脂肽Pam3Cys、细菌鞭毛蛋白、DDA/MPL、DDA/TDB和可溶性LAG3佐剂的组。
10.根据权利要求5-9中任意一项所述的用于免疫的组合物，其中所述的分枝杆菌多肽选自分枝杆菌TB复合种结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌卡介苗、非洲分枝杆菌、M.canetti和田鼠分枝杆菌。
11.根据权利要求5-10中任意一项所述的用于免疫的组合物，其中所述的多肽源是编码所述多肽的重组DNA分子，所述的重组DNA分子任选包含在载体和/或基因组中。
12.根据权利要求5-11中任意一项所述的用于免疫的组合物，其中所述的多肽源存在于重组分枝杆菌中，优选牛分枝杆菌卡介苗(BCG)。
13.根据权利要求5-12中任意一项所述的用于免疫的组合物，其中所述的多肽片段是合成肽，优选长度在18-45个氨基酸间，任意重叠或连接，任选还含有额外的氨基酸、免疫刺激的部分和/或保护基团来增强溶解性和增加体内稳定性。
14.根据权利要求5-13中任意一项所述的用于免疫的组合物，还包含CD40结合分子，所述的CD40结合分子选自抗体或其片段或CD40配体或其变异体。
15.根据权利要求5-14中任意一项所述的用于免疫的组合物，还包含能够刺激4-1BB受体的竞争性抗-4-1BB抗体或其片段。
16.根据权利要求5-15中任意一项所述的用于免疫的组合物，其中所述的组合物还包含非特异于潜伏期的分枝杆菌抗原。
17.诊断受试者分枝杆菌感染的方法，包含以下步骤：
a)使被分离的受试者的体液和/或被分离的白细胞的样品与选自TB休眠调节子编码的蛋白质的组的一个或多个多肽或其片段接触，所述休眠调节子包括：Rv1733c、Rv2029c(PfkB)、Rv2627c、Rv2628、Rv0080、Rv1737c(NarK2)、Rv1735c和Rv1736c(NarX)；和
b)通过抗体与所述指示分枝杆菌感染的多肽或其片段的结合来检测体液免疫应答；和/或
c)通过特异性增殖和/或细胞因子生成和/或细胞外或细胞内活化标记的表达来检测细胞免疫应答。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的多肽选自包括Rv1733c、Rv2029c、Rv2627c、和Rv0080的组。
19.实施权利要求17或18所述的诊断方法的诊断试剂盒，包含一种或多种权利要求1-4中任一项所定义的多肽和对结合于所述多肽的抗体进行检测和定量的试剂。
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