DE102016005550A1

DE102016005550A1 - Adjuvans zur lnduzierung einer zellulären lmmunantwort

Info

Publication number: DE102016005550A1
Application number: DE102016005550.2A
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Wiesmüller; Hans-Georg Rammensee
Original assignee: EMC Microcollections GmbH
Current assignee: RAMMENSEE, HANS-GEORG, PROF. DR., DE
Priority date: 2016-05-09
Filing date: 2016-05-09
Publication date: 2017-11-09

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines wasserlöslichen und unter GMP-Bedingungen herstellbaren synthetischen Lipopeptides als universelles Adjuvans für die Induzierung einer systemischen zellulären Immunantwort. Durch die Konjugation einer speziellen Peptid-Sequenz, wurde ein Pam3Cys-Derivat mit außergewöhnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften erhalten, das sich durch eine besonders gute Handhabbarkeit in wässrigen Lösungen und eine hohe Bioverfügbarkeit auszeichnet. Die erfindungsgemäßen Lipopeptide sind in reproduzierbar hohen Reinheiten darstellbar. Sie weisen eine gute Verträglichkeit auf und eignen sich besonders als Adjuvantien bei der therapeutischen oder prophylaktischen Vakzinierung mit synthetischen und natürlichen Biopolymeren. Erstmals wird eine effektive, durch synthetische Lipopeptide vermittelte und über den Ort der Immunisierung hinaus nachweisbare Aktivierung Antigen-spezifischer Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen in vivo im Menschen erreicht.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines wasserlöslichen und unter GMP-Bedingungen herstellbaren synthetischen Lipopeptides als universelles Adjuvans bei der therapeutischen oder prophylaktischen Vakzinierung mit immunogenen Biopolymeren, insbesondere für die Induzierung einer systemischen zellulären Immunantwort zur Bekämpfung infizierter und entarteter Zellen beim Menschen.
Erstmals wird eine effektive, durch synthetische Lipopeptide vermittelte und über den Ort der Immunisierung hinaus nachweisbare Aktivierung und Stimulation von Antigen-spezifischen Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen in vivo im Menschen erreicht, ohne dass eine Konjugation des Lipopeptides mit den Antigenen vorliegt.
Stand der Technik
Ein Drittel aller jährlichen Todesfälle in der Welt werden noch immer durch Infektionskrankheiten verursacht, die außerdem für wenigstens 15% der Krebsneuerkrankungen verantwortlich sind. Infektionskrankheiten sollen ferner in die Pathophysiologie verschiedener chronischer Krankheiten entzündlicher, vaskulärer oder degenerativer Art verwickelt sein.
Zur Abwehr von Infektionskrankheiten sind Impfungen zur wirksamsten Waffe geworden. Neuere Erkenntnisse legen nahe, dass Vakzinierungen außerdem ein sehr geeignetes Mittel bei der Immuntherapie und Immunprophylaxe gegen Autoimmunkrankheiten, chronische Entzündungen, Tumore und Allergien sind.
Durch die Gabe eines Impfstoffes soll das Immunsystem in der Weise aktiviert werden, dass es bestimmte Antigene, Krankheitserreger sowie krankhaft veränderte Zellen des eigenen Körpers langfristig erkennen und bekämpfen kann.
Diese sogenannte erworbene Immunität umfasst die Bereiche der humoralen und der zellulären Immunantwort. Erstere wird im Wesentlichen durch die B-Lymphozyten getragen, die z. B. Antikörper gegen in den Körperflüssigkeiten identifizierte Fremdstoffe sezernieren. Die zelluläre Immunantwort ist v. a. durch T-Helfer-Zellen (T_H) und cytotoxische T-Zellen (Cytotoxic T Lymphocyte, CTL) charakterisiert. Sie richtet sich gegen infizierte oder entartete Zellen. Die gebildeten Antigen-spezifischen Effektor-Zellen dienen dabei der sofortigen Erkennung und Bekämpfungder Erreger bzw. entarteten Zellen (therapeutische Vakzine). Die Prägung von Gedächtnis-Zellen ermöglicht bei erneuter Konfrontation mit dem Antigen eine schnelle und effektive Immunantwort (prophylaktische Vakzine).
Bei der Lenkung der Immunantwort spielen die dendritischen Zellen eine besondere Rolle. Als professionelle Antigen-präsentierende Zellen besitzen sie spezielle Oberflächenrezeptoren zur Erkennung körperfremder Strukturen. Nach der Phagozytose erkannter Fremdstoffe, wandern sie zu den Lymphknoten oder anderen lymphatischen Zielorganen, wo sie T- und B-Zellen stimulieren, indem sie diesen an ihrer Oberfläche die prozessierten Antigene in Form von MHC-I- und MHC-II-Peptid-Komplexen sowie weitere co-stimulierende Moleküle präsentieren.
Für die Prägung der T_H-Zellen ist die Interaktion mit MHC-II-Molekülen entscheidend. Diese legt den Typ und das Zytokin-Profil der reifen Zelle fest. T_H-1-Zellen sezernieren typischerweise INF-γ, IL-2 und TNF-α für die Unterstützung der zellulären Immunantwort. T_H-2-Zellen stützen dagegen die humorale Abwehr durch die Ausschüttung von IL-4, 5, 6, 10 und 13.
Für die Aktivierung Antigen-spezifischer, naiver CD8⁺ CTL-Zellen sind die MHC-I-Moleküle bestimmend. Hier genügt zunächst der Kontakt mit den Antigen-präsentierenden, reifen dendritischen Zellen, die über ihre Pathogen-mustererkennenden Rezeptoren (Pattern Recognition Receptors, PRRs), wie z. B. Toll-like-Rezeptoren (TLR), aktiviert und damit co-stimulationsfähig wurden. Um jedoch die Bildung von Gedächtnis-Zellen sowie eine vollständige Ausdifferenzierung der aktivierten CTL zu ermöglichen, müssen die dendritischen Zellen außerdem von CD4⁺ T-Helferzellen (T_H-1) aktiviert worden sein. Hierfür scheint eine Interaktion aller drei Zelltypen (dendritische Zellen, CD4⁺ T-Helferzellen und CD8⁺ T-Zellen) einschließlich der von ihnen sezernierten Zytokine zwingend notwendig zu sein.
Auch normale Körperzellen präsentieren auf ihrer Oberfläche Fragmente intrazellulärer Antigene. Dieser MHC-I-Peptid-Komplex wird durch CD8 und den auf das betreffende Antigen geprägten T-Zell-Rezeptor der CTL erkannt. In Verbindung mit weiteren Signale, wie z. B. die Zytokine INF-γ und IL-2, lösen sie die Zerstörung und den Verdau infizierter Zellen aus.
Allgemein anerkannt ist, dass das Immunsystem prinzipiell in der Lage ist, auch entartete Zellen zu erkennen und erfolgreich zu bekämpfen. Demnach präsentieren Tumorzellen aufgrund von Mutationen und Expressionsänderungen ein anderes Antigenspektrum als gesunde Zellen. Zellen mit unterdrücktem MHC-I-Komplex werden von natürlichen Killer-Zellen (NK) erkannt. Präsentieren die Krebszellen dagegen spezifische, Tumor-assoziierte Antigene auf den MHC-I-Molekülen, werden sie durch CTL lysiert. Dieser Mechanismus ist mitverantwortlich für spontane Tumorregressionen und wird als Ansatzpunkt für eine Reihe von Strategien zur Immuntherapie von Krebserkrankungen, beispielsweise bei einem adoptiven T-Zelltransfer (u. a. WO 2015/193 359 ) oder bei der dendritischen Zell-Vakzinierung (u. a. EP 2 050 455 ) ausgenutzt.
Bei der therapeutischen Vakzinierung bekommt der Patient zusätzlich rekombinant hergestellte oder chemisch synthetisierte Tumor-assoziierte Antigene, zumeist Peptide, verabreicht. Damit soll der insbesondere durch eine verminderte Antigen-Präsentation bewirkte Immun-Escape der Tumorzellen aufgehoben werden. Die nun mögliche Prägung einer ausreichenden Anzahl Antigen-spezifischer CTL sollte in einer Tumor-spezifischen Immunantwort resultieren ( DE 10 225 144 ), die idealerweise zum Tod der Tumorzellen führt.
Eine Reihe solcher Immunogene zur spezifischen aktiven Tumor-Vakzinierung befindet sich derzeit in der klinischen Entwicklung (u. a. bei der Firma immatics Biotechnologies und der Arbeitsgruppe um H.-G. Rammensee). Jedoch führte die direkte Injektion der Tumor-assoziierten Peptide bisher nicht zum erwünschten Erfolg.
Aus verschiedenen Gründen (geringe Immunogenität, schlechte Bioverfügbarkeit, mangelnde Stabilität des Impfstoffes, schnelle Ausscheidung, Dosisreduzierungen wegen begrenzter Verfügbarkeit oder erwarteten Nebenwirkungen) wird bei Impfungen, insbesondere mit peptidischen Antigenen, fast nie eine ausreichende Reaktion des Immunsystems erreicht. Außerdem soll zum Erzielen des erwünschten Impferfolges eine möglichst einmalige Applikation ausreichen. Deshalb müssen Hilfsstoffe, sogenannte Adjuvantien, zur Verstärkung der Immunogenität der Impfstoffe eingesetzt werden.
Dies können z. B. Lösevermittler, die Penetration fördernde Substanzen oder Depot-bildende Matrizes sein, die zu einer erhöhten und/oder verlängerten Präsenz der Antigene führen. Andererseits können bestimmte Substanzen die Antigen-spezifische Immunantwort durch eine unspezifische Aktivierung des Immunsystems, insbesondere über die Aktivierung von dendritischen Zellen, steigern. Adjuvantien können auch eingesetzt werden, um die Immunantwort zu lenken, z. B. in Richtung einer zellulären Immunantwort und der bevorzugten Aktivierung von T-Zellen.
Da für den Impferfolg sowohl die Stärke der hervorgerufenen Immunantwort als auch ihre Qualität von Bedeutung ist, spielt das bei der Vakzinierung eingesetzte Adjuvans eine entscheidende Rolle. Eine fehlgelenkte Immunantwort kann zu immunpathologischen Reaktionen und zur Verschlechterung der Infektionssymptome führen. Durch ein geeignetes Adjuvans kann dagegen die gewünschte Immunreaktion unterstützt werden.
Die Verwendung vieler Adjuvantien beruht jedoch allein auf Erfahrungen, wobei die Wirkung weder genau zu erklären noch vorherzusagen ist. Häufig verwendet werden Öl-Wasser-Emulsionen, Detergentien, Aluminium-Salze, Lipopolysaccharide, bakterielle Produkte, Toxine und Zytokine. Weitere bekannte Adjuvantien sind das Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH), das Bacillus Calmette Guérin (BCG) und das Freunds-Adjuvans.
In der aktuellen Impfstoff-Entwicklung kommt den TLR-Liganden eine besonders hohe Bedeutung zu. Als Untergruppe der PRRs binden die TLR der immunkompetenten Zellen an spezifische entwicklungsgeschichtlich konservierte Strukturmotive (Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs), die auf oder in bestimmten Mikroorganismen vorkommen. Bis heute sind 13 verschiedene TLR sowie deren natürliche Liganden bekannt, die jeweils für unterschiedliche Erregertypen sensibilisiert sind. Werden Erreger erkannt, wird durch die Auslösung spezifischer biochemischer Reaktionsketten zunächst die Abwehr durch das angeborene Immunsystem eingeleitet. Die Rekrutierung von dendritischen Zellen, Lymphozyten und Makrophagen, die Induktion co-stimulatorischer Moleküle, insbesondere CD80 und CD86, auf deren Zelloberflächen sowie die Ausschüttung verschiedener Zytokine, führen anschließend zu einer Verstärkung der Antigen-spezifischen adaptiven Immunantwort.
Prinzipiell lösen alle TLR-Liganden durch die Nachahmung der PAMPs adjuvante Effekte aus. Die gezielte Adressierung bestimmter TLR sollte jedoch geeignet sein, die Stimulation der angeborenen Immunantwort und die Reifung des Immunsystems in bestimmte Richtungen zu lenken.
Vor dem Hintergrund, dass TLR 2 als Rezeptor für Zellwandbestandteile grampositiver Bakterien beschrieben wird sowie in Verbindung mit TLR 6 auf Mykoplasmen und Zymosan aus Hefen und Pilzen reagiert, und dass solche Infektionen in der Regel die Zerstörung der befallenen Zellen erfordern, werden TLR 2-Liganden für die Induktion und Unterstützung einer T_H-1-vermittelten zellulären Immunantwort besonders geeignet sein.
Ein vielversprechender Ansatz sind insbesondere synthetische Lipopeptide, die in Anlehnung an das charakteristische Strukturmerkmal bakterieller Lipoproteine, ein durch zwei oder drei Fettsäuren acyliertes N-terminales Dihydroxypropylcystein (Dhc), entwickelt wurden (im Rest der Beschreibung als Lipopeptide bezeichnet).
In zahlreichen in vitro Struktur-Aktivitäts-Studien mit humanen und tierischen Zellen, wurde die TLR aktivierende Wirkung dieser Lipopeptide untersucht. Nach den aktuellen Erkenntnissen kann man zusammenfassen, dass diacylierte Lipoproteine und Lipopeptide durch TLR 6/TLR 2-Komplexe erkannt werden, während triacylierte Lipoproteine und Lipopeptide TLR 1/TLR 2-Komplexe aktivieren (Reitermann 1989, Takeuchi 2001, Takeuchi 2002, Omueti 2005, Buwitt-Beckmann 2005b). In besonderen Fällen werden diacylierte und triacylierte Lipopeptide auch von beiden Heterodimeren erkannt (Omueti 2005, Buwitt-Beckmann 2006).
Neben der Anzahl der Fettsäuren spielen auch deren Länge sowie die Aminosäure-Sequenz eine bedeutende Rolle für die Ligand-Rezeptor-Interaktion (Buwitt-Beckmann 2005a, Omueti 2005). Z. B. erfordern Spezies-abhängige Strukturen für die Aktivierung der humanen Rezeptor-Komplexe Fettsäuren mit Kettenlängen von mehr als 14 C-Atomen (Grabiec 2004).
Die Aktivierung der TLR 6/TLR 2- und TLR 1/TLR 2-Komplexe führt über eine intrazelluläre biochemische Signalkaskade zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, der daraufhin in den Zellkern transloziert und dort die Expression von Genen für die spezifische, im Zusammenspiel von angeborener und erworbener Immunantwort erfolgende, Abwehr der Erreger auslöst.
Das Muster der exprimierten Zytokine entspricht dabei eher dem für die Ausdifferenzierung der T_H-1-Lymphozyten notwendigen Spektrum. Während IL-1 als entzündungsfördernder Signalstoff und E-Selectin als Rezeptor die Einwanderung von Leukozyten in das Gewebe unterstützen, regelt TNF-α die Aktivität verschiedener Immunzellen bei lokalen und systemischen Entzündungen. IL-12 besitzt eine zentrale Funktion bei der Auslösung einer T-Zell-basierten Immunantwort.
Schon früh wurde ein immunpotenzierender Effekt für synthetische Lipopeptide, die von einem E. coli Membranprotein abgeleitet sind, postuliert ( EP 0 000 330 , EP 0 014 815 ) und vorgeschlagen, diese Verbindungen als Adjuvantien für unterschiedliche immunologische Anwendungen einzusetzen, ohne dass zu diesem Zeitpunkt schon der TLR 2-bezogene Mechanismus bekannt war oder belastbare experimentelle Ergebnisse vorlagen. In EP 0 114 787 wurde beschrieben, dass es mit einer Gruppe besonders aktiver triacylierter Lipopeptide, die eine spezifische Aminosäuresequenz aufweisen, gelang, Nager-Alveolar-Makrophagen in vitro zu aktivieren, sodass diese Tumorzellen abtöten können. Außerdem konnte die Antikörper-Produktion wesentlich gesteigert werden.
Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurden bereits verschiedene Medikamente und Impfstoffe für immunmodulatorische Therapien entwickelt, die acylierte Lipopeptide als Adjuvantien enthalten. Typischerweise werden hierzu die Lipopeptide, bevorzugt Pam₃Cys- und Pam₂Cys-Derivate als TLR 2 targetierende Substanz, mit einer antigenen Komponente für B-Lymphozyten oder für cytotoxische T-Zellen kovalent verknüpft und mit weiteren Hilfsstoffen versetzt, um synergistische Effekte zu induzieren ( WO 2007/103 322 , WO 2006/104 389 , US 7,387,271 ).
Auch die Formulierung als Liposomen, die Lipopeptide, bevorzugt Pam₃Cys, neben Antigenen und gegebenenfalls Zytostatika enthalten, werden für die Behandlung von verschiedenen Erkrankungen und Allergien beansprucht ( WO 2005/063 201 , WO 2005/063 288 ).
Jedoch ging man lange Zeit davon aus, dass die Antigene kovalent mit dem Lipopeptid konjugiert sein sollten, um sie über die Lipidketten an der Zelloberfläche immunkompetenter Zellen fixieren und damit gezielt präsentieren zu können ( EP 0 210 412 , US 6,074,650 ). Auch später wurde zumindest eine durch stabile physikalische Wechselwirkungen bewirkte, räumliche Koordination von Antigenen und Lipopeptid als notwendig erachtet, um die Antigen-spezifischen Effektor-T-Zellen effektiv zu prägen ( WO 2012/146 364 ).
So wurden in WO 2007/078 879 eine Kombination aus einem Membran-Protein des Influenza-Virus und einem Pam₃Cys-Derivat, in WO 2007/079 448 ein lineares Tandem-Molekül aus einem B-Zell-Epitop, einem T-Zell-Epitop und Pam₃Cys oder in WO 2004/014 956 und WO 2004/014 957 ein Molekül aus einem B-Zell- bzw. CTL-Epitop und einem T-Helfer-Zell-Epitop, die durch ein Pam₃Cys-Lipopeptid miteinander verbrückt sind, als Impfstoffe beschrieben.
Bezüglich der Stimulation einer zellbasierten Immunantwort durch ein Influenza-Nukleoprotein konnte in in vivo Untersuchungen bei Mäusen gezeigt werden, dass das Lipopeptid Pam₃Cys-SS erst nach der Konjugation mit den viralen Peptiden eine strenge adjuvante Wirkung hat (Deres 1989, Schild 1991). Demgegenüber konnten Hioe et al. (1996) bei der in vivo Immunisierung von Mäusen zeigen, dass eine Mischung eines Epitops aus dem Malaria-Erreger P. bergheicircumsporozoite mit dem stark polaren Pam₃Cys-SK₄ einen gleich guten CTL-stimulierenden Effekt hat, wie das Konjugat. Dies weist auf einen entscheidenden Einfluss der Eigenschaften der gekoppelten Aminosäure-Sequenz und der Formulierung auf die Intensität und Ausrichtung der Immunantwort hin.
Die reproduzierbare Herstellung und Aufreinigung von Lipopeptiden stellt unter GMP-Bedingungen eine große Herausforderung dar. In der Regel sind kovalente Konjugate aufgrund ihrer amphiphilen Struktur nur schwer handhabbar. Auch müssen für die Formulierung des Impfstoffes oftmals DMSO und ähnliche Löslichkeitsvermittler eingesetzt werden, die für eine pharmakologische Anwendung ungeeignet sind.
Zudem wurde festgestellt, dass die nach subkutaner Injektion gebildeten aktivierten T-Zellen bei Mäusen überwiegend in den Granuloma verbleiben. Auch die weniger hydrophoben Pam₂Cys-Konjugate, wie z. B. das in EP 1 490 106 als mukosales Adjuvans beschriebene MALP-2, führen aufgrund der begrenzten Löslichkeit zu einer differenzierten lokalen Wirkung.
Deshalb wurden die bisher beschriebenen Untersuchungen mit Pam₃Cys- und Pam₂Cys-Derivaten überwiegend in Zellkulturen oder mit Mäusen durchgeführt. Studien mit Lipopeptiden am Menschen konnten bisher nur in einem Fall durchgeführt werden. Bei dieser Phase I-Studie wurde ein synthetischer Lipopeptid-Impfstoff eingesetzt, der mit vielen polaren Lysin-Resten verknüpft war, um die Löslichkeit des Wirkstoffes zu gewährleisten (Seth 2000). Jedoch konnten in dieser Pilotstudie keine vorteilhaften Einflüsse auf die CTL-vermittelte Lyse von HIV-infizierten Zellen nachgewiesen werden.
Die meisten in vitro Studien zu Antigen-unabhängigen synthetischen Lipopeptiden bewerten deren immunmodulatorische Effekte anhand der bei der Inkubation von immunkompetenten Zellen ausgeschütteten Menge des Interleukins IL-8. Dieses Zytokin ist als Entzündungsmediator in die chemotaktische Rekrutierung von Leukozyten und insbesondere neutrophilen Granulozyten involviert. Damit zeigt dieser Parameter lediglich, dass das Lipopeptid eine Aktivierung des Immunsystems in Gang gesetzt hat. Über die Art der induzierten Immunantwort kann in diesem Stadium keine Aussage getroffen werden. Andere in vitro durchgeführte Untersuchungen schließen die Proliferationsrate von Immunzellen als wichtiges Kriterium mit ein, ohne jedoch ihre Antigen-spezifische Effektivität bei der Lyse infizierter Zellen zur betrachten (Farhat 2010).
In vivo Studien mit Allel-spezifischen Epitopen und in Verbindung mit einem freien Lipopeptid-Adjuvans zur Induktion der zellulären Immunantwort, sind aufgrund der beschriebenen Probleme, für humane Probanden bisher nicht beschrieben worden.
Auch im Zusammenhang mit der Tumor-Therapie werden Lipopeptide eingesetzt. EP 2 050 455 beansprucht die sequentielle Verwendung eines TLR 2 bindenden Lipopeptides und von LPS zur ex vivo Reifung von dendritischen Zellen. In WO 2015/070 031 wird der Effekt einer gleichzeitigen Applikation von TLR 2/TLR6-Agonisten und INF-γ auf die T-Zell-Migration beschrieben. Eine erfolgreiche direkte in vivo Applikation von Lipopeptiden für die Tumor-Vakzinierung ist jedoch bisher ebenfalls nicht publiziert worden.
Trotz intensiver Bemühungen sind derzeit praktisch keine hinlänglich wirksamen und gleichzeitig gut verträglichen Adjuvantien verfügbar. Während zahlreiche Kandidaten für die Entwicklung neuer Impfstoffe getestet werden, sind in Europa bisher nur fünf Adjuvantien, jeweils in Verbindung mit einem spezifischen Impfstoff, für humane Applikationen zugelassen. Bedenken und Komplikationen hinsichtlich der Verträglichkeit sowie der Auslösung von Allergien und Autoimmunkrankheiten, haben zwischenzeitlich zu einer hohen Zulassungsschwelle für neue Adjuvantien geführt.
Übersichten über derzeit entwickelte Adjuvantien sind in zahlreichen Publikationen ersichtlich (Rappuoli 2011, Montomoli 2011, Lee 2015). Zudem wurde von der University of Michigan eine Datenbank bereitgestellt, die Informationen zu mehr als 100 Adjuvantien enthält, die bei der Herstellung und Entwicklung von mehr als 380 Impfstoffen angewandt werden (Sayers 2012).
Technische Aufgabe
Ausgehend vom Stand der Technik und den aktuellen Trends in der Impfstoff-Entwicklung, besteht immer noch ein dringender Bedarf nach neuen verträglichen und effektiven Adjuvantien, insbesondere für humane Applikationen.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, auf der Basis der bisherigen Erfahrungen mit synthetischen Lipopeptiden, hochwirksame und universell einsetzbare Adjuvantien für die Anwendung am Menschen zu entwickeln, die aufgrund ihrer TLR 2-Affinität insbesondere für die Induzierung einer zellulären Immunantwort bei der therapeutischen oder prophylaktischen Vakzinierung unter Zusatz von funktionellen Epitopen einsetzbar sind. Optimale physikalisch-chemische Eigenschaften der Adjuvantien, sollten die einfache Herstellung, Formulierung und Applikation der Impfstoffe ermöglichen. Zudem sollte sich die bisher erforderliche Konjugation der Lipopeptide mit den Antigenen erübrigen, um ein breites Anwendungsspektrum hinsichtlich der medizinischen Indikationen sowie eine größtmögliche Unabhängigkeit von den angestrebten Applikationswegen zu erreichen. Insbesondere für eine personalisierte Anwendung von Patienten-spezifischen Antigenen ist die Unabhängigkeit von Antigen und Adjuvans unerlässlich.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Identifizierung einer Auswahl von dreifach acylierten Dihydroxypropylcysteinyl-Peptiden mit hohem adjuvantem Potential, wie sie in Anspruch 1 offenbart sind, und die aufgrund einer spezifischen Ladungsverteilung und Polarität der Aminosäure-Bausteine eine außergewöhnlich gute Löslichkeit in wässrigen Medien aufweisen. Die Ansprüche 2 bis 6 betreffen bevorzugte Ausführungsformen dieser Lipopeptide, während die Ansprüche 7 und 8 verschiedene Antigen-Typen auflisten, deren Wirkung von der Beimischung der erfindungsgemäßen Lipopeptid-Adjuvantien unterstützt wird. Die Formulierung und Anwendung der erfindungsgemäßen Lipopeptide, in unterschiedlichen Kombinationen mit anderen Impfstoff-Komponenten, ist Gegenstand der Ansprüche 9 bis 11. Vorteilhafte medizinische Indikationen sowie entsprechende pharmazeutische Präparate und Kits umfassen die Ansprüche 12 bis 16.
Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche sowie der Inhalt der zitierten Literaturstellen werden hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Detaillierte Beschreibung
In zahlreichen Untersuchungen mit synthetischen Lipopeptiden konnte gezeigt werden, dass Pam₃Cys-Derivate häufig eine starke Aktivierung des TLR 2-Rezeptors hervorrufen und diese entscheidend von dem gekoppelten Peptid abhängt. Diese Beobachtung legt nahe, dass die Bioverfügbarkeit dieser Verbindungen durch deren Lipophilie stark eingeschränkt ist. Zudem führten spezielle Anforderungen bei der Handhabung dieser Verbindungen oftmals zu schwankenden und von den individuellen Versuchsbedingungen abhängigen Ergebnissen.
Deshalb sollte zum einen die Entkopplung des Lipopeptides von den Peptid-Antigenen vorgenommen werden. Zum anderen wurde in umfassenden Struktur-Aktivitäts-Studien untersucht, wie durch die Modifizierung sowohl der Art und Anzahl der Fettsäure-Ketten als auch durch die Konjugation polarer Aminosäure-Sequenzen, die Wasserlöslichkeit der Lipopeptide bei gleichzeitiger Erhaltung einer effektiven TLR 2-Bindung verbessert werden kann.
Im Ergebnis zeigte sich, dass auch vom Antigen unabhängige Pam₂Cys und Pam₃Cys-Derivate immunstimulierende Effekte auslösen können. Jedoch verursachten viele Pam₂Cys-Derivate Nebenwirkungen. Einige Pam₃Cys-Derivate, wie z. B. das Pam₃Cys-SK₄, weisen zwar eine gute Wasserlöslichkeit auf, führten aber aufgrund des hohen Überschusses positiver Ladungen und des dadurch bedingten Detergens-Charakters der Verbindung, zu zelltoxischen Effekten.
Deshalb wurde der Schwerpunkt der weiteren Struktur-Aktivitäts-Studien auf Pam₃Cys-Lipopeptide mit längeren, in der Ladungsbilanz ausgeglichenen Aminosäuresequenzen, gelegt.
Unter zahlreichen, auf ihre physikalisch-chemischen und immunologischen Eigenschaften getesteten Lipopeptiden, konnte überraschenderweise die Verbindung (II) identifiziert werden, die neben einer sehr effizienten Immunstimulation eine ausgesprochen gute Wasserlöslichkeit aufweist.
Weitergehende Untersuchungen zeigten, dass das entscheidende Merkmal dieser Verbindung die spezielle Aminosäure-Sequenz ist. Durch eine ausgewogene Bilanz und Verteilung von geladenen, polaren und unpolaren Aminosäuren, konnte eine optimale Balance zwischen der für eine gute Bioverfügbarkeit und Handhabbarkeit wichtigen Löslichkeit in wässrigen Medien und den lipophilen Eigenschaften der Anker-Ketten für eine effektive Wechselwirkung mit dem TLR 2-Rezeptor erzielt werden.
Trotz der amphiphilen Struktur des Gesamtmoleküls, konnten die sonst bei triacylierten Lipopeptiden auftretenden Detergens- und Agglomerations-Effekte bei der Verbindung (II) nicht beobachtet werden. Bei der chromatographischen Aufreinigung wurde das identifizierte Lipopeptid, aufgrund seiner außergewöhnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften, in sonst für Lipopeptide unerreicht hohen Ausbeuten und in sehr hohen Reinheiten erhalten. Diese außergewöhnlichen Eigenschaften waren für Lipopeptide völlig unerwartet und konnten aus dem Stand der Technik nicht abgeleitet werden.
Schon in EP 1 490 106 wird vermutet, dass die carboxy-terminale Peptidkette vor allem eine die Hydrophilizität und Lipophilizität das Lipopeptides steuernde oder gegebenenfalls modifizierende Funktion hat. Auch aus den von Spohn et al. (2004) publizierten Untersuchungen wurde eine solche Hypothese abgeleitet. Somit müssen viele der früheren Untersuchungen, die einen entscheidenden Einfluss der Aminosäure-Sequenz postulieren, unter diesem Gesichtspunkt neu bewertet werden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung sollten generell alle Peptid- oder Proteinketten für die Herstellung von Pam₃Cys-basierten Lipopeptiden mit adjuvanter Wirkung geeignet sein. Für eine gute Handhabbarkeit der Lipopeptid-Adjuvantien und ihre GMP-konforme Herstellung, sollten die Peptide jedoch dieselben außergewöhnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweisen, wie das in dem von uns identifizierten Lipopeptid nach der Strukturformel (II) enthaltene Peptid. Damit wird der Strukturraum der für die erfindungsgemäße Verwendung als Adjuvantien in humanen Impfstoffen in Frage kommenden Verbindungen stark eingeschränkt.
Es ist dem Fachmann leicht verständlich, dass weitere Peptide die genannten spezifischen Eigenschaften aufweisen können. So wurde in unseren Untersuchungen bestätigt, dass punktuelle Modifikationen der Aminosäure-Sequenzen möglich sind, solange die charakteristischen Strukturmerkmale der resultierenden Peptide, insbesondere die Ladungsbilanz und -verteilung, erhalten bleiben. Das betrifft insbesondere die folgenden Modifikationen:

• konservativer Austausch, Einfügen oder Auslassen einzelner Aminosäuren,
• Verlängerung oder Verkürzung um einzelne Aminosäuren,
• Austausch aller oder einzelner L-Aminosäuren durch die entsprechenden D-Aminosäuren,
• Austausch einzelner Aminosäuren durch ähnliche Bausteine, wie z. B. Hydroxysäuren,
• Konjugation der terminalen Carboxy-Gruppe mit kleinen Molekülen, oder
• eine beliebige Kombination daraus.

Dabei umfasst der Begriff „konservativer Austausch” den Ersatz einer Aminosäure durch eine mit ähnlichen Seitenkettenfunktionalitäten ausgestattete Aminosäure innerhalb der Gruppen:

a) kleine aliphatische, unpolare oder wenig polare Seitenketten (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly),
b) polare, negativ geladene Seitenketten und deren Amide (Asp, Asn, Glu, Gln),
c) polare, positiv geladene Seitenketten (His, Arg, Lys),
d) große aliphatische, unpolare Seitenketten (Met, Leu, Ile, Val, Cys),
e) große aromatische Seitenketten (Phe, Tyr, Trp).

Für die Modifizierung der terminalen Carboxy-Gruppe sind v. a. die Amidierung oder die Veresterung mit einem aliphatischen Alkohol mit 1-3 C-Atomen vorteilhaft.
Darüber hinaus können solche Substitutionen auch nicht natürliche Aminosäuren, wie D-Aminosäuren oder Aminosäuren mit ungewöhnlichen Seitenketten, jedoch ähnlicher Polarität und Größe, einschließen.
Aus diesen Erkenntnissen und einigen ergänzenden Studien, wurden die charakteristischen Strukturmerkmale und Eigenschaften für die von der Erfindung umfassten und als Adjuvantien verwendbaren Lipopeptide, und insbesondere für den Aufbau des Peptides, abgeleitet.
Die erfindungsgemäßen Lipopeptide sind demnach charakterisiert durch die folgenden Struktur:
wobei
R1, R2 und R3, die gleich oder voneinander verschieden sein können, für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 14 bis 18 C-Atomen, und
R4 für ein aus 8 bis 11 Aminosäure-Resten bestehendes, physiologisch verträgliches und in der behandelten Spezies nicht per se immunogenes Peptid, das

• einen Anteil von mehr als 30% geladenen, von weniger als 35% unpolaren sowie weitere polare Seitenketten enthält, wobei die unpolaren Seitenketten einzeln und gleichmäßig über die Sequenz verteilt sind,
• bei pH 7 eine nahezu ausgeglichene Ladungsbilanz von ±1 aufweist, und
• in freier, veresterter oder amidierter Form, bevorzugt mit freiem C-Terminus, vorliegt,

Hierbei, wie auch im Rest der Beschreibung, steht der Terminus „Aminosäure” vorzugsweise für natürliche Aminosäuren. Jedoch werden auch nicht natürliche Aminosäuren, wie z. B. β- oder γ-Aminosäuren oder solche mit ungewöhnlichen Seitenketten, eingeschlossen.
Die Steuerung der Bioabbaubarkeit durch den gezielten Einbau von D-Aminosäuren, den Einbau ähnlicher Bausteine, die zur Bildung ungewöhnlicher Peptid-Bindungen, wie z. B. Ester-Bindungen führen, oder die Modifizierung des C-Terminus, ist ein weiteres wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung.
Eingeschlossen in diese Definition sind außerdem die entsprechenden

• pharmazeutisch akzeptablen Salze,
• Tautomere und beliebigen Tautomeren-Gemische,
• Stereoisomere und beliebigen Stereoisomeren-Gemische, sowie
• Prodrug-Ester und Prodrug-Peptide der erfindungsgemäßen Lipopeptide.

Bevorzugte Ausführungsformen werden in den Unteransprüchen sowie in den Ausführungsbeispielen beschrieben.
Die hohe immunstimulatorische Aktivität der identifizierten Lipopeptide veranlasste uns, das Potential der Verbindungen für die erfindungsgemäße Verwendung als universelles Adjuvans, insbesondere für die Vakzinierung mit Peptid-Impfstoffen, zu untersuchen. Aufgrund der bekannten Defizite in der Übertragbarkeit der Ergebnisse von immunologischen Studien mit transfizierten Zellkulturen, Mäusen oder anderen Tierspezies auf den Menschen, wurde ein Selbstversuch eines freiwilligen Probanden durchgeführt.
Für diese Studie wurde das mit der Struktur (II) beschriebene Lipopeptid Pam₃Cys-GDPKHPKSF mit den bei uns etablierten Methoden und unter GMP-ähnlichen Bedingungen in sehr hoher Reinheit hergestellt. Als Modell-Antigene für die personalisierten Multi-Peptid-Vakzine, haben wir funktionelle Epitope viraler Proteine ausgewählt, da bei der Krebs-Vakzinierung, wie bereits in DE 10 225 144 beschrieben, MHC-bindende Tumor-assoziierte synthetische Peptide mit oder ohne Zusatz von Adjuvantien zum Einsatz kommen sollen.
Nach einem epikutanen Verträglichkeitstest mit verschiedenen Anfangsdosen, wurde die Immunisierung durch subkutane Injektion einer Emulsion aus drei synthetischen viralen Peptiden, dem erfindungsgemäßen Lipopeptid und Montanide ISA51 als Depot vorgenommen. Die Dosis wurde dabei anhand der bisher gemachten Erfahrungen bei der Immunstimulation in humanen Zellkulturen und Tierversuchen festgelegt.
Das sich an der Injektionsstelle erwartungsgemäß bildende Granulom wurde umfassend phänomenologisch, histologisch sowie bezüglich der induzierten Genexpression beschrieben. Zudem wurden klinische Symptome aufgenommen sowie der Immunstatus, insbesondere bezüglich Antigen-spezifischer T-Zellen im Blut und im Granulom-Gewebe bestimmt. Nach der Vakzinierung entnommene Blut- und Gewebezellen wurden erneut mit den Peptiden konfrontiert und die Aktivität der T-Zellen über die Ausschüttung von INF-γ bewertet.
Es konnte gezeigt werden, dass das Granulom eine lang anhaltende hohe metabolische Aktivität aufweist. Die Analysen der mononukleären Zellen aus dem Blut (PBMC) zeigten, ganz überraschend, 4 Wochen nach der einmaligen Injektion, eine starke Aktivität Vakzinantigen-spezifischer CD8- und CD4-positiver T-Zellen, die nach 6 Wochen in gleicher Intensität bestätigt werden konnte. Im Gewebe des Granuloms wurden ebenfalls Antigen-spezifische hoch-aktivierte T-Zellen nachgewiesen, und zwar überwiegend T-Helfer- und CTL-Effektor-Gedächtnis-Zellen. Die Gesamtzahl der funktionellen Antigen-spezifischen T-Zellen war sowohl im Granulom als auch im peripheren Blut ungewöhnlich hoch.
Besonders hervorzuheben ist die systemische zelluläre Immunantwort und das Ausbleiben unerwünschter Nebeneffekte. Frühere Beschreibungen von durch subkutane Injektion induzierten Granuloma beim Menschen, bei denen die Peptid-Impfstoffe mit einem schwachen Adjuvans und ebenfalls in einem Öl-in-Wasser-Depot kombiniert wurden, weisen auf eine weitgehend lokale Beschränkung der Antigen-spezifischen T-Zellen auf den Ort der Injektion hin. Dies bestärkt die Hypothese, dass das erfindungsgemäße Lipopeptid, gerade aufgrund seiner vortrefflichen Biokompatibilität, als hocheffizientes Adjuvans für die Erzeugung einer nachhaltigen systemischen T-Zell-basierten Immunantwort geeignet ist.
Erstmals konnte gezeigt werden, dass eine solche Immunreaktion unabhängig von einer Konjugation mit den Antigenen ausgelöst werden konnte. Zudem wird aufgrund der guten Bioverfügbarkeit der erfindungsgemäßen Lipopeptide erwartet, dass ihre Wirkung weitgehend unabhängig von der Applikationsroute ist.
Diese in ihrer Klarheit und Stärke überraschenden Erkenntnisse über die erstmals in dieser Form beim Menschen bei der Immunisierung mit T-Zell-Epitopen beobachtete herausragende adjuvante Aktivität des erfindungsgemäßen Lipopeptides, erschließen ein neues Kapitel der Impfstoff-Entwicklung. Verallgemeinernd kann davon ausgegangen werden, dass die von uns identifizierten Lipopeptide hervorragend als universelle und von den Antigenen sowie einer Assoziation mit ihnen unabhängige Adjuvantien für eine Vielzahl von therapeutischen und prophylaktischen Impfstoffen in der humanen Anwendung geeignet sind. Insbesondere für die Krebs-Vakzinierung mit Tumor-assoziierten sowie Tumor-spezifischen Peptiden, wird ein deutlicher Entwicklungssprung erwartet.
Die durchgeführten Untersuchungen und die erzielten Ergebnisse des Selbstversuches sind in Beispiel B ausführlich dargestellt.
Die biomedizinischen Untersuchungen in Rahmen der Erfindung haben ergeben, dass bereits die racemische Mischung der erfindungsgemäßen Lipopeptide ausgeprägte adjuvante Effekte, insbesondere bei der Ausprägung einer systemischen zellulären Immunantwort, aufweisen. Erfahrungsgemäß weist das das RR-Stereoisomer des Dhc enthaltende Lipopeptid die höchste immunstimulatorische Aktivität auf (Takeuchi 2000, Spohn 2004, US 6,074,650 ). Auch bei natürlichen Lipoproteinen wurde bevorzugt das RR-Stereoisomer nachgewiesen. Somit ist zu erwarten, dass ein Isomeren-reines Pam₃-RR-Dhc-GDPKHPKSF einen deutlich verstärkten adjuvanten Effekt haben wird.
Besonders wirksam sind die erfindungsgemäßen Lipopeptide bei der Unterstützung von Impfstoffen, die Mischungen funktioneller Epitope von mikrobiellen Proteinen oder von Tumor-assoziierten bzw. Tumor-spezifischen Peptiden enthalten. Jedoch wird erwartet, dass auch für Impfstoffe, bei denen die Antigene in Form von Proteinen, DNA, RNA, Polysacchariden, Glykolipiden, Glykoproteinen, Tumor-Lysaten oder Erreger-Mixturen vorliegen, von den immunmodulatorischen Verstärkungseffekten der erfindungsgemäßen Lipopeptide unterstützt werden.
Das Wirkspektrum der erfindungsgemäßen Lipopeptide umfasst aufgrund des unspezifischen Immunisierungsansatzes über die TLR 1/TLR 2-Rezeptor-Komplexe die gesamte Breite der mikrobiell verursachten Infektionen. Insbesondere die Zerstörung von mit Viren, Bakterien, Pilzen oder Parasiten infizierten Zellen wird von einer effektiven zellulären Immunantwort profitieren.
Bei den Krebsvakzinen kann, in einem personalisierten Ansatz, die Erkennung und Präsentation Tumor-assoziierter Peptide verstärkt und damit die individual-therapeutische Zerstörung entarteter Zellen ausgelöst werden. Durch die Potenzierung der Wirkung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren wird das Immunsystem eines Krebspatienten in die Lage versetzt, die Tumor-Zellen noch besser zu erkennen und zu bekämpfen.
Auch die Behandlung anderer mit einer verstärkten Proliferation entarteter Zellen verbundener Erkrankungen, wie z. B. Autoimmun-Krankheiten, Entzündungen und Allergien, oder die allgemeine Immunstimulation bei immunologischen Defekten und Zuständen, sind erfolgversprechende Anwendungsfelder für die erfindungsgemäßen Lipopeptide.
Die erfindungsgemäßen Lipopeptide werden insbesondere synthetisch erhalten, können aber auch rekombinant hergestellt werden. Methoden für ihre Herstellung wurden hinreichend publiziert (Metzger 1991, EP 0519327 ).
Ein möglicher Weg ist die in Beispiel A beschriebene konvergente Synthese, bei der die ungewöhnliche Aminosäure Nαα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-Dhc-OH) mit einem Seitenketten-geschützten Peptid verknüpft und diese Vorstufe nachfolgend acyliert wird. In ähnlicher Weise kann ein bereits mit Fettsäuren modifiziertes Fmoc-Dhc-OH als Baustein zur konvergenten Synthese eingesetzt werden. Für die Herstellung eines stereochemisch definierten Derivates muss bei der Dhc-Synthese statt des racemischen Bausteins RS-2,3-Epoxy-1-propanol das entsprechende Enantiomer verwendet werden.
Die Aufreinigung der Zielverbindung kann aufgrund der außergewöhnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipopeptide mit chromatographischen Methoden erfolgen.
Anschließend werden die im Herstellungsprozess gebildeten TFA-Salze in verträglichere Formen, wie z. B. Hydrochloride oder Acetate bzw. die entsprechenden Säure-Additionssalze oder Salze von sauren und basischen Aminosäuren, umgewandelt.
Die erfindungsgemäßen Lipopeptide können auch als Prodrug-Verbindungen bereitgestellt werden, die durch die Modifizierung der Aminosäure-Sequenz zunächst inaktiv sind, jedoch in vivo durch metabolische Umwandlung in pharmakologisch aktive Moleküle überführt werden. So kann eine in der aktiven Verbindung vorhandene Hydroxy-Gruppe in Form eines Esters, ein Amin als Amid oder eine Carboxy-Gruppe als Ester oder Amid vorliegen. Auch eine Verlängerung des Peptides durch eine mit einem enzymatisch spaltbaren Linker gekoppelte Sequenz kommt in Betracht, um z. B. durch die Konjugation zellpenetrierender Peptide die Bioverfügbarkeit der Lipopeptide weiter zu verbessern.
Für die Sterilisation der erfindungsgemäßen Lipopeptide können die allgemein bekannten Methoden angewandt werden. Unter Berücksichtigung der Struktur-Stabilität des Peptides, wird die Sterilisation durch Filtration, durch Elektronenstrahlen oder mit radiochemischen Methoden besonders bevorzugt.
Unter sterilen Bedingungen sind Lösungen der erfindungsgemäßen Lipopeptide bei 4°C mindestens einen Monat stabil, vorausgesetzt, dass danach eine gute, durch Ultraschall unterstützte Durchmischung vorgenommen wird. Bevorzugt erfolgt die Lagerung jedoch als Lyophilisat, das bei Raumtemperatur über mehrere Jahre stabil ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Formulierung der erfindungsgemäßen Lipopeptide zur Herstellung pharmazeutischer Präparate für die Vakzinierung von Menschen. Je nach Anwendung sind hierbei verschiedenste Ausführungsformen vorgesehen.
Bevorzugt wird das Lipopeptid-Adjuvans als freie Verbindung eingesetzt. In bestimmten Fällen kann jedoch auch eine Konjugation oder räumliche Koordination mit den Antigenen durch kovalente Kopplung, physikalische Wechselwirkungen oder Assoziation an einem gemeinsamen Träger vorteilhaft sein. Auch die Konjugation mit verschiedenen biologischen Trägermolekülen oder physikalischen Trägermaterialien und -partikeln ist denkbar.
Zum anderen kann das Adjuvans in einer Zubereitung mit den aktiven Vakzinierungskomponenten, z. B. Antigenen, formuliert sein oder als Komponente eines Kits für die Co-Applikation mit einem Vakzin vorliegen. Dabei können alle Zubereitungen weitere Komponenten, wie z. B. weitere Adjuvantien, pharmazeutische Wirkstoffe, Antikörper sowie Träger, Hilfs- und Zusatzstoffe, insbesondere Konservierungsstoffe und Stabilisatoren, enthalten.
Pharmazeutisch geeignete Materialien sind die im Bereich der Pharmazie und Lebensmitteltechnologie sowie in angrenzenden Gebieten zugelassenen Stoffe, insbesondere die in den einschlägigen Arzneibüchern gelisteten, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen. Die Herstellung der pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach dem Fachmann bekannten Verfahren.
Für die Vakzinierung eingesetzt werden können beispielsweise Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate oder Pulver für die orale Applikation; Pflaster, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Pasten, Salben, Gele, Cremes, Lotionen oder Puder für die topische und transdermale Applikation; Sprays, Suspensionen, Lösungen, Suppositorien oder Pflaster für die mukosale Applikation; oder Injektabilia für die subkutane, intramuskuläre und intraperitoneale Applikation sowie für die Verabreichung in Blut, Lymphe oder direkt in das infizierte Gewebe. Bevorzugt ist die subkutane oder intramuskuläre Injektion einer alle Impfstoff-Komponenten enthaltenden isotonischen Kochsalzlösung, bei subkutaner Injektion wahlweise auch in einer Öl-Wasser-Emulsion als Depot.
Die Erfindung betrifft auch Anwendungsschemata für die Immunisierung von Menschen, bei denen die erfindungsgemäßen Lipopeptide allein oder in unmittelbarem Zusammenhang mit Komponenten der Vakzine und/oder weiteren pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, Antikörpern, Antigenen, Adjuvantien, Trägern, Hilfs- und Zusatzstoffen bzw. entsprechenden Zubereitungen verabreicht werden. Auch die Applikation verschiedener Vakzine oder von Vakzin-Teilen sowie die mehrmalige Medikamentation entsprechen dem Gegenstand der Erfindung. Die zeitliche Abfolge der einzelnen Schritte ist dabei nicht eingeschränkt.
Die Applikation der Vakzinkomponenten und erfindungsgemäßen Lipopeptide kann lokal oder systemisch, in der gleichen oder in verschiedenen Körperregionen, insbesondere:

a) in einer Zubereitung,
b) in getrennten Zubereitungen, zeitgleich, unter Nutzung der gleichen Applikationsform,
c) in getrennten Zubereitungen, zeitgleich, unter Nutzung verschiedener Applikationsformen,
d) in getrennten Zubereitungen, in zeitlichem Abstand, unter Nutzung der gleichen Applikationsform, oder
e) in getrennten Zubereitungen, in zeitlichem Abstand, unter Nutzung verschiedener Applikationsformen

Die exakte therapeutisch aktive Menge sowie die molare Zusammensetzung der Vakzine oder Vakzinkombination hängt von verschiedenen Faktoren, unter anderem von Art und Verlauf der Erkrankung, von Größe, Alter, Statur und Gesundheitszustand des Patienten, vom Applikationsweg, von den eingesetzten Antigenen und gegebenenfalls von den weiteren verwendeten Arzneimitteln ab. Somit ist es zum jetzigen Zeitpunkt nicht sinnvoll, eine exakte Menge zu definieren.
Die Untersuchungen an einem freiwilligen Probanden ergaben jedoch, dass die Beimischung von 80 μg des erfindungsgemäßen Lipopeptides Pam₃Cys-GDPKHPKSF (II) pro Impfdosis, zu einer signifikanten Erhöhung der Intensität und Nachhaltigkeit der spezifischen zellulären Immunantwort führt. Dementsprechend wird für Erwachsene von 50 bis 500 μg des racemischen Gemisches, oder 1 bis 80 μg des RR-Stereoisomers, als effektiv wirksame Einmaldosis ausgegangen. Die exakte Spezifikation ist abhängig von der konkreten Anwendung und erfordert weitere Untersuchungen in klinischen Studien.
Wesentliche Merkmale und vorteilhafte Wirkungen
Das zentrale Element der vorliegenden Erfindung besteht in der Identifizierung einer Gruppe synthetischer Lipopeptide mit hohem immunmodulatorischem Potential, deren speziell strukturierte, per se nicht immunogene Aminosäure-Sequenz eine optimale Balance zwischen der für eine gute Bioverfügbarkeit notwendigen Wasserlöslichkeit und den für eine effektive Wechselwirkung mit dem TLR 2-Rezeptor entscheidenden lipophilen Eigenschaften der Fettsäuren herstellt.
Das vorteilhafte physikalisch-chemische Verhalten der erfindungsgemäßen Lipopeptide sowie die gute Handhabbarkeit und Haltbarkeit der Formulierungen, machen erstmals die GMP-Produktion und damit die klinische Testung synthetischer Lipopeptide möglich.
In den biomedizinischen Untersuchungen erwiesen sich die erfindungsgemäßen Lipopeptide als potente Adjuvantien, insbesondere zur Erzeugung einer systemischen zellulären Immunantwort, wobei im Hinblick auf die immunmodulatorische Wirkung die Stereoselektivität besonders zu berücksichtigen ist.
Zum ersten Mal wird eine effektive, durch vom Antigen unabhängige synthetische Lipopeptide vermittelte Aktivierung und Stimulation von Antigen-spezifischen Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen direkt in vivo im Menschen nachgewiesen.
Die gebildeten Antigen-spezifischen T-Zellen waren in hoher Zahl und unabhängig vom Ort der Immunisierung nachweisbar, während mit alternativen Adjuvantien bisher lediglich geringe Effekte bestätigt werden konnten.
Das Lipopeptid selbst wurde von den induzierten T-Zellen nicht erkannt. Diese geringe Immunogenizität des erfindungsgemäßen Peptides stellt einen wesentlichen Vorteil gegenüber adjuvanten Proteinen dar, da eine Immunantwort gegen das Adjuvans die Wirksamkeit einer späteren mit demselben Adjuvans verabreichten Impfung beeinträchtigen kann.
Über den gesamten Beobachtungszeitraum traten bei dem mit viralen Peptiden geimpften Probanden neben der erwarteten lokalen Granulom-Bildung keinerlei Nebenwirkungen oder Zeichen akuter Toxizität auf.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die Erfindung begründet einen großen Fortschritt bei der Suche nach effektiven und universell einsetzbaren Adjuvantien für die Impfstoffentwicklung. Die erfindungsgemäßen Lipopeptide stellen eine leistungsfähige Alternative zu den bisher am Markt vorhandenen sowie den zahlreichen noch in der Entwicklung befindlichen Adjuvantien für die humane Anwendung dar.
Die erfindungsgemäßen Lipopeptide können als unabhängige Adjuvantien insbesondere in antimikrobiellen Impfstoffen sowie in der Individualtherapie mit Krebsvakzinen eingesetzt werden. Das Spektrum potentieller Anwendungen erstreckt sich jedoch weit über den Bereich der Vakzinierung hinaus. So können die erfindungsgemäßen Lipopeptide z. B. für die therapeutische Behandlung von Autoimmunkrankheiten, chronischen Entzündungen oder Allergien, immunologischen Defekten und akuten Infektionen oder für die Erzielung eines allgemeinen immunstimulierenden Effektes vorteilhaft eingesetzt werden. In der Krebstherapie können sie zudem die Wirkung von als Immun-Checkpoint-Inhibitor eingesetzten Antikörpern unterstützen.
Zudem können die erfindungsgemäßen Lipopeptide oder die sie enthaltenden Impfstoff-Formulierungen in Kombination mit weiteren pharmazeutischen Wirkstoffen, wie Antibiotika, Chemotherapeutika, entzündungshemmenden und -fördernden, anti-angiogenen, cytotoxischen oder immunmodulatorischen Stoffen und Liganden, oder Antikörpern sowie begleitend zu anderen Heilverfahren verabreicht werden, um deren Wirksamkeit zu unterstützen und/oder den durch diese verursachten immunologischen Schädigungen entgegen zu wirken.
Aus ökonomischer Sicht können die erfindungsgemäßen Lipopeptide relativ kostengünstig und in hohen Reinheiten hergestellt sowie umfassend analytisch charakterisiert werden. Zudem reichen in den meisten Fällen bereits vergleichsweise geringe Dosierungen aus, um deutliche immunologische Effekte zu erzielen.
Je nach Anwendung können die erfindungsgemäßen Lipopeptide als Lyophilisat oder fertige Zubereitung mit der Peptid-Lösung bereitgestellt werden. Im Interesse einer guten Lagerfähigkeit, bietet sich der Versand in Form pulverförmiger Präparate zur Rekonstitution beim Nutzer an.
Des Weiteren können die erfindungsgemäßen Lipopeptide als Einzelsubstanzen, als Systemkomponenten von Produkten und Kits oder verarbeitet, u. a. in Medizinprodukten und pharmazeutischen Präparaten, vermarktet werden.
Näheres zu besonders bevorzugten Ausführungsformen sowie weitere Merkmale, Vorteile und Nutzungsmöglichkeiten der Erfindung ergeben sich aus der vorangegangenen Beschreibung und den folgenden Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, Abbildungen und Referenzen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind.
Die aufgeführten Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein.
Abbildungen
1 Ex vivo IFN-γ ELISPOT der peripheren Blutlymphozyten (PBMCs) nach einmaliger Injektion s. c. von drei synthetischen Viruspeptiden formuliert in einer Emulsion mit Pam₃Cys-GDPKHPKSF als Adjuvans, gemessen unmittelbar vor der Injektion (oben) und am Tag 31 nach der Injektion (unten).
Die Grafik zeigt eine starke Induktion der Antigen-spezifischen T-Zell-Immunantwort im Blut gegen die applizierten Viruspeptide bei minimaler Reaktion auf die Kontrollpeptide sowie vor der Immunisierung.
2 Ex vivo IFN-γ ELISPOT der peripheren Blutlymphozyten (PBMCs) nach einmaliger Injektion s. c. von drei synthetischen Viruspeptiden formuliert in einer Emulsion mit Pam₃Cys-GDPKHPKSF als Adjuvans, gemessen am Tag 44 nach der Injektion.
Die Grafik zeigt eine anhaltende starke Induktion der Antigen-spezifischen T-Zell-Immunantwort im Blut gegen die applizierten Viruspeptide bei minimaler Reaktion auf die Kontrollpeptide.
3 Ex vivo IFN-γ ELISPOT der Granulom-infiltrierenden Lymphozyten (GILs) nach einmaliger Injektion s. c. von drei synthetischen Viruspeptiden formuliert in einer Emulsion mit Pam₃Cys-GDPKHPKSF als Adjuvans, gemessen am Tag 44 nach der Injektion.
Die Grafik zeigt eine starke Induktion der Antigen-spezifischen T-Zell-Immunantwort im Granulom-Gewebe gegen die applizierten Viruspeptide. Die beobachtete schwache Reaktion auf die Kontrollpeptide wird durch im Granulom noch vorhandene Impfpeptide erklärt (wurde massenspektrometrisch nachgewiesen).
4 Differentielle Genexpression im Granulom-Zentrum im Vergleich zu normalem Unterhautfettgewebe, gemessen mit RNASeq am Tag 44 nach der Injektion.
Das Diagramm zeigt u. a. eine starke Induktion der Pam₃Cys-bindenden Rezeptoren TLR 1 und TLR 2.
5 Links: Differentielle Genexpression (Hallmark ”inflammatory response”, GSEA Datensatz mit 197 Genen) in normalem Unterhautfettgewebe, am Granulom-Rand und im Granulom-Zentrum, gemessen mit RNASeq am Tag 44 nach der Injektion.
Die Grafik zeigt das Zytokin-Muster einer Entzündungsreaktion.
Rechts: Volcano-Blot der differentiellen Genexpression in normalem Unterhautfettgewebe (links) und im Granulom-Zentrum (rechts), gemessen mit RNASeq am Tag 44 nach der Injektion.
Die Grafik zeigt über 200 stark differentiell exprimierte Gene mit erhöhter Aktivierung.
6 Phänotypanalyse der Granulom-infiltrierenden CD4⁺ T-Zellen (HGR-ILs) im Vergleich mit peripheren Blutlymphozyten (PBMCs), gemessen am Tag 44 nach der Injektion.
Die Grafik zeigt eine starke Aktivierung von CD4⁺ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen im Granulom-Gewebe bei überwiegend naiven T-Zellen im peripheren Blut.
7 Phänotypanalyse der Granulom-infiltrierenden CD8⁺ T-Zellen (HGR-ILs) im Vergleich mit peripheren Blutlymphozyten (PBMCs), gemessen am Tag 44 nach der Injektion.
Die Grafik zeigt eine starke Aktivierung von CD8⁺ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen im Granulom-Gewebe bei überwiegend naiven T-Zellen im peripheren Blut.
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SEQ ID NO	<223>	Bedeutung
01–03	Lipopeptid Pam₃Cys	dreifach palmitoyliertes Dihydroxypropyl-cystein C-terminal gekoppelt mit dem Peptid
04	Epitop aus einem Protein von Mycoplasma salivarium	erfindungsgemäße Aminosäure-Sequenz, die dem Lipopeptid seine außergewöhnlichen Eigenschaften verleiht
05–11	HLA-XXX-abhängiges Epitop aus einem Protein des Y-Virus	HLA-restringierte immunologisch aktive Sequenzausschnitte aus viralen Proteinen, die für die Herstellung der personalisierten Multi-Peptid-Vakzine bzw. als Kontrollen verwendet wurden

Ausführungsbeispiele
Beispiel A – Herstellung des synthetischen Lipopeptides Pam₃Cys-GDPKHPKSF
In diesem Ausführungsbeispiel wird die allgemeine Methodik zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Lipopeptides beschrieben. Strukturmodifikationen können durch das Auslassen einzelner Syntheseschritte bzw. das Hinzufügen von dem erfahrenen Synthesechemiker bekannten Schritten vorgenommen werden.
Die Synthese der ungewöhnlichen Aminosäuren Fmoc-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-Dhc) bzw. S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-Dhc(Pam₂)), die alternativ nach Methode e) unter Auslassung von Schritt f) gekuppelt werden kann, erfolgt in Lösung, während die Peptide vorzugsweise an einer festen Phase aufgebaut werden. Anschließend werden beide Bausteine an der festen Phase konjugiert und acyliert. Dann wird das Endprodukt vom Synthese-Harz abgespalten.
Wird bei der Synthese der ungewöhnlichen Aminosäuren Fmoc-Dhc in Schritt c) der racemische Synthesebaustein RS-2,3-Epoxy-1-propanol verwendet, erhält man ein Diastereomeren-Gemisch der Zielverbindung. Durch Einsatz des Enantiomers R-2,3-Epoxy-1-propanol wird in analoger Weise das immunmodulatorisch aktivere Lipopeptid mit dem RR-Stereoisomer des Dhc erhalten.
a) Synthese von GDPKHPKSF – Herstellung des Peptides
Die Synthese der Peptide erfolgt nach klassischen, Literatur-bekannten Methoden unter Nutzung einer Fmoc-basierten orthogonalen Schutzgruppenstrategie in einem an der Merrifield-Synthese angelehnten automatisierten Verfahren. Die Verfahrensschritte bei der Festphasensynthese sind für nahezu alle Aminosäure-Sequenzen gleich. Deshalb wird in diesem Beispiel lediglich der prinzipielle Syntheseablauf beschrieben, ohne auf Besonderheiten einzelner Peptide, Aminosäure-Sequenzen und/oder Aminosäuren einzugehen, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind.

Das Peptid GDPKHPKSF wird mit einem Syntheseroboter, ausgehend von einem mit Fmoc-L-Phe beladenen Synthese-Harz, nach der Fmoc-Peptidsynthese-Methode aufgebaut. Dazu wird das beladene Tritylchlorid-Polystyrol-Harz (30 mg; 15 μmol) in einen Reaktor eingewogen. Die Aminosäuren werden in einer 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung (0,5 M) in N,N-Dimethylformamid in einer Konzentration von 0,5 M gelöst. Im ersten Syntheseschritt erfolgt die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe um an der frei gewordenen terminalen Amino-Gruppe die Anbindung der nächsten Aminosäure zu ermöglichen. Die Aminosäure-Seitenketten bleiben geschützt. Anschließend wird das Peptid durch die Konjugation der jeweils nächsten Aminosäure und die nachfolgende Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe der soeben gekoppelten Aminosäure schrittweise, vom C-Terminus her, an dem Harz aufgebaut. Der Ablauf des Syntheseprogramms ist in Tab. 2 dargestellt. Tab. 2: Repetitiver Zyklus zur Synthese der Peptide.

Syntheseschritt	Reagenzien/Lösungsmittel	Volumina [μL]	Dauer [min]
1. Kupplung	3 M N,N-Diisopropylethylamin in N,N-Dimethylformamid,	25	120
	3 M N,N'-Diisopropylcarbodiimid in N,N-Dimethylformamid,	25
	0,5 M Aminosäure-Lösungen	200
2. Waschen, 3×	N,N-Dimethylformamid	300	1
3. Deblockierung	30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid	200	5
4. Waschen, 3×	N,N-Dimethylformamid	300	1
5. Deblockierung	30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid	200	10
6. Waschen, 7×	N,N-Dimethylformamid	300	1
7. weiter bei Schritt 1.

b) Synthese von N,N'-Bis(fluorenylmethoxycarbonyl)-[R]-cystin-bis-tert.-butylester – Herstellung von Cystin mit Schutzgruppen
L-Cystin-bis-tert.-butylester (5,54 g; 13 mmol) und Fmoc-N-hydroxysuccinimidylester (7,09 g; 21 mmol) werden in Tetrahydrofuran (15 mL) gelöst. Unter Rühren wird N-Ethylmorpholin (3,83 g; 4,2 mL; 33 mmol) in Tetrahydrofuran (7,5 mL) dazugegeben. Die Reaktionslösung wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Hilfe des Rotationsverdampfers bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat (100 mL) gelöst und im Scheidetrichter mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 3 × 80 mL) sowie Wasser (3 × 80 mL) gewaschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer eingedampft und als Rückstand ein Öl erhalten. Dieser Rückstand wird mit Unterstützung eines Ultraschallbades in Dichlormethan/Methanol (1:4; 385 mL) gelöst und umkristallisiert (18h; –20°C). Der erhaltene farblose Niederschlag wird über eine Filternutsche abfiltriert, mit tert.-Butylalkohol/2-Propanol (1:1; 2 × 100 mL) gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute (Fmoc-Cys-OtBu)₂: 7,48 g (72%); [M+H]⁺: 797
c) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein-tert.-butylester – Aufbau der ungewöhnlichen Aminosäure Fmoc-Dhc
(Fmoc-Cys-OtBu)₂ (4,96 g; 6,2 mmol) wird in Dichlormethan (39 mL) gelöst. Anschließend werden Zink (2,84 g; 43 mmol) sowie eine Mischung aus Methanol, Salzsäure (32%) und Schwefelsäure (98%) (100:7:1; 20,7 mL) unter starkem Rühren zugegeben. Nach 15 min Reaktionszeit bei Raumtemperatur wird RS-2,3-Epoxy-1-propanol (4,59 g; 4,13 mL; 62 mmol) zu dem Reaktionsgemisch gegeben und es wird im Ölbad (5 h; 40°C) weiter gerührt. Anschließend wird die Lösung am Rotationsverdampfer auf das halbe Volumen eingedampft, mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 5,2 mL) versetzt und 16 h bei –2°C aufbewahrt. Das Produkt wird mit Dichlormethan (3 × 50 mL) extrahiert. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingedampft.
Ausbeute (Fmoc-Dhc-OtBu): 5,67 g (96%); [M+H]⁺: 474
d) Synthese von Na-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein – Hydrolyse des tert.-Butylesters
Fmoc-Dhc-OtBu (5,67 g; 12 mmol) wird in Trifluoressigsäure (99%; 142 mL) gelöst und das Reaktionsgemisch wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird anschließend am Rotationsverdampfer eingedampft, mit N-Hexan (50 mL) und Diethylether (30 mL) versetzt und erneut am Rotationsverdampfer eingedampft. Der zähflüssige, ölige Rückstand wird anschließend in tert.-Butylalkohol/Wasser (4:1; 100 mL) gelöst und lyophilisiert (64 h).
Ausbeute (Fmoc-Dhc-OH): 3,03 g (60%); [M+H]⁺: 418
e) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF – N-terminale Kopplung an die Aminosäure-Sequenz
Ein mit dem Seitenketten-geschützten Peptid GDPKHPKSF beladenes Tritylchlorid-Synthese-Harz (5,22 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 αL; 36,6 μmol; 7 Equivalente), Fmoc-RS-Dhc-OH (15,3 mg in 100 μL einer 0,5 M 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung in N,N-Dimethylformamid; 36,6 μmol; 7 Equivalente) und N,N'-Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 7 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Die Harz-Suspension wird für 2 h bei 37°C inkubiert. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) und Dichlormethan (3 × 600 μL) gewaschen.
f) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF – Veresterung von Fmoc-Dhc Peptid mit Palmitinsäure
Das mit dem Fmoc-Dhc-Peptid beladene Harz (5,22 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor inkubiert. Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 24,4 μL; 73,2 μmol; 14 Equivalente), Palmitinsäure (1 M in N,N-Dimethylformamid/Dichlormethan (1:1); 104 μL; 104 μmol; 20 Equivalente) und N,N'-Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 24,4 μL; 73,2 μmol; 14 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Nach 5 min wird 4-Dimethylaminopyridin (1 M in N,N-Dimethylformamid; 30,0 μL; 30,0 μmol; 5,7 Equivalente) zugegeben. Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) und Dichlormethan (3 × 600 μL) gewaschen.
g) Synthese von S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF – Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe
Fmoc-Dhc(Pam₂)-Peptid beladenes Harz (5,22 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor inkubiert. Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes wird Piperidin (30% in N,N-Dimethylformamid; 200 μL) zu dem Harz pipettiert und die Mischung 10 min bei Raumtemperatur belassen. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) gewaschen. Anschließend wird nochmals Piperidin (30% in N,N-Dimethylformamid; 200 μL) zu dem Harz pipettiert und die Suspension 20 min bei Raumtemperatur belassen. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL), Dichlormethan (3 × 600 μL) und Diethylether (4 × 600 μL) gewaschen.
h) Synthese von S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-N-palmitoyl-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF – Acylierung des Dhc(Pam₂)-Peptides mit Palmitinsäure
Das mit dem Pam₂-Dhc-Peptid beladene Harz (2,60 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor inkubiert. Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 14 Equivalente), Palmitinsäure (1 M in N,N-Dimethylformamid/Dichlormethan (1:1); 52 μL; 52 μmol; 20 Equivalente) und N,N'-Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 14 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C inkubiert. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) und Dichlormethan (3 × 600 μL) gewaschen. Die Vollständigkeit der Reaktion wird mit Hilfe des Ninhydrin-Tests kontrolliert.
i) Freisetzung von S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-N-palmitoyl-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF und Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen
Die Abspaltlösung (Trifluoressigsäure/Triisopropylsilan/Wasser (92,5:5:2,5; 300 μL) wird zu dem mit dem Seitenketten-geschützten Pam₃-RS-Dhc-Peptid beladenen Harz (2,60 μmol) pipettiert und die Suspension 2 h bei Raumtemperatur belassen. Nach der Filtration der Abspaltlösung in ein Reagenzglas, werden weitere 200 μL Abspaltlösung zu dem Harz pipettiert. Die Suspension wird nochmals 30 min bei Raumtemperatur belassen. Nach erneuter Filtration der Abspaltlösung wird das Harz mit Dichlormethan (200 μL) gewaschen. Die Filtrate und die Waschlösung werden vereinigt und die Lösung am Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wird mit Diethylether (3 × 300 μL) digeriert und anschließend zentrifugiert. Das Sediment wird in tert.-Butylalkohol/Wasser (4:1; 2 mL) aufgenommen und gefriergetrocknet (18 h).
Ausbeute (Pam₃-RS-Dhc-GDPKHPKSF): 4,4 mg (89%);
[M+H]⁺: 1904; [M+2H]² ⁺: 953; [M+3H]³ ⁺: 636
Beispiel B – Antivirale Immunisierung eines Probanden durch subkutane Injektion
Die im Beispiel B dargestellten Untersuchungen wurden mit einem Stereoisomeren-Gemisch des synthetischen Lipopeptides Pam₃Cys-GDPKHPKSF (II) durchgeführt. Dieses spezielle Lipopeptid wurde aufgrund seiner außergewöhnlichen chemisch-physikalischen Eigenschaften, der einfachen synthetischen Zugänglichkeit und des erwartet hohen adjuvanten Potentials ausgewählt. Für vertiefende klinische Untersuchungen ist das immunmodulatorisch aktivere Lipopeptid, das das RR-Stereoisomer des Dhc enthält, vorgesehen.
a) Impfstoff-Formulierung und Durchführung der Immunisierung
Für die Immunisierung wurden drei bekante Epitope viraler Proteine ausgewählt.

Die viralen Peptide wurden in DMSO gelöst und weiter mit Wasser verdünnt. Das wässrig gelöste Adjuvans wurde zugegeben und die gesamte Lösung mit dem Emulgator vermischt. 400 μL dieser Emulsion wurden subkutan abdominal injiziert. Tab. 3: Zusammensetzung der im Immunisierungsversuch eingesetzten personalisierten Multi-Peptid-Vakzine.

Komponente	Aminosäure-Sequenz bzw. Substanz	SEQ ID NO	Menge
virale VakzinierungsPeptide	LTDLGQNLLY (HLA-A01, Adenovirus)	05	240 μg
	ELRSRYWAI (HLA-B08, Influenza)	06	240 μg
	PRPVSRFLGNNSILY (HLA-DR, Epstein-Barr)	07	240 μg
Adjuvans	Pam₃Cys-GDPKHPKSF	03	80 μg
Lösungsmittel	Wasser/DMSO	-	200 μL
Emulgator	Montanide ISA51	-	200 μL

b) Klinische Symptome
Als lokale Reaktion auf die Immunisierung, wurde erwartungsgemäß ein indolentes Granulom mit einer Größe von ca. 4 ml gebildet. ¹⁸FDG-PET-MRT-Messungen am Tag 43 nach der Injektion, zeigten eine hohe metabolische Aktivität des Granulom-Gewebes. Am Tag 44 nach der Injektion wurde das gebildete Granulom komplett entfernt.
c) Nachweis Antigen-spezifischer Effektor-T-Zellen im Blut und im Granulom-Gewebe

An Tag 31 und Tag 44 nach der Injektion, wurden je 50 ml Blut aus einer Armvene entnommen. Aus dem venösen Blut wurden die peripheren Blutlymphozyten (PBMCs) extrahiert und eingefroren. Gleichzeitig wurde am Tag 44 eine Suspension Granulom-infiltrierender Zellen (GILs) aus dem resektierten Granulom-Gewebe gewonnen und eingefroren. Am Tag der Messung wurden alle entnommenen Zellen wieder aufgetaut und parallel in einer Serie bearbeitet. Die Zellsuspensionen wurden dazu in einem ELISPOT-Assay ohne in vitro Restimulation auf das Vorhandensein Peptid-spezifischer INF-γ produzierender CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen getestet. Tab. 4: Zusammenstellung der in dem INF-γ ELISPOT Aktivitäts-Assay eingesetzten Peptide und Kontrollverbindungen.

Funktion	Protein	Aminosäure-Sequenz	SEQ ID NO	HLA
virale-Nakzinierung-Peptide	Hex-Ade/Adenovirus	LTDLGQNLLY	05	A01
	Inf-NCAP/Influenza	ELRSRYWAI	06	B08
	EBV-GP350/Epstein-Barr-Virus	PRPVSRFLGNNSILY	07	DR
Negativ-Kontrollen	HIV	GSEELRSLY	08	A01
	HIV	GGKKKYKL	09	B08
	Filamin A	ETVITVDTKAAGKGK	10	DR
Substanz-Kontrollen	-	GDPKHPKSF	04	-
Substanz-Kontrollen	-	Pam₃Cys-GDPKHPKSF	03	-
Positiv-Kontrollen	BZLF1_EBV/Epstein-Barr-Virus	RAKFKQLL	11	B08
Positiv-Kontrollen	PHA-L		-	-

d) Nachweis von Effektor-Gedächtnis-T-Zellen (T_EM) im Granulom-Gewebe
Hierzu wurde aus dem resektierten Granulom-Gewebe eine Einzelzellsuspension gewonnen. Diese wurde per Durchflusszytometrie auf die Expression der einschlägigen Oberflächenmarker getestet. Dabei konnten 80 bis 90% der Granulom-infiltrierenden T-Zellen (HGR-ILs) als T_EM-Zellen (Effektor-Memory) eingestuft werden, während gleichzeitig im peripheren Blut (PBMCs) nur 40 bis 50% dieses T-Zell-Typs vorhanden waren.
e) Genexpression im Granulom-Gewebe
Gewebestücke des resektierten Granuloms, vom Rand des Resektats, aus dem Zentrum des Granuloms sowie vom Granulom-Rand, wurden einer Genexpressionsanalyse mit RNA-Seq unterzogen. Die Analysen wurden durch einen kommerziellen Dienstleister nach dem Stand der Technik durchgeführt.
f) Biokompatibilität und Verträglichkeit der Impfstoff-Formulierung
Neben der erwünschten und erwarteten Bildung eines indolenten Granuloms, wurden keinerlei Nebenwirkungen beobachtet.
In diesem Ausführungsbeispiel wird die starke T-Zellinduktion in vivo nach einer einzigen Injektion des mit dem erfindungsgemäßem Adjuvans emulgierten Impfstoffs gezeigt, und zwar sowohl in den T-Zellen des peripheren Blutes (1, 2) als auch in dem Granulom (3), das sich erwartungsgemäß and der Injektionsstelle entwickelte. Außerdem zeigt die Genexpressionsanalyse des Granulom-Gewebes die Induktion der Pam₃Cys-bindenden Toll-like-Rezeptoren TLR 1 und TLR 2 (4) sowie ein für eine Entzündungsreaktion typisches Zytokin-Muster (5). Schließlich zeigen die Immunfluoreszenz-basierten Phänotypanalysen in 6 und 7, dass die Granulom-infiltrierenden CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen überaus stark aktiviert sind. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass diese überwiegend sogenannte Effector-Memory-T-Zellen (T_EM) sind, also Antigen-erfahrene funktionelle T-Zellen, während die Blutlymphozyten vom gleichen Tag zum großen Teil naive T-Zellen sind. Zudem war die Gesamtzahl der funktionellen Antigen-spezifischen T-Zellen sowohl im Granulom-Gewebe als auch im peripheren Blut ungewöhnlich hoch. Das Lipopeptid selbst sowie das freie Peptid wurden vom Immunsystem nicht erkannt.
Diese Ergebnisse zeigen eine überaus starke Aktivierung funktioneller Antigen-spezifischer T-Zellen in vivo im Menschen, was bisher, soweit uns bekannt ist, durch eine Peptid-Vakzinierung nicht erreicht werden konnte.
Auch sind uns keine anderen Adjuvantien bekannt, die durch Zumischen eine ähnlich starke Induktion von Antigen-spezifischen CD8⁺ und T_H-1 CD4⁺ T-Zellen beim Menschen bewirken und zudem unter GMP-Bedingungen als Reinsubstanz darstellbar und sterilisierbar sind. Sequenzprotokoll

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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EP 2050455 [0011, 0037]
DE 10225144 [0012, 0064]
EP 0000330 [0026]
EP 0014815 [0026]
EP 0114787 [0026]
WO 2007/103322 [0027]
WO 2006/104389 [0027]
US 7387271 [0027]
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WO 2005/063288 [0028]
EP 0210412 [0029]
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WO 2012/146364 [0029]
WO 2007/078879 [0030]
WO 2007/079448 [0030]
WO 2004/014956 [0030]
WO 2004/014957 [0030]
EP 1490106 [0033, 0051]
WO 2015/070031 [0037]
EP 0519327 [0077]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Rappuoli 2011 [0039]
Montomoli 2011 [0039]
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Sayers 2012 [0039]
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Takeuchi 2000 [0072]
Spohn 2004 [0072]
Metzger 1991 [0077]

Claims

Verwendung eines Lipopeptides der folgenden Struktur
wobei R1, R2 und R3, die gleich oder voneinander verschieden sein können, für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 14 bis 18 C-Atomen, und R4 für ein aus 8 bis 11 Aminosäure-Resten bestehendes, physiologisch verträgliches Peptid, das • einen Anteil von mehr als 30% geladenen, von weniger als 35% unpolaren sowie weitere polare Seitenketten enthält, wobei die unpolaren Seitenketten einzeln und gleichmäßig über die Sequenz verteilt sind, • bei pH 7 eine nahezu ausgeglichene Ladungsbilanz von ±1 aufweist, und • in freier, veresterter oder amidierter Form, bevorzugt mit freiem C-Terminus, vorliegt, stehen, einschließlich der entsprechenden • pharmazeutisch akzeptablen Salze, • Tautomere und beliebigen Tautomeren-Gemische, • Stereoisomere und beliebigen Stereoisomeren-Gemische, sowie • Prodrug-Ester und Prodrug-Peptide, als Adjuvans bei der therapeutischen oder prophylaktischen Vakzinierung mit synthetischen und natürlichen Biopolymeren für die Induzierung einer zellulären Immunantwort beim Menschen.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1, R2 und R3 für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen stehen.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid R4 die Aminosäure-Sequenz GDPKHPKSF aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopeptid die folgende Struktur
aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem Lipopeptid vorkommende ungewöhnliche Aminosäure Dihydroxypropylcystein als RR-Stereoisomer vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopeptid mit physikalischen oder biologischen Trägern assoziiert oder verbunden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Vakzin-Antigene, die durch das Lipopeptid unterstützt werden, in Form von Peptiden, Proteinen, DNA, RNA, Polysacchariden, Glykolipiden, Glykoproteinen, Tumor-Lysaten oder Erreger-Mixturen vorliegen.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die bei der Vakzinierung eingesetzten Peptide funktionelle Epitope von mikrobiellen Proteinen und/oder Tumor-assoziierte Peptide und/oder Tumor spezifische Peptide und/oder mit anderen Entartungen assoziierte Peptide darstellen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopeptid in einer Impfstoff-Zubereitung mit gegebenenfalls mehreren Antigenen vorliegt, die gegebenenfalls weitere Adjuvantien, pharmazeutische Wirkstoffe, Antikörper, Hilfs- und Zusatzstoffe enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopeptid als separate Zubereitung vorliegt, die gegebenenfalls weitere Adjuvantien, pharmazeutische Wirkstoffe, Antikörper, Hilfs- und Zusatzstoffe enthält, und die für die Co-Applikation oder die in situ Mischung mit der Impfstoff-Zubereitung vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopeptid in unmittelbarem Zusammenhang mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Komponenten, wie pharmazeutischen Wirkstoffen, Antikörpern, Antigenen, Adjuvantien, Hilfs- und Zusatzstoffen bzw. entsprechenden Zubereitungen in der gleichen oder in verschiedenen Körperregionen verabreicht wird, insbesondere: a) in einer Zubereitung, b) in getrennten Zubereitungen, zeitgleich, unter Nutzung der gleichen Applikationsform, c) in getrennten Zubereitungen, zeitgleich, unter Nutzung verschiedener Applikationsformen, d) in getrennten Zubereitungen, in zeitlichem Abstand, unter Nutzung der gleichen Applikationsform, oder e) in getrennten Zubereitungen, in zeitlichem Abstand, unter Nutzung verschiedener Applikationsformen.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopeptid, gegebenenfalls im Zusammenwirken mit weiteren pharmakologisch aktiven Stoffen und Zubereitungen, zur Steigerung der körperlichen Abwehrkräfte geeignet ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopeptid als Adjuvans für Impfstoffe zur Prophylaxe gegen bakterielle, virale, mykotische und parasitäre Infektionen, zur therapeutischen Vakzinierung bei Tumoren und anderen proliferativen Erkrankungen, zur Unterstützung der Wirkung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren in der Krebstherapie, sowie zur Immunstimulation bei bereits vorhandenen Infektionen, immunologischen Defekten und immunsuppressiv wirkenden Behandlungen und Zuständen geeignet ist.
Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Lipopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und gegebenenfalls weitere Bestandteile, wie Antigene, pharmazeutische Wirkstoffe, Antikörper, weitere Adjuvantien, Hilfs- und Zusatzstoffe enthält.
Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer für die orale, topische, transdermale, mukosale, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse oder anderweitig parenterale Applikation oder für die direkte Injektion in das Gewebe, die Lymphknoten oder die Lymphgefäße geeigneten Formulierung vorliegt.
Vakzinierungs-Kit, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Komponente, die mindestens ein Lipopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält, beinhaltet.