DE69233607T2

DE69233607T2 - Peptide, die die zytotoxische T-Lymphozyte Antwort gegen Hepatitis-B-Virus induzieren

Info

Publication number: DE69233607T2
Application number: DE69233607T
Authority: DE
Inventors: Francis V. Del Mar Chisari; Carlo Ferrari; Amalia Penna; Gabriele Missale
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1991-08-26
Filing date: 1992-08-26
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2012-08-27
Also published as: PT534618E; EP0534618A3; IL102963A0; CZ42894A3; ZA926440B; EP0534618B1; DK0534618T3; EP0534618A2; JP3694300B2; NZ270625A; ATE320444T1; ES2262132T3; NZ244102A; DE69233607D1; JP3566284B2; JPH06510050A; NO940661L; FI940919A; CA2115927C; NO940661D0

Description

Staatliche Unterstützung
Die Regierung der USA kann aufgrund von finanziellen Unterstützungen, die von den National Institutes of Health zuerkannt wurden, bestimmte Rechte in Bezug auf diese Erfindung geltend machen.
Hintergrund der Erfindung
Das Hepatitis-B-Virus (HBV) infiziert Hepatozyten und verursacht akute und chronische Lebererkrankung und primäres Leberzellkarzinom. Die Infektion erfolgt typischerweise über infizierte(s) Blut oder Körperflüssigkeiten, und somit tritt eine HBV-Infektion vorwiegend unter Drogenabhängigen, die die Drogen intravenös verabreichen, Homosexuellen sowie in Ländern mit schwach entwickelten Gesundheitsversorgungssystemen, in denen das Risiko einer Aussetzung gegenüber infizierten Blutprodukten erhöht ist, auf. Etwa 90-95 % der infizierten Personen sind in der Lage, ihrer Infektion beizukommen, während die verbleibenden 5-10 % chronische Hepatitis entwickeln und in einen Trägerzustand gelangen, in dem die Möglichkeit einer späteren Entwicklung von Leberzirrhose und/oder primärem Leberzellkarzinom besteht. Erst jüngst wurde geschätzt, dass es weltweit etwa 250 Millionen Menschen gibt, die chronische Träger des HBV sind.
Die pathogenen Mechanismen, die für Leberzellschädigung in der HBV-Infektion verantwortlich sind, sind bis heute noch nicht gut bekannt, wobei jedoch angenommen wird, dass das Virus nicht direkt zytopathogen ist. Da jedoch das HBV menschliche Zellen nicht leicht in vitro infiziert, war es bis heute äußerst schwierig, das Virus zu untersuchen. Folglich gibt es noch keine wirksame Behandlung für eine bestehende HBV-Infektion.
Es wird umfassend angenommen, dass HBsAg das HBV-Antigen ist, das eine schützende Immunantwort induziert, die es den meisten infizierten Personen ermöglicht, ihrer Infektion über schützende Antikörper beizukommen. Tatsächlich können Anti-HBV-Hüllantikörper HBV-Partikel neutralisieren, und so wurden basierend auf HBsAg Vakzinen entwickelt, die die Entwicklung von HBV-Infektion unterbinden. Die Vakzinen verwenden HBsAg, das aus dem Plasma chronischer HBV-Träger isoliert wurde, oder aber mittels DNA-Rekombinationstechnologie hergestelltes HBsAg. Synthetische, auf HBsAg-Peptid basierende Vakzinen wurden ebenfalls bereits vorgeschlagen. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4.599.230 und 4.599.231. Die Anti-HBsAg-Vakzinen liefern jedoch nur bei etwa 90 % der immunisierten Personen Schutz. Jene, die immunisiert, jedoch nicht geschützt sind, liefern eine signifikante und unbewusste Quelle potenzieller Infektion.
Die Rolle des HBV-Nucleocapsid-Kernantigens (HBcAg) bei der Entwicklung einer schützenden Immunität ist weniger eindeutig. In manchen Fällen lieferte die Immunisierung von Schimpansen und Waldmurmeltieren mit Nucleocapsid-Kernantigen (HBcAg oder WHcAg) vollständigen oder teilweisen Schutz vor HBV- und WHV-Infektion. HBcAg-spezifische Helfer-T-Zellen erwiesen sich auch als unterstützende Zellen für Anti-Hüllantikörper-Produktion durch HBV-Hüll-spezifische B-Zellen. HBcAg wurde auch als ein sensibilisierendes Antigen für intrahepatische T-Zellen während chronischer HBV-Infektion dargestellt.
Der Beitrag anderer Formen von Immunität gegenüber HBV-Antigenen, insbesondere jener, die zytotoxische T-Lmyphozyten einbinden, war ebenfalls schwierig zu bewerten. Chisari et al. (Microbial Pathogen. 6, 31 (1989)) schlugen vor, dass Leberzellschädigung durch eine auf die HLA-Klasse I eingeschränkte Antwort zytotoxischer CD8⁺-T-Zellen auf HBV-kodiertes Antigen vermittelt werden kann. Auf Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplex- (MHC-) eingeschränkte Antworten zytotoxischer T-Zellen wurden für zahlreiche andere Viren, wie beispielsweise Influenza, identifiziert. Townsend et al., Cell 44, 959 (1986), berichteten beispielsweise, dass Epitope eines Influenzavirus-Nucleoproteins, die durch zytotoxische T-Lymphozyten erkannt werden, durch synthetische Peptide definiert werden könnten. In einem Versuch, die zytotoxische T-Lmphozyten-Antwort auf HBV zu definieren, wurde gezeigt, dass periphere Blutlymphozyten aus Patienten mit akutem und chronischem HBV in der Lage sein könnten, autologe Hepatozyten in vitro zu töten, die Spezifität der zytolytischen Aktivität, ihre NLA-Restriktionselemente und der zelluläre Phänotyp wurden jedoch nicht bestimmt. Siehe Mondelli et al., J. Immunol. 129, 2773 (1982), und Mondelli et al., Clin. Exp. Immunol. 6, 311 (1987). In noch jüngerer Vergangenheit berichteten Moriyama et al., Science 248, 361-364 (1990), dass das HBV-Haupthüllantigen an der Hepatozytenoberfläche in einer Form exprimiert wurde, die durch auf MHC-Klasse I eingeschränkte, zytotoxische CD8⁺-T-Lymphozyten sowie durch Hüll-spezifische Antikörper erkannt werden kann.
Auch wenn verschiedene Stämme von HBV bestehen, weisen sie alle zumindest eine gemeinsame Hülldeterminante auf, die als "a" bezeichnet wird. Jeder Stamm weist auch zwei andere Hülldeterminanten auf, von denen eine entweder "d" oder "y" und die zweite entweder "w" oder "r" ist. Somit gibt es vier mögliche Subtypen des Virus: adw, ayw, adr und ayr. Das Klonieren, Sequenzieren und die Expression von HBV werden in GB 2034323 , EP 13828 und US 4.935.235 beschrieben, und die vollständige Sequenz der HBV-Nucleocapsidregion wird weiters in Galibert et al., Nature 281, 646 (1979), beschrieben, wobei jede der oben genannten Referenzen hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Ferrari et al. (J. Clin. Invest. 88, 214-222 (1991)) offenbaren, dass synthetische Peptide, die auf der Hepatitis-B-Kernregion basieren, eine T-Zellen-Proliferationsantwort hervorrufen könnten.
Da die zur Zeit anerkannten HBV-Vakzinen nur etwa 90%igen Schutz unter den immunisierten Personen liefern, wäre es wünschenswert, wirksamere Immunität hervorzurufen, beispielsweise durch Steigern oder Diversifizieren der Immunogenität der Vakzinen. Auch wäre es wünschenswert, die Immunantworten von Personen, die chronisch mit HBV infiziert sind, zu stimulieren, sodass sie auf geeignete HBV-Antigene reagieren und die Infektion bekämpfen oder aber die Weiterentwicklung einer akuten zu einer chronischen Infektion unterbinden. Weiters würden Mittel zur Vorhersage, welche Patienten, die akut mit HBV infiziert sind, wahrscheinlich eine chronische Infektion als HBV-Träger entwickeln, das frühere Einsetzen von geeigneten Behandlungs- und/oder Vorsichtsmaßnahmen im Infektionsprozess ermöglichen. Überraschenderweise erfüllt die vorliegende Erfindung diesen Bedarf sowie andere, damit in Verbindung stehende Anforderungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide bereit, die auf MHC-Klasse I eingeschränkte Antworten zytotoxischer T-Lymphozyten gegen HBV-Antigen, wie in den Ansprüchen definiert, induzieren. Die Peptide von Interesse sind vom HBV-Nucleocapsid abgeleitet. In bestimmten Ausführungsformen bestehen die Peptide aus einer Sequenz aus zumindest neun Aminosäuren aus der Sequenz I (HBc_11-27) und sind noch bevorzugter Sequenz II (HBc_19-27) oder Sequenz III (HBc_18-27). In anderen Ausführungsformen bestehen die Peptide aus einer Sequenz aus zumindest zehn Aminosäuren aus Sequenz IV (HBc_111-125) oder Sequenz V (HBc_140-154) oder aus einer Sequenz aus zumindest neun Aminosäuren aus Sequenz X (HBenv_348-357). Andere Peptide der Erfindung umfassen Sequenz VII (HBpol_61-69), Sequenz VIII (HBpol_803-811) und Sequenz IX (HBX_126-134).
In manchen Fällen werden Peptide in einer Zusammensetzung als ein Gemisch kombiniert und werden nicht gebunden. Das Peptid kann auch an ein Lipid-hältiges Molekül konjugiert werden, das in der Lage ist, eine T-Lymphozyten-Antwort zu fördern, oder an ein anderes Peptid, das beispielsweise eine T-Helferzellen-Antwort induziert.
Es werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein Peptid der Erfindung umfassen, das mit einem zusätzlichen Peptid, einem Liposom, einem Adjuvans und/oder einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert ist. Somit können pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung akuter HBV-Infektion verwendet werden, insbesondere im Bemühen, ein Fortschreiten der Infektion zu einem chronischen Zustand oder Trägerzustand zu unterbinden. Die medizinische Verwendung der Peptide zur Behandlung von chronischer HBV-Infektion und HBV-Trägerzuständen wird ebenfalls bereitgestellt, worin die pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, um Personen in ausreichendem Ausmaß zu infizieren, um immunogen wirksame zytotoxische T-Zellen-Antworten gegen HBc-Epitope zu stimulieren. Zur Behandlung dieser Infektionen kann es besonders wünschenswert sein, Peptide, die auf MHC-Klasse I eingeschränkte Antworten zytotoxischer T-Lymphozyten gegen HBV-Antigen induzieren, mit anderen Peptiden oder Proteinen, die Immunantwort auf andere HBV-Antigene, wie z.B. HBsAg, induzieren, zu kombinieren. Zur Behandlung von Personen mit Infektionen im chronischen oder Trägerzustand können die Zusammensetzungen, je nach Erfordernis, in wiederholten Dosierungen über einen längeren Zeitraum hinweg verabreicht werden, um der Infektion und/oder der Ausbreitung des Virus beizukommen oder sie wesentlich abzuschwächen.
Vakzinenzusammensetzungen zur Prävention von HBV-Infektion, insbesondere von chronischer HBV-Infektion, werden ebenfalls bereitgestellt. Die Vakzinenzusammensetzungen umfassen eine immunologisch wirksame Menge eines HBV-Nucleocapsidpeptids, das eine auf MHC-Klasse I eingeschränkte Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten induziert, wie z.B. HBcAg_11-27 mit der Sequenz Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val, insbesondere im Fall von Personen des NLA-A2-Haplotyps, und umfassen ferner typischerweise ein Adjuvans, z.B. inkomplettes Freundsches Adjuvans oder Aluminiumhydroxid. Um erhöhten Schutz gegen HBV zu erzielen, kann die Vakzine weiters Komponenten umfassen, die eine schützende Antikörperantwort auf HBV-Hüllantigen hervorruft.
In wiederum anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Diagnoseverfahren, in denen die Peptide der Erfindung verwendet werden, um die Gegenwart von Lymphozyten in einer Person zu bestimmen, die zu einer zytotoxischen T-Zellen-Antwort auf HBV-Nucleocapsid-Antigen in der Lage sind. Die Abwesenheit solcher Zellen legt fest, ob die Person von Interesse eine Neigung zeigt, chronische HBV-Infektion zu entwickeln. Typischerweise sind die Lymphozyten solche aus peripherem Blut, und die Person von Interesse leidet an einer akuten HBV-Infektion.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Peptide, die in Pools verwendet werden, um einkernige periphere Blutzellen zu stimulieren, um HBV-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten zu identifizieren.
2 veranschaulicht die zytotoxische T-Zellen-Aktivität, die an den Peptidpools in jedem der Patienten M.B. (2A), V.J. (2B) und J.P. (2C) beobachtet werden, sowie die auf HLA A2 eingeschränkte Antwort, worin jene HLA-Allele, die alle Patienten und Targetzellen gemein haben, gezeigt sind.
3 zeigt die Erkennung von endogen synthetisiertem HBV-Nucleocapsid-Antigen durch Peptid-spezifische CTL, wobei die Effektorzellen von Patient M.B. (Tafel A) und Patient J.P. (Tafel B) stammen, worin Vwt für Wildtyp-Vakzinia, V core für Vakzinia, das den offenen HBcAg-Leseraster trägt, EBO-env für einen EBV-basierten episomalen Vektor, der HBV-Hülle exprimiert, und EBO-core für einen EBV-basierten episomalen Vektor, der HBV-Nucleocapsid-Antigen exprimiert, steht.
4 veranschaulicht die selektive Expansion von auf HLA A2 eingeschränkten CTL, die endogen synthetisiertes HBV-Nucleocapsid-Antigen erkennen, worin Tafel A zytolytische Aktivität durch CTL-Linie V.J. gegen mit HLA A2 übereingestimmte BCL, entweder mit HBc_11-27-Peptid vorgepulst oder in Medium alleine kultiviert, und gegen EBO-Transfektanten, die Nucleocapsid- oder Hüll-Antigene exprimieren, zeigt, wobei die Versuche vor (zwei Wochen) oder nach (vier Wochen) zwei Stimulationsdurchgängen mit EBO-core-Transfektanten durchgeführt wurden; Tafel B zeigt Erkennung durch CTL-Linie V.J. während der Wochen 3, 4 und 5 der Kultur nach 1, 2 oder 3 aufeinander folgenden Stimulationsdurchgängen mit EBO-core-Transfektanten; und Tafel C zeigt CTL-Aktivität gegenüber mit HLA A2 übereingestimmten und nicht-übereingestimmten BCL-Targets, die mit rekombinanten Vakziniaviren nach 5 Wochen Kultur infiziert wurden.
5 veranschaulicht HBc_11-27-spezifische CTL-Erkennung eines Epitops, das HBV-core- und -precore-Region-kodierte Polypeptide gemein haben, die von HLA-A2 BCL, infiziert mit rekombinantem Vakziniavirus, exprimiert werden, worin die CTL-Linie J.V. als Quelle für Effektorzellen verwendet wurde.
6 zeigt Aktivierung von HBV-spezifischen CTL durch PBMC-Stimulation mit Gemischen synthetischer Peptide. Zytolytische Aktivität von PBMC, eine Woche lang gegen autologe Targets stimuliert, wurden mit demselben Stimulationsgemisch oder mit Medium alleine vorgepulst. Das verwendete E/T-Verhältnis betrug 70:1 für Patient E.W. und 100:1 für Patient H.P.
7 bestätigt, dass HBcAg 140-155 das Peptid ist, das in Gemisch 2 erkannt wurde. Zytolytische Aktivität von PBMC, durch Peptide, die in Gemisch 2 vorhanden sind, für die erste Woche stimuliert und mit denselben Peptiden gegen autologe Targetzellen neuerlich stimuliert, wurden mit den einzelnen Peptiden des Gemischs vorgepulst. Das verwendete E/T-Verhältnis betrug 50:1 für Patient E.W. und 40:1 für Patient H.P.
8 zeigt, dass Aw68 das Restriktionselement der HBcAg-140-155-spezifischen CTL-Antwort von Linie H1 ist. Allogene Targetzellen wurden mit Peptid HBcAg140-155 oder mit Medium vorgepulst und auf der Ebene von Klasse I mit den Effektorzellen übereingestimmt und auf der Ebene von Klasse II vollständig nicht-übereingestimmt. Das verwendete E/T-Verhältnis belief sich auf 4:1.
9 zeigt, dass Aw68 und A31 Restriktionselemente der HBcAg-140-155-spezifischen CTL-Antwort der Klone 2D7 bzw. 3D1 1 sind. Autologe und allogene Targetzellen wurden mit Peptid 140-155 vorgepulst. Allogene Targetzellen wurden auf der Ebene von Klasse I und Klasse II mit den Effektorzellen übereingestimmt. Das verwendete E/T-Verhältnis belief sich auf 10:1.
10 veranschaulicht, dass HBcAg-140-155-spezifische CTL-Linien E4 und H1 Targetzellen, die das endogen synthetisiertes Antigen exprimieren, lysieren können.
Das für Linie E4 verwendete E/T-Verhältnis betrug 10:1, das E/T-Verhältnis für Linie H1 betrug 20:1 für die Peptid-vorgepulsten Targetzellen und 15:1 für die mit rekombinantem Vakziniavirus infizierten Targetzellen.
11 veranschaulicht, dass CTL-Klone 2D7 und 3D11 Targetzellen lysieren können, die das endogen synthetisierte Antigen in einer auf HLA eingeschränkten Weise exprimieren. Die Klone 2D7 und 3D11 wurden gegen allogene Targetzellen Aw68 bzw. A31 positiv getestet, die mit Peptid 140-155 präinkubiert und mit rekombinanten Vakziniaviren, die für das Kern- und Vorkernprotein von HBV kodieren, infiziert wurden.
12 veranschaulicht die Resultate von Versuchen, die zeigen, dass Peptid 141-151 die kürzeste, optimal erkannte Sequenz in HBcAg 140-155 für beide Restriktionselemente ist. Klon 3D11 wurde gegen allogene A31-positive Targetzellen und Klon 2D7 gegen allogene Aw68-positive Targetzellen getestet. Targetzellen wurden mit Peptidkonzentrationen im Bereich zwischen 0,001 bis 1 μM vorgepulst. Das verwendete E/T-Verhältnis betrug 10:1.
13 zeigt die CTL-Antwort auf zwei Polymerasepeptide, die das HLA-A2-Motiv enthalten, in einem Patient unter Verwendung von Targetzellen, die mit Peptid gepulst wurden und nur mit HLA-A2 übereingestimmt waren.
14 zeigt die Fähigkeit von mehreren, für Polymerasepeptid 803-811 spezifischen Klonen, endogen synthetisierte Polymerase zu erkennen.
15 zeigt, dass die CTL-Antwort auf Polymerasepeptid 803-811 Zellen erkennen kann, die mit Peptid und endogen synthetisierter Polymerase (Vpol) gepulst wurden, während die CTL-Antwort auf Polymerasepeptid 61-69 nur Zellen erkennt, die mit dem 61-69-Peptid gepulst wurden.
16 zeigt die Induktion einer CTL-Antwort durch ein HBX-126-134-Peptidanalogon, jedoch nicht durch das Wildtyp-Peptid.
17 zeigt die CTL-Antwort, die durch HBenv-Peptid 348-357 stimuliert wurde, auf Targetzellen, die mit homologem Peptid (bezeichnet als 884.01-ayw) gepulst wurden, und auf endogenes Hüllantigen vom awy-Subtyp, und andererseits die nicht vorhandene Antwort auf Zellen, die Antigen vom adw-Subtyp exprimieren.
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide, die von HBV-Proteinen abstammen, zur Verwendung in Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung, Prävention und Diagnose von HBV-Infektion bereit. Die Peptide stimulieren auf MHC HLA-Klasse I eingeschränkte Antworten zytotoxischer T-Lymphozyten auf HBV-infizierte Zellen. Die stimulierten zytotoxischen T-Lymphozyten sind in der Lage, die infizierten Zellen zu töten oder virale Replikation zu inhibieren und somit eine Infektion, einschließlich einer chronischen HBV-Infektion, zu unterbrechen oder im Wesentlichen zu vermeiden. Ein Peptid, das eine Antwort zytotoxischer T-Zellen hervorrufen kann, kann auch mit einem Immunogen kombiniert werden, das in der Lage ist, eine T-Helfer-Antwort hervorzurufen.
In einem Aspekt stammen die in der Erfindung verwendeten Peptide aus zwei unabhängigen HBV-Nucleocapsid- (HBc-) Polypeptiden, Kern und Vorkern. Der Vorkern enthält eine Amino-terminale Signalsequenz, die zu seiner Translokation in das endoplasmatische Retikulum und zur Sekretion als HBcA führt, während der Kern primär ein zytoplasmatisches und nukleares Protein (HBcAg) ist und nicht sekretiert wird. Die Peptide stammen aus der Region der HBc-Reste 19-27, HBc_28-47, HBc_111- ₁₂₅, HBc_140-154 (insbesondere HBc_141-151), worin die Nummerierung gemäß Galibert et al., s.o., erfolgte. In anderen Ausführungsformen stammen die Peptide aus der Sequenz des HBV-Polymeraseproteins (HBpol), insbesondere CTL-Epitope innerhalb von HBpol_61-69 und HBpol_803-811. In wiederum anderen Ausführungsformen enthalten die Peptide CTL-induzierende Epitope, die aus dem HBV-Transkriptions-Transaktivatorprotein HBx stammen, und insbesondere aus der Region von HBx_126-134. Die CTL-induzierenden Peptide können auch aus dem HB-Hüllantigen hergestellt werden, insbesondere aus dem Peptid, das der HBV-Sequenz von HBenv_348-357, entspricht.
Unter zytotoxische T-Lymphozyten induzierendem HBV-"Peptid" oder "Oligopeptid" der vorliegenden Erfindung wird eine Kette von zumindest vier HBV-Aminosäuresequenzresten, vorzugsweise zumindest sechs, noch bevorzugter acht oder neun, manchmal zehn bis zwölf Resten, und üblicherweise weniger als etwa fünfzig Resten, noch üblicher weniger als etwa fünfunddreißig Resten, und vorzugsweise weniger als fünfundzwanzig Resten, z.B. acht bis siebzehn Aminosäureresten, die aus einer HBc-Sequenz stammen, verstanden. Es kann wünschenswert sein, Peptide der Erfindung auf eine Länge von acht bis zwölf Aminosäureresten zu optimieren, sie also in ihrer Größe an endogen verarbeitete, virale Peptide anzugleichen, die an MHC-Klasse-1-Moleküle an der Zelloberfläche gebunden sind. Siehe im Allgemeinen Schumacher et al., Nature 350, 703-706 (1991); Van Bleek et al., Nature 348, 213-216 (1990); Rotzschke et al., Nature 348, 252-254 (1990); und Falk et al., Nature 351, 290-296 (1991), die alle hierin durch Verweis aufgenommen sind. Wie nachstehend noch näher erläutert wird, ist üblicherweise zumindest ein Großteil der Aminosäuren der Peptide zu einem entsprechenden Abschnitt zusammenhängender Reste der hierin identifizierten HBV-Sequenzen homolog, und die Peptide enthalten ein CTL-induzierendes Epitop.
Die Peptide können "synthetisch", wie nachstehend noch näher beschrieben wird, oder mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Auch wenn das Peptid vorzugsweise im Wesentlichen frei von anderen, natürlich vorkommenden HBV-Proteinen und Fragmenten davon ist, können die Peptide in manchen Ausführungsformen synthetisch an native Fragmente oder Partikel konjugiert werden. Die Bezeichnung Peptid wird in der vorliegenden Beschreibung synonym mit Polypeptid verwendet, um eine Reihe von Aminosäuren zu bezeichnen, die miteinander über Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und α-Carboxy-Gruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind. Die Polypeptide oder Peptide können zahlreiche verschiedene Längen aufweisen, entweder in ihren neutralen (ungeladenen) Formen oder in Formen, die Salze sind, vorliegen und entweder frei von Modifikationen wie Glykosylierung, Seitenkettenoxidation oder Phosphorylierung sein oder diese Modifikationen enthalten, unter der Maßgabe, dass die Modifikation die biologische Aktivität der Polypeptide, wie sie hierin beschrieben wird, nicht zerstört.
Wünschenswerterweise ist das Peptid so klein wie möglich, wobei es stets die gesamte biologische Aktivität des großen Peptids im Wesentlichen beibehält. Unter biologischer Aktivität wird die Fähigkeit verstanden, sich an ein geeignetes MHC-Molekül zu binden und eine Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten gegen HBV-Antigen oder -Antigenmimetika zu induzieren. Unter einer Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten wird eine CD8⁺-T-Lymphozyten-Antwort spezifisch auf ein HBV-Antigen von Interesse verstanden, wobei auf MHC-Klasse I eingeschränkte CD8⁺-T-Lymphozyten aktiviert werden. Die aktivierten T-Lymphozyten sekretieren Lymphokine (z.B. γ-Interferon), setzen Produkte (z.B. Serinesterasen) frei, die virale Replikation in infizierten autologen Zellen oder transfizierten Zellen inhibieren, und dies mit oder ohne Zelltötung.
Die Bezeichnung "homolog", "im Wesentlichen homolog" und "wesentliche Homologie", wie hierin verwendet, bezeichnen eine Sequenz von Aminosäuren mit zumindest 50 % Identität, worin eine Sequenz mit einer Referenzsequenz von Aminosäuren verglichen wird. Der Prozentsatz der Sequenzidentität oder -homologie wird durch gegenseitiges Vergleichen berechnet, wobei die eine Sequenz mit entsprechenden Abschnitten der Referenzsequenz abgeglichen wird.
Eine CTL-induzierende HBV-Peptid-Ausführungsform der Erfindung aus der Nucleocapsidregion umfasst sechs bis 35 Aminosäuren und enthält zumindest eine epitopische, auf HLA eingeschränkte CTL-Stelle aus der Peptidregion HBc_11-27. Ein Großteil der Aminosäuren des Peptids ist mit der Aminosäure der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBc_11-27-Region identisch oder im Wesentlichen homolog dazu, worin HBc_11-27 die folgende Sequenz aufweist:
I (HBc_11-27)
Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val.
Die Peptidausführungsformen dieser HBc_11-27-Region können gegebenenfalls an einem oder beiden der N- und C-Termini, je nach Bedarf, durch Aminosäuren von HBV-Sequenzen, einschließlich HBc, flankiert und/oder modifiziert sein, können zugesetzte Aminosäuren aufweisen, um Bindung zu erleichtern, können andere N- und C-terminale Modifikationen aufweisen, an Träger gebunden sein und dergleichen, wie hierin noch näher beschrieben wird. Das Peptid HBc_11-27 induziert eine Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten, die durch zumindest das MHC-Klasse-I-Molekül HLA-A2 vermittelt wird.
Innerhalb der Peptid-I-Region liegen Peptide, die das 9-mere Peptid HBc_19-27 umfassen und ein auf HLA eingeschränktes, CTL-induzierendes Epitop aufweisen, und Peptide, die davon abstammen, die (eine) CTL-induzierende epitopische Stelle(n) aus zumindest vier zusammenhängenden Aminosäuren der Sequenz von HBc_19-27 enthalten, worin HBc_19-27 die folgende Sequenz aufweist:
II (HBc_19-27)
Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val,
worin das Peptid an einem oder beiden Termini, wie oben für Peptid I bereits erwähnt, flankiert und/oder modifiziert sein kann. Wie im Fall von Peptid I induziert Peptid II eine Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten, die durch zumindest HLA-A2 vermittelt wird.
Eine besonders bevorzugte Peptidausführungsform in der Peptid-I/II-Region ist ein 10-mer, HBc_18-27, das die folgende Sequenz aufweist:
III (HBc_18-27)
Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val,
worin das Peptid wie zuvor erwähnt modifiziert und/oder flankiert werden kann.
Eine andere HBc-Peptidausführungsform der Erfindung umfasst das 15-mere Peptid HBc_111-125 und Peptide, die von HBc_111-125 abstammen, die (eine) CTL-induzierende, auf HLA-Klasse I eingeschränkte epitopische Stelle(n) aus zumindest sieben zusammenhängenden Aminosäuren enthalten. Ein Großteil der Aminosäuren des Peptids ist mit den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkom menden HBc_111-125-Sequenz identisch oder im Wesentlichen homolog dazu, worin HBc_111-125 (für HBV-Subtyp ayw) die folgende Sequenz aufweist:
IV (HBc_111-125)
Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp.
Das Peptid aus der HBc_111-125-Region kann an einem oder beiden Termini, wie hierin beschrieben, flankiert und/oder modifiziert sein. In einem Peptid des HBV-Subtyps adw ist Ile₁₁₆ durch Leu ersetzt.
In einer weiteren anderen Ausführungsform umfasst ein Peptid der Erfindung das 15-mere Peptid HBc_140-154 und Peptide, die von HBc_140-154 abstammen, die (eine) CTL-induzierende, auf HLA-Klasse I eingeschränkte epitopische Stelle(n) aus zumindest zehn zusammenhängenden Aminosäuren enthalten. Ein Großteil der Aminosäuren des Peptids ist mit den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBc_140-154-Sequenz identisch oder im Wesentlichen homolog dazu, worin HBc_140-154 (für HBV-Subtyp ayw) die folgende Sequenz aufweist:
V (HBc_140-154)
Leu-Ser-Thr-Leu-Pro-Glu-Thr-Thr-Val-Val-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg.
Ein Peptid, das aus dieser Region hergestellt wird, kann an einem oder beiden Termini, wie hierin beschrieben, flankiert und/oder modifiziert sein. Das Peptid V (HBc_140-154) induziert eine Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten, die durch zumindest ein MHC-Klasse-I-Molekül, HLA-A31, vermittelt wird, und kann auch durch HLA-Aw68 eingeschränkt sein. Wie im Abschnitt zu den Beispielen unten näher beschrieben, enthält die Sequenz von HBc_141-151 das minimale, optimal erkannte Epitop sowohl für die A31- als auch die Aw68-Restriktionselemente. Substitutionen von Alanin anstelle von Leucin 143 und Arginin 151 reduzieren oder eliminieren beinahe vollständig CTL-vermitteltes Töten von Targetzellen, was darauf schließen lässt, dass ein hydrophober Rest, wie z.B. Leucin, in Position 3 des Peptids und ein positiv geladener Rest, wie z.B. Arginin, am Carboxy-Terminus eines 11-meren Peptids ein Bindungsmotiv sowohl für auf HLA-A31 als auch für auf Aw68 eingeschränkte CTL-Epitope darstellen. Dieses Bindungsmotiv kann zur Identifikation oder zum Entwurf von auf HLA-A31 und/oder Aw68 eingeschränkten, CTL-induzierenden Epitopen von HBV und anderen Viren oder Pathogenen oder pathogenen Prozessen, in denen die Stimulation von CTL-Antworten zur schützenden Immunität beiträgt, verwendet werden.
Wiederum andere CTL-induzierende Peptide der Erfindung stammen aus der Region von HBc_28-47 und umfassen Peptide, die von HBc_28-47 abstammen, die eine oder mehrere CTL-induzierende, auf HLA-Klasse I eingeschränkte epitopische Stelle(n) aus zumindest sieben zusammenhängenden Aminosäuren enthalten. Ein Großteil der Aminosäuren des Peptids ist mit den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBc_28-47-Sequenz identisch oder im Wesentlichen homolog dazu, worin HBc_28-47 (für HBV-Subtyp ayw) die folgende Sequenz aufweist:
VI (HBc_28-47)
Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Thr-Ala-Ser-Ala-Leu-.
Tyr-Arg-Glu-Ala-Leu-Glu-Ser-Pro-Glu-His,
worin das selektierte Peptid an einem oder beiden Termini, wie hierin beschrieben, flankiert und/oder modifiziert sein kann.
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten die Peptide der Erfindung CTL-induzierende Epitope, die vom Polymeraseprotein abstammen. Insbesondere stammen die Peptide aus der Region von HBpol_61-69 oder HBpol_803-811 und umfassen Peptide, die von jenen Sequenzregionen abstammen, die eine oder mehrere CTL-induzierende, auf HLA-Klasse I eingeschränkte epitopische Stelle(n) aus zumindest sieben zusammenhängenden Aminosäuren enthalten. Ein Großteil der Aminosäuren des Peptids ist mit den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBpol_61-69- oder HBpol_803-811-Sequenzen identisch oder im Wesentlichen homolog dazu, worin HBpol_61-69 und HBpol_803-811 (für HBV-Subtyp ayw) die folgende Sequenzen aufweisen:
VII (HBpol_61-69)
Gly-Leu-Tyr-Ser-Ser-Thr-Val-Pro-Val, und
VIII (HBpol_803-811)
Ser-Leu-Tyr-Ala-Asp-Ser-Pro-Ser-Val,
worin das selektierte Peptid an einem oder an beiden Termini, wie hierin beschrieben, flankiert und/oder modifiziert sein kann.
Peptide der vorliegenden Erfindung, die Anti-HBV-CTL-induzierende Epitope enthalten, können auch vom HBV-Transkriptionsaktivatorprotein X abstammen. Insbesondere stammen die Peptide aus der Region von HBx_126-134 und umfassen Peptide, die von dieser Sequenzregion abstammen, die eine oder mehrere CTL-induzierende, auf HLA-Klasse I eingeschränkte epitopische Stelle(n) aus zumindest sieben zusammenhängenden Aminosäuren enthalten. Ein Großteil der Aminosäuren des Peptids, das aus dieser Region hergestellt wird, ist mit den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBx_126-134-Sequenz identisch oder im Wesentlichen homolog dazu, worin HBx_126-134 die folgende Sequenz aufweist:
IX (HBx_126-134)
Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Phe-Val-Leu,
worin das aus dieser Region hergestellte Peptid an einem oder beiden Termini, wie hierin beschrieben, flankiert und/oder modifiziert sein kann.
Anti-HBV-CTL-induzierende Peptide können auch vom HBV-Hüllprotein abstammen, und insbesondere ist das Peptid HBenv_348-357 und ist auf HLA-Klasse I eingeschränkt, worin HBenv_348-357 die folgende Sequenz (für Subtyp ayw) aufweist:
X (HBenv_348-357)
Gly-Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val,
worin das aus dieser Region hergestellte Peptid an einem oder beiden Termini, wie hierin beschrieben, flankiert und/oder modifiziert sein kann. Die Sequenz für den adw-Subtyp von HBenv_348-357 weist ein Alanin auf, das anstelle von Valin am Carboxy-terminalen Rest substituiert wurde.
Wie zuvor erwähnt können zusätzliche Aminosäuren zu den Termini eines Oligopeptids oder Peptids zugesetzt werden, um einfache Bindung von Peptiden aneinander zu ermöglichen, um aufgrund von oben erläuterten Gründen für Bindung an einen Träger, eine Stütze oder ein größeres Peptid zu sorgen, oder um die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids oder Oligopeptids zu modifizieren, und dergleichen. Aminosäuren wie Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin- oder Asparaginsäure und dergleichen können am C- oder N-Terminus des Peptids oder Oligopeptids eingeführt werden. Darüber hinaus können sich die Peptid- oder Oligopeptidsequenzen von der natürlichen Sequenz durch eine Modifikation mittels terminaler NH₂-Acylierung, z.B. Acetylierung, oder Thioglykolsäureamidierung, terminale Carboxy-Amidierung, z.B. Ammoniak, Methylamin usw., unterscheiden. In manchen Fällen können diese Modifikationen Stellen für Bindung an einen Träger oder ein anderes Molekül bereitstellen.
Es gilt zu verstehen, dass die HBV-Peptide der vorliegenden Erfindung oder Analoga davon, die zytotoxische T-Lymphozyten stimulierende Aktivität aufweisen, je nach Bedarf modifiziert werden können, um bestimmte andere erwünschte Attribute bereitzustellen, z.B. verbesserte pharmakologische Eigenschaften, wobei gleichzeitig die biologische Aktivität des unmodifizierten Peptids gesteigert oder zumindest im Wesentlichen beibehalten wird. Die Peptide können beispielsweise durch Ausweiten, Reduzieren oder Substituieren von Aminosäuren in der Peptidsequenz, z.B. durch Addition oder Deletion von Aminosäuren entweder am Amino-terminalen oder am Carboxy-terminalen Ende, oder an beiden, von Peptiden, die von den hierin offenbarten Sequenzen abstammen, modifiziert werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptide müssen mit den Peptiden I-IX oder mit einem bestimmten HBV-Nucleocapsid, einer Hülle, Polymerase oder X-Proteinsequenz nicht identisch sein, solange die vorliegenden Verbindungen in der Lage sind, für Aktivität zytotoxischer T-Lymphozyten gegen zumindest einen der vier Haupt-Subtypen von HBV zu sorgen. Daher können die Peptide verschiedenen Änderungen unterzogen werden, wie beispielsweise Insertionen, Deletionen und Substitutionen, entweder konservativ oder nicht-konservativ, worin solche Änderungen bestimmte Vorteile in ihrer Verwendung bereitstellen. Unter konservativen Substitutionen wird das Ersetzen eines Aminosäurerests durch einen anderen verstanden, der dem ersten biologisch und/oder chemisch ähnlich ist, z.B. einen hydrophoben Rest durch einen anderen oder einen polaren Rest durch einen anderen. Die Substitutionen umfassen Kombinationen wie Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr. Üblicherweise unterscheidet sich der Abschnitt der Sequenz, deren Zweck es ist, ein HBV-CTL-stimulierendes Epitop im Wesentlichen nachzuahmen, nicht um mehr als etwa 20 % von der Sequenz von zumindest einem Subtyp von HBV, außer wenn zusätzliche Aminosäuren an beiden Termini zugesetzt werden können, um die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids zu modifizieren, z.B. um Bindung oder Kupplung und dergleichen zu erleichtern. Wird erkannt, dass Regionen der Peptidsequenzen unter HBV-Subtypen polymorph sind, so ist es wünschenswert, eine oder mehrere Aminosäuren zu variieren, um differierende zytotoxische T-Lymphozyten-Epitope verschiedener HBV-Stämme oder – Subtypen wirksamer nachzuahmen.
Innerhalb der durch die vorliegende Erfindung identifizierten Peptidsequenzen, umfassend das repräsentative Peptid I (HBc_11-27), Peptid II (HBc_19-27), Peptid III (HBc_18-27), Peptid IV (HBc_111-125), Peptid V (HBc_140-154), Peptid VI (HBc_28-47), Peptid VII (HBpol_61-69), Peptid VIII (HBpol_803-811) und Peptid IX (HBx_126-134), liegen Reste (oder jene, die im Wesentlichen funktionell äquivalent sind), die es den Peptiden ermöglichen, ihre biologische Aktivität beizubehalten, d.h. die Fähigkeit, eine auf die Klasse I eingeschränkte Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten gegen HBV-infizierte Zellen oder Zellen, die HBV-Antigen exprimieren, zu stimulieren. Diese Reste können durch einfache Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen identifiziert werden. Weiters können die Beteiligungen, die durch die Seitenkette der Reste erfolgen, mittels eines systematischen Scans mit einer bestimmten Aminosäure (z.B. Ala) sondiert werden. Peptide, die Mehrfachsubstitutionen tolerieren, inkorporieren im Allgemeinen solche Substitutionen wie kleine, relativ neutrale Moleküle, z.B. Ala, Gly, Pro oder ähnliche Reste. Die Anzahl und Typen an Resten, die substituiert, addiert oder subtrahiert werden können, hängen von den erforderlichen Abständen zwischen den wesentlichen epitopischen Punkten und von bestimmten Konformations- und Funktionsattributen, die angestrebt werden (z.B. Hydrophobie vs. Hydrophilie), ab. Sofern erwünscht, kann das Steigern der Bindungsaffinität von Peptidanaloga zu ihrem MHC-Molekül zur Präsentation gegenüber einem zytotoxischen T-Lymphozyt auch durch solche Veränderungen erreicht werden. Im Allgemeinen verwenden jegliche Spacersubstitutionen, -additionen oder -deletionen zwischen epitopischen und/oder bezüglich der Konformation wichtigen Resten Aminosäuren oder Gruppierungen, die so ausgewählt werden, dass sie sterische Störung und Ladungsstörung vermeiden, die in weiterer Folge zu Bindungsstörung führen könnten.
Peptide, die Mehrfachsubstitutionen tolerieren, während sie die erwünschte biologische Aktivität beibehalten, können auch als D-Aminosäure-hältige Peptide synthetisiert werden. Solche Peptide können als "Inverso"- oder "Retro-Inverso"-Formen synthetisiert werden, d.h. durch Ersetzen von L-Aminosäuren einer Sequenz durch D-Aminosäuren oder durch Umkehren der Aminosäuresequenz und Ersetzen der L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren. Da die D-Peptide wesentlich resistenter gegenüber Peptidasen und daher in Serum und Geweben im Vergleich zu ihren L-Peptid-Gegenstücken stabiler sind, kann die Stabilität von D-Peptiden unter physiologischen Bedingungen einen Unterschied in der Affinität im Vergleich zum entsprechenden L-Peptid mehr als nur kompensieren. Weiters können L-Aminosäure-hältige Peptide mit oder ohne Substitutionen mit einer D-Aminosäure verkappt werden, um Exopeptidasezerstörung des antigenen Peptids zu hemmen.
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen beispielhaften Peptiden stellt die Erfindung Verfahren zur Identifikation anderer epitopischer Regionen bereit, die mit dem Induzieren von auf MHC eingeschränkten Antworten zytotoxischer T-Lymphozyten gegen HBV oder andere Viren, wie HCV, HIV und dergleichen, assoziiert werden. Die Verfahren umfassen das Erhalten peripherer Blutlymphozyten (PBL) aus infizierten oder nicht-infizierten Personen und das Aussetzen (Stimulieren) der Zellen gegenüber (mit) synthetischen Peptid- oder Polypeptidfragmenten, die aus einem Protein des Pathogens oder Antigens von Interesse stammen. In Fällen, in denen die Aminosäuresequenz des Proteins/der Proteine oder des Antigens bekannt ist, können Pools von sich überlappenden synthetischen Peptiden, wobei jedes typischerweise etwa 8 bis 20 Reste lang ist, verwendet werden, um die Zellen zu stimulieren. Aktive Peptide können aus Pools selektiert werden, die Aktivität zytotoxischer T-Lymphozyten induzieren. Die Fähigkeit der Peptide, spezifische zytotoxische Aktivität zu induzieren, wird durch Inkubieren der stimulierten PBL mit autologen markierten (z.B. ⁵¹Cr) Targetzellen (wie z.B. mit HLA übereinstimmende Makrophagen, T-Zellen, Fibroblasten oder B-Lymphoblasten), infiziert oder transfiziert mit dem Pathogen oder subgenomischen Fragmenten davon, sodass das Target-Antigen endogen durch die Zelle synthetisiert wird (oder die Zelle mit dem Peptid von Interesse gepulst wird), und durch Messen spezifischer Freisetzung von Markierung bestimmt.
Nachdem ein Peptid mit einer epitopischen Region, die eine Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten stimuliert, identifiziert wurde, kann das MHC-Restriktionselement der Antwort bestimmt werden. Dies umfasst das Inkubieren der stimulierten PBL oder kurzlebiger Linien davon mit einer Auswahl an (markierten) Targetzellen bekannter HLA-Typen, die mit dem Peptid von Interesse gepulst wurden, oder mit geeigneten Kontrollen. Das/Die HLA-Allel(e) von Zellen aus der Auswahl, die durch CTL lysiert wurden, wurden mit nicht lysierten Zellen verglichen, und das/die HLA-Restriktionselement(e) für die Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten auf das Antigen von Interesse wird/werden identifiziert.
Carbone et al., J. Exp. Med. 167, 1767 (1988), berichteten, dass Stimulation mit Peptiden zytotoxische T-Lymphozyten mit geringer Affinität zum entsprechenden endogenen Protein induzieren kann, sodass wiederholte Peptidstimulation zytotoxische T-Lymphozyten ergeben kann, die das Peptid, jedoch nicht das native Antigen erkennen. Da die Unfähigkeit stimulierter zytotoxischer T-Lymphozyten, native HBV-Proteine zu erkennen, in der Entwicklung von HBV-Peptidtherapeutika und Vakzinenzusammensetzungen nicht wünschenswert wäre, werden Verfahren verwendet, um diese mögliche Einschränkung zu umgehen. Eine serielle Restimulation zytotoxischer T-Zellen wird in der vorliegenden Erfindung verwendet, um T-Zellen mit einer höheren Affinität zu natürlich verarbeitetem Antigen als zu einem synthetischen Peptid zu identifizieren und selektieren. Kurzlebige zytotoxische T-Lymphozytenlinien werden durch Restimulieren von aktivierten PBL erstellt. Zellen, die mit Peptid stimuliert wurden, werden mit Peptid und rekombinantem oder nativem HBV-Antigen, z.B. HBcAg, HBsAg, HBpol oder HBx, restimuliert. Zellen mit Aktivität werden ebenfalls mit einem geeigneten T-Zellen-Mitogen, z.B. Phytohämagglutinin (PHA), stimuliert. Die restimulierten Zellen werden mit bestrahlten allogenen PBLs als eine nichtspezifische Antigen-Quelle von T-Zellen-Helfer und HBV-Antigen versorgt. Um die Popula tion zytotoxischer T-Lymphozyten, die natives HBV-Antigen erkennen, zu erweitern und um langlebige Linien zu erstellen, werden PBL aus einem Patienten zuerst mit Peptid und rekombinantem oder nativem HBV-Antigen stimuliert, gefolgt von Restimulation mit mit HLA übereingestimmten B-Lymphoblasten, die das entsprechende HBV-Antigenpolypeptid stabil exprimieren. Die Fähigkeit der Zelllinien, endogen synthetisiertes Antigen zu erkennen, wird unter Verwendung autologer und allogener B-Lymphoblasten oder anderer Zellen, die mit geeignetem Antigen transfiziert oder infiziert sind, neuerlich bestätigt.
Nach der Identifikation verschiedener Peptide der Erfindung, die zur Induktion von Anti-HBV-CTL-Antworten in einem oder mehreren Patienten oder HLA-Typen beitragen, kann es in manchen Fällen wünschenswert sein, zwei oder mehrere Peptide in einer Zusammensetzung zu verbinden. Die Peptide in der Zusammensetzung können gleich oder unterschiedlich sein, und zusammen sollten sie äquivalente oder stärkere biologische Aktivität als das/die verwandte(n) Peptid(e) bereitstellen. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren beispielsweise können zwei oder mehrere Peptide verschiedene oder überlappende zytotoxische T-Lymphozytenepitope aus einer bestimmten Region definieren, z.B. die HBc_11-27- und HBc_19-27-Peptide, wobei diese Peptide in einer Reagenzienmischung kombiniert werden können, um gesteigerte Immunogenität für Antworten zytotoxischer T-Lymphozyten bereitzustellen. Peptide einer Region können mit Peptiden anderer HBV-Regionen desselben oder eines anderen HBV-Proteins kombiniert werden, insbesondere wenn ein zweites oder darauf folgendes Peptid ein MHC-Restriktionselement aufweist, das sich vom ersten unterscheidet. Diese Zusammensetzung kann verwendet werden, um die immunologische Reichweite wirksam zu vergrößern, die durch Therapie-, Impf- oder Diagnoseverfahren und Zusammensetzungen der Erfindung unter einer sehr vielfältigen Bevölkerung bereitgestellt wird. Die unterschiedlichen Häufigkeiten von HLA-Allelen unter weit verbreiteten ethnischen Gruppen (kaukasisch, asiatisch oder schwarzafrikanisch) beispielsweise sind in Tabelle I unten gezeigt. Therapie- oder Vakzinenzusammensetzungen der Erfindung können so formuliert werden, dass bei einem größtmöglichen Prozentsatz einer Population für potenzielle Therapie oder Immunität gesorgt wird. Somit könnte die Einbindung des HBc_141-151-CTL-Epitops mit einem von HBc_18-27 stammenden Peptid in einem Therapeutikum oder einer Vakzine für bis zu 57 % der weltweit 300 Millionen Menschen, die chronisch mit HBV infiziert sind, von Nutzen sein. TABELLE I. HLA-ALLEL-HÄUFIGKEITEN UNTER WEIT VERBREITETEN ETHNISCHEN GRUPPEN

Abkürzungen: EUC, europäisch kaukasisch; NAC, nordamerikanisch kaukasisch; AFR, schwarzafrikanisch, JPN, japanisch.
* A28 steht für die zwei Allele Aw68 und Aw69.

Die Peptide der Erfindung können über eine Bindung kombiniert werden, um Polymere (Multimere) zu bilden, oder sie können zu einer Zusammensetzung ohne Bindung, z.B. in Form einer Beimischung, formuliert werden. Ist ein Peptid an gleiche Peptide gebunden, wodurch es ein Homopolymer bildet, so ist eine Vielzahl von sich wiederholenden epitopischen Einheiten vorhanden. Unterscheiden sich die einzelnen Peptide, z.B. bei einer Reagenzienmischung, die verschiedene HBV-Subtypen, verschiedene Epitope innerhalb eines Subtyps oder verschiedene HLA-Restriktionsspezifitäten aufweist, oder einem Peptid, das T-Helfer-Epitope enthält, so werden Heteropolymere mit sich wiederholenden Einheiten bereitgestellt. Zusätzlich zu kovalenten Bindungen sind auch nicht-kovalente Bindungen, die in der Lage sind, intermolekulare und intrastrukturelle Bindungen zu bilden, eingebunden.
Bindungen für Homo- oder Heteropolymere oder für das Kuppeln an Träger können auf zahlreiche verschiedene Weisen bereitgestellt werden. Cysteinreste können bei spielsweise sowohl an Amino- als auch an Carboxy-Termini zugesetzt werden, wobei die Peptide über gesteuerte Oxidation der Cysteinreste kovalent gebunden werden. Ebenfalls nützlich sind zahlreiche heterobifunktionelle Mittel, die eine Disulfidbindung an einem Ende einer funktionellen Gruppe und eine Peptidbindung am anderen Ende bilden, einschließlich N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP). Dieses Mittel bildet eine Disulfidbindung zwischen sich selbst und einem Cysteinrest in einem Protein und eine Amidbindung über die Aminogruppe an einem Lysin oder anderen freien Aminogruppe im anderen. Zahlreiche verschiedene solcher Disulfid/Amidbildenden Mittel sind bekannt. Siehe beispielsweise Immun. Rev. 62, 185 (1982), das hierin durch Verweis aufgenommen ist. Andere bifunktionelle Bindungsmittel bilden eine Thioether- und keine Disulfidbindung. Viele dieser Thioether-bildenden Mittel sind im Handel erhältlich und umfassen reaktive Ester von 6-Maleinimid-n-Hexansäure, 2-Bromessigsäure, 2-Iodessigsäure, 4-(N-Maleinimidmethyl)cyclohexan-1-carbonsäure und dergleichen. Die Carboxylgruppen können durch Kombinieren mit Succinimid oder 1-Hydroxy-2-nitro-4-sulfonsäure (Natriumsalz) aktiviert werden. Ein besonders bevorzugtes Bindungsmittel ist Succinimidyl-4-(N-maleinimidmethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC). Es gilt zu verstehen, dass Bindung keine der gebundenen Gruppen wesentlich daran hindern sollte, wie beschrieben, z.B. wie eine zytotoxische HBV-T-Zelldeterminante, Peptidanaloga oder T-Helferdeterminante, zu funktionieren.
In einem anderen Aspekt können die Peptide der Erfindung mit anderen Peptiden kombiniert oder gebunden werden, die HBV-T-Helferzellen-Epitope darstellen, d.h. Epitope, die T-Zellen, die bei der Induktion zytotoxischer T-Zellen gegen HBV mitwirken, stimulieren. Die T-Helferzellen können beispielsweise entweder der T-Helfer-1- oder T-Helfer-2-Phänotyp sein. T-Helfer-Epitope aus HBV-Sequenzen wurden bei HBc_1-20 mit der folgenden Sequenz identifiziert: Met-Asp-Ile-Asp-Pro-Tyr-Lys-Glu-Phe-Gly-Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro. Andere T-Helfer-Epitope werden von Peptiden aus der Region HBc_50-69 mit der folgenden Sequenz: Pro-His-His-Tyr-Ala-Leu-Arg-Gln-Ala-Ile-Leu-Cys-Trp-Gly-Glu-Leu-Met-Tyr-Leu-Ala und aus der Region von HBc_100-139, einschließlich HBc_100-119 mit der Sequenz Leu-Leu-Trp-Phe-His-Ile-Ser-Cys-Leu-Thr-Phe-Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Leu (worin Ile₁₁₆ im HBV- adw-Subtyp Leu ist), HBc_117-131 mit der Sequenz Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro-Ala und Peptid HBc_120-139 mit der Sequenz Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg-Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile, bereitgestellt. Siehe Ferrari et al., J. Clin. Invest. 88, 214-222 (1991), und das US-Patent 4.882.145, die beide hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Die Peptide der Erfindung können auf zahlreiche verschiedene Weisen hergestellt werden. Aufgrund ihrer relativ geringen Größe können die Peptide in Lösung oder an einem festen Träger gemäß herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthesegeräte sind im Handel erhältlich und können gemäß bekannten Arbeitsvorschriften verwendet werden. Siehe z.B. Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105, 6442 (1983); Merrifield, Science 232, 341-347 (1986); und Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer (Hrsg.), Academic Press, New York, 1-284 (1979), die alle hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Alternativ dazu können DNA-Rekombinationsverfahren verwendet werden, worin eine Nucleotidsequenz, die für ein Peptid von Interesse kodiert, in einen Expressionsvektor insertiert, in eine geeignete Wirtszelle transformiert oder transfiziert und unter für Expression geeigneten Bedingungen kultiviert wird. Diese Verfahren sind im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, wie allgemein in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), und Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1987), sowie in den US-Patenten Nr. 4.237.224, 4.273.875, 4.431.739, 4.363.877 und 4.428.941 beispielsweise beschrieben wird, deren Offenbarung jeweils hierin durch Verweis aufgenommen sind. Somit können Fusionsproteine, die eine oder mehrere Peptidsequenzen der Erfindung umfassen, verwendet werden, um die zytotoxischen HBV-T-Zellen-Determinanten zu präsentieren. Beispielsweise wird ein rekombinantes Kernprotein hergestellt, in dem die HBc-Aminosäuresequenz verändert wird, um Epitope von hierin beschriebenen Peptidregionen wirksamer zu präsentieren, um eine Antwort zytotoxischer T- Lymphozyten zu stimulieren. Auf diese Weise wird ein Polypeptid verwendet, das mehrere T-Zell-Epitope inkorporiert.
Da die Kodiersequenz für Peptide der hierin in Betracht gezogenen Länge mittels chemischer Verfahren synthetisiert werden kann, beispielsweise durch das Phosphotriesterverfahren von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981), kann die Modifikation einfach durch Substituieren der geeigneten Base(n) anstelle jener, die für die native Peptidsequenz kodieren, erfolgen. Die Kodiersequenz kann anschließend mit geeigneten Linkern versehen und in Expressionsvektoren, die auf dem Gebiet der Erfindung üblicherweise erhältlich sind, ligiert werden, und die Vektoren können verwendet werden, um geeignete Wirte zu transformieren, um das erwünschte Fusionsprotein herzustellen. Zahlreiche solcher Vektoren und geeigneter Wirtssysteme sind bereits erhältlich. Für die Expression der Fusionsproteine wird die Kodiersequenz mit operabel gebundenen Start- und Stoppcodons, Promotor- und Terminatorregionen und üblicherweise mit einem Replikationssystem versehen, um einen Expressionsvektor zur Expression im erwünschten Zellwirt bereitzustellen. Promotorsequenzen beispielsweise, die mit Bakterienwirten kompatibel sind, werden in Plasmiden bereitgestellt, die herkömmliche Restriktionsstellen zur Insertion der erwünschten Kodiersequenz enthalten. Die resultierenden Expressionsvektoren werden in geeignete Bakterienwirte transformiert. Hefe- oder Säugetierzellwirte können ebenfalls unter Einsatz geeigneter Vektoren und Kontrollsequenzen verwendet werden.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung sowie pharmazeutische und Vakzinenzusammensetzungen davon sind zur Verabreichung an Säugetiere, insbesondere Menschen, nützlich, um HBV-Infektion zu behandeln und/oder ihr vorzukehren. Da die Peptide verwendet werden, um Antworten zytotoxischer T-Lymphozyten auf HBV-infizierte Zellen zu stimulieren, können die Zusammensetzungen verwendet werden, um akute und/oder chronische HBV-Infektion zu behandeln oder ihr vorzukehren.
Im Fall von pharmazeutischen Zusammensetzungen werden die wie oben beschriebenen Peptide der Erfindung einer Person verabreicht, die bereits mit HBV infiziert ist. Jene in der Inkubationsphase oder der akuten Phase der Infektion können mit immunogenen Peptiden, getrennt oder gemeinsam mit anderen Behandlungen, je nach Eignung, behandelt werden. In therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen an einen Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um eine wirksame Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten auf HBV hervorzurufen und um seine Symptome und/oder Komplikationen zu beheben oder zumindest teilweise einzudämmen. Eine adäquate Menge, um dies zu erreichen, wird als "therapeutisch wirksame Dosis" bezeichnet. Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen z.B. von der Peptidzusammensetzung, der Art der Verabreichung, dem Alter und dem Ausmaß der zu behandelnden Erkrankung, dem Gewicht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und dem Erachten des die Therapie verschreibenden Arztes ab, liegen jedoch im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 μg bis etwa 2.000 mg Peptid für einen 70-kg-Patienten, wobei Dosierungen von etwa 10 μg bis etwa 100 mg Peptid noch üblicher verwendet werden, gefolgt von Booster-Dosierungen im Bereich von etwa 1 μg bis etwa 1 mg Peptid über Wochen oder Monate hinweg, je nach CTL-Antwort eines Patienten, die durch Messen von HBV-spezifischer CTL-Aktivität in PBLs, die dem Patienten abgenommen werden, bestimmt wird. Es muss bedacht werden, dass die Peptide und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen in schwerwiegenden Erkrankungszuständen, d.h. in lebensbedrohenden oder potenziell lebensbedrohenden Situationen, verwendet werden können. In solchen Fällen ist es in Anbetracht der Minimierung fremder Substanzen und der relativ nicht-toxischen Beschaffenheit der Peptide möglich, und kann vom behandelnden Arzt auch als wünschenswert gesehen werden, wesentliche Überschüsse dieser Peptidzusammensetzungen zu verabreichen.
Einfache oder mehrfache Verabreichung der Zusammensetzungen können in Dosierungshöhen und -mustern verabreicht werden, die vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. In jedem Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Men ge an zytotoxische T-Lymphozyten stimulierenden Peptiden der Erfindung bereitstellen, die ausreichend ist, um den Patienten wirksam zu behandeln.
Bei einer therapeutischen Verwendung sollte die Verabreichung bereits beim ersten Zeichen von HBV-Infektion oder kurz nach der Diagnose in Fällen von akuter Infektion eingesetzt und dann fortgesetzt werden, bis zumindest die Symptome im Wesentlichen abklingen, und auch noch eine gewisse Zeit danach. Bei fest bestehenden und chronischen Erkrankungen können Belastungsdosen erforderlich sein, denen Erhaltungs- oder Boosterdosen folgen. Das Hervorrufen einer wirksamen Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten auf HBV während der Behandlung akuter Hepatitis minimiert die Möglichkeit einer darauf folgenden Entwicklung von chronischer Hepatitis, HBV-Trägerzustand und nachfolgendem primärem Leberzellkarzinom.
Die Behandlung einer infizierten Person mit den Zusammensetzungen der Erfindung kann die erfolgreiche Bekämpfung der Infektion in akut infizierten Personen beschleunigen, von denen etwa 90 % in der Lage sind, der Infektion auf natürlichem Weg beizukommen. Für jene Personen, die für die Entwicklung einer chronischen Infektion empfänglich (oder anfällig) sind, sind die Zusammensetzungen im Rahmen von Verfahren zur Prävention der Entwicklung von einer akuten zu einer chronischen Infektion besonders nützlich. Werden die empfänglichen Personen vor oder während der Infektion, beispielsweise wie hierin beschrieben, als solche erkannt, so kann die Zusammensetzung auf sie gerichtet werden, was den Bedarf an einer Verabreichung an eine größere Menge an Personen minimiert.
Die Peptidzusammensetzungen können auch zur Behandlung von chronischer Hepatitis verwendet werden sowie zur Stimulierung des Immunsystems von Trägern, um virusinfizierte Zellen im Wesentlichen zu reduzieren oder sogar vollständig zu eliminieren. Jene mit chronischer Hepatitis können dadurch identifiziert werden, dass sie etwa 3-6 Monate nach der Infektion positive Ergebnisse bezüglich des Virus zeigen. Da Personen aufgrund einer inadäquaten (oder nicht vorhandenen) Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten während der akuten Phase ihrer Infektion eine chronische HBV-Infektion entwickeln können, ist es wichtig, eine Menge an immunpotenzieren dem Peptid in einer Formulierung und Verabreichungsart bereitzustellen, die ausreichend sind, um eine Antwort zytotoxischer T-Zellen auf wirksame Weise zu stimulieren. Somit liegt zur Behandlung von chronischer Hepatitis eine repräsentative Dosis im Bereich von etwa 1 μg bis 1.000 mg, vorzugsweise etwa 5 μg bis 100 mg, für einen 70-kg-Patienten. Die Verabreichung sollte fortgesetzt werden, bis zumindest die klinischen Symptome oder Laborwerte darauf hinweisen, dass die HBV-Infektion erfolgreich bekämpft oder im Wesentlichen gelindert wurde, und eine gewisse Zeit lang danach. Immunisierungsdosen, gefolgt von Erhaltungs- oder Boosterdosen in festgelegten Intervallen, z.B. in Intervallen von einer bis vier Wochen, können erforderlich sein, möglicherweise auch über einen längeren Zeitraum hinweg, um der Infektion beizukommen. Zur Behandlung von chronischer oder Träger-HBV-Infektion kann es auch wünschenswert sein, die CTL-Peptide mit anderen Peptiden oder Proteinen zu kombinieren, die eine Immunantwort auf andere HBV-Antigene induzieren.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur therapeutischen Behandlung sind für parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung konzipiert. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, z.B. intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär, verabreicht. Somit stellt die Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung bereit, die eine Lösung der zytotoxische T-Lymphozyten stimulierenden Peptide, aufgelöst oder suspendiert in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, umfassen. Zahlreiche verschiedene wässrige Träger können verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3 % Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, durchwegs bekannte Sterilisierungsverfahren sterilisiert werden, oder sie können sterilfiltriert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung wie sie sind verpackt werden, oder sie werden lyophilisiert, wobei das lyophilisierte Präparat vor Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, sofern dies erforderlich ist, um physiologischen Bedingungen näher zu kommen, wie beispielsweise pH-regulierende Mittel und Puffermittel, Tonizitäts-regulierende Mittel, Benetzungsmittel und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat und dergleichen.
In manchen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, zumindest eine Komponente in die pharmazeutische Zusammensetzung einzubinden, die CTL primt. Lipide wurden identifiziert, die in der Lage sind, CTL in vivo gegen virale Antigene zu primen, z.B. Tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serin (P₃CSS), das virusspezifische, zytotoxische T-Lymphozyten wirksam primen kann, wenn es kovalent an ein geeignetes Peptid gebunden ist. Siehe Deres et al., Nature 342, 561-564 (1989), hierin durch Verweis aufgenommen. Peptide der Erfindung können an P₃CSS beispielsweise gebunden sein, und das Lipopeptid kann an eine Person verabreicht werden, um eine Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten auf HBV spezifisch zu primen. Weiters können, da die Induktion von neutralisierenden Antikörpern auch mit P₃CSS, das an ein Peptid konjugiert ist, das ein geeignetes Epitop, z.B. HBsAg-Epitope, aufweist, geprimt werden kann, die zwei Zusammensetzungen kombiniert werden, um sowohl humorale als auch zellvermittelte Antworten auf HBV-Infektion wirksam hervorzurufen.
Die Konzentration von zytotoxische T-Lymphozyten stimulierenden Peptiden der Erfindung in den pharmazeutischen Formulierungen kann stark variieren, d.h. von weniger als etwa 1 Gew.-%, üblicherweise bei oder zumindest etwa 10 Gew.-% bis hin zu 20 bis 50 Gew.-% oder mehr, und wird primär anhand von Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten und dergleichen gemäß der bestimmten ausgewählten Verabreichungsart festgelegt.
Somit könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion so hergestellt werden, dass sie 250 ml sterile Ringer-Lösung und 100 mg Peptid enthält. Tatsächliche Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Verbindungen sind Fachleuten bekannt oder eindeutig ersichtlich und werden näher beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Science, 17. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985), hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben.
Die Peptide der Erfindung können auch über Liposomen verabreicht werden, die dazu dienen, die Peptide auf ein bestimmtes Gewebe, wie z.B. Lymphgewebe oder HBV-infizierte Leberzellen, zu richten. Liposomen können auch verwendet werden, um die Halbwertszeit der Peptidzusammensetzung zu erhöhen. Liposomen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Emulsionen, Schäume, Mizellen, unlösliche Monolayer, Flüssigkristalle, Phospholipiddispersionen, lamellare Layers und dergleichen. In diesen Präparaten ist das zuzuführende Peptid als Teil eines Liposoms, alleine oder in Verbindung mit einem Molekül, das sich an z.B. einen Rezeptor, der unter Lymphzellen häufig vorhanden ist, bindet, wie beispielsweise monoklonale Antikörper, die sich an das CD45-Antigen binden, oder mit anderen therapeutischen oder immunogenen Zusammensetzungen inkorporiert. Somit können Liposomen, die mit einem erwünschten Peptid der Erfindung gefüllt sind, auf die Stelle von Lymph- oder Leberzellen gerichtet werden, wo die Liposomen dann die ausgewählten therapeutischen/immunogenen Peptidzusammensetzungen abgeben. Liposomen zur Verwendung in der Erfindung werden aus vesikelbildenden Standard-Lipiden gebildet, die im Allgemeinen neutrale und negativ geladene Phospholipide und ein Sterin, wie z.B. Cholesterin, umfassen. Die Auswahl an Lipiden richtet sich im Allgemeinen nach Aspekten wie z.B. der Liposomengröße und der Stabilität der Liposomen im Blutkreislauf. Zahlreiche verschiedene Verfahren sind zur Herstellung von Liposomen verfügbar, wie z.B. in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980), den US-Patenten Nr. 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 und 5.019.369, hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben wird. Um Targeting auf die Immunzellen zu ermöglichen, kann ein Ligand, den es in das Liposom zu inkorporieren gilt, z.B. Antikörper oder Fragmente davon umfassen, die für Zelloberflächendeterminanten der erwünschten Immunsystemzellen spezifisch sind. Eine Liposomensuspension, die ein Peptid enthält, kann intravenös, lokal, topisch usw. in einer Dosis, die in Übereinstimmung mit der Art der Verabreichung, dem zuzuführenden Peptid, dem zu behandelnden Erkrankungszustand und dergleichen variiert, verabreicht werden.
Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche, nicht-toxische feste Träger verwendet werden, die beispielsweise pharmazeutische Qualitäten von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Sac charose, Magnesiumcarbonat und dergleichen umfassen. Zur oralen Verabreichung wird eine pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Zusammensetzung durch Einbinden eines beliebigen der normalerweise verwendeten Arzneimittelträger, wie beispielsweise jener zuvor aufgezählten Träger, und im Allgemeinen 10-95 % Wirkstoff, d.h. von einem oder mehreren Peptiden der Erfindung, und noch bevorzugter bei einer Konzentration von 25 %-75 %, gebildet.
Zur Aerosolverabreichung werden die zytotoxische T-Lymphozyten stimulierenden Peptide vorzugsweise in einer fein verteilten Form zusammen mit einem Tensid und einem Treibmittel bereitgestellt. Typische Prozentsätze für Peptide sind 0,01 Gew.-%- 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 %-10 %. Das Tensid muss natürlich nicht-toxisch sein und ist vorzugsweise im Treibmittel löslich. Beispiele für solche Mittel sind Ester oder Partialester von Fettsäuren, die 6 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, wie z.B. n-Hexansäure, Octansäure, Dodecansäure, Hexadecansäure, Octadecansäure, Octadeca-9,12-diensäure, Octadeca-9,12-15-triensäure, Olestearinsäure und cis-Octadec-9-ensäure mit einem aliphatischen mehrwertigen Alkohol oder seinem zyklischen Anhydrid. Gemischte Ester, wie z.B. gemischte oder natürliche Glyceride, können verwendet werden. Das Tensid kann 0,1 Gew.-%-20 Gew.-% der Zusammensetzung, vorzugsweise 0,25-5 Gew.-%, bilden. Den Rest der Zusammensetzung stellt üblicherweise das Treibmittel dar. Auch ein Träger kann, je nach Bedarf, eingebunden werden, z.B. Lecithin zur intranasalen Verabreichung.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Vakzinen, die als aktiven Bestandteil eine immunogen wirksame Menge eines zytotoxische T-Lymphozyten stimulierenden Peptids, wie hierin beschrieben, enthalten. Das/Die Peptid(e) kann/können in einen Wirt, einschließlich Menschen, gebunden an seinen/ihren eigenen Träger oder als ein Homopolymer oder Heteropolymer aktiver Peptideinheiten, eingeführt werden. Solch ein Polymer hat den Vorteil gesteigerter immunologischer Reaktion und, sofern verschiedene Peptide verwendet werden, um das Polymer zu bilden, jenen der zusätzlichen Fähigkeit, Antikörper und/oder zytotoxische T-Zellen zu induzieren, die mit verschiedenen antigenen Determinanten von HBV reagieren. Nützliche Träger sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und umfas sen z.B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Thyroglobulin, Albumine wie menschliches Serumalbumin, Tetanustoxoid, Polyaminosäuren wie Poly(D-Iysin:D-Glutaminsäure) und dergleichen. Die Vakzinen können auch ein physiologisch tolerierbares (annehmbares) Verdünnungsmittel wie Wasser, phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung enthalten und darüber hinaus ein Adjuvans umfassen. Adjuvanzien wie inkomplettes Freundsches Adjuvans, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid oder Alaun sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannte Materialien. Und, wie zuvor erwähnt, Antworten zytotoxischer T-Lymphozyten können durch Konjugieren von Peptiden der Erfindung an Lipide, wie P₃CSS, geprimt werden. Bei Immunisierung mit einer Peptidzusammensetzung, wie hierin beschrieben, mittels Injektion, Aerosol, oraler, transdermaler Verabreichung oder auf einem anderen Weg reagiert das Immunsystem des Wirts auf die Vakzine durch die Produktion großer Mengen an zytotoxischen T-Lymphozyten, die für HBV-Antigen spezifisch sind, und der Wirt wird zumindest teilweise gegen HBV-Infektion immun oder gegenüber der Entwicklung einer chronischen HBV-Infektion resistent.
Vakzinenzusammensetzungen, die die Peptide der Erfindung enthalten, können einem Patienten, der für eine HBV-Infektion empfänglich oder auf andere Weise einem erhöhten Risiko bezüglich dieser Infektion ausgesetzt ist, verabreicht werden, um die dem Patienten zueigene Immunantwortfähigkeiten zu steigern. Solch eine Menge ist als eine "immunogen wirksame Dosis" definiert. In dieser Verwendung hängen die exakten Mengen wiederum vom Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten, der Art der Verabreichung, der Beschaffenheit der Formulierung und dergleichen ab, liegt jedoch im Allgemeinen im Bereich von etwa 1,0 μg bis etwa 500 mg pro 70 kg Körpergewicht des Patienten, noch üblicher im Bereich von etwa 50 μg bis etwa 200 mg pro 70 kg Körpergewicht. Die Peptide können Personen von einem geeigneten HLA-Typ verabreicht werden, z.B. werden Vakzinenzusammensetzungen von Peptiden aus der Region von HBc_19-27 an HLA-A2-Personen verabreicht, und Peptide, die die epitopische HBc_141-151-Determinante enthalten, werden an A31- und Aw68-Personen verabreicht.
In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, die Peptidvakzinen der Erfindung mit Vakzinen zu kombinieren, die neutralisierende Antikörperantworten auf HBV, insbesondere auf HBV-Hüllantigene, induzieren, wie z.B. rekombinante HBV-envkodierte Antigene oder Vakzinen, die aus gereinigten Plasmapräparaten, gewonnen aus HBV-infizierten Personen, erhalten werden. Zahlreiche verschiedene HBV-Vakzinenpräparate wurden bereits beschrieben und basieren primär auf HBsAg und Polypeptidfragmenten davon. Beispiele für Vakzinen, die mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung formuliert werden können, sind im Allgemeinen in der EP 154.902 und der EP 291.586 sowie in den US-Patenten Nr. 4.565.697, 4.624.918, 4.599.230, 4.599.231, 4.803.164, 4.882.145, 4.977.092, 5.017.558 und 5.019.386, alle hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben. Die Vakzinen können kombiniert und gleichzeitig oder als separate Präparate verabreicht werden.
Für therapeutische Zwecke oder zur Immunisierung können die Peptide der Erfindung auch von abgeschwächten Viruswirten, wie z.B. Vakzinia, exprimiert werden. Dieser Ansatz umfasst die Verwendung von Vakziniavirus als Vektor, um Nucleotidsequenzen zu exprimieren, die für die HBV-Peptide der Erfindung kodieren. Bei Einführung in einen akut oder chronisch HBV-infizierten Wirt oder in einen nicht-infizierten Wirt exprimiert das rekombinante Vakziniavirus das HBV-Peptid und ruft dadurch eine Antwort zytotoxischer T-Lymphozyten im Wirt auf HBV hervor. Vakziniavektoren und Verfahren, die in Immunisierungsarbeitsvorschriften nützlich sind, werden z.B. im US-Patent Nr. 4.722.848, hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben. Ein anderer Vektor ist BCG (Bacillus Calmette Guérin). BCG-Vektoren werden in Stover et al. (Nature 351, 456-460 (1991)), hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben. Zahlreiche verschiedene andere Vektoren, die zur therapeutischen Verabreichung oder Immunisierung der Peptide der Erfindung nützlich sind, z.B. Salmonella-typhi-Vektoren und dergleichen, werden Fachleuten aus der vorliegenden Beschreibung ersichtlich sein.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der beanspruchten Erfindung können für Ex-vivo-Therapieformen verwendet werden. Unter Ex-vivo-Therapie wird verstanden, dass therapeutische oder immunogene Manipulationen außerhalb des Körpers durchgeführt werden. Lymphozyten beispielsweise können einem Patienten entnommen und mit hohen Dosen der vorliegenden Peptide behandelt werden, wobei eine stimulierende Konzentration von Peptid in das Zellmedium zugeführt wird, die jene Konzentrationen bei weitem überschreiten, die vom Patienten angenommen oder toleriert werden könnten. Nach der Behandlung zur Stimulierung der CTLs werden die Zellen wieder in den Wirt eingeführt, um die HBV-Infektion zu behandeln. Die Zellen des Wirts können demnach Vektoren ausgesetzt werden, die für die Peptide kodierende Gene tragen, wie zuvor beschrieben. Nachdem die Zellen mit den Vektoren transfiziert wurden, können sie in vitro vermehrt oder wieder in den Patienten eingeführt werden. Die Zellen, die in vitro vermehrt werden, können nach Erreichen einer vorgegebenen Zelldichte wieder in den Patienten eingeführt werden.
Die Peptide können auch Verwendung als Diagnosemittel finden. Ein Peptid der Erfindung kann beispielsweise verwendet werden, um die Empfindlichkeit einer bestimmten Person gegenüber einem Behandlungsplan, der das Peptid oder verwandte Peptide einsetzt, zu bestimmen, und kann somit zur Modifikation einer bestehenden Behandlungsvorschrift oder zur Festlegung einer Prognose für eine erkrankte Person hilfreich sein. Darüber hinaus können die Peptide auch verwendet werden, um vorherzusagen, welche Personen einem wesentlichen Risiko ausgesetzt sind, eine chronische HBV-Infektion zu entwickeln.
Die folgenden Beispiele werden als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung bereitgestellt.
BEISPIEL I
Identifikation von CTL-spezifischen HBc-Epitopen
Drei Patienten (M.B., J.P. und J.V.) wurden während der akuten Phase viraler Hepatitis, Typ B, untersucht. Die Diagnose von akuter Hepatitis basierte auf der Identifikation erhöhter Werte von SGPT-Aktivität (zumindest 10-mal der obere Wert des Normalen; der Mittel-SGPT-Höchstwert liegt bei 2.179 IE/I) in Verbindung mit der Detektion von IgM-Anti-HBcAg-Antikörpern im Serum. Alle Patienten erholten sich voll ständig von der Krankheit, unter Normalisierung von Serum-Transaminase und Clearance von HBsAg. Sie waren Antikörper-negativ gegenüber δ-Ag und Hepatitis-C-Virus. Patient J.P. war A2, A3, B44, B35, Cw4, DR1, DR2, DRw8 und DQw1; V.J. war A2, A11, B44, B62, Cw5, DR4, DRw12; B.M. war A2, B38, B27, DR5, DRw52 und DQw3. Somit waren alle Patienten HLA-A2-positiv. Periphere Blutlymphoyzten aus diesen Patienten wurden auf HBV-spezifische CTL-Aktivität analysiert, entweder unmittelbar nach der Isolierung, nach 1 oder 2 Wochen nach Stimulation mit autologen Stimulatorzellen, die mit HBV-Expressionsvektoren, wie nachstehend beschrieben, transfiziert waren, oder nach Stimulation mit einer Gruppe von 4 Pools von überlappenden synthetischen Peptiden, die 10 bis 20 Reste lang waren, wobei jeder 5 bis 6 Peptide umfasst, die die gesamte HBV-Nucleocapsid- (Kern- und Vorkern-) Region (ayw-Subtyp) abdeckten. Die Peptide, die in jedem Pool enthalten waren, sind in 1 gezeigt.
Peptid-spezifische CTL wurden aus den PBL der drei Patienten mit akuter Hepatitis wie folgt gebildet. PBL wurden bei 4 × 10⁶ Zellen pro ml in RPMI 1640, das 10 % AB-Serum plus entweder 10 μg/ml eines Peptidpools, der das HBc_11-27-Peptid enthielt, oder das HBc_11-27-Peptid und 1 μg/ml rekombinantes (r)HBcAg (Biogen, Genf, Schweiz) enthielt, in einer 24-Well-Platte (Corning) kultiviert. Nach 4 Tagen Kultur wurden die Zellen neuerlich mit RPMI 1640, das 10 % FCS und 20 E/ml rIL2 enthielt (Hoffman-LaRoche, Basel, Schweiz), genährt. Im Fall von Patient V.J. wurden die Peptid-geprimten Zellen nach 1 Woche Kultur mit HBc_11-27-Peptid und rHBcAg (1 mg/ml) in Gegenwart von autologen bestrahlten (3.500 RAD) PBL als Antigenpräsentierende Zellen restimuliert. Die Peptid-geprimten Zellen von Patient J.P. wurden an Tag 7 mit 1 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA) in Gegenwart von allogenen bestrahlten (7.000 RAD) PBL restimuliert. Zytotoxische Aktivität wurde nach 7 Tagen (Patient M.B.) oder 14 Tagen (Patienten V.J. und J.P.) Kultur bewertet.
Zytotoxische Aktivität wurde durch Inkubieren der stimulierten PBL mit autologen oder allogenen (mit HLA übereingestimmt oder nicht-übereingestimmt), ⁵¹Cr-markierten, Peptid-gepulsten (20 μg/ml, 1 h lang) BCL-Zellen 4 h lang in Rund-96-Well- Platten bei einem Verhältnis Effektor/Target (E/T) von 100 (M.B.) oder 10 (V.J., J.P.) bewertet. Parentale BCL-Zellen, die nicht mit Peptid gepulst wurden, dienten als negative Kontrollen. Prozentuelle Targetzelllyse wurde aus der Formel (E-M/T-M) × 100 berechnet, worin E = ⁵¹Cr-Freisetzung im Versuch (cpm); M = ⁵¹Cr-Freisetzung in Gegenwart von Kulturmedium (was zwischen 15-25 % der Gesamtzählungen lag); und T = gesamtes ⁵¹Cr, das durch 10 % Triton X freigesetzt wurde.
Wie in 2 veranschaulicht, wurde HBV-spezifische CTL-Aktivität reproduzierbar nur nach Stimulation mit der Gruppe an überlappenden Nucleocapsidpeptiden beobachtet. Peptid-spezifische CTL-Aktivität wurde nur bei einem der vier Peptidpools konsequent hervorgerufen, und Erkennung war auf ein einzelnes Peptid innerhalb dieses Pools beschränkt, das aus den Resten 11-27 von Hepatitis-B-Kernantigen (HBcAg) der Sequenz Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val besteht und unter den Hauptsubtypen von HBV erhalten ist. Dies ist ein dominantes Epitop in HLA-A2-positiven Patienten mit akuter viraler Hepatitis.
Nach einer Woche Stimulation mit einem Peptidgemisch, das die HBc_11-27-Determinante enthielt, lysierten Lymphozyten aus Patient M.B. auf spezifische Weise autologe und mit HLA-A2 übereingestimmte B-Lymphoblasten (BCL), die mit dem Peptid inkubiert waren (2A). Eine Peptid-spezifische CTL-Linie wurde ebenfalls aus PBL, die aus Patient V.J. stammten (2B), durch Stimulation mit dem HBc_11-27-Peptid plus rekombinantes HBV-Kernantigen als eine Quelle für Antigen-spezifische T-Zellen-Hilfe (Ferrari et al., J. Immunol. 145, 3422 (1990)) zur Erweiterung der HBc_11-27-spezifischen CTL, gefolgt von Restimulation mit denselben Reagenzien, erstellt. In ähnlicher Weise wurde eine NBc_11-27-spezifische CTL-Linie unter Verwendung von PBL aus Patient J.P. (2C) durch 1 Woche Peptid- und HBcAg-Stimulation, gefolgt von Restimulation mit PHA und bestrahlten allogenen PBL als eine nichtspezifische Antigen-Quelle für T-Zellen-Hilfe, erstellt. Die Verfahren führten zur Erstellung kurzlebiger CTL-Linien, die in der Lage waren, Peptid-gepulste autologe und allogene, HLA-A2-positive Targetzellen zu lysieren, jedoch nicht mit HLA-A2 nicht-übereingestimmte Targets, was zeigt, dass Peptiderkennung durch die CTL auf HLA-A2 eingeschränkt war.
In getrennten Versuchen, die im Allgemeinen wie hierin beschrieben durchgeführt wurden, wurde für die Peptide HBc_19-27 und HBc_18-27 erkannt, dass sie CTL-Aktivität auf eine durch zumindest HLA-A2 eingeschränkte Weise spezifisch stimulieren. In anderen Versuchen wurde für die Peptide HBc_28-47 und HBc_111-125 gezeigt, dass sie CTL-Aktivität gegen HBV-Antigene spezifisch stimulieren, und auch wurde gezeigt, dass das Peptid HBc_140-154 CTL-Aktivität auf eine Weise stimulierte, die auf zumindest HLA-A31 eingeschränkt zu sein schien.
BEISPIEL II
Für HBc-Peptide spezifische CTL erkennen rekombinantes HBV-Kernantigen
Die kurzlebigen, Peptid-spezifischen CTL-Linien von den drei Patienten aus Beispiel I wurden unter Verwendung autologer und allogener BCL-Targets, die mit den HBV-Kernexpressionsvektoren transfiziert oder infiziert waren, auf die Fähigkeit getestet, endogen synthetisiertes HBV-Kernantigen zu erkennen.
Es wurden zwei verschiedene eukaryotische Expressionssysteme verwendet. Rekombinante Vakziniaviren, die entweder die HBV-Kern- (Vcore-) oder -Vorkern(Vprecore-) Polypeptide (Subtyp ayw) exprimieren, wurden wie in Schlicht & Schaller, J. Virol. 63, 5399 (1987), hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben verwendet. Zusätzlich dazu wurden EBV-B-Zellen mit einer Reihe von rekombinanten Plasmiden stabil transfiziert, die das HBV-Kern- (EBO-core-) und -Hüll- (EBO-env-) Polypeptid (Subtyp ayw) in einem auf Epstein-Barr-Virus basierenden Vektor (EBOpLPP) exprimieren, wie in Canfield et al., Mol. Cell. Biol. 10, 1367 (1990), hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben.
Effektorzellen, die aus Patient M.B. und J.P. nach 7 und 14 Tagen Stimulation, wie in Beispiel I beschrieben, entnommen wurden, wurden mit Targetzellen 4 h lang bei E/T-Verhältnissen von 100:1 bzw. 10:1 inkubiert. Vor ⁵¹Cr-Markierung wurden BCL-Targets entweder mit rekombinanten Vakziniaviren (3, Tafel A) bei einer Infektionsmultiplizität von 20 14 h lang infiziert, um die Expression von HBV-kodierten Genprodukten zu ermöglichen (Vw = Wildtyp-Vakzinia; Vcore = Vakzinia, das den of fenen HBcAg-Leseraster trägt), oder, im Fall von Patient J.P., mit zuvor bereits gezeigten EBV-basierten episomalen Vektoren (Tafel B) infiziert, um ausreichend Expression entweder von Hüll- (EBO-env-) oder Nucleocapsidantigen (EBO-core) zu induzieren.
Wie in 3 gezeigt, lysierten die CTL auf spezifische Weise autologe BCL, die das HBV-Kernpolypeptid vorübergehend oder stabil exprimierten, jedoch nicht die HBV-Hüllantigene. Unter Verwendung einer Gruppe an mit HLA-A2 übereingestimmten und nicht-übereingestimmten allogenen Targetzellen musste spezifische Erkennung von endogen synthetisiertem, nativem (rekombinantem) Kernantigen ebenfalls auf HLA-A2 eingeschränkt sein.
BEISPIEL III
Serielle Stimulation mit Nucleocapsid-Transfektanten produziert Anti-HBV-CTL mit hoher Affinität
Stimulation mit Peptidantigen kann CTL mit geringer Affinität zum entsprechenden endogenen Protein induzieren (Carbone et al., J. Exp. Med. 167, 1767 (1988)), sodass wiederholte Peptidstimulation CTL ergeben kann, die das synthetische Peptid, jedoch nicht das native Antigen erkennen. Um die Population von CTL, die natives Nucleocapsid-Antigen erkennen, selektiv zu erweitern und um langlebige Linien zur weiteren Analyse zu erstellen, wurden PBL aus Patient J.V. 1 Woche lang mit Peptid NBc_11-27 plus rekombinantes HBcAg stimuliert, woraufhin die aktivierten PBL mit mit HLA übereingestimmten, transfizierten BCL restimuliert wurden, die das HBV-Nucleocapsid-Polypeptid stabil exprimierten.
Dieser Vorgang wird im Folgenden näher beschrieben. Nach zwei Wochen Stimulation mit HBc_11-27-Peptid und rHBcAg wurde die Peptid-spezifische CTL-Linie J.V. ( 2B) alle sieben Tage mit bestrahlten (7.000 RAD), mit HLA-Klasse I übereingestimmten EBO-core-Transfektanten (1 × 10⁶/ml) plus autologe bestrahlte (3.000 RAD) PBL (5 × 10⁶/ml) und rHBcAg (1 mg/ml in RPMI + 10 % FCS + 20 E/ml rIL2) weiter restimuliert. Wie in 4A gezeigt, wurde die zytolytische Aktivität gegen mit HLA-A2 über eingestimmte BCL, entweder mit HBc_11-27-Peptid vorgepulst oder in Medium alleine kultiviert, und gegen EBO-Transfektanten, die endogen synthetisierte Nucleocapsid- oder Hüllantigene exprimieren, getestet. Versuche wurden vor (2 Wochen vor) und nach (4 Wochen nach) zwei Stimulationsdurchgängen mit EBO-core-Transfektanten (E/T-Verhältnis = 20:1) durchgeführt.
Wie in 4A gezeigt wiesen die CTL vor Restimulation einen hohen Grad an Zytotoxizität gegenüber Peptid-gepulsten Targets, bei nur minimalem spezifischem Töten von Targetzellen, die endogen synthetisiertes Antigen exprimierten, auf. Nach Restimulation mit dem Nucleocapsid-Transfektanten zeigten T-Zellen erhöhtes Töten von Targets, die endogen synthetisiertes Antigen exprimierten, und parallel dazu einen Rückgang des Tötens von Peptid-gepulsten Targetzellen. 4A.
Die Erkennung von endogen synthetisiertem Antigen stieg progressiv mit der vergangenen Zeit nach der Restimulation an, wie in 4B gezeigt wird. Diese Tafel zeigt die Erkennung von endogen synthetisierten HBV-Nucleocapsid-Antigenen durch die CTL-Linie V.J. während der Wochen 3, 4 und 5 der Kultur nach 1, 2 oder 3 seriellen Stimulationsdurchgängen mit EBO-core-Transfektanten (E/T = 20:1). Diese Resultate lassen darauf schließen, dass CTL mit höherer Affinität zum endogen produzierten Antigen selektiert wurden.
4C zeigt die zytolytische Aktivität gegenüber mit HLA-A2 übereingestimmten und nicht-übereingestimmten BCL-Targets, die mit rekombinanten Vakziniaviren (wie in Beispiel II beschrieben) nach 5 Wochen Kultur (E/T = 50:1) infiziert wurden.
Diese Resultate lassen darauf schließen, dass natürlich verarbeitetes Nucleocapsid-Antigen dem synthetischen HBc_11-27-Peptid, das zur Erweiterung der CTL-Vorläuferpopulation verwendet wurde, ähnlich, jedoch nicht identisch damit ist. Die Tatsache, dass diese serielle Stimulation so gut funktionierte, wohingegen zahlreiche frühere Versuche, HBV-spezifische CTL in frisch isolierten PBL ohne vorangehende Stimulation zu detektieren, fehlschlugen, lässt darauf schließen, dass die HBV-spezifischen CTL-Vorläufer im peripheren Blutkompartiment bei sehr geringer Häu figkeit vorhanden sind. Die Tatsache, dass der Versuch, HBc-spezifische CTL alleine durch In-vitro-Stimulation mit stabil transfizierten, autologen BCL, die als ausgezeichnete Targetzellen dienten, zu induzieren, fehlschlug, weist darauf hin, dass allgemein gesprochen für CTL-Induktion höhere Epitopkonzentrationen erforderlich sind als für Lyse.
Der Phänotyp der HBc_11-27-spezifischen CTL wurde durch Inkubieren von HBV-Kerntransfektanten und Nucleocapsid-spezifischer CTL-Linie aus Patient V.J. mit Antikörpern, die für die Differenzierungsmarker CD4 und CD8 spezifisch waren, bewertet. Die CTL-Linie V.J. wurde gegen A2-positive EBO-core- und EBO-env-Targets in Gegenwart von sättigenden Konzentrationen (0,6 μg/ml) an monoklonalen IgG₁-Antikörpern Anti-Leu-3a (CD4) und Anti-Leu-2a (CD8), erhalten von Becton-Dickinson, getestet. Antikörper wurden zur Kultur zu Beginn des Chrom-Freisetzungstests zugesetzt. Antigen-spezifische Lyse wurde zu 80 % mit Antikörpern gegen CD8 blockiert, während keine Inhibierung mit Antikörpern gegen CD4 erzielt wurde. Diese Resultate zeigen, dass die HBc_11-27-spezifische, auf HLA-A2 eingeschränkte CTL-Aktivität ausschließlich durch CD8-positive Zellen vermittelt wird.
BEISPIEL IV
HBc_11-27-spezifische CTL erkennen ein Epitop, das durch HBV-Kern- und -Vorkern-Region kodierte Polypeptide gemeinsam haben
Das/Die HBc_11-27-Epitop(e) wird/werden innerhalb zweier unabhängiger Nucleocapsid-Polypeptide (Kern und Vorkern) angeordnet, wovon eines (Vorkern) eine Amino-terminale Signalsequenz enthält, die zu seiner Translokation in das endoplasmatische Retikulum und zur Sekretion als Hepatitis-B-e-Antigen (HBeAg) führt (Uy et al., Virology 155, 89 (1986); Roosinck et al., Mol. Cell. Biol. 6, 1393 (1986); und Standring et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8405 (1988)). Das Kernpolypeptid ist primär ein zytoplasmatisches und nukleares Protein (HBcAg) und wird nicht sekretiert (Roosnick & Siddiqui, J. Virol. 61, 955 (1987); und McLachlan et al., J. Virol. 61, 683 (1987)). Um zu bestimmen, ob ein oder beide Polypeptide dazu dienen, das/die auf HLA-A2 eingeschränkte(n), HBc_11-27-spezifische(n) CTL-Epitop(e) zu bilden, wurden HLA-A2-positive BCL-Targetzellen mit rekombinanten Vakziniaviren infiziert, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie die nativen Kern- und Vorkern-Polypeptide unabhängig voneinander exprimieren, wie in Beispiel II beschrieben wurde. Die CTL-Linie J.V. wurde als eine Quelle für Effektorzellen in einem vierstündigen ⁵¹Cr-Freisetzungstest bei dem in 5 angegebenen E:T-Verhältnis verwendet.
Die Resultate zeigten, dass beide Targetzelllinien zu einem gleichwertigen Grad durch HBc_11-27-spezifische CTL-Linie aus Patient V.J. getötet wurden, was beweist, dass HBcAg und HBeAg einen gemeinsamen intrazellulären Verarbeitungsstoffwechselweg aufwiesen und dass sie auf der auf HLA-Klasse I eingeschränkten CTL-Ebene kreuzreaktiv waren.
BEISPIEL V
Immundominanz des HBc_11-27-CTL-Epitogs in HLA-A2-Haplotyp-Patienten
Um die Immundominanz im HLA-A2-Haplotyp des/der CTL-Epitops/e, die im Peptid HBc_11-27 enthalten sind, zu testen, wurden acht zusätzliche Patienten mit selbsteingeschränkter akuter Hepatitis-B-Infektion, vier Patienten mit chronischer aktiver Hepatitis B und acht gesunde Personen ohne Hinweis auf vorangehende Aussetzung gegenüber HBV (alle HLA-A2-positiv) wiederholt getestet.
Alle akuten Patienten, die in Serie (alle 7 bis 10 Tage) während der Symptom- und Erholungsphasen der Erkrankung untersucht wurden, erkannten auf wirksame Weise autologe Targetzellen, die mit Peptid HBc_11-27 sowie mit MIX 4 gepulst worden waren (1). Einschränkungsversuche, die mit MIX4-stimulierten PBMC aus vier von ihnen durchgeführt wurden, bestätigten, dass CTL-Erkennung von Peptid HBc_11-27 auf HLA-A2 eingeschränkt war. Es wurden Unterschiede im Reaktionsmuster auf das Peptid von Patient zu Patient während des Krankheitsverlaufs beobachtet. Die zytolytische Aktivität war im Allgemeinen während der ikterischen Phase nachweisbar, in der die Transaminasewerte hoch waren; in manchen Patienten war die Antwort von längerer Dauer und war noch immer nachweisbar, wenn die GPT-Konzentrationen bereits auf das normale Niveau zurückgegangen waren, und in anderen Patienten war die lytische Aktivität 2 oder 3 Wochen nach dem Transaminase-Peak nicht mehr nachweisbar, auch wenn die GPT-Konzentrationen stets leicht verändert waren. Der Mangel einer konstanten Assoziation zwischen CTL-Aktivität und SGPT-Konzentrationen lässt darauf schließen, dass das periphere Blutkompartiment Immunvorgänge, die in der Leber an der Stelle von Antigensynthese und Zellschädigung stattfinden, nur teilweise widerspiegelt.
Drei der vier chronischen Patienten (jeder wurde zwei- oder dreimal gemäß derselben Versuchsvorschrift, die für die akuten Patienten verwendet wurde, getestet) zeigten keine zytolytische Aktivität gegen autologe Makrophagen, die mit Peptid HBc_11-27 gepulst worden waren, während ein Patient nachweisbare, wenn auch sehr niedrige Niveaus von Zytotoxizität gegen die relevante Peptidsequenz zeigte. Die lytische Aktivität gegen Peptid HBc_11-27 war in normalen HLA-A2-positiven Kontrollpersonen nicht nachweisbar, was beweist, dass diese Antwort nicht auf In-vitro-Priming zurückzuführen war und dass Peptidstimulation eine spezifische T-Zell-Population, die in vivo durch HBV-Infektion vorgeprimt worden war, selektiv erweiterte.
Diese Resultate zeigen eine klare Korrelation zwischen der CTL-Antwort auf Kernpeptid HBc_11-27 und akuter HBV-Infektion in Patienten, die das Virus erfolgreich aus ihrem Organismus klären konnten.
BEISPIEL VI
Identifikation von auf HLA-A31 und Aw68 eingeschränkter CTL Aktivität
Dieses Beispiel beschreibt die Identifikation einer CTL-Antwort auf ein HBV-Nucleocapsid-Epitop, das durch zwei unabhängige HLA-Klasse-I-Moleküle, HLA-A31 und HLA-Aw68, eingeschränkt ist.
Sechs Patienten, fünf männliche Patienten und eine weibliche Patientin, mit akuter Hepatitis B und neun normale Blutspender wurden untersucht (Tabelle II). Die Diagnose von akuter Hepatitis B basierte auf Standard-Diagnosekriterien, einschließlich klinischer und biochemischer Belege für schwere Leberzellschädigung bei einer Ala ninaminotransferase- (ALT-) Aktivität, die zumindest 20fach höher als die Obergrenzen normaler Aktivität lag, zusammen mit serologischen Beweisen für akute HBV-Infektion einschließlich Hepatitis-Oberflächenantigen (HBsAg) und IgM-Anti-HBc-Antikörper (IgM HBc-Ab) und der Abwesenheit von serologischen Beweisen für Infektion durch die Hepatitis-delta- oder Hepatitis-C-Viren (unter Verwendung von handelsüblichen Reagenzien, erhalten bei Abbott Laboratories, North Chicage, IL). Alle Patienten erholten sich vollständig von der Erkrankung und zeigten eine Normalisierung von Serum-Transaminase und eine Clearance von HBsAg innerhalb von 4 Monaten nach der anfänglichen Diagnose. TABELLE II: HLA-Klasse der untersuchten Patienten und der normalen HLA-A31- und Aw68-Spender, verwendet zur Produktion von Targetzellen
PBMC von Patienten und normalen Spendern wurden an Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten getrennt, dreimal in "Hanks balanced salt solution" (HBSS) gewaschen, in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit L-Glutamin (2 mM), Penicillin (50 E/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und HEPES (10 mM), das 10 % hitzeinaktiviertes menschliches AB-Serum enthielt, resuspendiert und in 24-Well-Platten bei 4 × 10⁶ Zellen/Well ausplattiert. Die synthetischen Peptide, jeweils bei 10 μg/ml, wurden zu den Zellkulturen wie folgt zugesetzt: Gemisch 1, Kernreste, 1-20, 20-34, 28-47, 50-69, 70-89, 61-80; Gemisch 2, Kernreste 82-101, 100-119, 120-139, 140-155, 155-169, 169-183; Gemisch 3, Vorkernrest 20-Kernrest 2, Kernreste 50-59, 117-131, 131-145, 111-125; und Gemisch 4, Kernreste 11-27, 91-110, 147-160, 162-176. rHBcAg (Biogen, Genf, Schweiz) wurde bei 1 μg/ml zugesetzt, um den Nutzen einer Helfer-T-Zellen-Antwort innerhalb der Kultur während der ersten Stimulationswoche herzuleiten. An Tag 3 wurde 1 ml RPMI mit 10 % menschlichem AB-Serum und rIL2 bei einer Endkonzentration von 10 E/ml zu jedem Well zugesetzt. Die kultivierten PBMC wurden auf CTL-Aktivität an Tag 7 getestet, und kurzlebige CTL-Linien, die CTL-Aktivität spezifisch für das Peptidgemisch zeigten, das während der ersten Stimulationswoche verwendet wurde, wurden durch Restimulation wie nachstehend beschrieben erweitert.
Die HBV-Kern-spezifische CTL-Linie H1 wurde aus Patient H.P., anfänglich mit Peptid-Gemisch 2 plus rHBcAg kultiviert, durch wöchentliche Restimulation mit 5 × 10⁵ autologen bestrahlten (3.000 RAD) PBMC in RPMI plus 10 % menschliches AB-Serum, rIL2 (20 E/ml) und Peptid-Gemisch 2 (erste Restimulation) oder Peptid 140-155 (10 μg/ml) für alle darauf folgenden Stimulationen gebildet. CTL-Linie E4 (aus Patient E.W.) und die CTL-Linien aus 4 weiteren Patienten (V.T., H.F., Q.M., C.N.) wurden durch Stimulieren von PBMC mit Peptid 140-155 plus rHBcAg in der ersten Woche und wöchentliche Restimulation hiernach mit Peptid 140-155 und rIL2 erstellt. Die PBMC der normalen, nicht infizierten Kontrollen wurden in ähnlicher Weise stimuliert, außer dass in ausgewählten Fällen Tetanustoxoid anstelle von rHBc während der ersten Stimulationswoche eingesetzt wurde, um eine andere Quelle für T-Zellen-Hilfe bereitzustellen, da diese Personen nicht HBcAg ausgesetzt worden waren.
HBV-spezifische CTL-Klone wurden durch Grenzverdünnung bei 1 Zelle/Well in 96-Well-Mikrotiterplatten aus einer HBV-spezifischen CTL-Linie E4 (Patient E.W.) gebildet. Nach Entfernung von CD4+-Zellen von der CTL-Linie durch Inkubation mit einem monoklonalen, CD4-spezifischen Antikörper (Becton Dickinson, Mountain View, CA) plus Komplement wurden die Zellen in Gegenwart von PHA bei 1 μg/ml, CD3- spezifischem, monoklonalem Antikörper bei 0,5 μg/ml (Coulter Immunology, Hialeah, FL), rIL-2 (20 E/ml) und bestrahlten (5.000 RAD), allogenen PBMC bei 10⁵/Well ausplattiert. HBV-spezifische Klone wurden in einer 24-Well-Platte mit 105 bestrahlten (9.000 RAD), autologen Transfektanten, die die HBV-Kernregion (wie oben beschrieben) exprimierten, mit 2 × 10⁶ allogenen, bestrahlten (3.000 RAD) PBMC-Feeder-Zellen pro Well, in RPMI-1640-Medium, das 10 % hitzeinaktivierte FCS und IL2, 20 E/ml, enthielt, restimuliert.
Für Target-Zelllinien wurden autologe und allogene, EBV-transformierte B-Lymphoblastenlinien (LCL) entweder bei The American Society for Histocompatibility and Immunogenetics (Boston, MA) erworben oder aus einem Pool von Patienten und normalen Spendern wie oben beschrieben erstellt. Die Zellen wurden in RPMI mit 10 Vol.-% hitzeinaktiviertem FCS aufrechterhalten. Kurzlebige Linien autologer PBMC-Blasten wurden durch Stimulieren peripherer Blut-PBMC mit PHA bei 1 μg/ml in RPMI mit 10 % FCS, 10 E/ml rIL2, 7 Tage lang vor der Verwendung als Targetzellen hergestellt.
Zytotoxizitätstests wurden unter Verwendung von Targetzellen von entweder a) autologen, PHA-stimulierten Blasten oder allogenen, mit HLA übereingestimmten und nicht-übereingestimmten B-LCL, über Nacht mit synthetischen Peptiden bei 10 pg/ml inkubiert; b) oben beschriebenen, stabilen B-LCL-Transfektanten; oder c) B-LCL, infiziert mit rekombinanten Vakziniaviren, durchgeführt. Vakzinia-infizierte Targets wurden durch Infektion von 1 × 10⁶ Zellen bei 50 plaquebildenden Einheiten/Zelle auf einer Schwingplatte bei Raumtemperatur eine Stunde lang, gefolgt von einem einzelnen Waschschritt und Inkubation über Nacht bei 37 °C, hergestellt. Targetzellen wurden dann mit 100 uCi ⁵¹Cr eine Stunde lang markiert und dreimal mit HBSS gewaschen. Zytolytische Aktivität wurde in einem vierstündigen Standard- ⁵¹Cr-Freisetzungstest unter Verwendung von U-Boden-96-Well-Platten, die 5.000 Targets pro Well enthielten, bestimmt. Stimulierte PBMC wurden bei E:T-Verhältnissen zwischen 70-100:1 getestet, während HBV-Kern-spezifische CTL-Linien bei E:T-Verhältnissen zwischen 4-50:1 und stimulierte PBMC aus normalen Donoren bei ei nem E:T-Verhältnis von 60:1 getestet wurden. Alle Tests wurden in doppelter Ausführung durchgeführt. Die prozentuelle Zytotoxizität wurde aus der folgenden Formel errechnet: 100 × [(Versuchs-Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)]. Maximale Freisetzung wurde mittels Lyse von Targets durch Detergens (1 % Triton X-100, Sigma) bestimmt. Spontane Freisetzung belief sich in allen Tests auf weniger als 25 % der maximalen Freisetzung.
PBMC aus 2 Patienten (E.W. und H.P.) mit akuter HBV-Infektion wurde 7 Tage lang mit den zuvor beschriebenen Peptidgemischen stimuliert und anschließend auf zytolytische Aktivität gegen autologe, ⁵¹Cr-markierte, PHA-aktivierte Blasten, vorgepulst mit demselben Peptidgemisch oder mit Medium, getestet. Antworten wurden in beiden Patienten auf Gemisch 2 beobachtet (6). Die verbleibenden Zellen wurden eine zweite Woche lang mit Peptidgemisch 2 restimuliert, und die antigene Spezifität der restimulierten CTL-Linie wurde mit autologen, PHA-aktivierten Blasten-Targets, vorgepulst mit den einzelnen Peptiden, die innerhalb des Gemisches enthalten waren, festgestellt. Durch diesen Ansatz wurde gezeigt, dass das Peptid HBcAg 140-155 für die durch Gemisch 2 induzierte CTL-Aktivität in beiden Patienten verantwortlich war (7). Keine zytotoxische Aktivität wurde unter Verwendung nichtstimulierter PBMC von Patient E.W. als Effektoren gegen autologe B-LCL, gefüttert mit Peptid HBcAg 140-155, beobachtet, was darauf schließen lässt, dass während akuter HBV-Infektion spezifische CTL in geringer Konzentration im peripheren Blut vorhanden waren. Patient H.P. zeigte ebenfalls eine CTL-Antwort auf Gemisch 4 (6), für die zuletzt gezeigt wurde, dass sie für Kernreste 11-27 spezifisch und durch HLA-A2 eingeschränkt ist. Dies bewies, dass mehrfache, voneinander unabhängige, eingeschränkte CTL-Antworten auf nicht-überlappende CTL-Epitope, die am selben viralen Protein vorhanden sind, während akuter HBV-Infektion leicht nachweisbar waren.
HBcAg-140-155-spezifische CTL-Linien wurden durch wöchentliche Stimulation von PBMC entweder mit Gemisch 2 oder mit einer aktiven Peptidkomponente (Kernreste 140-155) gebildet. Linie E4 (Patient E.W.) wurde in Gegenwart von rHBcAg und Peptid HBcAg 140-155 gestartet; Linie H1 (Patient H.P.) wurde in Gegenwart von rHBc und Gemisch 2 gestartet. Nach vier Wochen Restimulation wurde die HLA-Klasse-I- Restriktion von CTL-Linie H1 durch Verwendung mehrerer allogener Targetzellen, die teilweise mit den Effektorzellen an den HLA-Klasse-I-Loci übereingestimmt wurden, jedoch mit HLA-Klasse II vollständig nicht-übereingestimmt wurden, getestet. Die Resultate, gezeigt in 8, veranschaulichen, dass die CTL-Aktivität auf HLA-Aw68 eingeschränkt war.
Die HBcAg-140-155-spezifische CTL-Linie E4 wurde bei 1 Zelle/Well in Gegenwart von Anti-CD3, PHA und allogenen PBL als Feeder-Zellen kloniert. Nach 2 bis 3 Wochen zeigten 15 % der überimpften Wells Proliferation, und die wachsenden Zellpopulationen wurden auf spezifische Lyse von autologen B-LCL, präinkubiert mit HBcAg 140-155, getestet. Zwei Klone (3D11, 2D7), die hocheffiziente spezifische zytotoxische Aktivität zeigten, wurden zur weiteren Analyse selektiert. Die Klone wurden gegen autologe und allogene Targetzellen, teilweise mit den Effektoren auf der Ebene von HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Allelen übereingestimmt, getestet. Für die zytolytische Aktivität von Klon 3D11 wurde erkannt, dass sie auf HLA A31 eingeschränkt war, und die zytolytische Aktivität von Klon 2D7, abgeleitet aus demselben Patienten, war auf HLA Aw68 eingeschränkt (9). Beide Klone zeigten in Durchflusszytometrie den CD4 -, CD8 + Phänotyp.
Diese Resultate wurden durch eine Analyse von 4 zusätzlichen HLA-A31- oder Aw68-positiven Patienten mit akuter HBV-Infektion (H.F., V.T., Q.M., C.N.) bestätigt und erweitert. In allen diesen Patienten wurden HBcAg-140-155-spezifische CTL-Linien wie für Linie E4 beschrieben hergestellt (Tabelle III). Unter Verwendung von teilweise mit HLA übereingestimmten allogenen Targetzellen wurde gezeigt, dass die CTL-Antwort durch das HLA-A31-Allel in Patient V.T. eingeschränkt war; in Patient Q.M. war sie eindeutig HLA-Aw68-eingeschränkt und in Patient C.N. war sie sehr wahrscheinlich Aw68-eingeschränkt, während die Antwort in Patient H.F. zu schwach war, um eine Analyse zu ermöglichen. TABELLE III. HBcAg-140-155-spezifische CTL-Antwort von CTL-Linien aus HLA-A31- und Aw68-Patienten mit akuter HBV-Infektion

PBMC stimuliert mit HBcAg 140-155 plus rHBcAg (1 μg/ml).

Die Fähigkeit von HBcAg-140-155-spezifischen CTL-Linien und Klonen, Targetzellen zu lysieren, die endogen synthetisiertes HBcAg exprimieren, wurde bestimmt. Zwei [polyklonale] CTL-Linien (E4 und H1) und zwei von Linie E4 abgeleitete Klone (3D11 und 2D7) wurden unter Verwendung autologer und allogener Targetzellen, die mit rekombinanten Vakziniaviren infiziert oder mit den EBV-basierten Expressionsvektoren, die die Synthese der HBV-Kern- und -Vorkernproteine durch die Zelle steuern, stabil transfiziert worden waren, darauf getestet. Linie H1 wurde gegen endogen synthetisiertes Kernprotein, induziert durch das rekombinante Vakziniavirus, getestet, und Linie E4 wurde gegen endogen synthetisierte Kern- und Vorkernproteine, induziert durch beide Expressionsvektoren, getestet (10). Die Klone 3D11 und 2D7 wurden nur gegen endogen synthetisierte Kern- und Vorkernproteine, induziert durch die rekombinanten Vakziniaviren (11), getestet. Signifikante Niveaus spezifischer zytolytischer Aktivität wurden in allen Fällen nachgewiesen (10 und 11). Die Erkennung von endogen synthetisiertem Antigen durch für HBcAg-140-155-Peptidspezifische Linien und Klone zeigte, dass das CTL-Epitop, dargestellt durch die Kernsequenz 140-155, durch das intrazelluläre Verarbeiten endogen synthetisierter HBV-Kern- und -Vorkernproteine gebildet wird und dass diese CTL in vivo während HBV-Infektion geprimt werden. Die letzte Schlussfolgerung wird durch die Unfähigkeit bestätigt, HBcAg-140-155-spezifische CTL-Linien aus 6 HLA-A31-positiven oder aus 4 HLA-Aw68-positiven, normalen nichtinfizierten Kontrollen zu erstellen.
Um das minimale, optimal erkannte HLA-A31- und -Aw68-eingeschränkte Epitop innerhalb von HBcAg 140-155 zu bestimmen, wurden Carboxy- und Amino-terminale Trunkierungen von HBcAg 140-155 gebildet, wie in Tabelle IV gezeigt wird. Klon 3D11, der auf HLA A31 eingeschränkt ist, und Klon 2D7, der auf HLA Aw68 eingeschränkt ist, waren Effektorzellen, die verwendet wurden, um die subtile Spezifität der CTL-Antwort zu definieren. Autologe B-LCL wurden mit den trunkierten Peptiden präinkubiert und als Targets mit den zwei Klonen verwendet. Die Daten weisen darauf hin, dass Sequenz 141-151 das minimale, optimal erkannte Epitop für beide Restriktionselemente ist. Aus Tabelle IV geht hervor, dass Rest 151 (Arg) den Carboxy-Terminus des Epitops definiert, der durch beide CTL-Klone erkannt wird, auch wenn Rest 150, der auch ein Arginin ist, ebenfalls als der Carboxy-terminale Rest, jedoch weniger effizient, für beide Klone dienen kann, so lange Rest 141 als Amino-Terminus dient. Auch wenn Rest 141 (Ser) der optimale Amino-terminale Rest zu sein scheint, weisen die Daten darauf hin, dass Rest 142 (Thr) auch als der Amino-Terminus des Epitops für beide Klone dienen kann, wenn Arg 151 der Carboxyterminale Rest ist. Dahingegen kann nur der auf HLA Aw68 eingeschränkte Klon (2D7) Thr 142 verwenden, wenn der Carboxy-Terminus des Peptids über Rest 151 verlängert ist. TABELLE IV: SUBTILE SPEZIFITÄTSANALYSE ZYTOTOXISCHER AKTIVITÄT DER KLONE 3D11 UND 2D7
Um die Grenzen des/der Epitops/e exakter zu definieren, wurde eine Dosis-Titrieranalyse durchgeführt, in der die zwei CTL-Klone mit allogenen, HLA-A31- und HLA-Aw68-positiven Targetzellen, präinkubiert mit den Peptiden 140-151, 141-150, 141-151, 141-152, 142-151, in unterschiedlichen Molkonzentrationen im Bereich von 10^-3 μM bis 1 μM inkubiert wurden. Wie in 12 gezeigt, stellen die Reste 141-151 ein minimales, optimal erkanntes Epitop dar, das durch beide der CTL-Klone erkannt wird. Amino-terminale Verlängerung durch einen Rest beeinflusste die Effizienz von Targetlyse durch die beiden Klone nicht, während der Zusatz einer Aminosäure am Carboxy-Terminus die CTL-Antwort sowohl für den auf HLA A31 als auch den auf Aw68 eingeschränkten Klon zehnfach reduzierte, was zeigt, dass beide HLA-Allele dasselbe Peptid an ihre entsprechenden CTL binden und es ihnen gegenüber präsentieren.
BEISPIEL VII
Auf HLA eingeschränkte CTL-Antwort auf HBV-Polymeraseepitope
Dieses Beispiel beschreibt die Identifikation einer auf HLA-A2 eingeschränkten CTL-Antwort auf zwei HBV-Polymerasepeptide in einem Patienten mit akuter viraler Hepatitis. Die Epitope sind in den Aminosäuresequenzen HBpol_61-69 Gly-Leu-Tyr-Ser-Ser-Thr-Val-Pro-Val (GLYSSTVPV) (in den Fig. auch als Peptid 927.32 bezeichnet) und HBpol_803-811 Ser-Leu-Tyr-Ala-Asp-Ser-Pro-Ser-Val (SLYADSPSV) (in den Fig. auch als Peptid 927.27 bezeichnet) vorhanden.
Die durch die HBpol-Peptide induzierten CTL wurden in PBMCs aus einem Patienten mit akuter Hepatitis gemäß dem in Beispiel VI beschriebenen Verfahren identifiziert, mit der Ausnahme, dass die PBMCs mit einzelnen Peptiden und nicht mit Peptidgemischen stimuliert wurden. Die resultierenden CTL-Linien und/oder -Klone wurden dann auf die Fähigkeit getestet, mit HLA-A2 übereingestimmte Targetzellen zu töten, die entweder mit dem Peptid gepulst waren oder die das entsprechende endogene Polymerase-Antigen (Vpol oder EBO-pol) exprimierten. Die Konstruktion der Vakzinia-basierten Vpol- und Epstein-Barr-Virus-basierten EBO-pol-Konstrukte erfolgte wie in Beispiel II beschrieben.
Wie in 13 gezeigt, stimulierten beide Peptide, HBpol_803-811 und HBpol_61-69, CTL-Antworten in einem Patienten (HLA-A2⁺) unter Verwendung von Targetzellen, die mit Peptid gepulst worden waren, während andere Peptide 927.24 (WILRGTSFR) und 927.30 (DLNLGNLNV) und Mediumkontrollen die spezifische CTL-Antwort nicht stimulierten. Die Fähigkeit der HBpol_803-811-spezifischen Klone, endogen synthetisiertes Polymerase-Antigen (Vpol und EBP-pol) zu erkennen, ist in 14 gezeigt. Zwei Klone, bezeichnet als Be.27-1A1 und Be.27-1A5, wurden identifiziert, die das HBpol_803-811-Peptid erkannten. Wie in 15 gezeigt, wurden CTL-Antworten auf HBpol_61-69 und HBpol_803-811 mit Targetzellen gezeigt, die mit homologem Peptid gepulst worden waren, doch nur der HBpol_803-811-Klon zeigte eine Antwort auf endogen synthetisiertes Vpol-Antigen.
BEISPIEL VIII
Auf HLA eingeschränkte CTL-Antwort auf HBV-X-Protein
Dieses Beispiel beschreibt die Identifikation einer auf HLA-A2 eingeschränkten CTL-Antwort in einem Patienten mit akuter viraler Hepatitis auf eine Peptidsequenz, die vom HBV-X-Protein abstammt. Das CTL-Epitop ist in einem Peptid der Aminosäuresequenz HBx_126-134 Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Phe-Val-Leu (EIRLKVFVL) vorhanden.
Die durch die HBpol-Peptide induzierten CTL wurden in PBMCs aus einem Patienten mit akuter Hepatitis gemäß dem in Beispiel VI beschriebenen Verfahren identifiziert, mit der Ausnahme, dass die PMBCs mit einzelnen Peptiden und nicht mit Peptidgemischen stimuliert wurden. Die resultierenden CTL-Linien wurden dann auf die Fähigkeit getestet, mit HLA-A2 übereingestimmte Targetzellen zu töten, die mit dem Peptid gepulst worden waren.
Wie in 16 gezeigt, wurden CTL durch HBx-Peptid 126-134 stimuliert, in dem der Amino-terminale Rest durch einen Alaninrest substituiert worden war (EIRLKVFVL → AIRLKVFVL). CTL, die das analoge Peptid erkannten, erkannten auch das Peptid mit der Wildtypsequenz. Andererseits war das Wildtyppeptid nicht in der Lage, eine spezifische CTL-Antwort zu induzieren, die mit Zellen nachweisbar waren, die mit einem der beiden Peptide gepulst worden waren.
BEISPIEL IX
Auf HLA eingeschränkte CTL-Antwort auf HBenv348-357
Dieses Beispiel beschreibt die Identifikation einer auf HLA-A2 eingeschränkten CTL-Antwort in einem Patienten mit akuter viraler Hepatitis auf eine Peptidsequenz, die vom HBV-Hüllprotein abstammt. Das CTL-Epitop ist in einem Peptid der Aminosäu resequenz HBenv_348-357 Gly-Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val (Subtyp ayw) vorhanden.
Die durch das HBenv_348-357-Peptid induzierten CTL wurden in PBMCs aus einem Patienten mit akuter Hepatitis gemäß dem in Beispiel VI beschriebenen Verfahren identifiziert, mit der Ausnahme, dass die PMBCs mit einzelnen Peptiden und nicht mit Peptidgemischen stimuliert wurden. Die resultierende CTL-Linie wurde dann auf die Fähigkeit getestet, mit HLA A2 übereingestimmte Targetzellen zu töten, die mit dem Peptid gepulst worden waren oder die endogene Hüllantigene der ayw- oder adw-Subtypen exprimierten.
Wie in 17 gezeigt, reagierten CTL, die durch HBenv-Peptid 348-357 stimuliert wurden, auf Targetzellen (bei einem Effektorzellen:Targetzellen-Verhältnis von 3:1), gepulst mit Peptid (bezeichnet als 884.01-ayw), und auf endogenes Hüllantigen vom ayw-Subtyp, erkannte jedoch nicht den adw-Subtyp, wahrscheinlich aufgrund des unterschiedlichen Carboxy-terminalen Aminosäurerests.
Die in den vorangehenden Beispielen beschriebenen Resultate zeigen, dass die CTL-Antwort auf HBV in Menschen stark polyvalent zu sein scheint, wahrscheinlich, um wirksamen Schutz vor dieser schwerwiegenden Virusinfektion zu gewährleisten. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass die hierin verwendete Vorgehensweise zur Peptidstimulation in ihrer eingeschränkten Form, wie sie durch den polymorphen HLA-Klasse-I-Locus entsteht, sowohl effizient als auch wirksam zur Identifikation und Analyse der polyvalenten Antwort ist. Da zusätzliche, HLA-Allel-spezifische Bindungsmotive identifiziert werden, können von HBV abgeleitete Peptide, die diese Motive enthalten, zur In-vitro-Stimulation von CTL-Vorläufern verwendet werden.
Aus der obigen Beschreibung geht hervor, dass, auch wenn hierin spezifische Ausführungsformen der Erfindung zur Veranschaulichung beschrieben wurden, verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von der Idee und dem Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Folglich ist die Erfindung ausschließlich durch die beiliegenden Patentansprüche eingeschränkt.

Claims

HBV-spezifische CTL induzierendes Peptid, das aus einer Sequenz aus zumindest 9 Aminosäuren aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: I (HBc_11-27) Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val.
CTL-induzierendes Peptid nach Anspruch 1, das II (HBc_19-27) Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val oder III (HBc_18-27) Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val ist.
HBV-spezifische CTL induzierendes Peptid, das I (HBc_11-27) Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val ist.
HBV-spezifische CTL induzierendes Peptid, das aus einer Sequenz aus zumindest 10 Aminosäuren aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: V (I-HBc_140-154) Leu-Ser-Thr-Leu-Pro-Glu-Thr-Thr-Val-Val-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg.
HBV-spezifische CTL induzierendes Peptid, das aus einer Sequenz aus zumindest 10 Aminosäuren aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: IV (HBc_111-125) Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp.
HBV-spezifische CTL induzierendes Peptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: VII (HBpol_61-69) Gly-Leu-Tyr-Ser-Ser-Thr-Val-Pro-Val.
HBV-spezifische CTL induzierendes Peptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: VIII (HBpol_803-811) Ser-Leu-Tyr-Ala-Asp-Ser-Pro-Ser-Val.
HBV-spezifische CTL induzierendes Peptid, das aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht: IX (HBx_126-134) Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Phe-Val-Leu.
HBV-spezifische CTL induzierendes Peptid, das aus einer Sequenz aus zumindest 9 Aminosäuren, ausgewählt aus: X (HBenv_348-357) Gly-Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val besteht.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Bereitstellung einer Immunantwort auf HBV.