HUT67529A - Peptides for inducing cytotoxic t-lymphocyte respones to hepatitis b virus - Google Patents

Description

A hepatitisz B vírus (HBV) hepatocitákat fertőz, és akut valamint krónikus májmegbetegedéseket és hepatocelluláris karcinómát okoz. A fertőzés jellegzetesen fertőzött vérrel vagy testfolyadékkal történik, ennek következtében a HBV fertőzés leginkább az intravénás .narkomániások, a homoszexuálisok között fordul elő, valamint olyan országokban, amelyekben kevésbé fejlett az egészségügyi rendszer, és elég nagy a veszélye annak, hogy fertőzött vérkészítményekkel kerülnek kapcsolatba az emberek. A fertőzött egyedeknek körülbelül 90-95%-a képes leküzdeni a fertőzést, míg a maradék 5-10%-ban krónikus hepatitisz fejlődik ki, és átmegy hordozó állapotba, annak a lehetőségével, hogy később májcirrózis és/vagy hepatocelluláris karcinóma fejlődik ki. Egy friss becslés szerint a világban körülbelül 250 millió ember krónikus hordozója a HBV-nek.

A máj sejt HBV fertőzés következtében bekövetkező sérülésének patogén mechanizmusa még nem ismert elég jól, jóllehet az a vélemény alakult ki, hogy a vírus közvetlenül nem citopatikus. Mivel azonban a HBV nem könnyen fertőzi meg a humán sejteket in vitro körülmények között, ezért a vírust nagyon nehéz tanulmányozni. Ennek következtében jelenleg még nincs hatékony kezelés a létrejött HBV fertőzésre.

Széles körben elterjedt vélemény, hogy a HBsAg az a HBV antigén, amely egy védő immunválaszt indukál, amely lehetővé teszi a legtöbb fertőzött egyed számára, hogy a védő antitest révén leküzdje a fertőzését. Tény, hogy az anti-HBV burok antitestek képesek semlegesíteni a HBV részecskéket, és a HBsAg • · ·

alapj án vakcinákat fejlesztettek ki, amelyek megakadályozzák, hogy a vakcinákban krónikus HBV hordozók illetve rekombináns DNS

4,599,231 számú USA szabadalmi bejelentések]. Az anti-HBsAg vakcinák azonban az immunizált embereknek csak

90%-ában nyúj tanak védelmet.

Azok, akiket immunizáltak, de nem fejlődött ki bennük a védelem, nemvárt tartalékai potenciális fertőzésnek.

A HBV nukleokapszid mag antigén (HBcAg) szerepe a védő immunitás kifejlesztésében sokkal kevésbé tiszta.

Néhány esetben, a csimpánzok és az amerikai mormoták immunizálása a nukleokapszid mag antigénnel (HBcAg vagy WHcAg) teljes, vagy részleges védelmet nyújtott a HBV vagy

HBcAg-specifikus is kimutatták, hogy támogatják az anti-burok antitest

HBV burokspecifikus hogy érzékenyítő antigén az intrahepatikus T-sejtek számára a krónikus

A HBV antigének elleni immunitás egyéb formáinak a jelentőségét, főleg a citotoxikus T-limfocitákat magába foglaló formának a jelentőségét nehezen lehet megbecsülni. Chisari és munkatársai azt javasolták, hogy a máj sejtek sérülését befolyásolni lehet egy HLA I-es osztályúra korlátozódó, a HBV által kódolt antigén elleni CD8⁺ citotoxikus T-sejt válaszra [Chisari et al., Microbial. Pathogen., 6, 31 (1989)]. Az I-es típusú fő hisztokompatibilitásra (MHC) korlátozódó citotoxikus

T-limfocita válaszokat számos más vírus esetében kimutatták, például az influenza esetében. Például Townsend és munkatársai [Cell, 44, 959 (1986)] leírták, hogy a citotoxikus T limfociták által felismert influenzavírus nukleoprotein epitopjait szintetikus peptidekkel lehet meghatározni. Egy kísérlet során, amikor megpróbálták meghatározni a HBV elleni citotoxikus Tlimfocita választ, kimutatták, hogy az akut és krónikus HBV-ben szenvedő betegekből származó perifériális vér limfocitái képesek lehetnek arra, hogy elpusztítsák az autológ hepatocitákat in vitro, de a citolitikus aktivitás specifikusságát, a HLA restrikciós elemeit, és a celluláris fenotípust nem határozták meg [Mondelli et al., J. Immunoi., 129, 2773 (1992); Mondelli et al., Clin. Exp. Immunoi., 6, 311 (1987)]. Újabban Moriyama és munkatársai [Science, 248, 361-364 (1990)] írták le, hogy a HBV fő burok antigénje a hepatocita felszínén expresszálódott, olyan formában, amely felismerhető az MHC I-es csoportra korlátozódott, CD8⁺ citotoxikus limfociták és a burokspecifikus antitestek számára.

Jóllehet a HBV-nek különböző törzsei léteznek, ezek mind tartalmaznak legalább egy közös burok determinánst, amelynek a jele a. Mindegyik törzsnek van még két másik burok determinánsa, az egyiknek a jele d vagy y, a másiknak a jele w vagy r. A vírusnak tehát négy lehetséges altípusa van: adw, ayw, adr és ayr. HBV klónozását, szekvenálását és expresszióját a GB 2034323 illetve az U.S. 4,935,235 számú szabadalmi bejelentésekben írják le, és a HBV komplett nukleokapszid régióját is leírták [Galibert et al., Natúré, 281, 646 (1979)], ezekre mind hivatkozunk az alábbiakban.

Mivel a jelenleg elfogadott HBV vakcinák csak körülbelül 90%-ban védik meg az immunizált egyedeket, ezért kívánatos lenne, ha hatékonyabb immunitást lehetne kiváltani, például úgy, hogy fokozzuk, vagy sokrétűbbé tesszük a vakcinák immunogenitását. Az is kívánatos lenne, hogy fokozzuk az egyes, HBV-vel fertőzött egyedek immunválaszát, hogy reagáljanak a megfelelő HBV antigénekre és eliminálják a fertőzést, illetve megakadályozzák, hogy az akut fertőzésből krónikus fertőzés legyen. Emellett azok az eszközök, amelyekkel meg lehet jósolni, hogy melyik, akut HBV fertőzésben szenvedő betegben fog feltehetően krónikus fertőzés kifejlődni, és lesz belőle HBV hordozó, lehetővé teszik a megfelelő kezelést, és/vagy a megfelelő óvintézkedések megtételét a fertőzési folyamat korai fázisában. Meglehetősen meglepő módon, a jelen találmány kielégíti ezeket, és az ezekkel rokon igényeket.

A jelen találmány tárgyát olyan peptidek képezik, amelyek MHC I-es osztályra korlátozott citotoxikus T limfocita válaszokat indukálnak a HBV antigénnel szemben. A számunkra érdekes peptidek a HBV nukleokapszidból származnak. Bizonyos megvalósítási módok szerint a peptidek hattól ötvenig terjedő számú aminosavból állnak, és legalább négy egybefüggő aminosav szekvenciát tartalmaznak a ΙΙ-es szekvenciából (HBc₁₉_₂₇) [Seq. ID. No. 4] Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val, amelyben a peptidet adott esetben módosítani lehet illetve határolni lehet az N- és Cterminálisokon vagy csak az egyik terminálison, ahogy szükséges. Az előnyös megvalósítási módok szerint a peptid szekvenciája Alá-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val, (HBc-l-l_27) [Seq. ID. No. 21), illetve Leu-Pro-Ser- Asp-Phe-Phe-

Pro-Ser-Val (HBc2g_27) [Seq. ID No. 4], amely régiók megőrződnek a HBV fő altípusai között, jóllehet szubsztitúciók, deléciók és addíciók révén változtathatjuk a pepiidet, anélkül, hogy jelentősen károsítanánk a biológiai aktivitását.

Más megvalósítási módok szerint a peptidek körülbelül hatötven aminosavból állnak, és legalább négy egybefüggő rész van bennük a V szekvenciából (^HBc 14 ο -15 4) í^Se<3· ^ID No.

Leu-Ser-Thr-Leu-Pro-Glu-Thr-Thr-Val-Val-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg, amelyben a peptidet adott esetben módosítani lehet illetve határolni lehet az N- és C-terminálisokon vagy csak az egyik terminálison, ahogy szükséges. Egy másik megvalósítási mód szerint a peptidek legalább hét egymás utáni aminosavból származnak a szekvenciából, aholis a ^HBcn-i₂5 ^a HBV awy altípusához tartozik, szekvenciája Gly-Arg-Glu-Thr-Val-IleGlu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp [Seq. ID No. 6] , és a végeket az előzőkben említett módon lehet módosítani. Egy további megvalósítási mód szerint egy MHC I-re korlátozott citotoxikus T limfocita választ indukáló peptid a VI-os peptid (HBC28-47) [SEQ. ID NO. 8], amelynek a szekvenciája Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Thr-AlaSer-Ala-Leu-Tyr-Arg-Glu-Ala-Leu-Glu-Ser-Pro-Glu-His, és a kiválasztott peptid végei szükség esetén módosíthatók.

A különböző peptid megoldáoknál nyilvánvaló, hogy a peptidek polimerizálhatok, mindegyik önmagával, hogy nagyobb homopolimereket hozzanak létre, illetve más peptidekkel, heteropolimerek létrehozása céljából. Néhány esetben a peptideket kombináljuk egy készítményben keverék formájában, és nem kapcsoljuk össze őket. A peptid konjugálható lipidtartalmú molekulákhoz, amelyek képesek fokozni egy T limfocita választ, «

···<

illetve egy másik peptidhez, amely például fokozza a T-segítő sejt választ.

A találmány tárgyát olyan készítmények képezik, amelyek egy, a találmány szerinti peptidet tartalmaznak, egy másik peptiddel, egy adjuvánssal és/vagy egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval formulázva. Tehát gyógyászati készítmények használhatók akut HBV fertőzés kezelési eljárásaiban, különösen azokban az erőfeszítésekben, amelyekben azt akarják megakadályozni, hogy a fertőzés krónikus vagy hordozó állapotba fejlődjön. A HBV fertőzés és a HBV hordozó állapotok kezelésére szolgáló módszerek is a találmány tárgyát képezik, aholis a gyógyászati készítményeket fertőzött egyedeknek adjuk be olyan mennyiségben, amely elegendő ahhoz, hogy immunológiailag hatásos citotoxikus sejtválaszt serkentsünk HBc epitopok ellen. Ezeknek a fertőzéseknek a kezelésében különösen kívánatos, hogy kombináljuk azokat a peptideket, amelyek MHC I osztályra korlátozott citotoxikus T limfocita válaszokat indukálnak a HBV antigénnel szemben más peptidekkel vagy fehérjékkel, amelyek immunválaszt indukálnak más antigénekkel, például a HBsAg-vel szemben. Azoknak a betegeknek a kezelésére, akik krónikus vagy hordozó állapotú fertőzésben szenvednek, a készítményeket ismételt dózisokban adhatjuk be egy hosszabb időtartam alatt, ha szükséges, hogy a vírusfertőzést és/vagy a vírus rejtőzését feloldjuk, illetve lényegesen zavarjuk.

A találmány tárgyát továbbá HBV fertőzés, főleg krónikus HBV fertőzés megakadályozására alkalmas vakcina készítmények képezik. A vakcina készítmények egy immunológiailag hatásos mennyiségű HBV nukleokapszid fehérjét tartalmaznak, amely egy MHC I osztályra korlátozott citotoxikus T limfocita választ indukál, ilyen például a HBcAg₁₁_₂7, amelynek szekvenciája Ala-Thr-Val-Glu-LeuLeu-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val, főleg a HLA-A2 haplotípusú egyedek esetében, emellett általában tartalmaznak egy adjuvánst, például inkomplett Freund féle adjuvánst vagy aluminium-hidroxidot. Hogy elérjük a HBV elleni fokozott védelmet, a vakcina tartalmazhat emellett olyan komponenseket, amelyek védő antitestek keletkezését váltják ki a HBV burokfehérje antigénnel szemben.

A találmány további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát diagnosztikai módszerek képezik, amelyekben a találmány szerinti peptidek használhatók egy egyedben azon limfociták jelenlétének meghatározására, amelyek képesek citotoxikus T-sejt választ kiváltani a HBV nukleokapsziddal szemben. Az ilyen sejtek hiánya meghatározza, hogy a kérdéses egyed érzékeny-e arra, hogy krónikus HBV fertőzés fejlődjön ki benne. Általában a limfociták perifériális vér limfociták, és a vizsgált egyed akut HBV fertőzésben szenved.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábrán azok a peptidek láthatók, amelyeket egyesítve alkalmazunk azzal a céllal, hogy serkentsük a perifériális vér mononukleáris sejtjeit, hogy azonosítsák a HBV-specifikus citotoxikus T-limfocitákat.

A 2. ábrán a citotoxikus T-sejtek megfigyelt aktivitásának ábrázolása látható az egyesített peptidekkel az egyes betegekben; M.B. (2A. ábra), V.J. (2B. ábra) és J.P. (2C. ábra), és a HLA-A2-re korlátozott válasz, ahol az egyes betegek és célsejtek • ·

közötti közös HLA allélek láthatók.

A3. ábrán az endogén módon szintetizált nukleokapszid antigén felismerése látható a peptid-specifikus CTL révén, a betegből származó effektor sejtekkel; M.B. (A panel) és J.P. (B panel), ahol vW jelentése vad típusú vakolnia, Vcore jelentése a HBcAg nyitott leolvasási keretet hordozó vakolnia, EBO-env jelentése egy EBV alapú episzomális vektor, amely a HBV burkot expresszálja, és az EBO-core jelentése egy EBV alapú episzomális vektor, amely HBV nukleokapszid antigént expresszál.

A 4. ábrán a HLA-A2-re korlátozott CTL szelektív expanziója látható, amely felismeri az endogén módon szintetizált HBV nukleokapszid antigént, ahol az A panel a V.J. CTL vonal citolitikus aktivitását a HLA-A2-vel illeszkedő BCL-lel, amely lehet akár HBC]_-|__27 pepiiddel prepulzált, illetve egy közegben egymagában tenyésztett, és EBO-transzfektánsokkal szemben, amelyek nukleokapszid vagy burok antigéneket expresszálnak, olyan kísérletekben, amelyeket EBO-core transzfektánsokkal végzett serkentés előtt két héttel illetve utána négy héttel végzünk; a B panel a V.J. CTL vonallal való felismerést mutatja EBO-core transzfektánsokkal végzett 1, 2 vagy 3 egymást követő serkentés után 3, 4 és 5 héttel; a C panel a HLA-A2-vel illeszkedő illetve nem illeszkedő BCL célpontok elleni CTL aktivitást mutatja, amely célpontokat a tenyésztés 5. hete után rekombináns vakcínia vírusokkal fertőztünk.

Az 5. ábrán egy olyan epitop ^HBcn-27 specifikus CTL felismerését látjuk, amelyet a HBV mag és és előmag (precore) régió által kódolt polipeptidek osztanak meg, és a polipeptideket rekombináns vakcíniával fertőzött HLA-A2 BCL expresszálja, aholis

9

- 10 a J.V. CTL vonalat használjuk az effektor sejtek forrásaként.

A 6. ábrán a HBV-specifikus CTL szintetikus peptidek keverékével PBMC serkentés révén való aktiválását látjuk. A PBMC citolitikus aktivitása egy hétig serkentett azokkal az autológ célpontokkal szemben, amelyeket ugyanazzal a serkentő keverékkel prepulzáltunk, illetve csak a tápközeggel. A használt E/T arány 70:1 az E.W. beteg esetében és 100:1 a H.P. beteg esetében.

A 7. ábra megerősíti, hogy a HBcAg 140-155 az a peptid, amelyet a 2. keverék felismer. A 2-es keverékben levő peptidekkel serkentett PBMC citolitikus aktivitása az első héten, és újra serkentettük ugyanazokkal az autológ peptidekkel szemben, amelyeket a keverékben levő egyes peptidekkel prepulzáltunk. A használt E/T arány 50:1 volt az E.W. beteg esetében és 40:1 volt a H.P. beteg esetében.

A 8. ábrán az látható, hogy az Aw68 a Hl vonal HBcAg 140-155 specifikus CTL válasz korlátozó eleme. Az allogén célsejteket prepulzáljuk a HBcAg 140-155 pepiiddel vagy a tápközeggel, ezek illeszkedtek az I-es osztály szintjén az effektor sejtekkel, és egyáltalán nem illeszkedtek, a ΙΙ-es osztály szintjén. A használt E/T arány 4:1 volt.

A 9. ábrán az látható, hogy az Aw68 és az A31 a HBcAg 140144 specifikus CTL válaszkorlátozó elemei a 2D7 illetve a 3D1 kiónok esetében. Az autológ és allogén célsejteket a 140-155 peptidekkel prepulzáltuk. Az allogén célsejtek illeszkedtek az I-es és ΙΙ-es osztály szintjén is az effektor sejtekkel. A használt E/T arány 10:1 volt.

A 10. ábrán az látható, hogy az E4 ás Hl HBcAg 140-155 specifikus CTL vonalak képesek lizálni az endogén módon szintetizált antigént expresszáló sejteket. Az E4 vonal esetében alkalmazott E/T arány 10:1 volt, a Hl vonal esetében alkalmazott

E/T arány 20:1 volt a pepiiddel prepulzált célsejtek esetében, és

15:1 volt a rekombináns vakcínia vírussal fertőzött célsejtek esetében.

A 11. ábrán az látható, hogy a 2D7 és 3D11 CTL kiónok képesek lizálni azokat a sejteket, amelyek az endogén módon szintetizált antigént HLA-korlátozott módon expresszálják. A 2D7

és 3D11 kiónokat vizsgáljuk Aw68 illetve A31 pozitív	allogén
célsejtekkel szemben, amelyeket előinkubáltunk a	140-155
peptiddel, és a HBV mag illetve előmag fehérjéjét	kódoló

rekombináns vakcínia vírussal fertőztünk.

A 12. ábrán azoknak a kísérleteknek az eredményei láthatók, amelyek azt mutatják, hogy a 141-151 peptid a legrövidebb, optimálisan felismerhető szekvencia a HBcAg 140-155-ben mindkét korlátozó elem számára. A 3D11 kiónt vizsgáltuk allogén A31pozitiv célsejtekkel szemben, és a 2D7 kiónt vizsgáltuk allogén Aw68~pozitív célsejtekkel szemben. A célsejteket 0,001-1 gmol/l koncentrációtartományba eső peptidekkel prepulzáltuk. A használt E/T arány 10:1 volt.

A 13. ábrán két polimeráz peptidre adott CTL válasz látható, amely peptidek tartalmazzák a HLA-A2 motívumot egy betegben, olyan peptiddel pulzált célsejteket alkalmazva,amelyek csak a HLA-A2-nél illeszkednek.

A 14. ábrán számos polimeráz 803-811 peptid specifikus kiónnak az a képessége látható, hogy képesek felismerni az endogén módon szintetizált polimerázt.

A 15. ábrán az látható, hogy a 803-811 polimeráz peptidre • 4 • « adott CTL válasz képes felismerni azokat a sejteket, amelyeket pepiiddel és endogén módon szintetizált polimerázzal pulzáltak (Vpol), míg a 61-69 polimeráz peptidre adott CTL válasz csak a

61-69 peptiddel pulzált sejteket ismerte fel.

A 16. ábrán egy CTL válasz indukciója látható egy HBX 126134 peptid analóg révén, amely válasz nem indukálódik a vad típussal.

A 17. ábrán a HBenv 348-357 peptiddel serkentett CTL válasz látható olyan célsejtekkel szemben, amelyeket homológ peptidekkel pulzáltunk (jele 884.01-ayw), valamint az ayw altípusba tartozó endogén burok antigénnel szemben, de nincs válasz az adw altípusba tartozó antigént expresszáló sejtekkel szemben.

A jelen találmány tárgyát a HBV fehérjékből származó peptidek képezik, amelyeket a HBV fertőzés kezelésében, megelőzésében és diagnosztizálásában használatos készítményekben és módszerekben alkalmazunk. A peptidek serkentik az MHC HLA I-es osztályra korlátozott citotoxikus T limfocita válaszokat a HBVvel fertőzött sejtekkel szemben. A serkentett citotoxikus T limfociták képesek elpusztítani a fertőzött sejteket, illetve gátolni a vírus replikációját, és ezáltal megszakítani, illetve lényegében megelőzni a fertőzést, beleértve a krónikus HBV fertőzést. Egy olyan peptid, amelyik hatékonyan vált ki citotoxikus T-sejt válaszokat, szintén kombinálható egy olyan immunogénnel, amely képes T-segítő válasz kiváltására.

A találmány egyik megvalósítási módja szerint a találmányban alkalmazott peptidek két független HBV nukleokapszid (HBc) polipeptidből származnak, a mag és az előmag polipeptidekből. Az előmag egy amino-terminális szignál szekvenciát tartalmaz, amely a transzlokációt az endoplazmatikus retikulumba irányítja, a szekréciót HBeA formában valósítja meg, míg a mag elsődlegesen egy citoplazmatikus és sejtmag fehérje (HBcAg), és nem szekretálódik. A peptidek a 19-27 HBc csoportokból, a HBc2g_47, a ^HBclll-125' ^{a HBc}140-154 (főleg a ^HBci4i-i5i) régióból származik, ahol a számozást Galibert és munkatársai leírása szerint adjuk meg. Egy másik megvalósítási mód szerint a peptidek a HBV polimeráz fehérje szekvenciájából származnak (HBpol), főleg a CTL epitopokból a HBpol61_g9 és a HBpolgQ3_g11~ből. Egy másik megvalósítási mód szerint a peptidek CTL-t indukáló epitopokat tartalmaznak, amelyek a HBV transzkripciós transzaktivátor fehérjéből, a HBx-ből származnak, pontosabban a ^HBx126-134 régióból. A CTL-t indukáló peptideket a HB burok antigénből is elő lehet állítani, főleg abból a pepiidből, amely megfelel a HBV HBenvg^g-g57-es szekvenciának.

A jelen találmány szerinti HBV citotoxikus T limfocitát indukáló peptid vagy oligopeptid jelentése egy olyan lánc, amely legalább négy HBV aminosav szekvencia csoportból áll, előnyösen legalább hatból, még előnyösebben nyolcból vagy kilencből, néha tízből vagy tizenkettőből, általában tizenötnél kevesebből, még gyakoribb, hogy harminckettőnél kevesebből, és előnyösen ötvenkettőnél kevesebből, például nyolc-tizenhét, egy HBc szekvenciából származó aminosav szekvenciából. Szükséges lehet, hogy a találmány szerinti peptideket nyolc-tizenkét aminosav hosszra optimalizáljuk, ami méretben összemérhető az endogén módon processzált virális peptidekkel, amelyek a sejt felszínén az MHC I-es osztályú molekulákhoz kötődnek [Schumacher et al., Natúré, 350, 703-706 (1991); Van Bleek et al., Natúré,

348, 213-216 (1990) ;

(1990) ;

Rotzschke et al., Natúré, 348, 252-254

Fáik et al., NAture, 351, 290-296 (1991)], amely publikációkat referenciának tekintünk a továbbiakban. Amint azt az alábbiakban részletesebben leírjuk, a peptidekben általában többségben vannak azok az aminosavak, amelyek homológok az előzőkben azonosított HBV szekvenciák megfelelő, egybefüggő részével, és egy CTL-t indukáló epitopota tartalmaznak.

A peptideket előállíthatjuk szintetikusan, amint azt az alábbiakban ismertetjük, valamint rekombináns DNS technológiával. Jóllehet a peptid előnyösen lényegében mentes más természetes HBV fehérjéktől és azok fragmentjeitől, néhány megvalósítási módban a peptideket szintetikus úton konjugáltathatjuk natív fragmentekhez vagy részecskékhez. A peptid szakkifejezést a jelen leírásban a polipeptiddel azonos értelemben használjuk, hogy az aminosavak olyan sorozatát jelöljük így, amelyeket egymáshoz peptid kötések kötnek a szomszédos aminosavak alfa-amino és alfa-karboxil csoportjai között. A polipeptidek vagy peptidek hossza változó lehet, akár semleges (töltés nélküli) alakjukban, vagy sóformában, és vagy nincsenek módosítva, például glikozilezve, oldalláncúk eloxidálva, vagy foszforilezve, vagy tartalmazzák ezeket a módosításokat, azzal a feltétellel, hogy a módosítás nem rontja el az alábbiakban ismertetett polipeptidek biológiai aktivitását.

Nagyon előnyös, ha a peptid mérete a lehető legkisebb, miközben még megtartja a nagy peptid összes biológiai aktivitását. A biológiai aktivitás alatt azt értjük, hogy képes egy megfelelő MHC molekulához kötődni, és képes citotoxikus T limfocita választ indukálni HBV antigénnel vagy antigén • ·

- 15 mimetikummal szemben.Egy citotoxikus T limfocita válasz alatt egy olyan CD8⁺ T limfocita választ értünk, amely specifikus egy számunkra fontos HBV antigénre, aholis a CD8⁺, MHC I-es osztályba tartozó T limfociták aktiválódnak. Az aktivált T limfociták limfokineket szekretálnak (például gamma interferont), termékeket szabadítanak fel (például szerin észterázokat), amelyek gátolják a vírus replikációját a fertőzött autológ sejtekben vagy transzfektált sejtekben, a sejteket vagy elpusztítva vagy nem.

A homológ, lényegében homológ és lényeges homológia szakkifejezések jelentése a továbbiakban olyan aminosav szekvencia, amely legalább 50%-ban azonosságot mutat, ha a szekvenciát egy referencia aminosav szekvenciához hasonlítjuk. A szekvencia azonosság vagy homológia százalékát úgy számítjuk ki, hogy az egyiket összehasonlítjuk a másikkal, ha a referencia szekvencia megfelelő részeivel illesztjük.

A találmány szerinti, a nukleokapszid régióból származó CTL-indukáló HBV peptid hat-harmincöt aminosavat tartalmaz, és legalább egy HLA-korlátozott CTL epitop helyet tartalmaz a ^HBc11-27 ΡθΡΐίά régióból. A peptid aminosavainak legnagyobb része azonos, vagy lényegében homológ a természetben előforduló HBC11-27 régió megfelelő részeivel, aholis a ^HBc11-27 szekvenciája az alábbi:

I (HBc11-27) Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val Ennek a HBc₁₁_₂7 régiónak a peptidje adott esetben az egyik vagy mindkét végén (a C-terminálison és az N-terminálison) módosítva lehet, vagy tartalmazhat határoló szakaszokat, ha szükséges, a HBV szekvenciákból származó aminosavakkal, beleértve a HBc-t, a • · *

kapcsolódást megkönnyítő aminosavakat, más N- és C-terminális módosításokat, hordozókhoz való kötődést, stb., amint azt a továbbiakban részletesen ismertetkük. A ^HBcn-27 peptid citotoxikus T limfocita választ indukál, amelyet legalább a HLAA2 MHC I-es osztályba tartozó molekula befolyásol.

Az I-es peptid régión belül olyan peptidek vannak, amelyek tartalmazzák a kilenctagú HBc₁₉_₂₇ peptidet, és tartalmaznak egy HLA-korlátozott CTL-indukáló epitopot, valamintebbol származó peptideket, amelyek egy CTL-indukáló epitóp helye(ke)t tartalmaznak, méretük legalább négy egybefüggő aminosav a HBcig-27 szekvenciából, amelyben a ^HBc19-27 szekvenciája az alábbi:

II (HBc₁₉_₂₇) [SEQ. ID No. 4]

Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val, amely peptid lehet módosítva, vagy tartalmazhat határoló szakaszokat egyik vagy mindkét végén, amint azt az I-es peptidnél az előzőkben említettük. Csakúgy mint az I-es peptid, a Il-es peptid egy citotoxikus T limfocita választ indukál, amelyet legalább a HLA-A2 befolyásol.

Az I/II peptid régióban egy különösen előnyös kiviteli alak egy tíztagú peptid, a ΗΒο₁₈_₂₇, amelynek szekvenciája az alábbi:

III (HBc₁₈_₂₇) [SEQ. ID NO. 5]

Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val, amely peptid az előzőkben említettek szerint lehet módosítva, illetve tartalmazhat határoló szakaszokat.

találmány szerinti másik HBc peptid tizenöttagú ^HBcm-i25 peptidet, valamint a tartalmazza

-bői származó peptideket, amelyek egy CTL-indukáló

I-es osztályra ♦ ····· · ♦ · • ·· · · · ·· • · · · ·· · · · • ··· ·· ·· · « · .

korlátozott epitop helye(ke)t tartalmaz, mérete pedig legalább hét egybefüggő aminosav. A peptid aminosavainak többsége azonos, illetve lényegében homológ a természetben előforduló ^HBcm-i25 szekvencia megfelelő részeivel. A ^HBcm-i25 szekvenciája az alábbi (a HBV ayw altípusra):

ív (hbc₁₁₁_₁₂₅) [SEQ. ID NO. 6]

Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp.

A ^HBcni-i25 régióból származó peptid tartalmazhat módosítást illetve határoló szakaszokat mindkét végén, az előzőkben leírtak szerint. Egy az adw altípusba tartozó pepiidben az Ileng-ot Leu helyettesíti.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány szerinti peptid a tizenöttagú ^HBci40-154 peptidet tartalmazza, valamint a ^HBc140 -154^-5°°¹ származó peptideket, amelyek egy CTL-indukáló, I-es osztályú HLA által korlátozott epitop helye(ke)t tartalmaznak, méretük legalább tíz egybefüggő aminosav. A peptid aminosavainak a többsége azonos, illetve lényegében homológ a természetben előforduló ^BBc140-154 szekvencia aminosavaival, aholis a ^hbCi₄o-154 szekvenciája az alábbi (a HBV ayw altípus esetében):

V (HBc₁₄q_₁₅₄) [SEQ. ID NO. 7] Leu-Ser-Thr-Leu-Pro-Glu-Thr-Thr-Val-Val-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg.

Egy ebből a régióból készített peptid tartalmazhat módosításokat és/vagy határoló szakaszokat, az előzőkben említettek szerint. Az V-ös peptid (^HBc140-154^ ^egy citotoxikus T limfocita választ indukál, amelyet legalább egy MHC I-es osztályba tartozó molekula, a HLA-A31 közvetít, és korlátozhatja a HLA-Aw68 is. Amint azt az alábbi Példák részben részletesebben bemutatjuk, a • Μ

^HBc141-151 tartalmazza a minimális, optimálisan felismert epitopot mind az A31 mind az Aw68 korlátozó elemek számára.

Más, a találmány szerinti CTL-indukáló peptidek a ^HBc28-47 régióból származnak, és olyan, a HBc₂₈„4₇-ből peptidek tartoznak ide, amelyek egy vagy több CTL-indukáló HLA I által korlátozott epitop helyet tartalmaznak, méretük legalább hét egybefüggő aminosav. A peptid aminosavainak többsége azonos, illetve lényegében homológ a természetben előforduló HBc₂8-47 szekvencia megfelelő része aminosavaival, aholis a HBc₂g_4₇ szekvenciája az alábbi (a HBV ayw altípusra):

VI (HBc₂₈_₄₇) [SEQ. ID NO. 8]

Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Thr-Alá-Ser-Alá-Leu-Tyr-Arg-Glu-AláLeu-Glu-Ser-Pro-Glu-His, amelyben a kiválasztott peptidet az előzőkben leírt módon lehet módosítani, illetve határoló szakaszokat hozzáépíteni.

A jelen találmány más megvalósítási módjában a találmány szerinti peptidek aa polimeráz fehérjéből származó CTL-indukáló epitopokat tartalmaznak. Pontosabban, a peptidek a HBpolg-^-gg vagy HBpol₈Q3_₈₁₁ régióból származnak, és olyan peptidek tartoznak ide, amelyek azokból a szekvencia régiókból származnak, amelyek egy vagy több CTL-indukáló HLA I-es osztály által korlátozott epitop helye(ke)t tartalmaznak, méretük legalább hét összefüggő aminosav. A peptid aminosavainak többsége azonos, illetve lényegében homológ a természetben előforduló HBpolg^_gg vagy ^HBP°1803-811 szekvenciák megfelelő részei aminosavaival, ahol a ΗΒρο1₈₁_₆₉ és a HBpol₈₀3_₈₁₁ szekvenciája az alábbi (a HBV ayw altípusra):

VII (HBpol₆₁_g₉) [SEQ. ID NO. 9] ·· ·♦ ·· ··* · ·Μ • · · ·· ♦ · · » • ·· ♦ · · ·· • · ·· ·· ·· · ···· ·· ·· ·« ·

Gly-Leu-Tyr-Ser-Ser-Thr-Val-Pro-Val és

VIII (HBpol₈₀₃_₈₁₁) [SEQ. ID NO. 10]

Ser-Leu-Tyr-Ala-Asp-Ser-Pro-Ser-Val, amelyekben a kiválasztott peptidet az alábbiakban ismertetett módon az egyik és/vagy mindkét végén módosítani vagy határolni lehet.

A jelen találmány szerinti peptidek, amelyek anti-HBV CTLindukáló epitopokat tartalmaznak, szintén a HBV transzkripciós aktivátor X fehérjéjéből származnak. Jóllehet számos különböző, CTL aktivitással rendelkező HBx peptid azonosítható az alábbiak szerint, a peptidek előnyösen a HBx-j.26-134 régióból származnak. Az ebből a szekvencia régióból származó peptidek egy vagy több CTL indukáló HLA I-es osztály által korlátozott epitop helye(ke)t tartalmaznak, méretük legalább hét egybefüggő aminosav. Az ebből a régióból készített peptid aminosavainak többsége azonos, vagy lényegében homológ a természetben előforduló ^BBx126-134 szekvencia megfelelő része aminosavaival, aholis ^BBx126-134 ^az alábbi szekvenciával rendelkezik:

IX (HBx₁₂6-134⁾ [SEQ. ID NO. ]

Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Phe-Val-Leu, amelyben az ebből a régióból készített peptidet az alábbiakban ismertetett módon módosítani és/vagy határoló szakasszal lehet ellátni az egyik vagy mindkét végén.

A CTL-indukálópeptidek a HBV burokfehérjéjéből is származnak, pontosabban a peptid a HBenvg₄g_g₅₇, éd HLA I-es osztály által korlátozott, aholis a HBenv₃₄g_₃₅₇ az alábbi szekvenciáal rendelkezik (az ayw altípus esetében):

····«· t · · « ·· « * « ·· • · «· ·« ·· · ···* ·· ·· ·· ·

- 20 X (HBenv₃₄₈_₃₅₇) [SEQ. ID NO. ]

Gly-Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val, amelyben az ebből a régióból készített peptidet az alábbiakban ismertetett módon módosítani és/vagy határoló szakasszal lehet ellátni az egyik vagy mindkét végén. A HBenv₃₄g_₃s₇ adw altípus szekvenciájában a karboxi-terminálison az egyik valint alanin helyettesíti.

Amint az előzőkben említettük, további aminosavakat adhatunk egy oligopeptid vagy peptid végeihez, hgy ezzel megkönnyítsük a peptidek egymáshoz kapcsolását, egy hordozóhoz vagy egy nagyobb peptidhez való kapcsolását, az alábbiakban tárgyalt okok miatt, illetve azért, hogy módosítsuk a peptid vagy oligopeptid fizikai és kémiai tulajdonságait, és hasonló okok miatt. A peptid vagy oligopeptid C- vagy N-terminálisához aminosavak, például tirozin, cisztein, lizin, glutaminsav vagy aszparaginsav kapcsolható. Emellett a peptid vagy oligopeptid szekvenciák különbözhetnek a természetes szekvenciától, például oly módon, hogy az N-terminálisukon acileződhetnek, azaz acetileződhetnek, illetve módosulhatnak tioglikolsav-amidálás révén, terminális karboxi-amidálás révén, például ammóniával, metilaminnal, stb. Néhány esetben azek a módosítások biztosítják azt a pontot, ahol a hordozóhoz vagy más molekulához való kapcsolódás lejátszódhat.

Az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti HBV peptidek, illetve azok analógjai, amelyek citotoxikus T limfocita serkentő aktivitással rendelkeznek, szükség esetén módosíthatók, hogy egyéb kívánt tulajdonságokkal rendelkezzenek, ilyen például a javított farmakológiai jellemzők, miközben a módosítatlan peptid biológiai aktivitását fokozzuk, illetve legalább

lényegében megtartjuk, A peptidek például módosíthatók úgy, hogy növeljük, csökkentjük vagy helyettesítjük az aminosavakat a peptid szekvenciában, oly módon hogy a peptid C-terminális vagy az N-terminális végéhez aminosavakat adunk hozzá, illetve aminosavakat vágunk le onnan, olyan peptidek esetében, amelyek az az ismertetett szekvenciákból származnak. A peptidek módosíthatók oly módon hogy lényegében lényegesen fokozzuk a CTL indukáló aktivitásukat, azaz a módosított peptidanalóg CTL aktivitása nagyobb mint a vad típusú peptid CTL aktivitása. Például kívánatos lehet a peptid N-terminálisa hidrofobicitásának fokozása, különösen akkor, ha az N-terminálison a második csoport hidrofób, és ebből következhet, hogy a HLA korlátozó molekulához kötődik. Az N-terminális hidrofobicitásának fokozásával a Tsejteknek való bemutatás hatékonysága fokozódhat. Például, amint azt az alábbiakban a kísérleti részben leírjuk, a vad típusú ^HBx126-134 alacsony CTL aktivitással rendelkezik; de ha az N-terminális Glu aminosavát, egy viszonylag poláros, és pozitívan töltött csoportot Ala-ra cerélünk ki, amely egy apoláros hidrofób molekula, akkor a CTL-t indukáló aktivitás jelentősen fokozódik. Más betegségekhez kapcsolódó antigénekből készített peptidek, különösen azok, amelyek olyan CTL-t indukáló epitopokat tartalmaznak, amelyre a gazdaszervezet esetleg nem ad jelentős CTL aktivitást, CTL-indukálóvá tehetők, ha a peptid N-terminálián levő aminosavat hidrofób aminosavra cseréljük ki, főleg akkor, ha a második csoport normálisan hidrofób.

A találmányban alkalmazott peptideknek nem kell azonosaknak lenniük az I-X peptidekkel, vagy egy bizonyos HBV nukleokapsziddal, burokkal, polimeráz vagy X fehérje szekvenciával, ameddig a szóban forgó vegyület képes citotoxikus

T limfocita aktivitást kifejteni a HBV négy fő altípusa közül legalább eggyel szemben. Ennélfogva a peptideket különböző módokon módosíthatjuk, például inszerciókkal, deléciókkal és

helyettesítésekkel, legyenek ezek konzervatívok vagy nem konzervatívok, amennyiben az ilyen változtatások használata bizonyos előnyöket jelent. A egy aminosav csoport olyan konzervatív helyettesítések alatt aminosavval való helyettesítését értjük, amely biológiailag vagy kémiailag hasonló, azaz egy hidrofób csoportot egy másik hidrofób csoportra, illetve egy poláros csoportot egy másik poláros csoportra cserélünk ki. A helyettesítések az alábbi kombinációk lehetnek: Gly, Alá;

Val,

Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; és Phe,

Tyr.

Általában a szekvenciának az a része, amelynek lényegében az a feladata, hogy utánozzon egy HBV citotoxikus T limfocita serkentő epitopot, nem több mint

20%-ban különbözik legalább egy HBV altípus szekvenciáj ától, azzal a kivétellel, ahol további aminosavakat adhatunk a peptid akármelyik végéhez, azzal a céllal, hogy módosítsuk a peptid fizikai vagy kémiai tulajdonságait, például úgy, hogy ezzel megkönnyítsük a vagy a kapcsolódást, vagy hasonló folyamatokat. Ahol a peptid szekvenciákról kiderült, hogy a HBV altípusok között polimorfak, ott kívánatos lehet, hogy egy vagy több aminosavat variáljunk, azzal a céllal, hogy hatékonyabban utánozzák a különböző HBV törzsek vagy altípusok eltérő citotoxikus T-limfocita epitopjait.

A jelen találmány szerinti szekvenciákban, beleértve az I-es pepiidet (HBc₁₁_₂7)_í a ΙΙ-es pepiidet (HBc-|_g_27) , a Ill-as pepiidet (HBc₁₈_₂7), a IV-es pepiidet (HBcm. ₁₂5 ), az V-ös *··χ ,*· pepiidet (HBc₁₄o-154^' ^a VI-os peptidet (HBc2b-47)- ^a Vll-es peptidet (HBpol61_gg), a VlII-as peptidet (ΗΒρο1β₀3_₈₁₁) és a IX-es peptidet (HBx₁₂6-i3₄) ' vannak olyan csoportok (vagy olyanok, amelyek ezekkel lényegében funkcionálisan ekvivalensek), amelyek lehetővé teszik, hogy a peptid megtartsa a biológiai aktivitását, azaz azt a képességét, hogy serkenteni tud egy I-es osztály által korlátozott citotoxikus T-limfocita választ HBV-vel fertőzött sekjtekkel szemben, vagy olyan sejtekkel szemben, amelyek HBV antigént expresszálnak. Ezeket a csoportokat egyszeres aminosav cserékkel, deléciókkal vagy inszerciókkal lehet azonosítani. Emellett a csoportok oldalláncai által tett hozzájárulásokat egy specifikus aminosav szisztematikus vizsgálatával próbálhatjuk ki (ilyen például az Alá). Azok a peptidek, amelyek tolerálják a többszörös szubsztitúciókat, általában elfogadják azokat az olyan szubsztitúciókat, amelyeket kis, viszonylag semleges molekulákkal végezhetünk, például Alá, Pro, Gly vagy hasonló csoportokkal. A helyettesíthető, hozzáadható vagy kivonható csoportok száma és típusa függ a lényeges epitop pontok közötti szükséges távolságtól, valamint bizonyos konformációs és funkcionális tulajdonságoktól, amelyeket keresünk (például a hidrofobicitás a hidrofilitással szemben). Ha szükséges, akkor a peptid analógoknak az MHC molekulájukhoz való megnövekedett kötő affinitása, a citotoxikus T-limfocita bemutatása céljából, szintén elérhető ezekkel a változtatásokkal, amint azt az előzőkben említett ^HBx 126-134 peptid példáján keresztül tudunk bemutatni. Általában bármely távolságtartó szubsztitúció, addició vagy deléció az epitop és/vagy a konformációs szempontból fontos csoportok között olyan t

• ·

aminosavakat vagy egységeket tartalmaz, amelyeket úgy választottunk meg, hogy elkerüljük a szérikus és töltésbeli zavarokat, amelyek elronthatják a kötődést.

Azok a peptidek, amelyek tolerálják többszörös helyettesítést, miközben magtartj ák a kívánt biológiai aktivitást, D-aminosavat szintetizálhatok. Az ilyen tartalmazó peptidek formájában is peptideket szintetizálhatjuk inverz vagy retro-inverz formában, azaz a szekvenciában található L aminosavakat D-aminosavakkal helyettesíthetjük, illetve megfordíthatjuk az aminosavak szekvenciáját és emellett az Laminosavakat D-aminosavakkal helyettesíthetjük. Mivel a Daminosavak lényegesen ellenállóbbak a peptidázokkal szemben, és ennélfogva sokkal stabilabbak a szérumban és szövetekben mint a L-peptid megfelelőik, ezért a D-peptidek stabilitása fiziológiai körülmények között nagyobb mint ami kompenzálja az affinitásbeli különbséget a megfelelő L-peptiddel szemben. Emellett az Laminosavakat tartalmazó peptidek, amelyek vagy tartalmaznak helyettesítést vagy nem, lezárhatók egy D-amínosavval, hogy ezzel gátoljuk az antigén peptid exopeptidáz lebontását.

Az előzőkben példaként megadott peptidek mellett a találmány tárgyát képezik azok a módszerek, amelyeket más olyan epitop régiók azonosítására lehet használni, amelyek HBV vagy egyéb vírusok, azaz HCV, HÍV, stb. elleni MHC-korlátozott citotoxikus T limfocita válaszokhoz kötődnek. A módszer szerint perifériális vér limfocitákat veszünk (PBL) fertőzött vagy fertőzetlen egyedekből, és a sejteket érintkezésbe hozzuk (serkentjük) olyan szintetikus pepiiddel vagy polipeptid fragmentekkel, amelyek a számunkra érdekes patogén patogén fehérjéjéből vagy antigénjéből ♦ · · * · · t ♦ ♦ • ·· · · * «· • ·«···«·· ♦ · · · ♦ ι · · · · · származnak. Azokban az esetekben, amikor a fehérje(ék) vagy az antigén aminosav szekvenciája ismert, átlapoló szintetikus peptidek egyesített keverékét lehet használni (mindegyik általában

8-20 aminosavból áll) a sejtek serkentésére. Az aktív peptideket azokból a keverékekből választhatjuk ki, amelyek citotoxikus

T limfocita aktivitást indukálnak. A peptideknek az a képességét, hogy mennyire képes specifikus citotoxikus aktivitást indukálni, úgy határozzuk meg, hogy a serkentett PBL-t autológ jelzett (például ^Cr) célsejtekkel inkubáljuk (például

HLa-val illeszkedő makrofágokkal, T sejtekkel, fibroblasztokkal vagy B limfoblasztoid vagy transzféktáltünk patogénnel vagy annak szubgenomiális fragmentj eivel, oly módon, hogy a megcélzott antigént endogén módon szintetizálja a sejt (vagy a sejtet a számunkra érdekes peptiddel pulzáltatjuk), majd mérjük a a jelzés specifikus felszabadulását.

Ha egyszer egy peptidnek azonosítottuk egy olyan epitop régióját, amely serkenti a citotoxikus T limfocita választ, akkor a válasz MHC korlátozó elemét meghatározhatjuk.

Ez magában foglalhatja azt, hogy a serkentett PBL-t vagy annak vonalait olyan amelyeknek ismerjük a HLA típusát, és amelyeket egy számunkra lényeges peptiddel pulzáltattunk, vagy a megfelelő kontrollal. A panelben azon sejtek HLA alléijét(eit), amelyeket a CTL lizál, összehasonlítjuk azokkal a sejtekkel, amelyek nem lizálnak, és azonosítjuk a számunkra érdekes antigénre adott citotoxikus T limfocita válasz HLA korlátozó elemét(eit).

Carbone és munkatársai [J. Exp. Med., 167, 1767 (1988)] ’-J

leírták, hogy a peptidekkel való serkentés olyan citotoxikus T limfocitákat rendelkeznek hogy az ismételt peptid limfocitákat eredményezhet, természetes antigént nem.

limfocitáknak a természetes képtelensége nam kívánatos kifejlesztésében és a vakcina módszereket használunk, ki lehet kerülni.

serkentését azonosítsuk affinitással szemben mint citotoxikus affinitással oly módon, citotoxikus T peptidet, de a a serkentett citotoxikus T fehérjék felismerésére való HBV gyógyászati peptidek ezért olyan korlátozást új rahogy nagyobb antigénnel Rövidéletű létrehozni, az indukálhat, amelyek alacsony a megfelelő endogén fehérjével szemben, serkentés olyan amelyek felismerik a Mivel

HBV a

ké sz ítményekben, amelyekkel azt a lehetséges

A citotoxikus T sejtek szekvenciális a jelen találmányban arra használjuk, és kiválasszuk azokat a T sejteket, amelyek rendelkeznek a természetesen processzált egy szintetikus peptiddel szemben.

T limfocita sej fonalakat lehet aktivált PBL újra-serkentésével. A peptiddel serkentett sejteket újra-serkentjük peptiddel és rekombináns vagy természetes HBV antigénnel, például HBcAg-vel, HBsAg-vel, HBpol-lal vagy HBxszel. Az aktivitással rendelkező sejteket serkenteni lehet a megfelelő T-sejt mitogénnel is, például fitohemagglutininnel (PHA). Az újra-serkentett sejteket besugárzott allogén PBL-ekbol állítjuk elő, mint a Tsejt segítő antigén aspecifikus forrásaként és HBV antigénként. Hogy szelektíven kiterjesszük a citotoxikus T limfociták azon populációját, amelyek felismerik a természets HBV antigént, és létrehozzunk hosszú élettartamú sejtvonalakat, egy betegből származó PBL-t először serkentjük a peptiddel illetve rekombináns vagy természetes HBV antigénnel, majd újra serkentjük

HLA-val illeszkedő B limfoblasztoid sejtekkel, amelyek stabilan expresszálják a megfelelő HBV antigén polipeptidet. A sejtvonalakat újra megerősítjük abból a képességük szempontjából, hogy képesek-e felismerni az endogén módon szintetizált antigént, olyan autológ és allogén B-limfoblasztoid vagy egyéb sejteket használva, amelyeket a megfelelő antigénnel transzfektáltunk vagy fertőztünk.

A találmány szerinti azonosított peptidekkel rendelkezve, amelyek limfocita típusban, hozzájárulnak ahhoz, hogy anti-HBV citotoxikus T válaszok indukálódjanak egy vagy több betegben vagy HLA néhány esetben kívánatos lehet az, hogykét vagy több pepiidet összekapcsoljunk egy készítményben.

A készítményben peptidek lehetnek azonosak vagy különbözőek, és együttesen azonos, vagy nagyobb biológiai aktivitást kell biztosítaniuk, mint a kiindulási peptidek. Például az ismertetett módszerek alkalmazásával két vagy több peptid különböző vagy átlapoló

T limfocita epitopokat határozhat meg egy adott régióból, ilyenek lehetnek például a HBc₁₁_₂7 és a HBC]_g_27 peptidek, amelyeket egy koktélban kombinálhatunk, hogy ezáltal a citotoxikus T limfocita válaszokra fokozott immunogenitást kapjunk. Az egyik régió peptidjeit kombinálhatjuk más HBV régiók peptidjeivel, amelyek származhatnak ugyanabból vagy egy másik HBV fehérjéből, különösen akkor, amikor egy második vagy egy eleme van.

Ezt a készítményt használhatjuk arra, hogy hatékonyan kiszélesítsük a találmány szerinti terápiás, vakcina vagy diagnosztikai módszerek által biztosított immunológiai lefedésére populációban.

Például a HLA allélek eltérő frekvenciája a fő etnikai csoportok között (kaukázusi, ázsiai és afrikai fekete) látható az alábbi I. táblázatban. A találmány szerinti terápiás vagy vakcina készítmények úgy formulázhatók, hogy potenciális terápiát vagy immunitást biztosítsanak a populáció lehető lagmagasabb százalékában. Tehát a HBc144-454 CTL epitop egyesítése a HBc-|_g_ 27-ból származó peptiddel egy terápiában vagy vakcinában, az egész világban HBV-vel összesen fertőzött 300 millió ember 57%-ának lenne előnyös.

I. Táblázat

HLA alléi frekvenciák a főbb etnikai csoportokban

allélEUC	NAC	AFR	JPN
A2	45,3	46,6	27,3	43,2
A29	7,4	8, 1	12,3	0,4
A31	5,4	6,2	4,4	15 , 3
A32	8,8	7 , 1	3	0,1
A33	3,3	3,4	9	13 , 1
A2 8*	7,7	9,9	16,6	1,1

Rövidítések:

EUC :	európai	kaukázusi
NAC :	észak-amerikai kaukázusi
AFR:	afrikai	fekete
JPN:	j apán

*A28 két alléit képvisel, az Aw68-at és az Aw69-et.

A találmány szerinti peptidek kötések kialakítása révén kombinálhatok polimerek (multimerek) létrehozására, illetve • · fromulázhatók egy készítményben kötés kialakítása nélkül, keverék formájában. Amikor ugyanazt a peptidet kapcsoljuk önmagával, és így egy homopolimert hozunk létre, akkor számos ismétlődő epítop egységet képvisel. Ha a peptidek eltérnek,, például egy koktél különböző HBV altípusokat, egy altípuson belül különböző epitopokat, eltérő HLA korlátozó specifitásokat, amely T segítő epitopokat tartalmaz, képvisel, egy peptidet, akkor ismétlődő egységekből álló heteropolimereket állítunk így elő. A kovalens kötések mellett nem-kovalens kötéseket is kialakíthatunk, amelyek képesek intermolekuláris és ontertrukturális kötéseket is képezni.

A homo- vagy heteropolimereket létrehozó kötéseket, illetve a hordozókhoz való kapcsolódást számos különböző módon létrehozhatjuk. Például cisztein csoportokat adhatunk mind az Nterminális mind a C-terminális véghez, ahol a peptidek kovalens kötéssel kapcsolódnak a cisztein csoportok szabályozott oxidációja révén. Emellett hasznos egy nagyszámú heterobifunkciós ágens, amely diszulfid hidakat hoz létre az egyik funkciós csoport végen és egy peptid kötést a másik végen, beleértve az N-szukcinimidil-3-(2-piridil-ditio)-propionátot (SPDP). Ez a reagens diszulfid kötést hoz létre önmaga és az egyik fehérje egy cisztein csoportja között, és egy amid kötést hoz létre egy lizinen vagy más szabad aminocsoporton. Számos ilyen diszulfid/amid képző ágens ismert [Immun. Rév., 62, 185 (1982)1, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezeljük. Más bifunkciós ágensek tioétert hoznak létre a diszulfid kötés helyett. Számos ilyen tioéter kötést létrehozó ágens kereskedelmi forgalomban hozzáférhető, és ide tartoznak a 6-maleimido30 kapronsav, a 2-bróm-ecetsav, a 2-jód-ecetsav, a 4-(N-maleimidometil)-ciklohexán-1-karbonsav és a hasonlók. A karboxilcsoportokat úgy aktiválhatjuk, hogy szukcinimiddel vagy l-hidroxi-2-nitro-4-szulfonsav-nátriumsóval kombináljuk. Egy különösen előnyös kapcsoló ágens a szukcinimidil-4-(Nmaleimidometil)-ciklohexán-1-karboxilát (SMCC). Az nyilvánvaló, hogy a kapcsolás nem zavarhatja jelentősen egyik kapcsolt csoportot sem a leírt funkciójában, azaz például mint egy HBV citotoxikus T sejt determinánst, peptid analógot vagy T segítő determinánst.

A találmány szerinti peptideket egy másik szempontból kombinálhatjuk vagy kapcsolhatjuk más olyan peptidekkel, amelyek HBV T-segítő sejt epitopokat képviselnek, azaz olyan epitopokat, amelyek serkentik azokat a T sejteket, amelyek együttműködnek a citotoxikus T sejtek HBV elleni indukciójában. A T-segítő sejtek lehetnek például T-segítő 1 vagy T-segítő 2 fenotípusúak. A HBV szekvenciákból T-segítő szekvenciákat azonosítottunk a ^HBci-20~ ben, amelynek a szekvenciája: Met-Asp-Ile-Asp-Pro-Tyr-Lys-GluPhe-Gly-Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro. Más T-segítő epitopokat a HBcgQ.gg régióból származó peptidek szolgáltatnak, amelynek a szekvenciája: Pro-His-His-Tyr-Ala-Leu-Arg-Gln-AlaIle-Leu-Cys-Trp-Gly-Glu-Leu-Met-Tyr-Leu-Ala, valamint a HBc100_ 139 régióból, beleértve a ^HBcioo-119 régiót, amelynek a szekvenciája az alábbi: Leu-Leu-Trp-Phe-His-Ile-Ser-Cys-Leu-ThrPhe-Gly-Arg-Glu-Thr-Vallle-Glu-Tyr-Leu (amelyben az Ile^g Leu a HBV adw altípusban), a HBci17_i3i~ben, melynek szekvenciája: Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro-Alá, és a ^BBc120-139 P^ePtidben, amelynek szekvenciája Val-Ser-Phe-Gly-Val31

Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro-Ala-Tyr-Arg-Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile [Ferrari et al. , J. Clin. Invest., 88, 214-222 (1991); és a

4,882,145 számú USA bejelentés]; az említett publikációkat a továbbiakban referenciaként kezeljük.

A találmány szerinti peptideket számos, jelentősen eltérő módon állíthatjuk elő. Mivel viszonylag kicsi a méretük, ezért a peptideket szintetizálhatjuk oldatban vagy egy szilárd hordozón, a szokványos technikák alkalmazásával. Számos automata szintetizátor van kereskedelmi forgalomban, és használható az ismert protokollok szerint [Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105, 6442 (1992); Merrifield, Science,

232, 341-347 (1986); és Bárány and Merrifield, The Peptides,

Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York, 1-284 (1979)]; az említett publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelj ük.

Egy másik módszer szerint a rekombináns DNS technológia használható, amelyben a nukleotid szekvenciát, amely egy számunkra érdekes pepiidet kódol, egy expressziós vektorba építjük be, transzformáljuk vagy transzfektáljuk gazdasej tbe, és az expresszióhoz alkalmaz környezetben szaporítj uk.

Ezek az eljárások általában ismertek a szakterületen amint azt

Maniatis és munkatárai általánosságban leírták [Maniatis et al., Molecular Cloning, A

Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor

Press, Cold Spring

Harbor,

New York (1982); Ausubel and Sons, Inc.

4,431,739,

Current Protocols

New York (1987) ;

in Molecular Biology, valamint a 4,237,224,

4,363,877 és 4,428,941 számú

USA

John Wiley

4,237,875, szabadalmi

bejelentések], amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezeljük. Azaz a fúziós fehérjéket, amelyek egy vagy több, a találmány szerinti peptid szekvenciát tartalmaznak, használhatjuk arra, hogy bemutassák a HBV citotoxikus T sejt determinánsokat. Például egy rekombináns megfehérj ét készítünk, amelyben a HBc aminosav szekvencia úgy van megváltoztatva, hogy sokkal hatékonyabban mutassa be az ismertetett peptid régiók epitopjait, amelyek serkentik a citotoxikus T limfocita választ. Ezzel az eszközzel egy polipeptidet használunk, amely számos T sejt epitopot tartalmaz.

Mivel a tárgyalt hosszúságú peptideket kódoló szekvenciákat kémiai módszerekkel lehet szintetizálni, például a foszfotriészter módszer alkalmazásával [Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103, 3158 (1981)], módosításokat tehetünk, egyszerűen oly módon, hogy a megfelelő bázisokat a természetes szekvenciát kódoló bázisokra cseréljük ki. A kódoló szekvenciát azután linkerekkel láthatjuk el, és a szakterületen általánosan hozzáférhető expressziós vektorokba ligálhatjuk, majd a vektorokat arra használjuk, hogy megfelelő gazdaszervezeteket transzformáljunk velük, a választott fúziós fehérje előállítása céljából. Számos ilyen vektor és alkalmas gazdaszervezet hozzáférhető manapság. A fúziós fehérjék expresszálásához a kódoló szekvenciát működés szempontjábó megfelelő módon hozzákapcsolt start- és stopkodonokkal, promoterrel és terminátor régióval látjuk el, és általában egy replikációs rendszerrel, hogy biztosítsuk az expressziós vektor expresszióját a kiválasztott gazdasejtben. Például a baktérium gazdasejtekkel kompatibilis promoter szekvenciákat olyan plazmidokkal tesszük hozzáférhetővé, amelyek kényeles restrikciós hasítási helyeket tartalmaznak a kiválasztott kódoló szekvencia beillesztéséhez. A kapott expressziós vektorokat ezután a megfelelő baktérium gazdaszervezetbe transzformáljuk. Élesztő vagy vagy emlőssejt gazdaszervezeteket is használhatunk, a megfelelő vektorok és kontroll szekvenciák alkalmazásával.

A jelen találmány sz*erinti peptidek és gyógyászati valamint vakcina készítmények hasznosan adhatók be emlősöknek, főleg embereknek, hogy a HBV fertőzést kezeljük és/vagy megelőzzük. Mivel a peptideket a HBV-vel fertőzött sejtek elleni citotoxikus T limfocita válaszok serkentésére használjuk, ennélfogva a készítmények használhatók az akut és/vagy krónikus HBV fertőzés kezelésére vagy megelőzésére.

A gyógyászati készítményekben a találmány szerinti peptideket egy, a HBV-vel már megfertőzött egyednek adjuk be. Akik a fertőzés inkubációs fázisában vagy akut fázisában vannak, külön kezelhetők az immunogén peptidekkel, illetve más kezelésekkel együtt, amint az megfelelő. A gyógyászati alkalmazásokban a készítményeket egy betegnek olyan mennyiségben adjuk be, amely elegendő ahhoz, hogy hatásos citotoxikus T limfocita választ váltsunk ki HBV ellen és meggyógyítsuk, vagy legalább részlegesen megszüntessük a tüneteket és/vagy a komplikációkat. Ennek a feladatnak az elvégzéséhez elegendő mennyiség a gyógyászatilag hatékony dózis. Az ilyen célra használt mennyiség nagysága függ például a peptid összetételétől, a beadás módjától, a kezelt betegség stádiumától és súlyosságától, a beteg súlyától és általános egészségi állapotától, valamint a kezelőorvos megítélésétől, de általában egy 70 kg-os beteg esetében 1 és 2000 mg peptidet használunk, a dózis általában körülbelül 10 μg és 100 mg peptid között változik, ezt követi egy fokozó dózis, amelynek mérete 1 μg és körülbelül 1 mg között változik hetek illetve hónapok során, függően a beteg CTL válaszától, amit a betegtől vett PBL-ek HBVspecifikus CTL aktivitásával tudunk mérni. Azt azonban nem szabad »

elfelejteni. hogy a jelen találmány szerinti peptidek és készítmények általában súlyos beteségekben használhatók, azaz életveszélyben illetve az életet fenyegető helyzetekben. Ilyen esetekben, figyelembe véve a külső anyagok minimalizálását és a peptidek viszonylagos atoxikus tulajdonságait, lehetséges, és kívánatosnak tűnhet a kezelőorvos számára, hogy ezeket a peptid készítményeket jelentős feleslegben adja be.

A készítmények egyszeri vagy többszöri beadását olyan dózisszinteken és módon végezhetjük, amit a kezelőorvos választ meg. Mindegyik esetben a gyógyászati készítményeknek a találmány szerinti citotoxikus T-limfocita serkentő peptidekből annyit kell bejuttatni a betegbe, ami elegendő a kezeléséhez.

Gyógyászati felhasználás céljából a beadást a HBV fertőzés első jelére meg kell kezdeni, illetv röviddel a diagnózis után, az akut fertőzés esetében, és addig kell folytatni, ameddig legalább a tünetek lényegesen enyhülnek, valamint azután is egy ideig. A jól kialakult és krónikus esetekben egy töltő dózis után fenntartó vagy serkentő dózisokra lehet szükség. Az akut hepatitisz kezelése során HBV elleni hatásos T limfocita válasz kiváltása minimalizálja a krónikus hepatitisz, a HBV hordozó állapot ezt követő kifejlődését, valamint a hepatocelluláris karcinóma fellépését.

• »

- 35 - ..........

Egy fertőzött egyednek a találmány szerinti készítményekkel való kezelése elősegítheti, hogy az akut módon fertőzött egyedek gyrosabban leküzdjék a fertőzést, akiknek körülbelül 90%-a képes természetes úton leküzdeni a fertőzést. Azoknál a betegeknél, akik érzékenyek (vagy vagy valami módon nagyobb a valószínűsége) a krónikus fertőzés kifejlődésére, a készítmények különösen hasznosak azokban a módszerekben, amelyekkel meg lehet előzni az akut fertőzés krónikus fertőzéssé alakulását. Ahol az érzékeny egyedeket a fertőzés előtt vagy után azonosítani lehet, például oly módon, ahogy azt az alábbiakban ismertetjük, a a készítményt azokra irányíthatjuk, minimalizálva annak szükségességét, hogy egy nagyobb populációnak kelljen beadni.

A peptid készítményeket használhatjuk krónikus hepatitisz kezelésére, valamint a hordozók immunrendszerének serkentésére, hogy ezzel lényegesen csökkentsük vagy éppen elimináljuk a vírussal fertőzött sejteket. A krónikus hepatitiszben szenvedők úgy azonosíthatók, hogy vizsgáljuk a vírust a fertőzés után körülbelül 3-6 hónappal. Mivel az egyes egyedek krónikus HBV fertőzést kaphatnak, annak következtében, hogy a citotoxikus T limfocita válaszuk nem megfelelő, vagy éppen hiányzik fertőzésük akut fázisa során, ezért lényeges hogy immun-potencírozó mennyiségű pepiidet adjunk be egy készítménnyel, és egy adott adagolási móddal, ami elegendő ahhoz, hogy egy citotoxikus T sejt választ hatékonyan serkentsünk. Tehát a krónikus hepatitisz kezeléséhez egy reprezentatív dózis körülbelül 1 gg és 1000 mg között van, előnyösen körülbelül 5 μg és 100 mg között egy 70 kg-os beteg esetében. A beadást legalább addig kell folytatni, ameddig a klinikai tünetek vagy a laboratóriumi eredmények azt

mutatják, hogy a HBV fertőzést sikerült eliminálni, illetve lényegesen csökkenteni az utána következő periódusban. Immunizáló dózisok, majd fenntartó vagy serkentő dózisok szükségesek adott például egy-négy hetenként, egy hosszabb ahogy azt a fertőzés leküzdése kívánja. A krónikus és hordozó is szükség lehet, hogy a CTL peptideket más peptidekkel vagy fehérj ékkel kombináljuk, amelyek immunválaszt indukálnak más HBV antigénekkel szemben.

A terápiás kezelésben használt gyógyászati készítményeket parenterális, topikális, orális vagy lokális beadáshzoz állítjuk elő. A gyógyászati készítményeket előnyösen parenterális úton adjuk be, például intravénásán, szubkután, intradermálisan vagy intramuszkulárisan. Tehát a találmány tárgyát olyan, parenterális úton történő beadás céljára készített készítmények képezik, amelyek a citotoxikus T-limfocita serkentő peptidek oldatát tartalmazzák, egy elfogadható hordozóban, például előnyösen vizes hordozóban oldva . Számos különböző vizes hordozó használható, például víz, puffereit víz, 0,4%-os sóoldat, 0,3% glicin, hialuronsav és hasonlók. Ezeket a készítményeket szokványos, jól ismert sterilezési módszerekkel sterilezhetjük, illetve sterilre szűrhetjük. A kapott vizes oldatot ahogy van úgy is csomagolhatjuk, vagy liofilezhetjük, és a liofilezett készítményt a felhasználás előtt egy steril oldattal kombinálhatjuk. A készítmények tartalmazhatnak gyógyászatilag elfogadható kiegészítő anyagokat, amint az a megfelelő fiziológiai körülmények beállításához szükséges, például pH beállító és pufferelő anyagokat, ozmózisnyomást szabályozó anyagokat, • · · •· «4 ···· ·<

·· · · · · · · • · · · · · * nedvesítő anyagokat és hasonlókat, például nátrium-acetátot, nátrium-laktátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, kalciumkloridot, szorbitán-monolaurátot, trietanolamin-oleátot, stb.

Néhány megvalósítási módban szükséges lehet az, hogy a gyógyászati készítmény tartalmazzon legalább egy olyan komponenst,amely vezeti a CTL-t. A lipideket találták úgy, hogy azok képesek in vivő vezetni a CTL-t virális antigénekkel szemben, ilyen például a tripalmitoil-S-gliceril-ciszteinilszeril-szerin (P₃CSS), amely hatékonyan képes a vírus-specifikus citotoxikus T limfocitákat vezetni, ha kovalens kötéssel kötjük hozzá egy megfelelő peptidhez [Deres et al., Natúré, 342, 561-564 (1989)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A találmány szerinti peptideket hozzáköthetjük például a P₃CSS-hez, és a lipopeptidet egy egyednek beadhatjuk, hogyspecifikusan vezessünk egy citotoxikus T limfocita választ HBV ellen. Emellett, mivel a semlegesítő antitestek indukciója is vezethető egy olyan peptidhez konjugált P₃CSS-sel, amely egy megfelelő epitopot mutat be, például a HBsAg epitopokat, a két készítményt kombinálhatjuk, hogy hatékonyabban váltsuk ki mind a humorális mind a sejtek által közvetített válaszokat a HBV fertőzéssel szemben.

A találmány szerinti citotoxikus T limfocita serkentő peptidek koncentrációja a gyógyászati készítményben széles határok között változhat, azaz például körülbelül 1%-tól kisebb, általában legalább körülbelül 10%, egészen 20-50%-ig változhat a mennyisége súlyra számítva, és főleg a folyadék térfogata, a viszkozitás, stb. alapján választjuk ki, a kiválasztott beadási módnak megfelelően.

• * • ·«

Tehát egy tipikus, intravénás beadáshoz készített intravénás infúzió úgy állítható elő, hogy 250 ml steril Ringer féle oldatot és 100 mg peptidet tartalmazzon. A parenterálisan beadható vegyületek előállítására vonatkozó módszerek ismertek, illetve nyilvánvalóak a szakterületen jártas szakemberek számára, és részletesebben is közölve vannak [Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack ’Publishing Company, Easton, PA (1985)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezeljük.

A találmány szerinti peptideket liposzómák formájában is beadhatjuk, amelyeknek az a céljuk, hogy a peptideket egy bizonyos szövetbe irányítsák, azaz például limfoid szövetbe vagy HBV-vel fertőzött hepatikus sejtekbe. A liposzómákat arra is használhatjuk, hogy növeljük a peptid készítmény felezési idejét. A jelen találmányban jól használható liposzómák lehetnek emulziók, habok, micellák, oldhatatlen monorétegek, folyadékkristályok, foszfolipid diszperziók, lamelláris rétegek és hasonlók. Ezekben a készítményekben a bejuttatatndó peptidet egy liposzóma részévé tesszük, egyedül, illetve egy olyan molekulával, amely például egy receptorhoz kötődik, amely főleg a limfoid sejtek között fordul elő, például monoklonális antitestekkel, amelyek a CD45 antigénhez kötődnek, illetve más terápiás vagy immunogén készítményekkel. Tehát egy keresett peptiddel feltöltött liposzómákat a limfoid vagy hepatikus sejtek helyére irányíthatjuk, ahol a liposzómák leadják a kiválasztott terápiás/immunogén peptid készítményeket. A találmány szerinti liposzómákat standard vezikula-képző lipidekből állítjuk elő, amelyek általában semleges és negatívan töltött foszfolipideket és szterolokat, például koleszterolt tartalmaznak. A lipidek

- 39 kiválasztását általában az a megfontolás vezérli, hogy például mekkora a liposzómák mérete és stabilitása a véráramban. Számos módszer ismert a liposzómák előállítására [Szoka et al., Ann.

Rév. Biophys. Bioeng., 9., 467 (1980); és a 4,235,871, 4,501,728,

4,837,028 és 5,019,369 számú USA szabadalmak], amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezeljük. Ahhoz, hogy az immunsejtekhez irányítsuk, egy liposzómába beépítendő ligandum tartalmazhat például antitesteket illetve azok fragmentjeit, amelyek a kiválasztott immunrendszer sejtek sejtfelszíni determinánsaira specifikusak. A peptidet tartalmazó liposzóma szuszpenziót beadhatunk intravénásán, lokálisan, topikálisan, stb., egy olyan dózisban, amely a beadás módjától, a beadandó peptidtől, a kezelendő betegségi állapottól, stb. függ.

A szilárd készítményeknél a szokványos nem-toxikus szilárd hordozóanyagokat használhatjuk, például a gyógyszerkönyvi minőségű mannitot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, nátrium-szacharinátot, talkumot, cellulózt, glükózt, szacharózt, magnézium-karbonátot és hasonlókat. Az orális adagoláshoz egy gyógyászatilag elfogadható, nem toxikus készítményt állítunk elő, oly módon hogy bármelyik, normális körülmények között alkalmazott töltőanyagot adjuk hozzá, például azokat, amelyeket az előzőkben listáztunk, általában az aktív adalékanyag, azaz egy vagy több találmány szerinti peptid 10-95%-ában, előnyösebben 25-75% koncentrációban.

Az aeroszol formában való beadáshoz a citotoxikus T limfocita serkentő peptideket előnyösen finoman eloszlatott formában állítjuk elő, egy felületaktív anyaggal és egy hajtóanyaggal együtt. A peptidek százaléka tipikusan 0,01-20% a ·

között van (tömegre számítva), előnyösen 1-10% között. A felületaktív anyagnak természetesen nem szabad toxikusnak lennie, és előnyösen oldódnia kell a hajtóanyagban. Ilyen anyagok lehetnek például az észterek és a zsírsavak részleges észterei,a melyek 6-22 szénatomból állnak, ilyen például a kapronsav, oktánsav, laurilsav, palmitinsav, sztearinsav, linoleinsav, linolénsav olesztarinsav és az olaj savak, amelyek egy alifás polihidro-alkoholt vagy annak ciklikus anhidridjét tartalmazzák. Kevert észterek, például kevert vagy természetes gliceridek is használhatók. A felületaktív anyag tartalmazhat 0,1-20 tömeg%készítményt, előnyösen 0,25-5%-ot. A készítmény egyensúlyát normálisan a hajtóanyag adja meg. Hordozóanyagot is tehetünk bele szükség esetén, például lecitint az intranazális beadáshoz.

A jelen találmány tárgyát képezik azok a vakcinák, amelyek aktív adalékanyagként immunológiailag hatásos mennyiségű citotoxikus T-limfocita serkentő peptidet tartalmaznak, amint azt az alábbiakban ismertetjük. A peptide(ke)t bejuttathatjuk egy gazdaszervezetbe, ezek közé beleértve az embereket is, a saját hordozójához kapcsolva, illetve az aktív peptid egységek homopolimerje vagy heteropolimerje formájában. Egy ilyen peptid előnye a fokozott immunológiai reakció, és ahol eltérő peptideket használunk egy polimer készítéséhez, ott az a további tulajdonság, hogy antitesteket és Övagy citotoxikus T sejteket indukál, amelyek a HBV különböző antigén determinánsaival reagálnak. A használható hordozóanyagok jól ismertek a szakterületen, ide tartozik például a fúrócsiga hemocianin, a tiroglobulin, az albuminok, azaz például a humán szérum albumin, a tetanusz toxoid, a poliamino savak, azaz például a poli(D- 41 lizin:D-glutaminsav) és hasonlók. A vakcinák tartalmazhatnak egy fiziolóiásan elfogadható (tolerálható) higitószert, például vizet, foszfáttal puffereit sóoldatot vagy sóoldatot, emellett pedig általában egy adjuvánst. Az adjuvánsok, úgymint a Freund féle inkomplett adjuváns, az alumínium-foszfát, az aluminiumhidroxid vagy alumínium-oxid a szakterületen jól ismert anyagok. Emellett, amint azt az előzőkben említettük, a citotoxikus T limfocita válaszokat vezethetjük, a találmány szerinti peptideknek lipidekhez, például P^SSC-hez való konjugálásával. Egy előzőkben ismertetett peptid készítménnyel végzett immunizálással, injekció, aeroszol, orális, transzdermális vagy más módon, a gazdaszervezet immunrendszere a vakcinára úgy reagál, hogy nagy mennyiségben termel HBV antigénre specifikus citotoxikus T-limfocitákat, és a gazdaszervezet legalább részlegesen immunissá válik a HBV fertőzéssel szemben, illetve rezisztens lesz a kifejlődő krónikus HBV fertőzéssel szemben.

A találmány szerinti peptideket tartalmazó vakcina készítményeket HBV fertőzésre érzékeny, illetve annak kockázatának kitett betegnek adjuk be, hogy fokozzuk a beteg saját immunválasz képességét. Ezt a mennyiséget nevezzük immunológiailag hatékony dózis-nak. Ilymódon alkalmazva a pontos mennyiség ismét a beteg egészségi állapotától és súlyától függ, valamint a beadás módjától, a formulázás természetétől, stb., de általában körülbelül 1,0 Mg és körülbelül 500 mg per 70 kg-s beteg között változik, gyakrabban körülbelül 50 Mg és 200 mg per 70 kg-os beteg között változik. A peptideket megfelelő HLA típusú egyedeknek adjuk be, például a HBc-]_g_27 régióból származó peptidekbol készített vakcina készítményeket HLA-A2 egyedeknek adjuk be, illetve a HBc₁₄₁_₁₅₁ epitop determinánst tartalmazó peptideket A31 és Aw68 egyedeknek adjuk be.

Néhány esetben kívánatos lehet, hogy kombináljuk a találmány szerinti peptid vakcinákat olyan vakcinákkal, amelyek semlegesítő antitesteket indukálnak a HBV ellen, különösen a HBV burok antigénj ei ellen, azaz például rekombináns HBV env által kódolt antigének, tisztított plazma készítményekből előállított vakcinák ellen.

Számos különböző HBV vakcina készítmény írtak elsődlegesen a HBsAg-η, illetve annak polipeptid le, és ezek fragmentj ein alapulnak.

A jelen találmány szerinti peptidekkel formulázható vakcinákra példát az EP 154,902 és EP 291,586 számú Európai szabadalmi bejelentésekben, illetve a 4,565,697, 4,624,918,

4,599,230,

4,599,231, 4,803,164, 4,882,145, 4,997,092, 5,017,558 és 5,019,386 számú USA szabadalmi bejelentésekben találhatunk, amelyekre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. A vakcinákat kombinálhatjuk, és egyidejűleg adhatjuk be, illetve külön készítmények formájában.

Terápiás és immunizációs célokra a találmány szerinti peptidek expresszálhatók attenuált virális gazdaszervezetekben, például vakcíniában. Ez a megközelítés magában foglalja a vakcinia virus vektorként való alkalmazásátolyan nukleotid szekvenciák expresszálására, amelyek a találmány szerinti HBV peptideket kódolják. Egy akut vagy krónikusan HBV-vel fertőzött gazdaszervezetbe vagy egy nem fertőzött gazdaszervezetbe bejuttatva a rekombináns vakcinia vírus expresszálja a HBV pepiidet, és ezáltal egy gazda citotoxikus T limfocita választ vált ki HBV ellen. Az immunizálási protokollokban használható · ·

vakolnia vektorok ésat és módszereket például a 4,722,848 számú USA szabadallmi bejelentésben közük, amelyre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. Egy másik vektor a BCG (Bacille Calmette Guerin). A BCG vektorokat Stover és munkatársai írták le [Natúré, 351, 456-460 (1991)], amely publikációra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. Számos különböző más vektor is használható terápiás kezelésre, illetve a találmány szerinti peptidekkel végzett immunizálásra, például Salmonella typhi vektorok és hasonlók, amint az a szakterületen jártas szakemberek számára az alábbi leírásból nyilvánvaló lesz.

Az igényelt szabadalom készítményei és módszerei használhatók ex vivő terápiában. Az ex vivő terápia alatt azt értjük, hogy a terápiás vagy immunogén manipulációkat a testen kívül hajtjuk végre. Például limfocitákat vagy egyéb célsajteket távolíthatunk el a betegből, és a kiválasztott peptid magas dózisaival kezeljük, ezzel olyan serkentő koncentrációban használjuk a peptidet a közegben, amely messze maghaladja azt a szintet, amelyet a beteg elvisel. A CTL-ek serkentésére irányuló kezelés után a sejteket visszajuttatjuk a gazdaszervezetbe, hogy kezeljük a HBV fertőzést. A gazdaszervezet sejtjeit érintkezésbe hozhatjuk olyan vektorokkal, amelyek a peptideket kódoló géneket hordoznak, amint azt az előzőkben közöltük. Ha egyszer transzfektáltuk a vektorokkal, akkor a sejteket in vitro szaporíthatjuk, illetve visszajuttathatjuk a betegbe. Azokat a sejteket, amelyeket in vitro szaporítunk, azután juttathatjuk vissza a betegbe, miután egy előre meghatározott se j tsűruséget elértek.

A peptideket használhatjuk diagnosztikai reagensekként is.

·· ·· ·· ···* *· ♦*··· · · · '» «4 * · 9 «« • ·······♦ ···· *· ·* ·« »

- 44 Például, egy, a találmány szerinti peptidet használhatjuk arra is, hogy meghatározzuk egy adott egyed érzékenységét egy olyan kezelésre, amely a peptidet vagy rokon peptideket alkalmaz, és ezzel segíthetjük a létező kezelési protokoll módosítását, vagy prognózist állíthatunk fel egy érintett beteg számára. Emellett a peptideket arra is használhatjuk, hogy megjósoljuk, melyik betegnél áll fent jelentős veszélye annak, hogy krónikus HBV fertőzés fejlődjön ki benne.

Az alábbi példákat csak illusztrálás céljából adjuk meg, céljuk nem a szabadalom oltalmi körének korlátozása.

I. Példa

CTL-soecifikus HBc epitopok azonosítása

Három beteget (M.B., J.P. és J.V.) vizsgáltunk a virális hepatitisz B akut fázisában. Az akut hepatitisz diagnózisát arra alapozzuk, hogy megnőtt az SGPT aktivitás (legalább tízszerese a legmagasabb normál értéknek; az átlagos SGPT csúcsérték 2179 NE/1), az IgM anti-HBcAg antitesteknek a szérumban való kimutatásával kapcsolatban. Mindegyik beteg teljesen felgyógyult a betegségből, a szérum-transzamináz normalizálásával és a HBsAg eltűnésével. Negatívak voltak a szigma Ag-re és a hepatitisz C vírusra. A J.P beteg A2, A3, B44, B35, Cw4, DR1, DR2, DRw8 és DQwl; a V.J. beteg A2, All, B44, B62, CW5, DR4, DRwl2; a B.M. beteg A2, B38, B27, DR5, DRw52 és DQw3 volt. Tehát mindegyik beteg HLA-A2 pozitív. Az ezekből a betegekből származó perifériális vér limfocitákban vizsgáljuk a HBV-specifikus CTL aktivitást, vagy közvetlenül az izolálás után, vagy 1-2 héttel aHBV expressziós vektorral transzfektált autológ serkentő sejtekkel való serkentés után, az alábbiakban ismertetettek szerint, vagy azután, hogy négy átlapoló szintetikus peptid pool-ból álló panellal serkentettük A peptidek 4-20 aminosavból állnak, mindegyik 5-6 olyan peptidet tartalmaz, amelyek a teljes

HBV nukleokapszid, (mag altípus).Az egyes pool-okban be.

Peptid-specifikus CTL-t

levő peptideket az 1. ábrán mutatjuk generáltunk három akut hepatitiszben sej t per ml koncentrációban szporítjuk RPMI 1640 táptalajban, amely

10% AB szérumot tartalmaz, plusz vagy a HBC]_-|__27 peptidet és 1 μρ/ιηΐ rekombináns (r)HBcAg-t (Biogen, Genf, Sváhc) , egy 24 lukas lemezben (Corning). Négynapos tenyésztés után a sejteket új ra tápláljuk RPMI 1640-nel, amely 10% FCS-t és

E/ml rIL2-t (Hoffmann-LaRoche, Bázel, Svájc) tartalmaz. A

V.J.

nevű beteg esetében a peptiddel irányított sejteket újra serkentettük azután, hogy egy hétig szaporítottuk ^HBcll-27 peptiddel és rHBcAg-vel (1 mg/ml) besugárzott (3500

RÁD) autológ PBL, mint bemutató sejtek jelenlétében. A

J. P.

nevű peptiddel irányított sejteket a 7.

napon új ra serkentjük 1 gg/ml fitohemagglutininnel (PHA) allogén besugárzott (7000 RÁD) PBL jelenlétében. A tenyészet citotoxikus aktivitásának vizsgálatát 7 nap elteltével végeztük el (M.B. beteg) illetve 14 nap elteltével végeztük el (V.J. és J.P. betegek).

A citotoxikus aktivitást úgy becsüljük meg, hogy a serkentett PBL-t autológ vagy allogén (a HLA vagy egyezik, vagy nem) ^-'-CrOmal jelzett, peptiddel pulzált (20 μρ/τπΐ 1 óra hosszat) BCL sejtekkel 4 óra hosszat inkubáljuk kerekfenekű 96-lukas • · lemezeken 100-as effektor-target (Ε/Τ) (M.B.), illetve 10-es

Ε/Τ (V.J., J.P.) mellett. Apeptiddel nem pulzáltatott kiindulási

BCL sejtek szolgáltak kontrollként. A clsejtek százalékos lizisét az (E-M/T-M)X100 képlet alapján számítjuk, aholis jelentése kísérleti ₅₁Cr kibocsátás (cpm) ;

jelentése ₅₁Cr kibocsátás a szaporító tápközeg jelenlétében (ami az ossz beütésszám 15-25%-ára rúg) jelentése a 10%-os Triton X által felszabadított összes

51^Cr ·

Amint azt a 2. ábrán bemutatjuk, a HBV-specifikus CTL aktivitást reprodukálhatóan csak az átfedő nukleokapszid álló panekkek vlgzett serkentés után figyelhettük meg. A peptid-specifikus CTL aktivitást következetesen ki lehetett váltani a négy peptid pool közül eggyel, és a felismerés a pool-ben hepatitisz

B mag-antigén (HBcAg) 11-27-es csoportj ait tartalmazza, szekvenciáj a Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu a HBV fő altípusai között. Ez egy domináns epitop azokban a

HLA-2 pozitív betegekben, akik hepatitiszben szenvednek.

Egy héttel a ^HBcn-27 determinánst tartalmazó peptidkeverékkel végzett serkentés után, az M.B. nevű betegből származó limfociták specifikusan lizáltak a pepiiddel serkentett autológ és HLA-A2-vel illeszkedő B-limfoblasztoid sejtekkel (BCL) (2.

ábra).Egy peptid-specifikus CTL vonalat is létrehoztunk a V.J. nevű betegtől származó PBL-ből (2B. ábra), oly módon hogy a HBcn-27 peptiddel plusz a rekombináns HBV-mag antigénnel serkentettük, mint az antigén-specifikus T sejt segítő forrásával • · · fa

[Ferrari et al., J. Immunoi., 145, 3422 (1990)], a ^HBcn-27 specifikus CTL kiterjesztése céljából, majd ezt követte az ugyanezzel a reagenssel végzett újra serkentés. Hasonlóképpen, egy ^HBcn-27 specifikus CTL vonalat hoztunk létre a J.P. nevű betegből származó PBL felhasználásával (2C. ábra), egyhetes peptiddel és HBcAg-vel végzett serkentés után, majd PHA-val és besugárzott allogén PBL-lel, mint antigén aspecifikus T-sejt segítő forrással való újra-serkentés után.Az eredményeképpen rövidéletű CTL vonalakat lehetett amelyek képesek voltak lizálni a peptiddel pulzált élj árások létrehozni, autológ és allogén HLA-A2 pozitív célsejteket, de nem voltak képesek lizálni a HLA-A2-vel nem egyező célpontokat, jelezve ezzel, hogy a CTL által való peptid-felismerés a HLA-A2-re korlátozódik.

Külön kísérletekben, amelyeket általában az alábbiakbanismertetünk, a ^BBcig-27 és a ^HBc18-27 sejtekről kiderült, hogy specifikusan serkentik a CTL aktivitást, oly módon, hogy legalább a HLA-A2-re korlátozódik. Más kísérletekben a ΗΒο₂8-47 θε ^ΒΒ^ιιΐ-ΐ25 peptidekről kiderült, hogy specifikusan serkentik a CTL aktivitását a HBV antigénekkel szemben, és a HBci4o-i54 serkentette a CTL aktivitást, oly módon, amely legalább a HLA-31A-ra korlátozódottnak tűnt.

II. Példa

A HBc peptidekre specifikus CTL-ek felismerik a rekombináns

HBV mag antigént

Az I. példa betegeiből származó rövid élettartamú, peptidspecifikus CTL vonalaknak vizsgáljuk a kapacitását, hogy • · mennyire képes felismerni az endogén módon szintetizált HBV magantigént, a HBV mag expressziós vektorral transzfektált vagy fertőzött autológ és allogén BCL célpontok felhasználásával.

Két különböző eukarióta rendszert használtunk. Azokat a rekombináns vakolnia vírusokat, amelyek vagy a HBV mag (Vcore) vagy premag (Vprecore) polipeptideket expresszálják (ayw altípus) Schlicht és Schaller leírása szerint használjuk [J. Virol., 63, 5399 (1989)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezeljük. Emellett EBV-B sejteket stabilan transzfektáltünk egy olyan rekombináns plazmidokból álló panellel, amelyek a HBV mag (EBO-core) és burok (EBO-env) polipeptideket expresszálják (ayw altípus) egy Epstein-Barr vírus alapú vektorban (EBOpLPP), Canfield és munkatársai leírása szerint [Mól. Cell. Bioi., 10, 1367 (1990),amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.

Az M.B. és J.P. nevű betegekből a serkentés 7. és 14. napja után az I.példában leírt módon vett effektor sejteket célsejtekkel inkubáljuk 4 óra hosszat 100:1 illetve 10:1 E/T arány mellett. A ₅₁Cr-jelzés előtt a BCL célpontokat vagy rekombináns vakcínia vírusokkal fertőzzük (3. ábra, A panel) 20as multiplicitási faktorral 14 óra hosszat, hogy lehetővé tegyük a HBV-kódolt géntermékek expresszióját (Vw=vakcinia vad típus, Vcore=a HBcAg nyitott leolvasási keretet hordozó vakcínia), illetve a J.P. nevű beteg esetében EBV alapú episzomális vektorokkal transzfektáljuk (B panel), amelyekről korábban kimutattuk, hogy vagy a burok (EBO-env) vagy a nukleokapszid antigén hatékony expresszióját indukálják.

Amint az a 3. ábrán látható, a CTL specifikusan lizálja azokat az autológ BCL-eket, amelyek átmenetileg vagy stabilan expresszálják a HBV mag polipeptidet, de nem expresszálják a HBV burok antigéneket. HLA-A2-vel illeszkedő, illetve nem illeszkedő allogén célsejtekből álló panelt alkalmazva, az endogén módon szintetizált természetes (rekombináns) mag antigén specifikus felismerése szintén HLA-A2 korlátozott volt.

• ·

III. Példa

Nukleokapszid transzfektánsokkal végzett szekvenciális serkentés nagy affinitású anti-HBV CTL-t eredményez

A peptid antigénnel végzett serkentés alacsony affinitású CTL-t indukál a megfelelő endogén fehérjével szemben [Carbone et al., J. Exp. Med. , 167, 1767 (1988)1, oly módon, hogy az ismétlődő peptid serkentés olyan CTL-t eredményezhet,amely felismeri a szintetikus peptidet, de a natív antigént nem. Abból a célból, hogy szelektíven kiterjesszük azoknak a CTL-eknek a populációját, amelyek felismerik a natív nukleokapszid antigént, és hosszú élettartamú vonalakat hozzunk létre a további elemzésekhez, a P.J. nevű betegből származó PBL-t 1 hétig serkentettük a HBc₁₁_₂7 pepiiddel plusz a rekombináns HBcAg-vel, azután, hogy az aktivált PBL-t újra serkentettük HLA-val illeszkedő transzfektált BCL-lel, amely stabilan expresszálja a HBV nukleokapszid polipeptidet.

A részleteket az alábbiakban adjuk meg. A HBc₁₁„₂7 pepiiddel és az rHBcAg-vel végzett serkentés után két héttel a J.V.-ből származó peptid-specifikus CTL vonalat (2B. ábra) újra serkentjük minden hetedik napon, besugárzott (7000 RÁD) HLA I-es osztályú EBO-mag transzfektánsokkal (ΙχΙΟθ/ml), plusz autológ besugárzott (3000 RÁD) PBL-lel (5xl0^/ml) és rHBcAg-vel 1 mg/ml (RPMI + 10% FCS + 20 E/ml rIL2) összetételű oldatban. Amint az a 4A. ábráról látható, a citolitikus aktivitást HLA-A2-vel illeszkedő BCL ellen vizsgáljuk, amely vagy prepulzálva van HBc^-l-27 peptiddel, vagy csak táptalajon szaporítjuk, illetve EBO transzfektánsokkal szemben, amelyek endogén módon szintetizált nukleokapszid vagy burokfehérjét expresszálnak. A kísérleteket az EBO-mag transzfektánsokkal végzett kétszeri és után (négy héttel) hajtjuk végre (az E/T arány = 20:1).

Amint az a 4A. ábrán látható, az újraserkentés előtt a CTL magas szintű citotoxicitást mutatott a peptiddel pulzált célsej tekkel szemben, minimális specifikus pusztító hatással azokkal a célsej tekkel szemben, amelyek endogén módon szintetizált antigént expresszálnak.

nukleokapszid transzfektánssál végzett fokozott pusztító amelyek endogén hatást mutatnak azokkal a célsejtekkek szemben, módon szintetizált antigént expresszálnak, és célsejteket (4A. ábra).

Az endogén módon szintetizált antigén felismerése progresszíven fokozódott az újraserkentést követő időszakban, amint az a 4B. ábrán látható. Ez a panel mutatja az endogén módon szintetizált HBV nukleokapszid antigének felismerését a V.J.-ből származó CTL sejtvonallal, a szaporítás 3., 4. és 5. hetében, EBO-mag transzfektánsokkal (E/T = 20:1) végzett 1, 2 vagy 3 egymást követő serkentés után. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy azt a CTL-t választottuk, amely magasabb affinitással rendelkezik az endogén módon szintetizált antigénnel szemben.

A 4C. ábra mutatja a HLA-A2-vel illeszkedő, illetve nem illeszkedő, rekombináns vakcinia vírusokkal fertőzött (a III.

példában leírtak alapján) BCL célsejtekkel szembeni citolitikus aktivitást a szaporítás 5. hete után (E/T = 50:1).

Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a természetes úton processzált nukleokapszid antigén hasonló, de nem azonos a szintetikus HBcji]_-27 peptiddel, amelyet arra használtunk, hogy a

CTL prekurzor populációt kiterjesszük. A tény az, hogy ez a szekvenciális serkentés nagyon jól működött, akkor amikor számos korábbi próbálkozás, amely arra irányult, hogy HBV-specifikus CTL választ mutassunk ki frissen izolált PBL-ben, előzetes serkentés nélkül, kudatcot vallott, és ez azt sugallja, hogy a HBVspecifikus CTL prekurzorok nagyon alacsony koncentrációban vannak jelen a perifériális vérben. A stabilan transzfektált autológ BCL-lel, amely kiváló célsejtként szolgált, végzett pusztán in vitro serkentésekkel végzett HBc-specifikus CTL indukció kudarca azt sugallja, hogy magasabb epitop sűrűségek kellenek általában a CTL indukcióhoz, ha a lizishez szükséges sűrűséggel hasonlítjuk össze.

A ^HBch-27 specifikus CTL fenotípusát úgy becsüljük meg, hogy a HBV mag transzfektánsokat és a V.J. nevű betegből származó nukleokapszid-specifikus CTL vonalat inkubáljuk a CD4 és Cd8 differenciálódási markerekre specifikus antitestekkel inkubáljuk. A V.J. nevű betegből származó CTL vonalat A2-pozitív EBO-core és EBO-env célpontokkal szemben vizsgáljuk, telítési koncentrációjú (0,6 μg/ml) IgG]_ monoklonális antitestekkel (anti-Leu-3a; CD4, és anti-Leu-2a; CD8) szemben, amelyet a Beckton Dickinson cégtől lehet beszerezni. Az antitesteket a króm-kibocsátási vizsgálat kezdetekor adjuk a tenyészethez. Az antigén-specifikus lízist 80%-ban blokkolják a CD80 elleni antitestek, míg nem figyelhető meg gátlás a CD4 elleni antitestekkel. Ezek az eredmények azt igazolják, hogy a HBC]_]__27 specifikus, HLA-A2-re korlátozott CTL aktivitást kizárólag a CD8 molekulák közvetítik.

IV. Példa e · · · ·· ««·· ·· v····* ♦ · · • ·« · · · ·· ···· ·· ·· ·· ·

A HBc-q_27 specifikus CTL egy olyan epitopot ismer fel, amely közös a HBV mag és előmag régiója által kódolt polipeptidekben

A HBcj_]__27 epitop(ok) két egymástól független nukleokapszid polipeptidben található(k) (mag és előmag), ezek közöül az egyik (az előmag) egy amino-terminális szignál szekvenciát tartalmaz, amely az endoplazmatikus retikulumba való transzlokációt, és a hepatitisz B e antigén szekrécióját eredményezi (HBaAg) [Uy et al., Virology, 155, 89 (1986); Roosinck et al., Mól. Cell. Bioi., 6, 1393 (1986); és Standring et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8405 (1988)]. A mag polipeptd elsősorban egy citoplazmatikus és nukleáris fehérje (HBcAg), és nem szekretálódik [Roosinck and Siddiqui, J. Virol., 61, 955 (1987); és McLahlan et al., J.Virol., 61, 683 (1987)]. Annak meghatározására, hogy egy vagy két polipeptid szolgálja a HLA-A2-re korlátozott ^HBcn-27 specifikus CTL epitop(ok) keletkezését, HLA-A2 pozitív BCL célsejteket fertőztünk rekombináns vakcínia vírusokkal, amelyeket rekombináns DNS módszerekkelgy változtattunk meg, hogy a természetes mag és premag polipeptideket egymástól függetlenül expresszálj ák, amint azt a II. példában leírjuk.

származó CTL vonalat használjuk az effektor sejtek forrásaként egy négyórás ³¹Cr felszabadulási vizsgálatban, amelyben az E/T arányt az 5. ábrán mutatjuk be.

Az eredmények azt igazolják, hogy mindkét célsejt-vonalat azonos mértékben pusztítja a V.J. nevű betegtől származó HBcii-₂7 specifikus CTL vonal, igazolva ezzel, hogy a HBcAg és a HBeAg közös intracelluláris processzáló feldolgozási úttal rendelkezik, és ezek keresztreakciót adnak a HLA I-es osztályra korlátozott • ·

- 54 CTL szinten.

V. Példa

A HBc₄χ_27 CTL epitop immundominanciái a a HLA-A2 haplotípusú egyedekben

Abból a célból, hogy a ^HBch-27 peptidben levő CTL epitop(ok) HLA-A2 haplotipusában megbecsüljük az immundominanciát, nyolc további beteget, akiknek önkorlátozó akut hepatitisz B fertőzésük van, négy beteget, akiknek krónikus aktív hepatitisz B fertőzésük van, és nyolc egészséges embert, akiket ismételten levizsgáltunk, és nem mutatták jelét annak, hogy korábban HBV-vel kerültek kapcsolatba (mindegyik HLA-A2 pozitív), ismételten megvizsgáltunk.

Mindegyik akut beteget sorozatban vizsgáltunk (minden 7-10. napban) a betegség tünetes és felgyógyulási periódusában, és megfigyeltük, hogy hatékonyan felismerték az a HBc₄₁_27 pepiiddel valamint a MIX4-gyel pulzált autológ célsejteket (1. ábra). Négyükkel MlX4-gyel serkentett PBMC-vel végzett korlátozási kísérletekben megerősítettük, hogy a ^HBcn-27 peptid CTL felismerése HLA-A2-re korlátozott. Betegről-betegre való eltérés figyelhető meg a betegség során a peptidre adott válasz mintázatában. A citolitikus aktivitás általában az ikterikus fázisban mutatható ki, amikor a transzamináz értékek magasak; néhány betegben a válasz hosszú ideig tartott, még akkor is kimutatható volt, amikor a GPT szintek már normálisak voltak, míg más betegekben a litikus aktivitás kimutathatatlanná lett 2-3 héttel a transzamináz csúcs után, amikor a GPT szintek még enyhén mások voltak. A CTL aktivitás és az SGPT szintek közötti konstans *· ·♦ ·« «··· ·» « ·· · · · · · · 4 ·«· · · «· • · ·« · · ·· · ···· ·· ·· ·· «

- 55 összefüggés hiánya azt sugallja, hogy a perifériális vér csak részlegesen tükrözi a májban az antigén szintézis helyén és a sejtes sérülés helyés lezajló immunológiai eseményeket.

A négy krónikus beteg közül három (mindegyiket két-háromszor vizsgáltuk, ugyanazzal a kísérleti elrendezéssel, mint amit az akut betegeknél használtunk) nem mutatott citolitikus aktivitást a HBC]_]__27 pepiiddel pulzáltatott autológ makrofágokkal szemben, míg egy beteg mutatott kimutatható, de nagyon alacsony szintű citotoxicitást a megfelelő peptid-szekvenciával szemben. A HBcn_27 peptid elleni litikus aktivitás nem mutatható ki a normális HLA-A2 pozitív kontroliokban, demonstrálva ezzel, hogy ez a válasz nem az in vitro vezetés következménye, és a peptid serkentés szelektíven kiterjedt egy specifikus T-sejt populációban, amelyet in vivő elővezettünk HBV fertőzéssel.

Ezek az eredmények világos összefüggést mutatnak a ^HBcn-27 magpeptidre adott CTL válasz és az akut HBV fertőzés között olyan betegekben, akikből kitisztult a vírus.

VI. Példa

A HLA-A31-re és Aw68~ra korlátozott CTL aktivitás azonosítása

Ebben a példában egy HBV nukleokapszid epitopra adott CTL választ írunk le, amelyet két egymástól független HLA I-es osztályú molekula, a HLA-31 és a HLA-Aw68 korlátoz.

Hat beteget vizsgáltunk, három férfit és három nőt, akiknek akut hepatitisz B-jük volt, valamint kilenc normális véradót (II. táblázat). Az akut hepatitisz B diagnózisa standard diagnosztikai kritériumokon alapult, beleértve a súlyos máj sérülésre utaló • · · · «4 ···· ·· • ·· · · · · · · • · · · · · ·· • · ·· · · «· · •··· ·· ·· ·· 4 klinikai és biokémiai bizonyítékokat, a normális szint felső határánál legalább hússzor magasabb alanin-aminotranszferáz aktivitást, az akut HBV fertőzésre utaló szerológiai bizonyítékokkal együtt, beleértve a hepatitisz felszíni antigént (HBsAg) és az IgM anti HBc antitestet (IgM HBc-Ab), valamint a hepatitisz delta vagy hepatitisz C vírussal való fertőzésre utaló szerológiai bizonyítékok hiányát (az Abbott Laboratories-tói, North-Chicago, IL, megvásárolható reagensekkel). Mindegyik beteg teljesen felgyógyult a betegségből, normalizálódott szérumtranszamináz szinttel és a HBsAg kitisztulásával, a kezdeti diagnózistól számított 4 hónapon belül.

II. Táblázat

A vizsgált betegek és a célsejtek előállításához használt HLA-A31 valamint Aw68 normál donorok HLA osztálya

BETEG	I-es HLA osztály
E.W.	A31, Aw68, B35, Cw3, Cw4
Η. P.	A2, Aw68, B35, Bw62, Cw3, Cw4
V.T.	A25, A31, B7, BI8
H.F.	A31, Aw68, Bw61, Cw3
Q.M.	Aw36, Aw68, B49, Bw62, Cwl
V. P.	A24, Aw68, B35, Bw67
C .N.	A24, Aw68, Bw60, Cw3

DONOR

a	Al, A31, B17, Bw60
b	A2, A31, B27, B44, CW1

c	A3, A31, B7, B27
d	A24, A31, B14, B35
e	A3, A31, B7
f	A31, Aw68, B7, B44
g	A3, Aw68, B7, B44 ,
h	Al, Aw68, B8, B38,

, Bw60

Cw7

Cw7 i

, Cw4

All, Aw68, B35, B44, Cw4

A betegekből és normál donorokból származó PBMC-t FicollHypaque sűrűségi gradiensen választjuk el, háromszor mossuk Hank féle kiegyensúlyozott sóoldatban (HBSS), RPMI-ben 1640 táptalajban szuszpendáljuk, amely kiegészítésként tartalmaz 2 mmol/1 L-glutamint, 50 NE/ml penicillint, 50 μg/ml· sztreptomicint és 10 mmol/1 HEPES-t amely 10% hővel inaktivált humán AB szérumot tartalmaz, majd egy 24 lukas lemezen osztjuk szét, 4x10^ luk/sejt koncentrációban. Mindegyik szintetikus peptidet 10 μg/ml koncentrációban adjuk a sejttenyészetekhez

1-es keverék, 1-20, 20-34, 28-47, 50-69 magcsoportok, 2-es keverék, 82-101, 100-119,

155-169, 169-183 számú magcsoportok; 3-as csoport 20-mag csoport 2, 50-59,

117-131, magcsoportok; 4-es keverék, 11-27,

91-110, magcsoportok. rHBcAg-t (Biogen, Genf, koncentrációban, hogy ebből a segítő

T sejtek az

alábbiak	szerint:
3-89, 61-8	0 s z ámú
120-139,	140-155,
keverék,	pre-mag
131-145,	111-125
147-160,	162-176
lünk hozzá	1 μ9/πι1
válaszának	előnye

származzon a tenyészetben a serkentés első hetében. A 3. napon 1 ml, 10%-os humán AB szérummal és 10 E/ml végkoncentrációjú rIL2 vel kiegészített RPMI oldatot adunk minden egyes lukhoz. A tenyésztett PBMC-knek vizsgáljuk a CTL aktivitását a 7. napon, és

- 58 rövid élettartamú CTL vonalakat, amelyek a serkentés első hetében használt peptid-keverékre specifikus CTL aktivitást mutattak, meghosszabbítjuk, az alábbiakban ismertetett újraserkentéssel.

HBV magsepcifikus CTL vonalat indítottunk a H.P. nevű betegből, amelyet először a Mix 2 peptiddel plusz az rHBcAg-vel tenyésztettünk, hetente újraserkentve besugárzott (3000 rád) 5x10^ autológ PBMC-vel RPMI plusz 10% humán AB szérum plusz rIL2 (20 E/ml) és 2-es peptid Mix összetételű oldatban (első új raserkentés) illetve a 140-155-ös peptiddel (10 Mg/ml) az összes ezután következő serkentés során. Az E4 CTL vonalat (az

E.W. jelű betegből) és a további négy betegből (V.T., H.F., Q.M.,

C.N.) származó CTL vonalakat oly módon hoztuk létre, hogy a PBMC-t a 140-155-ös peptiddel plusz rHBcAg-vel serkentettük az első héten, hetente újra serkentve azután a 140-155-ös peptiddel és az rIL2-vel. A normál fertőzetlen kontrollok PBMC-jét hasonlóképpen serkentettük, azzal az eltéréssel, hogy egyes kiválasztott esetekben a tetanusz toxoidot rHBc-vel helyettesítettük a serkentés első hetében, hogy a T sejt segítő másik forrását biztosítsuk, mivel ezeket az egyedeket nem hoztuk érintkezésbe a HBcAg-vel.

A HBV-specifikus CTL kiónokat úgy hoztuk létre, hogy az E4 HBV-specifikus CTL vonalból (az E.W. jelű beteg) 1 sejt/luk korlátozott határhigítást végeztünk 96 lukas mikrotiter lemezeken. Miután a CD4 + T sejteket eltávolítottuk a CTL vonalból, oly módon hogy egy CD4-specifikus monoklonális antitesttel (Becton Dickinson, Mountain View, CA) plusz komplementtel inkubáltuk, a sejteket 1 Mg/ml PHA, 0,5 Mg/ml CD3 :

monoklonális antitest (Coulter Immunology, Hialeah, FL), rIL-2 (20 E/ml), és besugárzott (5000 rád) allogén PBMC (10® per sejt) jelenlétében szélesztjük. A HBV-specifikus kiónokat újra serkentjük egy 24 lukas lemezben 105 besugárzott (9000 rád) autológ transzfektánssal, amelyek a HBV mag régiót expresszálják (az előzőkben írtuk le) , lukanként 2x10 θ allogén besugárzott (3000 rád) PBMC táplálósejttel, RPMI 1640 táptalajban, amely 10% hővel inaktivált FCS-t és 20 E/ml IL2-t tartalmaz.

A célsejt vonalakhoz az autológ és allogén EBV-vel transzformált B limfoblasztoid sejtvonalakat (LCL) vagy az American Society fór Histocompatibility and Immunogenetics-től vásárolj uk (Boston, MA), vagy betegek és normál donorok keverékéből hozzuk létre, a fentiekben leírt módon.

A sejteket

RPMI plusz térf/térf% hővel inaktivált FCS összetételű oldatban tartjuk fenn. A rövid élettartamú autológ PBMC blasztokat úgy állítjuk elő, hogy perifériális vér PBMC-t 1 gg/ml koncentrációjú PHA-val serkentjük RPMI plusz 10% FCS, 10 E/ml rlL2 összetételű oldatban, hét nappal azelőtt, hogy célsejtként használnánk őket.

citotoxicitási vizsgálatokat olyan célsej tek felhasználásával végeztük, amelyek

a) vagy autolób PHA-val serkentett blasztok vagy allogén

HLA-val illeszkedő illetve nem illeszkedő B-LCL,éj szakén át inkubálva 10 pg/ml koncentrációjú szintetikus peptidekkel;

b) vagy az előzőkben ismertetett stabil B-LCL transzfektánsokkal ;

c) vagy rekombináns vakcínia vírussal fertőzött B-LCL-lel.

A vakcíniával fertőzött célsejteket úgy állítjuk elő, hogy 1x10® sejtet fertőzünk 50 tarfoltképző egység/per sejt koncentrációban egy rázatott lemezen, szobahőmérsékleten, egy óra hosszat, majd egyszer mossuk, és éjszakán át 37°C-on inkubáljuk. A célsejteket azután 100 gCi ⁵¹Cr-mal jelezzük egy óra hosszat, és háromszor mossuk HBSS-sel. A citolitikus aktivitást standard négyórás ⁵¹Cr-felszabadulási vizsgálatban határozzuk meg, kerekfenekű 96lukas lemezeket használva, amelyek lukanként 5000 célsejtet tartalmaznak. A serkentett PBMC-ket 70-100:1 E:T aránynál vizsgáljuk, míg a HBV magspecifikus CTL vonalakat 4-50:1 E:T arány mellett vizsgáljuk, és a normál donorok serkentett PBMC-it

60:1 E:T arány mellett. Az összes vizsgálatot két párhuzamosban végezzük. A százalékos citotoxicitást az határozzuk meg: 100 [(kísérleti kibocsátás - spontán kibocsátás)/(maximális kibocsátás-spontán kibocsátás)].

maximális kibocsátást a célsejtek detergenssel (1% Triton X-100,

Sigma) való lízisével határozzuk meg. A spontán kibocsátás az összes vizsgálatban a maximális kibocsátás 25%-ánál kisebb volt.

Két, akut HBV fertőzésben szenvedő betegből (E.W. és H.P.) származó PBMC-t 7 napig serkentettünk az előzőkben ismertetett peptid-keverékekkel, majd vizsgáltuk az autológ, ⁵¹Cr-mal jelzett, PHA-val aktivált, ugyanazzal a peptidkeverékkel vagy táptalajjal prepulzált blasztok. ellen. A 2-es keverékre adott válaszokat mindkét betegben megfigyelhettük (6. ábra). A megmaradt sejteket újra serkentettük egy második hétre a 2-es peptid keverékkel, és az újra serkentett CTL vonal antigén specifitásának meghatározásához olyan autológ, PHA-val aktivált blaszt célsejteket használtunk, amelyeket a keverékben levő egyes peptidek keverékével prepulzáltunk. Ezzel a megközelítéssel a

140-155-ös HBcAg pepiidről ki lehetett mutatni, hogy az felelős a

2-es keverék által indukált CTL aktivitásért mindkét betegben (7.

ábra). Nem volt megfigyelhető citotoxikus aktivitás az E.W.

betegből származó serkentetlen PBMC felhasználásával mint effektor sej tekkel, ezzel azt sugallva, hogy a specifikus CTL alacsony gyakorisággal volt jelen a perifériális vérben az akut

HBV fertőzés során. A H.P. nevű beteg is mutatott CTL választ a

4-es keverék ellen (6. ábra), amiről végül ki lehetett mutatni, hogy a 11-27 mag-csoportokra specifikus, és a HLA-A2 korlátozza. Ez azt igazolta, hogy a többszörös, egymástól függetlenül korlátozott CTL válaszok az ugyanazon a virális fehérjén levő nem-átlapoló CTL epitopokra könnyen kimutatható az akut fázisú

HBV fertőzésben.

A HBcAg-specifikus CTL vonalakat úgy állítjuk elő, hogy hetente serkentjük a PBMC-t akár a 2-es keverékkel, vagy egy aktív peptid komponenssel (140-155-ös csoport). Az E4 vonalat (az

E.W. beteg) rHBcAg és HBcAg 140-155 peptid jelenlétében indítottuk; a Hl vonalat (H.P. beteg) rHBc és a 2-es keverék jelenlétében indítottuk. Négyhetes újraserkentés után a Hl CTL vonal HLA I-es típusát vizsgáljuk, számos allogén célsejttel, amelyek részlegesen illeszkednek a HLA I-es osztály lókuszához, de egyáltalán nem illeszkednek a HLA ΙΙ-es osztályához. Az eredmények (8. ábra) azt mutatják, hogy a CTL aktivitás a HLAAw68-ra korlátozódik.

A HBcAg 140-155 specifikus E4 CTL vonalat 1 sejt/luk sűrűségben klónozzuk anti-CD3, PHA és allogén PBL mint tápláló sejt jelenlétében. 2-3 héttel később, a beoltott sejtek szaporodtak, és a növekvő sejtpopulációkat vizsgáljuk a HBcAg • ·

- 62 140-155-tel előinkubált autológ B-LCL-lel való specifikus lizis szempontjából. Két kiónt (3D11, 2D7), amelyek nagyon hatékony specifikus citotoxikus aktivitást mutattak, a további elemzésekhez kiemelünk. A kiónokat vizsgáljuk autológ és allogén célsejtekkel szemben ú, amelyek részlegesen illeszkednek az effektorokhoz a HLA I-es és ΙΙ-es osztályú allélek szintjén. A 3D11 klón citolitikus aktivitásáról kiderült, hogy HLA-31 által korlátozott, és a 2D7 klón citolitikus aktivitása, amely klón ugyanabból a betegből származott HLA-Aw68 által volt korlátozott (9. ábra). Mindkét klón mutatta a CD4-, CD8+ fenotipust áramlási citometria alapján.

Ezeket az eredményeket megerősítettük és kiterjesztettük további 4 HLA-A31 vagy Aw68 pozitív betegek vizsgálatável, akik akut HBV fertőzésben szenvedtek (F.F., V.T., Q.M., C.N.). Mindegyik betegben HBcAg 140-155 specifikus CTL vonalakat generáltunk, az E4 vonalra leirt módon (III. táblázat). Részlegesen HLA-val illeszkedő allogén célsajtek alkalmazásával a CTL válaszról kiderült, hogy a V.T. nevű betegben a HLA-A31 alléi korlátozza; világos volt, hogy a Q.M. jelű betegben ez HLA-Aw68 által korlátozott volt, és a C.N. nevű betegben Aw68 által korlátozott, míg a H.F. nevű beteg által adott válasz túl gyenge volt az elemzéshez.

III. Táblázat

Akut HBV fertőzésben szenvedő HLA-A31 és Aw68 betegekből származó

CTL vonalak HBcAg 140-155 specifikus CTL válasza

Célpont

Beteg	HLA illeszkedés	HBc 140-155	Közeg
		(a specifikus	lízis %-a)
V.T.	A31	75	34
H.F.	Mindegyik	10	1
Q.M.	Aw68	23	0
C.N.	AW68, A24	25	10

PBMC HBcAg 140-155-tel plusz rHBcAg-vel serkentve (1 μς/ιηΐ) .

A HBcAg 140-155 specifikus CTL vonalaknak és kiónoknak az a képességeét, hogy lizálják azokat a célsejteket, amelyek endogén módon szintetizált HBcAg-t expresszálnak, meghatároztuk. Két poliklonális CTL vonalat (E4 és Hl) valamint két, az E4 vonalból származó kiónt (3D11 és 2D7) vizsgáltunk, autológ és allogén célsejtekkel, amelyeket rekombináns vakcínia vírusokkal fertőztünk, vagy a HBV mag és előmagnak a szintézisét a sejtben irányító EBV alapú expressziós vektorokkal stabilan transzfektáltunk. A Hl vonalat endogén módon szintetizált megfehérjével szemben vizsgáljuk, amelyet a rekombináns vakcínia vírus indukált, az E4 vonalat endogén módon szintetizált mag és premag fehérjékkel szemben vizsgáljuk, amelyeket mindkét expressziós vektorral indukáltunk (10. ábra). A 3D11 és 2D7 kiónokat csak az endogén módon szintetizált mag és előmag fehérjékkel szemben vizsgáltuk, amelyeket a rekombináns vakcínia vírusokkal indukáltunk (11. ábra). Specifikus citolitikus aktivitás jelentős szintjét lehetett kimutatni mindegyik esetben (10. és 11. ábra). Az endogén módon szintetizált antigén HBcAg 140-155 peptid-specifikus vonalak és kiónok által való felismerése azt igazolta, hogy a mag 140-155-ös szekvenciája által képviselt CTL epitop az endogén módon szintetizált HBV mag és premag fehérjék intracelluláris processzálása révén jön létre, és ezek a CTL-ek in vivő vezetődnek a HBV fertőzés során. Ez utóbbi következtetést megerősíti, hogy nem lehet HBcAg 140-155 specifikus CTL vonalakat létrehozni a 6 HLA-A31 pozitív vagy a 4 HLA-Aw68 pozitív normál fertőzetlen kontroliból.

Annak	érdekében, hogy meghatározzuk a minimális, optimálisan
felismert	HLA A31 és Aw69 által korlátozott epitopot a HBcAg
140-155-ön	belül, a HBcAg 140-155 karboxi- és amino-terminálison
csonkított	változatait hoztuk létre, amint az a IV. táblázatban

látható. A 3D11 klón, amely HLA A31 által korlátozott, és a 2D7 klón, amely HLA Aw68 korlátozott, effektor sejtek, amelyeket arra használtunk, hogy meghatározzuk a CTL válasz finom specifitását. Az autológ B-LCL-t előinkubáltuk a csonkított peptidekkel, és célpontokként használtuk a két klónnal. Az adatok azt mutatják, hogy a 141-151 szekvencia a minimális, optimálisan felismert epitop mindkét korlátozó elem számára. A IV. táblázatból kitűnik, hogy a 151-es csoport (Arg) határozza meg a mindkét klón által

felismert

karboxi-terminálist, jóllehet a 150-es csoport, amely

szintén arginin, szintén szolgálhat karboxi-terminálisként, de kevésbé hatékonyan, mindkét klón esetében, ameddig a 141-es csoport az amino-terminális. Jóllehet a 141-es csoport (Ser)

tűnik az	optimális amino-terminális csoportnak, az adatok azt
mutatj ák,	hogy a 142-es csoport (Thr) szintén szolgálhat amino-

terminálisként az epitopon, mindkét klón esetében, amennyiben a

151-es arginin a karboxi-terminális csoport. Ezzel szemben, csak a HLA-Aw68 által korlátozott klón (2D7) használhatja a Thr 142-t, •*••4 · · · ·

- 65 ha a peptid karboxi-terminálisa a 151-es csoporton túlnyúlik.

IV. Táblázat

A 3D11 és 2D7 kiónok citotoxikus aktivitásának finomspecifikus elemzése

Klón Klón

3D11 2D7

Korlátozó elem

A31 Aw68

Százalék ⁵¹Cr felszabadulás

140-155	LSTLPETTVVRRRGRS --------	--------- 72	62
140-154	LSTLPETTVVRRRGR --------	-------- 63	60
140-153	LSTLPETTVVRRRG --------	------- 75	66
140-152	LSTLPETTVVRRR --------	------ 77	69
140-151	LSTLPETTVVRR --------	----- 72	67
140-150	LSTLPETTVVR --------	---- 0	6
141-155	STLPETTVVRRRGRS -------	--------- 81	66
141-154	STLPETTVVRRRGR -------	-------- 79	67
141-153	STLPETTVVRRRG -------	------- 79	59
141-152	STLPETTVVRRR -------	------ 68	68
141-151	STLPETTVVRR -------	----- 69	66
141-150	STLPETTVVR -------	---- 20	52
141-149	STLPETTVV -------	0	3
142-155	TLPETTVVRRRGRS ------	--------- 8	63
142-154	TLPETTVVRRRGR ------	-------- 18	54
142-153	TLPETTVVRRRG ------	------- 8	56
142-152	TLPETTVVRRR ------	------ 2	37
142-151	TLPETTVVRR ------	----- 47	60

IV. Táblázat

3D11 és

2D7 kiónok citotoxikus aktivitásának finomspecifikus elemzése (folytatás)

Klón Klón

3D11 2D7

Korlátozó elem

A31 Aw68

Százalék ^¹Cr felszabadulás

142-150	TLPETTVVR ---------	0	0
143-155	LPETTVVRRRGRS		0	0
143-154	LPETTVVRRRGR	0	0
143-153	LPETTVVRRRG	0	0
143-152	LPETTVVRRR	0	2
143-151	LPETTVVRR	—	0	0

Az epitop(ok) határainak pontosabb meghatározásához egy dózis titrálási elemzést végzünk, amelyben a két CTL klónt allogén HLA-A31 és HLA Aw68 pozitív célsejtekkel inkubáljuk, amely célsejteket a 140-151, 141-150, 141-151, 141-152, 142-151 peptidekkel előinkubáltuk, különböző moláris koncentrációban, amely 10“^ μηοΐ/ΐ és 1 gmol/l között változott. Amint az a 12. ábrán látható, a 141-151-es csoportokból álló peptid jelen egy minimális optimálisan felismert epitopot, amelyet mindkét CTL klón felismer. Az egy csoporttal való hosszabbítás az Nterminálison nem érintette a cél-lízis hatékonyságát egyik klónnál sem, míg egyaminosav hozzáadása a C-terminálishoz tizedrészére csökkentette a CTL választ mind a HLA A31 mind az

Aw68 korlátozott klónoknál, igazolva ezzel, hogy mindkét alléi kötődik, és ugyanazt a peptidet mutatja be a megfelelő CTL-jének.

VII. Példa

HLA-korlátozott válasz a HBV polimeráz epitoookra

Ebben a példában két HBV polimerázra adott HLA-A2 korlátozott CTL válasz azonosítását írjuk le, egy olyan betegben, akinek akut virális hepatitisze van. Az epitopok a HBpolg-j.-69 aminosav szekvenciában [SEQ. ID NO. 9] Gly-Leu-Tyr-Ser-Ser-ThrVal-Pro-Val (GLYSSTVPV) (amit jelölünk még 927.32-es pepiidként is az ábrákon), és a HBpol₈₀3_₈₁₁ aminosav szekvenciában [SEQ. ID NO. 10] Ser-Leu-Tyr-Ala-Asp-Ser-Pro-Ser-Val (SLYADSPSV) (az ábrákon 927.27 peptidnek is jelöljük).

A CTL-lel indukált HBpol peptideket egy olyan betegből származó PBMC-kben azonosítottuk, akinek akut hepatitisze van, a VI. példában közölt eljárással, azzal a különbséggel, hogy a PBMC-ket egyes peptidekkel serkentettük a peptid-keverékek helyett. A kapott CTL vonalakat és/vagy kiónokat azután megvizsgáltuk, hogy elpusztítják-e a HLA-A2-vel illeszkedő célsejteket, amelyeket vagy a pepiiddel pulzáltunk, vagy expresszálta a megfelelő endogén polimeráz antigént (Vpol vagy EBO-pol). A vakcinia alapú Vpol és az Epstein-Barr vírus alapú EBO-pol konstrukciók készítését a II. példában írjuk le.

Amint az a 13. ábrán látható, mind a HBpol₈Q₈_₈₁₁ mind a HBpolgi-gg peptid serkenti a CTL válaszokat egy HLA-A2⁺ betegben, egy pepiiddel pulzált célsejteket alkalmazva, míg a többi peptid, a 927.24 (WILRGTSFR) és a 927.30 (DLNLGNLNV), valamint a kontroll táptalajok serkentik a specifikus CTL választ. A HBpol₈Q3_₈₁₁ specifikus kiónoknak azt a képességét, hogy felismerik az endogén módon szintetizált polimeráz antigént (Vpol és EBO-pol), a 14. ábrán mutatjuk be. Két kiónt azonosítottunk, jelük Be.27-1A1 és Be.27-1A5, amelyek felismerik a HBpolgQ₃_gn peptidet. Amint az a 15. ábrán látható, a HBpolg]_-69^-re ®s a HBpolgQ3-8H“^re adott CTL válaszok homológ peptiddel pulzált célsejtekkel voltak kimutathatók, de csak a HBpolgQ3_g-|_i klón adott választ az endogén módon szintetizált Vpol antigénnel szemben.

VIII. Példa

HLA-korlátozott CTL válasz HBV X fehérjére

Ebben a példában egy HLA-A2 korlátozott CTL válasz azonosítását írjuk le eg betegben, akinek akut virális hepatitisze van, egy olyan peptid szekvenciával szemben, amely a HBV X fehérjéből származik. A CTL epitop a ^HBc126-134 aminosav szekvenciájú [SEQ. ID NO. 9] Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Phe-Val-Leu (EIRLKVFVL) peptiden található.

A HBpol peptidek által indukált CTL-t akut hepatítiszes betegek PBMC-iben azonosítottuk, a VI. példában közölt leírás szerint, azzal a különbséggel, hogy a PBMC-ket egyes peptidekkel serkentettük peptid-keverékek helyett. A kapott CTL vonalakat azután megvizsgáltuk, hogy képesek-e elpusztítani a HLA-A2-vel illeszkedő célsejteket, amelyeket a peptiddel pulzáltattunk.

/Kmint az a 16. ábrán látható, a CTL-t a HBx 126-134 peptid serkentette, amelyben az amino-terminális csoportot egy alanin csoporttal helyettesítettük (EIRLKVFVL helyett AIRLKVFVL). Az analóg peptidet felismerő CTL felismerte a vad típusú szekvenciával rendelkező szekvenciát is. Másrészről, a vad típusú • · · · peptid nem volt képes egy specifikus CTL választ indukálni, amely kimutatható lett volna akármelyik peptiddel pulzáltatott sej tekkel.

IX. Példa

HLA-korlátozott CTL válasz a HBenvg^8-357 Peótidre

Ebben a példában egy HLA-A2 korlátozott CTL válasz azonosítását írjuk le eg betegben, akinek akut virális hepatitisze van, egy olyan peptid szekvenciával szemben, amely a

HBV burokfehérjébol származik. A CTL epitop a HBenv₃₄g_₃g₇

Trp-Leu-Ser-Val (ayw altípus) peptiden található (az adw altípusban a Val csoportot Alá helyettesíti).

A HBen_VV348-357 peptidek által indukált CTL-t akut hepatítiszes betegek PBMC-iben azonosítottuk, a VI.

példában közölt leírás szerint, azzal a különbséggel, hogy a

PBMC-ket egyes peptidekkel serkentettük peptid-keverékek helyett.

A kapott

CTL vonalakat azután megvizsgáltuk, hogy képesek-e elpusztítani a pulzáltattunk, illetve amelyek az ayw vagy adw altípusú burok antigéneket expresszálják endogén módon.

Amint az a 17. ábrán látható, a HBenvg₄g_₃g₇ peptid által serkentett

CTL reagált a célsejtekre (3:1 effektor:célsejt arány amelyeket a peptiddel pulzáltattunk (jelzése 884.01 ayw), és fel az az ayw altípusú endogén burok antigénre, de nem ismerte adw altípust, valószínűleg annak következtében, hogy különbség van a C-terminális aminocsoportban (a Val-t Alá helyettesíti).

Az előző példákban ismertetett eredmények azt mutatják, hogy a HBV-re adott CTL válasz emberben meglehetősen polivalensnek tűnik, valószínűleg azért, hogy lehetővé tegye a hatékony védelmet ezzel a súlyos virális fertőzéssel szemben. Emellett az adatok azt mutatják, hogy az itt alkalmazott peptid-serkentési stratégia mind hatékony mind hatásos a polivalens válasz azonosításában és elemzésében, a polimorf HLA I-es lókusz által korlátozva. Ahogy további HLA alléi specifikus kötési motívumokat azonosítanak, az ezeket a motívumokat tartalmazó HBV eredetű peptidek használhatók a CTL prekurzorok in vitro serkentésére.

Az előzőkből az következik, hogy jóllehet a találmány specifikus megvalósítási módjait részletesen ismertettük a jobb megértés céljából, mégi tehetők különböző módosítások, amelyek nem térnek el a találmány szellemétől és oltalmi körétől. Tehát a találmányt csak a mellékelten megadott igénypontok korlátozzák.

1. Egy hat-huszonöt aminosavból álló CTL-t indukáló peptid, « »· · « » · · • ·· · · · ·· »··· ·· «· ·· ·

Ί2

Claims (39)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK azzal jellemezve, hogy az említett CTL-t indukáló peptidben az aminosavaknak legalább a többsége homológ a ^HBcn-27 megfelelő részével, amelynek szekvenciája az alábbi:

   Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser
2. 2. Az 1. igénypont szerinti peptid, azzal j ellemezve, hogy szekvenciája az alábbi:

   Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val [SEQ. ID NO.
3. 3. Az 1. igénypont szerint peptid, azzal j ellenezve, hogy szekvenciája az alábbi:

   Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val [SEQ. ID NO.5].
4. 4. Az 1. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája az alábbi:

   I HBc₁₁_27)

   Val [SEQ. ID NO. 2].
5. 6. Egy hat-huszonöt aminosavból álló CTL-t indukáló peptid, azzal jellemezve, hogy az említett CTL-t indukáló peptidben az aminosavaknak legalább a többsége homológ az alábbi szekvencia

   Leu-Ser-Thr-Leu-Pro-Glu-Thr-Thr-Val-Val-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg.
6. 7. A 6. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája az alábbi:

   v (hbc₁₄₀_₁₅₄) [SEQ. ID NO. 7]

   Leu-Ser-Thr-Leu-Pro-Glu-Thr-Thr-Val-Val-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg.
7. 8. A 6. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája az alábbi:

   (HBC₁₄₁_₁₅₁) [SEQ. ID NO. ]

   Ser-Thr-Leu-Pro-Glu-Thr-Thr-Val-Val-Arg-Arg-Arg-Gly-Arg.
8. 9. A 6. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy a CTL válasz legalább a HLA-A31-re korlátozódik.
9. 10. A 8. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy a CTL válasz legalább a HLA-A31-re vagy a HLA-Aw68-ra korlátozódik.
10. 11. Egy peptid, amely MHC I-es osztályra korlátozott CTL választ indukál hepatitisz B vírussal szemben, azzal jellemezve, hogy szekvenciája az alábbi:

    VI (HBc₂₈_₄₇) [SEQ. ID NO. 8]

    Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Thr-Ala-Ser-Ala-Leu-Tyr-Arg-Glu-AlaLeu-Glu-Ser-Pro-Glu-His.
11. 12. Egy hat-huszonöt aminosavból álló CTL-t indukáló peptid, azzal jellemezve, hogy a CTL-t indukáló peptid aminosavainak legalább a többsége homológ a ^HBcm-i25 peptid megfelelő részével, amelynek aminosav szekvenciája az alábbi:

    IV (HBc₁₁₁_₁₂₅) [SEQ. ID NO. 6]

    Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp.
12. 13. A 12. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy hogy aminosav szekvenciája az alábbi:

    IV (HBc₁₁₁_₁₂₅) [SEQ. ID NO. 6]

    Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp.
13. 14. Egy hat-huszonöt aminosavból álló CTL-t indukáló peptid, azzal jellemezve, hogy a CTL-t indukáló peptid aminosavainak legalább a többsége homológ a ΗΒρο1₆₁_₆₉ peptid megfelelő részével, amelynek, aminosav szekvenciája az alábbi:

    VII (HBpol₆₁_₆g) [SEQ. ID NO. 9]

    Gly-Leu-Tyr-Ser-Ser-Thr-Val-Pro-Val.
14. 15. A 14. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy aminosav szekvenciája az alábbi:

    VII (HBpol₆₁_₆₉) [SEQ. ID NO. 9]

    Gly-Leu-Tyr-Ser-Ser-Thr-Val-Pro-Val.
15. 16. Egy hat-huszonöt aminosavból álló CTL-t indukáló peptid, azzal jellemezve, hogy a CTL-t indukáló peptid aminosavainak legalább a többsége homológ a HBpolgQ3_g₁₁ peptid megfelelő részével, amelynek aminosav szekvenciája az alábbi:

    VIII (HBpolg o g _ g ]_ ]_) [SEQ. ID NO. 10]

    Ser-Leu-Tyr-Alá-Asp-Ser-Pro-Ser-Val.
16. 17. A 16. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy aminosav szekvenciája az alábbi:

    VIII (HBpolg q 3 _ ₈ ]_ ₁) [SEQ. ID NO. 10]

    Ser-Leu-Tyr-Alá-Asp-Ser-Pro-Ser-Val.
17. 18. Egy hat-huszonöt aminosavból álló CTL-t indukáló peptid, azzal jellemezve, hogy a CTL-t indukáló peptid aminosavainak legalább a többsége homológ a HBx₁₂5_i34 peptid megfelelő részével, amelynek aminosav szekvenciája az alábbi:

    IX (HBx₁₂₆_₁₃4) [SEQ. ID NO. 9]

    Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Phe-Val-Leu.
18. 19. A 18. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy ♦ · ·· ·· ·

    - 75 aminosav szekvenciája az alábbi:

    IX (HBx₁₂6-134) [SEQ. ID NO. 9]

    Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Phe-Val-Leu.
19. 20. Egy CTL-t indukáló peptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája az alábbi:

    X (HBenv₃₄₈_₃₅₇) [SEQ. ID NO. 10]

    Gly-Leu-Ser-Pro-Thr-Val-Trp-Leu-Ser-Val.
20. 21. Az 1., 3., 6., 8., 11., 12., 14., 16., 18. vagy 20.

    igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy egy második, eltérő immunogén peptidhez kapcsoljuk.
21. 22. A 21. igénypont szerinti heteropolimer, azzal jellemezve, hogy a második immunogén peptid a hepatitisz B vírusra specifikus immunválaszt vált ki.
22. 23. A 22. igénypont szerinti heteropolimer, azzal jellemezve, hogy a második immunogén peptid egy T-segítő sejt által közvetített választ vált ki.
23. 24. Az 1., 3., 6., 8., 11., 12., 14., 16., 18. vagy 20.

    igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy egy immunogén lipid hordozóhoz konjugáljuk.
24. 25. A 24. igénypont szerinti peptid-hordozó konjugátum. azzal jellemezve, hogy a lipid hordozó fokozza a humán Tlimfocita választ.
25. 26. A 25. igénypont szerinti peptid-hordozó konjugátum, azzal jellemezve, hogy a lipid egy lipoprotein molekula.
26. 27. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1.,

    3., 6., 8., 11., 12., 14., 16., 18. vagy 20. igénypont szerinti peptidet tartalmazza, valamint egy gyógyászatilag elfogadható hordozót.

    ·« «*»·
27. 28. A 27. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hordozó egy liposzóma.
28. 29. Eljárás hepatitisz B fertőzés kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 1., 3., 6., 8., 11., 12., 14., 16., 18. vagy 20. igénypont szerinti pepiidből hatásos mennyiséget adunk be egy HLA-A2 haplotípussal rendelkező fertőzött gazdaszervezetnek.
29. 30. A 29. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a fertőzött gazdaszervezetnek krónikus hepatitisz B fertőzése van, illetve hepatitisz B hordozó.
30. 31. ELjárás hepatitisz B jellemezve, hogy a 6. vagy 8. hatásos mennyiséget adunk be fertőzés kezelésére, azzal igénypont szerinti peptidből egy HLA-A31 vagy HLA-Aw68 haplotípusú fertőzött gazdaszervezetnek.
31. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezetnek krónikus hepatitisz B fertőzése van, illetve hepatitisz B hordozó.
32. 33. Eljárás hepatitisz B fertőzés kezelésére. azzal jellemezve, hogy a 11. vagy 12. igénypont szerinti peptidből hatásos mennyiséget adunk be egy fertőzött gazdaszervezetnek.
33. 34. Az 1., 3., 6., 8., 11., 12., 14., 16., 18. vagy 20. igénypont szerinti peptidet elegendő mennyiségben tartalmazó hepatitisz B vakcina készítmény, amely mennyiség elegendő ahhoz, hogy egy citotoxikus T limfocita választ váltson ki a hepatitisz B vírussal szemben egy nem-fertőzött gazdaszervezetben, és a készítmény egy fiziológiailag elfogadható hordozót is tartalmaz.
34. 35. A 34. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy egy adjuvánst is tartalmaz.
35. 36. A 35. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy ·· ·« ·· <··· ·* ·»*«·· ··· • ·· ♦ · · ·· • · · · * « · ♦ 4 ··»· *· ·« ·» · hogy egy olyan fehérjét tartalmaz, amely védő antitest választ vált ki a hepatitisz B vírussal szemben.
36. 37. Eljárás egy olyan egyed azonosítására, aki érzékeny krónikus hepatitisz B vírusfertőzés kifejlődésére, azzal jellemezve, hogy:

    egy számunkra fontos egyedből származó limfomononukleáris sejteket az 1., 3., 6.,'8., 11., 12., 14., 16., 18. vagy 20.

    igénypont szerinti hepatitisz B nukleokapszid antigénnel inkubálunk, ami HLA-I-es osztály által korlátozott citotoxikus T limfocita választ vált ki a hepatitisz B vírussal szemben; és ebből meghatározzuk az egyednek azt a képességét, hogy az antigénnel szemben citotoxikus T limfocita választ vált-e ki, és ezáltal érzékeny-e krónikus hepatitisz B vírusfertőzés kifejlődésére.
37. 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a limfomononukleáris sejteket a perifériális vérből nyerjük.
38. 39. A 38. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a számunkra fontos egyed akut hepatitisz B fertőzésben szenved.
39. 40. Az 1., 3., 6., 8., 11., 12., 14., 16., 18. vagy 20.

    igénypont szerinti peptid, amelyet egy olyan DNS konstrukció expresszál, amely tartalmaz egy transzkripciós promotert, egy, az említett peptidet kódoló DNS szekvenciát, valamint egy transzlációs terminátort, mindegyik elemet működés szempontjából az említett peptid expresszióját elősegítő módon kapcsolva össze.

    A meghatalmazott: