JPH06510050A - Ｂ型肝炎ウイルスに対する細胞障害性ｔリンパ球の応答を誘発するペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ウィルスに対する細胞障害性Ｔリンノ々球の応答を誘発するペプチド類 関連特許願 本願は１９９１年８月２６日付けて出願された米国特許願第０７／７４９．５４ ０号の一部継続出願である。なお米国特許願第０７／７４９．５４０号の開示事 項は本願に援用するものである。

政府の援助 本発明には米国国立衛生研究所から交付金が与えられて０るので、米国政府は本 発明に所定の権利をもって０る。

発明の背景 Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は肝実質細胞に感染して、急性および慢性の肝臓病 ならびに肝臓癌を起こす。ＨＢＶは一般（こ汚染された血液または体液によって 感染するので、この感染は静脈注射を行う麻薬常用者と同性愛者間、および健康 管理システムの発達力蔦遅れて、汚染血液製品に暴露される危険性が高１１国に 流行してし）る。感染した個体の約９０〜９５０６はその感染を消散すること力 （できる力（、残りの５〜１０９６は慢性の肝炎を起こしてキャリヤー態（ｃａ ｒｒｉｅｒ　５ｔａｔｅ）　ｌこなり、その後肝硬変および／または肝臓癌を起 こす可能性力（ある。全世界を通じてＨＢＶの慢性キャリヤーが約２億５千万人 し）ると最近推定されている。

ＨＢＶ感染による肝細胞の損傷に関与する病原性の機構：ま充分（こ理解されて いないか、このウィルスは細胞を直接（こ（よ変性しな（１と考えられている。

しかし、ＨＢＶは生体外ではヒト細胞に容易には感染しないので、このウィルス の研究は非常に困難である。したがって、いままでのところ、定着ＨＢＶ感染に 対する有効な治療法がない。

）ＩＢｓＡｇが防御免疫応答を誘発するＩ（ＢＹ抗原であり、その応答によって ほとんどの感染個体はその感染と防御抗体で消散させることができると広く考え られている。実際に、抗−ＨＢＶエンベロープ抗体はＨＢＶ粒子を中和すること ができるので、ＨＢｓＡｇに基づいて、ＨＢＶ感染が樹立されるに至るのを防止 するワクチンが開発されている。これらのワクチンには、慢性）ＩＢＶキャリヤ ーの血清から精製したＨＢｓＡｇ、または組換えＤＮＡ法で製造したＨＢｓＡｇ が用いられる。合成ＨＢｓＡｇペプチドベースのワクチンも提案されている（例 えば米国特許第４．５９９．２３０号および同第４．５９９．２３１号参照）。

しかしこれらの抗−ＨＢｓＡｇワクチン類は、免疫化された個体の約９０％しか 防御しない。したがって免疫化されているが防御されない個体は、感染を起こす 可能性がある、重大でかつ疑われることがない保菌者になる。

ＨＢＶヌクレオキャプシドのコア抗原（ＨＢｃＡｇ）の、防御免疫と発現する際 の役割は明らかではない。いくつかの例では、ヌクレオキャプシドコア抗原（Ｈ ＢｃＡｇまたはＷＨＣＡｇ）によるチャイニーズハムスターとウッドチャックの 免疫化は、ＨＢＶとＷＨＶの感染に対して完全にもしくは部分的になされている 。ＨＢｃＡｇ特異的ヘルパーＴ細胞も、ＨＢＶエンベロープ特異的Ｂ細胞による 抗エンベロープ抗体の産生を保持することが報告されている。また）ｌＢｃＡｇ は、慢性）ＩＢＶ感染中の肝臓内Ｔ細胞に対する感作抗原として報告されている 。

他の免疫形態のＨＢＶ抗原に対する寄与は、特に、細胞障害性Ｔリンパ球を必要 とする場合、評価が難しい。Ｃｈｉｓａｒｉら（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰａｔｈｏ ｇｅｎ、、　６巻、３１頁、１９８９年）は、肝細胞の損傷は、ＨＢＶがコード する抗原に対する、ＨＬＡ−クラス■で制限されたＣＤ８’″細胞障害性Ｔ細胞 の応答によって仲介されるということを示唆した。クラスＩ主要組織適合性（Ｍ ＨＣ）で制限された細胞障害性リンパ球の応答は、インフルエンザウィルスのよ うな各種の他ウィルスについて同定されている。例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄら（ Ｃｅｌｌ、　４４巻、９５９頁、１９８６年）は、細胞障害性Ｔリンパ球よって 認識されるインフルエンザウィルスの核タンパク質のエピトープは合成ペプチド によって作ることができると報告している。細胞障害性Ｔリンパ球のＨＢＶに対 する応答を定義する試みを行った際に、急性および慢性のＨＢＶに罹っている患 者由来の末梢血液のリンパ球は生体外で自家の肝実質細胞を殺すことかできるが 、その細胞分解活性の特異性、その１１シＡ制限要素および細胞表現型は樹立さ れなかったことか報告されている（Ｍｏｎｄｅｌｌｉら、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１． 、　１２９巻、２７７３頁、１９８２年、およびＭｏｎｄｅ　ｌ　ｌ　ｉら、Ｃ Ｉ　ｉｎ。

Ｅｘｐ、　１ｍｍｕｎｏ１．、６巻、３１１頁、１９８７年参照）。ごく最近に なって、Ｍｏｒｉｙａｍａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４８巻、　３６１〜３６４ 頁、１９８７年）は、）ＩＢＶ主要主要エン−ロープ抗原ＭＨＣクラスＩで制限 されたＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球およびエンベロープ特異的抗体によって認 識可能な形態で肝実質細胞の表面に発現されたと報告している。

異なる系統のＨＢＶか存在するが、これらは各々、“ａ”と呼ばれる少なくとも 一つの共通のエンベロープ決定因子を共有している。

これらの各系統は、他の二つのエンベロープ決定因子をもっており、その一方は “ｄ”もしくは“ｙ”てあり、他方は”Ｗ”または“ｒ“である。したかってウ ィルスの四種のサブタイプ：　ａｄｗ、　ａｙｗ、　ａｄｒおよびａｙｒか考え られる。ＨＢＶのクローン化、配列決定および発現は、英国特許第２．０３４． ３２３号、ヨーロッパ特許第１３８２８号および米国特許第４．９３５．２３５ 号に開示され、またＨＢＶヌクレオキャプシド領域の完全配列はＧａ１ｉｂｅｒ ｔら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８１巻、６４６頁、１９７９年に開示されている。こ れらの各文献は本願に援用するものとする。

現在認可されているＨＢＶワクチンは、免疫化された個体の約９０％しか防御し ないので、例えばワクチンの免疫原性を増大もしくは多様化することによって一 層有効な免疫性を誘発させることか望ましい。また、慢性的にＨＢＶに感染した 個体の免疫応答を刺激し適当なＨＢＶ抗原に応答させて感染を消失させるか、ま たは急性がら慢性にまで感染か進展するのを防止することが望ましい。さらに、 ＨＢＶキャリヤーは、感染過程の早期に適切な治療および／または予防措置を実 施てきるのて、ＨＢＶに急性感染したどの患者が慢性感染症になり易いかを子軸 する手段も望ましい。全く驚くべきことであるが、本発明はこれらおよび他の関 連する必要性を満たすのである。

発明の要約 本発明は、ＨＢＶ抗原に対するＭＨＣクラスＩ制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答 を誘発するペプチドを提供するものである。対象のペプチドはＩＩＢＶヌクレオ キャプシドから誘導する。いくつかの実施態様で、そのペプチドは６個〜約５０ 個のアミノ酸を含有し、配列■（ＨＢＣｔｓ−２７）　（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ 、　４　）　１ｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−３ｅ ｔ−Ｖａｔ内由来の少なくとも４個の連続アミノ酸をもっており、そのペプチド は、所望の場合、そのＮ末端とＣ末端の一方もしくは両方において、任意に隣接 を行うかおよび／または修飾を行ってもよい。好ましい実施態様において、該ペ プチドの配列は、Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ− Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−３ｅｔ− Ｖａ　ｌ　（ＨＢｃ　＋　＋　−１７）（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　２　）およ びＬｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ４ａｌ（ ＨＢＣｔｓ−ｚｔ）　（Ｓｅｑ、　ＩＩ）　Ｎｏ、　４　）であり、どちらの領 域もＨＢＶの主要サブタイプ中に保存されているが、置換、欠失および付加か、 そのペプチドに対して、その生物活性に大きく不利に影響することなく行うこと ができる。

他の実施態様において、該ペプチドは、６〜約５０個のアミノ酸を有し、配列Ｖ （ＨＢＣ＋４ｏ−＋ｓ４）　（Ｓｅｑ、　［Ｄ　Ｎｏ、　７　）　Ｌｅｕ−３ｅ ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒ ｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ由来の少なくとも４個の連続残基を存し、 そのペプチドは、所望の場合、Ｎ末端およびＣ末端の一方または両方において任 意に隣接を行うかおよび／または修飾を行ってもよい。他の実施態様において、 該ペプチドは、ＨＢＣＩＩＩ−ＩＳの配列の少なくとも７個の連続アミノ酸由来 のペプチドであり、ＨＢＶサブタイプのａｗｙのＨＢＣＩＩＩ−＋２ｓは配列Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖ ａｌ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ　Ｃ３ｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ。

６〕を有し、両末端は上記したのと同様に修飾してもよい。ＨＢＶａｄｗについ てはそのｆｌｅ＋＋ｓはＬｅｕて置換されている。さらに別の実施態様では、Ｍ ＨＣクラスＩ制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発するペプチドは、配列：　 Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ａｌａ− Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｐｒｏ− Ｇｌｕ−Ｈｉｓを有するペプチド■（ＨＢＣｔｓ−＜ｖ）　Ｃ３ｅｑ、　ＩＤ　 Ｎｏ、　８　）であり、その選択されたペプチドの両末端も所望の場合修飾する ことができる。

種々のペプチドの実施態様において、該ペプチドは、それ自体に各ペプチドを重 合させてより大きなホモポリマーを形成させてもよく、または異なるペプチドを 用いてヘテロポリマーを形成させてもよい。場合によっては、ペプチドは一つの 組成で混合物として混合して連結させない。また該ペプチドには、例えば、Ｔリ ンパ球の応答を増大できる脂質含有分子に複合させるか、またはＴヘルパー細胞 応答を誘発する異なるペプチドに複合させることかできる。

本発明は、本発明のペプチドを含有し、追加のペプチド、リポソーム、アジュバ ントおよび／または医薬として許容される担体を配合した組成物を提供するもの である。したかって、この医薬組成物は、急性ＨＢＶ感染症を治療する方法、特 に該感染症が慢性またはキャリヤー態の感染症まで進行するのを防止する方法に 用いることができる。また本発明は、慢性ＨＢＶ感染症およびＨＢＶキャリヤー 態の治療法も提供するものであり、この治療法では、本発明の医薬組成物を、Ｈ Ｂｃエピトープに対する、免疫性を得るのに有効な細胞障害性Ｔ細胞の応答を刺 激部するのに充分な量で、感染個体に投与する。

これらの感染症を治療するために、ＩＩＢＶ抗原に対する、ＭＨＣクラスＩ　１ ｔｉｌＪ限細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発するペプチドを、他の）ＩＢＶ抗 原例えばＨＢｓＡｇに対する免疫応答を誘発する他のペプチドまたはタンパク質 を組合わせることが特に好ましい。慢性感染症またはキャリヤー態感染症の個体 を治療するために、本発明の組成物を、必要に応じて長期間にわたって繰返し投 与して、ウィルスの感染および／または脱粒（５ｈｅｄｄ　ｉ　ｎｇ）を消散さ せるか大きく低減させる。

また本発明は、ＨＢＶの感染、特に慢性ＨＢＶ感染を防止するワクチン組成物を 提供するものである。このワクチン組成物は、特にＨＬＡ−Ａ２ハブロタイブの 個体の場合、配列：　Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅ 　ｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ− ３ｅｒ−Ｖａ　ｌからなるＨＢＣＡｇｚ−ｔｔのような、ＭＨＣクラスＩ制限細 胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発するＨＢ■ヌクレオキャプシドのペプチドの免 疫性を得るのに有効な量を含存し、一般に、アジュバント例えば不完全フロイン ドアジュバントまたは水酸化アルミニウムをさらに含有している。

１（ＢＶに対する防御を促進するため、本発明のワクチンは、）ＩＢＶエンベロ ープ抗原に対する、防御抗体応答を誘発する成分をさらに含有させてもよい。

さらに別の実施態様において、本発明は、本発明のペプチドを使って、ＨＢＶヌ クレオキャプシド抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞の応答を行えるリンパ球か個体 中に存在しているのを決定する診断法に関する。上記の細胞か存在しないと、対 象の個体か慢性ＨＢＶ感染を受け易いかどうかを決定する。一般に、上記リンパ 球は末梢血液のリンパ球であり、対象の１個体は急性）ＩＢＶ感染症にかかって いる。

図面の簡単な説明 図１は、末梢血液の単核細胞を刺激して、ＨＢＶ特異特異的細胞障害性シリン８ 球定するのにプールで用いるペプチドを示す。

図２は、患者Ｍ、Ｂ、（図２ａ）、同Ｖ、Ｊ、（図２ｂ）および同Ｊ、　Ｐ。

（図２ｃ）のペプチドプールで観察された細胞障害性Ｔ細胞活性、ならびにＨＬ Ａ−Ａ２制限応答を示す。図中に各患者の細胞と標的細胞とが共有するＨＬＡ対 立遺伝子を示す。

図３はペプチド特異的ＣＴして内因的に合成されたＨＢＡヌクレオキャプシド抗 原の、患者Ｍ、Ｂ、（パネルＡ）および患者Ｊ、Ｐ、　（パネルＢ）由来のエフ ェクター細胞による認識を示す。図中、Ｖｗ＝ワクシニア野生型、Ｖｃｏｒｅ　 ＝　ＨＢｃＡｇ読取り枠を保持するワクシニア、ＥＢＯ−ｅｎＶ＝　ＨＢＶエン ベロープを発現するＥＢＶベースのエビソームベクター、およびＥＢＱ−ｃｏｒ ｅ　＝　ｔ（ＢＶヌクレオキャプシド抗原を発現するＥＢＶベースのエピソーム ベクターを示す。

図４は、内因的に合成されたＨＢＶヌクレオキャプシド抗原を認識するＨＬＡ− Ａ２制限ＣＴＬの選択膨張を示し、図中パネルＡは、ＨＢＣ＋＋−ｔｖペプチド でプレパルス（ｐｒｅｐｕｌｓｅ）するかまたは培地だけで培養されたＨＬＡ− Ａ２適合ＢＣＬ（ｔ（ＬＡ−Ａ２　ｍａｔｃｈｅｄ　ＢＣＬ）ならびにヌクレオ キャプソドまたはエンベロープ抗原を発現するＥＢＯ−形質導入体に対する、Ｃ ＴＬ系Ｖ、　Ｊ、による細胞溶解活性を示すが、試験はＥＢＯ−ｃｏｒｅ形質導 入体による刺激の前（２週間）および刺激の後（４週間）に行った。

パネルＢは、ＥＢＯ−ｃｏｒｅ形質導入体による、１．　２または３ラウンドの 連続刺激後の３．４および５週中のＣＴＬ系Ｖ、　Ｊ、による認識を示す：およ びパネルＣは、組換えワクシニアウィルスに感染させた）ＩＬＡ−Ａ２適合およ びＨＬＡ−Ａ２不適合のＢＣＬ標的に対する、５週間培養後のＣＴＬ活性を示す 。

図５は、組換えワクシニアを感染させたＨＬＡ−Ａ２ＢＣＬによって発現され、 ＨＢＶのコアとプレコアの領域でコードされたポリペプチドが共有するエピトー プのＨＢＣ＋＋−ｔｔ特異的ＣＴＬ認識を示す。なおエフェクター細胞の起源と してＣＴＬ系Ｊ、　Ｖ、を用いた。

図６は、合成ペプチドの混合物でのＰＢＭＣ刺激にょるＨＢＶ特異的ＣＴＬの活 性化を示す。同じ刺激混合物または培地のみでプレパルスされた自家標的に対す る、−週間刺激されたＰＢＭＣの細胞溶解活性を示す。

使用したＥ／Ｔ比は、患者Ｅ、　Ｗ、については７０：１であり、患者Ｈ，Ｐ。

については＋００＋１であった。

図７は、ＨＢｃＡｇ　Ｉ　４゜−１６６が混合物２で認識されるペプチドである ことを確゛証している。最初の一週間、混合物２に含有されているペプチドで刺 激され次いて同じペプチドで再刺激されたＰＢＭＣの、該混合物の個々のペプチ ドでプレパルスされた自家標的細胞に対する細胞溶解活性を示す。利用されたＥ ／を比は患者Ｅ、　Ｗ、につぃては５０：１であり、患者Ｈ，Ｐ、については４ ０：ｌであった。

図８は、Ａｗ６８がＨｌ系の）ｌＢｃＡｇ＋ｉｏ−＋ｓｓ特異的ＣＴＬ応答の制 限要素であることを示す。同種異系標的細胞は、ペプチドＨＢｃＡｇ　Ｉ　４゜ −１１または培地でプレパルスし、次いでエフェクター細胞でクラス■のレベル で適合させ、次いでクラス■のレベルで完全に不適合にした。

利用したＥ／Ｔは４：１であった。

図９は、Ａｗ６８とＡ３１がそれぞれ、クローン２Ｄ７と３０１１のＨＢｃＡｇ 　Ｉ　ｍ。−１６８特異的ＣＴＬ応答の制限要素であることを示す。自家および 同種異系の標的細胞は、ペプチド１４０−１５５でプレパルスした。

同種異系標的細胞はクラス■とクラス■のレベルでエフェクター細胞と適合させ た。利用したＥ／Ｔ比は１０：ｌであった。

図１Ｏは、ＨＢｃＡｇ　Ｉ　４゜−１６，特異的ＣＴＬ系のＥ４とＨｌが内因的 に合成される抗原を発現する標的細胞を溶解できることを示す。Ｅ４系に利用し たＥ／Ｔ比は１０：ｌであり、Ｈｌ系に利用したＥ／Ｔ比は、ペプチドでプレパ ルスされた標的細胞については２０．１で、組換えワクシニアウィルスを感染さ せた標的細胞については１５：１であった。

図１１は、ＣＴＬクローン２Ｄ７と３Ｄ１１が、内因的に合成された抗原を発現 する標的細胞を、ＨＬＡ制限方式で溶解できることを示す。クローン２Ｄ７と３ ＤＩ＋はそれぞれ、ペプチド１４０１５５とともに正のプレインキュベートを行 い、次いてＨＢＶのコアおよびプレコアのタンパク質をコードする組換えワクシ ニアウィルスを感染させた同種異系の標的細胞ＡＷ６８とＡ３１に対して試験し た。

図１２は、ペプチド＋４１−１５１が、両方の制限要素に対して、ＨＢｃＡｇ、 、。−１３，中の最適に認識される最も短かい配列であることを示す実験結果を 示す。クローン３Ｄ１１は同種異系のＡ３１−陽性標的細胞に対して試験し、ク ローン２Ｄ７は同種異系のＡＷ６８−陽性標的細胞に対して試験した。これら標 的細胞は０．００１−１μＭの範囲の濃度のペプチドでプレパルスを行った。利 用したＥ／Ｔ比はｌＯ：１であった。

図１３は、）ＩＬＡ−Ａ２にのみ適合する、ペプチドでパルスされた標的細胞を 用いた、患者の、ＨＬＡ−Ａ２モチーフを含有する二つのポリメラーゼペプチド に対するＣＴＬ応答を示す。

図１４は、いくつかのポリメラーゼ８０３−８１１ペプチド特異的クローンの、 内因的に合成されたポリメラーゼを認識する性能を示す。

図１５は、ポリメラーゼペプチド８０３−８１１に対するＣＴＬ応答は、ペプチ ドでパルスされた細胞と内因的に合成されたポリメラーゼ（Ｖｐｏｌ）を認識で きるが、ポリメラーゼペプチド６１−６９に対するＣＴＬ応答は６１−６９ペプ チドでパルスされた細胞しか認識しなかったことを示す。

図１６は、ＣＴＬ応答がＨＢＸ　＋□−１，４ペプチド類似体によって誘発され るが野生型では誘発されないことを示す。

図１７は、相同ペプチドでパルスされた標的細胞（８８４，０１−ａｙｗと命名 ）とそのａｙ冑サブタイプの内因性エンベロープ抗原に対する、ＨＢｅｎＶペプ チド３４８−３５７によって刺激されたＣＴＬ応答を示すが、ａｄｗサブタイプ の抗原を発現する細胞に対する応答が欠除していることを示す。

具体的実施態様の説明 本発明は、ＨＢＶ感染症の治療、予防および診断に用いる組成物と方法に使用す るＨＢＶタンパク質由来のペプチドを提供するものである。これらのペプチドは 、ＨＢＶが感染した細胞に対するＭｌ（ＣＨＬＡクラスＩ制限細胞障害性Ｔリン パ球の応答を刺激する。刺激された細胞障害性Ｔリンパ球は、感染細胞を殺すか またはウィルスの複製を阻害し、その結果、慢性ＨＢＶ感染を含む感染を遮断す るかまたは感染をはソ防止する。細胞障害性Ｔ細胞の応答を誘発するのに有効な ペプチドは、Ｔ−ヘルパ一応答を誘発できる免疫原と組合わせてもよい。

本発明の一つの態様では、本発明に用いられるペプチドを、二つの独立したＨＢ Ｖヌクレオキャプシド（ＨＢｃ）ポリペプチドすなわちコアとプレコア内から誘 導する。プレコアは、これを小胞体中に転位させてＨＢｅＡとして分泌させるア ミノ末端シグナル配列をもっているか、コアは、主として細胞質の核タンパク質 （ＨＢｃＡｇ）であり分泌されない。これらのペプチドは、ＨＢＣ残基１９−２ ７の領域から誘導し、ＨＢＣ２１−４７１ＦＩＢＣ＋＋＋−＋ｔｓ＋　ＨＢＣＩ ４０−１６４　（特にＨＢＣＩ４１−ＩＳυがあり、その番号付けはＧａ１ｉｂ ｅｒｔらの上記文献にしたがって行う。他の実施態様ては、これらのペプチドは 、ＨＢＶポリメラーゼタンパク質（ＨＢｐｏｌ）の配列、特にＨＢｐＯ［ｓ＋− ｓ。とｔ（Ｂｐｏｌｍ。、−０１の中のＣＴＬエピトープ由来のものである。さ らに他の実施態様では、これらペプチドは、ＨＢＶの転写トランス作用因子タン パク質の）ＩＢｘ由来の、さらに詳しくはＨＢＸ＋ｚａ−＋ｚｓの領域由来のＣ ＴＬ誘発エピトープを含有している。またこのＣＴＬ誘発ペプチドは、１１Ｂエ ンベロープ抗原から、特にＨＢｅｎｖ、、□３，７のＨＢＶ配列に相当するペプ チドからも製造することかできる。

本発明の、ＨＢＶ細胞障害性Ｔリンパ球を誘発する“ペプチド”または”オリゴ ペプチド”は、少なくとも４個のＨＢＶアミノ酸配列配列基からなる連鎖を意味 し、好ましくは少なくとも６個、より好ましくは８個もしくは９個、ときには１ ０〜１２個の残基からなり、かつ通常約５０個より少ない残基からなり、より普 通に約３５個より少なく好ましくは２５個より少ない残基からなり、例えばＨＢ ｃ配列由来の８〜１７個のアミノ酸残基からなる連鎖を意味する。本発明のペプ チドは、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子に結合する、内因的にプロセスされたウ ィルスペプチドと大きさか等しい８〜１２個のアミノ酸残基の長さに最適化する ことか望ましい（一般に、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ。

３５０巻、　７０３〜７０Ｇ頁、１９９１年；　Ｖａｎ　Ｂｌｅｅｋら、　Ｎａ ｔｕｒｅ、　３４８巻、２１３〜２＋６頁、１９９０年；　Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４８巻、２５２〜２５４頁、１９９０年；およびＦａｌ ｋら、Ｎａｔｕｒｅ、　３５１巻、２９０〜２９６頁、１９９１年を参照のこと 。なおこれらの文献は本願に援用するものとする）。

以下に詳細に述へるように、通常、本発明のペプチドは、本願て同定されたＨＢ Ｖ配列の連続残基の対応する部分に相同でかつＣＴＬ誘発エピトープを含有する アミノ酸の少なくとも大部分をもっている。

本発明のペプチドは、以下に述へるように“合成によって”、または組換えＤＮ Ａ法によって製造することができる。本発明のペプチドは、他の天然産生のＨＢ Ｖタンパク質およびそのフラグメントを実質的に含有していないことか好ましい が、いくつかの実施態様では天然のフラグメントもしくは粒子に合成で接合する ことがある。ペプチドという用語は、本願明細書ではポリペプチドという用語と 交換可能に用いられ、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とα−カルボキシ基間の ペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸を意味する。これらのポ リペプチド類またはペプチド類は、種々の長さのものでもよく、その中性の（無 荷電の）形態または塩の形態てもよく、およびグリコジル化、側鎖の酸化もしく はリン酸化のような修飾がないか、またはその修飾が本願に記載されているポリ ペプチドの生物活性を破壊しないという条件のもとにこれらの修飾がなされてい てもよい。

本発明のペプチドは、できるだけ小さく、しかもその大きなペプチドの生物活性 のほぼすべてを保持していることが望ましい。生物活性という用語は、適切なＭ ＨＣ分子を捕捉し、１（ＢＶ抗原もしくは擬似抗原に対する細胞障害性１９２３ 球の応答を誘発する性能を意味する。細胞障害性１９２３球の応答という用語は 、対象のＨＢＶ抗原に対して特異的なＣＤ８’Ｔリンパ球の応答を意味し、ＣＤ ８’″のＭＨＣクラスＩ制限制限シリン３球性化される。活性化されたＴリンパ 球は、リンホカイン類（例えばγインターフェロン）を分泌し、感染された自家 細胞もしくはトランスフェクトされた細胞内でウィルスか複製するのを、細胞を 殺すかもしくは殺さずに阻害する産物（例えばセリンエステラーゼ類）を放出す る。

“相同の”、”実質的に相同の”および“かなりの相同性”という本願て用いら れる用語は、一つの配列を基準のアミノ酸配列と比較して少なくとも５０％か同 一であるアミノ酸配列を意味する。配列の同一性もしくは相同性の百分率は、基 準配列の対応する部分に並べて互いに比へることによって計算する。

ヌクレオキャプシド領域由来の、本発明のＣＴＬ誘発性ＨＢＶヘブチドの実施態 様は、６〜３５個のアミノ酸からなり、およびペプチド領域ＨＢＣｚ−ｚｔ由来 の少なくとも一つのＩｌｌ、Ａ制御Ｉ！　ＣＴＬＩビトーブ部位を含有している 。このペプチドのアミノ酸の大部分は、天然産のＨＢＣｌｌ−２７領域の対応す る部分のアミノ酸と同一もしくは実質的に相同であり、ＨＢＣｌｌ−２７は、配 列：　Ｉ　（ＨＢＣｌｌ−２７）　Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ　 −Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈ ｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｖａ　１を有している。このＨＢＣｌｌ−２７領域のペプ チドの実施態様は、本願でさらに説明するように、）ＩＢｃを含む）ＩＢＶ配列 由来のアミノ酸、連結を容易にするために付加するアミノ酸、担体に連結される 他のＮ末端およびＣ末端の修飾などによって、所望の場合に、Ｎ末端およびＣ末 端の一方もしくは両方において任意に連結および／もしくは修飾が行われる。こ のペプチドＨＢＣＩ＋−２□は、少なくともＭＨＣクラス■分子のＨＬＡ−Ａ２ によって仲介される細胞障害性１９２３球の応答を誘発する。

上記ペプチドｒ領域内には、９量体ペプチドＨＢＣＩＩ−４７からなりかつ）Ｉ ＬＡ制御Ｊ　ＣＴＬを誘発するエピトープを含有するペプチド、およびｔ（ＢＣ ＋ｓ−ｚ□の配列の少なくとも４個の連続アミノ酸からなるＣＴＬ誘発性エピト ープ部位を含有する、ＨＢＣ＋５−ａｔ由来のペプチドが存在している。なおｔ ｌＢｃ＋ｅ−２ｔは次の配列：　ＩＩ　（ｌｌＢｃ＋＊−ｚｔ）　（Ｓｅｑ、　 ＩＤ　Ｎｏ、　４　）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒ ｏ−Ｓｅｔ−Ｖａｌ　（このペプチドは上記ペプチド■について述へたのと同様 に一方もしくは両方の末端において連結および／または修飾かなされてもよい） をもっている。ペプチドＩの場合と同様に、ペプチド■は、少なくともＨＬＡ− Ａ２で仲介される細胞障害性１９２３球の応答を誘発する。

ペプチドＩ／ＩＩ領域中の特に好ましいペプチドの実施態様はＩＯ量体のＨＢＣ ｌｌ−２７てあり、次の配列：　ＩＩＩ　（ＨＢＣ＋５−ｚｖ）　（Ｓｅｑ、　 ＩＤ　Ｎｏ、　５　）Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈ ｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｔ−Ｖａｌ　（このペプチドは前述したのと同様に修飾および ／または連結を行ってもよい）ををしている。

本発明の他のＨＢｃペプチドの実施態様は、１５量体ペプチドのｔ（ＢＣ＋ｚ− ＋２ｓ、および少なくとも７個の連続アミノ酸からなるＣＴＬ誘発性ＨＬＡクラ ス■制限エピトープ部位を含有する、ＨＢＣｚ＋−＋ｔｓ由来のペプチドを含有 している。このペプチドのアミノ酸の大部分は、天然産生のＨＢＣ＋ｚ−＋□５ 配列の対応する部分のアミノ酸と同一または実質的に相同であり、ｔ（ＢＣ＋ｚ −＋ｔｓは配列（）ＩＢＶサブタイプａｙｗについての配列）　：　ＩＶ　（Ｈ ＢＣ＋＋＋−＋ｚｓ）　（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、　６）　Ｇｌｙ−Ａｒｇ−に１ ｕ−Ｔｈｒ−Ｖａ　Ｉ　−Ｉ　Ｉｅ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ−３ ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｖａ　１−Ｔｒｐを有する。

ＨＢＣ＋ｚ−＋ｔ５領域由来のペプチドは先に述べたのと同様に一方もしくは両 方の末端において連結および／または修飾を行ってもよい。

ＨＢＶサブタイプａｄｗのペプチドにおいて、ｌ１ｅｚ＊はＬｅｕで置換されて いる。

さらに他の実施態様において、本発明のペプチドは、１５量体のペプチドＨＢＣ ＋＋。−１，４、および少な（とも１０個の連続アミノ酸からなるＣＴＬ誘発性 １（ＬＡクラス■制限エピトープ部位を含有する、ＨＢｃ　＋　４゜−１，４由 来のペプチドを含有している。このペプチドのアミノ酸の大部分は、天然産生の ＨＢｃ　ｌ　４゜−１，４配列の対応する部分のアミノ酸と同一もしくは実質的 に相同であり、１（ＢＣ１４６−１４は、配列（＋（１３Ｖサブタイプａｙｗに 対する配列）　：　Ｖ　（ＨＢＣ＋４ｅ−＋ｇ４）Ｃ５ｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　 ７）　Ｌｅｕ−３ｃｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ −Ｖａ　Ｉ　−Ｖａ　Ｉ　−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｒｇを有 する。

この領域から作られるペプチドは、先に述へたのと同様に、一方の末端または両 方の末端において連結および／または修飾を行ってもよい。ペプチドＶ　（ｔ（ ＢＣｚ。−１６，）は、少なくとも一つのＭＨＣクラス■分子、Ｆ（ＬＡ−Ａ３ １て仲介されかっＨ［、Ａ−Ａｗ６８で制限することもできる細胞障害性Ｔ　’ Ｊンバ球の応答を誘発する。下記の実施例の項てより詳細に示すように、ＨＢＣ ＋４＋−＋ｓ＋の配列は、Ａ３１とＡｗ６８の両方の制限要素に対する最小で最 適に認識されるエピトープを含有している。

本発明のさらに他のＣＴＬ誘発性ペプチドは、ＨＢＣｚｓ−＊□の領域由来であ り、少なくとも７個の連続アミノ酸からなる１個以上のＣＴＬ誘発性１（ＬＡク ラスＩ制限エピトープ部位を含有する、ＨＢＣ２ｍ−４１由来のペプチドを含有 している。このペプチドのアミノ酸の大部分は、天然産生のＨＢＣｚｓ−＜ｉ配 列の対応する部分のアミノ酸と同一もしくは実質的に相同であり、ＨＢＣｔｔ− ｎ□は、配列（ＨＢＶサブタイプａｙｗに対する配列）　：　ＶＩ　（ＨＢＣｔ ｔ−５ｔ）　（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、　８）　Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −Ａｓｐ−Ｔｈ　ｒ−Ａ　１ａ−３ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ− Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇ　１普|Ｈｉ ｓ （その選択されたペプチドは、前に述べたのと同様に、一方の末端または両方の 末端において連結および／または修飾を行ってもよい）を有している。

本発明の他の実施態様において、本発明のペプチドはポリメラーゼタンパク質由 来のＣＴＬ誘発性エピトープを含有している。さらに詳しく述べると、このペプ チドは、）ＩＢ９０１ｇ＋−ａｓまたはＨＢｐｏｌ＊。＄−１１１の領域由来の ペプチドでありかつ少なくとも７個の連続アミノ酸からなる一つ以上のＣＴＬ誘 発性ＨＬＡクラス！制限エピトープ部分を含有する、上記配列領域由来のペプチ ドを含有している。このペプチドのアミノ酸の大部分は、天然産生のＨＢｐＯＩ ＊＋−ａｓもしくは１（Ｂｐｏｌｓ。ｆｆ−８Ｉ＋の配列の対応する部分のアミ ノ酸と同一もしくは実質的に相同てあり、ＨＢｐｏ１＠＋−ｓ。と１ＩＢｐｏｌ ｓ。３−１１１は下記配列（ＨＢＶサブタイプａｙｗに対する配列）：■（ｌＩ Ｂｐｏ１ｇ＋−ｓ＊）　（Ｓｅｑ、　＋Ｔ）　Ｎｏ、　９　）　Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ｔｙｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　、ならびに■（ ＨＢｐｏｌｓｏｓ−ｇ＋＋）Ｃ８ｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　１０）　５ｅｒ−Ｌｅ ｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｔ−Ｖａｌ　（その選択さ れたペプチドは、前に述べたのと同様に一方の末端もしくは両方の末端において 連結および／または修飾を行ってもよい）をもっている。

また抗ＨＢＶ　ＣＴＬ誘発性エピトープを含有する本発明のペプチドは、ＨＢＶ 転写活性タンパク質Ｘからも誘導される。ＣＴＬ誘発活性を有する各種のＨＢｘ ペプチドは先に述べたのと同様にして同定することができるが、好ましくはこれ らのペプチドはＨＢＸ＋ｔｓ−＋ｔｎの領域から誘導される。この配列領域由来 のペプチドは、少なくとも７個の連続アミノ酸からなる、一つ以上のＣＴＬ誘発 性ＨＬＡクラスＩ制限エピトープ部位を含有している。この領域から製造される ペプチドのアミノ酸の大部分は、天然産生のＨＢｘ　Ｉ　ｔ　＠　−１２＜の配 列の対応する部分のアミノ酸と同一かまたは実質的に相同であり、ＨＢＸ＋ｔｓ −＋ｓ４は下記の配列：　ＩＸ　（ＨＢＸ＋ｔｓ−ｍ）　（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ 、）　Ｇｌｕ−ｒｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＹａｋＰｈｅ−Ｖａｔ−Ｌｅ ｕ　（この領域から製造されるペプチドは、本願で述べているのと同様に一方の 末端または両方の末端において連結および／または修飾を行ってもよい）をもっ ている。

ＣＴＬ誘発性ペプチドはＨＢＶエンベロープタンパク質からも誘導される。より 詳しくのべると、そのペプチドはＨＢｅｎＶｓｓｓ−ｓｓｔであり、ＨＬＡクラ スＩに制限され、ＨＢｅｎＶ場ｍｓ−ｓｓｔは下記の配列（サブタイプａｙｗに 対する配列）　：Ｘ　（ＨＢｅｎＶｍ−ｔｓｔ）　（Ｓｅｑ、ＩＤＮｏ、）　Ｇ ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｖ ａｌ　（この領域から製造されるペプチドは先に述へたのと同様に一方の末端ま たは両方の末端で連結および／または修飾を行ってもよい）をもっている。

ＨＢｅｎＶｆｆ＊５−ｓｓｔのａｄｗサブタイプの配列はカルボキシ末端におい てバリンの代わりにアラニンをもっている。

上記のように、追加のアミノ酸は先に考察した理由からオリゴヌクレオチドまた はペプチドの両末端に付加して、ペプチドを互いに連結し易くし、担体、支持体 またはより大きなペプチドにカップリングし、または前記ペプチドもしくはオリ ゴペプチドの物理特性もしくは化学特性の修飾などを行うことができる。チロシ ン、システィン、リシン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸などのようなア ミノ酸は、上記ペプチドもしくはオリゴペプチドのＣ末端もしくはＮ末端に導入 することかできる。さらにこのペプチドもしくはオリゴペプチドの配列は、末端 Ｎ］（、のアシル化反応、例えばアセチル化もしくはチオグリコール酸アミＦ化 、末端カルボキシのアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンなどで修飾する ことによって、天然の配列と異なっていてもよい。場合によっては、これらの修 飾によって、支持体なとの分子に連結する部位が得られる。

細胞障害性Ｔリンパ球刺激活性を有する本発明のＨＢＶペプチドまたはその類似 体は、必要に応じて修飾して、未修飾のペプチドの生物活性を増大するかまたは 少なくとも実質的に保持しながら、ある種の池の所望の特性、例えば改良された 薬理特性を提供することができることは分かるであろう。例えば本発明のペプチ ドは、例えば本願に開示されている配列由来のペプチドのアミノ末端もしくはカ ルボキシ末端または両方の末端においてアミノ酸を付加するかもしくは除去する ことによって、本発明のペプチドの配列のアミノ酸を延長、減少もしくは置換し て修飾することができる。本発明のペプチドは、修飾してそのＣＴＬ誘発活性を 大きく増大することができ、その結果その修飾されたペプチド類似体は野生型配 列のペプチドよりＣＴＬ活性が大きい。例えばヘブチドのＮ末端の疎水性を増大 することが望ましく、特に、Ｎ末端の第２残基が疎水性てＨＬＡ制限分子への結 合に関与している。Ｎ末端の疎水性を増大することによって、■細胞に与える効 率を増大することがてきる。例えば、後記実験の項で述べるように、野生型のＨ ＢＸ目ト１ｆｆｌペプチドはほとんどＣＴＬ活性をもっていないか、アミノ末端 の比較的極性で正に帯電している残基Ｇｌｕを、非極性で疎水性の分子のＡｌａ で置換すると、ＣＴＬ誘発活性が著しく増大した。他の疾患に関連する抗原から 調製したペプチド、特に宿主が存意なＣＴＬ活性をもっていないＣＴＬ誘発性エ ピトープを含有するペプチドは、そのペプチド（その二番目の残基は通常疎水性 である）のＮ末端における疎水性残基を置換することによってＣＴＬ誘発性にす ることができる。

本発明に用いるペプチドは、本発明の化合物がＨＢＶの四つの主要サブタイプの 少なくとも一つに対する細胞障害性Ｔリンパ球活性を提供できるかぎり、ペプチ ド類■〜Ｘ、または特定のＨＢＶヌクレオキャプシド、エンベロープ、ポリメラ ーゼもしくはＸタンパク質の配列と同一である必要はない。それ故に、これらの ペプチドは、保存的または非保存的な、挿入、欠失および置換のような各種の変 化を受けることができ、このような変化によってその使用時にある種の利点か得 られる。保存的置換という用語は、アミノ酸残基を生物学的および／または化学 的に類似の別のアミノ酸残基で置換することを意味し、例えば別のアミノ酸残基 としては一つの疎水性残基または極性残基がある。その置換には次のような組合 せ：　Ｇｌｙ、　Ａｌａ　；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、　Ｌｅｕ；Ａｓｐ、　Ｇｌｕ；Ａ ｓｎ、　Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、　Ａｒｇ；およびＰｈｒ、　Ｔｙ ｒがある。通常、ＨＢＶの細胞障害性Ｔリンパ球刺激エピトープに実質的に似せ るのを目的とする配列の部分は、例えば連結もしくはカップリングなどを容易に 行うために、ペプチドの物理的特性もしくは化学的特性を修飾するのを目的とし て、追加のアミノ酸を両方の末端に付加する場合を除いて、ＨＢＶの少なくとも 一つのサブタイプの配列と比べてその差異は２０％以下である。ペプチド配列の 領域が、ＨＢＶサブタイプ中で多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ）であることが分 かっている場合、一つ以上の特定のアミノ酸を、異なるＨＢＶ株もしくはＨＢＶ サブタイプのより有効に類似した異なる細胞障害性Ｔリンパ球エピトープに変え ることが望ましい。

本発明によって同定されるペプチド配列には、代表的なペプチド１　（ｔ（Ｂｃ ＋　＋−２７）　、ペプチドＩｆ　（ＨＢＣ＋５−ｚｔ）　、ペプチドＩＩＩ　 （ＨＢｃ＋５−２ｉ）、ベブチＩ”ＩＶ　（ＨＢＣＩＩ＋−１２６）　、ペプチ ドＶ　（ＨＢＣ＋４ｏ−＋ｓ４）　、ペプチドＶＩ　（ＨＢＣ２１−４７）　、 ペプチド■（ＨＢｐＯ１ｇ＋−１，）、ペプチド■（ＨＢｐＯｌｇｏｚ−ｓ＋＋ ）およびペプチド■、（ＩＩＢＸ＋−−−−ｓｓ）が含まれ、それらの生物活性 すなわちＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶ抗原を発現する細胞に対するクラス ！制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答を刺激する性能をペプチドに保持させる残基 （または機能が実質的に均等である残基）である。これらの残基は、単一のアミ ノ酸の置換、欠失または挿入によって同定することができる。さらに、残基の側 鎖によってなされる寄与は、特定のアミノ酸（例えばＡｌａ）によって系統的な 走査を行うことによってプローブすることができる。多重置換を行えるペプチド は、小さくかつ比較的中性の分子例えばＡｌａ。

Ｇｌｙ、　Ｐｒｏまたは類似の残基のような置換基を一般に取入れる。置換、付 加または取出しを行える残基の数と種類は、必須のエピトープ部間に必要な間隔 と請求められているある種の配座特性と機能特性（例えば疎水性対親水性）に依 存している。所望により、細胞障害性Ｔリンパ球に与えるため、ペプチド類似体 の、そのＭＨＣ分子に対する結合親和性を増大することは、上記のＨＢＸ＋ｔ＊ −＋−ペプチドで例示するような変更によって達成できる。一般に、エピトープ としておよび／または配座として重要な残基間におけるスペサーの置換、付加ま たは欠失には、結合を破壊することかある立体的および電荷による干渉を避ける ため、選択されたアミノ酸もしくは部分を利用する。

所望の生物活性を保持しながら多重置換を行えるペプチドも、Ｄ−アミノ酸を含 有するペプチドとして合成することかてきる。このようなペプチドは、配列のし 一アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換するか、またはアミノ酸の配列の逆転およびＬ −アミノ酸のＤ−アミノ酸による置換を行うことによって、“インパーツ（ｉｎ ｖｅｒｓｏ）”または“レトロ−インパーツ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）　 ”形として合成することかできる。Ｄ−ペプチドはペプチダーゼに対してかなり 耐性であるからその相対物のＬ−ペプチドに比へて血清および組織中でより安定 であるので、Ｄ−ペプチド類の生理的条件下での安定性は、対応するし一ペプチ ドと比べたときの親和性の差をおぎなって余まりがある。さらにＬ−アミノ酸含 有ペプチドは置換かあるなしにかかわらず、Ｄ−アミノ酸でキャップ（Ｃａｐ） シて抗原ペプチドのエキソペプチダーゼによる破壊を阻害することができる。

本願に記載されている典型的なペプチドに加えて、本発明は、ＨＢＶ、またはＨ ＣＶ、　１（ＩＶなどのような他のウィルス類に対するＭＨＣ制限細胞障害性Ｔ リンパ球の応答の誘発に関連する他のエピトープ領域を同定する方法を提供する ものである。この方法は、被感染もしくは非感染の個体から末梢血液のリンパ球 （ＰＢＬ）を採取し、次いでその細胞を、対象の病原体もしくは抗原のタンパク 質由来の合成のペプチドもしくはポリペプチドフラグメントに暴露する（刺激す る）ことからなる方法である。上記のタンパク質もしくは抗原のアミノ酸配列が 公知の場合、合成のオーバーラツプペプチドのプール（このペプチドは一般に各 々約８〜２０残基の長さを有する）が、該細胞を刺激するのに用いることができ る。活性ペプチドは、細胞障害性Ｔリンパ球活性を誘発するプールから選択する ことができる。特異的な細胞障害活性を誘発するペプチドの性能は次のようにし て測定する。すなわち、病原体またはそのサブゲノミックフラグメント（ｓｕｂ ｇｅｎｏｍｉｃ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）に感染させたかまたはそれでトランスフェ クトした自家標識（例えば５ＩＣｒ）標的細胞〔例えばＨＬＡ適合マクロファー ジ（ＨＬＡ　ｍａｔｃｈｅｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）　、Ｔ細胞、繊維芽細胞 もしくはＢリンホブラストイド細胞（Ｂ　Ｉｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　ｃｅ ｌｌ）　）とともに、刺激されたＰＢＬをインキュベートし、その結果、標的化 抗原か該細胞によって内因的に合成され（または該細胞を対象のペプチドと）く ルスさせ）、次いて標的の特異的放出量を測定することによって行う。

細胞障害性Ｔリンパ球の応答を刺激するエピトープ領域を有するペプチドが同定 されれば、その応答のＭＨＣ制限要素を決定することができる。この決定は、刺 激されたＰＢＬもしくはその短期系（ｓｈｏｒｔｔｅｒｍ　１ｉｎｅ）を、対象 のペプチドもしくは適切な対照で予めノくルスしておいた公知のＨＬＡタイプの （標識を付けた）標的細胞のノくネルとともにインキュベートして行われる。Ｃ Ｔして溶解される。＜ネル中の細胞のＩＩＡＬ対立遺伝子を、溶解されない細胞 と比へ、次いて細胞障害性Ｔ　ＩＪリンパ球対象抗原に対する応答のＨＬＡ制限 要素を同定する。

Ｃａｒｂｏｎｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６７巻、１７６７頁、１９ ８８年には次のように報告されている。すなわち、ペプチドで刺激すると、対応 する内因性タンパク質に対する親和性が低い細胞障害性Ｔリンノく球か誘発され 、その結果、ペプチドによる刺激を反復すると、ペプチドを認識するか、未変性 の抗原を認識しない細胞障害性Ｔ　ＩＪンノ々球が生成すると報告されている。

刺激された細胞障害性Ｔリンノく球か未変性のＨＢＶタンパク質を認識できない ことは、ＨＢＶペプチド治療法およびワクチン組成物を開発するには望ましくな いので、この潜在的な制限を避ける方法を用いる。本発明は、天然にプロセスさ れた抗原に対して、合成ペプチドに対するよりも高い親和性を有するＴ細胞を同 定して選択するために、細胞障害性Ｔ細胞を連続して再刺激する（ｒｅｓｔｉｍ ｕｌａｔｅ）方法を利用する。細胞障害性Ｔリンノく球の短期系は、活性化され たＰＢＬを再刺激することによって引立される０６プチトて刺激された細胞は、 ペプチドおよび組換えもしくは未変性のＨＢＶ抗原例えばＨＢｃＡｇ、　ｌ（Ｂ ｓＡｇ、　Ｉ（ＢｐｏｌもしくはＨＢＸで再刺激する。

活性を有する細胞も適切なＴ細胞マイトジェン例えばフィトヘマグルチニン（Ｐ ＨＡ）で刺激する。再刺激された細胞には、照射された同種異形のＰＢＬを、Ｔ 細胞ヘルプ（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｈｅｌｐ）およびＨＢＶ抗原の抗原非特異的起源と して与える。未変性のＨＢＶ抗原を認識する細胞障害性Ｔリンパ球の集団を選択 的に膨張させかつ長期系を樹立するために、まず患者由来のＰＢＬを、ペプチド および組換えもしくは未変性の）ＩＢＶ抗原で刺激し、次いて対応するＨＢＶ抗 原のポリペプチドを安定に発現するＨＬＡ適合適合化シリンホブラストイド細胞 刺激する。

この細胞系は、内因的に合成された抗原を認識する性能について、自家および同 種異系のＢ−リンホブラストイド、または適切抗原でトランスフェクトされてい るかもしくは適切な抗原に感染している他の細胞を用いて、再確認する。

一つ以上の患者またはＨＬＡタイプにおいて抗ＨＢＶ細胞障害性Ｔリンパ球の応 答を誘発するのに関与する本発明の各種ペプチドを同定したので、場合によって は、一つの組成物に２種以上のペプチドを組合わせることが望ましい。本発明の 組成物のペプチドは同一もしくは異なっていてもよく、ともに親のベブチｌ”と 同等もしくは親ペプチドより高い生物活性をもっていなければならない。例えば 、本願に記載する方法を用い、２種以上のペプチド、例えばｔ（ＢＣ＋＋−ｔｖ およびＨＢＣＩ＊−ｔ□のペプチドを用い、特定の領域で、異種のまたはオーバ ーラツプしている細胞障害性Ｔリンパ球エピトープを作ることかできる。これら のペプチドは、“反応混液（ｃｏｃｋｔａｉｌ）　’中て結合可能てあり、細胞 障害性Ｔリンパ球の応答に対する免疫原性を強化する。−領域からなるペプチド は、特に第二のもしくは次のペプチドか第一のペプチドと異なるＭＨＣ制限要素 をもっている場合、同じか異なるＨＢＶタンパク質由来の他のＨＢＶ領域のペプ チドと組合わせてもよい。この組成物は、本発明の治療法、ワクチンもしくは診 断法および組成物の免疫学的適用範囲を、多様の個体群に有効に広げるために使 用できる。例えば主な民族グループ（コーカソイド、アジャ人およびアフリカ黒 人）間のＨＬＡ対立遺伝子の頻度の差を下記表１に示す。本発明の治療用組成物 もしくはワクチン組成物は、できるだけ高い比率の個体群に潜在的な治療もしく は免疫性を与えるように配合することができる。したがって、治療剤もしくはワ クチンにＨＢＣ＋＋＋−＋□ＣＴＬエピトープとＨＢＣＩ５−ｔｔ由来のペプチ ドを含有させると、ＨＢＶに慢性感染した、全世界の３億人の人々の５７％もの 多くの人に対して育苗である。

Ａ　２　４５．３　４６．６　２７．３　４３．２Ａ２９　７．４　８．１　１ ２．３　０．４Ａ３１　５．４　６．２　４．４　１５．３Ａ３２　８．８　７ ．１　３　０．１ Ａ３３　３．３　３．４　９　１３．ｌＡ２８’　７．７　９．９　１６．６　 １．１略字・　ＥＵＣ，ヨーロッパコーカソイド、ＮＡＣ，北アメリカコーカソ イド；　ＡＦＲ、アフリカ黒人、ＪＰＮ、日本人。

′Ａ２８は２種の対立遺伝子Ａｗ６８とＡｗ６９を示す。

本発明のペプチドは結合によって連結してポリマー（多量体）を形成させるか、 または結合させずに混合物として一つの組成物に配合することかできる。同じペ プチドをそれ自体に結合させるとポモポリマーが形成され、複数の反復エピトー プ単位が提供される。ペプチドが異なる場合、例えば異なるＨＢＶサブタイプを 示す反応混液、一つのサブタイプ内の異なるエピトープ、異なるＨＬＡ制限特異 性、Ｔヘルパーエピトープを含有するペプチドの場合は、反復単位を育するヘテ ロポリマーが得られる。共有結合に加えて、分子間および構造内の結合を形成で きる非共有結合も含まれる。

ホモポリマーまたはヘテロポリマーまたは担体へのカップリングの結合は種々の 方法で行うことができる。例えばシスティンの残基をアミノ末端とカルボキシ末 端の両方に付加し、そのシスティン残基を制御した酸化反応に付して、該ペプチ ドを両末端で共有結合させることができる。多数のへテロ２官能性試薬も有用で あり、これらの試薬は、一方の官能基でジスルフィド結合を生成し、他の官能基 でペプチド結合を形成し、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル− ジチオ）プロピオネ−）　（ＳＰＤＰ）が挙げられる。

この試薬は、それ自体と一つのタンパク質のシスティン残基との間にジスルフィ ド結合を生成し、およびリシンのアミノ基もしくはその外の他の遊離アミノ基に よってアミド結合を生成する。各種のこのようなジスルフィド／アミド形成試薬 が知られている（例えば、Ｉｍｍｕｎ、　Ｒｅｖ、、６２巻、１８５頁、１９８ ２年参照、なおこの文献は本願に援用するものである）。他の二官能性カップリ ング試薬はジスルフィド結合ではなくチオエーテル結合を形成する。これらのチ オエーテル形成試薬は多数市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブ ロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン− １−カルボン酸などの反応性エステルがある。そのカルボキシル基は、それにス クシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−二トロー４−スルオン酸ナトリウム塩 を結合させることによって活性化することができる。特に好ましいカップリング 剤は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ ルボキシレー）　（ＳＭＣＣ）である。結合は、結合された基のいずれかか例え ばＨＢＶ細胞障害性Ｔ細胞決定因子、ペプチド類似体またはＴヘルパー決定因子 として、記載されているように機能するのを実質的に阻害してはならないことは 分かるであろう。

他の態様で、本発明のペプチドは、１（ＢＶ　Ｔヘルパー細胞のエピトープすな わち細胞障害性Ｔ細胞をＨＢＶに対し誘発する際に協働するＴＩＢｌｔａを刺激 するエピトープを提供する他のペプチドと結合またはカップリングさせることが できる。そのＴヘルパー細胞は例えばＴヘルパー１またはＴヘルパー２の表現型 でもよい。ＨＢＶ配列由来のＴヘルパーエピトープは、配列：　Ｍｅｔ−Ａｓｐ −１１ｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｙ−Ａ 　ｌ　ａ−Ｔｈｒ−Ｖａ　Ｉ　−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅ　ｒ−Ｐｈｅ −Ｌｅｕ−Ｐｒｏを有するＨＢＣＩ−２゜て同定した。他のＴヘルパーエピトー プ類は下記の領域由来のペプチドによって得られる。すなわち配列：　Ｐｒｏ− Ｈｉｓ−ｔ（ｉｓ−Ｔｙｒ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａ　ｌ ａ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　−Ｔｒ　ｐ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　ｌｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅ 　ｔ−Ｔ凾秩|Ｌｅｕ− Ａｌａを有するＨＢＣａｏ−ｓ＊の領域、ならびに配列：　Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔ ｒｐ−Ｐｈｅ−Ｈｉ　ｓ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ− Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｖａ　ｌ−［１ｅ−Ｇ　Ｉ　普| Ｔｙｒ− Ｌｅｕ（そのｌｌｅ＋□はＨＢＶ　ａｄｗサブタイプてはＬｅｕである）を有す るＨＢＣＩｏｏ−＋＋＊の領域と、配列：　Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ− ３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ− Ｐｒｏ−Ａｌａを有するＩＩＢＣＩ＋７−１３１の領域と、配列：ＶａｉＳｅｒ −Ｐｈｅ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｖａ　１−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ− Ｐｒｏ−Ａ　Ｉａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ| Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−１１ｅを有するペプチドＨＢＣ＋ｔｏ−＋ｘｓとを含 むＨＢＣＩＯＩＩ−１１１の領域由来のペプチドによって得られる（Ｆｅｒｒａ ｒｉ　３．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

１ｎＶｅｓｔ、、８８巻、２１４−２２２頁、１９９１年および米国特許第４． ８８２．１４５号参照。なおこれらの文献は本願に援用するものとする）。

本発明のペプチド類は多種類の方法で製造することができる。本発明のペプチド 類は比較的短かいので、溶液中または固体支持体上で通常の方法にしたがって合 成することができる。種々の自動合成器か市販されており、公知のプロトコルに したがって使用できる（例えば、５ｔｅＷａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、　５ｏｌｉ ｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ第２版、　Ｐｉｅｒｃｅ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社、　１９８４年ＨＴａｍら、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃ ｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、１０５巻、６４４２頁、１９８３年；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　５ｃ ｉｅｎｃｅ、　２３２巻、３４１〜３４７頁、１９８６年；およびＢａｒａｎｙ およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｇｒｏｓｓおよび Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社、米国、ニューヨ ーク、１〜２８４頁、１９７９年参照。これらの文献は本願に援用するものであ る）。

あるいは組換えＤＮＡ法を採用してもよい。すなわち、対象のペプチドをコード するヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、そのベクターを用いて適切な宿 主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクトし、次いて発現させるのに適切 な条件下で培養する。これらの方法は以下の文献に記載されているように当該技 術分野で一般に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ ｒ、米国一ユーヨーク州、１９８２年；　Ａｕ５ｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎ ｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、社、米国ニューヨーク、１９８ ７年；ならびに米国特許第４．２３７．２２４号、同第４．２７３．８７５号、 同第４．４３１．７３９号、同第４．３６３．８７７号および同第４、４２８． ９４１号参照。これら文献の開示事項は本願に援用するものとする）。したがっ て、本発明の一つ以上のペプチド配列からなる融合タンパク質はＨＢＶ細胞障害 性Ｔ細胞決定因子を提供するのに使用できる。例えば、本願に記載されているペ プチド領域のエピトープをより有効に提供して細胞障害性１９２８球の応答を刺 激するためにＨＢｃのアミノ酸配列を変更した組換えコアタンパク質を製造する 。

このようにして、いくつものＴ細胞エピトープを含有するポリペプチドが使用さ れる。

本願で目的としている長さのペプチドのコーディング配列は、化学的方法の例え ば１Ｊａｔｔｅｕｃｃｉら、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１０３ 巻、３１８５頁、１９８１年のホスホトリエステル法で合成することかできるの で、未変性のペプチド配列をコードする塩基を適切な塩基で置換することによっ て簡単に修飾することができる。次いでそのコーディング配列に適切なリンカ− を与えて、当該技術分野で市販されている発現ベクターに連結し、次いでそのベ クターを使用して適切な宿主を形質転換して所望の融合タンパク質を生成させる 。かようなベクターと適切な宿主系は多数市販されている。融合タンパク質を発 現させるために、そのコーディング配列は、作動可能に連結された出発コドンと 停止コドン、プロモーターとターミネータ−の領域および普通は複製系を備え、 所望の細胞宿主中で発現するための発現ベクターを提供する。例えば細菌宿主と 相容性のプロモーター配列を、所望のコーディング配列を挿入するのに便利な制 限部位を含有するプラスミド中に入れる。得られた発現ベクターで適切な細菌宿 主を形質転換する。酵母または哺乳動物の細胞の宿主も、適切なベクターと制御 配列を用いて利用することができる。

本発明のペプチドおよびその医薬組成物とワクチン組成物は、哺乳動物特にヒト に投与してＨＢＶ感染症を治療および／または予防するのに有用である。本発明 のペプチドが、１（ＢＶに感染した細胞に対する細胞障害性Ｔ−リンパ球の応答 を刺激するのに使用されるので、その組成物は急性および／または慢性のＨＢＶ 感染症を治療もしくは予防するのに利用てきる。

すて、にＨＢＶに感染した個体には、医薬組成物の代わりに、上記の本発明のペ プチドを投与する。感染が潜伏相もしくは急性用の個体は、他の治療法とは別個 にまたは一諸に免疫原性ペプチドで治療できる。治療用途で、組成物は、細胞障 害性リンパ球のＨＢＶに対する有効な応答を誘発しかつその病状および／または 合併症を治癒させるかまたは少なくとも一部を阻止するのに充分な量で患者に投 与する。これを達成するのに適切な量は“治療に有効な投与量”として定義する 。この用途に有効な量は、例えばペプチドの組成、投与法、治療する疾患の段階 と重症度、患者の体重と一般健康状態、および処方する医師の判断によってきま るか、一般に７０ｋ［ｉ体重の患者については約ｌμｇ〜約２０００ｍｇのへブ チドの範囲内にあり、約ｌＯμｇ〜約１００ｍｇのペプチドの投与量がより普通 に用いられ、次いで患者から得たＰＢＬのＨＢＶ特異的ＣＴＬ活性を測定してめ た患者のＣＴＬ応答によって、数週間〜数ケ月にわたって約ｌμｇ〜約１ｍｇの ペプチドをブースター投与する。本発明のペプチドと組成物は、一般に、重篤な 病状すなわち生命にかかわるかまたは潜在的に生命にかかわる場合に用いること ができることに留意しなければならない。このような病状の場合、外来物質を最 少にすることと本発明のペプチドが相対的に非毒性であることから、これらペプ チドの組成物のかなりの過剰量を投与することが可能であり、かつ治療医師は望 ましいと感じるてあろう。

本発明の組成物を一回投与するかまたは多数回投与するかは治療医師が選択する 投与レベルとパターンによって実施することかできる。いずれにしろ、本発明の 医薬組成物は、患者を有効に治療するのに充分な量で本発明の細胞障害性Ｔ　Ｉ Ｊンバ球刺激ペプチドを投与しなければならない。

治療に用いる場合、投与は、ＨＢＶ感染の最初の徴候が見えたときかまたは急性 感染の症例では診断後すぐに始め、次いで少なくとも症状か大きく軽減するまで およびその後しばらくの期間続けなければならない。充分に定着した慢性症例で は、初回投与量、続いて維持投与量またはブースター投与量が必要である。急性 肝炎の治療中、細胞障害性Ｔリンパ球のＨＢＶに対する有効な応答が誘発される と、続いて、慢性肝炎、ＨＢＶキャリヤ一段階およびその後の肝細胞癌が発生す る可能性が最少になる。

被感染個体を本発明の組成物で治療すると、急性感染個体の感染の消散を速める ことができる。なお急性感染個体の約９０％は自然に感染を消散することができ る。慢性感染になり易い（または慢性感染になる傾向がある）これらの個体に対 して、本発明の組成物は、急性感染から慢性感染へ進行するのを防止する方法に 特に有用である。慢性感染になり易い個体が感染の前もしくは感染中に、例えば 本願で述べるようにして同定されると、本発明の組成物はそれらの個体を標的に することができ、大集団に投与する必要か少なくなる。

また本発明のペプチド組成物は、慢性肝炎の治療に用いることができ、かつキャ リヤーの免疫系を刺激してウィルス感染細胞を著しく減少させるかまたは消失さ せることさえてきる。慢性肝炎の個体は、感染後約３〜６ケ月間にウィルスに対 して陽性であるという試験結果て同定することができる。個体は、その感染の急 性相中に細胞障害性Ｔリンパ球の応答か不適切か（または該応答かない）ために 、慢性ＨＢＶ感染になるのであるから、細胞障害性Ｔ細胞応答を有効に刺激する のに充分な量の免疫強化ペプチドを組成物に含有させることと、上記刺激を行う のに充分な投与モードを実施することが重要である。したがって慢性肝炎を治療 するのに用いる代表的な投与量は、７０ｋｇ体重の患者に対し一回の投与当り約 ｌμｇ−１，０００ｍｇの範囲内であり、好ましくは約５μｇ〜１００　ｍｇで ある。投与は、少なくとも臨床徴候または試験指示薬が、ＨＢＶ感染か消失した かまたは著しく緩和したことを示すまておよびその後しばらくの間続けなければ ならない。免疫化投与に続いて、所定の時間間隔例えば１〜４週間をおいて維持 投与もしくはブースター投与か必要である。また感染を消散させるため必要に応 じて期間を延長することもある。

慢性およびキャリヤーのＨＢＶ感染を治療するには、ＣＴＬペプチドと、他のＨ ＢＶ抗原に対する免疫応答を誘発する他のペプチドまたはタンパク質を組合すこ とか望ましい。

治療に用いる本発明の医薬組成物は、非経口、局所、経口または局部の投与を目 的としている。本発明の医薬組成物は、例えば静脈、皮下、皮肉または筋肉内の 投与のような非経口で投与するのか好ましい。したがって本発明は、容認できる 担体、好ましくは水性担体に溶解もしくは懸濁させた細胞障害性Ｔリンパ球刺激 ペプチドの溶液もしくは懸濁液からなる非経口投与用組成物を提供するものであ る。各種の水性担体を使用することかでき、例えば水、緩衝水、０．４９６生理 的食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などがある。これらの組成物は、通 常の公知の滅菌法で滅菌することができ、または滅菌濾過を行うことができる。

得られた水溶液は、そのま−もしくは凍結乾燥して使用のために包装する。なお 凍結乾燥された製剤は投与する前に滅菌溶液と混合する。本発明の組成物は、必 要に応じて生理的条件に近づけるために、ｐＨを調節する緩衝剤、等張化剤、湿 潤剤などのような医薬として許容される補助物質を含有させてもよく、例えば酢 酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウ ム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどがある。

いくつかの実施態様では、ＣＴＬをプライムする成分を少なくとも一つ、本発明 の医薬組成物中に含有させることが好ましい。生体内で、ウィルス抗原に対して ＣＴＬをプライムすることができる脂質類か同定されており、例えばトリバルミ トイル−８−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ、Ｃ３５）があるが 、これは、適切なペプチドに共有結合させると、ウィルス特異的細胞障害性Ｔリ ンパ球を有効にプライムすることかできる（Ｄｅｒｅｓら、　Ｎａｔｕｒｅ、３ ４２巻、５６１〜５６４頁、１９８９年参照。この文献は本願に援用するもので ある）。

本発明のペプチドは例えばｐ、ｃｓｓにカップリングすることかでき、生成した りポリペプチドは個体に投与すると、細胞障害性Ｔリンパ球の１（ＢＶに対する 応答を特異的にプライムする。さらに、中和抗体の誘発も、適正なエピトープ例 えばＨＢｓＡｇエピトープを示すペプチドに接合されたＰ２Ｃ３Ｓでプライムさ れるので、これら二つの組成物を組合わせて、＋（ＢＶ感染に対する体液性およ び細胞性の両方の応答を一層有効に誘発することができる。

医薬製剤中の本発明の細胞障害性Ｔリンパ球刺激ペプチドの濃度は広範囲に変え ることができる。すなわち、約１重量％未満、通常は約１０重量％もしくは少な くとも約１０重量％から、２０〜５０重量％以上まての濃度てあり、主として流 体の容積、粘度などにより、選択される特定の投与モードにしたがって選択され る。

したがって、静脈注入用の典型的な医薬組成物は、滅菌リンゲル液２５０ｍ１と ペプチド＋００ｍｇを含有させて調製することができる。非経口投与を行える化 合物の実際の製造方法は、当該技術分野の当業者にとって公知もしくは明らかで あり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅ、第１７版、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、米国 ペンシルベニア州、イーストン、１９８５年により詳細に記載されている。なお この文献は本願に援用するものである。

また本発明のペプチドはリポソーム類によって投与してもよく、リポソーム類は 、特定の組織例えばリンパ組織もしくはＨＢＶに感染した肝細胞を目標として本 発明のペプチドを向ける働きをする。リポソーム類は本発明のペプチド組成物の 半減期を長（するのにも用いることかできる。本発明に有用なリポソームとして は、乳濁液、発泡体、ミセル、不溶性単分子層、液晶、リン脂質の分散液および ラメラ層などかある。これらの製剤において、放出されるペプチドは、リポソー ムの一部として、単独か、またはＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体の ようなリンパ系細胞中に多く存在している受容体に結合する分子もしくは他の治 療組成物もしくは免疫原性組成物とともに組込む。このようにして、本発明の所 望のペプチドとともに充填されたリポソームは、リンパ系細胞または肝細胞の部 位に送ることができ、その部位でリポソームは選択された治療／免疫原性ペプチ ド組成物を放出する。本発明に使用するリポソームは、標準の小胞形成性脂質か ら製造され、該脂質としては、一般に中性で負に帯電したリン脂質類およびステ ロール例えばコレステロールがある。脂質類の選択は、例えばリポソームの大き さおよび血液流中のリポソームの安定性を考慮することによって行う。リポソー ムを製造するのに各種の方法を利用できるが、例えば５ｚｏｋａら、Ａｎｎ、　 Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇ、、９巻、４６７頁、１９８０年：米国特許第４ ．２３５．８７１号、同第４．５０１．７２８号、同第４．８３７．０２８号お よび同第５．０１９．３６９号に記載されている。なおこれらの文献は本願に援 用するものとする。

免疫細胞を目標としてこれに向けるために、リポソームに組込まれるリガンドに は、例えば所望の免疫系の細胞の細胞表面決定因子に対して特異的な抗体もしく はそのフラグメントを含有させてもよい。

ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、投与モード、放出されるペプチド、治 療される疾患の段階などによって、投与量を変えて、静脈、局部、局所なとに投 与することができる。

固体組成物に対しては通常の非毒性固体の担体を用いることができ、担体として は例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マ グネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロ ース、炭酸マグネシウムなとが挙げられる。経口投与用の医薬として許容される 非毒性組成物は、先に挙げた担体のような通常用いられる賦形剤のいずれかを、 活性成分すなわち本発明の１種以上のペプチドのは′−″ｌＯ〜９５％で、より 好まし１くは２５９６〜７５％の濃度で組込んで製造する。

エアゾル投与用には、細胞障害性Ｔリンパ球刺激ペプチドは界面活性剤および噴 射剤によって細かく分割された形態で供給することか好ましい。ペプチドの一般 的な百分率は０．０１〜２０重量％であり、好ましくは１〜１０重量９６である 。界面活性剤は勿論非毒性でなければならず噴射剤に可溶性であるのが好ましい 。このような界面活性剤の代表的なものは、６〜２２個の炭素原子を含有する脂 肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、バルミチン酸、ステアリン 酸、リノール酸、リルン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ　ａｃｉｄ） およびオレイン酸の脂肪族多価アルコールもしくはその環状無水物によるエステ ルもしくは部分エステルである。混合グリセリドもしくは天然グリセリドのよう な混合エステルも利用できる。界面活性剤は組成物の０．１〜２０重量％を構成 していてもよく好ましくは０．２５〜５％を構成している。組成物の残りの部分 は通常噴射剤である。

所望の場合、担体も含有させてもよい。例えば鼻腔内攻出用のレシチンか挙げら れる。

池の態様において、本発明は、本願に記載されているような細胞障害性Ｔリンパ 球刺激ペプチドの免疫原性的に有効な量を活性成分として含有するワクチンに関 する。本発明のペプチドは、それ自体の担体に連結されて、または活性ペプチド 単位のホモポリマーもしくはヘテロポリマーとして、ヒトを含む宿主中に導入す ることができる。かようなポリマーは免疫反応を増大するという利点があり、そ してポリマーを製造するのに異なるペプチドを使用すると、ＨＢＶの異なる抗原 決定因子と反応する抗体および／または細胞障害性Ｔ細胞を誘発する追加の性能 が得られる。有用な担体は当該技術分野では公知であり、例えばキーホール・リ ンペット・ヘモシアニン、千ログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブ ミン類、破傷風トキソイド、ポリ（Ｄ−リシン、Ｄ−グルタミン酸）のようなポ リアミノ酸類などが挙げられる。本発明のワクチンは、水、リン酸緩衝食塩水も しくは生理的食塩水のような生理学的に容認できる（許容できる）希釈剤を含有 していてもよく、さらに一般にアジュバントを含有している。不完全フロインド アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンのよ うなアジュバントは当該技術分野で公知の物質である。そして、前述のように、 細胞障害性Ｔリンパ球の応答は、本発明のペプチドを脂質類例えばＰ３ＣＳＳに 接合することによってプライムすることができる。本願に記載のペプチド組成物 を用い、注射、エアゾル、経口、経皮などの経路で免疫化すると、宿主の免疫系 はワクチンに応答してＨＢＶ抗原に対して特異的な細胞障害性Ｔリンパ球を大量 に産生し、そのため宿主はＨＢＶの感染に対して少なくとも部分的に免疫になる か、または慢性ＨＢＶ感染症になることに対して耐性になる。

本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、ＨＢＶに感染し易いか、さもな ければＨＢＶに感染する危険がある患者に投与すると、患者自身の免疫応答性能 を増大させる。このような量は“免疫原性的に有効な投与量”と定義する。この 用途では、その正確な量はやはり、患者の健康状態と体重、投与法、製剤の性質 などによって決まるか、一般に７０ｋｇ体重の患者に対して約１．０μｇ〜約５ ００ｍｇの範囲内にあり、より普通は７０ｋｇ体重当り約５０μｇ〜約２００ｍ ｇである。

本発明のペプチドは適切なＨＬＡタイプの個体に投与する。例えばＭＢＣ＋ｔ− ｔ□の領域由来のペプチドのワクチン組成物は）ＩＬＡ−Ａ２の個体に投与し、 ＨＢｃ　Ｉ　＜　＋　−＋　ｓ　＋エピトープ決定因子を含有するペプチドは、 Ａ３１とＡｗ６８の個体に投与する。

場合によっては、本発明のペプチドワクチンは、ＨＢＶ特に）ＩＢＶ工ンベロー ブ抗原、例えば組換えＨＢＶｃｎｖがコードする抗原に対する中和抗体の応答を 誘発するワクチン、またはＨＢＶに感染した個体から得た精製血清製剤から製造 したワクチンと混合することが好ましい。

各種のＨＢＶワクチン製剤かすてに報告されているか、主として）（ＢｓＡ：と 、そのポリペプチドフラグメントに基づいている。本発明のペプチドを配合する ことができるワクチンの参照すべき例としては、ヨーロッパ特許第１５４．９０ ２号と同第２９１．５８６号、および米国特許第４、５６５．６９７号、同第４ ．６２４．９１８号、同第４．５９９．２３０号、同第４．５９９．り秀゛号、 同第４．８０３．１６４号、同第４．８８２．１４５号、同第４．９７７、０９ ２号、同第５．０１７．５５８号および同第５．０１９．３８６号がある。なお これらの文献は本願に援用するものである。これらのワクチン類は混合して同時 に投与してもよくまたは別個の製剤として投与してもよい。

治療または免疫化の目的のため、本発明のペプチドはワクシニアウィルスのよう な弱毒化させたウィルス宿主によって発現させることもできる。この方法として は、ワクシニアウィルスをベクターとして用いて、本発明のＨＢＶペプチドをコ ードするヌクレオチド配列を発現させる方法かある。組換えワクシニアウィルス は、急性または慢性のＨＢＶ感染宿主または未感染宿主中に導入すると、ＨＢＶ ペプチドを発現して宿主の細胞障害性Ｔリンパ球のＨＢＶに対する応答を誘発す る。免疫化のプロトコルに有用なワクシニアベクターと方法は例えば米国特許第 ４．７２２．８４８号に記載されている。なおこの文献は本願に援用するものと する。もう一つのベクターはＢＣＧ　（ｂａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ　Ｇｕ ｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクター類は、５ｔｏｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３５ １巻、４５６〜４６０頁、１９９１年に記載されている。なおこの文献は本願に 援用するものである。本発明のペプチドを治療のための投与かまたは免疫化のた めに有用な他のベクターとしては例えばサルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）のベクターなど様々の種類のものがあることは、本願の記 載事項から当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。

特許を請求する本発明の組成物と方法は生体外治療（ｅｘ　ｖｉｖ。

ｔｈｅｒａｐｙ）に用いることができる。生体外治療という用語は、治療または 免疫原性の操作を体外で行うことを意味する。例えばリンパ球などの標的細胞を 患者から取出し、高い投与量の対象ペプチドで処理し、患者が達成もしくは容認 できるレベルよりもはるかに過剰のペプチド刺激濃度を細胞媒体に与える。ＣＴ Ｌを刺激する処理に続いて、その細胞を宿主に戻してＨＢＶ感染を治療する。宿 主の細胞は、上記のようにペプチドをコードする遺伝子を保持するベクターに暴 露してもよい。細胞は該ベクターでトランスフェクトさせて、試験管内で増殖さ せるかまたは患者に戻す。試験管内で増殖させた細胞は所定の細胞密度に到達し てから患者に戻す。

本発明のペプチドには診断剤としての用途もある。例えば本発明のペプチドは、 特定の個体の、本発明のペプチドまたは類縁ペプチドを用いる治療処方計画に対 する感受性を測定するのに使えるので、既存の治療プロトコルの修正または罹患 個体に対する予後を決定するのに役立つ。その上、本発明のペプチドは、どの個 体が慢性ＨＢＶ感染症になる危険性か大きいかを予測するのにも用いることがで きる。

次に実施例を示すか、これは例示を目的とするものであり、本発明を限定するも のではない。

実施例Ｉ ＣＴＬ特異的）ＩＢｃエピトープの同定Ｂ型ウィルス肝炎の急性相中の３名の患 者（Ｍ、Ｂ、、　Ｊ、Ｐ、およびＪ、　Ｖ、　）について試験した。急性肝炎の 診断は、５ＧＰＴ活性の値が上昇していることを見つける（正常値の少なくとも 約１０倍の高いレベル；平均の５ＧＰＴの値のピークは２１７９１Ｖ／Ｌであっ た）のと、併せて血清中のＩｇＭ抗−ＨＢｃＡｇ抗体を検出することに基づいて 行った。すべての患者か該疾病から完全に回復し、血清トランスアミダーゼが正 常になりかつＩ（ＢｓＡｇが排除された。これらの患者は、δＡｇとＣ型肝炎ウ ィルスに対して抗体陰性であった。患者Ｊ、　Ｐ、はＡ２．　Ａ３．　Ｂ４４゜ Ｂ３５．　Ｃｗ４．　ＤＲＹ、　ＤＲ２，ＤＲｗ８、およびＤＱｗｌであった。

Ｖ、Ｊ、はＡ２゜Ａｌｌ、Ｂ４４．　Ｂ６２．　Ｃｗ５．　ＤＲ４，ＤＲｗ１２ てあった。Ｂ、Ｍ、はＡ２゜Ｂ３８．　Ｂ２７．　ＤＲ５，ＤＲｗ５２およびＤ Ｑｗ３てあった。したかって全患者かＨＬＡ−Ａ２陽性であった。これらの患者 から採取した末梢血液リンパ球のＨＢＶ特異的ＣＴＬ活性を、単離直後、後述の ようにしてＨＢＡ発現ベクターでトランスフェクトした自家刺激細胞で刺激して から１週間後もしくは２週間後、または１０〜２０残基の長さのオーバーラツプ 合成ペプチドの４プールの１パネル〔これらのプールは各々、全ＨＢＶヌクレオ キャプシド（コアとブレコア）領域（ａｙｗサブタイプ）をカバーする５〜６種 のペプチドで構成されている〕で刺激してから測定した。各プールを構成するペ プチドを図１に示す。

ペプチド特異的ＣＴＬは、下記のように、急性肝炎の上記３名の患者のＰＢＬか ら得た。ＰＢＬは、１０％　ＡＢ血清＋ｔ（ＢＣＩＩ−ｔｔペプチドを含有する ペプチドプールのＩＯμｇ／ｍｌ、またはＨＢＣＩ＋−２７ペプチドと組換え（ ｒ　）　ｌｆＢｃＡｇ（Ｂｉｏｇｅｎ社、スイス、ジエネバ）ｌμｇ／ｍｌを含 有する、ＲＰＭｌ　１６４０中４ＸＩＯ＠個／ｍｌの細胞を、２４ウエルプレー ト（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中で培養した。４日間培養した後、ＩＯ％ＦＣ５と２０ Ｕ／ｍｌのｒｌＬ２（ｌｆｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ社、スイス　ハーゼル ）を含有するＲＰＭ１１６４０を再供給した。患者Ｖ、　Ｊ、の場合、ペプチド でプライムされた細胞は、培養を１週間行った後、抗原提供細胞として自家の放 射線を照射された（３５００ＲＡＤ）　ＦＢＩ、の存在下、１ＩＢｃｌ＋−２７ ペプチドとｒＨＢｃＡｇ（Ｉ　ｍｇ／ｍｌ）で再刺激を行った。患者Ｊ、　Ｐ、 由来のペプチドてプライムした細胞を、同種異系の放射線を照射された（７００ ０ＲＡＤ）　ＰＢＬの存在下ｌμｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で ７日目に再刺激を行った。細胞障害活性を培養７日後（患者Ｍ、　Ｂ、　）また は１４日後（患者Ｖ、　Ｊ、およびＪ、　Ｐ、　）に評価した。

細胞障害活性は、刺激されたＰＢＬを、自家もしくは同種異系の（ＨＬＡ適合も しくはＨＬＡ非適合の）　”Ｃｒで標識をっけたペプチドでパルスした（２０μ ｇ／ｍｌ、１時間）　ＢＣＬ細胞とともに、丸底９６ウエルプレート内でエフェ クタ一対標的比（Ｅ／Ｔ比）が１１００（、Ｂ、　）または１０　（Ｖ、Ｊ、、 　Ｊ、Ｐ、）にて４時間インキュベートすることによって評価した。ペプチドて パルスしなかった親のＢＣＬ細胞は負の対照として使用できた。標的細胞溶解の 百分率は、式（Ｅ−Ｍ／Ｔ−Ｍ）Ｘ１００（式中Ｅ＝実測Ｓ　Ｉ　（：、ｒ放出 量（ｃｐｍ）　；　Ｍ−培養培地の存在下での５１　Ｃｒ放出量（これは全カウ ント数の１５〜２５％の範囲内であった）。

およびＴ＝ＩＯ％　ＴｒｉｔｏｎＸが放出した全６１　Ｃｒ　）で計算した。

図２に示すように、ＨＢＶ特異的ＣＴＬ活性は、オーバーラツプヌクレオキャプ シドペプチドのパネルによる刺激の場合のみ、再現可能に観察された。ペプチド 特異的ＣＴＬ活性は、前記４種のペプチドプールのなかの１種によってのみ常に 誘発され、認識はそのプール内の単一のペプチドに限定されており、そのペプチ ドはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の残基１１〜２７で構成され、配列：　Ａ ｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐ ｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｖａｌ　（Ｓｅｑ、 ＩＤ。

Ｎｏ、２）を存し、ＨＢＶの主要サブタイプ中に保存されている。これは急性ウ ィルス肝炎にかかっているＨＬＡ−Ａ２陽性患者の優性エピトープである。

ＨＢＣ＋＋−ｔ７決定因子を含有するペプチド混合物による刺激を１週間行った 後、患者Ｍ、　Ｂ、由来のリンパ球は、ペプチドとともにインキュベートした自 家のＨＬＡ−Ａ２適合Ｂリンホブラストイド細胞ＢＣＬを特異的に溶解した（図 ２Ａ）。ペプチド特異的ＣＴＬ系も、ＨＢＣ＋＋−２を特異的ＣＴＬを膨張させ るためのＴ細胞ヘルプの抗原非特異的起源（Ｆｅｒｒａｒｉら、　、ＬＩｍｍｕ ｎｏｌ、、１４５巻、３４２２頁、１９９０年）として、ＨＢＣＩ＋−２７ペプ チド十組換え）ＩＢＶ−コア抗原で刺激し、続いて同じ試薬で再刺激することに よって、患者Ｖ、　Ｊ、由来のＰＢＬから樹立した（図２Ｂ）。同様に、ＨＢＣ ｚ−ｇ７特異的ＣＴＬ系は、患者Ｊ、　Ｐ、由来ＰＢＬを用い（図２Ｃ）、ヘブ チドとＨＢｃＡｇの刺激の１週間に続いて、Ｔ細胞ヘルプの抗原非特異的起源と してのＰＩ（Ａと放射線を照射された同種異系ＰＢＬによる再刺激によって引立 した。この方法によって、ペプチドでパルスした自家および同種異系ＨＬＡ−Ａ ２陽性標的細胞を溶解できる短期ＣＴＬ系を樹立できたが、ＨＬＡ−Ａ２非適合 標的については樹立できなかった。

このことはＣＴＬによるペプチドの認識が）化Ａ−Ａ２に制限されていたことを 示している。

ニーに記載されているのと同様に行った別の実験で、ペプチドＨＢＣ＋５−２７ とＨＢＣｚｍ−ｔｔは少なくともＨＬＡ−Ａ２に制限された方式でＣＴＬ活性を 特異的に刺激することが見出された。他の実験で、ペプチドＨＢＣ２１−４７と ＨＢＣ＋＋＋−＋ｔｓはＨＢＶ抗原に対するＣＴＬ活性を特異的に刺激すること を示し、およびペプチＪ”ＨＢＣｚｔｏ−＋ｓ４が少な（ともＨＬＡ−Ａ３１に 制限されていると思われる方式でＣＴＬ活性を刺激した。

実施例■ ＨＢｃペプチドに対して特異的なＣＴＬはＩＩＢＶコア抗原を認識する実施例■ の３名の患者由来の短期のペプチド特異的ＣＴＬ系を、ＨＢＶコア発現ベクター でトランスフェクトさせたかもしくは該ベクターに感染させた自家および同種異 系ＢＣＬ標的を用い、内因的に合成されたＨＢＶコア抗原を認識する性能につい て試験した。

２種の真核発現系を用いた。ＨＢＶのコア（Ｖコア）またはブレコア（Ｖブレコ ア）のポリペプチド（サブタイプａｙｍ）を発現する組換えワクシニアウィルス を、５ｃｈｌｉｃｈｔと５ｃｈａｌｌｅｒ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　６３巻、５ ３９９頁、１９８９年に記載されているのと同様にして用いた。なおこの文献は 本願に援用するものである。さらにＥＢＶ−Ｂ細胞は、Ｃａｎｆｉｅｌｄら、Ｍ ｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　１０巻、１３６７頁、１９９０年に記載されて いるのと同様に、エプスタイン・バールウィルスに基づくベクター（ＥＢＯｐＬ ＰＰ）中てＨＢＶのコア（ＥＢＯ−コア）および１二７ベローブ（ＥＢＣＬ−ｅ ｎｖ）のポリペプチド（サブタイプａｙｗ）を発現する組換えプラスミドのパネ ルで安定にトランスフェクトされた。なお上記の文献は本願に援用する。

患者Ｍ、　Ｂ、とＪ、　Ｐ、由来のエフェクター細胞を実施例■に記載されてい るのと同様に７日問および１４日間刺激した後、それぞれ、　！００　：１と１ ０：１のＥ／Ｔ比て４時間標的細胞とともにインキュベートした。５１Ｃｒで標 識を付ける前に、ＢＣＬｆ！Ｉｆ！的は、感染多重度２ｏで１４時間、組換えワ クシニアウィルスに感染させて（図３パネルＡ）　ＨＢＶがコードする遺伝子産 物を発現させるが（Ｖｗ＝ワクシニア野生型、Ｖｃｏｒｅ＝　ＨＢｃＡｇ読取り 枠を保存するワクシニア）、または患者Ｊ、　Ｐ、につぃては、エンベロープ（ ＥＢＯ−ｅｎｖ）もしくはヌクレオキャプシド抗原（ＥＢＯ−コア）の有効な発 現を誘発することが予め分かっているＥＢＶベースのエピソームベクターでトラ ンスフェクトした（パネルＢ）。

図３に示すように、ＣＴＬは、ＨＢＶコアポリペプチドを一時的にまたは安定し て発現する自家のＢＣＬを特異的に溶解した。ＨＬＡ−Ａ２適合およびＨＬＡ− Ａ２非適合の同種異系の標的細胞のパネルを用いることによって、内因的に合成 された未変性（組換え）コア抗原の特異的認識もＨＬＡ−Ａ２に制限されていた 。

実施例■ ヌクレオキャプシドのトランスフエクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）によ る逐次刺激によって高親和性の抗ＨＢＶ　ＣＴＬか産生されるペプチド抗原によ って刺激すると、対応する内因性タンパク質に対して低い親和性を有するＣＴＬ を誘発することができ（Ｃａｒｂｏｎｅら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１６７巻 、１７６７頁、１９８８年）、その結果、ペプチド刺激を反復すると、合成ペプ チドを認識するか未変性抗原を認識しないＣＴＬを得ることができる。未変性の ヌクレオキャプシド抗原を認識するＣＴＬの集団を選択的に膨張させかつ別の分 析に用いる長期系を樹立するために、患者ＪＪ、由来のＰＢＬを、ペプチドＨＢ ＣＩ＋−２□プラス組換えＩＩＢｃＡｇて１週間刺激し、得られた活性化ＰＢＬ は、ＨＢＶヌクレオキャプシトボリベブチトを安定して発現する、ＨＬＡ適合の トランスフェクトされたＢＣして再刺激した。

詳細は下記のとおりである。Ｉ（ＢＣＩ＋−２７ペプチドとｒｔ（ＢＣＡｇて２ 週間刺激した後、ペプチド特異的ＣＴＬ系Ｊ、Ｖ、（図２Ｂ）を、さらに、放射 線照射（７０００１？ＡＤ）　ＨＬＡクラス■適合ＥＢＯ−コアトランスフエク タント（Ｉ　Ｘ　１０＠／ｍｌ）プラス自家の放射線照射（３０００ＲＡＤ）　 ＰＢＬ　（５ＸＩＯ’　／ｍｌ）　、およびｒＨＢｃＡｇ　（ＲＰＭｌ＋ＩＯ％ ＦＣ３＋２０Ｕ／ｍｌのｒｌＬ２中Ｉｍｇ／ｍｌ）て７日毎に再刺激した。図４ 八に示すように、細胞障害活性ハ、ＨＢＣｚ−ｚ＋ペプチドでブレパルスされた かもしくは培地だけで培養されたＨＬＡ−Ａ２適合ＢＣＬ、または内因的に合成 されたヌクレオキャプシドもしくはエンベロープ抗原を発現するＥＢＯＩ−ラン スフエクタントに対して試験した。試験は、ＥＢＯ−コアトランスフエクタント による２ラウンドの刺激（Ｅ／Ｔ比−２０：１．）の２週間前と４週間後に実施 した。

図４八に示すように、再刺激を行う前に、ＣＴＬはペプチドでパルスされた標的 に対して高レベルの細胞障害性を示したか、内因的に合成された抗原を発現する 標的細胞の特異的キリング（ｋｉｌｌｉｎｇ）は最少であった。Ｔ細胞は、ヌク レオキャプシドのトランスフエクタントによる再刺激に続いて、内因的に合成さ れた抗原を発現する標的のキリングの増大を示し、同時にペプチドでパルスされ た標的細胞のキリングの減少を示した（［ｆｆ１４Ａ参照）。

内因的に合成された抗原の認識は、図４Ｂに示すように、再刺激に続いて時間が 経過するにつれて次第に増大した。このパネルは、ＥＢＯ−コアトランスフエク タントによる１、２または３の連続ラウンドの刺激の後３，４および４週間の培 養中（Ｅ／Ｔ＝２０：　ｌ）のＣＴＬ系Ｖ、Ｊ、による、内因的に合成されたＨ ＢＶヌクレオキャプシド抗原の認識を示す。これらの結果は、内因的に産生され た抗原に対して高い親和性を有するＣＴＬか選択されていたことを示唆している 。

図４０は、組換えワクシニアウィルスに感染させた（実施例■に記載したのと同 様にして感染させた）ＨＬＡ−Ａ２適合およびＨＬＡ−Ａ２非適合のＢＣＬ標的 に対する、５週間培養（Ｅ／Ｔ＝５０：　１）後の細胞障害活性を示す。

これらの結果は、天然にプロセスされたヌクレオキャプシド抗原が、ＣＴＬ前駆 体の集団を膨張させるために使用された合成ＨＢＣＩ＋−１７ペプチドに類似し ているか同一でないことを示唆している。予め刺激を行うことなく、新たに単離 したＰＢＬ中にＨＢＣ特異的ＣＴＬを検出しようとした従来の多くの試みが失敗 したのに上記の連続刺激がこのように良好に作用したという事実は、末梢血液区 域に非常に低い頻度てＨＢＶ特異的ＣＴＬ前駆体か存在していることを示唆して いる。

優れた標的細胞として役立った、安定にトランスフェクトされた自家ＢＣＬで試 験管内刺激を行うだけではＨＢｃ特異的ＣＴＬを誘発することかできないのは、 ＣＴＬを誘発するには、溶解に必要なエピトープ密度と比べて一層高いエピトー プ密度が一般に必要であることを示唆している。

）ＨＢＣｌｌ−ｔｔ特異的ＣＴＬの表現型は、ＨＢＶコアトランスフエクタント と患者Ｖ、Ｊ、由来のヌクレオキャプシド特異的ＣＴＬ系を、分化マーカーのＣ Ｄ４とＣＤ８に対して特異的な抗体とともにインキュベートすることによって評 価した。Ｖ、　Ｊ、のＣＴＬ系は、飽和濃度（０，６μｇ／ｍｌ）のｒｇＧＩモ ノクローナル抗体の抗−Ｌｅｕ−３ａ　（ＣＤ４　）と抗−Ｌｅｕ−２ａ（ＣＤ 　８　ＸＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社から入手）の存在下、Ａ２陽性Ｅ ＢＯ−コアとＥＢＯ−ｅｎｖの標的に対して試験した。抗体は、クロム放出検定 を開始するときに培養物に添加した。抗原特異的溶解は、ＣＤ８に対する抗体に よって８０％阻害され、一方ＣＤ４に対する抗体では阻害は全く起こらなかった 。これらの結果は、１ｌＢＣ＋＋−ｔｖ特異的で）ＩＬＡ−Ａ２で制限されたＣ ＴＬ活性は、ＣＤ８陽性細胞によってもっばら仲介されることを示している。

実施例■ ）ＨＢＣｌｌ−２７特異的ＣＴＬは、ＨＢＶのコアとプレコアの領域でコードさ れるポリペプチドによって共有されているエピトープを認識するＨＢＣｌｌ−２ □エピトープは二つの独立したヌクレオキャプシドポリペプチド（コアおよびプ レコア）の中に位置し、その一方（プレコア）は、その小胞体へのトランスロケ ーションとＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）としての分泌をもたらすアミノ末端の シグナル配列を含有している（Ｕｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５５巻、８９頁、 １９８６年；　Ｒｏｏｓｉｎｃｋら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、６巻、１３９３頁、１９８６年；およびＳｔａｎｄｒｉｎｇら、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８５巻、８４０５頁、１９８８年）。そのコアポ リペプチドは、主として細胞質の核タンパク質（ＨＢｃＡｇ）であり分泌されな い（Ｒｏｏｓｉｎｃｋおよび５ｉｄｄｉｑｕｉ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　６１巻 、　９５５頁、１９８７年、およびＭｃＬａｃｈｌａｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、 　６１巻、　６８３頁、１９８７年）。一方のポリペプチドまたは両方のポリペ プチドのどちらがＨＬＡ−Ａ２制限ＨＢＣＩ＋−２□特異的ＣＴＬエピトープを 生成するのに役立つのかを決定するために、ＨＬＡ−Ａ２陽性ＢＣＬ標的細胞を 、実施例■に記載されているのと同様にして、独立して未変性のコアとプレコア のポリペプチドを発現するため調製した組換えワクシニアウィルスに感染させた 。図５に示すＥ−Ｔ比での４時間の６ＩＣ，放出検定に、ＣＴＬ系Ｊ、　Ｖ、を エフェクター細胞の起源として使用した。

試験結果は、両方の標的細胞系が、患者Ｖ、　Ｊ、由来のＨＢＣｌｌ−１７特異 的ＣＴＬ系によって同程度に死滅させられたことを示した。このことは、ＨＢｃ ＡｇとＨＢｅＡｇが共通の細胞内プロセシング経路を共有し、かつＨＬＡクラス Ｉ制限ＣＴＬレベルで交差反応性であることを示している。

実施例Ｖ ＨＬＡ−Ａ２ハブロタイブ個体中のＨＢＣｌｌ−２７ＣＴＬエピトープの免疫優 性ペプチドＨＢＣ＋＋−ｔｔ中に含有されているＣＴＬエピトープのＨＬＡ−Ａ ２ハブロタイブの免疫優性を評価するために、自己限定性の急性Ｂ型肝炎に感染 している８名の追加の被検者、慢性の活性Ｂ型肝炎の４名の被検者および以前に ＨＢＶに暴露されたという徴候がない８名の健康な被検者くすべてＨＬＡ−Ａ２ 陽性）を繰返し試験した。

疾患の症状期と回復期の間に連続的に試験した（７〜ＩＯ日毎に）急性患者はす へて、混合物４てのみならずペプチドＨＢＣＩ＋−１７でパルスされた自家標的 細胞を有効に認識した（図１）。それらの四つ由来の混合物４−刺激ＰＢＭＣて 実施した制限実験によって、ペプチドＨＢＣｚ−ｔ□のＣＴＬ認識がＨＬＡ−Ａ ２で制限されていることが確認された。

ペプチドに対する応答のパターンの患者毎の変化は、疾病の過程中で観察された 。細胞障害活性は、トランスアミナーゼ値が高い黄痘期中、一般に検出できたが 、いくらかの患者ではこの応答が長く続き、ＧＰＴレベルがすでに正常になった ときでもいぜんとして検出可能であった。そして他の被検体では溶解活性は、ト ランアミダーゼがピークになってから２．３週間後、ＧＴＰレベルかわずかしか 変化しなくなったときに検出てきなくなった。このようにＣＴＬ活性と５ＧＰＴ レベルとの間に一定の関連がないことは、末梢血液区域が、肝臓中、抗原合成と 細胞損傷の部位で起こる免疫現象をごく部分的にしか反映していないを示唆して いる。

４名の慢性患者のうち３名は（これらの患者は各々急性の患者に対して用いたの と同じ試験プロトコルにしたがって２〜３回試験した）、ペプチドＨＢＣＩ＋− ２□でパルスした自家マクロファージに対して細胞障害活性を示さなかったが、 １名の患者は、関連ペプチド配列に対する細胞障害性をごく低いレベルではある が、検出可能であることを示した。ペプチドＨＢＣＩ＋−２７に対する溶解活性 は正常な）化Ａ−Ａ２陽性対照被検体には検出てきなかった。このことは、この 応答が試験管内ブライミングが原因ではなく、ペプチド刺激によって、ＨＢＶ感 染で試験管内プレプライムがなされた特異的Ｔ細胞集団が選択的に膨張したこと を示している。

これらの結果は、コアペプチドＨＢＣｚ−ｔｔに対するＣＴＬ応答と、ウィルス を除去するのに成功した患者の急性Ｉ（ＢＶ感染との間の明確な相関関係を示し ている。

実施例■ ＨＬＡ−Ａ３１とＨＬＡ−Ａｗ６８に制限されたＣＴＬ活性の同定この実施例で は、二つの独立したＨＬＡクラス１分子であるＨＬＡ−Ａ３１とｆ（ＬＡ−Ａｗ ６８によって制限されているＨＢＶヌクレオキャブシドエピトーブに対するＣＴ Ｌ応答の同定について述べる。

急性のＢ型肝炎にかかっている６名の患者（男性５名および女性１名）ならびに ６名の正常な献血者を試験した（表■）。急性Ｂ型肝炎の診断は、正常者の上限 の少なくとも２０倍も高いアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を 有する重篤な肝臓細胞の損傷の臨床および生化学上の徴候および急性ＨＢＶ感染 の血清学的徴候；ならびに肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）とＩｇＭ抗ＨＢｃ抗体（ ＩｇＭ　ＨＢｃ−Ａｂ）　、およびデルタ型肝炎もしくはＣ型肝炎のウィルスに よる感染の血清学的徴候がないこと（米国、イリノイ州、ノースジカゴ、Ａｂｂ ｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ社から入手した市販試薬を使用）を含む標準の 診断基準に基づいて行った。すべての患者が最初の診断から４ケ月以内に血清ト ランスアミナーゼが正常化しかつＨＢｓＡｇが除去されて、疾病から完全に回復 した。

表■ ム■５彼検患者および標的細胞を製造するのに使用したＨＬＡ−Ａ３１とＩ（Ｌ Ａ−Ａ９６８の正常な献血者のＨＬＡクラス患　者　ＨＬＡクラスＩ Ｅ、Ｗ、　Ａ３１．　Ａｗ６８．　Ｂ３５．　Ｃｗ３．　Ｃｗ４Ｈ，Ｐ、　Ａ２ ．　Ａｗ６８．　Ｂ３５．８ｗ６２．　Ｃｗ３．　Ｃｗ４Ｖ、Ｔ、　Ａ２５．　 Ａ３１．　Ｂ７．　ＢＩ３１（、Ｆ、　Ａ３１．　Ａｗ６８．　Ｂ冑６ｔ、Ｃｗ ３Ｑ、Ｍ、　Ａｗ３６．　Ａｗ６８．　Ｂ４９．８ｗ６２．　ＣｗｌＶ、Ｐ、　 Ａ２４．　Ａｗ６８．　Ｂ３５．８ｗ６７Ｃ，Ｎ、　Ａ２４．　Ａｗ６８．８ｗ ６０．　Ｃｗ３献血者 ａ　Ａｔ、　Ａ３１．　Ｂ１７．８ｗ６０ｂ　Ａ２．　Ａ３１．　Ｂ２７．８４ ４．　Ｃｗｌｃ　Ａ３．　Ａ３１．　Ｂ７．　Ｂ２７ｄ　Ａ２４．　Ａ３１．　 Ｂ１４．　Ｂ３５．　Ｃｗ４ｅ　Ａ３．　Ａ３１．　Ｂ７ ｆ　Ａ３１．　ＡＷ６Ｂ、　Ｂ３５．８ｗ６０ｇ　Ａ３．　ＡＷ６８．　Ｂ７． 　Ｂ４４．　Ｃｗ７ｈ　Ａｌ、　Ａｗ６Ｂ、　Ｂ８．　Ｂ３８．　Ｃｗ７患者と 正常な献血者由来のＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法で 分離し、ハンクスの平衡塩類溶液（）ＩＢｓｓ）で３回洗浄し、Ｌ−グルタミン （２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）　、ストレプトマイシン（５０μｇ／ ｍｌ）　、および１０９６の熱不活化ヒトＡＢ血清を含有するＨＥＰＥＳ（１０ ｍＭ）を補充したＲＰＭ［１６４０培地中に懸濁させ、次し）で２４ウェルプレ ートに４ＸＩＯ’細胞／ウエルの量でプレートした。合成のペプチドを各々１０ μｇ／ｍｌで下記のようにし”Ｃ細胞培養物中に添加した。

すなわち、混合物ｌ、コア残基１−２０．２０−３４．２８−４７．５０−６９ ．７０−８９゜６１−８０　；混合物２、コア残基８２−１０１．１００−１１ ９．１２０−１３９．１４０−１５５゜１５５−１６９．１６９−１８３．混合 物３、プレーコア残基２０−コア残基２、コア残基５０−５９．１１７−１３１ ．１３１−１４５．　ｌ１ｌ−１２５；および混合物４、コア残基１１−２７． ９１−１１０．１４７−１６０．１６２−１７６である。刺激の第１週中に培養 物内でヘルパーＴ細胞の応答の利益をもたらすために、ｒｔ（ＢｃＡｇ（Ｂｉｏ ｇｅｎ社、スイス、ジエネバ）をｌμｇ／ｍｌで添加した。３日目に、ｌＯ％ヒ １−ＡＢ血清およびｒｌＬ２（最終濃度１０Ｕ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ　１ 　ｍｌを各ウェルに添加した。培養したＰＢＭＣを７日目にＣＴＬ活性について 試験し、次いで刺激中の第１週に用いたペプチド混合物に対して特異的なＣＴＬ 活性を示した短期ＣＴＬ系を下記のように再刺激によって膨張させた。

）ＩＢＶコア特異的ＣＴＬ系Ｉ（１は、最初、ペプチド混合物２　＋　ｒＨＢｃ Ａｇとともに培養し、週に１回、ＲＰＭＩ＋１．Ｏ％ヒトＡＢ血清、ｒｌＬ２　 （２０Ｕ／ｍｌ）およびペプチド混合物２中で放射線を照射された（３０００ｒ ａｄ）　５×１０５の自家ＰＢＭＣで再刺激しく第１回再刺激）または続く全刺 激にペプチド１４０〜１５５（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激することによって 、患者Ｈ，Ｐ、から生成した。ＣＴＬ系Ｅ４（患者Ｅ、　Ｗ、由来）および４名 の追加の患者（Ｖ、Ｔ、、　Ｈ，Ｆ、、　Ｑ、Ｍ、、　Ｃ，Ｎ、）由来のＣＴＬ 系を、ＰＢＭＣをペプチド１４０〜１５５　＋ｒＨＢｃＡｇて最初の１週間刺激 し、次いて１週間毎にペプチド１４０〜１５５とｒｌＬ２で再刺激することによ って樹立した。

正常な未感染の対照のＰＢＭＣは、これらの個体がｔｌＢｃＡｇに暴露されたこ とがなかったので、Ｔ細胞ヘルプの別の起源を与えるため、選択された例で、刺 激の最初の一週間は破傷風トキソイドをｒＨＢｃの代わりに用いることを除いて 同様に刺激した。

ＨＢＶ特異的ＣＴＬのクローンは、９６ウ工ル微量滴定プレート中１細胞／ウェ ルに希釈を限定することによって、ＨＢＶ特異的ＣＴＬ系Ｅ４（患者Ｅ、　Ｗ、 　）から生成させた。ＣＤ４＋該ＣＴＬ系由来のＴ細胞を、ＣＤ４特異的モノク ローナル抗体（米国、カリフォルニア州、マウンテン・ビュー、Ｂｅｃｔｏｎ　 Ｄｉｃｋｉ口ｓｏｎ社）十補体とともにインキュベートすることによって除去し た後、得られた細胞を、ＰＨＡ（ｊＪｉｇ／ｍｌ）　、ＣＤ３特異的モノクロー ナル抗体（０，５μｇ／ｍｌ米国、フロリダ州、ハイアリーア、Ｃｏｕｌｔｅｒ 　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ社）７、ｒｌＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）および放射線を 照射した（５０００ラド）同種異系ＰＢＭＣＩ０６／ウェルの存在下プレートし た。ＨＢＶ特異的クローンを、１０％の熱不活性化ＦＣＳおよび１１．２２０Ｕ ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ　１６４０培地中、ＨＢＶ−１ア領域（上記の）を発 現する１０５の放射線照射（７０００ラド）自家トランスフエクタントおよびｌ ウェル当り２Ｘ１０＠の同種異形の放射線照射（３０００ラド）　ＰＢＭＣ支持 細胞で、２４ウエルプレート中で再刺激した。

標的細胞系については、自家および同種異系のＥＢＶで形質転換されたＢリンホ ブライストイド細胞系（ＬＣＬ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙｆｏｒ 　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉ＋ｙおよび１ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ　ｉｃ ｓ社（米国、マサチューセッツ州、ボストン）から購入するか、または上記の患 者および正常な献血者のプールから樹立した。これらの細胞は１０％（ｖｏｌ／ ｖｏｌ）の熱不活性化ＦＣ３を含有するＲＰＭＩ中に保存した。自家ＰＢＭＣ芽 球の短期系は、標的細胞として使用する前に、ｌＯ％ＦＣ３、ＩＯＵ／ｍｌのｒ ｌＬ２を含有するＲＰＭＩ中でｌμｇ／ｍｌのＰＨＡで、末梢血液ＰＢＭＣを７ 日間刺激することによって製造した。

細胞障害性の検定は、ａ）ＰＨＡで刺激された自家芽球もしくは合成ペプチド（ ＩＯＩ１ｇ／ｍｌ）とともに−夜インキユベートした同種異形のＨＬＡ適合と非 適合のＢ−ＬＣＬ　、　ｂ　’）上記の安定なり−ＬＣＬ　トランスフエクタン ト、またはＣ）組換えワクシニアウィルスに感染させｌこＢ−ＬＣＬの標的細胞 を用いて行った。ワクシニアに感染した標的は、室温で１時間ロッキングプレー ト（ｒｏｃｋｉｎｇ　ｐｌａｔｅ）上で５０プラーク形成Ｕ／細胞でｌＸｌ０＠ の細胞に感染させ、続いて一回洗浄し、次いて一夜３７°Ｃでインキュベートす ることによって製造した。標的細胞は次いて１００μＣ１のＳ　Ｉ　Ｃｒで１時 間かけて標識つけ、ＨＢＳＳで３回洗浄した。細胞障害活性は、ｌウェル当り５ ０００の標的が入っているＵ形底９６ウエルプレートを用い、標準の４時間８１ Ｃｒ放出検定法で測定した。刺激されたＰＢＭＣは７０〜１００　：　１のＥＡ Ｔ比で試験し、一方ＨＢＶコア特異的ＣＴＬ系は４〜５０：ｌのＥＡＴ比て試験 し、正常な献血者のＰＢＭＣは６０：ｌのＥＡＴ比で刺激した。検定はすべて２ 回づつ行った。細胞障害性の百分率は、式：ｌ００Ｘ（（実測放出値−自然放出 値）／（最大放出値−自然放出値）〕からめた。最大放出値は界面活性剤（Ｉ％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ社）で標的を溶解することによってめた 。自然放出値は、すべての検定において最大放出値の２５％未満であった。

急性ＨＢＶ感染の２名の患者（Ｅ、　Ｗ、とＨ，Ｐ、　）由来のＰＢＭＣは、前 記のペプチド混合物で７日間刺激し、次いで、同じペプチド混合物もしくは媒体 でプレパルスされＳ　Ｉ　Ｃｒで標識を付けＰＨＡで活性化された自家の芽球に 対する細胞障害活性を試験した。応答は両方の患者に、混合物２に対して認めら れた（図６）。残りの細胞を第２の１週間ペプチド混合物２で再刺激を行い、そ の再刺激されたＣＴＬ系の抗原特異性を、該混合物内に含有されている個体のペ プチドでプレパルスされＰＨＡて活性化された自家の芽球標的で樹立した。この 方法によって、ペプチドＨＢｃＡｇ　Ｉ　４゜〜１，５は、両方の患者に対し混 合物２によって誘発されたＣＴＬ活性に対して応答可能であることを示した（図 ７）。ペプチドＨＢｃＡｇ　ｌ　４゜−１６，を供給された、自家Ｂ−ＬＣＬに 対するエフェクターとしての患者Ｅ、　Ｗ、の未刺激ＰＢＭＣを用いた場合、細 胞障害活性は全く認められなかった。このことは特異的ＣＴＬが、急性ＨＢＶ感 染中、末梢血液中に低頻度で存在していたことを示唆している。

また患者Ｈ，Ｐ、は、混合物４に対してＣＴＬ応答を示しく図６）、結局、コア 残基１１〜２７に対し特異的でかつＨＬＡ−Ａ２で制限されていることを示した 。このことは、同じウイルスタンノくり賃上に存在する非オーバーラツプＣＴＬ エピトープに対する多重の独立して制限されてし）るＣＴＬ応答は、急性ＨＢＶ 感染中、容易に検出できることを示した。

ＨＢＣＡｇ＋、ｏ−＋ｓｓ特異的ＣＴＬ系は、ＰＢＭＣを、混合物２または活性 成分ペプチド（コア残基１４０〜１５５）で毎週刺激することによって製造した 。系Ｅ４（患者Ｅ、　Ｗ、　）はｒＨＢｃＡｇとペプチドＨＢＣＡｇ＋ｉｏ−＋ ｓｓの存在下でスタートし；系Ｈ１（患者Ｈ，Ｐ、　）はｒＨＢｃと混合物２の 存在下でスタートした。４週間の再刺激を終ってから、ＣＴＬ系Ｈ１のＨＬＡク ラスＩ制限を、ＨＬＡクラスｌの遺伝子座においてエフェクター細胞と部分的に 適合しているかＨＬＡクラス■とは完全に非適合のシ）＜つ力１の同種異形標的 細胞を用いて試験した。その試験結果は、図８（こ示したが、そのＣＴＬ活性は ＨＬＡ−Ａｗ６８て制限されていたことを示して０る。

ＨＢＣＡｇ＋ａｏ−＋ｓｓ特異的ＣＴＬ系Ｅ４を、抗−ＣＤ３、ＰＨＡおよび支 持細胞としての同種異系ＰＢＬの存在下、１細胞／ウエルてクローンイヒした。

２〜３週間後、接種されたウェルの１５％か増殖を示し、次０でその増殖細胞集 団を、ＨＢｃＡｇ　１４゜〜１６．とともにプレインキュベ−１・した自家Ｂ　 −Ｌ　ＣＬの特異的溶解について試験した。高度に効率的ｆ、ｌ特異的細胞障害 活性を示した二つのクローン（３０１１，２Ｄ７）をさらに分ヰ斤するために選 択した。これらのクローンは、ＩＩＬＡのクラスＩとクラス■の対立遺伝子のレ ベルで、エフェクターと部分的（二適合した自家および同種異系の標的細胞に対 して試験した。クローン３ＤＩＩの細胞障害活性はＨＬＡ−Ａ３１て制限され、 そして同じ患者由来のクローン２Ｄ７の細胞障害活性はＨＬＡ−Ａｗ６８で制限 されていることが見出された（図９）。また両方のクローンは流動細胞計測法に よって、ＣＤ４−。

ＣＤＢ十表視表現型した。

これらの試験結果は、急性ＨＢＶ感染の４名の追加のＨＬＡ−Ａ３１もしくはＨ ＬＡ−Ａｗ６８陽性の患者（Ｈ，Ｆ、、　Ｖ、Ｔ、、　Ｑ、Ｍ、、　Ｃ，Ｎ、） 　（７）分析で確認され拡大された。これらの患者の全員に、ＨＢｃＡｇ　Ｉ　 ４゜−１８６特異的ＣＴＬ系が、系Ｅ４について記載したのと同様に生成した（ 表■）。部分的にＨＬＡに適合した同種異形標的細胞を用いて、ＣＴＬ応答が、 患者Ｖ、　Ｔ、てはＨＬＡ−Ａ３１対立遺伝子で制限されていることが分かり、 患者Ｑ、　Ｍ、では明らかにＨＬＡ−Ａｗ６８で制限されており、また患者Ｃ， Ｎ、では恐ら＜　Ａｗ６８て制限されているようであった。一方患者Ｈ，Ｆ、の 応答は非常に弱いため分析できなかった。

表■、急性ＨＢＶ感染（７）　ＨＬＡ−Ａ３１およびＨＬＡ−Ａｗ６８（７）患 者由来のＣＴＬ系のＨＢＣＡｇ＋４゜〜、。特異的ＣＴＬ応答標的 患者　ＨＬＡ適合　ＨＢｃＡｇＩ　４゜−３６，媒体〔％比溶解度（Ｓｐｅｃｉ ｆｉｃ　Ｌｙｓｉｓ））Ｖ、Ｔ、Ａ３１　７５　３４ Ｈ，Ｆ、ＡＬＬ　１０　１ Ｑ、Ｍ、Ａｗ６８　２３　０ ＰＢＭＣは）ＩＢＣＡｇ＋４ａ−＋ｓａ＋ｒＨＢＣＡｇ　（ｌ　ｕ　ｇ／ｍｌ） で刺激した。

ＨＢｃＡｇ　Ｉ　４゜−１６５特異的ＣＴＬ系とクローンの、内因的に合成され たＨＢｃＡｇを発現する標ｄ勺細胞を溶解する性能を測定した。二つのポリクロ ーナルＣＴＬ系（Ｅ４とＨｌ）および系Ｅ４由来の二つのクローン（３Ｄ１１と ２Ｄ７）を、予め、組換えワクシニアウィルスに感染させたか、または細胞によ るＨＢＶのコアとプレコアのタンパク質の合成を誘導するＥＢＶベースの発現ベ クターで安定してトランスフェクトした自家および同種異形の標的細胞を用いて 試験した。系Ｈ１は、組換えワクシニアウィルスで誘発され内因的に合成された コアタンパク質に対して試験し、そして系Ｅ４は両方の発現ベクターて誘発され 内因的に合成されたコアとプレコアのタンパク質に対して試験した（図１０）。

クローン３Ｄ１１と２０７は、組換えワクシニアウィルスによって誘発され内因 的に合成されたコアとプレコアのタンノくり質に対してのみ試験した（図１１） 。有意なレベルの比細胞障害活性（ｓｐｅｃｆｉｃ　ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ　ａｃ ｔｉｖｉｔｙ）がすべての場合に検出された（図１０とＩり。内因的に合成され た抗原が、ＨＢｃＡｇ　Ｉ　ａ。−３，６ペプチド特異的系とクローンによって 認識されるということは、コア配列１４０−１５５で表されるＣＴＬエピトープ が、内因的に合成されたＨＢＶのコアとプレコアのタンパク質の細胞内プロセシ ングによって生成し、およびこれらのＣＴＬがＨＢＶ感染中、生体内でプライム されることを示している。上記の後者の結論は、六つのＨＬＡ−Ａ３１陽性の正 常な未感染対照または四つの）ＩＬＡ−Ａｗ６８陽性の正常な未感染対照からＨ ＢＣＡｇ＋４゜−１，。

特異的ＣＴＬ系を樹立てきないことによって確認されている。

最小の最適に認識されＨＬＡ　Ａ３１とＨＬＡ　Ａｗ６８で制限されたエピトー プをＨＢＣＡｇ＋４ｏ−＋ｓｓ内で測定するために、ＨＢｃＡｇ　Ｉ　４゜−３ ６，のカルボキシ末端とアミノ末端を切取ったものを製造し、表■に示した。ク ローン３Ｄ１１はＨＬＡ　Ａ３１て制限され、そしてクロン２Ｄ７はＨＬＡ　Ａ ｗ６８で制限されているか、ＣＴＬ応答の微細な特異性を定義するのに使用され るエフェクター細胞であった。自家Ｂ−ＬＣＬは、前記の切取ったペプチドでブ レインキュベートして前記二つのクローンとともに標的として使用した。データ は、配列＋４１−１５１が、両方の制限要素に対する最小て最適に認識されたエ ピトープであることを示している。表■から、残基１５１　（Ａｒｇ）が、両方 のＣＴＬクローンによって認識されるエピトープのカルボキシ末端を形成し、一 方残基１５０はこれもアルギニンでありカルボキシ末端の残基として働くが、残 基１４１がアミノ末端として働く限り両方のクローンに対して効率が低いと考え られる。残基１４１　（Ｓｅｔ）は最適のアミノ末端残基のようであるが、デー タは、Ａｒｇ　１５１がカルボキシ末端残基の場合、残基１４２　（Ｔｈｒ）も 両方のクローンに対するエピトープのアミノ末端として働くことを示している。

それに対して、ペプチドのカルボキシ末端が残基１５１を越えて延びる場合、Ｈ ＬＡ−Ａｗ６８制限クローン（２Ｄ７）だけがＴｈｒ　１４２を利用てきる。

第■表：クローン３Ｄ１１及び２Ｄ７の細胞毒性活性の精密な特異性分析エピト ープの境界をより正確に定義するために、用量滴定分析を行なった。ここで２種 のＣＴＬクローンが、１ｏ−３μＭ〜１μＭの範囲の異なったモル濃度でペプチ ド１４０−１５１．１４１−１５０．１４１−１５１．１４１１５２、　１４２ −１５１と共にブレインキュベートされたアロジェニックＨＬＡ−Ａ３１及びＨ ＬＡ−Ａｗ６８陽性標的細胞と共にインキュベートされた。第１２図に示される ように、残基１４１−１５１は、両ＣＴＬクローンにより認識される最小の最適 に認識されたエピトープを表わす。１つの残基によるアミノ末端拡張は、いづれ かのクローンによる標的分解の効率に影響を及ぼさず、そしてカルボキシ末端で の１つのアミノ酸の付加は、ＨＬＡ　Ａ３１及びＡｗ６８制限クローンの両者に 対してＣＴＬ応答を１０倍減じ、これは、両ＨＬＡ対立遺伝子が、それらの対応 するＣＴＬに同じペプチドを結合し、そして向けることを示す。

例■ ＨＢＶポリメラーゼエピトープに対するＨＬＡ−制限ＣＴＬ応答この例は、急性 ウィルス肝炎を有する患者における２種の）ＩＢＶポリメラーゼペプチドに対す るＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬ応答の同定を記載する。

前記エピトープは、アミノ酸配列ｔｔＢｐｏｌ＊＋−ｇ＊　Ｃ配列番号９　）　 Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　 （ＧＬＹＳＳＴＶＰＶ）（また図においてはペプチド９２７．２１としても命名 される）及びＨＢｐＯｌｓｏｓ−＊＋＋　（配列番号１０）Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔ ｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｖａｌ　（ＳＬＹＡＤＳＰＳ ＶＸまた図においてはペプチド９２７．２７としても命名される）に存在する。

ＨＢｐｏｌペプチドにより誘発されたＣＴＬは、例■に示される方法に従って、 急性肝炎を有する患者からのＰＢＭＣに同定され、但し、ＰＭＢＣはペプチド混 合物よりもむしろ個々のペプチドにより刺激された。

次に、得られたＣＴＬ系及び／又はクローンを、前記ペプチドによりパルスされ た又はその対応する内因性ポリメラーゼ抗原（Ｖｐｏｌ又はＥＢＯ−ｐａｌ）を 発現する、ＨＬＡ−Ａ２適合標的細胞を殺す能力について試験した。ワクシニア に基づ＜　Ｖｐｏｌ及びＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｎｒウィルスに基づ＜　ＥＢＯ− ｐｏｌ構成体の構成法は例■に記載される通りであった。

第１３図に示されるように、両ペプチドＨＢｐｏ１＊。＄−１１１及びＨＢｐＯ １ｓ＋−ｓｓ刺激ＣＴＬは、ペプチドによりパルスされた標的細胞を用いて患者 （ＨＬＡ−Ａ２”　）において応答し、ところが他のペプチド９２７．２４（Ｗ ＩＩＲＧＴＳＦＲ）　及び９２７．３０（ＤＬＮＬＧＮＬＮＶ）及び媒体対照ハ 特異的ＣＴＬ応答を刺激しなかった。内因的に合成されたポリメラーゼ抗体（Ｖ ｐｏｌ及びＥＢＯ−ｐｏｌ、）を認識するＨＢＩ）ｏｌｍ。、−０１特異的クロ ーンの能力は第１４図に示される。Ｂｅ、　２７−ＩＡＩ及びＢｅ、　２７−Ｉ Ａ５と命名された２種のクローンか同定され、これらはｔｌＢｐｏｌ＊。、−０ ，ペプチドを認識した。第１５図に示されるように、ＨＢｐｏｌ。−０及びＨＢ ｐｏｌｓ。！−ａｌｌに対するＣＴＬ応答が相同ペプチドによりパルスされた標 的細胞により示されているか、しかしＨＢｐＯ１＋ｏｓ−＊ｚクローンのみが内 因的に合成されたＶｐｏｌ抗原に対する応答を示した。

例■ ＨＢＶ　Ｘタンパク質に対するＨＬＡ制限ＣＴＬ応答この例は、Ｉ’１ＢＶＸタ ンパク質に由来するペプチド配列に対する、急性ウィルス肝炎を有する患者にお けるＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬ応答の同定を記載する。ＣＴＬエピトープは、アミ ノ酸配列ＨＢＸＩ２＠−＋３４　Ｃ配列番号９　）　Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｒｇ− Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　（ＥＩＲＬＫＶＦＶＬ）の ペプチドに存在する。

ＨＢｐｏｌペプチドにより誘発されたＣＴＬは、例■に示される方法に従って、 急性肝炎を有する患者からのＰＢＭＣに同定され、但し、ＰＭＢＣはペプチド混 合物よりもむしろ個々のペプチドにより刺激された。

次に、得られたＣＴＬ系を、前記ペプチドによりパルスされた、ＨＬＡ−Ａ２適 合標的細胞を殺す能力について試験した。

第１６図に示されるように、ＣＴＬがｔ（Ｂｘペプチド＋２６−１３４により刺 激され、ここでアミノ末端残基がアラニン残基により置換された（Ｅ［ＲＬＫＶ ＦＶＬ　−Ａ［ＲＬＫＶＦＶＬ）　。相同ペプチドを認識しりＣＴＬハまた、野 生型配列を存するペプチドを認識した。他方、野生型ペプチドは、いづれかのペ プチドによりパルスされた細胞により検出できる特異的ＣＴＬ応答を誘発するこ とができなかった。

この例は、ＨＢＶエンベロープタンパク質に由来するペプチド配列に対する、急 性ウィルス肝炎を有する患者における１（ＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬ応答の同定を記 載する。ＣＴＬエピトープは、アミノ酸配列ＨＢｅｎＶ＊４ｓ−□７〔配列番号 １０）　Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ− ３ｅｒ−Ｖａｌ（サブタイプａＹｗＸＡｌａはサブタイプａｄｗにおいてＣ−末 端Ｖａｌと置換される）のペプチドに存在する。

ＨＢｅｎＶｓ４ｓ−ｓｓｔペプチドにより誘発されたＣＴＬは、例■に示される 方法に従って、急性肝炎を育する患者からのＰＢＭＣに同定され、但し、ＰＭＢ Ｃはペプチド混合物よりもむしろ個々のペプチドにより刺激された。次に、得ら れたＣＴＬ系を、ペプチドによりパルスされ、又はａｙｗ又はａｄｗサブタイプ の内因性エンベロープ抗原を発現する、ＨＬＡ−Ａ２適合標的細胞を殺す能力に ついて試験した。

第１７図に示されるように、ＨＢｅｎジペプチド３４８−３５７により刺激され たＣＴＬは、ペプチド（８８４，０１−ａｙｗと命名された）によりパルスされ た標的細胞（３・ｌのエフェクター：標的細胞比で）、及びａｙｗサブタイプの 内因性エンベロープ抗原に対して応答するが、しかしたぶん、カルボキシ末端の アミノ酸残基（ＡｌａがＶａｌと置換されている）における差異のために、ａｄ ｗサブタイプを認識しなかった。

前記例に記載される結果は、ヒトにおけるＨＢＶに対するＣＴＬ応答は、たぶん この重度のウィルス感染からの効果的な保護を付与するために、多価であるよう に思われる。さらに、データは、本発明で使用されるペプチド刺激法は、多価応 答の同定及び分析のために効果的且つ有効であることを示す。追加のＨＬＡ対立 遺伝子特異的結合も特性が同定されるので、それらの特性を含むＨＢＶ由来のペ プチドは、ＣＴＬ前駆体のインビトロ刺激のために使用され得る。

前記から、本発明の特定の態様が例示的目的のために本明細書に記載されて来た が、種々の変法が本発明の範囲内で行なわれ得ることは明らかであろう。

ＦＩＧ、２ｂ ＊′Ｈ娘（ロ）冨♀シ％ 刺激の週数 共有されるＨＬＡ対立遺伝子 ＦＩＧ、　４ ±ｔＮ鋭（ロ）筒軸％ 市ｔａｓ＜ｃ７ｅｗｂｂ％ ％特異的溶解率 ％特異的溶解率 ＦＩＧ、　７ −ｉ：フＷπ謎９茸♀城甘 ％特異的溶解率 ＦＩＧ、　１０ 市濁にγ口ｄ　ノつ四％ ［μＭ１ １μＭＩ ＦＩＧ、１２ 卦誓南叫％ 標的細胞処理 標的細胞処理 ＦＩＧ、　１５ 暑誓昧叫％ ＦＩＧ、　１７ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０７２１３ Ｚ　発明の名称 Ｂ型肝炎ウィルスに対する細胞障害性１９２８球の応答を誘発するペプチド類 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ザ　スクリップス　リサーチ　インスティテユート４、代理人 住所　〒１０５　東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号　静光虎ノ門ビル５、補正 命令の日付 １）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）２）図面 の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 ｌ）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文　各１通２）図面の翻訳文　１通 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、Ｓ Ｄ、　５Ｅ （７２）発明者　ペンナ、アマリア イタリー国、イー４３１００　パルマ、ビアコレリ、１

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．６〜２５個のアミノ酸を含んで成るＣＴＬ誘発性ペプチドであって、前記Ｃ ＴＬ誘発性ペプチドの少なくとも大多数のアミノ酸が、次の配列： １（ＨＢＣ１１−２７）〔配列番号２〕【配列があります】 を有する、ＨＢＣ１１−２７の対応する部分に対して相同であることを特徴とす るペプチド。
2. ２．ＩＩ（ＨＢＣ１９−２７）〔配列番号４〕【配列があります】 である請求の範囲第１項記載のペプチド。
3. ３．ＩＩＩ（ＨＢＣ１８−２７）〔配列番号５〕【配列があります】 である請求の範囲第１項記載のペプチド。
4. ４．Ｉ（ＨＢｃ１１−２７）〔配列番号２〕【配列があります】 である請求の範囲第１項記載のペプチド。
5. ５．前記ＣＴＬ応答が少なくともＨＬＡ−Ａ２に制限される請求の範囲第１項記 載のペプチド。
6. ６．６〜２５個のアミノ酸を含んで成るＣＴＬ誘発性ペプチドであって、前記Ｃ ＴＬ誘発性ペプチドの少なくとも大多数のアミノ酸が、次の配列： Ｖ（ＨＢｃ１４０−１５４）〔配列番号７〕【配列があります】 の対応する部分に対して相同であることを特徴とするペプチド。
7. ７．Ｖ（ＨＢＣ１４０−１５４）〔配列番号７〕【配列があります】 である請求の範囲第６項記載のペプチド。
8. ８．（ＨＢｃ１４１−１５１）〔配列番号〕【配列があります】 である請求の範囲第６項記載のペプチド。
9. ９．前記ＣＴＬ応答が少なくともＨＬＡ−Ａ３１に制限される請求の範囲第６項 記載のペプチド。
10. １０．前記ＣＴＬ応答が少なくともＨＬＡ−Ａ３１又はＨＬＡ−Ａｗ６８に制限 される請求の範囲第８項記載のペプチド。
11. １１．ＶＩ（ＨＢｃ２８−４７）〔配列番号８〕【配列があります】 である、Ｂ型肝炎ウイルスに対してＭＨＣクラスＩ−誘発性ＣＴＬ応答を誘発す るペプチド。
12. １２．６〜２５個のアミノ酸を含んで成るＣＴＬ誘発性ペプチドであって、前記 ＣＴＬ誘発性ペプチドの少なくとも大多数のアミノ酸が、次の配列： ＩＶ（ＨＢｃ１１１−１２５）〔配列番号６〕【配列があります】 を有する、ＨＢＣ１１１−１２５の対応する部分に対して相同であることを特徴 とするペプチド。
13. １３．ＩＶ（ＨＢｃ１１１−１２５）〔配列番号６〕【配列があります】 である請求の範囲第１２項記載のペプチド。
14. １４．６〜１７個のアミノ酸を含んで成るＣＴＬ誘発性ペプチドであって、前記 ＣＴＬ誘発性ペプチドの少なくとも大多数のアミノ酸が、次の配列： ＶＩＩ（ＨＢｐｏｌ６１−６９）〔配列番号９〕【配列があります】 を有する、ＨＢｃ６１−６９の対応する部分に対して相同であることを特徴とす るペプチド。
15. １５．ＶＩＩ（ＨＢｐｏｌ６１−６９）〔配列番号９〕【配列があります】 である請求の範囲第１４項記載のペプチド。
16. １６．６〜１７個のアミノ酸を含んで成るＣＴＬ誘発性ペプチドであって、前記 ＣＴＬ誘発性ペプチドの少なくとも大多数のアミノ酸が、次の配列： ＶＩＩＩ（ＨＢｐｏｌ１０３−８１１）〔配列番号１０〕【配列があります】 を有する、ＨＢｐｏｌ８０３−８１１の対応する部分に対して相同であることを 特徴とするペプチド。
17. １７．ＶＩＩＩ（ＨＢｐｏｌ８０３−８１１）〔配列番号１０〕【配列がありま す】 である請求の範囲第１６項記載のペプチド。
18. １８．６〜１７個のアミノ酸を含んで成るＣＴＬ誘発性ペプチドであって、前記 ＣＴＬ誘発性ペプチドの少なくとも大多数のアミノ酸が、次の配列： ＩＸ（ＨＢｘ１２６−１３４）〔配列番号９〕【配列があります】 を有する、ＨＢｘ１２６−１３４の対応する部分に対して相同であることを特徴 とするペプチド。
19. １９．ＩＸ（ＨＢｘ１２６−１３４）〔配列番号９〕【配列があります】 である請求の範囲第１８項記載のペプチド。
20. ２０．下記配列： Ｘ（ＨＢｅｎｖ３４８−３５７）〔配列番号１０〕【配列があります】 を有するＣＴＬ誘発性ペプチド。
21. ２１．異なった第２免疫原性ペプチドに連結される請求の範囲第１，３，６，８ ，１１，１２，１４，１６，１８又は２０項記載のペプチド。
22. ２２．前記第２免疫原性ペプチドがＢ型肝炎ウイルスに対して特異的な免疫応答 を誘発する請求の範囲第２１項記載のヘテロポリマー。
23. ２３．前記第２免疫原性ペプチドがＴ−ヘルパー細胞介在の応答を誘発する請求 の範囲第２２項記載のヘテロポリマー。
24. ２４．免疫原性脂質キャリヤーに接合される請求の範囲第１，３，６，８，１１ ，１２，１４，１６，１８又は２０項記載のペプチド。
25. ２５．前記脂質キャリヤーがヒトＴ−リンパ球応答を増強する請求の範囲第２４ 項記載のペプチドキャリヤー接合体。
26. ２６．前記脂質がリボタンパク質である請求の範囲第２５項記載のペプチドキャ リヤー接合体。
27. ２７．請求の範囲第１，３，６，８，１１，１２，１４，１６，１８又は２０項 記載のペプチド及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物。
28. ２８．前記キャリヤーがリボソームである請求の範囲第２７項記載の医薬組成物 。
29. ２９．Ｂ型肝炎感染の処理方法であって、請求の範囲第１，３，１４，１６，１ ８又は２０項記載のペプチドの有効量を、ＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプを有する感 染された宿主に投与することを含んで成る方法。
30. ３０．前記感染された宿主が慢性Ｂ型肝炎感染を有し、又はＢ型肝炎キャリヤー である請求の範囲第２９項記載の方法。
31. ３１．Ｂ型肝炎感染の処理方法であって、請求の範囲第６又は８項記載のペプチ ドの有効量を、ＨＬＡ−Ａ３１又はＨＬＡ−Ａｗ６８ハプロタイプを有する感染 された宿主に投与することを含んで成る方法。
32. ３２．前記宿主が慢性Ｂ型肝炎感染を有し、又はＢ型肝炎キャリヤーである請求 の範囲第３１項記載の方法。
33. ３３．Ｂ型肝炎感染の処理方法であって、請求の範囲第１１又は１２項記載のペ プチドの有効量を、感染された宿主に投与することを含んで成る方法。
34. ３４．非感染宿主において、Ｂ型肝炎ウイルスに対する細胞毒性Ｔリンパ球応答 を誘発するのに十分な量での請求の範囲第１，３，６，８，１１，１２，１４， １６，１８又は２０項記載のペプチド、及び生理学的に許容できるキャリヤーを 含んで成るＢ型肝炎ワクチン組成物。
35. ３５．アジュバントをさらに含んで成る請求の範囲第３４項記載のワクチン。
36. ３６．Ｂ型肝炎ウイルスに対する保護抗体応答を誘発するタンパク質をさらに含 んで成る請求の範囲第３５項記載のワクチン。
37. ３７．進行する慢性Ｂ型肝炎感染に対して敏感な個人を同定するための方法であ って： 請求の範囲第１，３，６，８，１１，１２，１４，１６，１８又は２０項記載の 及びＢ型肝炎ウイルスに対するＨＬＡクラスＩ−制限細胞毒性Ｔリンパ球応答を 誘発するＢ型肝炎ヌクレオカブシドペプチド抗原と共に対象の個人からのリンパ 単核細胞をインキュベートし；そしてそれから、抗原に対する細胞毒性Ｔリンパ 球応答を高める個人の能力及び従って、進行する慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染に対 する感応性を決定することを含んで成る方法。
38. ３８．前記リンパ単核細胞が末梢血液から得られる請求の範囲第３７項記載の方 法。
39. ３９．前記対象の個人が急性Ｂ型肝炎感染を有する請求の範囲第３８項記載の方 法。
40. ４０．請求の範囲第１，３，６，８，１１，１２，１４，１６，１８又は２０項 記載のペプチドであって、転写プロモーター、前記ペプチドをコードするＤＮＡ 配列及び転写ターミネーター、ここで個々は前記ペプチドの発現のために操作可 能的に連結されている、を含んで成るＤＮＡ構造体により発現されることを特徴 とするペプチド。