CN1452634A

CN1452634A - Hla结合肽及其用途

Info

Publication number: CN1452634A
Application number: CN00819410A
Authority: CN
Inventors: A·塞特; J·悉尼; W·M·卡斯特; S·索思伍德
Original assignee: Epimmune Inc
Current assignee: Epimmune Inc
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2003-10-29
Also published as: JP2003524016A; MXPA02008219A; EP1263775A1; BR0017136A; AU2000232427A1; WO2001062776A1; EP1263775A4; CA2400215A1

Abstract

本发明提供了选择免疫原性肽的手段和方法，以及能够特异性地与HLA等位基因编码的糖蛋白结合并在受该等位基因限制的T细胞中诱导T细胞活化的免疫原性肽组合物。这些肽能用于引起针对所需抗原的免疫应答。

Description

HLA结合肽及其用途

相关申请的参考

本发明申请为USSN 08/205,713(1994年3月4日递交)的部分继续申请。本申请还涉及USSN09/017,735、USSN08/753,622、USSN08/822,382、USSN60/013,980、USSN08/589,108、USSN08/454,033、USSN08/349,177、USSN08/073,205和USSN08/027,146。本发明申请还涉及USSN09/017,524、USSN08/821,739、USSN60/013,833、USSN08/758,409、USSN08/589,107、USSN08/451,913以及USSN08/347,610、USSN08/186,266、USSN08/159,339、USSN09/116,061、USSN08/103,396、USSN08/027,746和USSN07/926,666。本发明申请还涉及USSN09/017,743、USSN08/753,615、USSN08/590,298、USSN08/452,843、USSN09/115,400、USSN08/344,824和USSN08/278,634。本发明申请还涉及USSN08/197,484和USSN08/815,396。本文将上述各项申请全部纳入作为参考。

发明背景

本发明涉及用于预防、治疗或诊断多种病理状况如，病毒性疾病和癌症的组合物和方法。特别是，本发明提供了能与选定的主组织相容性复合基因(MHC)分子结合并诱导免疫应答的一些新颖的肽。

MHC分子可分为I类或II类分子。II类MHC分子主要在参与引发和维持免疫应答的细胞(如T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等)上表达。II类MHC分子可被辅助(helper)T淋巴细胞识别，并可诱导辅助T淋巴细胞的增殖和放大对该特异的免疫原性肽的免疫反应。I类MHC分子在几乎所有的有核细胞中都可表达，并可被各种细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别，后者再摧毁带有抗原的细胞。CTL类在排斥肿瘤和对抗病毒感染方面尤为重要。

CTL识别抗原的方式是通过结合于I类MHC分子的肽片段，而不是其本身直接接触外来抗原。抗原通常必须是由细胞内源性合成的、而且一部分蛋白质抗原在细胞质中被降解成小的肽片段。这种小型肽片段有的被转移至前-高尔基分隔内并与I类重链发生作用，以便形成专门的折叠，并和亚单位β2微球蛋白相连。接着肽-I类MHC分子复合物被传送至细胞表面，以供表达并可能被特定的CTL识别。

对人的I类MHC分子HLA-A2.1的晶体结构的研究表明，通过I类重链的α1和α2区域的折叠产生了肽结合槽(groove)(Bjorkman等人， Nature 329：506(1987))。然而，在这些研究中尚未确定与该槽结合的肽的同一性。

Buus等人( Science 242：1065(1988))首先描述了从MHC将结合的肽洗脱的酸洗脱法。随后，Rammensee及其同仁(Falk等人， Nature 351：290(1991))开发了一种对天然加工的与I类分子结合的肽的鉴定方法。其他一些研究者利用质谱仪法对从B型(Jardetzky等人，Nature 353：326(1991))和A2.1型(Hunt等人，Science 225：1261(1992))的I类分子洗脱的肽的常规自动测序法，对各种HPLC组分中较丰富的肽成功地实现了直接的氨基酸测序。Rotzschke和Falk已对I类MHC中天然加工的肽的特性作了综述(Rotzschke和Falk， Immuno1.Today12：447(1991))。

Sette等人( Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3296(1989))证明：MHC等位基因的特异性基序能用来预测MHC的结合能力。Schaeffer等人(Proc.Natl.Acad.SciUSA 86：4649(1989))证明，MHC的结合作用与免疫原性相关。另几个作者(DeBruijn等人， Eur.J.Immunol.，21：2963-2970(1991)；Pamer等人，991 Nature 353：852-955(1991))已提供了有关I类的结合基序在动物模型中能用于鉴别潜在的免疫原性肽的初步证据。但对某给定的I类同型的一些人的等位基因特异的I类基序还有待加以描述。最好是这些不同的等位基因的结合频率足够高，以至能覆盖相当大一部分或几乎是大多数远系婚配人群。

尽管在本领域中已有所进展，但是此前还没有在这些研究的基础上开发出有用的基于人体肽的疫苗或治疗剂。而本发明提供了这些和其他方面的好处。

发明概述

本发明提供了含有携带HLA-A2.1分子的结合基序的免疫原性肽的组合物。结合于适当的MHC等位基因的免疫原性肽最好是长度为9-10个残基，并且在某些位置上有保守性的残基，比如，在2位和9位上。此外，该肽在其他位置上，比如，当肽长为9个氨基酸时在1，3，6，和/或7位；当肽长为10个氨基酸时在1，3，4，5，7，8，和/或9位上，则不含有如本文所述的起负结合作用的结合残基。本发明限定了基本模式中的位置，从而能够选择那些能与HLA A2.1有效结合的肽。

本发明的基序包括9个氨基酸的肽，其在N-端的第二位置上包含第一个保守的残基(选自I、V、A和T)，和在C端上包含第二个保守的残基(选自V、L、I、A和M)。此外，该肽还可能在N端的第二位点包含第一个保守的残基(选自L、M、I、V、A和T)；且在C端包含第二个保守的残基(选自A和M)。如果该肽包含10个残基，则其在N端的第二位点包含第一个保守的残基(选自L、M、I、V、A和T)；且在C端位置包含第二个保守的残基(选自V、I、L、A和M)；其中第一与第二个保守的残基间距7个残基。

用本发明的肽能鉴别出若干免疫原性靶蛋白质上的表位。适当的抗原的例子包括，前列腺癌特异性抗原(PSA)，前列腺特异性膜抗原(PSM)，乙型肝炎病毒髓芯及表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，I型人类免疫缺陷病毒(HIV1)，皮肤多发性生血性肉瘤疱疹病毒(KSHV)，人乳头瘤病毒(HPV)抗原，拉萨热病毒、结核分枝杆菌(MT)，p53和鼠p53(mp53)，CEA，锥虫表面抗原(TSA)，酪氨酸酶相关蛋白质(TRP)家族的成员和Her2/neu。因此，这些肽对在活体内和在活体外用于治疗和诊断的各种药物组合物是有用的。

本发明还提供了包含具有可供I类MHC分子结合的一些基序的免疫原性肽的组合物。通常这种免疫原性肽的长度为约8-11个残基之间，且包含参与与由适当MHC等位基因编码的蛋白质相结合的保守性残基。已确定了若干等位基因特异性基序。

例如，HLA-A3.2的基序，从N端到C端，在2位包含L、M、I、V、S、A、T和F的第一个保守的残基，在C端包含K、R或Y的第二个保守的残基。另外第一个保守的残基是C、G或D或E。其它第二个保守的残基是E或F。第一个和第二个保守的残基宜间隔6-7个残基。

为HLA-A1提供的基序从N端到C端包含第一个保守的残基是T、S或M，第二个保守的残基是D或E和第三个保守的残基是Y。其它第二个保守的残基是A、S或T。第一个和第二个保守的残基相邻接，且宜与第三个保守的残基间隔6-7个残基。第二个基序包含的第一个保守的残基是E或D和第二个保守的残基是Y，其中第一和第二个保守的残基间隔5-6个残基。

供HLA-A11的基序，从N端到C端包含：在第2位的第一个保守的残基是T、V、M、L、I、S、A、G、N、C、D或F，和K、R、C端的保守的残基是Y或H。第一和第二个保守的残基宜间隔6-7个残基。

供HLA-A24.1的基序，从N端到C端包含：在第2位的第一个保守的残基是Y、F或W和C端保守的残基是F、I、W、M或L。第一和第二个保守的残基宜间隔6-7个残基。

可用这种方式鉴定若干潜在的目标蛋白质的表位。适合的抗原实例包括，前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺特异性膜抗原(PSM)，乙型肝炎病毒髓核芯及表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，恶性黑色素瘤抗原(MAGE-1)，EB病毒抗原，I型人类免疫缺陷病毒(HIV1)，乳头瘤病毒抗原，拉萨热病毒、结核分枝杆菌(MT)，p53和鼠p53(mp53)，CEA和Her2/neu，以及酪氨酸酶相关蛋白质(TRP)家族的成员。因此，这些肽可用作在活体内和在活体外治疗和诊断应用的药物组合物。

本发明还提供了包含具有可供各种非-A HLA等位基因结合的一些基序的免疫原性肽的组合物。这种免疫原性肽的长度较佳地为约9-10个残基，且在有些位置包含保守的残基，如在2位的脯氨酸和在羧基端的芳族残基(如Y、W、F)或疏水性残基(如L、I、V、M或A)。特别是，本发明的肽的一个优点是它们能结合于两种或多种不同的HLA等位基因。

可用这种方式鉴定若干潜在目标蛋白质的表位。适合的抗原实例包括，前列腺特异性抗原(PSA)，乙型肝炎病毒髓核芯及表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，恶性黑色素瘤抗原(MAGE-1)，EB病毒抗原，I型人类免疫缺陷病毒(HIV1)，乳头瘤病毒抗原，拉萨热病毒、结核分枝杆菌(MT)，p53，CEA和Her2/neu。因此，这些肽可用作在活体内和在活体外治疗和诊断应用的药物组合物。

定义

术语“肽”与“寡肽”在本说明书中可互换使用，指一系列互相连接的残基，通常为L-氨基酸，通常是通过相邻氨基酸的各α-氨基与羧基之间的肽键相互相连。本发明的寡肽的长度小于约15个残基，通常为约8-11个残基，最好为9或10个残基。

“免疫原(性)肽”是含有等位基因特异性基序的肽，从而该肽会与MHC分子结合并诱导CTL应答。本发明的免疫原性肽能结合适当的HLA-A2.1分子并诱导细胞毒性T细胞对产生免疫原性肽的抗原的应答反应。

用本发明的算法能方便地鉴别出各种免疫原性肽。该算法是一套数学程序，以产生能用于选择各种免疫原性肽的评分标准。通常，人们是将“结合阀”与该算法评分标准一起使用，从而能够选择出具有一定亲和力的高结合概率的，并因此产生免疫原性的肽。该算法或是以MHC可与含肽的基序的特定位点上的特定氨基酸相结合的效应为基础，或中以可与该基序上的特定替代物相结合的效应为基础。

“保守性残基”是指在某肽的特定位点上以远大于预期随机分布的频率存在的氨基酸。保守的残基一般是在MHC结构上可为免疫原性肽提供接触点的一个残基。限定在位免疫原性肽的一个基序上的限定长度的肽内至少有1-3个或更多，保守的残基宜为2个。这些残基通常紧密接触与肽相结合的槽(groove)，以其关于侧链埋在槽(groove)的特异包(pocket)中。免疫原肽一般最多具有3个保守的残基，更常见的是2个保守的残基。

本文所用的“负结合性残基”是指如果存在于一定位点(如，九聚物的1，3，和/或7位)上时会导致肽不能结合(非结合物)或结合性差(差的结合物)，从而不能产生免疫原性，即不能诱导CTL应答的一些氨基酸。

术语“基序”是指在限定长度(通常为约8-11个氨基酸)的肽上的能被特定的MHC等位基因识别的残基基本模式。对于每个人的MHC等位基因的肽基序一般都不相同，而且在各高度保守的残基和各负性残基的模式上都有差别。

供等位基因结合的基序能越来越准确地加以限定。在一种情况下，所有的保守残基都位于肽上的正确位点，而且在位点1，3和/或7上没有负作用残基。

词语“分离的”或“生物学纯的”是指物质大致或基本上不含有那些在原生状态下常与其伴随的成分的材料。因此，本发明的肽不含有在其原生环境中通常与其相伴的物质，如含有抗原的细胞上的各种MHC I分子。即使在蛋白质已被分离成均质的或主要条带的情况下，但仍有5-10％的原生蛋白质等痕量污染物与所需蛋白质一起被纯化。本发明的分离的肽都不含有这种内源性的一起纯化的蛋白质。

术语“残基”指通过酰胺键或拟酰胺键掺入寡肽的氨基酸或模拟氨基酸。

优选例子的描述

I.HLA-A2.1基序

本发明涉及确定对人I类MHC(有时也可称为HLA)各等位基因亚型提供的各种等位基因特异性的肽基序，尤其是，能被HLA-A2.1各等位基因识别的各种肽基序。这些基序以后就可被用于对来自任何所期望的抗原的T细胞表位进行定义，尤其是那些与人的病毒性疾病、癌症或自体免疫疾病(对于这些疾病的各种潜在的抗原靶或自体抗原靶的氨基酸序列都已经知道)相关的表位。

位于一些潜在的靶蛋白质上的表位都能用这种方式鉴别。合适的抗原的例子包括，前列腺特异性抗原(PSA)，乙型肝炎病毒髓芯和表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，黑色素瘤抗原(如，MAGE-1)，人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原，人乳头瘤病毒(HPV)抗原，拉萨热病毒，结核分枝杆菌(MT)，p53，CEA，锥虫表面抗原(TSA)和Her2/neu。

含有来自这些抗原的表位的肽已被合成，并已在一系列试验中测试它们与适当的MHC分子结合的能力，其中使用例如，纯化的I类分子和放射性碘标记的肽和/或表达空白I类分子的细胞，并通过例如，免疫萤光染色法和流式显微萤光分析法，肽依赖性I类集合试验法(assembly assays)以及利用肽竞争作用而抑制CTL的识别能力。对于那些与I类分子结合的肽进一步评估了其作为感染的或免疫过的个体产生的CTL的靶目标的能力，以及它们作为潜在治疗剂在活体外或在活体内诱导原发性CTL应答的能力，这种CTL应答能导致能与病毒感染性靶细胞或肿瘤细胞发生反应的CTL群的增加。

MHC I类抗原由HLA-A、B和C位点编码。HLA-A和B抗原以大致相同密度在细胞表面表达，而HLA-C的表达则低得多(也许可低10倍之多)。这些位点的每一个都具有若干等位基因。本发明的各种肽结合基序对于每种等位基因亚型都具有相对特异性。

对于肽基疫苗，本发明的肽最好具有能被在人群中广泛分布的一种MHCI类分子识别的基序。因为在不同的人种和亚种中，MHC等位基因发生的频率不同，所以对靶MHC等位基因的选择取决于选定的靶人群。表1显示了在不同的人亚种中位于一些HLA-A位点产物的各种等位基因的频率。例如，大部分白种人群可以被与四种HLA-A等位基因亚型(具体指HLA-A2.1，A1，A3.2，和A24.1)结合的肽所覆盖。同样，大部分亚洲人群则还可以加上与第五种等位基因HLA-A11.2结合的肽就可概括。

表1A等位基因/亚型 N(69)^* A(54) C(502)

A1 10.1(7) 1.8(1) 27.4(138)

A2.1 11.5(8) 37.0(20) 39.8(199)

A2.2 10.1(7) 0 3.3(17)

A2.3 1.4(1) 5.5(3) 0.8(4)

A2.4 - - -

A2.5 - - -

A3.1 1.4(1) 0 0.2(0)

A3.2 5.7(4) 5.5(3) 21.5(108)

A11.1 0 5.5(3) 0

A11.2 5.7(4) 31.4(17) 8.7(44)

A11.3 0 3.7(2) 0

A23 4.3(3) - 3.9(20)

A24 2.9(2) 27.7(15) 15.3(77)

A24.2 - - -

A24.3 - - -

A25 1.4(1) - 6.9(35)

A26.1 4.3(3) 9.2(5) 5.9(30)

A26.2 7.2(5) - 1.0(5)

A26V - 3.7(2) -

A28.1 10.1(7) - 1.6(8)

A28.2 1.4(1) - 7.5(38)

A29.1 1.4(1) - 1.4(7)

A29.2 10.1(7) 1.8(1) 5.3(27)

A30.1 8.6(6) - 4.9(25)

A30.2 1.4(1) - 0.2(1)

A30.3 7.2(5) - 3.9(20)

A31 4.3(3) 7.4(4) 6.9(35)

A32 2.8(2) - 7.1(36)

Aw33.1 8.6(6) - 2.5(13)

Aw33.2 2.8(2) 16.6(9) 1.2(6)

Aw34.1 1.4(1) - -

Aw34.2 14.5(10) - 0.8(4)

Aw36 5.9(4) -

表中数据得自B.DuPont，“HLA的免疫学”，第I卷，Histocompatibility Testing 1987，Springer-Verlag，New York 1989。

^*N＝黑种人；A＝亚洲人；C＝白种人。括号内的数字为列入分析的人数。

用于描述各种肽化合物的术语按照惯例，其中在每个氨基酸残基的左侧(N-端)是氨基，而在右侧(C-端)是羧基。在表示选定的本发明的一些特殊例子的式子中，尽管没有特别标出)其氨基端和羧基端基团假定都处于生理pH值范围的形式(除非另加说明)。在氨基酸结构式中，各残基通常用标准的三字符或单字符表示。L型的氨基酸残基用大写的单个字母或第一个字母大写的三字母符号表示。D型的氨基酸的D型残基用小写的单个字母或小写的三字符表示。甘氨酸没有不对称碳原子，则直接用“Gly”或“G”表示。

用于鉴别本发明的肽的程序，一般按照Falk等人，Nature 351：290(1991)公开的方法(本文将其纳入作为参考)。简言之，该方法包括从适当的细胞或细胞系中，一般是通过免疫沉淀法或亲和层析法，大规模分离MHC I类分子。本领域技术人员普遍熟知的用于分离所需的MHC分子的其他方法的例子包括，离子交换层析法，外源凝集素层析法，分子大小分离法，高效液相色谱法，以及所有上述技术的组合形式。

在典型情况下，是用免疫沉淀法分离所需的等位基因。可以依据使用的抗体的特异性而采用几种技术方案。例如，对于HLA-A，HLA-B1和HLA-C分子的亲和纯化处理，可以使用等位基因特异性单克隆抗体(mAb)试剂。已有数种用于分离HLA-A分子的mAb试剂。单克隆BB7.2适用于分离HLA-A2分子。利用标准技术用这种mAb制备的亲和层析柱可以成功地分别纯化各HLA-A等位基因产物。

除了各种等位基因特异性mAb，可以在上述申请所述的另外的各种亲和纯化处理方案中使用具有广泛反应性的各种抗-HLA-A、B、C mAb，例如W6/32和一种B9.12.1，和抗-HLA-B、C mAb，B1.23.2。

一般可使用酸处理来洗脱结合于分离的MHC分子的肽结合槽上的肽。还可用各种标准的变性方法使肽与I类分子解离，例如通过热、pH、洗涤剂、盐类、离液序列高的试剂或其组合。

再用反相高效液相色谱法(HPLC)可将肽部分与MHC分子分开，并测序。可以用技术人员熟知的其他各种标准方法分离肽，其中包括过滤法，超滤法，电泳法，分子大小分离色谱法，用特异性抗体沉淀法，离子交换层析法，等电聚焦法等。

可以用标准方法对分离的肽进行测序，例如，用Edman降解法(Hunkapiller，M.W等人，Method Enzymol 91，399(1983))。其他适用于测序的方法包括，上述的对个别肽的质谱分析法测序法(Hunt等人，Science 225：1261(1992))，本文将其纳入作为参考)。对来自不同的I类分子的大量异源肽(如混合的HPLC组分)的氨基酸测序，表明各种I类等位基因都各有特征性的序列基序。

确定了不同的I类等位基因特异性基序，就能够鉴别已知氨基酸序列的抗原蛋白质的潜在的肽表位。潜在的肽表位的鉴别，一般是先使用计算机对所需的抗原的氨基酸序列进行扫描，以确定是否存在基序。然后合成表位序列。并用各种不同方法测量结合MHC I类分子的能力。一种方法是，在上述的相关申请中描述的I类分子结合试验法。其他在文献中描述过的方法包括：抗原表现抑制法(Sette等人，J.Immunol.141：3893(1991))，在活体外装配试验法(Townsend等人，Cell 62：285(1990))，和使用突变细胞如RMA.S的基于FACS的试验法(Melief等人，Eur.J.Imminol.21：2963(1991))。

接着，对在I类MHC结合试验中呈阳性的肽测试其在活体外诱导特异性CTL应答的能力。例如，对已和某肽一起培育的表现抗原的细胞，可测试其诱导各种应答细胞群中的CTL应答的能力。表现抗原的细胞可以是正常细胞(如，外周血单核细胞)或树突细胞)(Inaba等人，J.Exp.Med.166：182(1987)；Boog，Eur.J.Immunol 18：219(1988))。

或者，可以按常规使用的各种突变性哺乳动物细胞系(在负载带有内源加工的肽的能力方面有缺陷I类分子)，比如小鼠细胞系RMA-S(Karre等人，Nature319：675(1986)；Ljunggren等人，Eur.J.Immunol.21：2963-2970(1991))，和人的体细胞T细胞杂交细胞，T-2(Cerundolo等人，Nature 345：449-452(1990))以及已用适当的人I类基因转染的细胞，当向它们加入肽时，测试该肽在活体外诱导初级CTL应答的能力。其他可供使用的真核生物细胞系包括：各种昆虫细胞系如，蚊幼虫(各种ATCC细胞系CCL125，126，1660，1591，6585，6586)，蚕(ATCCCRL8851)，黏虫(ATCC CRL1711)，蛾(ATCC CCL80)，和果蝇属细胞系如Schneider细胞系(参见Schneider J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-356(1927))。

在对正常供血者或病人进行简易的静脉穿刺或白细胞提取法之后，很容易分离出外周血淋巴细胞，用作CTL前体的应答细胞源。在一个例子中，将适当的表现抗原的细胞与10-100uM的肽在无血清培养基中以适宜的培养条件孵育4小时。然后将负载肽的表现抗原的细胞于最优化培养条件下与应答细胞群进行活体外孵育7-10天。测试培养物中是否存在能杀死放射标记的靶细胞的CTL，就可确定阳性的CTL激活作用，其中的靶细胞包括各种特异性的受肽脉冲调节的(peptide-pulsed)靶以及表达相关病毒或肿瘤抗原(肽序列来自这些抗原)的内源加工形式的各种靶细胞。

通过对表达适当或不适当的人I类MHC分子的不同的肽的靶细胞进行测试，就可确定CTL的特异性和MHC限制性。在MHC结合试验中呈阳性并导致特异性CTL应答的肽，在此处被称为免疫原性肽。

免疫原性肽可以用合成法或重组DNA技术制备，或从天然原料如完整的病毒或肿瘤中制备。尽管肽最好基本上不含其他天然存在的宿主细胞的蛋白质或其片段，但在某些实施例中肽可以通过合成而与原生的片段或粒子相结合。

多肽或肽都可以有各种长度，或以中性(不带电荷)形式或以盐形式存在，或者不经修饰(如糖基化，侧链氧化或磷酸化)或者经过这类修饰而如此处所述的该修饰并不破坏该多肽生物活性的情况。

理想的是，肽应尽可能小同时仍能维持大肽的基本上所有生物活性。若在可能条件下，本发明优化的肽的理想长度为约9或10个氨基酸残基，这在大小上相当于在细胞表面上结合于I类MHC分子的内源性加工的病毒肽或肿瘤细胞肽的长度。

具有所需活性的肽可以按需要进行修饰，以提供某些需要的特性，如，改进药理学特性，并同时提高或至少基本保守未修饰的肽结合于所需的MHC分子并激活适当T细胞的全部生物活性。例如，肽可以经过各种改变，比如，保守性或不保守性的替代作用，这些改变在使用上可能会提供某些好处，比如改进MHC的结合。保守性替代是指一个氨基酸残基被另一个在生物学和/或化学上相似的氨基酸残基替代，如，用憎水性残基替代另一个憎水性残基，或用极性残基替代另一个极性残基。替代作用包括某些组合形式如，Gly，Ala；Val，Ile，Leu，Met；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。单一氨基酸替代的效果也可以使用D-氨基酸类进行探测。这些修饰可以利用公知的肽合成方法进行，比如在本文引用作为参考的下列文献中描述的方法例如：Merrifield，Science 232：341-347(1986)，Barany和Merrifield，“肽”，Gross and Meienhofer编辑(N.Y.，Academic Press)，第1-284页(1979)；和Stewart和Yong，“固相肽的合成”，(Rockford，I11.，Pierce)，第2版(1984)。

还可以通过延长或缩短化合物的氨基酸序列来修饰肽，例如通过增加或删去一些氨基酸。本发明的肽或类似物还可以通过改变某些残基的顺序或组合而加以修饰，这很容易理解，某些在生物活性方面必须的氨基酸残基，比如，位于关键接触位点的残基或保守的残基，通常就不会改变而不致对生物活性产生有害影响。非关键性氨基酸不一定局限于那些天然存在于蛋白质的种类如，各种L-α-氨基酸或其D-异构体，但可包括非天然性氨基酸，如，各种β-γ-δ-氨基酸，以及许多L-α-氨基酸类的衍生物。

一般可用一系列具有单一氨基酸替代的肽来确定静电电荷、憎水性等对结合的影响。例如，沿肽的长度方向有一系列带正电荷(如Lys或Arg)或负电荷(如Glu)的氨基酸替代物，表明对各种MHC分子和T细胞受体的敏感度模式都不同。此外，可以使用小而相对中性的分子部分如，Ala，Gly，Pro或类似的残基进行多重替代，这类替代物可以是同种寡聚物或异种寡聚物。用于替代或添加的残基的数目和类型，取决于关键接触点间所必须的间隔以及某些所想要达到的功能特性(如憎水性/亲水性)。与亲本肽的亲和力相比，也可以通过这样的替代来实现，提高对MHC分子或T细胞受体的结合亲和力。无论如何，这种替代应采用那些选定的氨基酸残基或其他分子片段，以避免例如，可能会破坏结合的空间或电荷方面的干扰。

氨基酸替代一般都是单个残基。可以通过替代、缺失、插入的综合或其任何组合以获得最终的肽。各种替代性突变体是肽的至少一个残基被去除，并且在该位置上插入一个不同的残基的突变类型。当需要精细地调节肽的特性时，通常可以根据下列表2进行这类替代。

表2

原来的残基替代示例

Ala Ser

Arg Lys，His

Asn Gln

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Lys；Arg

Ile Leu；Val

Leu Ile；Val

Lys Arg；His

Met Leu；Ile

Phe Tyr；Trp

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr；Phe

Tyr Trp；Phe

Val Ile；Leu

Pro Gly

获得功能上的重大改变(如对MHC分子或T细胞受体的亲和力)是通过选择那些比表2中列出的较少保守的替代分子，即通过选择在对维持下列各方面的效果差别更大得多的残基：(a)在替代区域的肽主干的结构，如，片状或螺旋构象，(b)靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。通常，预期肽的特性会产生最大改变的替代物是(a)亲水性残基(如丝氨酰基)与憎水性残基(如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)相互替代；(b)具有正电荷侧链的残基(如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)与具有负电荷的残基(如谷氨酰基，天门冬氨酰基)相互替代；或(c)侧链体积大的残基(如苯丙氨酰基)与没有侧链的残基(如甘氨酰基)相互替代。

肽还可以包括免疫原性肽中两个或多个残基的等配物。如此文所定义的一个等配物是二个或多个残基的某个序列，它可替代第二序列，因为第一序列的立体构象与第二序列的特异性结合点相适配。该术语特别包括本领域技术人员熟知的肽主干的一些修饰物。这类修饰物包括，酰胺氮原子、α-碳原子、酰胺羰基的修饰、酰胺键的完全替换、缺失、延伸或主干交联。一般可参见，Spatola，“氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学”，第VII卷(Weinstein编辑，1983)。

含各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸的肽的修饰在提高肽在活体内的稳定性方面特别有效。稳定性可用多种方法测定。例如，可使用各种肽酶和各种生物性介质如人血浆和血清来测试其稳定性。参见，例如，Verhoef等人，Eur.J.Drug Metab Pharmacokin.11：291-302(1986)。本发明的肽的半衰期可用25％人血清(V/V)试验方便地加以测定。该方案通常如下所述。在使用前将混合的人血清(AB型，来加热灭活)经离心脱脂。接着用RPMI组织培养基将血清稀释至25％，用其测试肽的稳定性。按预定的时间间隔取出少量反应溶液，加入6％三氯乙酸水溶液或乙醇。将混浊的反应样品在4℃冷却15分钟，再离心使已沉淀的血清蛋白质集聚成块。再通过反相HPLC使用稳定性-特异性的色谱条件，确定肽的存在与否。

本发明的具有CTL激活活性的肽或其类似物，可以经修饰而提供除了改进血清半衰期之外的各种所需的性能。例如，通过与含有至少一个能诱导T辅助细胞应答的表位的序列相连接，可以提高肽诱导CTL活性的能力。特别优选的是免疫原性肽/T辅助细胞结合物通过间隔分子相连。间隔分子一般包括较小的中性分子，如氨基酸或氨基酸类似物，它们在生理条件下基本上不带电荷。间隔分子一般可选自：如Ala，Gly或其他非极性氨基酸或中性极性氨基酸的中性间隔分子。应理解，可优选地存在的间隔分子不一定含有相同的残基，因而可以是异种低聚物或同种低聚物。当间隔分子存在时，通常至少含1个或2个残基，更常见含3-6个残基。或者，CTL肽也可以不用间隔分子而连于T辅助细胞肽。

免疫原性肽可以直接或通过间隔分子在CTL肽的氨基端或羧基端连于T辅助肽。免疫原性肽或T辅助肽的氨基端可以是酰基化的。示例性T辅助肽包括破伤风类毒素830-843，流感307-319，疟疾环状子孢子体382-298和378-389。

在一些实施例中，在本发明的药物组合物中最好是含有至少一种引发CTL的成分。经鉴别，脂质类能作为在活体内引发CTL抗病毒抗原的制剂。例如，棕榈酸残基可附着于Lys残基的α和ε氨基，然后例如再通过一个或多个连接残基如Gly，Gly-Gly，Ser，Ser-Ser等而与免疫原性肽相连接。该脂质化的肽就可以直接以胶粒形式用于掺入脂质体或在佐剂(如不完全的Freund佐剂)中乳化而注射。在一个优选实例中，特别有效的免疫原含有附着于Lys的α和ε氨基团的棕榈酸，它再通过如Ser-Ser的方式连接于免疫原性肽的氨基端。

作为脂质引发CTL应答的另一例子，是大肠杆菌的脂蛋白类(如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P₃CSS))，可用于在共价附着于适当的肽时引发病毒特异性CTL。参见Deres等人，Nature，342：561-564(1989)，本文将其纳入作为参考。本发明的肽能连接于例如P₃CSS，然后该脂质化肽可以施用于人体以特异性地引发对靶抗原的CTL应答。此外，因为连接于显示适当表位的肽的P₃CSS还可以引发产生中和性抗体，所以该两种组合物可以结合使用以更有效地对感染引发体液和细胞介导性应答。

此外，可以在肽的各种个经端添加额外的氨基酸类，从而使肽容易互相连接，或可连接于支承载体或更大的肽，或可修饰肽或寡肽等的物理或化学性能等。可将诸如酪氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，谷氨酸或天门冬氨酸之类的氨基酸引入肽或寡肽的C-或N-端。某些情况下在C端的修饰会改变肽的结合性能。此外，可使肽或寡肽的各序列与天然序列不同，例如使末端-NH₂酰化，如通过烷酰基(C₁-C₂₀)或巯基形式乙醇酰基化作用或使末端羧基酰胺化如用氨或甲基胺等等而加以修饰。在某些情况下，这些修饰提供了与支承物或其他分子结合的位点。

本发明的肽可以用多种不同的方法进行制备。由于其尺寸相对较小，可以用常规技术在溶液或固相载体上合成这些肽。已有各种自动合成仪市售供应，可以根据已知的技术方案使用。参见，例如Steward和Young，“固相肽合成”，第2版，Pierce Chemical Co.(1984)，同上。

或者，也可以使用重组DNA技术，其方法是将可编码相关的免疫原性肽的核苷酸序列插入适当的表达载体，转化或转染入适当的宿主细胞，并在适宜表达的条件下培养。这些程序都是本领域通晓的，如一般在Sambrook等人，“分子克隆处理，实验室手册”，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1982)中所述，本文将其纳入作为参考。因此，包含一个或多个本发明的肽序列的各种融合蛋白质都能用于提供适当的T细胞表位。

因为此处规定长度的肽的编码序列可以用化学方法如Matteucci等人的磷酸三酯法(J.Am Chem.Soc.103：3185(1981))进行合成，因此，通过对可编码再生肽序列的核苷酸中的适当碱基进行替代就可以方便地进行修饰。随后就可给该编码序列配上合适的接头而与本领域常备的表达载体连接，然后使用该载体转化合适的宿主以产生所需的融合蛋白质。现在已可提供一些这样的载体和合适的宿主系统。为了表达融合蛋白质，可以给编码序列配备可操作性连接的起始密码子和终止密码子，起动子和终止子区域，以及通常配备一个复制系统，为在所需的细胞宿主中的表达提供一个表达载体。例如，在含有可供插入所需编码序列合适的的限制性(酶切)位点的质粒中，可以提供与细菌宿主相容的各种起动子序列。得到的各种表达载体就可转化至一些合适的细菌宿主中。当然，若采用合适的载体和调控序列，也可以使用酵母或哺乳动物细胞宿主。

本发明的肽及其药用及疫苗用组合物都适用于哺乳动物，特别是人使用，以治疗和/或预防病毒性感染和癌症。可以用本发明的免疫原性肽治疗的疾病例子包括诸如前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、爱滋病AIDS、肾癌、宫颈癌、淋巴瘤，巨细胞病毒CMV和尖锐湿疣。

作为药物组合物，本发明的免疫原性肽能适用于已罹患癌症或被相关的病毒感染的个体。那些处于感染的潜伏期或急性期的病人可以单独地用免疫原性肽进行治疗，或可结合其他治疗手段(如果合适的话)进行治疗。在治疗中，将组合物施用于病人的用量，须足以引发有效的对病毒或肿瘤抗原的CTL应答，并且能治愈或至少部分消除症状和/或并发症。足以实现该目的的用量被定义为“治疗有效剂量”。对于该用途的有效量取决于，例如，肽组合物，施用方式，被治疗的疾病所处的阶段和严重性，病人的体重和健康的总体状况以及处方医生的判断，但是作为初次免疫接种(适用于治疗或预防)，对于70kg的病人，其用量范围通常为约1.0μg至约5000μg肽，随后各次加强剂量为约1.0-1000μg肽，在数周至数月内按照加强治疗方案施用，这种加强方案取决于病人的应答及病情(通过测量病人血中特异性CTL活性而知)。应记住，本发明的肽和各种组合物通常可用于严重的疾病状态，也就是危及生命或可能危及生命的状态。在这种情况下，由于尽可能减少了外来物质及肽的相对无毒性，即使是主治疗医生施用大大过量的，这类肽组合物还是可行而且可认为是合乎需要的。

作为治疗用途，应当在病毒感染首批症候出现时、或检出或手术去除肿瘤时，或在刚诊断出急性感染后不久便开始施用。随后使用加强剂量，直到至少症状基本消退并且经过一段时间。在慢性感染中，需要在负荷剂量后接着用加强剂量。

用本发明的组合物治疗感染的个体，可以使急性感染个体的感染状态加速消退。对于那些容易(或素质易于)发展成慢性感染的个体，该组合物在防止急性感染向慢性感染演变的方法中特别有用。当易感个体在感染之前或感染中被查出时，例如，(如本文所述)，便可将是组合物以他们为目标，从而可减少对更大人群施用的需要。

肽组合物还可用于治疗慢性感染和刺激免疫系统以消除携带者体内病毒感染的细胞。在配方中提供一定量具有免疫增强作用的肽和足以有效激活细胞毒性T细胞应答的施用方式是至关重要的。因此对于治疗慢性感染的代表性剂量，对于70kg重的病人的每次剂量为约1.0-5000μg，较佳为5-1000μg。免疫剂量之后，可能需要按规定间隔(如1-4周)施用加强剂量，有时可能需要更长时间以便有效地使个体产生免疫。在慢性感染时，应当连续施用直到至少临床症状或实验室检查表明，病毒感染已被清除或基本消退并经过一段时间。

用于治疗处理的药物组合物可以采取非肠道施用、体表施用、口服或局部施用。较好的是，药物组合物是通过非经肠道施用，如静脉内施用，皮下施用，皮内施用或肌肉内施用。因此，本发明提供了非肠道施用的各种组合物，包括溶于或悬浮于可接受的载体，最好是水质载体中的免疫原性肽的溶液。可以使用各种水质载体，如水、缓冲水、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以用已知的常规灭菌技术进行灭菌处理，也可进行无菌过滤。得到的水溶液可以按原样或冻干包装以供使用，冻干制剂在施用之前与无菌溶液进行混合。各种组合物还可以含有类似生理状态所需的药学上可接受的辅助性物质，如pH调节及缓冲剂，张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨聚糖、三乙醇胺油酸酯等。

在药物配方中本发明的刺激肽的CTL浓度可以在大范围中变动，从小于约0.1％(通常为或至少为约2％)至高达20％-50％或更高(按重量计)，而且根据选用的特定施用方式，可以主要通过液体的体积、粘度等进行选择。

本发明的肽还可以通过脂质体形式进行施用，脂质体将肽定向输送至特定的组织(如淋巴组织)或选择性地定向送至受感染细胞，它还会提高肽组合物的半衰期。脂质体可包括，乳剂、泡沫剂、胶粒、不溶性单分子层、液晶、磷脂质分散剂、薄片层等。在这些制剂中，待输送的肽可以掺入脂质体作为其一部分，单独或以与如淋巴组织细胞中普遍存在的受体相结合的分子(例如，结合于CD45抗原的单克隆抗体，或者和其他治疗性或免疫原性组合物)一起输送。因此，用本发明所需的肽填入的或修饰的脂质体，可以被导向淋巴组织细胞所在部位，然后在该部位脂质体释出选定的治疗性/免疫原性肽组合物。用于本发明的脂质体可以用标准的成泡性脂质类制备，通常包括，中性或带负电荷的磷脂类和甾醇，如胆固醇。脂质类的选择依据通常是考虑如，脂质体大小，酸不稳定性和在血流中脂质体的稳定性。已有各种制备脂质体的方法，如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys Bioeng.9：467(1980)，美国专利4,235,871号、4,501,728号、4,837,028号和5,019,369号所述(本文将它们全部纳入作为参考)。

为了靶向导入免疫细胞，掺入到脂质体中的配基可以包括：例如对于所期望的免疫系统细胞的细胞表面决定簇具有特异性的抗体或其片段。含有肽的脂质体悬浮液可以供静脉内施用，局部施用或体表施用等，其用量可以根据(尤其是)施用方式、被输送的肽、以及被治疗的疾病所处的阶段而改变。

对于各种固体组合物，可以使用常规的无毒性的固相载体，包括如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服施用，可以通过掺入任何通常采用的赋形剂(例如，前面列出的那些载体)而形成药学上可接受的无毒性组合物，它通常含有10％-95％活性成分(即一种或多种本发明的肽)，更佳的是浓度为25％-75％。

对于气雾剂施用，免疫原性肽最好以精细分散的形式和表面活性剂及推进剂一起提供。肽的一般百分比为0.01-20％(重量)，更佳的是为1-10％。当然，表面活性剂必须无毒性，而且最好溶于推进剂中。这类药剂的代表形式是含有6-22个碳原子的脂肪酸(例如，己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸和油酸)与脂族多痉基醇或其环状酐形式的酯或部分酯。可以使用混合酯类，例如混合的或天然的甘油酯类。表面活性剂可占组合物的0.1-20％(重量)，更佳为0.25-5％。组合物的其余部分通常为推进剂。如果需要还可包括一种载体例如，用于鼻内给药的卵磷酯。

本发明另一方面涉及疫苗，它含有致免疫性有效量的本文所述的免疫原性肽作为活性成分。可将肽引入某宿主体(包括人)，其形式可以是连于其自己的载体或者作为活性肽单元的同源聚合物或异源聚合物。这种聚合物具有下列优点：可提高免疫反应，而且当使用不同的肽构成聚合物时，还具有诱导能与病毒或肿瘤细胞的不同抗原决定簇发生反应的抗体和/或CTL的额外能力。各种有效的载体是本领域公知的，包括例如，甲状腺球蛋白、各种白蛋白(如人血清白蛋白)，破伤风类毒素，各种聚氨基酸(如聚(赖氨酸：谷氨酸))，流感、乙型肝炎病毒髓芯蛋白质，乙型肝炎病毒重组疫苗等。这类疫苗还可含有生理上可承受的(可接受的)稀释剂，如水、磷酸盐缓冲盐水、或盐水，一般还可含有佐剂，诸如不完全Freund佐剂，磷酸铝，氢氧化铝，或明矾之类的佐剂都是本领域公知的材料。而且，如上所述通过将本发明的肽与脂质类(如P3CSS)结合，就可以引发CTL应答。一旦通过注射、气雾剂、口服、皮内或其他途径施用，用此处所述的肽组合物进行免疫处理，则宿主的免疫系统会通过产生大量针对所需抗原的特异性CTL而对该疫苗应答，宿主至少对以后的感染会产生部分免疫力，或能防止演变为慢性感染。

含有本发明的肽的疫苗组合物可以施用于易感或处于病毒感染或癌症威胁的病人，以引发针对抗原的免疫应答，并因此增强病人自身的免疫应答能力。这样的用量被定义“致免疫性有效剂量”。在这样应用中，精确的用量同样取决于病人的健康状况和体重，施用方式，配方的性质等，对于每一体重70kg的病人通常为1.0μg至约5000μg，更常用的为每70kg约10-500μg。

在某些情况下，最好是将本发明的肽疫苗和能诱导针对相关的病毒(尤其是病毒包膜抗原)的中和抗体应答的疫苗一起混合使用。

对于治疗或免疫用途，还可将可编码本发明的一种或多种肽的核酸类施用于患者。通常可方便地使用多种方法将各种核酸送递给患者。例如，可直接以“裸DNA”的方式送递核酸。这种方法可参见例如，Wolff等人，Science247：1465-1468(1990)以及美国专利第5,580,859和5,589,466号。也可用冲击送递法(ballistic delivery)施用核酸，参见如美国专利第5,204,253号。可以给予只包含DNA的粒子。或者，可将DNA附着于粒子(如黄金粒子)。也可将核酸以与阳离子化合物(阳离子脂质类)的复合物形式施用。脂质-介导基因的送递方法可参见，如，WO96/18372、WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)：682-691；Rose美国专利第5,279,833号；WO91/06309；和Feigner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7414。本发明的肽还可以由减毒的病毒宿主(如牛痘或鸡痘(fowlpox)病毒)进行表达。这种方法涉及使用牛痘病毒作为载体，来表达可编码本发明的肽的各种核苷酸序列。一旦引入急性或慢性感染的宿主中或未感染的宿主中，该重组的牛痘病毒便可表达免疫原性肽，从而引起宿主的CTL应答。用于一些免疫方案中的牛痘病毒载体和方法在例如，美国专利第4,722,848号中有所描述(本文将其纳入作为参考)。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stover等人的著作中(Nature 351：456-460(1991))有所描述(本文将其纳入作为参考)。本领域的熟练技术人员根据本文所述显然会找到可供用于治疗或免疫的本发明的肽使用的大量其他的载体(如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体等)。

施用可编码本发明的肽的各种核酸的优选方法，是使用可编码本发明多表位的一些小基因构建物。为了制备可编码选定的一些CTL表位(小基因)的DNA序列(用于在人细胞内表达)，要逆向翻译这些表位的氨基酸序列。可用人密码子查索表来指导对各氨基酸的密码子选择。将这些编码表位的DNA序列直接连接，就可产生一个连续的多肽序列。为了使表达和/或免疫原性最优化，可将其它元件掺入小基因设计中。可逆向翻译且包含在这种小基因序列中的氨基酸序列实例包括：辅助T淋巴细胞的各种表位、一个前导(信号)序列和一个内质网保守信号。另外，通过在与CTL各表位相邻处包含一些合成的(如，聚-丙氨酸)或天然存在的侧翼序列，也可改善CTL表位的MHC表现。

通过装配可编码小基因正股和负股的寡核苷酸类就可将小基因序列转化成DNA。用各种已知的方法在适合的条件下可合成、磷酸化、纯化并韧化重叠的寡核苷酸类(长度为30-100个碱基)。用T4DNA连接酶连接寡核苷酸的末端。此合成的、可编码CTL表位多肽的小基因就可经克隆成为合适的表达载体。

在该载体中包含本领域技术人员熟知的各种标准调节序列，可以确保在靶细胞中的表达。还需要一些载体元件：具有在下游可克隆供小基因插入的位点的启动子；可供有效转录终止的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌源复制作用；和大肠杆菌选择性标记物(如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。在这方面可使用多种启动子，如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。其它合适的启动子序列可参见美国专利第5,580,859和5,589,466号。

小基因的表达和免疫原性的最优化可能还需要其它载体修饰。在一些情况中，有效的基因表达需要各种内含子，并可将一个或多个合成的或天然的内含子掺入小基因被转录的区域中。也可认为mRNA的一些稳定序列的包含可增加小基因的表达。最近已提出：各种免疫性刺激序列各种(ISS或CpG)在DNA疫苗的免疫原性中起着作用。如果认为需要提高免疫原性，可以在小基因编码序列外的载体内包含这些序列。

在一些实施例中，可以使用生物同位素分析(bioistronic)表达载体，以产生小基因编码的一些表位和所包含的可提高或降低免疫原性的第二种蛋白质。如果共同表达时能有益地提高免疫应答的各种蛋白质或多肽的实例包括：各种细胞因子(如IL2、IL12、GM-CSF)、各种可诱导细胞因子的分子(如LeIF)或各种辅助刺激分子。各种辅助性(HTL)表位可与各种细胞内的靶信连接并与各CTL表位分开表达。这就可以将各HTL表位导向至不同各CTL表位的细胞区室。如果需要，这还可以更有效地协助各HTL表位进入II类MHC途径，从而改善CTL的诱导作用。与CTL诱导相反，用一些免疫抑制分子(如TGF-β)的共同表达特异性地降低免疫应答，可能对一些疾病是有益的。

一旦选定了表达载体，就可将小基因克隆入启动子的多接头区域下游。将该质粒转化入适合的大肠杆菌菌株中，并用标准方法制备DNA。载体中所包含的小基因的定向和DNA序列以及所有其它元件，可用限制性(酶切)绘图和DNA序列分析进行验证。可存储携带正确质粒的细菌细胞，作为主细胞库和工作细胞库。

通过由大肠杆菌的发酵作用以及随后的纯化处理，可制备治疗量的质粒DNA。将工作细胞库取得的等份细胞接种发酵培养基(如Terrific肉汤)，并用熟知的方法在摇瓶或生物反应器内生长至饱和。并可以用标准生物分离方法，如固相阴离子交换树脂(Quiagen提供)纯化处理质粒DNA。如果需要，可以用凝胶电泳法或其它方法将超螺旋结构的DNA与开环和线形DNA分离。

可以用各种配方制备注射用的纯化的质粒DNA。其中最简单的是将冷冻干燥DNA用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)重建。已描述了多种方法，还有一些新方法也将可供使用。如上所述，各种核酸可方便地用一些阳离子脂质类配制。另外，还可将糖脂质、基因融合脂质体、肽和综合称为PINC(保护性、相互作用、非-凝缩性)的化合物类也都可与纯化的质粒DNA复合，从而影响对各种特定器官或细胞类型的各项变量，如稳定性、肌内分散和交流。

可使用靶细胞敏化作用对小基因编码的CTL各表位的表达和I类MHC表现进行功能性试验。质粒DNA可引入适用于作为标准CTL铬释放试验的靶标的哺乳动物细胞系。所用的转染方法取决于最终的制剂。可使用电穿孔去使DNA“暴露”，而阳离子脂质类则可指导在活体外转染。可用表达绿色荧光蛋白质(GEP)的质粒共同转染，而使经荧光活化的细胞分选法(FACS)转染的细胞富集。然后用铬-51标记这些细胞，并用作各表位-特异性CTL系的靶细胞。用51Cr的释放来检测的细胞溶解现象就可表明表现MHC的小基因编码的一些CTL表位的产生。

在活体内，免疫原性是小基因DNA制剂功能性测试的另一种方法。用DNA制品对可表达适当的人MHC分子的转基因小鼠施行免疫接种。施用的剂量和途径是依制剂而定(如对PBS制备的DNA采用肌肉IM，对脂质-复合的DNA采用腹腔内IP)。免疫接种后21天，收获脾细胞，并在可编码经测试的各表位的存在下再刺激1周。用标准方法测试这些效应细胞(CTL)的负载肽的铬-51标记的靶细胞的细胞溶解情况。据相应于小基因编码的各种表位的负载的MHC肽敏化的靶细胞发生的裂解表明了DNA疫苗在活体内引发各种CTL的功能。

抗原肽还可以用来在活体外引发CTL。得到的CTL能用于治疗病人的慢性感染(病毒性或细菌性)或肿瘤，这些病人对其他常规的治疗方法不产生应答或者对于治疗用的肽疫苗方法不产生应答。通过在组织培养物中将病人的CTL前体细胞(CTLp)和存在抗原的细胞(APC)源及适当的免疫原性肽一起孵育，对特定病原(感染因子或肿瘤抗原)的离体CTL应答，就可诱导。孵育适当时间后(一般为1-4周)，CTLp被激活并成熟并扩张成效应CTL，将该细胞输回病人，在病人体内它们会摧毁其特异性靶细胞(感染的细胞或肿瘤细胞)。

肽还被发现可以用作诊断试剂。例如，本发明的一种肽可以用于确定特定个体对采用肽或相关肽的治疗方案的敏感性，因而能够有助于修改已有的治疗方案，或有助于确定受感染的个体预后情况。此外，肽还可以用于预测哪些个体会受到演变为慢性感染的重大危险。

下面提供实施例是为了阐述而不是限制本发明。

实施例I

用如上所述的相关申请所述的方法进行I类抗原的分离。然后用这里所述的方法分离天然加工的肽并对它们测序。确定一个等位基因特异性基序和各种算法，并进行一组定量的结合试验。

利用上述对来自若干抗原的HLA-A2.1等位基因氨基酸序列进行鉴定的各种基序来分析是否存在这些基序。表3提供了这些研究的结果。字母“J”表示正亮氨酸。

提供上面的一些实施例是用于阐述本发明，而不是限制其范围。本发明的其他一些变体本领域普通技术人员很容易邻会，它们包括在附录权利要求条款中。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均引入此作为参考。

表3肽 AA 序列来源 A ^* 020117.0317 9 LQIGNIISI F1u.24 0.013038.0103 9 NLSLSCHAA CEA.432 0.01101233.11 9 YLSGANLNV CEA.605V9 0.06901295.03 9 SMPPPGTRV p53.149M2 0.02901295.04 9 SLPPPGTRV p53.149L2 0.04101317.24 9 KTCPVQLWV p53.139 0.00691323.02 9 KLLPENNVV p53.24V9 0.01301323.04 9 ALNKMFBQV p53.129B7V9 0.02601323.06 9 KLBPVQLWV p53.139L2B3 0.11001323.08 9 BLTIHYNYV p53.229B1L2V9 0.04301323.18 10 LLPPQHLIRV p53.188L2 0.00611323.29 11 YMCNSSCMGGM p53.236 0.00751323.31 11 YLCNSSCMGGV p53.236L2V11 0.23001323.34 11 KLYQGSYGFRV p53.101L2V11 0.06201324.07 9 CQLAKTCPV p53.135 0.02401325.01 9 RLPEAPPV p53.65L2 0.06401325.02 9 GLAPPQHLV p53.187V9 0.01301325.04 9 KMAELVHFL MAGE3.112M2 0.2100

表3(续)肽 AA 序列来源 A^*02011325.05 9 KLAELVHFL MAGE3.112L2 0.25001326.01 9 CLLAKTCPV p53.135L2 0.04001326.02 9 KLSQHMTEV p53.164L2 0.04101326.04 9 ELAPVVAPV p53.68L2V9 0.08601326.06 10 QLAKTCPVQV p53.136 0.03201326.08 9 HLTEVVRRV p53.168L2 0.01801329.01 11 KTYQGSYGFRL 0.00281329.03 10 VVVPYEPPEV p53.216 0.00811329.14 9 BQLAKTBPV p53.135B1B7 0.04901329.15 9 BLLAKTBPV p53.135B1L2B7 0.11001330.01 9 QIIGYVIGT CEA.78 0.01601330.02 9 QLIGYVIGV CEA.78L2V9 0.53001330.05 9 YVCGIQNSV CEA.569 0.05101330.06 9 YLCGIQNSV CEA.569L2 0.10001330.07 9 ATVGIMIGV CEA.687 0.14001330.08 9 ALVGIMIGV CEA.687L2 0.50001330.09 10 VLYGPDDPTI CEA.411 0.01701330.10 10 VLYGPDDPTV CEA.411V10 0.03101331.02 9 DLMLSPDDV p53.42V91331.03 9 ALMLSPDDI p53.42A11331.04 9 ALMLSPDDV p53.42A1V91331.05 9 DLMLSPADI p53.42A71331.06 9 DLMLSPADV p53.42A7V91331.07 9 DLMLSPDAI p53.42A81331.08 9 DLMLSPDAV p53.42A8V938.0007 9 AILTFGSFV KSHV.89 0.085038.0009 9 HLRDFALAV KSHV.106 0.018338.0015 9 ALLGSIALL KSHV.155 0.047038.0018 9 ALLATILAA KSHV.161 0.049038.0019 9 LLATILAAV KSHV.162 0.160038.0022 9 RLFADELAA KSHV.14 0.0150

表3(续)肽 AA 序列来源 A^*020138.0024 9 YLSKCTLAV KSHV.65 0.200038.0026 9 LVYHIYSKI KSHV.153 0.045738.0029 9 SMYLCILSA KSHV.208 0.025038.0030 9 YLCILSALV KSHV.210 0.350038.0033 9 VMFSYLQSL KSHV.268 0.500038.0035 9 RLHVYAYSA KSHV.285 0.027038.0039 9 GLQTLGAFV KSHV.98 0.011038.0040 9 FVEEQMTWA KSHV.105 0.038038.0041 9 QMTWAQTVV KSHV.109 0.011038.D042 9 IILDTAIFV KSHV.130 0.680038.0043 9 AIFVCNAFV KSHV.135 0.091038.0046 9 AMGNRLVEA KSHV.172 0.020038.0047 9 RLVEACNLL KSHV.176 0.018038.0059 9 TLSIVTFSL KSHV.198 0.220038.0063 9 KLSVLLLEV KSHV.292 0.140038.0064 9 LLLEVNRSV KSHV.296 0.027038.0068 9 FVSSPTLPV KSHV.78 0.035038.0070 9 AMLVLLAEI KSHV.281 0.082038.0075 9 QMARLAWEA KSHV.1116 0.099038.0131 10 VLAIEGIFMA KSHV.10 0.073038.0132 10 YLYHPLLSPI KSHV.27 0.140038.0134 10 SLFEAMLANV KSHV.49 0.950038.0135 10 STTGINQLGL KSHV.62 0.071038.0137 10 LAILTFGSFV KSHV.88 0.01.6038.0139 10 ALLGSIALLA KSHV.155 0.036038.0141 10 ALLATILAAV KSHV.161 0.110038.0142 10 LLATILAAVA KSHV.162 0.011038.0143 10 RLFADELAAL KSHV.14 0.180038.0148 10 YLSKCTLAVL KSHV.65 0.030038.0150 10 LLVYHIYSKI KSHV.152 0.013038.0151 10 SMYLCILSAL KSHV.208 0.0360

表3(续)肽 AA 序列来源 A^*020138.0153 10 HLHRQMLSFV KSHV.68 0.016038.0163 10 LLCGKTGAFL KSHV.167 0.010038.0164 10 ETLSIVTFSL KSHV.197 0.018039.0063 9 VMCTYSPPL mp53.119 1.400039.0065 9 KLFCQLAKT mp53.129 0.016039.0067 9 ATPPAGSRV mp53.146 0.013039.0133 10 FLQSGTAKSV mp53.110 0.018039.0169 10 CMDRGLTVFV KSHV.311 0.012039.0170 10 VLLNWWRWRL KSHV.327 0.150040.0070 9 GVFTGLTHI HCV.1565 0.011040.0072 9 QMWKCLIRL HCV.1611 0.062040.0074 9 IMTCMSADL HCV.1650 0.012140.0076 9 ALAAYCLST HCV.1674 0.250040.0080 9 VLSGKPAII HCV.1692 0.015040.0082 9 FISGIQYLA HCV.1773 0.100040.0134 10 YIMTCMSADL HCV.1649 0.030040.0137 10 AIASLMAFTA HCV.1791 0.058040.0138 10 GLAGAAIGSV HCV.1838 0.032041.0058 8 MIGVLVGV CEA.692 0.012041.0061 9 VLPLAYISL TRP1 0.011041.0062 9 SLGCIFFPL TRP1 0.970041.0063 9 PLAYISLFL TRP1 0.022041.0065 9 LMLFYQVWA TRP1 0.027041.0071 9 NISIYNYFV TRP1 0.230041.0072 9 NISVYNYFV TRP1 0.060041.0075 9 FVWTHYYSV TRP1 1.500041.0077 9 FLWHRYHL TRP1 0.550041.0078 9 LWHRYHLL TRP1 0.160041.0082 9 MLQEPSFSL TRP1 0.690041.0083 9 SLPYWNFAT TRP1 0.011041.0088 9 RLPEPQDVA TRP1 0.0180

表3(续)肽 AA 序列来源 A^*020141.0090 9 VTQCLEVRV TRP1 0.016041.0096 9 LLHTFTDAV TRP1 0.270041.0100 9 NMVPFWPPV TRP1 0.620041.0104 9 AVVGALLLV TRP1 0.021041.0105 9 AVVAALLLV TRP1 0.039041.0108 9 LLVAAIFGV TRP1 1.900041.0112 9 SMDEANQPL TRP1 0.077041.0114 9 VLPLAYISV TRP1 0.110041.0115 9 SLGCIFFPV TRP1 3.200041.0116 9 PLAYISLFV TRP1 0.031041.0117 9 LLLFQQARV TRP1 0.110041.0118 9 LMLFYQVWV TRP1 2.400041.0119 9 LLPSSGPGV TRP1 0.370041.0121 9 NLSTYNYFV TRP1 0.970041.0122 9 NLSVYNYFV TRP1 0.870041.0123 9 FLWTHYYSV TRP1 5.600041.0124 9 SLKKTFLGV TRP1 0.022441.0125 9 FLTWHRHV TRP1 0.380041.0129 9 MLQEPSFSV TRP1 1.600041.0130 9 SLPYWNFAV TRP1 0.570041.0131 9 ALGKNVCDV TRP1 0.016041.0132 9 SLLISPNSV TRP1 0.130041.0133 9 SLFSQWRVV TRP1 0.074041.0134 9 TLGTLCNSV TRP1 0.033041.0136 9 RLPEPQDVV TRP1 0.100041.0137 9 VLQCLEVRV TRP1 0.036041.0138 9 SLNSFRNTV TRP1 0.014041.0139 9 SLDSFRNTV TRP1 0.044041.0141 9 FLNGTGGQV TRP1 0.022041.0142 9 VLLHTFTDV TRP1 0.018041.0145 9 ALVGALLLV TRP1 0.2600

表3(续)肽 AA 序列来源 A^*Q20141.0146 9 ALVAALLLV TRP1 0.580041.0147 9 LLVALIFGV TRP1 1.000041.0148 9 YLIRARRSV TRP1 0.017041.0149 9 SMDEANQPV TRP1 0.160041.0151 10 SLGCIFPLL TRP1 0.180041.0157 10 GMCCPDLSPV TRP1 0.095041.0160 10 AACNQKILTV TRP1 0.012041.0162 10 FLTWHRYHLL TRP1 0.083041.0166 10 SLHNLAHLFL TRP1 0.390041.0174 10 LLLVAAIFGV TRP1 0.300041.0177 10 LLVAAIFGVA TRP1 0.082041.0178 10 ALIFGTASYL TRP1 0.023041.0180 10 SMDEANQPLL TRP1 0.025041.0181 10 LLTDQYQCYA TRP1 0.032041.0183 10 SLGCIFFPLV TRP1 0.320041.0186 10 FLMLFYQVWV TRP1 0.810041.0189 10 ALCDQRVLIV TRP1 0.053041.0190 10 ALCNQKILTV TRP1 0.077041.0191 10 FLTWHRYHLV TRP1 0.051041.0197 10 SLHNLAHLFV TRP1 0.500041.0198 10 NLAHLFLNGV TRP1 0.410041.0199 10 NMVPFWPPVV TRP1 0.280041.0201 10 ILVVAALLLV TRP1 0.019041.0203 10 LLVALIFGTV TRP1 0.120041.0205 10 ALIFGTASYV TRP1 0.090041.0206 10 SMDEANQPLV TRP1 0.035041.0207 10 LLTDQYQCYV TRP1 0.210041.0212 11 LLIQNIIQNDT CEA.107 0.014041.0214 11 IIQNDTGFYTL CEA.112 0.013041.0221 11 TFNVTRNDTA CEA.201 0.011041.0235 11 LTLLSVTRNDV CEA.378 0.0150

表3(续)肽 AA 序列来源 A^*020141.0243 11 GLYTCQANNSA CEA.473 0.029041.0268 11 ATVGIMIGVLV CEA.687 0.016044.0075 11 GLVPPQHLIRV mp53.184.V3 0.037044.0087 11 GLAPPVHLIRV mp53.184.V6 0.033044.0092 11 GLAPPEHLIRV mp53.184.E6 0.16001227.10 9 ILIGVLVGV CEA.691.L2 0.23001234.26 10 YLIMVKCWMV Her2/neu.952.L2 0.3800

V101295.06 9 LLGRDSFEV mp53.261 0.20001319.01 9 FMYSDFHFI Flu.RRP2.446 0.44001319.06 9 NMLSTVLGV Flu.RRP2.446 0.17001319.14 9 SLENFRAYV Flu.RRP2.446 0.04301325.06 KMAELVHFV Mage3.112 0.19001325.07 KLAELVHFV Mage3.112 0.35001334.01 VLIQRNPQV Her2/neu.153.V9 0.09101334.02 VLLGVVFFGV Her2/neu.665.L2 2.1000

V91334.03 SLISAVVGV Her2/neu.653.L2 0.7000

V91334.04 YMIMVKBWMI Her2/neu.952.B7 0.27001334.05 YLIMVKBWMV Her2/neu.952.L2 0.6900

B7V101334.06 KLWEELSVV Mage3.220.L2V 0.4500

91334.08 AMBRWGLLV Her2/neu.5.M2B 0.1400

3V91345.01 9 IJIGVLVGV CEA.691.J2 0.05701345.02 9 ATVGIJIGV CEA.687.J6 0.15951345.03 9 SJPPPGTRV p53.149.J2 0.05451345.04 10 LVFGIELJEV MAGE3.160.J8 0.7650918.12 8 ILGFVFTL Flu.M1.59 0.7900

表3(续)

肽 AA 序列来源 A^*02.01

1095.22 9 KIFGSLAFL Her2/neu.

1090.01 10 YLQLVFGIEV MAGE2

1126.01 9 MMNDQLMFL PSM

1126.02 10 ALVLAGGFFL PSM

1126.03 9 WLCAGALVL PSM

1126.05 9 MVFELANSI PSM

1126.06 10 RMMNDQLMFL PSM

1126.09 9 LVLAGGFFL PSM

1126.10 9 VLAGGFFLL PSM

1126.12 9 LLHETDSAV PSM

1126.14 9 LMYSLVHNL PSM

1126.16 10 QLMFLERAFI PSM

1126.17 9 LMFLERAFI PSM

1126.20 10 KLGSGNDFEV PSM

1129.01 10 LLQERGVAYI PSM

1129.04 10 GMPEGDLVYV PSM

1129.05 10 FLDELKAENI PSM

1129.08 9 ALFDIESKV PSM

1129.10 10 GLPSIPVHPI PSM

II.非-HLA-A2基序

本发明还涉及确定人I类MHC(有时称为HLA)各等位基因亚型的等位基因特异性的肽基序。这些基序接着被用于定义来自任何所期望的抗原的各种T细胞表位，尤其是那些与人的病毒性疾病、癌症或自体免疫疾病相关的表位，对于这些疾病人们已经知道潜在的抗原或自体抗原靶的氨基酸顺序。

位于若干潜在的靶蛋白质上的表位能用这种方式鉴别。合适的抗原的一些例子包括，前列腺特异抗原(PSA)，乙型肝炎病毒髓芯和表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，黑色素瘤抗原(如MAGE-1)，人类免疫缺陷型病毒(HIV)抗原，人乳头瘤病毒(HPV)抗原，拉萨热病毒，结核分枝杆菌(MT)，p53，CEA和Her2/neu。

含有来自这些抗原的表位的肽已被合成，接着在一些试验中测试了它们与适当的MHC分子的结合能力，例如使用纯化的I类分子和放射性碘标记的肽和/或表达空白I类分子的细胞，通过例如，免疫萤光染色法和流式显微萤光分析法，肽依赖性I类装配试验法(assembly assays)以及利用肽竞争作用对CTL识别的抑制试验进行测试。对于那些与I类分子结合的肽还进一步评估了其作为来自感染或免疫过的个体的各种CTL的靶目标的能力，以及它们作为潜在治疗剂在活体外或在活体内诱导原发性CTL应答的能力，从而导致能与病毒感染的靶细胞或肿瘤细胞反应的CTL群的增加。

各种MHC I类抗原可由HLA-A、B和C位点编码。HLA-A和B抗原以大致相同密度在细胞表面表达，而HLA-C的表达则低得多(也许可低至10倍之多)。这些位点的每一个都具有若干等位基因。本发明的肽结合的各基序对于每种等位基因亚型都是相对特异的。

对于各种肽基疫苗，本发明的肽最好具有能被在人群中具有广泛分布的一种MHC I分子识别的基序。因为在不同的人种和亚种中，MHC等位基因存在的频率不同，所以对靶MHC等位基因的选择，可能取决于选定的靶人群。表4显示了在不同亚种中位于HLA-A位点产物的各种等位基因的频率。例如，大部分白种人群可以被与四种HLA-A等位基因亚型(具体指HLA-A2.1，Al，A3.2，和A24.1)结合的肽所覆盖。同样，大部分亚洲人群可以通过添加与第五种等位基因HLA-A1 1.2结合的肽而概括。

表4A等位基因/亚型 N(69)^* A(54) C(502)

A1 10.1(7) 1.8(1) 27.4(138)

A2.1 11.5(8) 37.0(20) 39.8(199)

A2.2 10.1(7) 0 3.3(17)

A2.3 1.4(1) 5.5(3) 0.8(4)

A2.4 - - -

A2.5 - - -

A3.1 1.4(1) 0 0.2(0)

A3.2 5.7(4) 5.5(3) 21.5(108)

A11.1 0 5.5(3) 0

A11.2 5.7(4) 31.4(17) 8.7(44)

A11.3 0 3.7(2) 0

A23 4.3(3) - 3.9(20)

A24 2.9(2) 27.7(15) 15.3(77)

A24.2 - - -

A24.3 - - -

A25 1.4(1) - 6.9(35)

A26.1 4.3(3) 9.2(5) 5.9(30)

A26.2 7.2(5) - 1.0(5)

A26V - 3.7(2) -

A28.1 10.1(7) - 1.6(8)

A28.2 1.4(1) - 7.5(38)

A29.1 1.4(1) - 1.4(7)

A29.2 10.1(7) 1.8(1) 5.3(27)

A30.1 8.6(6) - 4.9(25)

A30.2 1.4(1) - 0.2(1)

A30.3 7.2(5) - 3.9(20)

A31 4.3(3) 7.4(4) 6.9(35)

A32 2.8(2) - 7.1(36)

Aw33.1 8.6(6) - 2.5(13)

Aw33.2 2.8(2) 16.6(9) 1.2(6)

Aw34.1 1.4(1) - -

Aw34.2 14.5(10) - 0.8(4)

Aw36 5.9(4) - -

表中数据汇编自B.DuPont，“HLA的免疫学”，第I卷，HistocompatibilityTesting 1987，Springer-Verlag，New York 1989。

^*N＝黑种人；A＝亚洲人；C＝白种人。括号内的数字为分析中包括的人数。

用于描述肽化合物的术语按照惯例，其中氨基在每个氨基酸残基的左侧(N-端)而羧基在右侧(C-端)。在阐明本发明的一些选用的特定例子的配方中，尽管没有特别明，其氨基端和羧基端基团都假定是处于生理pH值下形式(除非另加说明)。在氨基酸结构式中，各残基通常用标准的三字符或单字符表示。L型的氨基酸残基用大写的单个字母或第一个字母大写的三字母符号表示。那些氨基酸的D型残基用小写的单个字母或小写的三字符表示。甘氨酸没有不对称碳原子，则直接用“Gly”或“G”表示。

用于鉴别本发明的肽的程序，一般按照Falk等人，Nature 351：290(1991)公开的方法(本文将其纳入作为参考)。该方法的原理是，从适当的细胞或细胞系中大规模分离MHC I类分子，一般是通过免疫沉淀法或亲和层析法。对于本领域技术人员普遍熟知的用于分离所需的MHC分子的其他一些方法的例子包括，离子交换层析法，外源凝集素层析法，分子大小排除法，高效液相色谱法，以及所有上述技术的组合形式。

已知大量具有确定的MHC分子(尤其是I类MHC分子)的细胞，而且容易获得。例如，已证实：人EBV-转化的B细胞系是制备型分离I类和II类MHC分子的极好来源。可从私人或商业途径获得已完全鉴定的细胞系，例如美国典型培养物保藏中心(“细胞系和杂交瘤目录”，第6版(1988)Rockville，Maryland，U.S.A.)；“国立综合医学研究院1990/1991细胞系(NIGMS)人基因突变细胞陈列室目录”，Camden，NJ；和ASHI陈列室，Bingham and Women′s Hospital，75Francis Street，Boston，MA 02115。表5列出了一些可适于用作各种HLA-A等位基因来源的一些B细胞系。所有这些细胞系都能大批量的培养，因此可用于大规模制备MHC分子。技术人员应理解这些仅仅是示范性的细胞系，还可以使用许多其它的细胞来源。与HLA-B和HLA-C同属纯合子的类似的EBV B细胞系，也可分别作为HLA-B和HLA-C的等位基因的来源。

表5

人细胞系(HLA-A源)HLA-A等位基因 B细胞系

A1 MAT

COX(9022)

STEINLIN

(9087)

A2.1 JY

A3.2 HEM(9080)

H0301(9055)GM3107

A24.1 T3(9107)，TISI(9042)

A11 BVR(GM6828A)

WT100(GM8602)WT52

(GM8603)

在一般情况下，是用免疫沉淀法分离所需的等位基因。依据所使用的抗体的特异性可以采用几种技术方案。例如，可以使用各种等位基因特异性单克隆抗体(mAb)试剂，对于HLA-A，HLA-B1和HLA-C分子进行亲和纯化处理。已有数种mAb试剂可用于分离HLA-A分子(表6)。因此，对各种目标HLA-A等位基因，都各有可用于直接分离HLA-A分子的试剂。利用标准技术用这类mAb制备的各种亲和柱可以成功地分别用于纯化各种HLA-A等位基因产物。

除了各种等位基因特异性mAb，可以在下面实施例一节中所述的另外一些亲和纯化方案中使用活性更广的抗-HLA-A、B、C mAb，例如W6/32和B9.12.1，和一种抗-HLA-B、C mAb，即B1.23.2。

表6

抗体试剂

抗-HLA 名称

HLA-A1 12/18

HLA-A3 GAPA3 (ATCC，HB122)

HLA-11，24.1 A11.1M (ATCC，HB164)

HLA-A，B，C W6/32 (ATCC，HB95)

单形 B9.12.1 (INSERM-CNRS)

HLA-B，C B.1.23.2 (INSERM-CNRS)

单形

一般是使用酸处理法来洗脱结合于分离的MHC分子的肽结合槽上的肽。还可用各种标准的变性方法使肽与I类分子解离，例如通过热、pH、去污剂、盐类、离液序列高的试剂或其组合。

再用反相高效液相色谱法(HPLC)可将肽组分与MHC分子分开，并测序。可以用技术人员熟知的几种其他标准方法分离肽，其中包括过滤法，超滤法，电泳法，分子大小排阻色谱法，用特异性抗体沉淀法，离子交换层析法，等电聚焦法等。

可以用一些标准方法进行分离的肽的测序工作，例如用Edman降解法(Hunkapiller，M.W等人，Methods Enzymol 91，399(1983))。其他适用于测序的一些方法包括，上述的个别肽的质谱分析法测序(Hunt等人，Science 225：1261(1992)，本文将其纳入作为参考)。来自不同的I类分子的大量异源性肽(如混合的HPLC馏分)的氨基酸测序表明，各种I类等位基因都各有特征性的序列基序。

明确了不同的I类等位基因的特异性基序，就能够鉴别已知氨基酸序列的抗原蛋白质的潜在的一些肽表位。潜在的肽表位的鉴别，一般先是使用计算机扫描所需的抗原的氨基酸序列，以确定是否存在基序。然后再合成各表位序列。并用各种不同方法测量其结合MHC I类分子的能力。一种方法是在上述的相关申请中描述的I类分子结合试验法。在文献中描述的其他方法包括：抑制抗原的表现(Sette等人，J.Immunol.141：3893(1991))，在活体外装配试验法(Townsend等人，Cell 62：285(1990))，和使用突变细胞如RMA.S的基于FACS的试验(Melief等人，Eur.J.Imminol. 21：2963(1991))。

接着，对在I类MHC结合试验中呈阳性的肽测试其在活体外诱导特异性CTL应答的能力。例如，对已和某肽一起培养的表现抗原的细胞可测试其诱导各应答细胞群中的CTL应答的能力。表现抗原的细胞可以是正常细胞(如外周血单核细胞)或树突细胞(Inaba等人，J.Exp.Med.166：182(1987)；Boog，Eur.J.Immunol 18：219(1988))。

另外，可以按常规使用突变的各种哺乳动物细胞系(负载带有内加工的肽的I类分子的能力方面有缺陷)，比如小鼠细胞系RMA-S(Karre等人，Nature319：675(1986)；Ljunggren等人，Eur.J.Immunol.21：2963-2970(1991))，和人体T细胞杂交细胞，T-2(Cerundolo等人，Nature 345：449-452(1990))以及已用适当的人I类基因转染的细胞等都很适用，当向它们加入肽时，测试该肽在活体外诱导初级CTL应答的能力。其他可使用的真核生物细胞系包括：各种昆虫细胞系如蚊子幼虫(ATCC细胞系CCL125，126，1660，1591，6585，6586)，桑蚕(ATCCCRL 8851)，黏虫(ATCC CRL 1711)，蛾(ATCC CCL 80)，和果蝇属细胞系如Schneider细胞系(参见Schneider J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-365(1927))。

在对正常供血者或病人进行简易的静脉穿刺或白细胞提取法之后，就很容易分离外周血淋巴细胞，用作CTL前体的应答细胞源。在一个例子中，将适当的表现抗原的细胞与10-100μM的肽在无血清培养基中以适宜的培养条件一起孵育4小时。然后将负载肽的表现抗原的细胞于最优化培养条件下与应答细胞群进行活体外孵育7-10天。可由测试培养物中是否存在能杀死放射标记靶细胞的CTL而确定阳性CTL激活情况，包括特异性的肽脉冲调节的(peptide-pulsed)靶以及表达相关病毒或肿瘤抗原(肽序列来自这些抗原)的内源加工形式的靶细胞。

对可表达适当或不适当的人I类MHC分子的不同肽的靶细胞进行测试，就可确定CTL的特异性和MHC限制性。在MHC结合试验中测试呈阳性并导致产生特异性CTL应答的肽，在此处被称为免疫原性肽。

免疫原性肽可以用合成法或重组DNA技术制备，或从天然来源如完整的病毒或肿瘤中获得。尽管这种肽最好基本上不含其他天然存在的宿主细胞的蛋白质或其片段，但在某些实施例中，这种肽可以通过合成方法而与各种原性的片段或粒子相结合。

多肽或肽可以是各种长度的，以中性(不带电荷)形式或以盐类形式存在，可以不烃修饰(如糖基化，侧链氧化或磷酸化)，或者含有这些修饰物而如此处所述的经受修饰而并不会破坏多肽生活性。

最好是，该肽应尽可能小同时又尽可能基本上维持大肽的所有生物活性。若可能，最好是将本发明的肽优化为长度约9或10个氨基酸残基，其大小相当于在细胞表面上结合于I类MHC分子的内源加工的病毒肽或肿瘤细胞肽的长度。

具有所需活性的肽可以按需要进行修饰以提供某些需要的特性，如改进药理学特性，并同时提高或至少基本保守未修饰的肽结合于所需的MHC分子并激活适当T细胞的全部生物活性。例如，肽可以经过各种改变，比如，保守性或非保守性替代，而这些改变在用途上可能会提供某些好处，比如，改进MHC的结合。保守性替代是指一个氨基酸残基被另一个在生物学和/或化学上相似的氨基酸残基替代，如，憎水性残基被另一个憎水性残基替代，或一个极性残基替代另一个。替代包括某些组合，如，Gly，Ala；Val，Ile，Leu，Met；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。单一氨基酸替代的效果可以使用D-氨基酸类进行探测。这些修饰可以用公知的肽合成方法进行，例如，本文引用作为参考的下列文献中描述的方法：Merrifield，Science232：341-347(1986)；Barany和Merrifield，“肽”，Gross and Meienhofer编辑(N.Y.，Academic Press)，第1-284页(1979)；和Stewart和Yong，“固相肽合成”，(Rockford，Ill.，Pierce)，第2版(1984)。

还可以通过扩展或缩减化合物的氨基酸序列来修饰肽，例如通过增加或删减一些氨基酸。本发明的肽或类似物还可以通过改变某些残基的顺序或组合而加以修饰，很容易理解，某些在生物活性方面必要的氨基酸残基，比如位于关键接触点的残基或保守性残基，若是在生物活性方面没有不良影响通常是不会改变的。非关键氨基酸类则不限于那些天然存在于蛋白质的种类如L-α-氨基酸或其D-异构体，而可包括非天然氨基酸类，如β-γ-δ-氨基酸，以及L-α-氨基酸类的许多衍生物。

典型地，具有单一氨基酸替代的肽系列一般可用来确定静电电荷、憎水性等对结合的影响。例如，沿肽长度方向形成的一系列带正电荷(如，Lys或Arg)或负电荷(如Glu)的氨基酸替代物，对各种MHC分子和T细胞受体可显示不同的敏感度模式。此外，可以使用能利用小而相对中性的分子部分如，Ala，Gly，Pro或类似的残基的多重替代物，替代物可以是同种寡聚物或异种寡聚物。用于替代或添加的残基的数目和类型，取决于关键接触点之间所需的间隔以及某些预期的功能特性(如憎水性/亲水性)。与亲本肽的亲和力相比，通过这样的替代还可提对MHC分子或T细胞受体的结合亲和力。无论如何，这类替代应采用那些选定的氨基酸残基或其他分子片段，以避免例如，可能会破坏结合的空间的或电荷方面的干扰。

氨基酸替代一般都为单个残基的替代。可以综合替代、缺失、插入或其任何组合以达到最终的肽。各种替代性变体是去除肽的至少一个残基并且在该位置上插入一个不同的残基。当需要精细地调节肽的特性时，通常可以根据下列表2进行这种替代。

表2

原来的残基替代示例

Ala Ser

Arg Lys，His

Asn Gln

Asp Glu

Cys Ser

Glu Asp

Gly Pro

His Lys；Arg

Ile Leu；Val

Leu Ile；Val

Lys Arg；His

Met Leu；Ile

Phe Tyr；Trp

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr，Phe

Tyr Trp；Phe

Val Ile；Leu

Pro Gly

功能上的重大改变(如对MHC分子或T细胞受体的亲和力)是通过选择那些比表2中列出的较少保守性替代而形成的，即通过选择在对维持下列性状的作用方面有更明显差别的残基：(a)在替代区域的肽主链的结构，如，片状或螺旋构象，(b)在靶位点上的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。通常，预期肽的性状会产生最大改变的替代是(a)亲水性残基，如丝氨酰基可与憎水性残基如，亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基相互替代；(b)具有正电荷的侧链的残基如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基可与具有负电荷的残基如谷氨酰基，天门冬氨酰基相互替代；或(c)侧链体积大的残基如，苯丙氨酰酸基可与没有侧链的残基如，甘氨酸相互替代。

肽可以包括免疫原性肽中两个或多个残基的等配物。如在此所确定的等配物是二个或多个残基的某个序列，它可用于替代第二个序列，因为第一个序列的立体构象与第二个序列特异的结合点相适配。该术语特别包括本领域技术人员熟知的肽主链方面的修饰。这类修饰包括酰胺氮原子、α-碳原子、酰胺羰基的修饰、酰胺键的完全替换、缺失、延伸或主链交联。一般可参见，Spatola，“氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学”，第VII卷(Weinstein编辑，1983)。

含各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸的肽的修饰在提高肽在活体内的稳定性方面特别有效。稳定性可用多种方法测定。例如，已使用肽酶类和各种生物介质如人血浆和血清测试稳定性。参见，例如，Verhoef等人，Eur.J.Drug MetabPharmacokin.11：291-302(1986)。本发明的肽的半衰期可用25％人血清(V/V)试验方便地加以测定。该方案通常如下所述。在使用前经离心使混合的人血清(AB型，非热灭活的)脱脂。接着用RPMI组织培养基将血清稀释至25％，再用其测试肽的稳定性。按预定的时间间隔取出少量反应溶液，加入6％三氯乙酸水溶液或乙醇。将混浊的反应样品在4℃冷却15分钟，再离心使已沉淀的血清蛋白质集聚成块。再使用稳定性-特异性的色谱法条件，通过反相HPLC确定肽的存在与否。

本发明的具有CTL激活的活性的肽或其类似物可以经修饰而不仅能改进血清的半衰期，还可提供其他各种所需的特性。例如，通过连接于含有至少一个能诱导T辅助细胞应答的表位的序列，可以提高肽诱导CTL活性的能力。特别优选的免疫原性肽/T辅助细胞结合物是通过间隔物分子而相连。间隔物一般包括较小的中性分子，如各种氨基酸或氨基酸模拟物，它们在生理条件下基本上不带电荷。这类间隔分子一般选自：如Ala，Gly或其他非极性氨基酸类中性氨基酸类的中性间隔分子。应理解，任意存在的间隔分子不必含有相同的残基，因而可以是异种寡聚物或同种寡聚物。当该间隔分子存在时，通常至少为1个或2个残基，更常见为3-6个残基。或者，CTL肽也可以不用间隔分子而连于T辅助肽。

免疫原性肽可以直接或通过在CTL肽的氨基端或羧基端的间隔分子连于T辅助肽。免疫原性肽或T辅助肽的氨基端可以形成酰基化。示例性T辅助肽包括，破伤风类毒素830-843，流感307-319，疟疾环子孢子状体382-398和378-389。

在一些实施例中，在本发明的药物组合物中最好含有至少一种引发(prime)CTL的成分。据鉴别，脂质类能作为在活体内引发抗病毒抗原的CTL的物质。例如，各种棕榈酸残基可以随着于Lys残基的α和ε氨基，然后再通过例如一个或多个连接残基如，Gly，Gly-Gly-，Ser，Ser-Ser等连于免疫原性肽。于是这种脂化的肽就可以直接掺入脂质体或在佐剂(如不完全的Freund佐剂)中乳化以胶粒形式注射。在一个优选实例中，特别有效的免疫原含有连于Lys的α和ε氨基基团的棕榈酸，它再通过如Ser-Ser的方式附着于免疫原性肽的氨基末端。

作为脂质引发CTL应答的另一例子，可用大肠杆菌的各种脂蛋白(如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰基丝氨酰基-丝氨酸(P3CSS))以共价键附着于适当的肽而引发病毒特异性CTL。参见Deres等人，Nature，342：561-564(1989)，本文将其纳入作为参考。本发明的肽能偶连于P3CSS，例如，该脂质肽可以施用于人体以特异性地引发对靶抗原的CTL应答。此外，因为还可以用偶连于具有一个适当表位的肽的P3CSS引发诱导中和抗体，所以两种组合物可以混合使用从而可对感染更有效地引发体液和细胞介导的应答。

此外，在肽的各末端添加额外的氨基酸，就可易于肽互相连接，与支承载体或更大的肽偶连，或修饰肽或寡肽的物理或化学特性等。可将诸如，酪氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，谷氨酸或天门冬氨酸之类的氨基酸引入肽或寡肽的C-或N-端。某些情况下在C末端的修饰会改变肽的结合特性。此外，通过例如烷酰基(C₁-C₂₀)或巯乙酰基乙酰化作用使末端-NH₂-酰化，或用氨或甲基胺等使末端-羧基酰胺化等而加以修饰，就可使肽或寡肽的序列可与天然序列不同。在某些情况下，这些修饰可为支承物或其他分子提供结合的一些位点。

本发明的肽可以用广泛不同的方法进行制备。由于这些肽相对较小的尺寸，可以用几种常规技术在溶液或固相载体上合成。已有各种市售的、可以根据已知的技术方案使用的自动合成仪。参见，例如Steward和Young，“固相肽合成”，第2版，Pierce Chemieal Co.(1984)，同上。

或者，也可以使用重组DNA技术，其中方法是将可编码相关的免疫原性肽的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染入适当的宿主细胞，并在适宜表达的条件下培养。这些技术都是本领域通晓的，一般如在Sambrook等人，“分子克隆，实验室手册”，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1982)中所述，本文将其纳入作为参考。因此，包含一个或多个本发明的肽序列的各种融合蛋白质能用于提供适当的T细胞表位。

因为用于此处对预期长度的肽的编码序列可以用各种化学方法，如，Matteucci等人的磷酸三酯法(J.Am Chem.Soc.103：3185(1981))进行合成，因此，通过对可编码原生肽序列的核苷酸中的适当碱基的替代就可以方便地进行修饰。再给该编码序列配上合适的接头并连入本领域常用的表达载体，然后使用该载体转化合适的宿主以产生所需的融合蛋白质。现在已可供应一批这样的载体和合适的宿主系统。为了表达各种融合蛋白质，可以给编码顺序配备一些可操作连接的起始密码子和终止密码子，起动子和终止子区域，而且通常一个复制系统，就可提供一个在所需的细胞宿主中表达的表达载体。例如，在含有可供插入所需编码序列的合适的限制性酶切位点的质粒中，可以提供与细菌宿主相容的起动子序列。将得到的表达载体可转化至合适的细菌宿主中。当然，若采用合适的载体和调控序列，还可以使用酵母或哺乳动物细胞宿主。

本发明的肽及其药物及疫苗组合物适用于哺乳动物，特别是供人使用，以治疗和/或预防病毒性感染和癌症。可以用本发明的免疫原性肽治疗的疾病的例子包括巨细胞病毒，诸如，前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、肾癌、宫颈癌、淋巴瘤，CMV和尖锐湿疣。

对于各种药物组合物，本发明的免疫原性肽能施用于已得癌症或被相关的病毒感染的个体。那些处于感染的潜伏期或急性期的病人，可以单独地用免疫原性肽进行治疗或结合其他治疗手段(如果合适的话)进行治疗。在治疗用途方面，施用于病人的组合物的用量须足以引发对病毒或肿瘤抗原的有效的CTL应答，并且可治愈或至少部分抑阻症状和/或并发症。足以实现该目的的用量被定义为“治疗有效剂量”。用于该用途的有效量取决于，例如肽组合物，施用方式，被治疗的疾病所处的阶段和严重性，病人的体重和健康的总体状况以及处方医生的判断，但是作为初次免疫处理(即，用于治疗或预防性施用)，对于70kg的病人，其用量通常为约1.0μg至约5000μg肽，随后加强剂量为约1.0-1000μg肽，在数周至数月内按照加强治疗方案施用，这种加强方案取决于病人的应答及病情(通过测量病人血中特异性CTL活性而知)。应记住，本发明的肽和各种组合物通常可用于严重的疾病状态也就是危及生命或可能危及生命的状态。在这种情况下，鉴于已尽可能减少了外来物质以及肽的相对无毒性，因而经治疗医生施用大大过量的这类肽组合物是可行而且也是合理的。

作为治疗用途时，可以在初现病毒感染症候或检知或手术去除肿瘤时、或在刚诊断出急性感染后不久便开始施用。随后使用加强剂量，直到至少症状基本消退并且经过一段时间。在慢性感染中，需要在负荷剂量后接着施用加强剂量。

用本发明的各种组合物治疗感染的个体，可以加速急性感染个体的感染状态的消退。对于那些容易(或素质易于)发展成慢性感染的个体，该类组合物在防止从急性感染向慢性感染的演变的方法中特别有用。当易感个体在感染之前或感染中被诊断出时(如本文所述)，便可将组合物以他们为目标，以减少对更大人群范围施用的需要。

各种肽组合物还可用于治疗慢性感染，和刺激免疫系统以消除携带者体内病毒感染的细胞。在配方中提供一定量具有免疫增强作用的肽和一种足够有效地激活细胞毒性T细胞应答的施用方式是至关重要的。因此，在治疗慢性感染方面对于70kg重的病人的代表性的剂量，每次约1.0-5000μg，较佳为5-1000μg。在施用免疫剂量后，可能需要按规定间隔(如1-4周)施用加强剂量，有时可能需要更长时间以便有效地使个体产生免疫。在慢性感染情况下，则须连续施用，直到至少临床症状或实验室检查表明，病毒感染已被清除或基本消退并持续一段时间。

用于治疗处理的各种药物组合物，可以非肠道施用、体表施用、口服或局部施用。药物组合物最好是通过非肠道施用，如静脉施用，皮下施用，皮内施用或肌内施用。因此，本发明提供了非肠道施用的组合物，其中包括溶于或悬浮于可接受的载体中的免疫原性肽溶液，最好是水质载体。可以使用各种水质载体如水、缓冲液、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以用已知的灭菌技术按常规进行灭菌处理或可灭菌过滤。得到的水溶液可以按原样进行包装以供使用，或冻干处理，冻干制剂在施用之前与无菌溶液进行混合。组合物还可以含有类似生理状态所需的药学上可接受的辅助性物质，如pH调节及缓冲剂，张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨聚糖、三乙醇胺油酸酯等。

在各种药物配方中本发明的CTL刺激性肽的浓度可以在大范围中变动，即，从小于约0.1％(通常为或至少为约2％)至高达20％-50％或更高(按重量计)，而且根据选用的特定施用方式，可以主要通过流体体积、粘度等进行选择。

本发明的肽还可以以脂质体形式进行施用，脂质体可将肽送至特定的组织(如，淋巴组织)或选择性地送至感染细胞，它还会提高肽组合物的半衰期。脂质体包括乳剂、泡沫剂、胶粒、不溶性单分子层、液晶、磷脂层分散剂、片状层等。在这些制剂中，待输送的肽作为脂质体的一部分掺入，或单独或连同结合于如，淋巴组织细胞中普遍存在的受体的分子，例如，结合于CD45抗原的单克隆抗体，或者和其他治疗或免疫组合物一起使用。因此，填入的或用所需要的本发明的肽修饰的脂质体可以被导向淋巴组织细胞所在部位，然后在该部位脂质体释出选定的治疗/免疫用原性肽组合物。用于本发明的脂质体可以用标准的成泡脂质类制备，其中通常包括，中性或带负电荷的磷脂类和甾醇，如胆固醇。脂质类的选择通常考虑如，脂质体大小，酸不稳定性和在血流中脂质体的稳定性。已有各种制备脂质体的方法，如，Szoka等人，Ann.Bey.BiophysBioeng 9：467(1980)，美国专利第4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369号所述(本文将它们全部纳入作为参考)。

为了靶向免疫细胞，掺入到脂质体中的配基可以包括：例如，对于所期望的免疫系统细胞的细胞表面决定簇具有特异的抗体或其片段。含有肽的脂质体悬浮液可以静脉内施用，局部施用或体表施用等，其用量可以根据尤其是施用方式、被输送的肽、以及被治疗的疾病所处的阶段而改变。

对于各种固体组合物，可以使用各种常规的无毒性固相载体，包括如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服，可以通过掺入任何通常采用的赋形剂(例如前面列出的那些载体)而形成药学上可接受的无毒性组合物，它通常含有10％-95％活性成分(即一种或多种本发明的肽)，更佳的浓度为25％-75％。

对于气雾剂施用，免疫原性肽最好和表面活性剂及推进剂一起，以精细分散的形式施用。肽的一般百分比为0.01-20％(重量)，更佳为1-10％。当然，表面活性剂必须无毒性、而且最好可溶于推进剂中。这类制剂的代表是，含有6-22个碳原子的脂肪酸(例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸和油酸)与脂族多羟醇或其环状酐形式的酯类或部分酯类。可以使用混合酯类，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂可占组合物的0.1-20％(重量)，更佳为0.25-5％。组合物的其余部分通常为推进剂。如果需要，还可包括一种载体，和例如用于鼻内给药的卵磷酯。

本发明另一方面涉及疫苗，它含有致免疫有效量的本文所述的免疫原性肽作为活性成分。可将肽引入某宿主(包括人)，其形式可以是连于其自己的载体或者作为活性肽单元的同类多聚物或异类多聚物。这种聚合物具有使免疫反应增加的优点，而且当使用不同的肽构成聚合物时还具有诱导能与病毒或肿瘤细胞的不同抗原决定簇反应的抗体和/或CTL的额外能力。可以使用的各种载体是本领域公知的，包括例如，甲状腺球蛋白、白蛋白(如人血清白蛋白)，破伤风类毒素，聚氨基酸(如聚(赖氨酸：谷氨酸))，流感、乙型肝炎病毒髓芯蛋白，乙型肝炎病毒重组疫苗等。各种疫苗还可含有生理上可承受的(可接受的)稀释剂如水、磷酸盐缓冲盐水、或盐水，一般还可包括佐剂。诸如，不完全Freund佐剂，磷酸铝，氢氧化铝，或明矾之类的佐剂是本领域公知的材料。而且，如上所述，通过将本发明的肽偶连于脂质类(如P₃CSS)可以引发CTL应答。一旦通过注射、气雾剂、口服、皮内或其他途径施用此处所述的肽组合物进行免疫，则宿主的免疫系统会通过产生大量针对所需抗原特异性的CTL而对疫苗应答，该宿主至少可对以后的感染有部分免疫力或能防止演变为慢性感染。

含有本发明的肽的各种疫苗组合物，可以施用于易感或处于病毒感染或癌症威胁的病人，可引发针对抗原的免疫应答，并因此增强病人自身的免疫应答能力。这样的用量被定义“致免疫有效剂量”。在这样应用中，精确的用量同样取决于病人的健康状况和体重，施用方式，配方的性质等，但对于每一70kg的病人的用量范围，通常为1.0μg至约5000μg，更常用的为每70kg体重约10-500μg。

在某些情况下，最好是将本发明的各种肽疫苗和能诱导针对相关的病毒(尤其是病毒包膜抗原)的中和抗体应答的疫苗一起混合使用。

对于治疗或免疫用途，还可将可编码本发明一种或多种肽的各种核酸施用于患者。可方便地使用多种方法将核酸送递给患者。例如，可直接以“裸DNA”方式送递核酸。这种方法可参见例如Wolff等人，Science 247：1465-1468(1990)以及美国专利第5,580,859和5,589,466号。也可用冲击送递法施用核酸，参见如，美国专利第5,204,253号所述。可以给予只包含DNA的粒子。或者，可将DNA附着于粒子(如黄金粒子)。也可将核酸复合于阳离子化合物(阳离子脂质类)施用。脂质-介导的基因送递方法可参见，如WO96/18372、WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)Bio Techniques 6(7)：682-691；Rose美国专利第5,279,833号；WO91/06309；和Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7414。本发明的肽还可以由减毒的病毒宿主(如牛痘或鸡痘病毒)进行表达。这种方法涉及使用牛痘病毒作为载体，来表达可编码本发明的肽的各种核苷酸序列。一旦引入急性或慢性感染的宿主中或未感染的宿主中，重组的牛痘病毒便可表达免疫原性肽，从而引起宿主的CTL应答。用于免疫方案中的牛痘载体和方法在例如美国专利第4,722,848号中有所描述(本文将其纳入作为参考)。另一种载体是BCG(卡介苗)。各种BCG载体在Stover等人的著作中(Nature 351：456-460(1991))有所描述(本文将其纳入作为参考)。本领域的熟练技术人员将根据本文的描述能显而易见领会和掌握大量其他的能用于治疗性施用或免疫施用本发明的肽的载体(如，鼠伤寒沙门氏菌载体等)。

施用可编码本发明的肽的各种核酸的一些优选方法是，使用可编码本发明多元表位的小基因构建物。为了制备可编码选定的CTL的一些表位(小基因)的DNA序列用于在人细胞内表达，须逆向翻译这些表位的氨基酸序列。利用人密码子检索表可指导对各氨基酸的密码子选择。将这些编码表位的DNA序列直接连接，可产生一个连续的多肽序列。为了最优化表达和/或免疫原性，可将其它元件掺入小基因设计中。可逆向翻译且包含在这种小基因序列中的氨基酸序列各种实例包括：辅助T淋巴细胞表位、前导(信号)序列和内质网保守信号。另外，通过在与CTL表位相邻处包含合成的(如聚-丙氨酸)或天然存在的一些侧翼序列，就可改善CTL表位的MHC表现。

通过装配可编码小基因的正股和负股的各种寡核苷酸，就可将小基因序列转化成DNA。用已知的一些方法在适合的条件下合成、磷酸化、纯化并韧化各种重叠寡核苷酸(长度为30-100个碱基)。再用T4 DNA连接酶连接各寡核苷酸的各末端。然后就能将此合成的可编码CTL表位多肽的小基因克隆入合适的病毒载体中。

在载体中包含本领域技术人员熟知的各种标准调节序列，可以确保靶细胞中的表达。所需要的一些载体元件：具有供小基因插入的下游克隆位点的启动子；用于有效转录终止的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制原点；和大肠杆菌选择性标记(如，氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。有将多种启动子可用于此目的，如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。其它合适的启动子序列可参见美国专利第5,580,859和5,589,466号。

可能需要其它一些载体修饰来最优化小基因的表达和免疫原性。在一些情况中，有效的基因表达需要一些内含子，和可插入小基因被转录的区域中的一个或多的合成的或天然的内含子。mRNA稳定性序列的包含，也可视为有利于增加小基因的表达。据最近提出：一些免疫刺激性序列(各种ISS或CpG)可在DNA疫苗的免疫原性中起作用。可以在小基因编码序列外的载体内包含这些序列以期提高免疫原性。

在一些实施例中，可以使用生物同位素分析(bioistronic)病毒载体，以产生小基因编码的一些表位和所包含的提高或降低免疫原性的第二种蛋白质。如果共-表达能有益地提高免疫应答的各种蛋白质或多肽的实例包括：细胞因子(如IL2、IL12、GM-CSF)、可诱导细胞因子的分子(如LeIF)或一些辅助刺激分子。可辅助细胞(HTL)的一些表位可结合入一些细胞内的靶信号并与各种CTL表位分开表达。这可以将HTL表位异向于和CTL表位不同的细胞区室。如果需要，这还可有利于HTL表位更有效地进入II类MHC途径，从而改善CTL的诱导作用。与CTL诱导相反，通过一些免疫抑制分子(如TGF-β)的共表达而特异性降低免疫应答可能对一些疾病是有益的。

一旦选定了表达载体，小基因就可克隆入启动子下游的多接头区域。该质粒可转化入适合的大肠杆菌菌株中，并可用标准方法制备DNA。使用限制性酶切绘图和DNA测序试验就可验证。这种小基因的定向作用和DNA序列以及载体中所包含的所有其它元件。可存储这种携带正确质粒的细菌细胞，作为母本细胞库和工作细胞库。

通过大肠杆菌的发酵作用以及随后的纯化处理可制备治疗用量的质粒DNA。将工作细胞库的若干等份细胞用于接种发酵培养基(如Terrific肉汤)，并用熟知的方法使之摇瓶或生物反应器内生长至饱和。可以用标准生物分离方法，如固相阴离子交换树脂(Quiagen提供)纯化质粒DNA。如果需要，可以用凝胶电泳法或其它方法将超螺旋DNA与开环和线形DNA分开。

可以用各种配方来制备注射用的纯化的质粒DNA。其中最简单的方法是在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重建冷冻干燥DNA。已描述了多种方法，还有一些新方法也将可供使用。如上所述，各种核酸可方便地用一些阳离子脂质类配制。另外，还可将糖脂质类、基因融合脂质体、肽和综合性的PINC(保护性、活性、非-凝缩性)的各种化合物与纯化的质粒DNA复合，从而影响各种变量，如，稳定性、肌内分布、向特定的器官或细胞类型运输。

可将靶细胞敏化作用用于对小基因编码的各种CTL表位的表达和I类MHC表现的功能性试验。将质粒DNA引入适用于作为标准CTL铬释放试验的靶标的哺乳动物细胞系。所用的转染方法取决于最终的制剂。“可使用电穿孔法裸”出DNA，而用各种阳离子脂质类指导活体外转染。可用表达绿色荧光蛋白质(GEP)的质粒共转染，使用荧光活化细胞分选法(FACS)富集转染的细胞。然后用铬-51标记这些细胞，并用作各种表位-特异性CTL系的靶细胞。据51Cr释放探测的细胞溶解情况表明：其中有表现小基因编码的CTL表位的MHC的产生。

在活体内，免疫原性是对小基因DNA制剂功能性测试的另一种方法。用DNA制品免疫接种可表达适当的人MHC分子的转基因小鼠。施用的剂量和途径是依制剂而定(如PBS DNA配制的采用肌肉注射(IM)，脂类-复合配制的DNA采用腹膜内注射(IP))。免疫接种后21天，收获脾细胞，并在可编码测试的各表位的肽的存在下再刺激1周。用标准方法测试这些效应细胞(CTL)的负载肽的以铬-51标记的靶细胞的细胞溶解情况。用相应于小基因编码的表位的负载MHC的肽敏化的靶细胞的裂解表明：DNA疫苗具有在活体内诱导CTL的功能。

抗原肽还可以用来在离体条件下引发CTL。得到的CTL能用于治疗对其他常规的治疗方法不产生应答或者对于肽疫苗的治疗方法不会产生应答的。病人的慢性感染(病毒性或细菌性)或肿瘤，而这些病人通过在组织培养物中将病人的CTL前体细胞(CTLp)和某来源的表现抗原的细胞(APC)及适当的免疫原性肽一起孵育对特定病原(感染因子或肿瘤抗原)的离体CTL应答。诱导孵育适当时间后(一般为1-4周)，在此期间CTLp被激活并成熟并扩大成效应CTL，再将细胞输回病人，在病人体内它们会摧毁其特异性靶细胞(感染细胞或肿瘤细胞)。为了最优化在活体外产生特异性细胞毒性T细胞的条件，须将刺激细胞的培养物维持在适当的无血清培养基中。

在将待活化的细胞(如前体CD8+细胞)与刺激细胞一起培养之前，在刺激细胞培养物中去加入一定量抗原性肽，所加入的肽的量要足以负载到能在刺激细胞的表面上表达的人I类分子上。在本发明中，肽的足够量指能让约200(较佳地为200或更多)个人I类MHC分子将在各刺激细胞表面上表达负载到的用量。较佳的是，将＞20μg/ml肽与刺激细胞一起培养。

然后将静息的或前体CD8+细胞与合适的刺激细胞一起在培养物中培养一段足以活化CD8+细胞的时间。较佳的是，以抗原特异性方式活化CD8+细胞。对于各个体之间，静息的或前体CD8+细胞与刺激细胞的比例各不相同，取决于各种因素，如个体的淋巴细胞对培养条件的顺应性和疾病善的性质和严重程度，或在所述范围内来用的治疗模式的其它条件。但淋巴细胞：刺激细胞的比例的范围宜为约30∶1到300∶1。可以将效应细胞/刺激细胞培养物尽量维持刺激在治疗上产生有效量CD8+细胞所需的时间。

在该活体外对CTL的诱发需要结合于APC上的等位基因特异性I类MHC分子的肽的特异性识别。每个APC的特异性MHC/肽复合物的数量对刺激CTL(尤其是在初期免疫应答中)是关键性的。当每个细胞仅有少量肽/MHC复合物时就细胞足以使CTL易被(TL)裂解或可刺激二级CTL应答，在初级应答过程中，CTL前体(pCTL)的成功活化需要有明显多量的MHC/肽复合物。细胞上的空载的主要组织相容性复合分子在负载肽后就能诱导初级细胞毒性T淋巴细胞应答。

由于各种突变细胞系不存在每种人类MHC等位基因，最好是用一种技术从APC表面除去内源性MHC-相关性肽，随后用相关的免疫原性肽负载到得到的空载的MHC分子上。最好是用患者的未-转化的(非-致肿瘤性)、未-感染的细胞和较佳的是其自身细胞作为APC，CTL治疗CTL诱导方案来设计开发对针对以指导离体的。本申请公开了从APC表面剔除内源性MHC-相关性肽，随后再负载所需的肽的各种方法。

稳定的I类MHC分子是由如下一些元件形成的一种三聚复合物：1)通常长度为8-10个残基的肽，2)透膜多形性蛋白质重链，在它的α1和α2区域具有肽结合位点和3)非共价结合的非-多形性轻链，β₂微球蛋白。从复合物除去结合的肽和/或将β₂微球蛋白从复合物上分开，使I类MHC分子失去功能且不稳定，从而迅速降解。从各种PBMC分离的所有I类MHC分子都具有结合于其上的内源性肽。因此，第一步骤是除去与APC上I类MHC分子结合的所有内源性肽，并且让它们不降解以便添加外源肽。

两种除去结合肽的I类MHC分子的可能方法包括：将培养温度从37℃降低至26℃过夜，使β2微球蛋白不稳定，然后用温和的酸处理除去细胞上的内源性肽。这种方法将原先结合的肽释放到细胞外，从而让新的外源性肽结合到空载的I类分子中。低温培养方法能让外源肽有效地结合于MHC复合物，但需要在26℃培养过夜，而这会降低细胞的代谢速度。用这种低温方法，细胞可能不能主动合成MHC分子(如静息的PBMC)，也不产生大量表面空载的MHC分子。

可采用该酸洗脱包括用三氟乙酸(pH2)提取肽或酸变性免疫亲合纯化的I类-肽复合物。但这些方法对CTL诱导不适用，因为重要的是要保留APC活力和最优化代谢状况(对抗原表现是关键的)，而只要除去内源性肽。已使用pH3的弱酸溶液(如，甘氨酸或柠檬酸-磷酸缓冲液)来鉴定内源性肽和肿瘤相关性T细胞表位。这种处理是特别有效的，因为只有I类MHC分子失稳(并释放相关性肽)，而其它表面抗原(包括II类MHC分子)则保持完整。最重要的是，用弱酸溶液处理细胞不会影响细胞的活力和代谢状况。弱酸处理是迅速的，因为内源性肽的洗脱在4℃进行只要2分钟，并且在合适的肽负载后APC易于行使功能。这里用这种方法制备肽特异性的各种APC用于产生初级抗原特异性CTL。得到的APC能有效地诱导肽特异性CD8+CTL。

用各种已知方法中的一种可有效地将活化的CD8+细胞与刺激细胞分开。例如，可用对刺激细胞、负载到刺激细胞的肽或CD8+细胞(或其片段)有特异性的单克隆抗体来结合它们适当的补偿性配体。随后可以用合适的手段(如通过熟知的免疫沉淀性或免疫测定方法)从刺激细胞-效应细胞混合物中提取各种抗体标记的分子。

活化的CD8+细胞的有效的细胞毒性用量在活体外和活体内的使用可以不同，且也取决于这些淋巴细胞最终的靶细胞的数量和类型。其用量同样还取决于患者的体况，并应由医生考虑所有适合的因素后予以确定。但较佳的是，用于成年人的活化CD8+细胞用量为约1×10⁶-1×10¹²，更佳的为1×10⁸-1×10¹¹，尤佳的是1×10⁹-1×10¹⁰与之相比，小鼠用量为约5×10⁶-5×10⁷个细胞。，

较佳地，如上所述，从细胞培养物收获活化的CD8+细胞并将该CD8+细胞施用于待处理的个体。但特别要指出的是：与其它已有的和拟采用的处理用药程式不同，本发明的方法使用的是非致肿瘤的细胞培养物系统。因此，即使没有实现刺激细胞和活化CD8+细胞的完全分离，也不会出现已知与施用少量刺激细胞相关的固有危险，而施用哺乳动物类的肿瘤促进细胞则是非常危险的。

再引入细胞成分的各种方法是本领域已知的，包括如，在授予Honsik等人的美国专利第4,844,893号和授予Rosenberg的美国专利第4,690,915号中示例的一些方法。例如，通过静脉灌注施用活化的CD8+细胞是适用的。

还可将本发明的免疫原性肽用于制备单克隆抗体。这些抗体可用作潜在的诊断剂或治疗剂。

本发明的肽还可以用于诊断试剂。例如，本发明的一种肽可以用于确定特定个体对采用肽或相关肽的治疗方案的敏感性，因而能够有助于修改现有的治疗方案或有助于对受染的个体确定其预后情况。此外，该肽还可以用于预测哪些个体会受到演变成慢性感染的真正危险。

为了鉴定本发明的肽，如在相关的申请中所述进行I类抗体的分离、以及天然形成的肽的分离和测序。然后用这些肽来确定以下各等位基因A3.2、A1、A11和A24.1的特异性结合基序。在以上说明书的第3页对这些基序进行了描述。下列表8-11所述的一些基序，是从相关的申请中所述的天然加工的肽的合并的测序数据中确定的。

表8

汇综

HLA-A3，2等位基因-特异性基序

位置保守的残基

1 -

2 V，L，M

3 Y，D

4 -

5 -

6 -

7 I

8 Q，N

9 K

10 K

表9

汇综

HLA-A1等位基因-特异性基序

位置保守的残基

1 -

2 S，T

3 D，E

4 P

5 -

6 -

7 L

8 -

9 Y

10 K

表10

汇综

HLA-A11等位基因-特异性基序

位置保守的残基

1 -

2 T，V

3 M，F

4 -

5 -

6 -

7 -

8 Q

9 K

10 K

表11

汇综

HLA-A24.1等位基因-特异性基序

位置保守的残基

1 -

2 Y

3 I，M

4 D，E，G，K，P

5 L，M，N

6

7 N，V

8 A，E，K，Q，S

9 F，L

10 F，A

实施例2

免疫原性肽的鉴定

用上述对从各种病原体和肿瘤相关性蛋白质的各种I类MHC等位基因氨基酸序列鉴定的基序来分析是否存在这些基序。按相关的申请所述进行筛选。表12提供了对这些抗原的检索结果。

表12肽 AA 序列来源 A^*0301 A^*110128.0719 10 ILEQWVAGRK HDV.nuc.16 0.0170 0.001228.0727 10 LSAGGKNLSK HDV.nuc.115 0.0097 0.01501259.02 11 STDTVDTVLEK Flu.HA.29 0.0001 0.06701259.04 9 GIAPLQLGK Flu.HA.63 0.6100 0.20001259.06 10 VTAACSHAGK Flu.HA.149 0.0380 0.04901259.08 9 GIHHPSNSK Flu.HA.195 0.1300 0.01401259.10 10 RMNYYWTLLK Flu.HA.243 2.5000 2.30001259.12 11 ITNKVNSVIEK Flu.HA.392 0.0200 0.06701259.13 11 KMNIQFTAVGK Flu.HA.402 0.0280 0.00921259.14 9 NIQFTAVGK Flu.HA.404 0.0017 0.03301259.16 11 AVGKEFNKLEK Flu.HA.409 0.0210 0.04601259.19 11 KVKSQLKNNAK Flu.HA.465 0.0470 0.00311259.20 11 SVRNGTYDYPK Flu.HA.495 0.0410 0.14001259.21 9 SIIPSGPLK Flu.VMT1.13 0.7800 8.80001259.25 10 RMVLASTTAK Flu.VMT1.178 0.5500 0.03501259.26 9 MVLASTTAK Flu.VMT1.179 1.7000 1.40001259.28 10 RMGVQMQRFK Flu.VMT1.243 0.1000 0.00591259.33 10 ATEIRASVGK Flu.VNUC.22 0.1400 0.30001259.37 11 TMVMELVRMIK Flu.VNUC.188 0.0890 0.03101259.43 10 RVLSFIKGTK Flu.VNUC.342 0.8000 0.0830F119.01 9 MSLQRQFLR ORF3P 0.2000 0.7200F119.02 9 LLGPGRPYR TRP.197 0.0190 0.0091F119.03 9 LLGPGRPYK TRP.197K9 2.2000 0.680034.0019 8 RVYPELPK CEA.139 0.0130 0.044034.0020 8 TVSAELPK CEA.495 0.0037 0.032034.0021 8 TVYAEPPK CEA.317 0.0160 0.022034.0029 8 TINYTLWR MAGE2.74 0.0140 0.055034.0030 8 LVHFLLLK MAGE2.116 0.0290 0.150034.0031 8 SVFAHPRK MAGE2.237 0.1410 0.081034.0043 8 KVLHHMVK MAGE3.285 0.0580 0.019034.0050 8 RVCACPGR p53.273 0.3500 0.0490

表12肽 AA 序列来源 A^*0301 A^*110134.0051 8 KMFCQLAK p53.132 0.3800 0.360034.0062 8 RAHSSHLK p53.363 0.5500 0.007134.0148 9 FVSNLATGR CEA.656 0.0019 0.049034.0152 9 RLQLSNGNK CEA.546 0.0250 0.011034.0153 9 RNGIPQQK CEA.628 0.0400 0.078034.0154 9 KIRKYTMRK HER2/neu.681 0.0620 0.005534.0155 9 LVHFLLLKK MAGE2.116 0.5220 1.400034.0156 9 SMLEVFEGK MAGE2.226 0.0950 1.600034.0157 9 SSFSTTINK MAGE2.69 0.1600 2.000034.0158 9 TSYVKVLHK MAGE2.281 0.5300 0.150034.0159 9 VIFSKASEK MAGE2.149 0.4900 0.053034.0160 9 GSVVGNWQK MAGE3.130 0.0040 0.206034.0161 9 SSLPTTMNK MAGE3.69 0.6180 0.710034.0162 9 SVLEVFEGK MAGE3.226 0.1330 0.900034.0171 9 SSBMGGMNK p53.240 0.5440 1.100034.0172 9 SSCMGGMNK p53.240 0.0090 0.049034.0211 10 RTLTLFNVTK CEA.554 0.2200 1.300034.0212 10 TISPLNTSYK CEA.241 0.1800 0.033034.0214 10 STTINYTLWK MAGE2.72 0.0870 0.650034.0215 10 ASSLPTTMNK MAGE3.68 0.0420 0.027034.0225 10 KTYQGSYGFK p53.101 0.4900 0.420034.0226 10 VVRRBPHHEK p53.172 0.1800 0.210034.0228 10 GLAPPQHLIK p53.187 0.0570 0.016034.0229 10 NSSCMGGMNK p53.239 0.0071 0.029034.0230 10 SSBMGGMNRK p53.240 0.0420 0.160034.0232 10 RVCACPGRDK p53.273 0.0190 0.025034.0295 11 KTITVSAELPK CEA.492 0.3600 0.160034.0296 11 TTITVYAEPPK CEA.314 0.0200 0.028034.0298 11 PTISPSYTYYR CEA.418 (0.0002) 0.130034.0301 11 GLLGDNQVMPK MAGE2.188 0.0780 0.004734.0306 11 MVELVHFLLLK MAGE2.113 0.0200 0.012034.0308 11 FSTTINYTLWR MAGE2.71 0.0110 0.0170

表12

肽 AA 序列来源 A^*0301 A^*1101

34.0311 11 GLLGDNQIMPK MAGE3.188 0.1300 0.0570

34.0317 11 RLGFLHSGTAK p53.110 0.0430 0.0001

34.0318 11 ALNKMFCQLAK p53.129 0.4400 0.0420

34.0323 11 RVCACPGRDRR p53.273 0.0290 0.0290

34.0324 11 LSQETFSDLWK p53.14 (0.0009) 0.0470

34.0328 11 RAHSSHLKSKK p53.363 0.0270 0.0038

34.0329 11 VTCTYSPALNK p53.122 0.0700 0.1200

34.0330 11 GTRVRAMAIYK p53.154 1.1000 0.3300

34.0332 11 STSRHKKLMFK p53.376 0.3100 0.1300

40.0107 9 LAARNVLVK Her2/neu.846 0.0580 0.0285

40.0109 9 MALESILRR Her2/neu.889 0.0034 0.0237

40.0145 10 ISWLGLRSLR Her2/neu.450 0.0410 0.0027

40.0147 10 GSGAFGTVYK Her2/neu.727 0.0660 0.1300

40.0153 10 ASPLDSTFYR Her2/neu.997 0.0003 0.0670

实施例3

免疫原性肽的鉴定

用在所述相关的申请中鉴定为B7样的一些超螺旋基序，分析各种病原体和肿瘤相关性蛋白质的序列是否存在这些基序。用相关申请所述进行筛选。表13提供了对这些抗原的检索结果。

表13

肽序列来源

40.0013 SPGLSAGI CEA.680I8

40.0022 KPYDGIPA Her2/neu.921

40.0023 KPYDGIPI Her2/neu.921I8

40.0050 APRMPEAA p53.63

40.0051 APRMPEAI p53.63I8

40.0055 APAAPTPI p53.76I8

表13(续)肽序列来源40.0057 APTPAAPI p53.79I840.0059 TPPAAPAPI p53.81I840.0061 APAPAPSI p53.84I840.0062 SPALNKMF p53.12740.0063 SPALNKMI p53.127I840.0117 SPSAPPHRI CEA.3I940.0119 PPHRWCIPI CEA.7I940.0120 GPAYSGREI CEA.9240.0156 MPNQAQMRILI Her2/neu.706I1040.0157 MPYGCLLDHVI Her2/neu.801I1040.0161 APPHRWCIPW CEA.640.0162 APPHRWCIPI CEA.6I1040.0163 IPWQRLLLTA CEA.1340.0164 IPWQRLLLTI CEA.13I1040.0166 LPQHLFGYSI CEA.58I1040.0201 RPRFRELVSEF Her2/neu.96640.0202 RPRFRELVSEI Her2/neu.966I1140.0205 PPSPREGPLPA Her2/neu.114940.0206 PPSPREGPLPI Her2/neu.1149I1140.0207 GPLPAARPAGA Her2/neu.115540.0208 GPLPAARPAGI Her2/neu.1155I1140.0231 APAPAAPTPAA p53.7440.0232 APAPAAPTPAI p53.74I1140.0233 APAAPTPAAPA p53.7640.0234 APAAPTPAAPI p53.76I1145.0003 IPWQRLLI CEA.13.I845.0004 LPQHLFGI CEA.58.I845.0007 RPGVNLSI CEA.428.I845.0010 IPQQHTQI CEA.632.I845.0011 TPNNNGTI CEA.646.I845.0016 CPLHNQEI Her2/neu.315.I845.0017 KPCARVCI Her2/neu.336.I845.0019 WPDSLPDI Her2/neu.415.I8

表13(续)肽序列来源45.0023 SPYVSRLI Her2/neu.779.I845.0024 VPIKWMAI Her2/neu.884.I845.0026 RPRFRELI Her2/neu.966.I845.0028 APGAGGMI Her2/neu.1036.I845.0031 SPGKNGVI Her2/neu.1174.I845.0037 SPQGASSI MAGE3.64.I845.0038 YPLWSQSI MAGE3.77.I845.0044 SPLPSQAI p53.33.I845.0046 MPEAAPPI p53.66.I845.0047 APAPSWPI p53.86.I845.0051 KPVEDKDAI CEA.155.I945.0054 IPQQHTQVI CEA.632.I945.0060 APPVAPAPI p53.70.I945.0062 APAAPTPAI p53.76.I945.0064 PPGTRVRAI p53.152.I945.0065 APPQLIRI p53.189.I945.0071 IPQQHTQVLI CEA.632.I1045.0072 SPGLSAGATI CEA.680.I1045.0073 SPMCKGSRCI Her2/neu.196.I1045.0074 MPNPEGRYTI Her2/neu.282.I1045.0076 CPLHNQEVTI Her2/neu.315.I1045.0079 KPDLSYMPII Her2/neu.605.I1045.0080 TPSGAMPNQI Her2/neu.701.I1045.0084 GPASPLDSTI Her2/neu.995.I1045.0091 APPVAPAPAI p53.70.I1045.0092 APAPAAPTPI p53.74.I1045.0093 APTPAAPAPI p53.79.I1045.0094 APSWPLSSSI p53.88.I1045.0103 APTISPLNTSI CEA.239.I1145.0108 SPSYTYYRPGI CEA.421.I1145.0117 CPSGVKPDLSI Her2/neu.600.I1145.0118 SPLTSIISAVI Her2/neu.649.I1145.0119 IPDGENVKIPI Her2/neu.740.I11

表13(续)

肽序列来源

45.0124 SPLDSTFYRSI Her2/neu.998.I11

45.0128 LPAARPAGATI Her2/neu.1157.I11

45.0134 HPRKLLMQDLI MAGE2.241.I11

45.0135 GPRALIETSYI MAGE2.274.I11

45.0139 GPRALVETSYI MAGE3.274.I11

45.0140 APRMPEAAPPI p53.63.I11

45.0141 VPSQKTYQGSI p53.97.I11

1145.10 FPHCLAFAY HBVPOL541类似物

1145.09 FPVCLAFSY HBVPOL541类似物

26.0570 YPALMPLYACI HBV.pol.645

提供以上描述用于阐述本发明而不是限制其范围。本发明的其他一些改变对于本领域普通技术人员是容易明了的，它们包括在所附的权利要求中。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均结合于此作为参考。

Claims

1.一种包含具有HLA-A2.1结合基序的免疫原性肽的组合物，其特征在于，所述的免疫原性肽选自：

AILTFGSFV，

HLRDFALAV，

ALLGSIALL，

ALLATILAA，

LLATILAAV，

RLFADELAA，

YLSKCTLAV，

LVYHIYSKI，

SMYLCILSA，

YLCILSALV，

VMFSYLQSL，

RLHVYAYSA，

GLQTLGAFV，

FVEEQMTWA，

QMTWAQTVV，

IILDTAIFV，

AIFVCNAFV，

AMGNRLVEA，

RLVEACNLL

TLSIVTFSL，

KLSVLLLEV，

LLLEVNRSV，

FVSSPTLPV，

AMLVLLAEI，

QMARLAWEA，

VLAIFGIFMA，

YLYHPLLSPI，

SLFEAMLANV，

STTGINQLGL，

LAILTFGSFV，

ALLGSIALLA，

ALLATILAAV，

LLATILAAYA，

RLFADELAAL，

YLSKCTLAVL，

LLVYHIYSKI，

SMYLCILSAL，

HLHRQMLSFV，

LLCGKTGAFL，

ETLSIVTFSL，

VMCTYSPPL，

KLFCQLAKT，

ATPPAGSRV，

FLQSGTAKSV，

CMDRGLTVFV，

VLLNWWRWRL，

GVFTGLTHI，

QMWKCLIRL，

IMTCMSADL，

ALAAYCLST，

VLSGKPAII，

FISGIQYLA，

YIMTCMSADL，

AIASLMAFTA，

GLAGAAIGSV，

MIGVLVGV，

VLPLAYISL，

SLGCIFFPL，

PLAYISLFL，

LMLFYQVWA，

NISIYNYFV，

NISVYNYFV，

FVWTHYYSV，

FLTWHRYHL，

LTWHRYHLL，

MLQEPSFSL，

SLPYWNFAT，

RLPEPQDVA，

VTQCLEVRV，

LLRTFTDAV，

NMVPFWPPV，

AVVGALLLV，

AVVAALLLV，

LLVAAIFGV，

SMDEANQPL，

VLPLAYISV，

SLGCIFFPV，

PLAYISLFV，

LLLFQQARV，

LMLFYQVWV，

LLPSSGPGV，

NLSIYNYFV，

NLSVYNYFV，

FLWTHYYSV，

SLKKTFLGV，

FLTWHRYHV，

MLQEPSFSV，

SLPYWNFAV，

ALGKNVCDV，

SLLISPNSV，

SLFSQWRVV，

TLGTLCNSV，

RLPEPQDVV，

VLQCLEVRV，

SLNSFRNTV，

SLDSFRNTV

FLNGTGGQV

VLLHTFTDV

ALVGALLLV

ALVAALLLV，

LLVALIFGV，

YLIRARRSV，

SMDEANQPV，

SLGCIFFPLL，

GMCCPDLSPV，

AACNQKILTV

FLTWHRYHLL，

SLHNLAHLFL

LLLVAAIFGV

LLVAAIFGVA，

ALIFGTASYL，

SMDEANQPLL，

LLTDQYQCYA，

SLGCIFFPLV，

FLMLFYQVWV，

ALCDQRVLIV，

ALCNQKILLTV，

FLTWHRYHLV，

SLHNLAHLFV，

NLAHLFLNGV，

NMVPFWPPVV，

ILVVAALLLV，

LLVALIFGTV，

ALIFGTASYV，

SMDEANQPLV，

LLTDQYQCYV，

LLIQNIIQNDT，

IIQNDTGFYTL，

TLFNVTRNDTA

LTLLSVTRNDV

GLYTCQANNSA，

ATVGIMIGVLV，

GLVPPQHLIRV，

GLAPPVHLIRV，

GLAPPEHLIRV，

ILIGVLVGV，

YLIMVKCWMV，

LLGRDSFEV，

FMYSDFHFI，

NMLSTVLGV

SLENFRAYV，

KMAELVHFV，

KLAELVHFV

VLIQRNPQV，

VLLGVVFGV，

SLISAVVGV，

YMIMVKBWMI，

YLIMVKBWMV，

KLWEELSVV，

AMBRWGLLV，

IJIGVLVGV，

ATVGIJIGV，

SJPPPGTRV，

LVFGIELJEV，

ILGFVFTL，

KIFGSLAFL，

YLQLVFGIEV，

MMNDQLMFL，

ALVLAGGFFL，

WLCAGALVL，

MVFELANSI，

RMMNDQLMFL，

LVLAGGFFL，

VLAGGFFLL，

LLHETDSAV，

LMYSLVHNL，

QLMFLERAFI，

LMFLERAFI，

KLGSGNDFEV，

LLQERGVAYI，

GMPEGDLVYV，

FLDELKAENI，

ALFDIESKV，

和GLPSIPVHPI。

2.一种可引发细胞毒性T细胞针对患者体内表达HLA-A2.1 MHC产物的预选定的抗原发生应答的方法，其特征在于，所述的方法包括将患者的细胞毒性T细胞与含有选自以下免疫原性肽的组合物相接触：

AILTFGSFV，

HLRDFALAV，

ALLGSIALL，

ALLATILAA，

LLATILAAV，

RLFADELAA，

YLSKCTLAV，

LVYHWSKI，

SMYLCILSA，

YLCILSALV，

VMFSYLQSL，

RLHVYAYSA，

GLQTLGAFV，

FVEEQMTWA，

QMTWAQTVV，

IILDTAIFV，

AIFVCNAFV，

AMGNRLVEA，

RLVEACNLL

TLSIVTFSL，

KLSVLLLEV，

LLLEVNRSV，

FVSSPTLPV，

AMLVLLAEI，

QMARLAWEA，

VLAIEGIFMA，

YLYHPLLSPI，

SLFEAMLANV，

STTGINQLGL，

LAILTFGSFV，

ALLGSIALLA，

ALLATILAAV，

LLATILAAVA，

RLFADELAAL，

YLSKCTLAVL，

LLVYHIYSKI，

SMYLCILSAL，

HLHRQMLSFV，

LLCGKTGAFL，

ETLSIVTFSL，

VMCTYSPPL，

KLFCQLAKT，

ATPPAGSRV，

FLQSGTAKSV，

CMDRGLTVFV，

GVFTGLTHI，

QMWKCLIRL，

IMTCMSADL，

ALAAYCLST，

VLSGKPAII，

FISGIQYLA，

YIMTCMSADL，

AIASLMAFTA，

GLAGAAIGSV，

MIGVLVGV，

VLPLAYISL，

SLGCIFFPL，

PLAYISLFL，

LMLFYQVWA，

NISIYNYFV，

NISVYNYFV，

FVWTHYYSV，

FLTWHRYHL，

LTWHRYHLL，

MLQEPSFSL，

SLPYWNFAT，

RLPEPQDVA，

VTQCLEVRV，

LLHTFTDAV，

NMVPFWPPV，

AVVGALLLV，

AVVAALLLV，

LLVAAIFGV，

SMDEANQPL，

VLPLAYISV，

SLGCIFFPV，

PLAYISLFV，

LLLFQQARV，

LMLFYQVWV，

LLPSSGPGV，

NLSIYNYFV，

NLSVYNYFV，

FLWTHYYSV，

SLKKTFLGV，

FLTWHRYHV，

MLQEPSFSV，

SLPYWNFAV，

ALGKNVCDV，

SLLISPNSV，

SLFSQWRVV，

TLGTLCNSV，

RLPEPQDVV，

VLQCLEVRV，

SLNSFRNTV，

SLDSFRNTV

FLNGTGGQV

VLLHTFTDV

ALVGALLLV

ALVAALLLV，

LLVALIFGV，

YLIRARRSV，

SMDEANQPV，

SLGCIFFPLL，

GMCCPDLSPV，

AACNQKILTV

FLTWHRYHLL，

SLHNLAHLFL

LLLVAAIFGV

LLVAAIFGVA，

ALIFGTASYL，

SMDEANQPLL，

LLTDDQYQCYA，

SLGCIFFPLV，

FLMLFYQVWV，

ALCDQRVLIV，

ALCNQKILTV，

FLTWHRYHLV，

SLHNLAHLFV，

NLAHLFLNGV，

NMVPFWPPVV，

ILVVAALLLV，

LLVALIFGTV，

ALIFGTASYV，

SMDEANQPLV，

LLTDQYQCYV，

LLIQNIIQNDT，

IIQNDTGFYTL，

TLFNVTRNDTA

LTLLSVTRNDV

GLYTCQANNSA，

ATVGIMIGVLV，

GLVPPQHLIRV，

GLAPPVHLIRV，

GLAPPEHLIRV，

ILIGVLVGV，

YLIMVKCWMV，

LLGRDSFEV，

FMYSDFHFI，

NMLSTVLGV

SLENFRAYV，

KMAELVHFV，

KLAELVHFV

VLIQRNPQV，

VLLGVVFGV，

SLISAVVGV，

YMIMVKBWMI，

YLIMVKBWMV，

KLWEELSVV，

AMBRWGLLV，

IJIGVLVGV，

ATVGIJIGV，

SJPPPGTRV，

LVFGIELJEV，

ILGFVFTL，

KIFGSLAFL，

YLQLVFGIEV，

MMNDQLMFL，

ALVLAGGFFL，

WLCAGALVL，

MVFELANSI，

RMMNDQLMFL，

LVLAGGFFL，

VLAGGFFLL，

LLHETDSAV，

LMYSLVHNL，

QLMFLERAFI，

LMFLERAFI，

KLGSGNDFEV，

LLQERGVAYI，

GMPEGDLVYV，

FLDELKAENI，

ALFDIESKV，

和GLPSIPVHPI.。

3.一种包含选自以下的免疫原性肽的组合物：

RVYPELPK，

TVSAELPK，

TVYAEPPK，

TINYTLWR，

LVHFLLLK，

SVFAHPRK，

KVLHHMVK，

RVCACPGR，

KMFCQLAK，

RAHSSHLK，

FVSNLATGR，

RLQLSNGNK，

RINGIPQQK，

KIRKYTMRK，

LVHFLLLKK，

SMLEVFEGK，

SSFSTTINK，

TSYVKVLHK，

VIFSKASEK，

GSVVGNWQK，

SSLPTTMNK，

SVLEVFEGK，

SSBMGGMNK，

SSCMGGMNK，

RTLTLFNVTK，

TISPLNTSYK，

STTINYTLWK，

ASSLPTTMNK，

KTYQGSYGFK，

VVRRBPHHEK，

GLAPPQHLIK，

NSSCMGGMNK，

SSBMGGMNRK，

RVCACPGRDK，

KTTTVSAELPK，

TTTTVYAEPPK，

PTISPSYTYYR，

GLLGDNQVMPK，

MVELVHFLLLK，

FSTTINYTLWR，

GLLGDNQIMPK，

RLGFLHSGTAK，

ALNKMFCQLAK，

RVCACPGRDRR，

LSQETFSDLWK，

RAHSSHLKSKK，

VTCTYSPALNK，

GTRVRAMAIYK，

STSRHKKLMFK，

LAARNVLVK，

MALESILRR，

ISWLGLRSLR，

GSGAFGTVYK，

和ASPLDSTFYR。

4.一种可引发细胞毒性T细胞针对患者体内预选定的抗原发生应答的方法，其特征在于，所述的方法包括将患者的细胞毒性T细胞与含有选自以下免疫原性肽的组合物相接触：

RVYPELPK，

TVSAELPK，

TVYAEPPK，

TINYTLWR，

LVHFLLLK，

SVFAHPRK，

KVLHHMVK，

RVCACPGR，

KMFCQLAK，

RAHSSHLK，

FVSNLATGR，

RLQLSNGNK，

RINGIPQQK，

KIRKYTMRK，

LVHFLLLKK，

SMLEVFEGK，

SSFSTTINK，

TSYVKVLHK，

VIFSKASEK，

GSVVGNWQK，

SSLPTTMNK，

SVLEVFEGK，

SSBMGGMN，

SSCMGGMNK，

RTLTLFNVTK，

TISPLNTSYK，

STTINYTLWK，

ASSLPTTMNK，

KTYQGSYGFK，

VVRRBPHHEK，

GLAPPQHLIK，

NSSCMGGMNK，

SSBMGGMNRK，

RVCACPGRDK，

KTITVSAELPK，

TTITVYAEPPK，

PTISPSYTYYR，

GLLGDNQVMPK，

MVELVHFLLLK，

FSTTINYTLWR，

GLLGDNQIMPK，

RLGFLHSGTAK，

ALNKMFCQLAK，

RVCACPGPDRP，

LSQETFSDLWK，

RAHSSHLKSKK，

VTCTYSPALNK，

GTRVRAMAIYK，

STSRHKKLMFK，

LAARNVLVK，

MALESILRR，

ISWLGLRSLR，

GSGAFGTVYK，

和ASPLDSTFYR。

5.一种包含免疫原性肽的组合物，其特征在于，所述的免疫原性肽选自表13所列出的肽。

6.一种可引发细胞毒性T细胞针对患者体内预选定的抗原发生应答的方法，其特征在于，所述的方法包括将患者的细胞毒性T细胞与包含一种免疫原性肽的组合物相接触，所述的免疫原性肽选自表13所列出的肽。