DE69733352T2

DE69733352T2 - Hla-a2.1 bindende peptide und deren verwendung

Info

Publication number: DE69733352T2
Application number: DE69733352T
Authority: DE
Inventors: M. Howard GREY; Alessandro Sette; John Sidney
Original assignee: Epimmune Inc
Current assignee: Epimmune Inc
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2017-03-22
Also published as: AU2658897A; CN1218406A; EP0907370A4; BR9708220A; JP4210735B2; EP0907370A1; EP0907370B1; CA2248667A1; CA2248667C; DE69733352D1; ATE296313T1; WO1997034621A1; JP2002515869A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Prävention, Behandlung oder Diagnose einer Anzahl von pathologischen Zuständen wie beispielsweise viralen Erkrankungen und Krebserkrankungen. Insbesondere stellt sie neue Peptide bereit, die in der Lage sind, ausgewählte Histokompatibilitätskomplex-(MHC)-Moleküle zu binden und eine Immunantwort zu induzieren.
MHC-Moleküle werden als entweder Klasse I- oder Klasse II-Moleküle klassifiziert. MHC-Moleküle der Klasse II werden in erster Linie auf Zellen exprimiert, die bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von Immunantworten beteiligt sind, wie beispielsweise T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Macrophagen etc. Klasse II-MHC-Moleküle werden von Helfer-T-Lymphozyten erkannt und induzieren die Proliferation von Helfer-T-Lymphozyten und die Amplifikation der Immunantwort gegen das spezielle immunogene Peptid, das gezeigt wird. MHC-Moleküle der Klasse I werden auf fast allen nukleären Zellen exprimiert und von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) erkannt, die dann die Antigen-tragenden Zellen zerstören. CTLs sind besonders wichtig bei der Tumorabstoßung und bei der Bekämpfung viraler Infektionen.
Die CTL erkennen das Antigen in der Form eines Peptidfragmentes, das an die MHC-Moleküle der Klasse I gebunden ist, statt das intakte fremde Antigen selbst. Das Antigen muss normalerweise endogen durch die Zelle synthetisiert werden und ein Teil des Proteinantigens wird im Zytoplasma zu kleinen Peptidfragmenten abgebaut. Einige dieser kleinen Peptide wandern in ein prä-Golgi-Kompartiment und treten in Wechselwirkungen mit schweren Ketten der Klasse I, um eine geeignete Faltung und Assoziierung mit der Microglobulin-Untereinheit β2 zu erleichtern. Der Peptid-MHC-Klasse I-Komplex wird dann zur Expression und potentiellen Erkennung durch spezifische CTLs zu der Zelloberfläche geleitet.
Untersuchungen der Kristallstruktur der menschlichen MHC-Moleküle der Klasse I, HLA-A-2.1, zeigen, dass eine Peptid-bindende Spalte durch die Faltung der α1- und α2-Domänen der schweren Kette der Klasse I erzeugt wird (Bjorkman et al., Nature 329:506 (1987). Bei diesen Untersuchungen wurde jedoch die Identität von in der Spalte gebundenen Peptiden nicht bestimmt.
Buus et al., Science 242:1065 (1988) haben zuerst ein Verfahren für die Säureelution von gebundenen Peptiden aus MHC beschrieben. Anschließend haben Rammensee und seine Mitarbeiter (Falk et al., Nature 351:290 (1991) einen Ansatz entwickelt, um natürlich prozessierte Peptide zu charakterisieren, die an Moleküle der Klasse I gebunden sind. Andere Forscher haben erfolgreich eine direkte Aminosäuresequenzierung der reichlicheren Peptide in verschiedenen HPLC-Fraktionen durch herkömmliche automatisierte Sequenzierung von Peptiden erreicht, die von Molekülen der Klasse I des B-Typs eluiert wurden (Jardetzky, et al., Nature 353:326 (1991), und des A2.1-Typs durch Massenspektrometrie (Hunt, et al., Science 225:1261 (1992). Eine Übersicht der Charakterisierung von natürlich prozessierten Peptiden in MHC der Klasse I ist von Rötzschke und Falk gegeben worden (Rötzschke und Falk, Imunol. Today 12:447 (1991).
Sette et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3296 (1989) zeigten, dass MHC-Allel-spezifische Motive verwendet werden könnten, um MHC-Bindungsfähigkeit vorherzusagen. Schaeffer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4649 (1989) zeigten, dass MHC-Bindung mit der Immunisierungsstärke in Beziehung stand. Mehrere Autoren (De Bruijn et al., Eur. J. Immunol., 21:2963-2970 (1991); Pamer et al., 991 Nature 353:852-955 (1991)) haben den vorläufigen Nachweis erbracht, dass Klasse I-bindende Motive auf die Identifizierung potentieller immunogener Peptide in Tiermodellen angewandt werden können. Klasse I-Motive, die für eine Anzahl menschlicher Allele eines gegebenen Klasse I-Isotyps spezifisch sind, sind noch nicht beschrieben worden. Es ist wünschenswert, dass die kombinierten Häufigkeiten dieser verschiedenen Allele hoch genug sein sollten, um einen großen Teil oder möglicherweise die Mehrzahl der hervorgebrachten menschlichen Population abzudecken.
WO-A-94/20127 offenbart Mittel und Verfahren zum Auswählen von immunogenen Peptiden, die in der Lage sind, spezifisch Glycoproteine zu binden, die von dem HLA-A2.1-Molekül codiert sind.
WO-A-95/28958 offenbart ein Verfahren zur Behandlung von pathogenen Erkrankungen, das die Verabreichung eines MHC-Klasse I-beschränkten, 8-12 Aminosäure langen Antigenpeptids in Kombination mit einem geeigneten Adjuvants umfasst.
WO-A-91/00912 offenbart hybride Proteaseinhibitoren, die nicht immunogen und mit einer aktiven Stelle einer Protease in einem Organismus reaktiv sind.
WO-A-96/18409, veröffentlicht am 20. Juni 1996, offenbart Verfahren, Zusammensetzungen und Peptide, die nützlich sind bei der Aktivierung von CTLs in vivo mit einer Spezifität für besondere Antigenpeptide.
Burg et al, AIDS, Band 9(2) Seiten 121-7(1995) offenbaren die Induktion einer primären menschlichen zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort gegen ein neues konserviertes Epitop in einer funktionalen Sequenz der reversen Transkriptase von HIV.
Trotz dieser Entwicklungen auf dem Gebiet muss der Stand der Technik noch ein nützliches, menschliches Peptid-basiertes Vakzin oder therapeutisches Agens auf der Grundlage dieser Arbeit bereitstellen. Die vorliegende Erfindung liefert diese und andere Vorteile.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt immunogene Peptide bereit mit Bindungsmotiven für HLA-A2.1-Moleküle. Die immunogenen Peptide, die an das geeignete MHC-Allel binden, umfassen eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgebildet ist umfassend SEQ ID NO: 6,8 und 18.
Die Peptide basieren auf Sequenzen antigener Proteine des menschlichen Immundefizienztyp I-Virus (HIV1). Die Peptide, oder sie codierenden Nukleinsäuren, sind somit für pharmazeutischen Zusammensetzungen für sowohl in vivo als auch ex vivo therapeutische und diagnostische Anwendungen nützlich.
Definitionen
Der Begriff „Peptid" wird in der vorliegenden Beschreibung austauschbar mit „Oligopeptid" verwendet, um eine Reihe von Resten, typischerweise L-Aminosäuren zu bezeichnen, die miteinander typischerweise durch Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und Carbonyl-Gruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind. Die Oligopeptide der Erfindung weisen eine Länge von weniger als 15 Resten auf und bestehen üblicherweise aus zwischen 8 und 11 Resten, bevorzugterweise 9 oder 10 Resten.
Ein „immunogenes Peptid" ist ein Peptid, das ein Allel-spezifisches Motiv umfasst, so dass das Peptid an ein MHC-Molekül binden und eine CTL-Antwort induzieren wird. Immunogene Peptide der Erfindung sind in der Lage, an ein geeignetes HLA-A2.1-Molekül zu binden und eine zytotoxische T-Zellantwort gegen das Antigen zu induzieren, von dem das immunogene Peptid abgeleitet ist.
Immunogene Peptide werden passenderweise unter Verwendung der Algorithmen der Erfindung identifiziert. Die Algorithmen sind mathematische Prozeduren, die eine Bewertung ergeben, die die Auswahl von immunogenen Peptiden erlaubt. Typischerweise verwendet man die Algorithmusbewertung mit einer „Bindungsschwelle", um die Auswahl von Peptiden zu ermöglichen, die eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweisen, mit einer bestimmten Affinität zu binden und wiederum immunogen sein werden. Der Algorithmus basiert entweder auf den Wirkungen der MHC-Bindung einer speziellen Aminosäure an einer speziellen Position eines Peptids oder den Wirkungen der Bindung einer speziellen Substitution in einem ein Motiv enthaltenden Peptid.
Die Beziehung zwischen Bindungsaffinität für MHC-Moleküle der Klasse I und Immunisierungsstärke diskreter Peptidepitope ist in zwei experimentellen Ansätzen analysiert worden (Sette, et al., J. Immunol., 153:5586-5592 (1994)). Im ersten Ansatz wurde die Immunisierungsstärke potentieller Epitope, deren MHC-Bindungsaffinität über einen 10.000-fachen Bereich reichte, in HLA-A 0201-transgenen Mäusen analysiert. Im zweiten Ansatz wurde die Antigenität von etwa 100 verschiedenen potentiellen Epitopen, die von Hepatitis B-Virus (HBV) abgeleitet waren, bestimmt, die alle A 0201-bindende Motive trugen, unter Verwendung von PBL von akuten Hepatitis-Patienten. In beiden Fällen stellte man fest, dass eine Affinitätsschwelle von etwa 500 nM (bevorzugterweise 500 nM oder weniger) die Fähigkeit eines Peptidepitops bestimmt, eine CTL-Antwort hervorzurufen. Diese Daten korrelieren sehr gut mit Messungen zur Klasse I-Bindungsaffinität von entweder natürlich prozessierten Peptiden oder zuvor beschriebenen T-Zell-Epitopen. Diese Daten zeigen die wichtige Rolle einer Determinantenauswahl bei der Ausformung von T-Zellantworten.
Ein „konservierter Rest" ist eine Aminosäure, die mit einer erheblich höheren Frequenz auftritt, als durch zufällige Verteilung an einer speziellen Position in einem Peptid erwartet werden würde. Typischerweise ist ein konservierter Rest ein solcher, wo die MHC-Struktur einen Kontaktpunkt mit dem immunogenen Peptid liefern kann. Ein bis drei, bevorzugterweise zwei konservierte Reste innerhalb eines Peptides mit einer definierten Länge definieren ein Motiv für ein immunogenes Peptid. Diese Reste sind typischerweise in engem Kontakt mit der Peptid-bindenden Spalte, wobei ihre Seitenketten selbst in spezifischen Taschen der Spalte vergraben sind. Typischerweise wird ein immunogenes Peptid bis zu drei konservierte Reste, üblichererweise zwei konservierte Reste aufweisen.
Wie hierin verwendet sind „negative Bindungsreste" Aminosäuren, die, wenn sie an bestimmten Positionen vorhanden sind (z. B. Positionen 1, 3 und/oder 7 eines 9-mers), dazu führen werden, dass ein Peptid ein nicht-Binder oder schlechterer Binder und wiederum nicht immunogen sein wird, d. h. keine CTL-Antwort induziert.
Der Begriff „Motiv" bezeichnet das Muster der Reste in einem Peptid mit definierter Länge, üblicherweise etwa 8 bis etwa 11 Aminosäuren, das durch ein spezielles MHC-Allel erkannt wird. Die Peptidmotive sind üblicherweise für jedes menschliche MHC-Allel unterschiedlich und unterscheiden sich im Muster der hoch konservierten Reste und negativen Reste.
Das Bindungsmotiv für ein Allel kann mit einem steigenden Umfang an Genauigkeit definiert sein. In einem Fall sind alle konservierten Reste in einem Peptid an den richtigen Stellen vorhanden und es gibt keine negativen Reste an den Positionen 1, 3 und/oder 7.
Die Formulierungen „isoliert" oder „biologisch rein" bezeichnen Material, das beträchtlich oder wesentlich frei ist von Bestandteilen, die es normalerweise begleiten, wie in seinem nativen Zustand gefunden. Die Peptide dieser Erfindung enthalten somit keine Materialien, die normalerweise mit ihrer in situ-Umgebung verbunden sind, z. B. MHC-I-Moleküle auf Antigen-präsentierenden Zellen. Selbst wo ein Protein zu einer homogenen oder dominanten Ban de isoliert worden ist, gibt es Spesen von Verunreinigungen im Bereich von 5-10% des nativen Proteins, die mit dem erwünschten Protein co-gereinigt werden. Isolierte Peptide dieser Erfindung enthalten kein derartiges endogenes co-gereinigtes Protein.
Der Begriff „Rest" bezeichnet eine Aminosäure oder Aminosäuremimetikum, das in einem Oligopeptid durch eine Amidbindung oder ein Amidbindungsmimetikum enthalten ist.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung Allel-spezifischer Peptidmotive für menschliche MHC-Allelsubtypen der Klasse I (manchmal als HLA bezeichnet), insbesondere Peptidmotive, die von HLA-A2.1-Allelen erkannt werden. Diese Motive werden dann verwendet, um T-Zellepitope von dem erwünschten Antigen zu definieren, insbesondere jene, die mit HIV-1 verbunden sind, für den die Aminosäuresequenz des potentiellen Antigen-Zielmoleküls oder Autoantigen-Zielmoleküls bekannt ist.
Epitope auf einer Anzahl von potentiellen Zielproteinen können auf diese Art und Weise identifiziert werden.
Peptide, die die Epitope von diesen Antigenen enthalten, werden synthetisiert und dann auf ihre Fähigkeit hin getestet, an geeignete MHC-Moleküle in Tests zu binden, die, beispielsweise, gereinigte Klasse I-Moleküle und radio-jodierte Peptide und/oder Zellen verwenden, die leere Klasse I-Moleküle exprimieren, durch, beispielsweise, Immunfluoreszenzfärbung und Flussmicrofluorometrie, Peptid-abhängige Klasse I-Assemblierungstests und Inhibierung von CTL-Erkennung durch Peptidkompetition. Jene Peptide, die an das Klasse I-Molekül binden, werden weiter hinsichtlich ihrer Fähigkeit evaluiert, als Zielmoleküle für CTLs zu dienen, die aus infizierten oder immunisierten Personen stammen, ebenso wie hinsichtlich ihrer Fähigkeit, primäre in vitro oder in vivo CTL-Antworten zu induzieren, die CTL-Populationen hervorbringen können, die in der Lage sind, mit viral infizierten Zielzellen oder Tumorzellen als potentiell therapeutische Agenzien zu reagieren.
Die Antigene der MHC-Klasse I werden durch die HLA-A-, B- und C-Orte codiert. HLA-A- und B-Antigene werden auf der Zelloberfläche mit in etwa gleichen Dichten exprimiert, wohingegen die Expression von HLA-C signifikant geringer ist (vielleicht soviel wie zehnfach geringer). Ein jeder dieser Orte weist eine Anzahl von Allelen auf. Die Peptid-bindenden Motive der Erfindung sind vergleichsweise spezifisch für einen jeden Allel-Subtyp.
Für Peptid-basierte Vakzine umfassen die Peptide der vorliegenden Erfindung bevorzugterweise ein Motiv, das von einem MHC I-Molekül erkannt wird, das eine weite Verteilung in der menschlichen Population aufweist. Da die MHC-Allele mit unterschiedlichen Häufigkeiten innerhalb unterschiedlicher ethnischer Gruppen und Rassen auftreten, kann die Auswahl eines Ziel-MHC-Allels von der Zielpopulation abhängen. Tabelle 1 zeigt die Häufigkeit verschiedener Allele an den HLA-A-Ortsprodukten bei verschiedenen Rassen. Beispielsweise kann die Mehrheit der kaukasischen Population durch Peptide abgedeckt werden, die an vier HLA-A-Allelsubtypen binden, genauer HLA-A2.1, A1, A3.2 und A24.1. In ähnlicher Weise wird die asiatische Population mit der Zugabe von Peptiden umfasst, die an ein fünftes Allel HLA-A11.2 binden.
TABELLE 1

Tabelle Zusammengestellt von B. DuPont, Immunobiology of HLA, Band I, Histocompatibility Testing 1987, Springer-Verlag, New York 1989.
*N – negroid; A = asiatisch; C = kaukasisch. Die Zahlen in Klammern geben die in der Analyse enthaltene Anzahl von Personen wieder.

Die Nomenklatur, die verwendet wird, um Peptidverbindungen zu beschreiben, folgt der üblichen Praxis, bei der die Aminogruppe auf der linken Seite (dem N-Terminus) und die Carboxylgruppe auf der rechten Seite (dem C-Terminus) eines jeden Aminosäurerestes angegeben ist. Bei den Formeln, die ausgewählte spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, liegen die Amino- und Carboxyl-terminalen Gruppen, obwohl nicht spezifisch gezeigt, in der Form vor, die sie bei physiologischen pH-Werten annehmen würden, sofern nicht anders angegeben. In den Aminosäurestrukturformeln wird im allgemeinen ein jeder Rest durch standardmäßige drei Buchstaben- oder Einbuchstabenbezeichnungen wiedergegeben. Die L-Form eines Aminosäurerestes wird durch einen großen Einzelbuchstaben oder einen großen ersten Buchstaben eines dreibuchstabigen Symbols angegeben, und die D-Form für jene Aminosäuren in der D-Form wird durch einen kleinen Einzelbuchstaben oder ein kleines Dreibuchstabensymbol angegeben. Glycin weist kein asymmetrisches Kohlenstoffatom auf und wird einfach als „Gly" oder G angegeben.
Die Verfahrensweisen, die verwendet werden, um Peptide der vorliegenden Erfindung zu identifizieren, folgen allgemein den Verfahren, wie sie in Falk et al., Nature 351:290 (1991) offenbart sind, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Kurz gesagt umfassen die Verfahren eine Isolierung von MHC-Molekülen der Klasse I im großem Maßstab, typischerweise durch Immunpräzipitation oder Affinitätschromatographie, aus der geeigneten Zelle oder Zelllinie. Beispiele für andere Verfahren zum Isolieren des erwünschten MHC-Moleküls, die den Fachleuten im gleichen Maße gut bekannt sind, umfassen Ionenaustauschchromatographie, Lectin-Chromatographie, Größenausschluss-Hochleistungsligandenchromatographie und eine Kombination aller vorstehender Techniken.
Im typischen Falle wird eine Immunpräzipitation verwendet, um das erwünschte Allel zu isolieren. Eine Anzahl von Protokollen kann verwendet werden, abhängig von der Spezifität der verwendeten Antikörper. Beispielsweise können Allel-spezifische mAb-Reagenzien verwendet werden für die Affinitätsreinigung der HLA-A-, HLA-B₁- und HLA-C-Moleküle. Mehrere mAb-Reagenzien für die Isolierung von HLA-A-Molekülen sind verfügbar. Der monoklonale Antikörper BB7.2 ist für die Isolierung von HLA-A2-Molekülen geeignet. Affinitätssäulen, die mit diesen mAbs unter Verwendung von Standardtechniken präpariert sind, werden erfolgreich verwendet, um die entsprechenden HLA-A-Allel-Produkte zu isolieren.
Zusätzlich zu den Allel-spezifischen mAbs könnten breit reaktive anti-HLA-A, B, C-mAbs, wie beispielsweise W6/32 und B9.12.1 und ein anti-HLA-B, C-mAb, B1.23.2, in alternativen Affinitätseinigungsprotokollen verwendet werden, wie im Beispielsteil unten beschrieben.
Die an die Peptidbindungsspalte der isolierten MHC-Moleküle gebundenen Peptide werden typischerweise unter Verwendung von Säurebehandlung isoliert. Peptide können auch von Klasse I-Molekülen durch eine Vielzahl von Standarddenaturierungsmitteln dissoziiert werden, wie beispielsweise Hitze, pH, Detergenzien, Salze, chaotrope Agenzien oder eine Kombination davon.
Peptid-Fraktionen werden weiter von den MHC-Molekülen durch Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) getrennt und sequenziert. Peptide können durch eine Vielzahl von anderen Standardmitteln getrennt werden, die den Fachleuten gut bekannt sind, einschließlich Filtration, Ultrafiltration, Elektrophorese, Größenchromatographie, Präzipitation mit spezifischen Antikörpern, Ionenaustauschchromatographie, isoelektrische Fokussierung und dergleichen.
Die Sequenzierung der isolierten Peptide kann durchgeführt werden gemäß Standardtechniken wie beispielsweise Edman-Abbau (Hunkapiller, M. W., et al., Methods Enzymol, 91, 399 [1983]). Andere Verfahren, die für die Sequenzierung geeignet sind, umfassen Massenspektrometriesequenzierung einzelner Peptide, wie kürzlich beschrieben (Hunt, et al., Science 225:1261 (1992), was hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist). Aminosäuresequenzierung von Batch-heterogenen Peptiden (z. B. gepoolte HPLC-Fraktionen) von verschiedenen Klasse I-Molekülen offenbart typischerweise ein charakteristisches Sequenzmotiv für ein jedes Allel der Klasse I.
Die Definition von Motiven, die für verschiedene Allele der Klasse I spezifisch sind, erlaubt die Identifizierung von potentiellen Peptidepitopen von einem antigenen Protein, dessen Aminosäuresequenz bekannt ist. Typischerweise wird die anfängliche Identifizierung potentieller Peptidepitope durchgeführt unter Verwendung eines Computers, um die Aminosäuresequenz eines erwünschten Antigens auf die Anwesenheit von Motiven abzurastern. Die Epitopsequenzen werden dann synthetisiert. Die Fähigkeit, MHC-Moleküle zu binden, wird auf einer Anzahl von Wegen bestimmt. Ein Mittel ist ein Klasse I-Molekül-Bindungstest, wie er in den verwandten, oben angegebenen Anmeldungen beschrieben ist. Andere, in der Literatur beschriebene Alternativen umfassen die Inhibierung der Antigenpräsentation (Sette, et al., J. Immunol. 141: 3893 (1991), in vitro – Assemblierungstests (Townsend, et al., Cell 62: 285 (1990), und FACS-basierte Tests unter Verwendung von mutierten Zellen, wie bspw. RMA.S (Melief, et al., Eur. J. Immunol. 21: 2963 (1991)).
Als nächstes werden Peptide, die im MHC I-Klassen-Bindungstest positiv sind, auf ihre Fähigkeit hin getestet, spezifische CTL-Antworten in vitro zu induzieren. Beispielsweise können Antigen-präsentierende Zellen, die mit einem Peptid inkubiert worden sind, auf die Fähigkeit hin getestet werden, CTL-Antworten in Responder-Zell-Populationen zu induzieren. Antigenpräsentierende Zellen können normale Zellen wie bspw. mononukläre Zellen des peripheren Blutes oder dendritische Zellen sein (Inaba, et al., J. Exp. Med. 166: 182 (1987); Boog, Eur. J. Immunol. 18: 219 [1988]).
Alternativ werden mutierte Säugetierzelllinien, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit defizient sind, Klasse I-Moleküle mit intern prozessierten Peptiden aufzuladen, wie die Maus-Zelllinien RMA-S (Kärre et al., Nature 319: 675 (1986); Ljunggren et al., Eur. J. Immunol. 21: 2963-2970 (1991)) und das menschliche somatische T-Zellhybrid T-2 (Cerundolo et al., Nature 345: 449-452 (1990)), und die mit den geeigneten menschlichen Klasse I-Genen transfiziert worden sind, in passender Weise verwendet, wenn Peptid zu ihnen zugegeben wird, um die Fähigkeit des Peptids zu testen, in vitro primäre CTL-Antworten zu induzieren. Andere eukaryotische Zelllinien, die verwendet werden könnten, umfassen verschiedene Insektenzelllinien wie bspw. Zelllinien von Moskitolarven (ATCC-Zelllinien CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), der Seidenraupe (ATCC CRL 8851), Armyworm (ATCC CRL 1711), der Motte (ATCC CCL 80) und von Drosophila wie bspw. eine Schneider-Zelllinie (siehe Schneider J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353-365 [1927]).
Lymphozyten des peripheren Blutes werden in passender Weise nach einer einfachen Venenpunktierung oder einer Leukaphorese normaler Spender oder Patienten isoliert und als Responder-Zellenquelle für CTL-Vorläufer verwendet. In einer Ausführungsform werden die geeigneten Antigen-präsentierenden Zellen mit 10-100 μM Peptid in serumfreiem Medium für 4 Stunden unter geeigneten Kulturbedingungen inkubiert. Die Peptid-beladenen Antigen-präsentierenden Zellen werden dann mit den Responder-Zellpopulationen in vitro für 7 bis 10 Tage unter optimierten Kulturbedingungen inkubiert. Eine positive CTL-Aktivierung kann bestimmt werden, indem die Kulturen auf die Anwesenheit von CTLs getestet werden, die radioaktiv markierte Zielzellen abtöten, sowohl spezifische Peptid-gepulste Ziele als auch Zielzellen, die eine endogen prozessierte Form des relevanten Virus- oder Tumorantigens exprimieren, von dem die Peptidsequenz abgeleitet wurde.
Die Spezifität und MHC-Restriktion der CTL wird bestimmt, indem gegen verschiedene Peptidzielzellen getestet wird, die geeignetes oder ungeeignetes menschliches MHC der Klasse I exprimieren. Die Peptide, die in dem MHC-Bindungstest positiv getestet werden und spezifische CTL-Antworten ergeben, werden hierein als immunogene Peptide bezeichnet.
Die immunogenen Peptide können synthetisch oder durch rekombinante DNA-Technologie oder aus natürlichen Quellen wie bspw. ganzen Viren oder Tumoren hergestellt werden. Obwohl das Peptid bevorzugterweise im wesentlichen frei sein wird von anderen natürlicherweise vorkommenden Wirtszellproteinen und Fragmenten davon, können in einigen Ausführungsformen die Peptide synthetisch mit nativen Fragmenten oder Partikeln konjugiert sein.
Die Polypeptide oder Peptide können eine Vielzahl von Längen aufweisen, entweder in ihren neutralen (unveränderten) Formen oder in Formen, die Salze sind, und entweder frei von Modifikationen wie bspw. Glykosylierung Seitenkettenoxidation oder Phosphorylierung sein, oder diese Modifikationen enthalten, vorbehaltlich dessen, dass die Modifikation die biologische Aktivität der Polypeptide, wie hierin beschrieben, nicht zerstört.
Wünschenswerterweise wird das Peptid so klein wie möglich sein, während es noch im wesentlichen alle biologischen Eigenschaften des großen Peptids beibehält. Wenn möglich kann es wünschenswert sein, die Peptide der Erfindung auf eine Länge von 9 oder 10 Aminosäurereste in Übereinstimmung mit endogen prozessierten viralen Peptiden oder Tumorzellpeptiden zu optimieren, die an MHC-Moleküle der Klasse I auf der Zelloberfläche gebunden sind.
Peptide mit der erwünschten Aktivität können modifiziert sein wie es erforderlich ist, um bestimmte erwünschte Eigenschaften aufzuweisen, z.B. verbesserte pharmakologische Eigenschaften, während im wesentlichen die ganze biologische Aktivität des unmodifizierten Peptids, an das erwünschte MHC-Molekül zu binden und die geeignete T-Zelle zu aktivieren, erhöht oder wenigstens beibehalten wird. Beispielsweise können die Peptide verschiedenen Änderungen unterworfen sein wie bspw. Substitutionen, entweder konservative oder nichtkonservative, wobei derartige Änderungen bestimmte Vorteile bei ihrer Verwendung mit sich bringen wie bspw. verbesserte MHC-Bindung. Unter konservativen Substitutionen wird das Ersetzen eines Aminosäurerestes durch einen anderen verstanden, der biologisch und/oder chemisch ähnlich ist, z.B. ein hydrophober Rest durch einen anderen oder ein polarer Rest durch einen anderen. Die Substitutionen umfassen Kombinationen wie bspw. Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr. Wie Wirkung von einzelnen Aminosäuresubstitutionen kann auch sondiert werden durch D-Aminosäuren. Derartige Modifikationen können vorgenommen werden unter Verwendung gut bekannter Peptidsyntheseverfahren, wie z.B. beschrieben in Merrifield, Science 232: 341-347 (1986), Barany und Merrifield, The Peptides, Gross und Meienhofer, Hrsg. (N.Y., Academic Press), Seiten 1-284 (1979); und Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford I11., Pierce), 2. Auflage (1984), hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Die Peptide können auch modifiziert sein durch Verlängern oder Verkürzen der Aminosäuresequenz der Verbindung bspw. durch Addition oder Deletion von Aminosäuren. Die Peptide oder Analoga der Erfindung können auch durch Ändern der Reihenfolge oder Zusammensetzung bestimmter Reste modifiziert werden, wobei leicht anerkannt wird, dass bestimmte Aminosäurereste für die biologische Aktivität essentiell sind, bspw. können jene an kritischen Kontaktstellen oder konservierte Reste im allgemeinen nicht geändert werden, ohne nachteilige Wirkung auf die biologische Aktivität. Die nicht-kritischen Aminosäuren brauchen nicht auf jene beschränkt zu sein, die natürlicherweise in Proteinen auftreten, wie bspw. L-α-Aminosäuren oder ihre D-Isomeren, sondern können auch nicht-natürliche Aminosäuren umfassen, wie bspw. β-γ-δ-Aminosäuren, ebenso wie viele Derivate von L-α-Aminosäuren.
Typischerweise wird eine Reihe von Peptiden mit einzelnen Aminosäuresubstitutionen verwendet, um die Wirkung von elektrostatischer Ladung, Hydrophobie etc. auf das Binden zu bestimmen. Beispielsweise wird eine Reihe von positiv geladenen (z.B. Lys order Arg) oder negativ geladenen (z.B. Glu) Aminosäuresubstitutionen entlang der Länge des Peptids vorgenommen, was unterschiedliche Empfindlichkeitsmuster gegenüber verschiedenen MHC-Molekülen und T-Zellrezeptoren enthüllt. Zusätzlich können mehrfache Substitutionen unter Verwendung kleiner, vergleichsweise neutraler Molekülteile wie Ala, Gly, Pro oder ähnlicher Reste vorgenommen werden. Die Substitutionen können Homo-Oligomere oder Hetero-Oligomere sein. Die Anzahl und die Arten der Reste, die substituiert oder hinzugefügt sind, hängen von dem Abstand ab, der zwischen essentiellen Kontaktpunkten und bestimmten funktionalen Eigenschaften, die nachgesucht werden (wie z.B. Hydrophobie gegenüber Hyd rophilie), erforderlich ist. Eine verglichen mit der Affinität des Elternpeptids erhöhte Bindungsaffinität für ein MHC-Molekül oder einen T-Zellrezeptor kann auch durch derartige Substitutionen erreicht werden. Auf jeden Fall sollten derartige Substitutionen Aminosäurereste oder andere Molekülfragmente verwenden, die so ausgewählt sind, dass, bspw., eine sterische oder durch die Ladung bedingte Störung vermieden wird, was die Bindung zerreißen könnte.
Aminosäuresubstitutionen betreffen typischerweise einzelne Reste. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder irgendeine Kombination davon können miteinander kombiniert werden, um zu einem letztendlichen Peptid zu gelangen. Substitutionsvarianten sind jene, bei denen wenigstens ein Rest eines Peptids entfernt worden ist und ein anderer Rest an seiner Stelle eingefügt ist. Derartige Substitutionen werden im allgemeinen gemäß der folgenden Tabelle 2 durchgeführt, wenn es erwünscht ist, die Eigenschaften des Peptids fein zu modulieren.
TABELLE 2
Wesentliche Änderungen der Funktion (z. B. Affinität für MHC-Moleküle oder T-Zellrezeptoren) werden herbeigeführt durch Auswählen von Substitutionen, die weniger konservativ sind als jene von Tabelle 2, d. h. durch Auswählen von Resten, die sich hinsichtlich ihrer Wirkung bei der Aufrechterhaltung (a) der Struktur des Peptidrückgrats im Bereich der Substitution, z. B. als eine Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Größe der Seitenkette erheblicher unterscheiden. Die Substitutionen, von denen allgemein erwartet wird, dass sie die größten Veränderungen in den Peptideigenschaften herbeiführen, werden jene sein, bei denen (a) ein hydrophiler Rest, z. B. Seryl, ausgetauscht wird für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, ausgetauscht wird für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z. B. Glutamyl oder Aspartyl; oder (c) ein Rest mit einer großen Seitenkette, z. B. Phenylalanin, ausgetauscht wird für (oder durch) einen ohne Seitenkette, z. B. Glycin.
Die Peptide können auch Isostere von zwei oder mehr Resten im immunogenen Peptid umfassen. Ein Isoster, wie hierin definiert, ist eine Sequenz aus zwei oder mehr Resten, die eine zweite Sequenz ersetzten kann, da die sterische Konformation der ersten Sequenz an eine Bindungsstelle passt, die für die zweite Sequenz spezifisch ist. Der Begriff umfasst spezifisch Peptidrückgratmodifikationen, die den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind. Derartige Modifikationen umfassen Modifikationen des Amidstickstoffs, des α-Kohlenstoffs, des Amidcarbonyls, vollständige Ersetzung der Amidbindung, Verlängerungen, Deletionen oder Rückgratquervernetzungen. Siehe allgemein Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, peptides and Proteins, Band VII (Weinstein Hrsg.., 1983).
Modifikationen von Peptiden mit verschiedenen Aminosäuremimetika oder nicht natürlichen Aminosäuren, sind besonders nützlich bei der Erhöhung der Stabilität der Peptide in vivo. Die Stabilität kann auf vielen Wegen getestet werden. Beispielsweise sind Peptidasen und verschiedene biologische Medien, wie beispielsweise menschliches Plasma und Serum, verwendet worden, um Stabilität zu testen. Siehe z. B. Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin. 11:291-302 (1986). Die Halbwertszeit der Peptide der vorliegenden Erfindung wird in angemessener Weise bestimmt unter Verwendung eines Tests mit 25% menschlichem Serum (Vol/Vol). Das Protokoll lautet allgemein wie folgt. Vereinigtes menschliches Serum (Typ AB, nicht-hitzeinaktiviert) wird vor der Verwendung durch Zentrifugation von Lipiden befreit. Das Serum wird dann auf 25% mit RPMI-Gewebekulturmedien verdünnt und verwen det, um Peptidstabilität zu testen. Bei zuvor bestimmten Zeitabständen wird eine geringe Menge Reaktionslösung entfernt und zu entweder 6% wässriger Trichloressigsäure oder Ethanol hinzugegeben. Die wolkige Reaktionsprobe wird für 15 Minuten gekühlt (4°C) und dann zentrifugiert, um die präzipitierten Serumproteine zu pelletieren. Die Anwesenheit der Peptide wird dann durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Stabilität-spezifischen Chromatographiebedingungen bestimmt.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung oder Analoge davon, die eine CTL-stimulierende Aktivität aufweisen, können modifiziert sein, um erwünschte Eigenschaften aufzuweisen, die verschieden sind von einer verbesserten Serumhalbwertszeit. Beispielsweise kann die Fähigkeit der Peptide CTL-Aktivität zu induzieren, durch Verknüpfung mit einer Sequenz, die wenigstens ein Epitop umfasst, das in der Lage ist, eine T-Helferzellenantwort zu induzieren, verstärkt werden. Besonders bevorzugte immunogene Peptide/T-Helfer-Konjugate sind durch ein Abstandshaltermolekül verknüpft. Der Abstandshalter besteht typischerweise aus vergleichsweise kleinen, neutralen Molekülen wie beispielsweise Aminosäuren oder Aminosäuremimetika, die im wesentlichen unter physiologischen Bedingungen ungeladen sind. Die Abstandshalter sind typischerweise ausgewählt aus, z. B., Ala, Gly, oder anderen neutralen Abstandshaltern aus nicht-polaren Aminosäuren oder neutralen polaren Aminosäuren. Es wird verstanden werden, dass der optional vorhandene Abstandshalter nicht aus den gleichen Resten bestehen muss und somit ein Hetero- oder Homo-Oligomer sein kann. Wenn er vorhanden ist, wird der Abstandshalter üblicherweise wenigstens ein oder zwei Reste umfassen, üblichererweise drei bis sechs Reste. Alternativ kann das CTL-Peptid mit dem T-Helferpeptid ohne einen Abstandshalter verbunden sein.
Die immunogenen Peptide können mit dem T-Helferpeptid entweder direkt oder vermittels eines Abstandshalters entweder an dem Amino- oder Carboxy-Terminus des CTL-Peptids gebunden sein. Der Aminoterminus von entweder dem immunogenen Peptid oder dem T-Helferpeptid kann acyliert sein. Beispielhafte T-Helferpeptide umfassen Tetanus-Toxoid 830-843, Influenza 307-319, Malaria-Circumsporozoit 382-398 und 378-389.
In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, in die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung wenigstens einen Bestandteil aufzunehmen, der CTL initiiert. Man hat Lipide als Agenzien identifiziert, die in der Lage sind CTL in vivo gegen virale Antigene zu initiieren. Beispielsweise können Palmitinsäurereste an die alpha- und epsilon- Aminogruppen eines Lys-Restes und dann, beispielsweise durch einen oder mehrere verbindende Reste wie beispielsweise Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, oder dergleichen an ein immunogenes Peptid gebunden sein. Das mit einem Lipid versehene Peptid kann dann direkt in eine Micellenform injiziert, in ein Liposom eingebaut werden oder in einem Adjuvans emulgiert werden, beispielsweise unvollständigem Freundsches Adjuvans. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein besonders wirksames Immunogen Palmitinsäure, die an die alpha- und epsilon-Aminogruppen von Lys gebunden sind, das vermittels einer Verbindung, beispielsweise Ser-Ser, mit dem Aminoterminus des immunogenen Peptids verbunden ist.
Als ein weiteres Beispiel für Lipidinitiierung von CTL-Antworten können E. coli-Lipoproteine, wie beispielsweise Tripalmitoyl-S-Glycerylcysteinlyseryl-Serin (P₃CSS) verwendet werden, um Virus-spezifische CTL zu initiieren, wenn sie kovalent an ein geeignetes Peptid gebunden sind. Siehe Deres et al., Nature 342:561-564 (1989), was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Peptide der Erfindung können beispielsweise an P₃CSS gekoppelt und das Lipopeptid einem Lebewesen verabreicht werden, um spezifisch eine CTL-Antwort gegen das Zielantigen zu initiieren. Weiterhin können, da die Induktion von neutralisierenden Antikörpern auch mit P₃CSS initiiert werden kann, das mit einem Peptid konjugiert ist, das ein geeignetes Epitop zeigt, zwei Zusammensetzungen kombiniert werden, um wirksamer sowohl humorale als auch Zell-vermittelte Antworten auf Infektion hervorzurufen.
Zusätzlich können zusätzliche Aminosäure an den Enden eines Peptids hinzugegeben werden, um eine leichtere Verknüpfung der Peptide miteinander bereitzustellen, zum Koppeln einer Trägerstütze oder eines größeren Peptids, um die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids oder Oligopeptids oder dergleichen zu modifizieren. Aminosäuren wie beispielsweise Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin- oder Asparaginsäure und dergleichen können am C- oder N-Terminus des Peptids oder Oligopeptids eingeführt sein. Modifikationen am C-Terminus kann in einigen Fällen die Bindungseigenschaften des Peptids ändern. Zusätzlich können sich die Peptid- oder Oligopeptidsequenzen gegenüber der natürlichen Sequenz unterscheiden, indem sie durch terminale NH₂-Acylierung, beispielsweise durch Alkanoyl (C₁-C₂₀)- oder Thioglycolyl-Acetylierung, terminate Carboxylamidierung, z. B. Amonium, Methylamin etc. modifiziert sind. In einigen Fällen können diese Modifikationen Orte für die Verbindung mit einem Träger oder einem anderen Molekül bereitstellen.
Die Peptide der Erfindung können auf vielen Wegen hergestellt werden. Infolge ihrer vergleichsweise geringen Größe können die Peptide in Lösung oder an einem festen Träger gemäß herkömmlicher Techniken synthetisiert werden. Verschiedene automatisierte Synthesevorrichtungen sind kommerziell erhältlich und können gemäß bekannten Protokollen verwendet werden. Siehe z. B. Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984), aao.
Alternativ kann rekombinante DNA-Technologie verwendet werden, wobei eine Nukleotidsequenz, die ein interessierendes immunogenes Peptid codiert, in einen Expressionsvektor eingeführt wird, in eine geeignete Wirtszelle transformiert oder transfiziert wird und unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Expression geeignet sind. Diese Verfahren sind in der Technik allgemein bekannt, wie beispielsweise allgemein beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Somit können Fusionsproteine, die eine oder mehrere Peptidsequenzen der Erfindung umfassen, verwendet werden, um das geeignete T-Zellepitop zu präsentieren.
Da die codierende Sequenz für Peptide der hierin ins Auge gefassten Länge durch chemische Techniken synthetisiert werden kann, beispielsweise das Phosphotriester-Verfahren von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981), kann eine Modifikation leicht vorgenommen werden durch Substituieren der geeigneten Base(n) statt jener, die die native Peptidsequenz codieren. Die codierende Sequenz kann dann mit geeigneten Linkern versehen werden und in Expressionsvektoren ligiert werden, die üblicherweise in der Technik verfügbar sind, und die Vektoren können verwendet werden, um geeignete Wirtszellen zu transformieren, um das erwünschte Fusionsprotein zu produzieren. Eine Anzahl derartiger Vektoren und geeigneter Wirtssysteme sind nun verfügbar. Für die Expression der Fusionsproteine wird die codierende Sequenz bereitgestellt mit funktionell verknüpften Start- und Stop-Codons, Promotor- und Terminatorregionen und üblicherweise einem Replikationssystem, um einen Expressionsvektor für die Expression in dem erwünschten zellulären Wirt bereitzustellen. Beispielsweise werden Promotorsequenzen, die mit bakteriellen Wirten kompatibel sind, in Plasmiden bereitgestellt, die passende Restriktionsstellen enthalten zum Einführen der erwünschten codierenden Sequenz. Die sich ergebenden Expressionsvektoren werden in geeignete bakterielle Wirte transformiert. Natürlich können auch Hefe- oder Säugetierzellwirte unter Anwendung geeigneter Vektoren und Steuersequenzen verwendet werden.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung und pharmazeutische und Impfstoffzusammensetzungen davon sind nützlich für die Verabreichung an Säugetiere, insbesondere Menschen, um virale Infektion und Krebs zu behandeln und/oder zu verhindern. Beispiele für Erkrankungen, die unter Verwendung der immunogenen Peptide der Erfindung behandelt werden können, umfassen Prostatakrebs, Hepatitis B, Hepatitis C, AIDS, Nierenkarzinom, Zervikalkarzinom, Lymphom, CMV und Condyloma acuminatum.
Für pharmazeutische Zusammensetzungen werden die immunogenen Peptide der Erfindung einem Lebewesen verabreicht, das bereits an Krebs erkrankt ist oder mit dem interessierenden Virus infiziert ist. Jene in der Inkubationsphase oder der akuten Phase der Infektion können mit immunogenen Peptiden getrennt oder in Verbindung mit anderen Behandlungen behandelt werden, wie angemessen. Bei therapeutischen Anwendungen werden einem Patienten Zusammensetzungen in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um eine wirksame CTL-Antwort auf den Virus oder das Tumorantigen hervorzurufen und die Symptome und/oder Komplikationen zu heilen oder wenigstens teilweise zu stoppen. Eine Menge, die angemessen ist, um dies zu erreichen, wird als „therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Mengen, die für diese Anwendung wirksame sind, werden, beispielsweise, von der Peptidzusammensetzung, der Art der Verabreichung, dem Zustand, dem Grad und der Schwere der zu behandelnden Erkrankung, dem Gewicht und dem generellen Gesundheitszustand des Patienten und dem Urteil des verschreibenden Arztes abhängen, aber im allgemeinen für die anfängliche Immunizierung (d. h. für die therapeutische oder prophylaktische Verabreichung) von etwa 1,0 μg bis etwa 5.000 μg Peptid für ein 70 kg Patienten reichen, gefolgt von Auffrischungsdosierungen von etwa 1,0 μg bis etwa 1.000 μg Peptid gemäß einem Auffrischungsschema über Wochen bis Monate, abhängig von der Reaktion des Patienten und dem Zustand des Patienten durch Messen spezifischer CTL-Aktivität im Blut des Patienten. Man muss berücksichtigen, dass die Peptide und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung allgemein bei schweren Erkrankungszuständen verwendet werden können, d. h. lebensbedrohlichen oder potentiell lebensbedrohlichen Situationen. Bei derartigen Fällen ist es mit Blick auf die Minimierung von Fremdsubstanzen und der vergleichsweise untoxischen Natur der Peptide möglich und kann von dem behandelnden Arzt als wünschenswert empfunden werden, erhebliche Überschüsse dieser Peptidzusammensetzungen zu verabreichen.
Für die therapeutische Anwendung sollte die Verabreichung beim ersten Zeichen einer viralen Infektion oder dem Nachweis oder der chirurgischer Entfernung von Tumoren oder kurz nach der Diagnose im Falle einer akuten Infektion beginnen. Dem folgen Auffrischungsdosierungen, bis wenigstens Symptome wesentlich verringert sind, und für eine Zeitspanne danach. Bei chronischer Infektion können Beladungsdosierungen gefolgt von Auffrischungsdosierungen erforderlich sein.
Die Behandlung einer infizierten Person mit den Zusammensetzungen der Erfindung kann die Lösung der Infektion bei akut infizierten Personen beschleunigen. Für diese Personen, die dafür empfänglich (oder prädisponiert) sind, eine chronische Infektion zu entwickeln, sind die Zusammensetzungen besonders nützlich bei Verfahren zur Verhinderung der Entwicklung von einer akuten in eine chronische Infektion. Wo die empfänglichen Personen vor oder während der Infektion identifiziert werden, beispielsweise wie hierin beschrieben, kann die Zusammensetzung ihnen spezifisch verabreicht werden, wodurch die Notwendigkeit, eine größere Population zu behandeln, minimiert wird.
Die Peptidzusammensetzungen können auch für die Behandlung von chronischen Infektionen verwendet werden und um das Immunsystem zu stimulieren, Virus-infizierte Zellen in Trägern zu eliminieren. Es ist wichtig, eine Menge von immunpotenzierendem Peptid in einer Formulierung und eine Verabreichungsart bereitzustellen, die ausreichend ist, um wirksam eine zytotoxische T-Zellantwort zu stimulieren. Somit ist für die Behandlung einer chronischen Infektion eine typische Dosis im Bereich von etwa 1,0 μg bis etwa 5.000 μg, bevorzugterweise etwa 5 μg bis 1.000 μg für einen 70 kg Patienten pro Dosis. Immunisierungsdosierungen, gefolgt von Auffrischungsdosierungen in etablierten Zeitabständen z. B. von einer bis vier Wochen, können erforderlich sein, möglicherweise für eine längere Zeitspanne, um eine Person wirksam zu immunisieren. Im Falle einer chronischen Infektion sollte die Verabreichung solange fortgesetzt werden, bis wenigstens klinische Symptome oder Labortests anzeigen, dass die virale Infektion eliminiert oder im wesentlichen gestoppt ist, und für eine Zeitspanne danach.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen für die therapeutische Behandlung sind für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung bestimmt. Bevorzugterweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, z. B. intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär verabreicht. Die Erfindung stellt somit Zusammensetzungen für die paren terale Verabreichung bereit, die eine Lösung des immunogenen Peptids enthalten, das in einem akzeptablem Träger, bevorzugterweise einem wässrigen Träger, gelöst oder suspendiert ist. Eine Vielzahl von wässrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,8% Saline, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, gut bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert oder steril filtriert werden. Die sich ergebenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung wie sie sind abgepackt oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat mit einer sterilen Lösung vor der Verabreichung zusammengegeben wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe enthalten, wie sie erforderlich sind, um sich physiologischen Zuständen anzunähern, wie beispielsweise pH-einstellende und Pufferagenzien, die Tonizität-einstellende Agenzien, Benetzungsmittel und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat etc.
Die Konzentration an CTL-stimmulatorischen Peptiden der Erfindung in den pharmazeutischen Formulierungen kann über große Bereiche variieren, d. h. von weniger als etwa 0,1%, gewöhnlicherweise bei oder wenigstens etwa 2%, zu soviel wie 20% bis 50% oder mehr (bezogen auf das Gewicht) und wird in erster Linie durch Fluidvolumina, Viskositäten etc. gemäß der speziell ausgewählten Verabreichungsart ausgewählt werden.
Die Peptide der Erfindung können auch vermittels Liposomen verabreicht werden, die dazu dienen, die Peptide an ein spezielles Gewebe zu bringen, wie beispielsweise Lymphgewebe, oder selektiv infizierte Zellen targetieren, ebenso wie die Halbwertszeit der Peptidzusammensetzung zu erhöhen. Liposomen umfassen Emulsionen, Schäume, Micellen, unlösliche Monolayer, Flüssigkristalle, Phospholipiddispersionen, lamellare Schichten und dergleichen. Bei diesen Präparaten ist das abzugebende Peptid als Teil eines Liposoms eingebaut, alleine oder in Verbindung mit einem Molekül, das, beispielsweise, an einen Rezeptor bindet, der in Lymphzellen weit verbreitet ist, wie beispielsweise monoklonale Antikörper, die an das CD45-Antigen binden, oder mit anderen therapeutischen oder immunogenen Zusammensetzungen. Somit können Liposomen, die entweder mit einem erwünschten Peptid der Erfindung gefüllt oder damit versehen sind, direkt an den Ort von Lymphzellen gesteuert werden, wo die Liposomen dann die ausgewählten therapeutischen/immunogenen Peptidzusammensetzungen abgeben. Liposomen für die Verwendung im Rahmen der Erfindung werden aus standardmäßigen Vesikel-bildenden Lipiden ausgebildet, die im allgemeinen neutrale oder negativ gela dene Phospholipide und ein Sterol, wie beispielsweise Cholesterol, enthalten. Die Auswahl von Lipiden wird im allgemeinen bestimmt durch Überlegungen wie beispielsweise Liposomengröße, Säurelabilität und Stabilität der Liposomen im Blutstrom. Eine Vielzahl von Verfahren zum Herstellen von Liposomen sind verfügbar, wie, beispielsweise beschrieben in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), und in den US-Patenten 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 und 5,019,369, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Zum Targetieren der Immunzellen kann ein in das Liposom einzubauender Ligand beispielsweise Antikörper oder Fragmente davon enthalten, die für Zelloberflächendeterminanten der erwünschten Immunsystemzellen spezifisch sind. Eine Liposomensuspension, die ein Peptid enthält, kann intravenös, lokal, topisch etc. in einer Dosierung verabreicht werden, die, unter anderem, entsprechend der Art der Verabreichung, dem abzugebendem Peptid und dem Stadium der zu behandelnden Krankheit variiert.
Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche nicht-toxische feste Träger verwendet werden, die, beispielsweise, Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Zellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen pharmazeutischer Qualitätsstufen enthalten. Für die orale Verabreichung wird eine pharmazeutisch akzeptable nicht-toxische Zusammensetzung ausgebildet durch Einbauen der normalerweise verwendeten Bindemittel, wie beispielsweise die zuvor aufgelisteten Träger, und im allgemeinen 10 bis 95% des aktiven Bestandteils, d. h. eines oder mehrerer Peptide der Erfindung und bevorzugterweise bei einer Konzentration von 25 bis 75%.
Für die Aerosol-Verabreichung werden die immunogenen Peptide bevorzugterweise in fein verteilter Form zusammen mit einem oberflächenaktiven Agens und einem Treibmittel bereitgestellt. Typische Prozentzahlen an Peptid sind 0,01 bis 20 Gew.-%, bevorzugterweise 1% bis 10%. Das oberflächenaktive Mittel muss, natürlich, nicht-toxisch sein und bevorzugterweise löslich sein in dem Treibmittel. Typische derartige Agenzien sind die Ester oder Teilester von Fettsäuren, die von 6 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, wie beispielsweise Capronsäure, Octansäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Linolsäure, Linolensäure, olesterische Säure und Oleinsäure mit einem aliphatischen, mehrere Hydroxylgruppen enthaltenden Alkohol oder sein zyklisches Anhydrid. Mischester, wie beispielsweise gemischte oder natürliche Glyceride können verwendet werden. Das oberflächenaktive Agens kann 0,1 bis 20 Gew.-% der Zusammensetzung ausmachen, bevorzugterweise 0,25 bis 5%. Der Rest der Zusammen setzung ist üblicherweise Treibmittel. Ein Träger kann, sofern erwünscht, auch verwendet werden, wie beispielsweise Lecithin für die intranasale Abgabe.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Vakzine, die als einen aktiven Bestandteil eine immunogen wirksame Menge eines immunogenen Peptids enthalten, wie hierin beschrieben, oder eine Nukleinsäure, die dafür codiert. Das/die Pepitd(e) oder Nukleinsäuren können in einen Wirt eingeführt werden, einschließlich den Menschen, geknüpft an seinen eigenen Träger oder als ein Homopolymer oder Heteropolymer aktiver Peptideinheiten. Ein derartiges Polymer weist den Vorteil einer erhöhten immunologischen Reaktion auf und, wo verschiedene Peptide verwendet werden, um das Polymer auszubilden, die zusätzliche Fähigkeit, Antikörper und/oder CTLs zu induzieren, die mit verschiedenen antigenen Determinanten des Virus oder der Tumorzellen reagieren. Nützliche Träger sind in der Technik bekannt und umfassen, beispielsweise, Thyroglobulin, Albumin wie beispielsweise menschliches Serumalbumin, Tetanustoxoid, Polyaminosäuren wie beispielsweise Poly(Lysin:Glutaminsäure), Influenza, Hepatitis B-Virus-Kernprotein, rekombinates Hepatitis B-Virus-Vakzin und dergleichen. Die Vakzine können auch ein physiologisch tolerierbares (akzeptables) Verdünnungsmittel wie beispielsweise Wasser, Phosphat-gepufferte Saline oder Saline enthalten, und enthalten typischerweise weiter ein Adjuvans. Adjuvanzien wie beispielsweise unvollständiges Freundsches Adjuvans, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid oder Aluminiumsulfat sind Materialien, die in der Technik gut bekannt sind. Wie oben erwähnt können CTL-Antworten initiiert werden durch Konjugieren von Peptiden der Erfindung mit Lipiden, wie beispielsweise P₃CSS. Nach Immunisierung mit einer Peptidzusammensetzung, wie hierin beschrieben, vermittels Injektion, Aerosol, oraler, transdermaler oder anderer Route antwortet das Immunsystem des Wirtes auf das Vakzin durch Produzieren großer Mengen an CTLs, die für das erwünschte Antigen spezifisch sind, und der Wirt wird wenigstens teilweise für eine spätere Infektion immun oder resistent, eine chronische Infektion zu entwickeln.
Vakzinzusammensetzungen, die die Peptide der Erfindung enthalten, werden einem Patienten verabreicht, der für eine virale Infektion oder Krebs empfänglich ist oder für den ansonsten ein diesbezügliches Risiko besteht, um eine Immunantwort gegen das Antigen hervorzurufen und somit die eigenen Immunantwortmöglichkeiten des Patienten zu verstärken. Eine derartige Menge ist als eine „immunogen wirksame Dosis" definiert. Bei dieser Verwendung hängen die genauen Mengen vom Gesundheitszustand und Gewicht, der Verabreichungsweise, der Art der Formulierung etc. ab, reicht aber im allgemeinen von etwa 1,0 μg bis etwa 5.000 μg pro 70 Kilogramm Patient, üblichererweise von etwa 10 μg bis etwa 500 μg pro 70 kg Körpergewicht.
Bei einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Peptidvakzine der Erfindung mit Vakzinen zu kombinieren, die neutralisierende Antikörperantworten gegen den interessierenden Virus induzieren, insbesondere gegen virale Hüllantigene.
Für therapeutische Immunisierungszwecke können die Peptide der Erfindung auch durch attenuierte virale Wirte, wie beispielsweise Vaccinia oder Fowlpox exprimiert werden. Dieser Ansatz umfast die Verwendung von Vaccinia-Virus als einen Vektor, um Nukleotidsequenzen zu exprimieren, die die Peptide der Erfindung codieren. Nach Einführung in einen akut oder chronisch infizierten Wirt oder in einen nicht-infizierten Wirt exprimiert der rekombinante Vaccinia-Virus das immunogene Peptide und ruft dadurch eine CTL-Antwort im Wirt hervor. Vaccinia-Vektoren und Verfahren, die bei den Immunisierungsprotokollen nützlich sind, sind, beispielsweise, in US Patent 4,722,848 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Ein anderer Vektor ist BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG-Vektoren sind in Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)) beschrieben, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Eine große Vielzahl anderer Vektoren, die bei der therapeutischen Verabreichung oder Immunisierung der Peptide der Erfindung nützlich sind, beispielsweise Salmonella typhi-Vektoren und dergleichen, werden für die Fachleute ausgehend von der Beschreibung hierin offenkundig sein.
Nukleinsäuren, die ein oder mehrere der Peptide der Erfindung codieren, können ebenfalls dem Patienten verabreicht werden. Dieser Ansatz ist, beispielsweise, in Wolff et. al., Science 247:1465-1468 (1990) ebenso wie in den US-Patenten 5,580,859 und 5,589,466 beschrieben.
Ein bevorzugtes Mittel zum Verabreichen von Nukleinsäuren, die die Peptide der Erfindung codieren, verwendet Minigen-Konstrukte, die Mehrfachepitope der Erfindung codieren. Um eine DNA-Sequenz zu erzeugen, die die ausgewählten CTL-Epitope (Minigene) für die Expression in menschlichen Zellen codiert, werden die Aminosäuresequenzen der Epitope revers translatiert. Eine Tabelle mit der menschlichen Codon-Verwendung wird verwendet, um die Auswahl des Codons für eine jede Aminosäure zu steuern. Diese Epitop-codierenden DNA-Sequenzen sind direkt miteinander verbunden, wodurch eine durchgängige Polypeptidsequenz erzeugt wird. Um die Expression und/oder Immunisierungsstärke zu optimieren, können zusätzliche Elemente in die Minigen-Konstruktion eingebaut sein. Beispiele für Aminosäuresequenzen, die revers translatiert werden und in der Minigensequenz enthalten sein könnten, umfassen: Helfer-T-Lymphozyten-Epitope, eine Leader (Signal)-Sequenz und ein Retentionssignal des endoplasmatischen Retikulums. Zusätzlich kann die MHC-Präsentation von CTL-Epitopen verbessert werden, indem synthetische (z. B. Poly-Alanin) oder natürlicherweise auftretende flankierende Sequenzen benachbart dem CTL-Epitope enthalten sind.
Die Minigen-Sequenz wird in DNA umgewandelt durch Zusammenbau von Oligonukleotiden, die den Plus- und den Minus-Strang des Minigens codieren. Überlappende Oligonukleotide (30-100 Basen lang) werden synthetisiert, phosphoryliert, gereinigt und anneliert unter geeigneten Bedingungen unter Verwendung gut bekannter Techniken. Die Enden der Oligonukleotide werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase miteinander verbunden. Dieses synthetische Minigen, das das CTL-Epitoppolypeptid codiert, kann dann in einen erwünschten Expressionsvektor cloniert werden.
Standardmäßige regulatorische Sequenzen, die den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, sind in dem Vektor enthalten, um eine Expression in den Zielzellen zu gewährleisten. Mehrere Vektorelemente sind erforderlich: ein Promotor mit einer stromabwärtigen Clonierungsstelle für die Minigeneinfügung; ein Polyadenylierungs-Signal für eine wirksame Transkriptionstermination; ein E. coli-Replikationsursprung; und ein in E. coli selektierbarer Marker (z. B. Ampicillin- oder Kanamycin-Resistenz). Viele Promotoren können zu diesem Zweck verwendet werden, z. B. der menschliche Cytomegalovirus (hCMV)-Promotor. Siehe US Patente 5,580,859 und 5,589,466 für andere geeignete Promotorsequenzen.
Zusätzliche Vektormodifikationen können erwünscht sein, um die Minigen-Expression und Immunisierungsstärke zu optimieren. In einigen Fällen sind Introns für eine wirksame Genexpression erforderlich oder es könnten ein oder mehrere synthetische oder natürlich auftretende Introns in die transkribierte Region des Minigens eingebaut sein. Das Einfügen von mRNA-Stabilisierungssequenzen kann auch zur Erhöhung der Minigen-Expression in Erwägung gezogen werden. Es ist kürzlich vorgeschlagen worden, dass immunstimulatorische Sequenzen (ISSs oder CpGs) eine Rolle bei der Immunisierunsstärke von DNA-Vakzinen spielen. Diese Sequenzen können in dem Vektor, außerhalb der Minigen-codierenden Sequenz, enthalten sein, wenn man findet, dass die Immunisierungsstärke erhöht wird.
In einigen Ausführungsformen kann ein bicistronischer Expressions-Vektor verwendet werden, um die Produktion der Minigen-codierten Epitope und eines zweiten enthaltenen Proteins zu erlauben, um die Immunisierungsstärke zu erhöhen oder zu verringern. Beispiele für Proteine oder Polypeptide, die vorteilhafterweise die Immunantwort erhöhen könnten, umfassen, wenn co-exprimiert, Zytokine (z. B. IL2, IL12, GM-CSF), Zytokin-induzierte Moleküle (z. B. LeIF) oder costimulatorische Moleküle. Helfer (HTL)-Epitope könnten an intrazelluläre Targetierungssignale gebunden sein und getrennt von den CTL-Epitopen exprimiert werden. Dies könnte das Steuern der HTL-Epitope zu einem Zellkompartiment erlauben, das verschieden ist von dem der CTL-Epitope. Sofern erforderlich, würde dies einen wirksameren Eintritt von HTL-Epitopen in den MHC-Klasse II-Weg erleichtern, wodurch die CTL-Induktion verbessert wird. Im Gegensatz zu CTL-Induktion kann das spezifische Verringern der Immunantwort durch Co-Expression immunsupressiver Moleküle (z. B. TGF-β) bei bestimmten Erkrankungen nützlich sein.
Wenn ein Expressionsvektor einmal ausgewählt ist, wird das Minigen in die Polylinkerregion unterhalb des Promotors eincloniert. Dieses Plasmid wird in einen geeigneten E.coli-Stamm transformiert und DNA wird unter Verwendung von Standardtechniken präpariert. Die Orientierung und DNA Sequenz des Minigens, ebenso wie alle anderen Elemente, die im Vektor enthalten sind, wie durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Bakterielle Zellen, die das korrekte Plasmid enthalten, können als einen Masterzellbank und eine Arbeitszellbank gelagert werden.
Therapeutische Mengen von Plasmid-DNA werden durch Fermentation in E. coli hergestellt, gefolgt von Aufreinigung. Aliquots der Arbeitszellbank werden verwendet, um das Fermentationsmedium (z. B. Terrific Broth) zu inokulieren und bis zur Sättigung in Schüttelkolben oder einem Bioreaktor gemäß gut bekannten Techniken angezogen. Plasmid-DNA kann gereinigt werden unter Verwendung von standardmäßigen Biotrennverfahren wie beispielsweise Festphasen-Anionenaustauschharzen, die von Quiagen bereitgestellt werden. Sofern erforderlich, kann DNA mit einer Superwindung aus den offenen kreisförmigen und linearen Formen isoliert werden unter Verwendung von Elektrophorese oder anderen Verfahren.
Gereinigte Plasmid-DNA kann für die Injektion hergestellt werden unter Verwendung einer Vielzahl von Formulierungen. Die einfachste davon ist die Rekonstitution von lyophilisierter DNA in steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Dieser Ansatz, bekannt als „nackte DNA", wird derzeit für die intramuskuläre (IM)-Verabreichung bei klinischen Versuchen verwendet. Um die immuntherapeutischen Wirkungen von Minigen-DNA-Vakzine zu maximieren, kann ein alternatives Verfahren zur Formulierung von gereinigter Plasmid-DNA wünschenswert sein. Eine Vielzahl von Verfahren ist beschrieben worden und neue Techniken werden möglicherweise verfügbar. Kationische Lipide können ebenfalls in der Formulierung verwendet werden (siehe, z. B., wie von Debs und Zhu beschrieben (1993) WO 93/24640; Mannino und Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose US Patent Nr. 5,279,833; Brigham (1991) WO 91/06309 und Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414). Zusätzlich könnten Glycolipide, fusogene Liposomen, Peptide und Verbindungen, die kollektiv als schützend, interaktiv und nicht-kondensierend (PINC) bezeichnet werden, auch mit gereinigter Plasmid-DNA komplexiert werden, um Variablen wie beispielsweise Stabilität, intramuskuläre Dispersion, Steuerung zu spezifischen Organen oder Zelltypen zu beeinflussen.
Die Nukleinsäuren können auch unter Verwendung einer ballistischen Abgabe verabreicht werden, wie, beispielsweise, in US Patent 5,204,253 beschrieben. Partikel, die lediglich aus DNA bestehen, können verabreicht werden. Alternativ kann DNA an Partikel, wie beispielsweise Goldpartikel, befestigt sein.
Zielzellensensibilisierung kann als ein funktioneller Test für Expression und MHC-Klasse I-Präsentation von Minigen-codierten CTL-Epitopen verwendet werden. Die Plasmid-DNA wird in eine Säugetierzelllinie eingeführt, die als Ziel für standardmäßige CTL-Chrom-Freisetzungstests geeignet ist. Das verwendete Transfektionsverfahren wird von der letztendlichen Formulierung abhängen. Elektroporation kann für „nackte" DNA verwendet werden, wohingegen kationische Lipide eine direkte in vitro Transfektion erlauben. Ein Plasmid, das das Grünfluoreszenzprotein (GFP) exprimiert, kann co-transfiziert werden, um eine Anreicherung transfizierter Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) zu erlauben. Diese Zellen werden dann mit Chrom-51 markiert und als Zielzellen für Epitop-spezifische CTL-Linien verwendet. Cytolyse, nachgewiesen durch ⁵¹Cr-Freisetzung, zeigt die Produktion einer MHC-Präsentation von Minigen-codierten CTL-Epitopen an.
Die in vivo Immunisierungsstärke ist ein zweiter Ansatz für das funktionale Testen von Minigen-DNA-Formulierungen. Transgene Mäuse, die geeignete menschliche MHC-Moleküle exprimieren, werden mit dem DNA-Produkt immunisiert. Die Dosis und der Verabreichungsweg hängen von der Formulierung ab (z.B. IM für DNA in PBS, IP für Lipidkomplexierte DNA). Einundzwanzig Tage nach Immunisierung werden Milzzellen geerntet und erneut für eine Woche in Gegenwart von Peptiden stimuliert, die ein jedes getestete Epitop codiert. Diese Effektor-Zellen (CTLs) werden auf Cytolyse von mit Peptid beladenen, Chrom-51-markierten Zielzellen unter Verwendung von Standardtechniken getestet. Die Lyse von Zielzellen, die durch MHC-Beladung mit Peptiden sensibilisiert sind, die den Minigencodierten Epitopen entsprechen, zeigt das Funktionieren vom DNA-Vakzinen für in vivo Induktion von CTLs.
Antigene Peptide können verwendet werden, um auch CTL ex vivo hervorzugrufen. Die sich ergebenden CTL können verwendet werden, um chronische Infektionen (viral und bakteriell) oder Tumoren bei Patienten zu behandeln, die nicht auf andere herkömmliche Therapieformen oder nicht auf einen therapeutischen Peptidvakzinansatz ansprechen. Ex vivo CTL-Antworten gegen ein speziellen Pathogen (infektiöses Agens oder Tumorantigen) werden induziert durch Inkubieren von CTL-Vorläuferzellen (CTLp) des Patienten in Gewebekultur zusammen mit einer Quelle für Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und dem geeigneten immunogenen Peptid. Nach einer angemessenen Inkubationszeit (typischerweise 1 bis 4 Wochen), während der die CTLp aktiviert werden und zu Effektor-CTL reifen und expandieren, werden die Zellen zurück in den Patienten infundiert, wo sie ihre spezifische Zielzelle (eine infizierte Zelle oder eine Tumorzelle) zerstören werden.
Die Peptide können auch als diagnostische Agenzien verwendet werden. Beispielsweise kann ein Peptid der Erfindung verwendet werden, um die Empfänglichkeit einer speziellen Person für ein Behandlungsschema zu bestimmen, das das Peptid oder verwandte Peptide verwendet, und kann somit hilfreich sein beim Modifizieren eines bestehenden Behandlungsprotokolls oder bei der Bestimmung einer Prognose für eine betroffene Person. Zusätzlich können die Peptide auch verwendet werden, um vorherzusagen, welche Personen einem erheblichen Risiko ausgesetzt sind, eine chronische Infektion zu entwickeln.
Das folgende Beispiel wird zu Zwecken der Veranschaulichung und nicht zu Zwecken der Beschränkung angegeben.
Beispiel 1
Die Isolierung eines Klasse I-Antigens wurde durchgeführt wie in den oben angegebenen verwandten Anmeldungen beschrieben. Natürlich prozessierte Peptide wurden dann wie dort beschrieben isoliert und sequenziert. Ein Allel-spezifisches Motiv und Algorithmen wurden bestimmt und quantitative Bindungstest wurden durchgeführt.
Unter Verwendung der oben für HLA-A2.1 identifizierten Motive wurden Allel-Aminosäuresequenzen von verschiedenen antigenen Proteinen auf die Anwesenheit dieser Motive hin analysiert. Tabelle 3 liefert die Ergebnisse dieser Untersuchungen. Bindungsaffinitäten sind als Prozentsätze Bindung verglichen mit Standardpeptid in dem Test angegeben, wie in den verwandten Anmeldungen beschrieben.
Die obigen Beispiele sind angeführt, um die Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht, um ihren Umfang zu beschränken. Andere Varianten der Erfindung werden für die Fachleute leicht offensichtlich sein und sind von den beigefügten Ansprüchen umfasst.
Tabelle 3
Die SEQ ID Nos 1 bis 5, 7, 9 bis 17 und 20 bis 48 sind in Tabelle 3 lediglich zu Vergleichszwecken angegeben und sind nicht Teil der Erfindung.

Claims

Isoliertes Peptid mit weniger als 15 Aminosäuren, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6), LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8) und RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18).
Isoliertes Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6) besteht.
Isoliertes Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8) besteht.
Isoliertes Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18) besteht.
Isoliertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Peptid mit einem weiteren Peptid verknüpft ist.
Isoliertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Peptid mit einem zweiten Molekül verknüpft ist.
Isoliertes Peptid nach Anspruch 6, wobei das zweite Molekül ein Lipid, ein T-Helfer-Epitop, ein Epitop eines cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) oder ein Trägermolekül ist.
Zusammensetzung, die ein isoliertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst, das mit einem HLA A2.1-Molekül komplexiert ist, das auf einer Antigen-präsentierenden Zelle vorhanden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und ein pharmazeutische akzeptables Bindemittel umfasst.
Isolierte Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid codiert, das CTL-Epitope von HIV umfasst, die miteinander verbunden sind, wobei ein oder mehrere Epitope eine Aminosäuresequenz umfassen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6), LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8), RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18) und KLVGKLNWA (SEQ ID NO: 19).
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 10, wobei eines der Epitope aus der Aminosäuresequenz MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6) besteht.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 10, wobei eines der Epitope aus der Aminosäuresequenz LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8) besteht.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 10, wobei eines der Epitope aus der Aminosäuresequenz RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18) besteht.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 10, wobei eines der Epitope aus der Aminosäuresequenz KLVGKLNWA (SEQ ID NO: 19) besteht.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid Epitope umfasst, die aus den Aminosäuresequenzen MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6), LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8), RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18), und KLVGKLNWA (SEQ ID NO: 19) bestehen.
Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei das Polypeptid flankierende Sequenzen benachbart zu einem oder mehreren der CTL-Epitope umfasst.
Polypeptid, das von der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 10 bis 16 codiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 10 bis 16 und ein pharmazeutische akzeptables Bindemittel.
Ex vivo Verfahren zur Verwendung einer immunogenen Peptidzusammensetzung, das Bereitstellen eines isolierten Peptides mit weniger als 15 Aminosäuren, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6), LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8) und RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18); Komplexieren des immunogenen Peptids mit einem HLA A2.1-Molekül; und Kontaktieren in vitro eines HLA A2.1- beschränkten CTL mit dem Komplex aus dem Peptid und dem HLA A2.1-Molekül umfasst, wobei eine CTL-Antwort induziert wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6) besteht.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8) besteht.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18) besteht.
Verwendung eines immunogenen Peptids für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung oder Prävention von HIV-Infektion, wobei das Peptid weniger als 15 Aminosäuren aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6), LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8), RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18), und KLVGKLNWA (SEQ ID NO: 19).
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6) besteht.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8) besteht.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18) besteht.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz KLVGKLNWA (SEQ ID NO: 19) besteht.
Verwendung einer Nukleinsäure für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prävention von HIV-Infektion, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid codiert, das CTL-Epitope von HIV umfasst, die miteinander verbunden sind, wobei eines oder mehrere Epitope eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6), LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8), RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18) und KLVGKLNWA (SEQ ID NO: 19).
Verwendung nach Anspruch 28, wobei eines der Epitope aus der Aminosäuresequenz MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6) besteht.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei eines der Epitope aus der Aminosäuresequenz LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8) besteht.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei eines der Epitope aus der Aminosäuresequenz RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18) besteht.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei eines der Epitope aus der Aminosäuresequenz KLVGKLNWA (SEQ ID NO: 19) besteht.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei das Polypeptid Epitope umfasst, die aus den Aminosäuresequenzen MTNNPPIPV (SEQ ID NO: 6), LTFGWCFKL (SEQ ID NO: 8), RILQQLLFI (SEQ ID NO: 18), und KLVGKLNWA (SEQ ID NO: 19) bestehen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 28 bis 33, wobei das Polypeptid flankierende Sequenzen benachbart zu einem oder mehreren der CTL-Epitope umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das HLA A2.1-Molekül auf einer Zelle exprimiert wird.