CN1950106A - 用作肿瘤特异性疫苗的合成蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种符合GMP要求的方法以化学合成蛋白质，所述蛋白质可以被有利地应用于用于接种疫苗的无生物学污染物的组合物中。该方法利用传统方法合成肽，并将这些肽连接起来以生成合成蛋白质，所述合成蛋白质优选包括抗原的所有T细胞表位。优选地，一种佐剂与合成蛋白质共价连接以生成完全的合成疫苗。本发明主要通过利用HPV蛋白质定向免疫为模型进行举例说明。
Description
技术领域
本发明一般涉及医学领域，且更特别地涉及诱导和/或增强针对抗原的T细胞应答，这通过利用合成肽并将这些合成肽连接起来以生成包含所述抗原的所有T细胞表位的合成蛋白质而实现。优选地，将佐剂与合成蛋白质共价连接以生成合成疫苗。本发明主要通过以HPV定向免疫作为模型进行举例说明。但是，本发明不应当被理解为局限于HPV，而是与很多种免疫相关性疾病或可与免疫相关的疾病有关。
背景技术
HPV感染在年轻的、性活跃的男性和女性个体中呈高流行性。大规模的前瞻性研究显示从男性伴侣感染HPV是常见的，在3年的随诊期内有40-60％的对象出现了这种情况(Koutsky et al.，Am J Med102(5a)3，1997；Ho et al.，N Eng J Med 338(7)1998；Marrazzo et al.，Am J Obstet Gynecol 183(3)，2000)。因此，HPV可能是最常见的性传播疾病。高危类型的乳头瘤病毒(例如HPV-16、-18、-31、-33和-45)是造成宫颈癌的原因(Bosch et al.，Natl Cancer Inst 87，1995；ZurHausen，Bioch Biophys Acta 1288，F55 1996)。在感染基底上皮细胞之后，表达立即HPV早期基因E1、E2、E6和E7。E6和E7癌蛋白的延长及增加的表达都与HPV诱导的发育异常以及向宫颈癌的转化密切相关。
免疫抑制的肾移植患者和感染HIV的患者都显示出比正常对照高17倍的生殖器HPV感染发生率，这一事实表明了免疫系统在抵御人体中的HPV相关性疾病和HPV诱导的癌症中的保护作用(Matorraset al.Am J Obstet Gynecol 164，42，1991；Halpert et al.，Obstet Gynecol68(2)1986)。免疫抑制个体减退HPV感染的能力的减弱间接地指出了免疫系统在感染早期的保护作用。通过CD4+T细胞在退行性生殖器疣中的优势性(Coleman et al.，J.Clin.Pathol.，102，1994)以及通过对大多数患有自发性退行性CIN病变的患者中对HPV 16 E7的迟发型过敏反应的检测(Hopfl et al.，18th int.Papillomavirus conference，pp2000)都表明了HPV特异性Th免疫的积极作用。对人体中的HPV16特异性T细胞免疫的研究表明保护性HPV16特异性免疫的特征是反应性对抗三种HPV16早期蛋白E2、E6和E7的与IFN-γ和白介素-5强相关的Th1/Th2型记忆T辅助细胞应答(de Jong et al.，Cancer Res.62，p472-9，2002；Welters et al.，Cancer Res.63，p631-41，2003)。大多数患有HPV16阳性的癌前病变或宫颈癌的患者都不能诱导出这种类型的T细胞反应性，缺少T细胞辅助可以解释在这些患者中的HPV16特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞的普遍缺失(Ressing et al.，CancerRes.56，1996；Nimako et al.，Cancer Res.57，1997)。重要的是，对毕格尔犬(beagle)和兔中自发诱导的抗乳头瘤病毒的保护性免疫的研究证实了我们的发现，即E2和E6特异性T细胞应答在病毒诱导的病变消退的过程中达到峰值(Moore RA，Virology 2003)。此外，编码早期抗原E2、E6和E7的DNA疫苗的应用阻止了这些动物模型中的持续感染和相关的上皮发育异常(Han et al.，1999，Selvakumar et al.，JVirol 69(1)1995)。这些数据表明抗E2、E6和E7的免疫力作为对乳头瘤病毒感染的免疫预防以及用于HPV诱导的病变和癌症的治疗是有效的。
最近，出现了关于导致成功攻击慢性病毒感染或病毒诱导的肿瘤的分子及细胞事件的新观点。对裂解效应细胞的全面动员关键取决于DC的正确激活(成熟)，或经天然免疫触发物例如Toll样受体(TLR)的微生物配体激活和/或经适应性免疫触发物例如活化的CD4+辅助(Th)细胞上的CD40配体(CD40L)激活(Melief et al.，Immunol Rev.188，2002)。因为HPV16对上皮的感染并不伴有(至少在初期)该组织的严重破坏和/或强烈的促炎性刺激，成功的免疫应答可能是依赖于HPV16特异性CD4+T细胞辅助。现在，有可能设计出为诱导效应T细胞和T记忆细胞的全面爆发提供正确的抗原信号及辅助信号的完全合成的疫苗，而不依靠于很不明确的免疫系统触发物例如重组载体以及不具有分子上明确功能的佐剂。这种疫苗的主要标记是它们不仅提供了刺激CD4+和CD8+T细胞的抗原，还含有严格模拟树突状细胞(DC)活化最成功的天然触发物的化合物(Melief et al.，Immunol.Rev.188，2002；Zwaveling J.Immunol.169，2002)。对于免疫对象的临床相关方法，例如抗(分枝)细菌和/或病毒感染的细胞或肿瘤细胞，特别是HPV感染的细胞，优选地都诱导特异T辅助细胞和CTL。我们已经显示用最小CTL表位进行免疫接种在一些模型中形成了抗肿瘤保护(Feltkamp et al.Eur.J.Immunol.23，1993；Kast et al.PNAS，88(6)1991)，而在其它模型中，这可以导致病毒和肿瘤特异性CTL(否则当被诱导时将会是保护性的)的耐受性或功能缺失(Toeset al.PNAS 93(15)1996；Toes et al.，J Immunol 156(10)，1996)。耐受性或功能缺失的发生显著地降低了接种疫苗的效应。因此，参与这一效应的表位不适用于免疫接种的目的。在已知的内源途径之后(Jondalet al.，Immunity 5(4)1996；Reimann et al.Curr.Opin Immunol 9(4)，1997)，通过交叉引发(cross-priming)和其它机制对外源性抗原加工用于I型MHC分子呈递现在被广泛地认为是用于I型MHC呈递的第二条加工途径已知。经此途径对抗原进行加工的正常结果是CTL耐受性，除非发生了CD4+T细胞对APC的激活(Kurts et al.，J ExpMed 186(12)，1997)。此外，在一些鼠病毒感染的研究中，检测到了CTL前体细胞频率和保护性免疫之间的正相关(Sedlik et al.J Virol 74(13)2000；Fu et al.，J Immunol 162(7)1999)。对于CTL的最佳诱导，CTL表位的呈递优选发生在专职抗原呈递细胞(APC)(例如树突状细胞)的表面(Mellman et al.，Trends Cell Biol 8，1998；Rodriguez et al.Nat Cell Biol 1，1999)。尽管任何体细胞都可以在无需专职抗原呈递细胞进行加工的条件下把最小的CTL表位呈递给T细胞，仍可能存在蛋白质需要被专职抗原呈递细胞摄取并加工以用于分别在I型MHC和II型MHC中的CTL和Th表位的最佳呈递(Manca et al.J AcquirImmune Defic Syndr 7，1994)。
来自生物学来源(或来自天然来源或宿主系统中表达的重组蛋白质)的蛋白质的应用容许纯化形式或粗制形式的小蛋白质和较大蛋白质应用于接种疫苗目的，并被常规地应用于接种疫苗领域。但是，来自生物学来源的蛋白质或重组蛋白质的应用需要大量的纯化和质量控制。自生物学来源产生蛋白质或重组蛋白质固有地具有生物学变异、各种污染物和误差。因为生物学来源固有的可变性和不可预测性，在所用的细胞系、细菌、病毒和载体中的高频率的突变和后生改变，DNA特别是病毒或重组DNA的污染的威胁，监管机构例如EMEA(欧洲药物评审局(European Medicines Evaluation Agency))、USFDA(美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration))或日本健康、劳动和福利部的药物和食品安全局(Japanese Pharmaceutical andFood Safety Bureau of Ministry of Health，Labour and Welfare)所设定的安全及质量控制的要求都是广泛且极为严格的。医疗机构对用于接种疫苗的制剂的临床验证和认证以及GMP级材料、设备和方法的强制性使用都使得应用来自生物学来源的蛋白质和重组蛋白质是极为费力的、危险的、昂贵的以及通常是不吸引人的。
WO 02/070006证实了中等大小的22-45个氨基酸的合成肽的用途，所述合成肽组合了CTL和T辅助细胞表位并且大到足以被专职抗原呈递细胞(APC)所摄取。与小的或中等大小的合成肽的应用相关的问题是它们在体内的短半衰期以及被快速地从血流中清除，这限制了该组合物用于接种疫苗或疫苗的总效力。此外，短链氨基酸限制了合成肽中所含有的可利用表位的数目。十分优选含有待免疫对象的所有HLA分子的给定蛋白质的大多数或所有表位的主要为较大的或甚至全长的蛋白质。本领域的现状允许合成大概长达60个氨基酸的合成肽，这却决于氨基酸组成。尽管理论上可以合成更长的肽，但是产量和质量都随着肽长度的增加而逐步降低。
一方面，应用非常明确的、受严密控制和监控的化学方法获得合成蛋白质将避免与使用来自生物学来源的蛋白质相关的问题。但是，另一方面，化学合成肽的长度限制也限制了它们作为疫苗的免疫学效应。本发明的一个目的是克服这些缺点并提供通过化学合成制备的免疫学有效的蛋白质疫苗。
发明内容
定义
合成的或人工肽在此被定义为化学制备的氨基酸或多肽的聚合体，其通过化学合成经肽键连接的20种天然存在的氨基酸的聚合体而生成。合成蛋白质被定义为至少两种或两种以上化学合成的长度范围从2到80个氨基酸的合成肽的融合产物。两种或两种以上合成肽的连接生成了合成蛋白质，其可以对应于天然存在的蛋白质的一部分或全长，且其长度可以在从约80氨基酸到约1000个氨基酸的范围内变化，优选从85到400个氨基酸，更优选从90到200个氨基酸。相反地，天然的或重组蛋白质被定义为酶学制备的蛋白质或多肽，通过编码RNA模板的翻译在体内或体外酶学制备。
在优良生产规范方案下生产GMP级肽，其中该过程中的所有步骤都是标准化的、完全记录的及持续监控的。记录系统生成了合乎逻辑的且易于接受监管部门例如FDA或EMEA审核的批记录，并将有助于对人工蛋白质的认证及临床应用所需的质量控制和监控。
在临床应用于疫苗之前，可以用下面的非穷尽性的技术深入地测试GMP级蛋白质：质谱分析、氨基酸分析(AAA)、肽测序、反相HPLC、残余有机挥发物、细菌内毒素评价、生物负荷评价、通过AAA测定净肽含量、抗衡离子含量(例如乙酸、三氟乙酸、盐酸等)、二级平衡离子含量、水含量、质量平衡计算，附加测试可以包括旋光率(相同性)、毛细管区带电泳(纯度)、滴定以及其它对于本领域熟练人员显而易见已知的化学和生物学分析技术。
可以往组合物中添加佐剂以增强和刺激对用于接种疫苗的制剂中的合成蛋白质的免疫应答。各种用于接种疫苗目的的佐剂的应用是本领域已知的(例如，Melief Immunol Rev 188，2002；Zwaveling J.Immunol.169，2002)。特别优选的与本发明的合成蛋白质一起使用的佐剂是细菌LPS、CpG DNA和其它的Toll样受体激活佐剂和树突状细胞刺激佐剂。在本发明的一个更优选的实施方式中，所用的佐剂是被存在于专职抗原呈递细胞上的Toll样受体(TLR)所识别。TLR所识别的各种佐剂在本领域是已知的，包括例如脂肽、脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸(liopteichoic)、脂蛋白质(来自支原体、分枝杆菌或螺旋体)、双链RNA(polyI:C)、非甲基化DNA、脂阿拉伯甘露聚糖、鞭毛蛋白、含CpG的DNA和咪唑喹啉。佐剂可以与抗原一起施用，或通过化学修饰、合成、缀合及本领域已知的其它方法与抗原物理连接。
本发明的合成蛋白质可呈现与它们天然存在的副本的一些序列差异。术语“序列相同性”意指两条多肽序列在比较窗(window ofcomparison)上是同一的(即依据氨基酸对氨基酸组成)。术语“序列相同性百分比”是通过在整个比较窗上比较两条最佳比对的序列，确定两种序列中出现同一残基的位置的数目以获得相匹配的位置的数目，用整个比较窗中匹配位置的数目除以位置的总数(即窗口大小，window size)，并用结果乘以100得到序列相同性百分比进行计算。
当应用于本发明的肽时，术语“基本上的相同性”意指当例如通过利用默认参数的GAP或BESTFIT程序进行最优化比对时，两条肽序列享有至少80％的序列相同性，优选至少90％的序列相同性，更优选至少95％的序列相同性或更高的序列相同性(例如99％的序列相同性)。GAP利用Needleman和Wunsch整体比对算法在全长上对两条序列进行比对，将匹配的数目最大化并将缺口的数目最小化。一般使用GAP默认参数，其中缺口生成罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对核苷酸而言，所用的默认得分矩阵是nwsgapdna，而对蛋白质而言，默认得分矩阵是Blosum62(Henikoff & Henikoff，1992)。
优选地，残基位置(不同的残基位置)因保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
典型地，相对短的氨基酸序列(小于约30个残基)的比对和比较是直接的。通过Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法、通过Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、通过Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin GeneticsSoftware Package Version 10.2，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，Wisconsin 53711，USA)、或通过肉眼观察可以进行用于比较窗序列最佳比对，并选出提供各种方法所得到的最佳比对(即得到整个比较窗的最高百分比的序列相似性)。
具体实施方式
因此，本发明的第一个方面涉及一种用于产生合成蛋白质的方法。所述合成蛋白质优选包含与病原体或肿瘤的天然存在的抗原性蛋白质的至少46个连续氨基酸具有至少80、85、90、95、97、98、99或100％相同性的氨基酸序列。本发明的方法包括以下步骤：(a)化学合成两种或两种以上片段，每种片段都由氨基酸序列中的2-80个连续氨基酸组成，其中在所述氨基酸序列中，所述两种或两种以上片段是相邻且不重叠的；(b)化学连接一种片段的C末端与邻近片段的N末端以产生合成蛋白质或其一部分；(c)任选地，重复步骤C以顺序连接从步骤C或步骤B获得的进一步的邻近片段，以产生所述合成蛋白质。
优选地，所述合成蛋白质包含与病原体或肿瘤的天然存在的抗原性蛋白质的至少46、47、48、50、55、60、70或80个连续氨基酸具有至少80、85、90、95、97、98、99或100％相同性的氨基酸序列。更优选地，所述合成蛋白质包含与病原体或肿瘤的天然存在的抗原性蛋白质的全部(即全长)氨基酸序列具有至少80、85、90、95、97、98、99或100％相同性的氨基酸序列。优选的天然存在的抗原性蛋白质是一种HPV蛋白质，更优选是HPV E2、E6或E7蛋白，甚至更优选天然存在的HPV蛋白质是HPV16、-18、-31、-33或-45蛋白，其中最优选HPV16和HPV18蛋白。因此，本发明中所采用的合成蛋白质与病原体或肿瘤的天然存在的抗原性蛋白质不必是同一的，但可以是基本上同一的。同样，所述合成蛋白质可以进行各种变化，例如插入、缺失和取代(或保守的或非保守的取代)，其中这些变化可能为它们的应用提供某些优点。同样，可以用多种方式对本发明的HPV衍生的合成蛋白质进行修饰，其中所述蛋白质优选包含与选自SEQID NO：1-6的HPV衍生的抗原序列中的至少一种抗原序列的氨基酸序列基本上同一的(如上定义)序列，同时保留与SEQ ID NO：1-6中的其中一种序列至少80、85、90、95、97、98、99或100％的序列相同性。
在本发明的方法中，通过顺序连接在本申请中所公开的合成肽可以合成更大的合成蛋白质。优选地，在该方法的第一个步骤中，合成肽被固定在基质上。在随后的步骤中，通过化学手段将第二种和任选地更多种合成肽与支持物上的肽或融合肽共价连接。在实施例中，对于其它高免疫原性的HPV蛋白质的化学合成也遵循相似的策略。从4种人工肽中可以便利地合成HPV16和HPV18的E6蛋白(实施例2和5)。对于更大的HPV16和HPV18的E2蛋白，本发明提供两种不同的策略，以非限制性实施例的方式举例说明了该方法的可变通性(实施例3和6)。选择合适的替换方式确保各肽的有效连接以获得人工蛋白质可以避免序列特异性的难题。
在一个优选的实施方式中，选择包含N末端半胱氨酸或甘氨酸残基的邻近且非重叠的片段(即用作用于通过化学连接合成合成蛋白质的构建块的各合成肽)。待合成的各邻近且非重叠的片段优选为中等长度(从20到80个氨基酸，优选达约65个氨基酸，更优选达55个氨基酸长，更优选达45个氨基酸长，最优选达35个氨基酸长)；并且优选通过标准固相肽合成法(例如基于Fmoc或基于Boc的化学方法)，在标准固体支持物(例如含有适当的柄(例如安全制动柄)的基于聚苯乙烯或基于聚苯乙烯/聚乙烯甘油共聚物的材料)上，以可接受的纯度(例如优选超过80％的纯度)，以其硫酯的形式进行合成。优选地，不使用具有羧基末端的脯氨酸(P)的构建块，因为与脯氨酸硫酯结合是很困难的。如果待合成的蛋白质不含有与优选的实施方式相符合的天然存在的半胱氨酸(例如因为半胱氨酸在序列中分得太远)，优选应用经修饰的连接策略，其中使用一种或多种具有氨基末端甘氨酸(G)的构建块。然后，可以用保护/活化基团如N-2，3，4-三甲氧基-5-巯苯基基团修饰N末端G，这就给甘氨酸提供了转化为与半胱氨酸的硫酯相当的硫酯的反应性，并且仍然在终产物中生成甘氨酸(J.Am.Chem.Soc.124，4642(2002))。
本发明也非常适合于产生高毒性的或不稳定的蛋白质。所述的方法可以给由于其固有的毒性或其在细菌/病毒/真核表达系统体内的不稳定性而使得在目前通过重组技术难以产生的蛋白质(例如HPV16E2，野生型p53)的产生提供一种可供选择的方法。
体内注射的蛋白质常常被细胞外基质中存在的肽链端解酶迅速降解。在本发明的一个优选的实施方式中，通过蛋白质修饰(如在N和C末端以及在蛋白质序列中的关键位点上引入D氨基酸)可以克服这种降解。另外，通过在序列内的特定位点引入非天然氨基酸可以使得蛋白质对于酶降解更为稳定。例如，非天然氨基酸可以是各种形式的合成α氨基酸、合成β氨基酸和/或N-甲基化的合成氨基酸，其特点是不能通过传统的用于蛋白质产生的体内方法容易地获得。
与最小的(9AA)或更长的(35AA)合成肽相比，合成E7蛋白显著增强的免疫原性活性也至少部分归因于合成蛋白质在体内的稳定性增强。下面的事实举例说明了这一点，即与合成E7蛋白相反，用等摩尔剂量的长E7肽的接种不足以诱导CD8+产IFNγ的HPV16E7-特异性T细胞，缺乏抗肿瘤攻击的保护作用反映了这一点。但是，用约8倍高剂量的长肽进行接种的确造成了强烈的E7特异性T细胞应答及肿瘤保护作用。更大的或全长(与天然表达的蛋白质副本相比)的合成蛋白质的应用或特定结构域、化学修饰、去除合成蛋白质中的用于降解的靶信号的应用都是将有助于设计呈现延长的体内半衰期的合成蛋白质的技术措施。具有增强的稳定性的合成蛋白质是免疫原性反应的更有效的诱导物。通过更大的蛋白质的较慢降解以及延缓从血流中清除至少部分地解释了增强的免疫原活性(即与短合成肽相比较，在等摩尔合成蛋白质疫苗的基础上，在小鼠的预防性及治疗性测试中都更为有效)。在部分降解及部分蛋白水解之后，更大的合成蛋白质的剩余片段仍可足够大到以至能被专职抗原呈递细胞摄取并引发有力的免疫应答。
可以对经化学连接形成本发明的合成蛋白质的(多)肽进行修饰以提供各种所需的特性例如改进的药理学特性，同时增加或至少保留未修饰肽的基本上全部的生物学活性。例如，可通过佐剂的连接，增强稳定性或辅助合成肽的融合过程进行修饰的肽，通过改变、延长、减少蛋白质的氨基酸序列增强了免疫学特性。也可以用不同的氨基酸或氨基酸模拟物进行取代。
通过肽键或肽键模拟物可以将本发明的免疫原性蛋白质来源的合成蛋白质的各残基掺入所述合成蛋白质中。本发明的肽键模拟物包括本领域技术人员已知的肽骨架修饰。这种修饰包括对酰胺氮、α碳、酰胺羧基的修饰、对酰胺键的完全取代、延长、缺失或骨架交叉连接。通常参见Spatola，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptidesand Proteins，Vol.VII(Weinstein ed.，1983)。一些肽骨架修饰是已知的，包括ψ[CH2S]、ψ[CH2NH]、ψ[CSNH2]、ψ[NHCO]、ψ[COCH2]和ψ[(E)或(Z)CH＝CH]。上面所使用的术语遵循上面Spatola的建议。在申请中，ψ表示缺乏酰胺键。括号内的内容说明了取代酰胺键的结构。
可以将氨基酸模拟物掺入所述合成蛋白质中。本申请所使用的“氨基酸模拟物”是一种不同于天然存在的氨基酸的组分，它们在构象及功能上用作本发明的肽的氨基酸的取代物。这样一种组分可以用作氨基酸残基的取代物，只要它们不干扰肽引发抗相关表位(例如，衍生自HPV的表位)的免疫应答的能力。氨基酸模拟物可以包括非蛋白质氨基酸例如β-、γ-、δ-氨基酸，β-、γ-、δ-亚氨基酸(例如哌啶-4-羧酸)以及多种L-α-氨基酸的衍生物。本领域技术人员已知多种合适的氨基酸模拟物，包括环己基丙氨酸、3-环己基丙酸、L-金刚烷丙氨酸、金刚烷乙酸等等。Morganand Gainor，(1989)Ann.Repts.Med.Chem.24：243-252讨论了适用于本发明的肽的肽模拟物。
在本发明的方法的另一个优选的实施方式中，将所述合成肽与佐剂化学缀合。优选的佐剂是化学合成的佐剂。(合成的)佐剂与抗原的缀合在本领域是已知的(Shirota et al.，2000.J.Immunol.164：5575；Cho，H.J.，K.，et al.，2000.Nat.Biotechnol.18：509；Tighe，H.，K.et al.，2000.J.Allergy Clin.Immunol.106：124；Tighe，H.，K.et al.，2000.Eur.J.Immunol.30：1939.)。
上面所提及的抗原与能经例如TOLL样受体特异性激活专职抗原呈递细胞例如树突状细胞的佐剂的缀合物与那些其中将这两种成分混和在一起的疫苗相比是更优良的疫苗，这也是本领域中所已知的。在一个实施方式中，优选将合成的佐剂与本发明的合成蛋白质缀合，形成了用于接种疫苗目的的纯合成的并因此在化学上完全明确的组合物。
一种用于缀合生物分子的合适技术在本领域被称作“点击(click)化学”。在这一技术中，一个分子中的叠氮部分与另一个分子中的炔基相互反应，以产生一种其中两种分子经1，2，3-三唑环共价连接的缀合物。该反应与实际上在生物分子中正常存在的所有反应基团互不相关，该反应由Cu(I)离子催化，并可以在相对温和的反应条件下，在水性媒介中进行；参考Kolb H.C.et al.，Angew.Chem.Int.Ed.40，2004-2021(2003)和Wang，Q.et al.，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)。但是，用于缀合生物分子且适用于本发明的抗原和佐剂的其它方法在本领域是已知的。
用于与本发明的抗原结合和/或缀合的优选的佐剂是刺激专职抗原呈递细胞(例如树突状细胞)的佐剂。优选地，这种佐剂由Toll样受体(TLR)所识别，且在本领域是已知的，包括例如脂肽、脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸、脂蛋白质(来自支原体、分枝杆菌或螺旋体)、双链RNA(polyI:C)、非甲基化DNA、脂阿拉伯甘露聚糖、鞭毛蛋白质、含CpG的DNA、和咪唑喹啉。
在本发明的一个优选的实施方式中，CpG DNA被用作TLR激活佐剂，并被共价地连接到合成蛋白质的N和/或C末端或特定的氨基酸上。已知CpG DNA及其类似物是TLR9的有效活化剂。在参考文献中广泛地描述了CpG与蛋白质缀合的方法(Shirota et al.，2000.J.Immunol.164：5575；Cho，H.J.，K.，et al，2000.Nat.Biotechnol.18：509；Tighe，H.，K.et al.，2000.J.Allergy Clin.Immunol.106：124；Tighe，H.，K.et al.，2000.Eur.J.Immunol.30：1939.)。其中一个分子中的亲核基团例如硫醇基的可以与另一个分子中的亲电子基团例如卤代乙酰基或马来酰亚胺基反应。或者，其中一个分子中的胺基可以与另一个分子中的活化的羧酸基团(例如羧基琥珀酰亚胺酯)反应。通过与双官能交联剂(例如戊二醛(gluteraldehyde))的反应，其中一个分子中的胺基也可以与另一个分子中的胺基反应(Drijfhout，J.W.andHoogerhout，P in W.C.Chan and P.D.White，Chapter 10.OxfordUniversity Press 2000)。
作用于TLR3的polyIC也可以与本发明的合成蛋白质共价连接。polyIC(聚肌苷酸：聚胞苷酸)是一种双链病毒RNA的“模拟物”并诱导干扰素。同样地，它可以被用作接种疫苗中的佐剂(MonshouwerM.et al.，Biochem.Pharmacol.52，1195-1200(1996)和Moriyama H，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，5539-5544(2002))。通过在参考文献(Shirota et al.，2000.J.Immunol.164：5575；Cho，H.J.，K.，et al.，2000.Nat.Biotechnol.18：509；Tighe，H.，K.et al.，2000.J.Allergy Clin.Immunol.106：124；Tighe，H.，K.et al.，2000.Eur.J.Immunol.30：1939.)中所述的方法也可以将polyIC与合成蛋白质共价连接。
也可以优选单独地或与其它用于缀合本发明的合成蛋白质的合成佐剂一起联合使用作用于TLR7和8的咪喹莫特及类似物、以及作用于TLR2的Pam3Cys。Pam3Cys是一种化合物，其中经甘油分子将3个棕榈酸单位与半胱氨酸结合，且其为一种有效的佐剂(Rabanal，F.，et al.，J.Chem.Soc，Perkin Trans.1，945-952(1991)和Metzger J.W.etal.，Biochim.Biophys.Acta，1149，29-39(1993))。
在另一个优选的实施方式中，该方法包括通过将所述蛋白质与如下所定义的药学上可接受的载体相混合而将所述合成蛋白质配制成药物组合物的步骤。因此，本发明的一方面也涉及用于产生包含本发明的合成蛋白质的药物组合物的方法。该方法至少包括将在上述方法中获得的本发明的合成蛋白质与药学上可接受的载体以及如上面及下面所述的另一种成分例如佐剂相混合的步骤。
另一方面，本发明涉及一种包括在上所述的方法中获得的合成蛋白质的组合物。所述合成蛋白质优选如上所定义。包含在本发明的方法中通过化学合成所获得的合成蛋白质的组合物具有一些优于包含从生物系统中所获得的抗原性蛋白质的传统组合物的优点。用于在生物系统中产生蛋白质的方法固有地具有生物学变异。除了这种变异之外，还存在固有的危险，即分离自生物学来源的组分(假设来自重组宿主、非GMO或甚至无细胞系统)都可能被来自生物学生产系统中的其它生物分子所污染，其中一些可能是非常有害的。相反，本发明的组合物基本上没有生物学污染物。优选地，所述组合物没有生物学污染物，其程度是这些污染物的水平低于可利用的检测法的检测水平。在所述组合物中不存在的生物学污染物包括来自产生有机体或系统的任何生物分子。因此，这种污染物包括蛋白质、碳水化合物、核酸(包括DNA和RNA)、脂类、及它们的组合物例如细菌内毒素，以及甚至还可以包括能感染人的病毒。优选地，所述组合物基本上没有来自天然存在蛋白质所来源的有机体或病毒(即其中所述蛋白质天然存在，或者其中如果重组产生时产生所述蛋白质的有机体或病毒)的污染物(生物分子)。一个主要的问题是核酸对蛋白质制剂的潜在污染，特别是致病性和/或致癌性核酸例如病毒和/或重组核酸。因此，包含本发明的合成蛋白质的组合物基本上没有核酸污染，更特别地没有病毒和/或致癌性核酸的污染，其中特别是DNA。通过本领域已知的PCR扩增技术(Ausubel et al.，Current protocols，1989)可以证实核酸的污染，特别是病毒和/或致癌性核酸的污染，更特别是HPV核酸的污染。优选地，所述组合物包含合成蛋白质(例如包含与病原体或肿瘤的天然存在的抗原性蛋白质的至少46个连续氨基酸具有至少80％相同性的氨基酸序列的蛋白质)，其中所述组合物不含编码所述合成蛋白质的氨基酸系列的核酸。优选地，当用适于扩增病毒和/或致癌性核酸的引物在进行PCR扩增30个循环、更优选的40个循环及最优选的50个循环之后通过PCR扩增进行检测时，包含本发明的合成蛋白质的组合物都没有显示出可检测的DNA污染。更优选地，如用合适的HPV特异性引物进行30、40或50个循环的PCR扩增可检测到的那样，所述组合物不含HPV核酸(DNA)片段。最优选地，所述组合物基本上不含编码SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列的DNA。
另一个优选的组合物包含佐剂。所述佐剂优选地是能激活树突状细胞的佐剂。更优选地，所述佐剂是能激活TLR的佐剂，例如如上所定义的佐剂。所述组合物可以包含与所述合成蛋白质混和的佐剂，或者它可以含有与所述蛋白质共价缀合的佐剂，或者它可以含有这两种佐剂。此外，可以存在一种以上的佐剂。本领域技术人员已知多种佐剂。合适的佐剂包括不完全弗氏佐剂、明矾、磷酸铝、氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(CGP 11637，称作去甲-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷氧基)-乙胺(CGP 19835A，称作为MTP-PE)、和RIBI(其含有三种从细菌提取的组分，于2％角鲨烯/Tween80乳剂中的单磷酰脂A、海藻糖二酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS))。佐剂的效力可以通过测量针对免疫原性肽的抗体的量确定。Kwak et al.New Eng.J.Med.327-1209-1215(1992)中描述了一种特别有用的佐剂及免疫接种方案。其中所描述的免疫佐剂包含于磷酸盐缓冲溶液中的5％(重量/体积)角鲨烯、2.5％聚氧丙烯L121聚合体和0.2％聚山梨醇酯。在本发明的一个优选的实施方式中，佐剂被存在于抗原呈递细胞上的Toll样受体所识别，即该佐剂是一种TLR配体。上面描述了各种TLR所识别的佐剂，它们可用于与本发明的合成蛋白质混和和/或缀合。
所述佐剂最优选是一种合成佐剂，其是化学合成的而非纯化自生物学来源。在本发明的最优选的实施方式中，合成蛋白质与(一种或多种)合成的可被TLR识别的佐剂缀合，这形成了用于接种疫苗的完全明确的和合成的组合物的基础。另一个优选的组合物包含抗CD40抗体。
本发明的组合物还包括可药学上可接受的载体。(用于接种疫苗的)药物组合物被设计成用于肠胃外、口服、经皮或经粘膜施用。所述药物组合物可以肠胃外例如皮下、皮内或肌内施用。因此，本发明提供了用于口服或优选用于肠胃外施用的组合物，其包含溶解或悬浮在可接受的载体(优选水性载体)中的免疫原性合成蛋白质或合成疫苗的溶液。可以使用各种水性载体，例如水、缓冲液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等等。这些组合物可以通过传统的、已知的灭菌技术进行灭菌，或可以被无菌过滤。所形成的水溶液可以直接分装使用，或冻干，冻干的制剂在施用之前与无菌溶液合并。根据需要，所述组合物可以含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等等(例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯和油酸三乙醇胺)。
对于固体组合物而言，可以使用传统的无毒的固体载体，其包括例如药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠盐、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等等。对于口服施用而言，药学上可接受的无毒的组合物是通过掺入任一种通常应用的赋形剂而形成，例如前面所列的那些载体，通常活性成分(即一种或多种本发明的合成蛋白质)10-95％，更优选的浓度是25％-75％。如上所提及，所述组合物被设计用于诱导对所述合成蛋白质的免疫应答。因此，优选适于将该免疫应答最大化的组合物和施用方法。例如，可以将合成蛋白质引入宿主(包括人)体内，连接到载体上或作为活性蛋白质单位的同聚体或异聚体。有用的载体在本领域中是已知的，包括例如甲状腺球蛋白质、白蛋白例如人血清白蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸例如聚(赖氨酸：谷氨酸)、流感、B型肝炎病毒核心蛋白、B型肝炎病毒重组疫苗等等。或者，可以使用合成蛋白质的“混合物(cocktail)”，包含从免疫原性HPV合成蛋白质例如E7、E6和E2或其一部分以及它们与佐剂的缀合物进行选择。一种以上的合成蛋白质的混和物具有增强免疫学反应的优点。
本发明的免疫原性合成蛋白质在药物制剂中的浓度可以在很大范围内变化，即从小于重量的约0.1％，通常为或至少约2％到差不多20％到50％或更高，且可以根据所选定的特殊施用模式，主要通过液体体积、粘度等进行选择。
在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mace PublishingCompany，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)中可以找到进一步的关于适于各种施用类型的制剂的指导。对于药物输送方法的简要综述参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。例如经皮输送系统包括膜片、凝胶、胶带和乳剂，并可以含有赋形剂例如增溶剂、渗透增强剂(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、亲水性聚合体(例如聚卡波非和polyvinyl pyrillidine)以及粘合剂及胶粘剂(例如聚异丁烯、基于硅酮的粘合剂、丙烯酸酯和聚丁烯)。经粘膜转运系统包括膜片、片剂、栓剂、阴道栓剂、凝胶和乳剂，并可以含有赋形剂例如增溶剂和增强剂(例如丙二醇、胆汁盐和氨基酸)、和其它载体(例如聚乙二醇、脂肪酸酯及衍生物、以及亲水性聚合体例如羟丙基甲基纤维素和透明质酸)。可注射的输送系统包括溶液、悬浮液、凝胶、微球和聚合的可注射物，并可以含有赋形剂例如溶解度改变剂(例如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合体(例如聚辛内酯(polycaprylactones)和PLGA)。可植入的系统包括棒和盘，并可以含有赋形剂例如PLGA和聚辛内酯(polycapryl lactone)。可用于施用本发明的药物组合物的其它输送系统包括鼻内输送系统例如喷雾剂和粉末、舌下输送系统和用于经吸入输送的系统。对于通过吸入施用，利用适当的推进剂(例如二氯二弗甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体)，以加压包装或喷雾器产生的气雾剂的形式便利地输送本发明的药物组合物。对于加压的气雾剂，通过提供一个输送计量的量的阀可以确定出剂量单位。可以配制出用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，其含有本发明的肽与合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混和物。如按照美国专利6,358,530中所述的那样，本发明的药物组合物还可以被配制成经吸入施用。本发明的优选的组合物是用作疫苗的组合物。
另一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防肿瘤或感染性疾病的方法，其中该方法包括给对象施用治疗有效量的如上所定义产生的合成蛋白质或如上所定义的组合物。因此，该合成蛋白质包含如上所定义的肿瘤或感染因子的天然存在的抗原性蛋白质的氨基酸序列。一种优选的方法是用于治疗或预防与HPV相关的疾病的方法，该方法包括预防或治疗HPV感染(特别是生殖器感染)，预防或消退HPV病毒诱导的病变例如生殖器疣和上皮发育异常，以及特别包括预防和治疗HPV诱导的发育异常及向癌症(尤其是宫颈癌、肛门生殖器癌或头颈部癌、以及其它HPV诱导的癌症)的转化。
对于那些法律规定治疗方法不能获得专利权的管辖地区，本发明同样涉及如上定义制备的合成蛋白质或如上所定义的组合物在制备用于治疗或预防如上所定义的肿瘤或感染性疾病(的方法中)的药物中的用途。
因此，本发明涉及合成蛋白质和合成组合物在用于对象的接种疫苗的方法中的接种疫苗的用途。接种疫苗的方法优选针对抗HPV，更优选地抗致癌型HPV 16、18、31、33和45。该方法包括给所述对象施用包含如上所定义的合成蛋白质的药物组合物。在一个优选的方法中，所述药物组合物还包含TLR激活佐剂，优选合成的佐剂，更优选所述合成的佐剂与本发明的合成蛋白质相缀合。
另一方面，本发明涉及如上所定义的衍生自HPV的抗原性合成蛋白质在制备用于免疫接种、针对预防和/或治疗对象体内的HPV感染的疫苗或组合物中的用途。优选地，所述疫苗是一种适于口服、肠胃外、经皮或经粘膜施用的药物组合物。
包含至少一种本发明的合成蛋白质的药物(疫苗)组合物也是本发明的一个实施方式。本发明的合成蛋白质及其药物组合物有利于施用给哺乳动物(特别是人)以治疗和/或预防如上所指出的疾病。例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，17th ed.(1985)中可找到合适的配制剂，这在本领域中是已知的并易于本领域技术人员所采用。
预防性施用或给已经患有所述疾病的个体施用本发明的免疫原性合成蛋白质。给患者施用足以引发有效的免疫应答的所述组合物。足以实现这一目的的量被定义为“治疗有效剂量”或“免疫原性有效剂量”。这种应用的有效量将依赖于例如肽组合物、施用方式、所治疗的疾病的阶段和严重程度、患者的体重和总体健康状况、以及处方医生的判断，但对于初次免疫接种(即对于治疗性或预防性施用)的剂量范围通常是从每个患者每千克(kg)体重约0.1μg-约50μg，更常见的是从每kg体重约1μg-约20μg。典型地，加强剂量是从每kg体重约1μg-约20μg，根据患者的反应和状况使用数周到数月的加强方案。合适的方案将包括3-4次引发(priming)注射，每次间隔3周，最后以规律的间隔(例如6个月)进行加强注射。
以下非限制性实施例描述了本发明的衍生自HPV的抗原性合成蛋白质的制备。
附图说明
图1：用于合成HPV16-E7蛋白的合成方案。
图2：纯化的合成HPV16-E7蛋白的Maldi-tof质谱。
图3：4.5nmol合成HPV16-E7蛋白的单次注射导致诱导大量高数目HPV16-E749-57特异性CD8+T细胞。以混合了CpG的、具有等摩尔浓度最小CTL表位(E749-57)的所示抗原给C57BL/6小鼠皮下注射，以注射150μg E743-77(高剂量)肽+CpG的作为阳性对照，或不接种疫苗(原初的(naive))。在离体(ex-vivo)直接地(A)或在一轮体外(in vitro)刺激之后(B)显示出经H-2Db-E749-57PE缀合的四聚体(TM)染色的来自脾的CD8+T细胞的百分比。条表示三只小鼠的平均百分比和SEM。
图4：用合成HPV16-E7蛋白接种诱导了功能性的产IFNγ的CD8+T细胞。仅用树突状细胞系D1或以E743-77肽进行脉冲式处理的D1细胞或以重组HPV16-E7蛋白进行脉冲式处理的D1刺激脾细胞培养物，并在流式细胞仪上通过细胞内细胞因子染色对其进行分析。用所述合成HPV16-E7蛋白注射的三只小鼠与用等摩尔浓度的重组HPV16-E7或高剂量的肽E743-77注射的小鼠的代表性例子以及未经免疫接种的(原初的)小鼠联合显示。
图5：
a)用4.5nmol合成E7蛋白(n＝10)和等摩尔量的重组E7蛋白(n＝9)或与50μg CpG混和的长肽(低剂量肽，n＝10)或仅用PBS(原初的，n＝7)在第-28天和第-14天接种小鼠组。作为对照，也使用约高8倍剂量的长肽(n＝5)，已且定其在80％的小鼠中都有保护性。在第0天，在对侧皮下注射50,000个TC-1肿瘤细胞，并每2-3天监测肿瘤生长直至100天，并绘制存活曲线。
b)当在第9天肿瘤可触摸检查时，用所标示疫苗(每组n＝8)在对侧对受TC-1肿瘤细胞攻击的小鼠进行接种，并在第23天强化(箭头)。监测肿瘤生长直至第95天，并绘制存活曲线。
实施例
实施例1：HPV 16 E7肽的化学合成以及肽的连接
HPV 16 E7肽和蛋白的化学合成
通过化学连接经Fmoc固相合成所分开装配的两个寡肽制备均相合成E7蛋白。根据已发表的方法(Ingenito，R et al.，J.Am.Chem.Soc.121，11369-11374(1999))，在磺酰胺安全制动(safety-catch)树脂上制备E7的N末端的60-聚体的片段，并将其转换成硫酯1[E7(1-60)]。经标准的Fmoc固相方法产生C末端的38-聚体的氨甲酰[E7(61-98)，2]。随后，连接经RP-HPLC纯化的片段1和2得到全长E7蛋白(3)。根据最初的自然连接方法中的一种方法(Hackeng T.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，10068-10073(1999)和Dawson，P.E.，et al.，J.Am.Chem.Soc.119，4325-4329(1997))，使用苯硫酚/苄硫醇作为添加剂可以成功地进行连接反应。但是，本申请发明人发现巯乙基磺酸钠盐(Favell R.R.，et al.，Org.Lett.4，p165-168，2002)是更为方便的添加剂，因为它生成了均相的且无味的反应混和物。
为了获得可接受的蛋白质产率，将下面的基本修饰引入到总的合成途径中。首先，在连接缓冲液中包括20mM EDTA以阻止产物/反应中间产物的完全的及不可逆的沉淀被证实是必需的。本申请发明人还发现不能用RP HPLC对E7蛋白进行预先纯化，因为经由这一步骤的产率很低。满意的纯化方案包括在强变性条件下(6M盐酸胍)，将反应混和物通过Superdex 75柱进行凝胶过滤，随后对含靶蛋白质的池级分对水进行透析。必须要注意的是，在非变性(磷酸缓冲液)或弱变性(7M尿素)条件下进行的凝胶过滤步骤所产生的产物仍然带有E7(61-98)污染，这大概是因为后一片段与全长E7的共聚集。这些结果与已知的(Alonso，L. G.，et al.，Biochemistry，41，10510-10518(2002))E7的聚集能力以及所报道的E7的C末端部分是蛋白质寡聚化的原因的观察结果(Clemens，K.E.，et al.，Virol.214，289-293(1995))完全一致。
试验
肽合成：使用ABI 433A设备，通过伴随PyBOP激活的Fmoc-SPPS以0.25mmol的规模制备片段E7(1-60)硫酯(1)和E7(61-98)C末端氨甲酰(2)。使用在(Han，Y.X.，et al.，J.Org.Chem.62，4307-4312(1997))中所推荐的原位方案以使Cys残基的外消旋作用最小化。每个合成周期包括用于NMP中的20％哌啶溶液去除Fmoc、NMP洗涤、在2mmol DIPEA存在的条件下用1mmol Fmoc-氨基酸进行PyBOP辅助的结合步骤1h、第二次NMP洗涤、Ac2O/DIPEA加帽(capping)步骤以及最后的NMP洗涤。
肽硫酯E7(1-60)(1)：自4-氨磺丁酰基AM树脂(Novabiochem)开始装配片段1。以Boc-Met-OH的形式引入N末端的甲硫氨酸残基。自固定化的及被保护的寡肽生成硫酯。简要地说，用TMSCHN2将树脂烷基化，在NaSPh存在的条件下用乙基3-巯基丙酸酯切割该肽，并用TFA/乙基3-巯基丙酸酯/TIS/m-甲酚/H2O 96/1.2/1.2/0.8/0.8将肽脱保护。
肽酰胺E7(61-98)(2)：在RAM Tentagel树脂(Rapp Polymere)上装配片段2。在完成链装配之后，用切割混和物(TFA/EDT/TIS/m-甲酚/H2O 96/1.2/1.2/0.8/0.8)处理2小时对该肽进行脱保护并从树脂上切割下来，如Dick，F.in Methods in Molecular Biology，Vol.35：Peptide Synthesis Protocols pp.63-72.(Eds.Pennington，M.W.& Dunn，B.M.)(Humana Press Inc.，Totowa，NJ，1994))所述。
连接以获得全长E7蛋白(3)
方法A：将肽硫酯1(22mg，3.1μmol)与肽2(11.3mg，2.7μmol)混和，并溶解在3.0mL缓冲液中(100mM磷酸、20mM EDTA、6MGdn-HCl、pH 8)。随后，加入60μL苯硫酚和60μL苄硫醇，并于22℃搅拌混和物65小时。用100mg DTT处理该混和物，并将混和物加载到在25mM Na2HPO4、25mM NaH2PO4、5mM EDTA、5mM DTT(pH7)中平衡的Superdex 75HL 16/60柱(Pharmacia)上。收集37mL(1mL/分)时所洗脱下的产物，并用于0.1％的水性TFA中的乙腈梯度洗脱通过RP HPLC(Vydac C-4214TP510柱，250×10mm，5mL/分)将其再纯化，以生成0.6mg(产率2％)的均相E7蛋白，如通过质谱法、RP HPLC和定量氨基酸分析所确定的那样。在PE Sciex API165单独的四极质谱仪上进行电喷射离子化MS。利用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，在Voyager DE PRO设备上记录基质辅助激光脱附离子化(MALDI)MS光谱。
方法B：将肽硫酯1(10.5mg，1.4μmol)与肽2(16mg，2μmol)混和，并溶解在1.8mL连接缓冲液(200mM磷酸、20mM EDTA、6M盐酸胍、75mM MesNa、pH8.5)中，于22℃搅拌混和物65个小时，然后将混和物加载到在纯化缓冲液(6M盐酸胍、25mM Na2HPO4、25mM NaH2PO4、5mM EDTA、5mM DTT、pH7)中平衡的Superdex75HL 16/60柱(Pharmacia)上，并以0.8mL/分进行洗脱。收集50mL时所洗脱下的产物(5.5mL)，并使用具有3KD截断值的透析管透析到水中(2L水，40小时换水3次)，以得到7.5mL含有6.7mg(产率44％)E7蛋白的溶液。该物质的层析、光谱及免疫原性特性与通过方法A所获得的蛋白质都不可区分。
实施例2：HPV16 E6的化学合成
HPV16-E6蛋白序列：
001 MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV
061 YRDGNPYAVC DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INCQKPLCPE
121 EKQRHLDKKQ RFHNIRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL
被选择用于肽合成以获得全长HPV16E6合成蛋白的四个片段：
01：001-039 MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVY-SR
02：040-072 X-CKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDK-SR
03：073-117 X-CLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPL-SR
04：118-158 CPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL-OH
这些片段以其硫酯(-SR)的形式呈现，其中X表示临时性保护基团，该基团在结合特定片段之后被去除(例如MSC基团)。合成过程为：将片段04与片段03结合，随后从构建体03/04去除X，将片段03/04与片段02结合，从构建体02/03/04去除X，将片段02/03/04与片段01结合。
实施例3：HPV16 E2的化学合成
HPV16-E2蛋白序列：
001 METLCQRLNV CQDKILTHYE NDSTDLRDHI DYWKHMRLEC AIYYKAREMG FKHINHQVVP
061 TLAVSKNKAL QAIELQLTLE TIYNSQYSNE KWTLQDVSLE VYLTAPTGCI KKHGYTVEVQ
121 FDGDICNTMH YTNWTHIYIC EEASVTVVEG QVDYYGLYYV HEGIRTYFVQ FKDDAEKYSK
181 NKVWEVHAGG QVILCPTSVF SSNEVSSPEI IRQHLANHPA ATHTKAVALG TEETQTTIQR
241 PRSEPDTGNP CHTTKLLHRD SVDSAPILTA FNSSHKGRIN CNSNTTPIVH LKGDANTLKC
301 LRYRFKKHCT LYTAVSSTWH WTGHNVKHKS AIVTLTYDSE WQRDQFLSQV KIPKTITVST
361 GFMSI
被选择用于肽合成以获得全长HPV 16 E2合成蛋白的七个片段：
01：001-039 METLCQRLNVCQDKILTHYENDSTDLRDHIDYWKHMRLE-SR
02：040-108 X-CAIYYKAREMGFKHINHQVVPTLAVSKNKALQAIELQLTLETIYNSQYSNE
KWTLQDVSLEVYLTAPTG-SR
03：109-139 X-CIKKHGYTVEVQFDGDICNTMHYTNWTHIYI-SR
04：140-194 X-CEEASVTVVEGQVDYYGLYYVHEGIRTYFVQFKDDAEKYSKNK
VWEVHAGGQVIL-SR
05：195-250 X-CPTSVFSSNEVSSPEIIRQHLANHPAATHTKAVALGTEETQTTIQR
PRSEPDTGNP-SR
06：251-299 X-CHTTKLLHRDSVDSAPILTAFNSSHKGRINCNSNTTPIVHLKGD
ANTLK-SR
07：300-365 CLRYRFKKHCTLYTAVSSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQFLSQV
KIPKTITVSTGFMSI
这些片段以其硫酯(-SR)的形式呈现，其中X表示临时性保护基团，该基团在结合特定片段之后被去除(例如MSC基团)。合成策略与HPV 16 E6的合成策略相似。
注意：构建体06/07与片段05之间的结合可能是困难的，因为该结合是与P结合。
HPV16-E2，另一种策略，该蛋白的两个重叠部分，甘氨酸连接。
因为长度的限制和/或不利的系列，通过片段的C末端硫酯与另一片段的N末端C的结合进行正常的化学连接。如果是HPV 16 E2，可以使用另一种策略：
部分1：001-210
01：001-039 METLCQRLNV CQDKILTHYE NDSTDLRDHI DYWKHMRLE-SR
02：040-108 X-CAIYYKAREMGFKHINHQVVPTLAVSKNKALQAIELQLTLE
TIYNSQYSNEKWTLQDVSLEVYLTAPTG-SR
03：109-155 X-CIKKHGYTVEVQFDGDICNTMHYTNWTHIYICEEASVTVVEG
QVDYY-SR
04：156-210 XX-GLYYVHEGIRTYFVQFKDDAEKYSKNKVWEVHAGGQVILCPTSVF
SSNEVSSPEI
部分2：190-365
01：190-229 GQVILCPTSVFSSNEVSSPEIIRQHLANHPAATHTKAVAL-SR
02：230-280 XX-GTEETQTTIQRPRSEPDTGNPCHTTKLLHRDSVDSAPILTA
FNSSHKGRIN-SR
03：281-308 X-CNSNTTPIVHLKGDANTLKCLRYRFKKH-SR
04：309-365 CTLYTAVSSTWHWTGHNVKHKSAIVTLTYDSEWQRDQFLSQV
KIPKTITVSTGFMSI
这些片段以其硫酯(-SR)的形式呈现，其中X表示临时性保护基团，该基团在结合了特定片段之后被去除(例如MSC基团)；XX表示与N末端G连接的S保护的N-(2，3，4-三甲氧基-5-巯苯基)基团(J.Am.Chem.Soc.124，4642(2002))。
实施例4：HPV18 E7的化学合成
HPV 18 E7蛋白序列：
01 MHGPKATLQD IVLHLEPQNE IPVDLLCHEQ LSDSEEENDE IDGVNHQHLP ARRAEPQRHT
61 MLCMCCKCEA RIELVVESSA DDLRAFQQLF LNTLSFVCPW CASQQ
被选择用于肽合成以获得全长HPV 18 E7合成蛋白的两个片段，详情与实施例1相同：
01：001-065 MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLP
ARRAEPQRHT MLCMC-SR
02：066-099 CKCEA RIELVVESSA DDLRAFQQLF LNTLSFVCFW CASQQ
实施例5：HPV 18 E6的化学合成
HPV18E6蛋白序列：
001 MARFEDPTRR PYKLPDLCTE LNTSLQDIEI TCVYCKTVLE LTEVFEFAFK DLFVVYRDSI
061 PHAACHKCID FYSRIRELRH YSDSVYGDTL EKLTNTGLYN LLIRCLRCQK PLNPAEKLRH
121 LNEKRRFHNI AGHYRGQCHS CCNRARQERL QRRRETQV
被选择用于肽合成以获得全长HPV 18 E6合成蛋白的四个片段：
01：001-034 MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVY-SR
02：035-064 X-CKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAA-SR
03：065-104 X-CHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIR-SR
04：105-158 CLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERL
QRRRETQV
这些片段以其硫酯(-SR)的形式呈现，其中X表示临时性保护基团，该基团在结合特定片段之后被去除(例如MSC基团)。
实施例6：HPV 18 E2的化学合成
HPV 18 E2蛋白序列：
001 MQTPKETLSE RLSCVQDKII DHYENDSKDI DSQIQYWQLI RWENAIFFAA REHGIQTLNH
061 QVVPAYNISK SKAHKAIELQ MALQGLAQSR YKTEDWTLQD TCEELWNTEP THCFKKGGQT
121 VQVYFDGNKD NCMTYVAWDS VYYMTDAGTW DKTATCVSHR GLYYVKEGYN TFYIEFKSEC
181 EKYGNTGTWE VHFGNNVIDC NDSMCSTSDD TVSATQLVKQ LQHTPSPYSS TVSVGTAKTY
241 GQTSAATRPG HCGLAEKQHC GPVNPLLGAA TPTGNNKRRK LCSGNTTPII HLKGDRNSLK
301 CLRYRLRKHS DHYRDISSTW HWTGAGNEKT GILTVTYHSE TQRTKFLNTV AIPDSVQILV
361 GYMTM
被选择用于肽合成以获得全长HPV 18 E2合成蛋白的七个片段：
01：001-013 MQTPKETLSERLS-SR
02：014-101 X-CVQDKIIDHYENDSKDIDSQIQYWQLIRWENAIFFAAREHGIQTLNH
OVVPAYNISKSKAHKAIELQMALQGLAQSRYKTEDWTLQDT-SR
03：102-155 X-CEELWNTEPTHCFKKGGQTVQVYFDGNKDNCMTYVAWDS
VYYMTDAGTWDKTAT-SR
04：156-199 X-CVSHRGLYYVKEGYNTFYIEFKSECEKYGNTGTWEVHFGNNVID-SR
05：200-251 X-CNDSMCSTSDDTVSATQLVKQLQHTPSPYSSTVSVGTAKTY
GQTSAATRPGH-SR
06：252-300 X-CGLAEKQHCGPVNPLLGAATPTGNNKRRKLCSGNTTPIIHLKGD
RNSLK-SR
07：301-365 X-CLRYRLRKHSDHYRDISSTWHWTGAGNEKTGILTVTYHSE
TQRTKFLNTVAIPDSVQILVGYMTM
这些片段以其硫酯(-SR)的形式呈现，其中X表示临时性保护基团，该基团在结合特定片段之后被去除(例如MSC基团)。
HPV18-E2，另一种策略，该蛋白的两个重叠部分，甘氨酸连接。
因为长度的限制和/或利的序列，优选地通过一个片段的C末端硫酯与另一个片段的N末端C的结合进行化学连接。如果是HPV16 E2，可以使用另一种策略：
部分1：001-210
01：001-053 MQTPKETLSERLSCVQDKIIDHYENDSKDIDSQIQYWQLI
RWENAIFFAAREH-SR
02：054-112 XX-GIQTLNHQVVPAYNISKSKAHKAIELQMALQGLAQSRYKTEDWTLQD
TCEELWNTEPTH-SR
03：113-155 X-CFKKGG VQVYFDGNKD NCMTYVAWDS VYYMTDAGTW DKTAT-SR
04：156-210 X-CVSHRGLYYVKEGYN TFYIEFKSEC EKYGNTGTWE VHFGNNVIDC
NDSMCSTSDD
部分2：191-365
01：191-251 VHFGNNVIDCNDSMCSTSDDTVSATQLVKQLQHTPSPYSS
TVSVGTAKTYGQTSAATRPGH-SR
02：252-300 X-CGLAEKQHCGPVNPLLGAATPTGNNKRRKLCSGNTTPIIHLKGD
RNSLK-SR
03：301-365 X-CLRYRLRKHSDHYRDISSTWHWTGAGNEKTGILTVTYHSE
TQRTKFLNTVAIPDSVQILVGYMTM
这些片段以其硫酯(-SR)的形式呈现，其中X表示临时性保护基团，该基团在结合了特定片段之后被去除(例如MSC基团)；XX代表与N末端G连接的S保护的N-(2，3，4-三甲氧基-5-巯苯基)基团(J.Am.Chem.Soc.124，4642(2002))。
实施例7：合成HPV16-E7蛋白疫苗的抗原性方法：
对照抗原和佐剂：生成两种肽，即H-2Db-限制性CTL表位HPV16-E749-57(RAHYNIVTF)和E743-77的35个残基的长肽GQAEPD
RAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR。通过RP-HPLC测定该肽的纯度，结果发现其通常都是超过90％纯。将肽溶解在于PBS中的0.5％DMSO，如果不是立即使用，将其储存在-20℃。在用Pet-19b-HPV16-E7转化的重组大肠杆菌中产生重组体，并如前所述进行纯化(De Bruijn，M.L.et al.，Cancer Res.58 p724-31，1999)。CpG-寡脱氧核苷酸(ODN)1826(序列TTCATGACGTTCCTGACGTT)由ColeyPharmaceutical提供，并以50μg/只小鼠的工作浓度使用(Zwaveling S.et al.，J.Immunol.169，p350-8，2002)。
小鼠、免疫接种、细胞系和T细胞培养物：C57BL/6(B6，H-2b)小鼠获自IFFA Credo(巴黎，法国)。肿瘤细胞系13.2衍生自5型腺病毒衍生的E1蛋白转化的MEC(B6)，其中HPV16-E749-57CTL表位取代了H-2DbE1A表位。将衍生自HPV-16E6和E7以及c-Ha-ras致癌基因共转化的C57BL/6小鼠的原代上皮细胞的TC-1培养在IMDM+10％FCS(Van der Burg S.H.et al.，Vaccine 19，3652-60，2001)中。D1细胞是来源于C57BL/6小鼠的长期生长因子依赖性的未成熟的脾树突状细胞(DC)，并将其如Winzler C.et al.，J.Exp.Med.185，p317-28，1997所述进行培养。给C57BL/6小鼠皮下注射等摩尔水平(4.5nmol)的E749-57短肽(5.0μg)或E743-77的35个残基的长肽(18μg)、重组HPV16-E7(50μg)或溶解在PBS中的合成HPV16-E7蛋白(50μg)。将ODN-CpG1826(50μg)溶解在PBS中，并在进行皮下接种之前将其与所述肽混和。作为阳性对照，也给小鼠注射大约8倍高剂量的肽(37.7nmol，150μg)，所述肽溶解在PBS中并与ODN-CpG1826混和的肽(Zwaveling et al.，J.Immunol.169，p350-8，2002)。总的注射量为200μl/只小鼠。10天后收获脾。通过在存在5×105个表达E749-57的细胞(肿瘤细胞系13.2)的条件下于完全培养基中培养脾细胞(24孔板中每孔4×106个细胞)从免疫小鼠获得T细胞。将培养物保持在37℃、含有5％CO2的潮湿空气中。不添加外源性IL-2。在第6天，通过Ficoll密度梯度离心从培养物中去除死亡细胞，将剩下的活细胞按1.5×106个细胞/孔接种在24孔板中。在第7天，进行四聚体染色或细胞内细胞因子染色。
HPV16-E7特异性CD8+T细胞的分析：构建含有PE标记的H-2Db表位E749-57(RAHYNIVTF)的四聚体，并如前所述用于肽特异性CTL免疫性分析(Van der Burg et al.，Vaccine 19，p3652-60，2001)。如前所述(Zwaveling S.et al.，J.Immunol.169p350-8，2002)，将FITC标记的抗CD8b.2Ab(Ly-3.2)(克隆53-5.8)和PE标记的抗IFNγAb(克隆XMG1.2)(BD PharMingen，San Diego，USA)用于分析HPV16-E7特异性CTL的抗原特异性IFNγ产生。
肿瘤攻击试验：在预防性接种策略试验中，在第-28天和第-14天，用所标示疫苗在小鼠的左侧腹部皮下接种小鼠。在第0天，给小鼠皮下注射50,000个TC-1肿瘤细胞，并随诊肿瘤生长100天。在治疗性接种疫苗情形中，用50,000个TC-1肿瘤细胞在小鼠的左侧腹部攻击小鼠。在第9天，当肿瘤成为可触摸检查时，用所标示疫苗在小鼠的右侧腹部接种疫苗小鼠。14天后，这些小鼠接受了疫苗接种加强注射。监测肿瘤生长95天。
合成HPV16-E7蛋白的体内抗原性
因为众多研究都显示：(1)C57BL/6小鼠抗表达HPV16-E7的肿瘤的保护作用很大程度上依赖于E749-57特异性CD8+T细胞(De BruijnM.L.et al.，Cancer Res.58，p 724-31，1998；Greenstone H.L.et al.，PNAS 95，p1800-5，1998；Lin K.Y.et al.，Cancer Res.56，p21-6，1996；Feltkamp M.C.et al.，Eur.J.Immunol.23，p2242-9，1993)，和(2)保护HPV16-E7特异性T细胞抗肿瘤发生或消除已发生肿瘤的能力与E749-57-四聚体阳性CD8+T细胞的百分比相关(Van der Burg et al.，Vaccine 19，p3652-60，2001)，因此合成HPV16-E7蛋白的抗原性通过其诱导这种HPV16-E749-57特异性CD8+T细胞的能力得到评估。给C57BL/6小鼠几种在过去成功应用的疫苗，包括最小CTL表位(E749-57：RAHYNIVTF)、已知诱导强烈的E749-57特异性CD8+T细胞应答的更长的肽(E743-77)、与最小CTL表位等摩尔浓度的重组HPV16-E7或合成HPV16-E7蛋白，并联合CpG。接种疫苗10天后，收获脾，并用H2-Db E749-57(RAHYNIVTF)-四聚体染色对细胞进行直接分析(Van der Burg S.H.Vaccine 19，p3652-60，2001)(图3a)，并在测定E749-57特异性CD8+T细胞的百分比之前，使细胞接受一轮附加的体外刺激，该刺激放大但并不改变体内诱导的CD8+T细胞应答的级数(hierarchy)(图3b)。与预期的那样，高抗原剂量以及较低剂量的更长的E7肽都能诱导强烈的HPV16-E7特异性CD8+T细胞，而最小CTL表位所诱导的应答明显更弱。重要的是，合成E7蛋白的单次注射所诱导的HPV16-E7特异性CD8+T细胞应答与重组HPV16-E7蛋白所诱导的应答相似，并比其它疫苗所诱导的应答稍强。为了确认功能性CD8+T细胞应答是在单次免疫接种合成E7蛋白之后被触发的，仅用树突状细胞(DC)刺激、或用长E743-77肽或重组E7蛋白进行脉冲式处理，紧接着测定产IFNγ的CD8+T细胞的数目。在用合成E7蛋白接种的小鼠的脾中检测到大量产IFNγ的CD8+T细胞，证实了通过H2-DbE749-57-四聚体所检测到的CD8+T细胞是具有功能活性的(图4)。此外，来自这些小鼠的CD8+T细胞反应性地抗重组E7蛋白脉冲式处理的DC，这表明合成HPV16-E7蛋白保留了其全部的抗原潜力。
合成E7蛋白接种造成TC-1肿瘤细胞的消除
用50,000个TC-1肿瘤细胞攻击后，从第11天开始，未经处理的小鼠开始发展出可触摸检查的肿瘤，且所有小鼠都在肿瘤接种41天内死亡。在初次-加强方案中，用4.5nmol合成E7蛋白接种的小鼠受到保护直至第70天。这一天之后，仅仅十分之一的用合成E7接种的小鼠产生肿瘤，而在用重组E7蛋白接种的小鼠组中有3只小鼠死亡。当用等摩尔量的长E7肽接种小鼠时，所有的小鼠都产生肿瘤(图5a)，但对于用先建立的保护性的、约8倍高剂量的长肽(13)注射的小鼠，只有4只发生了肿瘤。为了测试这种疫苗消除已发生的肿瘤的能力，首先用TC-1肿瘤细胞攻击小鼠，然后在肿瘤可触摸检查时的第9天进行接种。14天后给予加强接种。肿瘤攻击39天之内，所有未经处理的小鼠都死亡。对于用低剂量长肽(与合成蛋白质等摩尔量)注射的小鼠，在第40天仍有＞40％小鼠存活，但最终所有的小鼠都在第56天前死亡。对于用合成E7蛋白接种的8只小鼠，6只小鼠在第50-70天之间死亡，而最后的2只小鼠至少存活至第95天。用重组E7蛋白接种的小鼠死亡得稍快，但其生存动力学与用合成蛋白质接种的组的生存动力学相似(图5b)。
上面试验证实了合成E7蛋白诱导强烈的CD8+产IFNγ的T细胞免疫，其在预防性和治疗性情形中都能保护小鼠对抗肿瘤。合成E7的治疗性接种没有造成所有小鼠中的肿瘤消除，但是这可能与在这些试验中所观察到的TC-1肿瘤生长的迅速蔓延有关。注射TC-1细胞之后，可触摸检查的肿瘤不仅出现得明显更早，而且它们的生长速度也更高，因为所有的小鼠都在7天内死亡(图5b)，而在我们先前的试验中，未经处理的小鼠在14-21天内死亡(Van der Burg S.H.Vaccine19，p3652-60，2001)。甚至在先前的研究中极好地保护小鼠的高剂量长肽(Zwaveling S.et al.，J.Immunol.169，p350-8，2002)在本研究中也不能完全地阻止肿瘤的发生。
与重组或合成E7比较，用等摩尔剂量的长E7肽接种不足以诱导CD8+产IFNγ的HPV16E7特异性T细胞，缺乏抗肿瘤攻击的保护反映了这一点。因为用约8倍高剂量的长肽进行接种确实产生了强烈的E7特异性T细胞应答和肿瘤保护作用，在CpG介导的DC活化部位上的抗原呈递的寿命扮演了重要作用。这不仅涉及肽和蛋白质在体外/体内对蛋白质水解降解的敏感性以及蛋白质与肽在全身的传播的差异相关，也涉及到佐剂CpG在体外和体内的敏感性。本申请数据表明在等摩尔的基础上，合成蛋白质用于对于接种目的具有更好的价值。
序列表
<110>莱顿大学医学中心
<120>用作肿瘤特异性疫苗的合成蛋白质
<130>P210601 pct
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>98
<212>PRT
<213>Human papillomavirus type 16
<400>1
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210>2
<211>158
<212>PRT
<213>Human papillomavirus type 16
<400>2
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
130 135 140
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155
<210>3
<211>365
<212>PRT
<213>Human papillomavirus type 16
<400>3
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1 5 10 15
Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr
20 25 30
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu
35 40 45
Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val
50 55 60
Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp
85 90 95
Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys
100 105 110
His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr
115 120 125
Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser
130 135 140
Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val
145 150 155 160
His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu
165 170 175
Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val
180 185 190
Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro
195 200 205
Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr
210 215 220
Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg
225 230 235 240
Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu
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260 265 270
Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile
275 280 285
Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg
290 295 300
Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His
305 310 315 320
Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr
325 330 335
Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile
340 345 350
Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile
355 360 365
<210>4
<211>105
<212>PRT
<213>Human papillomavirus type 18
<400>4
Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu
1 5 10 15
Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser
20 25 30
Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His
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Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met
50 55 60
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala
65 70 75 80
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe
85 90 95
Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln
100 105
<210>5
<211>158
<212>PRT
<213>Human papillomavirus type 18
<400>5
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys
20 25 30
Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala
35 40 45
Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala
50 55 60
Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr
85 90 95
Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu
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115 120 125
Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg
130 135 140
Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val
145 150 155
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<211>365
<212>PRT
<213>Human papillomavirus type 18
<400>6
Met Gln Thr Pro Lys Glu Thr Leu Ser Glu Arg Leu Ser Cys Val Gln
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr Glu Asn Asp Ser Lys Asp Ile Asp Ser
20 25 30
Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp Glu Asn Ala Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Ala Arg Glu His Gly Ile Gln Thr Leu Asn His Gln Val Val Pro
50 55 60
Ala Tyr Asn Ile Ser Lys Ser Lys Ala His Lys Ala Ile Glu Leu Gln
65 70 75 80
Met Ala Leu Gln Gly Leu Ala Gln Ser Arg Tyr Lys Thr Glu Asp Trp
85 90 95
Thr Leu Gln Asp Thr Cys Glu Glu Leu Trp Asn Thr Glu Pro Thr His
100 105 110
Cys Phe Lys Lys Gly Gly Gln Thr Val Gln Val Tyr Phe Asp Gly Asn
115 120 125
Lys Asp Asn Cys Met Thr Tyr Val Ala Trp Asp Ser Val Tyr Tyr Met
130 135 140
Thr Asp Ala Gly Thr Trp Asp Lys Thr Ala Thr Cys Val Ser His Arg
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Tyr Val Lys Glu Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ile Glu Phe
165 170 175
Lys Ser Glu Cys Glu Lys Tyr Gly Asn Thr Gly Thr Trp Glu Val His
180 185 190
Phe Gly Asn Asn Val Ile Asp Cys Asn Asp Ser Met Cys Ser Thr Ser
195 200 205
Asp Asp Thr Val Ser Ala Thr Gln Leu Val Lys Gln Leu Gln His Thr
210 215 220
Pro Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Val Ser Val Gly Thr Ala Lys Thr Tyr
225 230 235 240
Gly Gln Thr Ser Ala Ala Thr Arg Pro Gly His Cys Gly Leu Ala Glu
245 250 255
Lys Gln His Cys Gly Pro Val Asn Pro Leu Leu Gly Ala Ala Thr Pro
260 265 270
Thr Gly Asn Asn Lys Arg Arg Lys Leu Cys Ser Gly Asn Thr Thr Pro
275 280 285
Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Arg Asn Ser Leu Lys Cys Leu Arg Tyr
290 295 300
Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg Asp Ile Ser Ser Thr Trp
305 310 315 320
His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr
325 330 335
Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe Leu Asn Thr Val Ala Ile
340 345 350
Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr Met Thr Met
355 360 365
Claims (22)
1.一种用于产生包含与病原体或肿瘤的天然存在的抗原性蛋白质的至少46个连续氨基酸具有至少80％相同性的氨基酸序列的合成蛋白质的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)化学合成两种或两种以上片段，每种片段由所述氨基酸序列的2-80个连续氨基酸组成，其中所述两种或两种以上片段在所述氨基酸序列中是邻近且非重叠的；
b)将一种片段的C末端与邻近片段的N末端化学连接以产生所述合成蛋白质或其一部分；
c)任选地，重复步骤B以顺序连接从步骤B或步骤C获得的进一步的邻近片段，以产生所述合成蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中邻近且非重叠的片段包含N末端半胱氨酸或甘氨酸残基。
3.权利要求1或2的方法，其中所述天然存在的蛋白质是一种HPV蛋白质。
4.权利要求1到3中的任一项的方法，其中HPV蛋白质是来自HPV16、HPV18、HPV31、HPV33或HPV45的E2、E6或E7蛋白。
5.权利要求1到4中的任一项的方法，其中将从步骤B或C获得的合成蛋白质与一种佐剂化学缀合。
6.权利要求5的方法，其中所述佐剂是化学合成的。
7.权利要求5或6的方法，其中所述佐剂能激活树突状细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述佐剂选自polyIC、CpG DNA、咪喹莫特、Pam3Cys、LPS及其组合。
9.权利要求1到8中的任一项的方法，该方法进一步包括通过将所述合成蛋白质与药学上可接受的载体混和而将所述合成蛋白质配制成药物组合物的步骤。
10.一种包含合成蛋白质的组合物，所述蛋白质包含与病原体或肿瘤的天然存在的抗原性蛋白质的至少46个连续氨基酸具有至少80％相同性的氨基酸序列，其中所述组合物不含编码所述氨基酸序列的核酸。
11.权利要求10的组合物，其中所述蛋白质包含与SEQ ID No：1-6中的一个序列的至少46个连续氨基酸具有至少80％相同性的氨基酸序列，其中所述组合物不含编码SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列的DNA。
12.权利要求11的组合物，其中该组合物还包括佐剂。
13.权利要求12的组合物，其中所述佐剂能激活树突状细胞。
14.权利要求13的组合物，其中的佐剂TLR激活佐剂选自polyIC、CpG DNA、咪喹莫特、Pam3Cys、LPS及其组合。
15.权利要求10到14中的任一项的组合物，其中所述佐剂与所述蛋白质共价缀合。
16.权利要求9到15中的任一项的组合物，其中所述组合物还包括药学上可接受的载体。
17.权利要求9到16中的任一项的组合物，其中所述组合物还包括抗CD40抗体。
18.用作疫苗的权利要求9到17中的任一项的组合物。
19.一种用于治疗或预防与HPV相关的疾病的方法，所述方法包括给对象施用治疗有效量的按权利要求1-9任一项的方法产生的合成蛋白质或权利要求10-18任一项的组合物。
20.权利要求19的方法，其中所述与HPV相关的疾病是HPV诱导的癌症。
21.权利要求1-9任一项的方法所产生的合成蛋白质或权利要求10-18任一项的组合物在制备用于治疗或预防与HPV相关的疾病的药物中的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述与HPV相关的疾病是HPV诱导的癌症。
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