KR20210134353A - 면역 반응을 변형시키기 위한 pbmc로의 생체분자의 전달 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 항원을 포함하는 말초 혈액 단핵 세포, 이러한 PBMC를 제조하는 방법, 및 예컨대 개체에서 면역 반응을 조정하기 위해 이러한 PBMC를 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 아주반트의 존재 하에 PBMC를 인큐베이션하는 것에 의해 조건화된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 2월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 62/812,225, 2019년 3월 11일에 출원된 유럽 특허 출원 번호 19161964.2, 2019년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/841,089, 2019년 8월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 62/886,799, 2019년 11월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 62/933,304, 및 2019년 12월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/948,732를 우선권 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일의 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일의 하기 제출 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) (파일명: 750322002241SEQLIST.TXT, 기록된 날짜: 2020년 2월 24일, 크기: 15 KB).
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC), 이러한 PBMC 세포를 제조하는 방법, 및 예컨대 개체에서 면역 반응을 조정하기 위해 이러한 PBMC를 사용하는 방법에 관한 것이다.
면역요법은 수동 또는 능동의 2가지 주요 유형의 개입으로 나누어질 수 있다. 수동 프로토콜은 사전-활성화 및/또는 조작된 세포, 질환-특이적 치료 항체 및/또는 시토카인의 투여를 포함한다. 능동 면역요법 전략은 생체내 면역계 이펙터 기능을 자극하는 것을 겨냥한다. 여러 현행 능동 프로토콜은 질환-연관 펩티드, 용해물 또는 동종 전세포를 사용한 백신접종 전략, 종양 항원 전달을 위한 비히클로서의 자가 DC의 주입, 및 면역 체크포인트 조정제의 주입을 포함한다. 문헌 [Papaioannou, Nikos E., et al. Annals of translational medicine 4.14 (2016)]을 참조한다.
질환-연관 항원에 의해 자극된 CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL) 및 CD4+ 헬퍼 T (Th) 세포는 이환 세포를 표적화하고 파괴하는 잠재력을 갖지만; 내인성 T 세포 반응을 유도하는 현행 방법은 문제에 직면하였다.
특허 출원 및 간행물을 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 개체에서 면역 반응의 자극을 위한 항원을 포함하는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원은 셀 스퀴즈(Cell Squeeze)® 플랫폼을 사용하여 세포내로 전달된다. 본 발명자들은 예상외로 PBMC의 혼합 집단이 순수한 B 세포 및 T 세포 집단보다 더 큰 효능을 갖는다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명은 적어도 부분적으로, PBMC가 개체에게 투여되는 경우에, PBMC를 아주반트로 조건화하는 것이 PBMC의 항원 제시 세포의 활성화를 증가시켜 면역자극을 증가시킨다는 예상외의 발견에 기초한다.
일부 측면에서, 본 발명은 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제공하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 항원을 포함하는 복수의 변형된 PMBC를 제공하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이고, 암 항원, 감염성 질환 항원 또는 바이러스-질환 연관 항원이다. 일부 측면에서, 본 발명은 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PMBC를 제공하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이고, 암 항원, 감염성 질환 항원 또는 바이러스-질환 연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 항원 및 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이다.
일부 측면에서, 본 발명은 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 항원을 PBMC에 도입하기 전에, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고; 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항원을 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC는, 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 것을 추가로 포함하는 방법에 따른 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 투입 PBMC 및/또는 변형된 PBMC를, 추가의 인큐베이션 단계 없이 제조된 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 수술, 요법 또는 진단에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 수술, 요법 또는 진단에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스 연관 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 HPV-연관 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 HPV-연관 질환의 치료에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
일부 측면에서, 본 발명은 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 HPV-연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 여기서 아주반트는 CpG ODN이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 여기서 아주반트는 CpG ODN이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 아주반트는 CPG 7909이다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 34 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 34 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 개체에게 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 투여하고; b) 개체에게 아주반트를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 개체에게 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 투여하고; b) 개체에게 아주반트를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 a) 개체에게 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 투여하고; b) 개체에게 아주반트를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 a) 개체에게 서열식별번호: 19 및/또는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 복수의 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 투여하고; b) 개체에게 아주반트를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 a) 개체에게 서열식별번호: 19 및 서열식별번호: 23의 아미노산 서열로 이루어진 복수의 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 투여하고; b) 개체에게 아주반트를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 비-공유 연결된 펩티드의 풀 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 비-공유 연결된 펩티드의 풀 내에 함유되며, 여기서 각각의 펩티드는 1개 이하의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 비-공유 연결된 펩티드의 풀 내에 함유되고, 여기서 서열식별번호: 19의 아미노산 서열 및 서열식별번호: 23의 아미노산 서열은 별개의 펩티드 내에 함유된다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 단계; b) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 단계; b) 항원을 복수의 PBMC에 도입하는 단계; 및 c) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 아주반트와의 인큐베이션 전에 세포 현탁액으로부터 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항원을 포함하는 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및 d) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항원을 포함하는 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및 d) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 개체에게 항원과 회합된 복수의 PBMC를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하며, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 a) 항원이 투입 PBMC의 세포 표면과 회합되도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원과 회합된 복수의 PBMC를 생성하는 단계; 및 b) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 아주반트를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것을 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 아주반트와의 인큐베이션 전에 세포 현탁액으로부터 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 항원을 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 투입 PBMC 및/또는 변형된 PBMC를, 추가의 인큐베이션 단계 없이 제조된 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1a는 E6 및/또는 E7 SLP의 SQZ-매개 전달; 및 MHC-I 상에 각각 E6 및 E7 에피토프의 후속 가공 및 제시를 나타내는, 복수의 PBMC 내의 대표적인 세포의 개략도이다. 대표적인 세포는 PBMC 세포 유형 (예컨대 T 세포, 단핵구, NK 세포, 및 B 세포) 중 어느 하나일 수 있다.
도 1b는 HPV 항원을 포함하는 PBMC를 CpG 아주반트의 공-투여와 함께 또는 공-투여 없이 개체에게 단일요법 투여하는 증량 상에서의 코호트의 개략적 대표도이다. 원의 양은 변형된 PBMC의 상대 용량을 도시하고, 화살표는 투여를 도시하고, 이중 나선은 CpG 아주반트를 나타내고, "AVB"는 추가의 백신 부스트를 나타낸다.
도 1c는 HPV 항원을 포함하는 PBMC 및 아테졸리주맙을 개체에게 조합 투여하는 증량 상에서의 코호트의 개략적 대표도이다. 원의 양은 변형된 PBMC의 상대 용량을 도시하고, 화살표는 투여를 도시하고, "AVB"는 추가의 백신 부스트를 나타낸다.
도 2a는 덱스트란의 인큐베이션 (세포내이입) 및 30, 60, 및 90 psi의 구동 압력 하에 덱스트란의 SQZ-매개 전달 후 비장세포에서의 하위집단의 생존율을 나타낸다. 도 2b는 세포내이입 또는 30, 60, 및 90 psi의 구동 압력 하에 SQZ-매개 전달에 의해 전달된 덱스트란을 갖는 세포의 백분율을 나타낸다.
도 3은 OVA가 SQZ-로딩된 B 세포 또는 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응에 있어서의 세포 조건화 및 CpG의 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 4는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응에 있어서의 비장세포 조건화 및 다양한 농도의 CpG의 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 5는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응에 있어서의 비장세포 조건화 및 CpG 또는 IFNα의 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 6은 1회 투여 (프라임(Prime)) 또는 2회 투여 (프라임-부스트(Prime-boost))로 상이한 세포 용량으로 투여되었을 때 OVA가 SQZ-로딩된 조건화된 정교화된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응을 나타낸다.
도 7은 1회 투여 (프라임) 또는 2회 투여 (프라임-부스트)로 상이한 용량으로 투여되었을 때 (a) OVA가 SQZ-로딩된 조건화된 B 세포 또는 (b) OVA가 SQZ-로딩된 조건화된 정교화된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응을 나타낸다.
도 8은 OVA가 SQZ-로딩된 성숙된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응에 있어서의 조건화 (CpG 인큐베이션) 기간의 효과를 나타낸다.
도 9는 E7-발현 TC1 종양을 억제하는데 있어서의 E7 HPV 항원이 SQZ-로딩된 성숙된 비장세포의 용량-의존성 효과를 나타낸다.
도 10a는 인간 PBMC (상단) 및 뮤린 비장세포 (하단) 내의 B 세포 하위집단에서의 활성화 마커에 대한 CpG 인큐베이션의 효과를 나타낸다.
도 10b는 인간 PBMC 또는 뮤린 비장세포를 CpG와 함께 인큐베이션한 경우의 시토카인/케모카인 프로파일의 변화를 나타낸다.
도 11은 인간 PBMC를 60 psi의 구동 압력 및 3.5 μm 또는 4 μm의 협착부 폭에서 SQZ-매개 전달에 적용한 경우의 세포 조성 및 MHC-I 수준의 변화를 나타낸다.
도 12a는 60 psi의 구동 압력 및 3.5 μm 또는 4 μm의 협착부 폭에서 SQZ-매개 전달에 적용된 인간 PBMC 내의 CD3+ T 세포 또는 CD14+ 단핵구의 생존율 및 페이로드 전달을 나타낸다.
도 12b는 60 psi의 구동 압력 및 3.5 μm 또는 4 μm의 협착부 폭에서 SQZ-매개 전달에 적용된 인간 PBMC 내의 CD20+ B 세포 또는 CD56+ NK 세포의 생존율 및 페이로드 전달을 나타낸다.
도 13은 3.5 μm 또는 4 μm 협착부 폭을 사용하는 SQZ-매개 과정을 통해 E7 HPV 항원이 로딩된 성숙된 인간 PBMC와 공동-배양된 경우에 PBMC 집단의 하위세트에서의 전달 (하단)과 E7-특이적 반응자 세포의 자극 (상단)의 상관관계를 나타낸다.
도 14는 45 psi 또는 60 psi의 구동 압력, 3.5 μm, 4 μm 또는 4.5 μm의 협착부 폭을 갖는 SQZ-매개 과정을 통해 E7 HPV 항원이 로딩된 성숙된 인간 PBMC와 함께 공동-배양된 경우에 E7-특이적 반응자 세포의 자극을 보여주며, 여기서 상기 과정은 RT에서 (상단) 또는 얼음 상에서 (하단) 수행된다.
도 15 상단 패널은 (1 μM CpG의 존재 또는 부재 하에) pp65가 SQZ-로딩된 인간 PBMC 또는 pp65가 SQZ-로딩되고 아주반트로 성숙된 인간 PBMC와 공동-배양한 경우에 pp65-특이적 반응자 세포의 자극을 나타낸다.
도 15 하단 패널은 (a) 1 μM CpG의 존재 하에, pp65가 SQZ-로딩된 인간 PBMC 또는 pp65가 SQZ-로딩되고 아주반트로 성숙된 인간 PBMC와 공동-배양된 경우; 또는 (b) pp65가 SQZ-로딩된 인간 T 세포 또는 pp65가 SQZ-로딩되고 아주반트로 성숙된 인간 T 세포와 공동-배양된 경우에 pp65-특이적 반응자 세포의 자극을 나타낸다.
도 16은 반응자가 pp65 CMV 항원이 SQZ-로딩된 성숙 인간 PBMC와 공동-배양된 경우에, pp65-특이적 반응자 세포의 자극에 있어서의 (a) 다양한 아주반트에 의한 PBMC 성숙 및 (b) SQZ 로딩에 사용된 pp65 항원 농도의 효과를 나타낸다.
도 17은 pp65 CMV 항원이 SQZ-로딩된 성숙 인간 PBMC와 공동-배양된 경우에 pp65-특이적 반응자 세포의 자극에 있어서의, 3 또는 24시간의 인큐베이션 시간으로 상이한 아주반트 CpG, R837, 및 R848에 의한 PBMC 성숙의 효과를 나타낸다.
도 18은 pp65 CMV 항원이 SQZ-로딩된 조건화된 뮤린 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 반응에 있어서의, SQZ-매개 로딩 전 대 후의 비장세포의 조건화의 효과를 나타낸다.
도 19는 E7-발현 종양을 보유하는 마우스에게 pp65-로딩된 비장세포 단독 (군 B); 화학요법 (시스플라틴) 단독 (군 C, D, G); 또는 pp65-로딩된 비장세포와 화학요법의 조합 (군 E, F, H)을 투여한 경우의 종양 억제에 대한 효과를 나타낸다.
도 20a는 실온에서 또는 얼음 상에서 인간 PBMC의 하위집단으로의 3kDa 덱스트란의 SQZ-매개 전달의 효율을 나타낸다. 도 20b는 50 psi 또는 70 psi의 구동 압력에서 인간 PBMC의 하위집단으로의 3kDa 덱스트란의 SQZ-매개 전달의 효율을 나타낸다.
도 21a 및 b는 E7-발현 종양을 보유하는 마우스에게 E7 HPV 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 투여한 경우에 종양 억제 (도 21a) 및 생존율 개선 (도 21b)에 있어서의 비장세포 조건화 또는 CpG 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 22는 OVA 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 반응에 있어서의, CpG 또는 IFNα와의 공-투여의 존재 또는 부재 하의 비장세포 조건화의 효과를 나타낸다.
도 23a-23h는 SQZ-가공되거나 또는 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포 내에서의 B 세포 마커 CD86 (도 23a-d) 및 H-2Kb (도 23e-h)의 발현에 있어서의, CpG 1826과의 인큐베이션의 존재 또는 부재 하의 비장세포 조건화의 효과를 나타낸다.
도 24a-24d는 비처리 마우스 (도 24a), 1 μg CpG 1826 IV 단독을 주사한 마우스 (도 24b), E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포로 면역화된 마우스 (도 24c), 또는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 공동-주사하고, 1 μg CpG 1826 IV를 공동-주사한 마우스 (도 24d)에서의 순환 시토카인의 수준을 나타낸다.
도 25는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 (M-SQZ-비장세포-HPV) 및 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포의 순환 동역학을 나타낸다.
도 26a-26e는 E7-특이적 T 세포 침윤의 양을 나타내고, 도 26f는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 또는 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포로의 면역화 후 시간 경과에 따른 종양 부피를 나타낸다. 종양 환경에서 생존 세포당 CD8+ T 세포의 백분율, 및 종양 질량당 CD8+ T 세포의 수를 각각 도 26a 및 26d에 제시한다. 종양 환경에서 생존 세포당 E7-특이적 T 세포의 백분율, 및 종양 질량당 E7-특이적 T 세포의 수를 각각 도 26c 및 26e에 제시한다. 종양 환경에서 CD8+ T 세포당 E7-특이적 T 세포의 백분율이 도 26b에 제시된다.
도 27a-27d는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포에 의한 자극, 또는 OVA와 함께 인큐베이션된 (인큐베이션 대조군) 정교화된 뮤린 비장세포에 의한 자극, 또는 무자극 (OT-I 대조군)으로 WT 또는 MHC-I -/- 마우스에서의 OVA-특이적 T 세포 (OT-I CD8+ T 세포)의 생체내 증식의 양을 나타낸다. 도 27a 및 27c는 2회 반복 실험 동안 수용자 림프절에서의 각각의 OT-I 증식을 나타낸다. 도 27b 및 27d는 2회 반복 실험 동안 수용자 비장에서의 각각의 OT-I 증식을 나타낸다.
도 28a-28e는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 (도 28a), 또는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포의 지정된 하위세트 (도 28b, 28c, 28d, 28e 각각에 대해 B 세포, T 세포, 단핵구, NK 세포의 하위세트)와의 공동-배양 후의 OT-I CD8+ T 세포에서의 활성화 마커 CD69의 증식 및 발현을 나타낸다.
도 29a-29f의 상단 패널은 각각의 샘플에 대한 Z-스택의 중간으로부터의 공초점 영상화를 나타내며, 이는 형질 막의 국재화 (CD45 염색, PM, 상단 패널); FAM-표지된 HPV SLP의 국재화 (SLP, 상단으로부터 2번째 패널); 및 그의 상대적 국재화를 보여주는 오버레이 (오버레이, 상단으로부터 3번째 패널)를 입증하는 반면, 도 29의 하단 패널은 RPMI에서 SQZ-가공된 인간 PBMC (도 29a, 29c, 29e) 또는 FAM-표지된 E6, E7 또는 E6+E7 SLP가 SQZ-로딩된 인간 PBMC (각각 도 29b, 29d, 29f)에 대해 각각의 오버레이 패널에 제시된 흰색 선을 따라 세포의 중심을 가로지르는 추적 선을 나타낸다.
도 30은 CFSE 희석 (좌측 패널) 및 후속 정량화 (우측 패널)에 의해 측정된 바와 같은, 비처리되거나 (NC), gp100 SLP와 함께 인큐베이션되거나 (Incub. ctrl), gp100 SLP로 SQZ-로딩되거나 (스퀴즈), 또는 gp100 SLP로 펄스된 (PP) B 세포의 공동-주사 후의 gp100 특이적 T 세포의 증식을 나타낸다.
도 31은 비처리되거나 또는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 비장세포가 예방적으로 투여된 마우스에서의 이식된 TC-1 종양의 종양 부피 변화를 나타낸다. 비처리 코호트 I에 제0일에 TC-1 종양을 이식하였다. 비처리 코호트 II에 제60일에 TC-1 종양을 이식하였다. SQZ-로딩된 비장세포로 처리된 마우스에게 제0일 및 제60일 둘 다에 TC-1 종양을 이식하였다.
도 32는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 비장세포의 치료적 처리 후의 이식된 TC-1 종양의 종양 부피 변화를 나타낸다. 마우스를 0.1 x 106 또는 1.0 x 106개의 SQZ-로딩된 비장세포로 처리하고, 단일 용량의 프라임 (이식 후 제10일에) 또는 프라임 및 부스트 요법 (이식 후 제10일에 프라임, 제17일 및 제24일에 부스트) 하에 투여하였다.
도 33a 및 b는 E7-발현 종양을 보유하는 마우스에게 HPV E7 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 투여한 경우에 종양 억제 (도 33a) 및 생존율 개선 (도 33b)에 있어서의 비장세포 조건화 또는 CpG 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 34는 정교화된 비장세포가 화물 없이 SQZ-가공되거나 (SQZ 단독) 또는 OVA의 존재 하에 SQZ-가공된 (SQZ +OVA) 후에 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비장세포 하위집단에서 OVA로부터 가공된 에피토프 SIINFEKL (서열식별번호: 54)의 MHC-I 제시의 정도를 나타낸다.
도 35는 HPV16 E7 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 반응에 있어서의 비장세포 투여의 용량-의존성 효능을 나타낸다.
도 36a-36c는 E7-특이적 T 세포 침윤의 양을 나타내고, 도 36d는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 또는 펩티드 백신으로 면역화하거나 또는 비처리로 둔 후의 시간 경과에 따른 종양 부피를 나타낸다. 종양 환경에서 생존 세포당 CD45+ 백혈구의 백분율, CD45+ 세포 중 CD8+ T 세포의 수, 및 종양 환경에서 CD8+ T 세포당 E7-특이적 T 세포의 백분율이 각각 도 36a, 36b 및 36c에 제시된다.
도 37a는 전형적인 연구 세팅에서 SQZ-처리된 세포의 수 대 제조 세팅에서 SQZ-처리된 세포의 수를 나타낸다. 도 37b는 덱스트란과 함께 인큐베이션한 후, 또는 덱스트란의 존재 하에 SQZ-가공한 후의 PBMC의 생존율을 나타낸다. 도 37c는 PBMC, 뿐만 아니라 B 세포 (CD20+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에 대한, 덱스트란과의 SQZ-가공 또는 인큐베이션 후의 덱스트란에 대해 양성인 세포의 백분율을 나타낸다.
도 38a는 PBMC를 비처리로 두거나 (NC), 빈 페이로드로 SQZ-가공하거나 (빈 SQZ), 또는 CD86-코딩 mRNA로 SQZ-로딩한 (SQZ) 후의, B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 PBMC 하위집단 내의 CD86-발현 세포의 백분율을 나타낸다. 도 38b는 PBMC를 빈 페이로드로 SQZ-가공하거나 (빈 SQZ), 또는 IFNα2-코딩 mRNA로 SQZ-로딩한 (SQZ) 후의, B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 PBMC 하위집단 내의 IFNα2-발현 세포의 백분율을 나타낸다.
도 39a는 PBMC를 빈 페이로드로 SQZ-가공하거나 (빈 SQZ), 또는 CD86-코딩 mRNA로 SQZ-로딩한 (SQZ) 후 72시간에 걸친 T 세포 (CD3+)의 PBMC 하위집단 내의 CD86-발현의 백분율을 나타낸다. 도 39b는 PBMC를 빈 페이로드로 SQZ-가공하거나 (빈 SQZ), 또는 4-1BBL-코딩 mRNA로 SQZ-로딩한 (SQZ) 후 72시간에 걸친 T 세포 (CD3+)의 PBMC 하위집단 내의 4-1BBL-발현 세포의 백분율을 나타낸다.
도 40은 PBMC를 0 μg/mL 내지 200 μg/mL의 mRNA 농도에서 비변형된 eGFP mRNA로 또는 5-메톡시우리딘 백본 변형 (5moU)을 보유하는 eGFP mRNA로 SQZ-가공한 후의 T 세포 (CD3+)의 PBMC 하위집단 내의 eGFP 발현의 양을 나타낸다.
도 41은 PBMC를 비처리로 두거나 (NC) 또는 각각 IL-12, IFNα 또는 IL-2를 코딩하는 mRNA로 SQZ-가공한 (SQZ) 후 PBMC에 의한 IL-12, IFNα 또는 IL-2 시토카인의 분비 정도를 나타낸다.
도 42a는 이펙터 면역 세포 반응을 자극하는데 있어서 증진된 항원 제시 세포로부터의 신호 1, 2, 3의 개략도를 나타낸다. 도 42b는 PBMC를 각각 CD70 또는 4-1BBL을 코딩하는 mRNA로 SQZ-가공한 후, B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 PBMC 하위집단 내의 48시간에 걸친 신호 2 이펙터 발현의 양을 나타낸다. 도 42c는 PBMC를 각각 IFNα2 또는 IL-2를 코딩하는 mRNA로 SQZ-가공한 후, 24시간에 걸친 PBMC에 의한 신호 3 이펙터 분비의 양을 나타낸다.
도 43a는 비자극된, SQZ-가공 전에 ConA로 자극된, SQZ-가공 후에 conA로 자극된 PBMC에 대한, PBMC에서의 eGFP 번역 및 발현의 양을 나타내고, 여기서 PBMC는 eGFP-코딩 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공되었다. 도 43b는 PBMC가 CD86-코딩 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공되는 경우에, SQZ-가공 전에 ConA로 자극되지 않았거나 자극된 PBMC에서의 CD86 발현의 양을 나타낸다.
도 44a는 신호 2 및 신호 3 이펙터 mRNA가 SQZ-로딩 이후에 정교화된 마우스 비장세포에서 번역되었는지 여부를 연구하는 실험의 개략도를 나타낸다. 도 44b는 각각 CD70, CD80, CD86 또는 OX40L을 코딩하는 mRNA의 존재 하에, 정교화된 비장세포가 SQZ-가공된 후, 정교화된 뮤린 비장세포에서의 CD70, CD80, CD86 또는 OX40L 발현의 양을 나타낸다. 도 44c는 정교화된 비장세포가 각각 IL-12, IL-2 또는 IFNα2를 코딩하는 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공된 후, 정교화된 뮤린 비장세포에 의한 IL-12, IL-2 또는 IFNα2 분비의 양을 나타낸다.
도 45a는 정교화된 뮤린 비장세포에서 신호 2 및 신호 3 이펙터 mRNA의 SQZ-로딩이 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 증진시킬 수 있는지 여부를 연구하는 실험의 개략도를 나타낸다. 도 45b는 OVA 펩티드 및 신호 2 이펙터 (CD70, CD80 또는 CD86)를 코딩하는 mRNA가 SQZ-로딩된, 정교화된 뮤린 비장세포와의 공동-배양 시의 OVA-특이적 T 세포의 활성화 정도를 나타냈다. 도 45c는 OVA 펩티드 및 신호 3 이펙터 IL-2를 코딩하는 mRNA가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포와의 공동-배양 시의 OVA-특이적 T 세포의 활성화 정도를 나타냈다.
도 46a는 각각의 항원 (E7, HSV GD1, MART-1, pp65 또는 인플루엔자 M1)을 코딩하는 mRNA가 SQZ-로딩된 인간 PBMC와의 공동-배양 시의 항원-특이적 반응자 T 세포의 활성화 양을 나타낸다. 도 46b 및 46c는 PBMC를 각각 E7 또는 M1을 코딩하는 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공한 후의 PBMC에서의 E7 또는 M1의 번역 및 발현의 양을 나타낸다.
도 47a는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는데 있어서 로딩된 뮤린 비장세포의 효력과 관련하여 mRNA의 SQZ-로딩 대 항원의 단백질 형태를 비교하는 실험의 개략도를 나타낸다. 도 47b는 OVA 단백질 또는 OVA-코딩 mRNA가 SQZ-로딩된 뮤린 비장세포와의 공동-배양 시의 활성화된 OVA-특이적 T 세포의 양을 나타낸다.
도 48a 및 48b는 E7-로딩된 정교화된 비장세포 및 항-CTLA4 투여의 조합이 E7-보유 종양 TC1에 대한 개선된 치료 효과를 유발할 것인지 여부를 연구하는데 있어서의 실험의 실험 설계 및 개략도를 각각 나타낸다. 도 48c, 48d, 48e 및 48f는 E7-발현 종양을 보유하는 마우스에 HPV E7 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 항-CTLA4 항체의 추가 투여와 함께 또는 추가 투여 없이 투여한 경우에 종양 성장 억제 (도 48c), 종양 발생에 대한 지연 또는 억제 (도 48d 및 48e) 및 생존 개선 (도 48f)에 있어서의 종양 항원-로딩된 비장세포 및 면역 체크포인트 억제제의 조합의 상가적 치료 효과를 나타낸다.
도 1b는 HPV 항원을 포함하는 PBMC를 CpG 아주반트의 공-투여와 함께 또는 공-투여 없이 개체에게 단일요법 투여하는 증량 상에서의 코호트의 개략적 대표도이다. 원의 양은 변형된 PBMC의 상대 용량을 도시하고, 화살표는 투여를 도시하고, 이중 나선은 CpG 아주반트를 나타내고, "AVB"는 추가의 백신 부스트를 나타낸다.
도 1c는 HPV 항원을 포함하는 PBMC 및 아테졸리주맙을 개체에게 조합 투여하는 증량 상에서의 코호트의 개략적 대표도이다. 원의 양은 변형된 PBMC의 상대 용량을 도시하고, 화살표는 투여를 도시하고, "AVB"는 추가의 백신 부스트를 나타낸다.
도 2a는 덱스트란의 인큐베이션 (세포내이입) 및 30, 60, 및 90 psi의 구동 압력 하에 덱스트란의 SQZ-매개 전달 후 비장세포에서의 하위집단의 생존율을 나타낸다. 도 2b는 세포내이입 또는 30, 60, 및 90 psi의 구동 압력 하에 SQZ-매개 전달에 의해 전달된 덱스트란을 갖는 세포의 백분율을 나타낸다.
도 3은 OVA가 SQZ-로딩된 B 세포 또는 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응에 있어서의 세포 조건화 및 CpG의 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 4는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응에 있어서의 비장세포 조건화 및 다양한 농도의 CpG의 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 5는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응에 있어서의 비장세포 조건화 및 CpG 또는 IFNα의 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 6은 1회 투여 (프라임(Prime)) 또는 2회 투여 (프라임-부스트(Prime-boost))로 상이한 세포 용량으로 투여되었을 때 OVA가 SQZ-로딩된 조건화된 정교화된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응을 나타낸다.
도 7은 1회 투여 (프라임) 또는 2회 투여 (프라임-부스트)로 상이한 용량으로 투여되었을 때 (a) OVA가 SQZ-로딩된 조건화된 B 세포 또는 (b) OVA가 SQZ-로딩된 조건화된 정교화된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응을 나타낸다.
도 8은 OVA가 SQZ-로딩된 성숙된 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 면역 반응에 있어서의 조건화 (CpG 인큐베이션) 기간의 효과를 나타낸다.
도 9는 E7-발현 TC1 종양을 억제하는데 있어서의 E7 HPV 항원이 SQZ-로딩된 성숙된 비장세포의 용량-의존성 효과를 나타낸다.
도 10a는 인간 PBMC (상단) 및 뮤린 비장세포 (하단) 내의 B 세포 하위집단에서의 활성화 마커에 대한 CpG 인큐베이션의 효과를 나타낸다.
도 10b는 인간 PBMC 또는 뮤린 비장세포를 CpG와 함께 인큐베이션한 경우의 시토카인/케모카인 프로파일의 변화를 나타낸다.
도 11은 인간 PBMC를 60 psi의 구동 압력 및 3.5 μm 또는 4 μm의 협착부 폭에서 SQZ-매개 전달에 적용한 경우의 세포 조성 및 MHC-I 수준의 변화를 나타낸다.
도 12a는 60 psi의 구동 압력 및 3.5 μm 또는 4 μm의 협착부 폭에서 SQZ-매개 전달에 적용된 인간 PBMC 내의 CD3+ T 세포 또는 CD14+ 단핵구의 생존율 및 페이로드 전달을 나타낸다.
도 12b는 60 psi의 구동 압력 및 3.5 μm 또는 4 μm의 협착부 폭에서 SQZ-매개 전달에 적용된 인간 PBMC 내의 CD20+ B 세포 또는 CD56+ NK 세포의 생존율 및 페이로드 전달을 나타낸다.
도 13은 3.5 μm 또는 4 μm 협착부 폭을 사용하는 SQZ-매개 과정을 통해 E7 HPV 항원이 로딩된 성숙된 인간 PBMC와 공동-배양된 경우에 PBMC 집단의 하위세트에서의 전달 (하단)과 E7-특이적 반응자 세포의 자극 (상단)의 상관관계를 나타낸다.
도 14는 45 psi 또는 60 psi의 구동 압력, 3.5 μm, 4 μm 또는 4.5 μm의 협착부 폭을 갖는 SQZ-매개 과정을 통해 E7 HPV 항원이 로딩된 성숙된 인간 PBMC와 함께 공동-배양된 경우에 E7-특이적 반응자 세포의 자극을 보여주며, 여기서 상기 과정은 RT에서 (상단) 또는 얼음 상에서 (하단) 수행된다.
도 15 상단 패널은 (1 μM CpG의 존재 또는 부재 하에) pp65가 SQZ-로딩된 인간 PBMC 또는 pp65가 SQZ-로딩되고 아주반트로 성숙된 인간 PBMC와 공동-배양한 경우에 pp65-특이적 반응자 세포의 자극을 나타낸다.
도 15 하단 패널은 (a) 1 μM CpG의 존재 하에, pp65가 SQZ-로딩된 인간 PBMC 또는 pp65가 SQZ-로딩되고 아주반트로 성숙된 인간 PBMC와 공동-배양된 경우; 또는 (b) pp65가 SQZ-로딩된 인간 T 세포 또는 pp65가 SQZ-로딩되고 아주반트로 성숙된 인간 T 세포와 공동-배양된 경우에 pp65-특이적 반응자 세포의 자극을 나타낸다.
도 16은 반응자가 pp65 CMV 항원이 SQZ-로딩된 성숙 인간 PBMC와 공동-배양된 경우에, pp65-특이적 반응자 세포의 자극에 있어서의 (a) 다양한 아주반트에 의한 PBMC 성숙 및 (b) SQZ 로딩에 사용된 pp65 항원 농도의 효과를 나타낸다.
도 17은 pp65 CMV 항원이 SQZ-로딩된 성숙 인간 PBMC와 공동-배양된 경우에 pp65-특이적 반응자 세포의 자극에 있어서의, 3 또는 24시간의 인큐베이션 시간으로 상이한 아주반트 CpG, R837, 및 R848에 의한 PBMC 성숙의 효과를 나타낸다.
도 18은 pp65 CMV 항원이 SQZ-로딩된 조건화된 뮤린 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 반응에 있어서의, SQZ-매개 로딩 전 대 후의 비장세포의 조건화의 효과를 나타낸다.
도 19는 E7-발현 종양을 보유하는 마우스에게 pp65-로딩된 비장세포 단독 (군 B); 화학요법 (시스플라틴) 단독 (군 C, D, G); 또는 pp65-로딩된 비장세포와 화학요법의 조합 (군 E, F, H)을 투여한 경우의 종양 억제에 대한 효과를 나타낸다.
도 20a는 실온에서 또는 얼음 상에서 인간 PBMC의 하위집단으로의 3kDa 덱스트란의 SQZ-매개 전달의 효율을 나타낸다. 도 20b는 50 psi 또는 70 psi의 구동 압력에서 인간 PBMC의 하위집단으로의 3kDa 덱스트란의 SQZ-매개 전달의 효율을 나타낸다.
도 21a 및 b는 E7-발현 종양을 보유하는 마우스에게 E7 HPV 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 투여한 경우에 종양 억제 (도 21a) 및 생존율 개선 (도 21b)에 있어서의 비장세포 조건화 또는 CpG 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 22는 OVA 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 반응에 있어서의, CpG 또는 IFNα와의 공-투여의 존재 또는 부재 하의 비장세포 조건화의 효과를 나타낸다.
도 23a-23h는 SQZ-가공되거나 또는 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포 내에서의 B 세포 마커 CD86 (도 23a-d) 및 H-2Kb (도 23e-h)의 발현에 있어서의, CpG 1826과의 인큐베이션의 존재 또는 부재 하의 비장세포 조건화의 효과를 나타낸다.
도 24a-24d는 비처리 마우스 (도 24a), 1 μg CpG 1826 IV 단독을 주사한 마우스 (도 24b), E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포로 면역화된 마우스 (도 24c), 또는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 공동-주사하고, 1 μg CpG 1826 IV를 공동-주사한 마우스 (도 24d)에서의 순환 시토카인의 수준을 나타낸다.
도 25는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 (M-SQZ-비장세포-HPV) 및 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포의 순환 동역학을 나타낸다.
도 26a-26e는 E7-특이적 T 세포 침윤의 양을 나타내고, 도 26f는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 또는 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포로의 면역화 후 시간 경과에 따른 종양 부피를 나타낸다. 종양 환경에서 생존 세포당 CD8+ T 세포의 백분율, 및 종양 질량당 CD8+ T 세포의 수를 각각 도 26a 및 26d에 제시한다. 종양 환경에서 생존 세포당 E7-특이적 T 세포의 백분율, 및 종양 질량당 E7-특이적 T 세포의 수를 각각 도 26c 및 26e에 제시한다. 종양 환경에서 CD8+ T 세포당 E7-특이적 T 세포의 백분율이 도 26b에 제시된다.
도 27a-27d는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포에 의한 자극, 또는 OVA와 함께 인큐베이션된 (인큐베이션 대조군) 정교화된 뮤린 비장세포에 의한 자극, 또는 무자극 (OT-I 대조군)으로 WT 또는 MHC-I -/- 마우스에서의 OVA-특이적 T 세포 (OT-I CD8+ T 세포)의 생체내 증식의 양을 나타낸다. 도 27a 및 27c는 2회 반복 실험 동안 수용자 림프절에서의 각각의 OT-I 증식을 나타낸다. 도 27b 및 27d는 2회 반복 실험 동안 수용자 비장에서의 각각의 OT-I 증식을 나타낸다.
도 28a-28e는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 (도 28a), 또는 OVA가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포의 지정된 하위세트 (도 28b, 28c, 28d, 28e 각각에 대해 B 세포, T 세포, 단핵구, NK 세포의 하위세트)와의 공동-배양 후의 OT-I CD8+ T 세포에서의 활성화 마커 CD69의 증식 및 발현을 나타낸다.
도 29a-29f의 상단 패널은 각각의 샘플에 대한 Z-스택의 중간으로부터의 공초점 영상화를 나타내며, 이는 형질 막의 국재화 (CD45 염색, PM, 상단 패널); FAM-표지된 HPV SLP의 국재화 (SLP, 상단으로부터 2번째 패널); 및 그의 상대적 국재화를 보여주는 오버레이 (오버레이, 상단으로부터 3번째 패널)를 입증하는 반면, 도 29의 하단 패널은 RPMI에서 SQZ-가공된 인간 PBMC (도 29a, 29c, 29e) 또는 FAM-표지된 E6, E7 또는 E6+E7 SLP가 SQZ-로딩된 인간 PBMC (각각 도 29b, 29d, 29f)에 대해 각각의 오버레이 패널에 제시된 흰색 선을 따라 세포의 중심을 가로지르는 추적 선을 나타낸다.
도 30은 CFSE 희석 (좌측 패널) 및 후속 정량화 (우측 패널)에 의해 측정된 바와 같은, 비처리되거나 (NC), gp100 SLP와 함께 인큐베이션되거나 (Incub. ctrl), gp100 SLP로 SQZ-로딩되거나 (스퀴즈), 또는 gp100 SLP로 펄스된 (PP) B 세포의 공동-주사 후의 gp100 특이적 T 세포의 증식을 나타낸다.
도 31은 비처리되거나 또는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 비장세포가 예방적으로 투여된 마우스에서의 이식된 TC-1 종양의 종양 부피 변화를 나타낸다. 비처리 코호트 I에 제0일에 TC-1 종양을 이식하였다. 비처리 코호트 II에 제60일에 TC-1 종양을 이식하였다. SQZ-로딩된 비장세포로 처리된 마우스에게 제0일 및 제60일 둘 다에 TC-1 종양을 이식하였다.
도 32는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 비장세포의 치료적 처리 후의 이식된 TC-1 종양의 종양 부피 변화를 나타낸다. 마우스를 0.1 x 106 또는 1.0 x 106개의 SQZ-로딩된 비장세포로 처리하고, 단일 용량의 프라임 (이식 후 제10일에) 또는 프라임 및 부스트 요법 (이식 후 제10일에 프라임, 제17일 및 제24일에 부스트) 하에 투여하였다.
도 33a 및 b는 E7-발현 종양을 보유하는 마우스에게 HPV E7 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 투여한 경우에 종양 억제 (도 33a) 및 생존율 개선 (도 33b)에 있어서의 비장세포 조건화 또는 CpG 공-투여의 효과를 나타낸다.
도 34는 정교화된 비장세포가 화물 없이 SQZ-가공되거나 (SQZ 단독) 또는 OVA의 존재 하에 SQZ-가공된 (SQZ +OVA) 후에 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비장세포 하위집단에서 OVA로부터 가공된 에피토프 SIINFEKL (서열식별번호: 54)의 MHC-I 제시의 정도를 나타낸다.
도 35는 HPV16 E7 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포에 의해 유발된 항원-특이적 반응에 있어서의 비장세포 투여의 용량-의존성 효능을 나타낸다.
도 36a-36c는 E7-특이적 T 세포 침윤의 양을 나타내고, 도 36d는 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 또는 펩티드 백신으로 면역화하거나 또는 비처리로 둔 후의 시간 경과에 따른 종양 부피를 나타낸다. 종양 환경에서 생존 세포당 CD45+ 백혈구의 백분율, CD45+ 세포 중 CD8+ T 세포의 수, 및 종양 환경에서 CD8+ T 세포당 E7-특이적 T 세포의 백분율이 각각 도 36a, 36b 및 36c에 제시된다.
도 37a는 전형적인 연구 세팅에서 SQZ-처리된 세포의 수 대 제조 세팅에서 SQZ-처리된 세포의 수를 나타낸다. 도 37b는 덱스트란과 함께 인큐베이션한 후, 또는 덱스트란의 존재 하에 SQZ-가공한 후의 PBMC의 생존율을 나타낸다. 도 37c는 PBMC, 뿐만 아니라 B 세포 (CD20+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에 대한, 덱스트란과의 SQZ-가공 또는 인큐베이션 후의 덱스트란에 대해 양성인 세포의 백분율을 나타낸다.
도 38a는 PBMC를 비처리로 두거나 (NC), 빈 페이로드로 SQZ-가공하거나 (빈 SQZ), 또는 CD86-코딩 mRNA로 SQZ-로딩한 (SQZ) 후의, B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 PBMC 하위집단 내의 CD86-발현 세포의 백분율을 나타낸다. 도 38b는 PBMC를 빈 페이로드로 SQZ-가공하거나 (빈 SQZ), 또는 IFNα2-코딩 mRNA로 SQZ-로딩한 (SQZ) 후의, B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 PBMC 하위집단 내의 IFNα2-발현 세포의 백분율을 나타낸다.
도 39a는 PBMC를 빈 페이로드로 SQZ-가공하거나 (빈 SQZ), 또는 CD86-코딩 mRNA로 SQZ-로딩한 (SQZ) 후 72시간에 걸친 T 세포 (CD3+)의 PBMC 하위집단 내의 CD86-발현의 백분율을 나타낸다. 도 39b는 PBMC를 빈 페이로드로 SQZ-가공하거나 (빈 SQZ), 또는 4-1BBL-코딩 mRNA로 SQZ-로딩한 (SQZ) 후 72시간에 걸친 T 세포 (CD3+)의 PBMC 하위집단 내의 4-1BBL-발현 세포의 백분율을 나타낸다.
도 40은 PBMC를 0 μg/mL 내지 200 μg/mL의 mRNA 농도에서 비변형된 eGFP mRNA로 또는 5-메톡시우리딘 백본 변형 (5moU)을 보유하는 eGFP mRNA로 SQZ-가공한 후의 T 세포 (CD3+)의 PBMC 하위집단 내의 eGFP 발현의 양을 나타낸다.
도 41은 PBMC를 비처리로 두거나 (NC) 또는 각각 IL-12, IFNα 또는 IL-2를 코딩하는 mRNA로 SQZ-가공한 (SQZ) 후 PBMC에 의한 IL-12, IFNα 또는 IL-2 시토카인의 분비 정도를 나타낸다.
도 42a는 이펙터 면역 세포 반응을 자극하는데 있어서 증진된 항원 제시 세포로부터의 신호 1, 2, 3의 개략도를 나타낸다. 도 42b는 PBMC를 각각 CD70 또는 4-1BBL을 코딩하는 mRNA로 SQZ-가공한 후, B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 PBMC 하위집단 내의 48시간에 걸친 신호 2 이펙터 발현의 양을 나타낸다. 도 42c는 PBMC를 각각 IFNα2 또는 IL-2를 코딩하는 mRNA로 SQZ-가공한 후, 24시간에 걸친 PBMC에 의한 신호 3 이펙터 분비의 양을 나타낸다.
도 43a는 비자극된, SQZ-가공 전에 ConA로 자극된, SQZ-가공 후에 conA로 자극된 PBMC에 대한, PBMC에서의 eGFP 번역 및 발현의 양을 나타내고, 여기서 PBMC는 eGFP-코딩 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공되었다. 도 43b는 PBMC가 CD86-코딩 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공되는 경우에, SQZ-가공 전에 ConA로 자극되지 않았거나 자극된 PBMC에서의 CD86 발현의 양을 나타낸다.
도 44a는 신호 2 및 신호 3 이펙터 mRNA가 SQZ-로딩 이후에 정교화된 마우스 비장세포에서 번역되었는지 여부를 연구하는 실험의 개략도를 나타낸다. 도 44b는 각각 CD70, CD80, CD86 또는 OX40L을 코딩하는 mRNA의 존재 하에, 정교화된 비장세포가 SQZ-가공된 후, 정교화된 뮤린 비장세포에서의 CD70, CD80, CD86 또는 OX40L 발현의 양을 나타낸다. 도 44c는 정교화된 비장세포가 각각 IL-12, IL-2 또는 IFNα2를 코딩하는 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공된 후, 정교화된 뮤린 비장세포에 의한 IL-12, IL-2 또는 IFNα2 분비의 양을 나타낸다.
도 45a는 정교화된 뮤린 비장세포에서 신호 2 및 신호 3 이펙터 mRNA의 SQZ-로딩이 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 증진시킬 수 있는지 여부를 연구하는 실험의 개략도를 나타낸다. 도 45b는 OVA 펩티드 및 신호 2 이펙터 (CD70, CD80 또는 CD86)를 코딩하는 mRNA가 SQZ-로딩된, 정교화된 뮤린 비장세포와의 공동-배양 시의 OVA-특이적 T 세포의 활성화 정도를 나타냈다. 도 45c는 OVA 펩티드 및 신호 3 이펙터 IL-2를 코딩하는 mRNA가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포와의 공동-배양 시의 OVA-특이적 T 세포의 활성화 정도를 나타냈다.
도 46a는 각각의 항원 (E7, HSV GD1, MART-1, pp65 또는 인플루엔자 M1)을 코딩하는 mRNA가 SQZ-로딩된 인간 PBMC와의 공동-배양 시의 항원-특이적 반응자 T 세포의 활성화 양을 나타낸다. 도 46b 및 46c는 PBMC를 각각 E7 또는 M1을 코딩하는 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공한 후의 PBMC에서의 E7 또는 M1의 번역 및 발현의 양을 나타낸다.
도 47a는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는데 있어서 로딩된 뮤린 비장세포의 효력과 관련하여 mRNA의 SQZ-로딩 대 항원의 단백질 형태를 비교하는 실험의 개략도를 나타낸다. 도 47b는 OVA 단백질 또는 OVA-코딩 mRNA가 SQZ-로딩된 뮤린 비장세포와의 공동-배양 시의 활성화된 OVA-특이적 T 세포의 양을 나타낸다.
도 48a 및 48b는 E7-로딩된 정교화된 비장세포 및 항-CTLA4 투여의 조합이 E7-보유 종양 TC1에 대한 개선된 치료 효과를 유발할 것인지 여부를 연구하는데 있어서의 실험의 실험 설계 및 개략도를 각각 나타낸다. 도 48c, 48d, 48e 및 48f는 E7-발현 종양을 보유하는 마우스에 HPV E7 항원이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 항-CTLA4 항체의 추가 투여와 함께 또는 추가 투여 없이 투여한 경우에 종양 성장 억제 (도 48c), 종양 발생에 대한 지연 또는 억제 (도 48d 및 48e) 및 생존 개선 (도 48f)에 있어서의 종양 항원-로딩된 비장세포 및 면역 체크포인트 억제제의 조합의 상가적 치료 효과를 나타낸다.
항원 제시 세포 (APC)는 CTL의 내인성 활성화를 유도하는데 주요 역할을 한다. 이 작업에서, 암 및 감염성 질환을 포함한 다양한 적응증에 대한 면역 반응을 조정하는데 사용하기 위한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 조작하기 위한 셀 스퀴즈® 플랫폼의 구현이 기재된다. 표적 항원 및/또는 아주반트의 PBMC로의 효율적인 시토졸 전달을 가능하게 함으로써, 이 플랫폼은 표적 항원의 고도로 효과적인 MHC-I 제시 및 생체내 CTL의 자극을 유도하는 능력을 입증하였다. 본 발명자들은 예상외로 PBMC의 혼합 집단이 순수한 B 세포 및 T 세포 집단 단독보다 더 큰 효능을 갖는다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 예상외로, 개체에게 투여되는 경우에, PBMC를 아주반트로 조건화하는 것이 항원 제시 세포의 활성화를 증가시켜 비-조건화된 항원-로딩된 PBMC와 비교하여 보다 큰 면역자극을 유발한다는 것을 발견하였다.
본 출원은, 일부 측면에서, 항원 및 아주반트를 포함하는 변형된 PBMC를 제공하며, 여기서 항원은 세포내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 PBMC는 개체에게 투여하기 전에 일정 기간 동안 아주반트의 존재 하에 인큐베이션된다 (즉, PBMC는 조건화된다). 일부 실시양태에서, PBMC는 항원을 PBMC에 도입하기 전에 일정 기간 동안 아주반트의 존재 하에 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 a) 투입 PBMC 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC 세포의 교란을 유발하여 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고; 이에 의해 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 생성하는 단계에 의해 제조된다. 또한, 개체에서 면역 반응을 조정하기 위해, 예를 들어 개체에서 면역 반응을 증진시키기 위해 변형된 PBMC를 사용하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 증진된 면역 반응은 항원에 대해 지시된다. 일부 실시양태에서, 세포-변형 협착부는 마이크로유체 채널, 예컨대 본원에 기재된 임의의 마이크로유체 채널에 함유된다.
일반적 기술
본원에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 널리 이해되고, 통상의 방법론, 예컨대 예를 들어 하기 문헌에 기재된 널리 이용되는 방법론을 사용하여 통상적으로 사용된다: [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)].
정의
본 명세서의 해석을 위하여, 하기 정의가 적용될 것이며, 적절한 경우 단수형으로 사용된 용어는 복수형도 또한 포함할 것이며, 그 반대의 경우도 그러할 것이다. 하기에 기재된 임의의 정의가 본원에 참조로 포함된 임의의 문서와 상충되는 경우, 기재된 정의가 우선하여야 한다.
본원에 사용된 바, 단수 형태는 달리 나타내지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 이러한 측면 및 실시양태를 "포함하고", "이루어지고" 및 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 실시양태를 포함 (및 기재)한다.
본원에 사용된 "말초 혈액 단핵 세포" 또는 "PBMC"는 원형 핵을 갖는 혈액 세포의 이종 집단을 지칭한다. PBMC 집단에서 발견될 수 있는 세포의 예는 림프구, 예컨대 T 세포, B 세포, NK 세포 (NKT 세포 및 CIK 세포 포함) 및 단핵구, 예컨대 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다. 본원에 사용된 "복수의 PBMC"는 혈액 세포의 적어도 2가지 유형의 세포를 포함하는 PBMC의 제제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포 중 2종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포 중 3종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포 중 4종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다.
PBMC는 관련 기술분야에 공지된 수단에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, PBMC는 다른 혈액 세포와 비교하여 PBMC의 밀도를 기초로 개체의 말초 혈액으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, PBMC는 피콜 (예를 들어, 피콜 구배)을 사용하여 개체의 말초 혈액으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 엘루트라(ELUTRA)® 세포 분리 시스템을 사용하여 개체의 말초 혈액으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, PBMC 집단은 개체로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는, 특정한 개체로부터 유래되고 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 조작되며 그 특정한 개체로 복귀된 자가 PBMC 집단이다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는, 한 개체로부터 유래되어 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 조작되고 제2의 개체에게 투여되는 동종 PBMC 집단이다.
일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 재구성된 PBMC 제제이다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 전형적으로 PBMC 집단에서 발견되는 세포를 혼합함으로써; 예를 들어 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중 2종 이상의 집단을 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비장세포의 집단 내의 세포의 비는 인간 PBMC의 집단 프로파일을 보다 잘 반영하도록 조정 (예를 들어, 정교화)된다. 예를 들어, B 세포는 인간 PBMC의 집단을 보다 잘 반영하기 위해 비장세포의 집단으로부터 취해질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세공"은 물질 내의 구멍, 인열부, 공동, 간극부, 파쇄부, 틈, 또는 천공을 포함하는 개구부를 지칭한다. 일부 예에서, (지시된 경우에)이러한 용어는 본 개시내용의 표면 내의 세공을 지칭한다. 다른 예에서, (지시된 경우에) 세공은 세포 막 내의 세공을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "막"은 세공을 함유하는 선택적 장벽 또는 시트를 지칭한다. 상기 용어는 경계 또는 라이닝으로서 작용하는 유연한 시트형 구조를 포함한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 세공을 포함하는 표면 또는 필터를 지칭한다. 이러한 용어는 용어 "세포 막"과 별개이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "필터"는 세공을 선택적으로 통과하는 것을 허용하는 다공성 물품을 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 세공을 함유하는 표면 또는 막을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비균질성"은 구조 또는 조성 면에서 혼합되었거나 균일하지 않은 것을 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 크기, 형상, 또는 소정의 표면 내에서의 분포가 다양한 세공을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "균질성"은 전체적으로 구조 또는 조성 면에서 일관적이거나 균일한 것을 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 크기, 형상, 또는 소정의 표면 내에서의 분포가 일관적인 세공을 지칭한다.
코딩 서열 및 제어 서열과 같은 핵산 서열과 관련되었을 때의 "이종성"이라는 용어는 일반적으로는 함께 연결되지 않고/않거나 일반적으로는 특정한 세포와 회합되지 않는 서열을 가리킨다. 따라서, 핵산 구축물 또는 벡터의 "이종성" 영역은 자연에서 다른 분자와 회합되어 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내의 핵산 절편 또는 이러한 또 다른 핵산 분자에 부착된 핵산 절편이다. 예를 들어, 핵산 구축물의 이종성 영역은 자연에서 코딩 서열과 회합되어 발견되지 않는 서열이 플랭킹된 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종성 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 구축물 (예를 들어, 천연 유전자와 코돈이 상이한 합성 서열)이다. 유사하게, 정상적으로는 세포 내에 존재하지 않는 구축물로 형질전환된 세포가 본 발명의 목적을 위해 이종성으로 간주될 것이다. 대립유전자 변이 또는 자연 발생 돌연변이 이벤트는 본원에 사용된 경우에 이종성 DNA를 일으키지 않는다.
용어 "이종"은 아미노산 서열, 예컨대 펩티드 서열 및 폴리펩티드 서열에 관한 것일 때, 정상적으로 함께 연결되지 않고/거나 특정한 세포와 정상적으로 회합되지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 펩티드 서열의 "이종" 영역은 자연에서 다른 분자와 회합된 채로 발견되지 않는 또 다른 아미노산 분자 내의 또는 그에 부착된 아미노산의 절편이다. 예를 들어, 펩티드 구축물의 이종 영역은 자연에서 펩티드의 아미노산 서열과 회합된 채로 발견되지 않는 서열이 플랭킹되어 있는 펩티드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이종 펩티드 서열의 또 다른 예는 펩티드 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 구축물 (예를 들어, 천연 유전자로부터 코딩되는 것과 상이한 아미노산을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 세포에 정상적으로 존재하지 않는 아미노산 구축물을 발현하는 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적상 이종으로 간주될 것이다. 대립유전자 변이 또는 자연 발생 돌연변이 사건은 본원에 사용된 바와 같은 이종 펩티드를 생성시키지 않는다.
용어 "외인성"은 세포와 관련하여 작용제, 예컨대 항원 또는 아주반트에 대하여 사용되는 경우에, 세포 외부로부터 (즉, 세포의 외부로부터) 전달되는 작용제를 지칭한다. 세포는 이미 존재하는 작용제를 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있고, 외인성 작용제가 전달된 후에 작용제를 생산할 수 있거나 생산하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "억제하다"는 특정한 표적의 존재 또는 활성을 차단, 감소, 제거 또는 다르게는 길항하는 작용을 지칭할 수 있다. 억제는 부분적 억제 또는 완전 억제를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 저해하는 것은 면역 반응의 차단, 저하, 제거, 또는 임의의 다른 길항작용에 이르는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산 발현의 억제는 핵산 전사의 감소, mRNA 풍부의 감소 (예를 들어, mRNA 전사를 침묵화함), mRNA 분해, mRNA 번역의 억제 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "저해하다"는 특정한 표적의 존재 또는 활성을 저하, 감소, 금지, 제한, 경감 또는 다르게는 하락시키는 작용을 지칭할 수 있다. 저해는 부분적 저해 또는 완전 저해를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 저해하는 것은 면역 반응을 저하, 감소, 금지, 제한, 경감 또는 다르게는 하락하도록 유도하는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산 발현의 저해는 핵산 전사의 감소, mRNA 풍부의 감소 (예를 들어, mRNA 전사를 침묵화함), mRNA 분해, mRNA 번역의 억제 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "증진시키다"는 특정한 표적의 존재 또는 활성을 개선, 부스팅, 상승 또는 다르게는 증가시키는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 강화하는 것은 면역 반응을 개선하거나, 증진시키거나, 고조시키거나, 또는 다른 방식으로 증가시키는 것에 이르는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 하나의 예시적인 예에서, 면역 반응을 증진시키는 것은 항원 및/또는 아주반트를 사용하여 면역 반응을 개선, 부스팅, 상승 또는 다르게는 증가시키는 것을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산 발현을 강화하는 것은 핵산 전사의 증가, mRNA 풍부의 증가 (예를 들어, mRNA 전사를 증가시킴), mRNA 분해의 감소, mRNA 번역의 증가 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "조정하다"는 특정한 표적의 존재 또는 활성을 변화, 변경, 변이 또는 다르게는 변형시키는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 조정하는 것은 면역 반응을 변화, 변경, 변이 또는 다르게는 변형시키도록 유도하는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현을 조정하는 것은 핵산 전사의 변화, mRNA 존재비의 변화 (예를 들어, mRNA 전사의 증가), mRNA 분해의 상응하는 변화, mRNA 번역의 변화 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "유도하다"는 결과를 개시, 촉발, 자극, 확립 또는 다르게는 생성시키는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응의 유도는 목적하는 면역 반응을 개시, 촉발, 자극, 확립 또는 다르게는 생성시키도록 유도하는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산 발현을 유도하는 것은 핵산 전사의 개시, mRNA 번역의 개시 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동성"은 동일한 유기체로부터 유래된 분자를 지칭한다. 일부 예에서, 이러한 용어는 소정의 유기체에서 정상적으로 발견 또는 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 천연이거나, 화학적 또는 생화학적으로 변형되었거나, 비-천연이거나 또는 유도체화된 기타 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 당 및 포스페이트 기 (전형적으로 RNA 또는 DNA에서 발견되는 바와 같을 수 있음), 또는 변형된 또는 치환된 당 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 합성 서브유닛, 예컨대 포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트의 중합체를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포르아미데이트 (P-NH2) 또는 혼합 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 또한, 상보적 가닥을 합성하고 적절한 조건 하에 가닥들을 어닐링시킴으로써, 또는 DNA 폴리머라제와 적합한 프라이머를 사용하여 신생으로 상보적 가닥을 합성함으로써, 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 이중-가닥 폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭하도록 상호교환가능하게 사용되고, 최소 길이에 제한되지 않는다. 아미노산 잔기들의 이러한 중합체는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있고, 펩티드, 올리고펩티드, 아미노산 잔기의 이량체, 삼량체 및 다량체를 포함하나 이에 되지는 않는다. 전장 단백질 및 그의 단편 양쪽 모두가 이러한 정의에 포함된다. 이러한 용어는 폴리펩티드의 번역-후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 또한 포함한다. 게다가, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩티드"는 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (일반적으로 성질 면에서 보존적임)을 포함하는 단백질을 지칭하고, 단 이러한 단백질은 원하는 활성을 유지한다. 이러한 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해서와 같이 의도적일 수 있거나, 또는 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해서와 같이 우발적일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아주반트"는 면역 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 조정하고/거나 일으키는 물질을 지칭한다. 일반적으로, 아주반트는 항원과 함께 투여되어 항원 단독과 비교하여 항원에 대한 면역 반응의 증진을 가져온다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 복수의 PBMC를 조건화하는데 사용된다 (예를 들어, 실시예에서 입증된 바와 같음). 다양한 아주반트가 본원에 기재되어 있다.
용어 "CpG 올리고데옥시뉴클레오티드" 및 "CpG ODN"은 포스페이트에 의해 분리된 시토신 및 구아닌의 디뉴클레오티드를 함유하는 DNA 분자 (본원에서 "CpG" 디뉴클레오티드 또는 "CpG"로도 지칭됨)를 지칭한다. 본 개시내용의 CpG ODN은 적어도 1개의 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드를 함유한다. 즉, CpG 디뉴클레오티드 내의 시토신은 메틸화되지 않는다 (즉, 5-메틸시토신이 아님). CpG ODN은 부분 또는 완전 포스포로티오에이트 (PS) 백본을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는" 또는 "약리학상 상용성인"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이 아닌 것을 의미하고, 예를 들어 물질은 어떠한 심각한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나, 물질이 함유된 조성물 중 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호 작용하는 것 없이 환자에게 투여되는 제약 조성물에 포함될 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성학적 시험 및 제조 시험의 요구 표준을 충족시키고/거나 미국 식품 의약품국에 의해 작성된 불활성 성분 지침에 포함된다.
본원에 기재된 임의의 구조적 및 기능적 특징에 대해, 이러한 특성을 결정하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
변형된 PBMC, 조성물, 및 변형된 PBMC의 생성 방법
변형된 PBMC
특정 측면에서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 제공되며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이다. 다른 측면에서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PMBC가 제공되며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이고, 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원 또는 바이러스-질환 연관 항원이다. 일부 측면에서, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공되며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이다. 일부 측면에서, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PMBC가 제공되며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이고, 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원 또는 바이러스-질환 연관 항원이다. 특정 측면에서, 항원 및 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 존재하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 비히클로 운반되고, 여기서 하나 이상의 비히클은 투입 PBMC에 전달된다. 일부 실시양태에서, 비히클은 바이러스 또는 바이러스-연관 입자이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 레트로바이러스 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 AAV를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비히클은 지질-기반 비히클, 예를 들어 리포솜이다. 일부 실시양태에서, 비히클은 나노입자이다.
일부 측면에서, 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 다른 측면에서, 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다.
일부 측면에서, 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 다른 측면에서, 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 다른 측면에서, 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다.
일부 측면에서, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 따라 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원을 PBMC에 도입하기 전에, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC가 제공된다.
일부 측면에서, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC가 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 코딩하는 핵산 (예를 들어, mRNA)을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC가 제공된다. 다른 측면에서, 항원을 PBMC에 도입하기 전에, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 코딩하는 핵산 (예를 들어, mRNA)을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC가 제공된다.
항원 및/또는 아주반트는 협착-매개 전달 (SQZ)을 사용하여 PBMC 내로 도입될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 비히클로 운반되고, 여기서 하나 이상의 비히클은 투입 PBMC에 전달된다. 일부 실시양태에서, 비히클은 바이러스 또는 바이러스-연관 입자이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 레트로바이러스 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 AAV를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비히클은 지질-기반 비히클, 예를 들어 리포솜이다. 일부 실시양태에서, 비히클은 나노입자이다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 교란된 투입 PBMC로 항원이 들어가도록 하기에 충분한 시간 동안 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
특정 측면에서, a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 다른 측면에서, a) 항원을 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 제공된다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 여기서 아주반트는 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC는 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC는 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, 항원은 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 변형된 PBMC는 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC는 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 1 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 1 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 10000:1 내지 약 1:10000이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 200:1이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 20:1이다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 시토졸에 존재하고, 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 소포에 존재한다. 일부 실시양태에서, 소포는 엔도솜이다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 다중 구획에 존재한다. 추가 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95%, 또는 약 99% 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 표면에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 각각의 세포의 적어도 약 70%에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 각각의 세포의 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95% 또는 약 99% 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중 1종 이상의 세포의 적어도 약 70%에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중 1종 이상의 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95% 또는 약 99% 세포 중 어느 하나에 존재한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 수술, 요법 또는 진단에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나를 포함하는, 암 또는 감염성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 암은 두경부암, 자궁경부암, 외음부암, 질암, 음경암, 항문암, 항문주위암, 항문생식기암, 구강암 또는 타액선암 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 감염성 질환은 HIV, HPV, EBV, MCV, HBV 또는 HCV와 연관된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 존재한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 것이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 1종 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 mRNA를 포함한다.
조성물
특정 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, 수술, 요법 또는 진단에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이고, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계, 그에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키는 단계이며, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이고, 그에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스 연관 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용하기 위한 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, 개체에서 HPV-연관 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수인 단계이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, 개체에서 HPV-연관 질환의 치료에 사용하기 위한 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, HPV-연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 1 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 1 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 10000:1 내지 약 1:10000이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 200:1이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 20:1이다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 시토졸에 존재하고, 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 소포에 존재한다. 일부 실시양태에서, 소포는 엔도솜이다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 다중 구획에 존재한다. 추가 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95%, 또는 약 99%, 또는 100% 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 표면에 결합된다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 1종 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 mRNA를 포함한다.
복수의 변형된 PBMC의 생성 방법
일부 측면에서, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것을 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 방법이 또한 제공된다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
특정 측면에서, a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 항원을 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
특정 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 여기서 아주반트는 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC는 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC는 아주반트와 함께 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 인큐베이션된다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC는 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC는 아주반트와 함께 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 인큐베이션된다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 1 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 1 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 10000:1 내지 약 1:10000이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 200:1이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 20:1이다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 시토졸에 존재하고, 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 소포에 존재한다. 일부 실시양태에서, 소포는 엔도솜이다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 다중 구획에 존재한다. 추가 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95%, 또는 약 99%, 또는 100% 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 표면에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 각각의 세포의 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95% 또는 약 99% 또는 100% 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중 1종 이상의 세포의 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95% 또는 약 99% 또는 100% 중 어느 하나에 존재한다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 투입 PBMC 및/또는 변형된 PBMC를, 추가의 인큐베이션 단계 없이 제조된 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다.
개체에서 반응을 자극하는 방법
일부 측면에서, 본 발명은 암 또는 감염성 질환을 갖는 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 변형된 PBMC는 암 또는 감염성 질환과 연관된 항원을 세포내에 포함하는 것인, 상기 개체에서 암 또는 감염성 질환을 치료 및 예방하고/거나 면역 반응을 조정하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC, 조성물 또는 제약 조성물 중 어느 하나를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, a) 개체에게 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및 b) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다.
특정 측면에서, a) PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 단계; b) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, a) PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 단계; b) 항원을 복수의 PBMC에 도입하는 단계; 및 c) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 아주반트와의 인큐베이션 전에 세포 현탁액으로부터 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
특정 측면에서, a) 항원을 포함하는 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및 d) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 항원을 포함하는 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및 d) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 HPV 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 HPV 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 HPV 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 HPV 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 4 μm 내지 약 10 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC는 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 4 μm 내지 약 10 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm이다. 일부 실시양태에서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC는 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 1 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 1 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 10000:1 내지 약 1:10000이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 200:1이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비는 약 20:1이다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 시토졸에 존재하고, 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 소포에 존재한다. 일부 실시양태에서, 소포는 엔도솜이다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 다중 구획에 존재한다. 추가 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트는 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95%, 또는 약 99%, 또는 100% 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 표면에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95%, 약 99%, 또는 100% 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중 1종 이상의 세포의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 각각의 세포의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 항원은 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 중 1종 이상의 세포의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 95%, 약 99% 또는 100% 중 어느 하나에 존재한다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 투입 PBMC 및/또는 변형된 PBMC를, 추가의 인큐베이션 단계 없이 제조된 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 제3 아주반트를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및 제3 아주반트는 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 제3 아주반트는 개체에게 복수의 변형된 PBMC의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 투여 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 및 제3 아주반트를 포함하는 조성물은 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제3 아주반트는 협착부-전달 아주반트와 동일하다. 일부 실시양태에서, 제3 아주반트는 조건화 아주반트와 동일하다. 일부 실시양태에서, 제3 아주반트는 협착부-전달 아주반트와 상이하다. 일부 실시양태에서, 제3 아주반트는 조건화 아주반트와 상이하다.
일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC의 다중 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC의 약 3 내지 약 9회 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15회 투여 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 필요에 따라 변형된 PBMC의 연속 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC의 2회 연속 투여 사이의 시간 간격은 약 1일 내지 약 30일이다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC의 2회 연속 투여 사이의 시간 간격은 약 21일이다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역 세포의 2회 연속 투여 사이의 시간 간격은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 150일 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 개체는 HLA-A2의 발현에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 적어도 하나의 세포는 HLA-A2의 발현에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 어느 하나는 HLA-A2의 발현에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC 내의 T 세포의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 어느 하나는 HLA-A2의 발현에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC 내의 B 세포의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 어느 하나는 HLA-A2의 발현에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC 내의 NK 세포의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 어느 하나는 HLA-A2의 발현에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC 내의 단핵구의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 어느 하나는 HLA-A2의 발현에 대해 양성이다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 제3 아주반트를 투여하기 전에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 제3 아주반트의 투여 전 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 제3 아주반트의 투여 전 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 제3 아주반트의 투여 전 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 제3 아주반트의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 제3 아주반트의 투여 후 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 제3 아주반트의 투여 후 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 제3 아주반트의 투여 후 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 제3 아주반트는 IFN-α 또는 CpG ODN 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 제3 아주반트는 CpG 7909이다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 치료제의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 투여 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 면역 체크포인트 억제제, 화학요법 또는 방사선요법 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 1종 이상의 시토카인을 포함한다.
면역 체크포인트는 면역계의 조절제이고, 면역 반응을 체크한다. 면역 체크포인트 억제제는 면역 반응을 용이하게 증진하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 조성물은 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 조성물은 순차적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 전 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 전 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 전 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 전 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 전 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 후 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 후 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 후 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 후 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 면역 체크포인트 억제제의 투여 후 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 다중 투여 및/또는 면역 체크포인트 억제제의 다중 투여를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 변형된 PBMC 및/또는 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 조성물의 2회 투여, 3회 투여, 4회 투여, 5회 투여, 6회 투여, 7회 투여, 8회 투여, 9회 투여, 10회 투여, 11회 투여, 12회 투여, 13회 투여, 14회 투여 또는 15회 투여를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 변형된 PBMC 및/또는 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 조성물의 5회 미만의 투여, 10회 미만의 투여, 15회 미만의 투여, 20회 미만의 투여, 25회 미만의 투여, 30회 미만의 투여, 50회 미만의 투여, 75회 미만의 투여, 100회 미만, 또는 200회 미만의 투여를 포함한다.
예시적인 면역 체크포인트 억제제는, 비제한적으로, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 또는 BTLA에 대해 표적화된다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 또는 BTLA 중 1종 이상을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1에 결합하는 항체, PD-L1에 결합하는 항체, CTLA-4에 결합하는 항체, LAG3에 결합하는 항체, 또는 TIM-3에 결합하는 항체, TIGIT에 결합하는 항체, VISTA에 결합하는 항체, TIM-1에 결합하는 항체, B7-H4에 결합하는 항체, 또는 BTLA에 결합하는 항체 중 1종 이상이다. 추가 실시양태에서, 항체는 전장 항체 또는 임의의 변이체, 예를 들어 비제한적으로 항체 단편, 단일 쇄 가변 단편 (ScFv) 또는 항원-결합 단편 (Fab)일 수 있다. 추가 실시양태에서, 항체는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 또는 BTLA 중 1종 이상에 결합하고/거나 이를 억제하는 1종 이상의 화학적 화합물이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 또는 BTLA 중 1종 이상에 결합하고/거나 이를 억제하는 1종 이상의 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1에 대해 표적화된다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-L1에 대해 표적화된다.
시토카인은 암, 예를 들어 HPV-연관 암에 대한 상가적 또는 상승작용적 효과를 달성하기 위해 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 1종 이상의 시토카인의 투여와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및 시토카인은 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및 시토카인은 순차적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 전 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 전 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 전 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 전 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 전 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 후 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 후 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 시토카인의 투여 후 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
예시적인 시토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 세포성 면역 반응을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 항체 반응을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 유형 I 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 유형 2 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IL-2, IL-15, IL-10, IL-12, IFN-a, 또는 IL-21 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IL-15를 포함한다.
화학요법은 암, 예를 들어 HPV-연관 암에 대한 상가적 또는 상승작용적 효과를 달성하기 위해 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및 화학요법은 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및 화학요법은 순차적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 전 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 전 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 전 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 후 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 후 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 후 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 후 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여 후 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 다중 투여 및/또는 화학요법의 다중 투여를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 변형된 PBMC 및/또는 화학요법을 포함하는 조성물의 2회 투여, 3회 투여, 4회 투여, 5회 투여, 6회 투여, 7회 투여, 8회 투여, 9회 투여, 10회 투여, 11회 투여, 12회 투여, 13회 투여, 14회 투여 또는 15회 투여를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및/또는 화학요법의 5회 미만의 투여, 10회 미만의 투여, 15회 미만의 투여, 20회 미만의 투여, 25회 미만의 투여, 30회 미만의 투여, 50회 미만의 투여, 75회 미만의 투여, 100회 미만, 또는 200회 미만의 투여를 포함한다.
예시적인 화학요법은 세포 주기 의존성 또는 세포 주기 비의존성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학요법은 1종 이상의 화학요법제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 암에서의 세포 분열, DNA 또는 대사 중 1종 이상을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 백금-기반 작용제, 예컨대 비제한적으로 시스플라틴, 옥살리플라틴 또는 카르보플라틴이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 탁산 (예컨대 도세탁셀 또는 파클리탁셀)이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 5-플루오로우라실, 독소루비신 또는 이리노테칸이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 알킬화제, 항대사물, 항종양 항생제, 토포이소머라제 억제제 또는 유사분열 억제제 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 화학요법은 시스플라틴을 포함한다.
방사선요법은 암, 예를 들어 HPV-연관 암에 대한 상가적 또는 상승작용적 효과를 달성하기 위해 본원에 기재된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및 방사선요법은 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및 방사선요법은 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여와 조합되어, 화학요법과 조합되어, 및/또는 면역 체크포인트 억제제와 조합되어 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 전 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 전 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 전 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 후 약 1시간 내지 약 1주에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 후 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 후 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 후 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일에 투여된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여 후 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일에 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 다중 투여 및/또는 방사선요법의 다중 투여를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및/또는 방사선요법의 2회 투여, 3회 투여, 4회 투여, 5회 투여, 6회 투여, 7회 투여, 8회 투여, 9회 투여, 10회 투여, 11회 투여, 12회 투여, 13회 투여, 14회 투여 또는 15회 투여를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물 및/또는 방사선요법의 5회 미만의 투여, 10회 미만의 투여, 15회 미만의 투여, 20회 미만의 투여, 25회 미만의 투여, 30회 미만의 투여, 50회 미만의 투여, 75회 미만의 투여, 100회 미만, 또는 200회 미만의 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법에 사용하기 위한 항원을 포함하는 복수의 PBMC가 제공된다.
본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 방법에서, 방법은 개체에서 HPV 항원에 대한 면역 반응을 자극한다. 유두종바이러스는 비리온 크기가 ~55 nm 직경인 소형 비외피보유 DNA 바이러스이다. 100종 초과의 HPV 유전자형이 완전히 특징화되어 있고, 보다 높은 수가 존재하는 것으로 추정된다. HPV는 자궁경부암, 뿐만 아니라 일부 외음부암, 질암, 음경암, 구인두암, 항문암 및 직장암의 공지된 원인이다. 대부분의 HPV 감염은 무증상이고 자발적으로 사라지지만, 종양원성 HPV 유형 중 하나에 의한 지속성 감염은 전암 또는 암으로 진행될 수 있다. 다른 HPV-연관 질환은 보통 사마귀, 족저 사마귀, 편평 사마귀, 항문생식기 사마귀, 항문 병변, 표피이형성증, 국소 상피 증식증, 구강 유두종, 사마귀양 낭, 후두 유두종증, 편평 상피내 병변 (SIL), 자궁경부 상피내 신생물 (CIN), 외음부 상피내 신생물 (VIN) 및 질 상피내 신생물 (VAIN)을 포함할 수 있다. 복수의 공지된 인간 유두종바이러스 (HPV) 유형은 하위세트가 종양원성인 양성 병변을 유발한다. 역학 및 계통발생학적 관계에 기초하여, HPV 유형은 15종의 "고위험 유형"(HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 및 82) 및 3종의 "개연성 있는 고위험 유형"(HPV 26, 53 및 66)으로 분류되며, 이들은 함께 저등급 및 고등급 자궁경부 변화 및 암, 뿐만 아니라 다른 항문생식기암, 예컨대 외음부암, 질암, 음경암, 항문암 및 항문주위암, 뿐만 아니라 두경부암으로서 나타나는 것으로 공지되어 있다. 최근에, 고위험 유형 HPV 16 및 18과 유방암과의 연관성이 또한 기재되었다. "저위험 유형"으로 분류된 11종의 HPV 유형 (HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72 및 81)은 양성 저등급 자궁경부 변화, 생식기 사마귀 및 재발성 호흡기 유두종증으로서 나타나는 것으로 공지되어 있다. 피부 HPV 유형 5, 8 및 92는 피부암과 연관된다. 일부 HPV-연관 암에서, 면역계는 저하되고, 상응하게 항종양 반응은 유의하게 손상된다. 문헌 [Suresh and Burtness, Am J Hematol Oncol 13(6):20-27 (2017)]을 참조한다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 1종 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 mRNA를 포함한다.
PBMC 조성물
본원에 사용된 바와 같이, PBMC는 개체로부터 수득된 전혈로부터 백혈구분리반출술에 의해 단리될 수 있다. 또한, 동일한 개체 또는 상이한 개체로부터의 상이한 PBMC 풀을 혼합함으로써 재구성된 PBMC 조성물이 제공된다. 다른 예에서, PBMC는 또한 생성된 프로파일을 갖는 혼합 세포 조성물 내로 상이한 세포 집단을 혼합함으로써 재구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, PBMC를 재구성하는데 사용된 세포 집단은 혼합 세포 집단 (예컨대 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중 1종 이상의 혼합물)이다. 일부 실시양태에서, PBMC를 재구성하는데 사용된 세포 집단은 정제된 세포 집단 (예컨대 정제된 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구)이다. 추가의 예에서, PBMC 조성물을 재구성하는데 사용되는 상이한 세포 집단은 동일한 개체 (예를 들어 자가)로부터 단리될 수 있거나 또는 상이한 개체 (예를 들어 동종이형 및/또는 이종)로부터 단리될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD14+ 단핵구, CD56+ NK 세포 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈 내의 PBMC 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 본질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈로부터의 백혈구분리반출술 생성물 내의 PBMC 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 본질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 1%, 2%, 5%, 10% 15%, 20%, 25%, 30%, 40% 또는 50% 중 어느 하나 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈 내의 PBMC 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 10% 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈로부터의 백혈구분리반출술 생성물 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 1%, 2%, 5%, 10% 15%, 20%, 25%, 30%, 40% 또는 50% 중 어느 하나 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈로부터의 백혈구분리반출술 생성물 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 10% 이하만큼 상이하다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%는 NK 세포이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 90% 내지 약 99%는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99% 중 어느 하나는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 90%는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 90% 내지 약 99%는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99% 중 어느 하나는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 90%는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 중 어느 하나는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 25%는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 또는 30% 중 어느 하나는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 2.5%는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 또는 30% 중 어느 하나는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 3.5%는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 중 어느 하나는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 4%는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 적어도 약 25%는 T 세포이고; 투입 PBMC의 적어도 약 2.5%는 B 세포이고; 투입 PBMC의 적어도 약 3.5%는 NK 세포이고; 투입 PBMC의 적어도 약 4%는 단핵구이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70% 중 어느 하나는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 20%는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 0.25%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25% 또는 30% 중 어느 하나는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 2%는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 또는 30% 중 어느 하나는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 3%는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 중 어느 하나는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 3%는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 적어도 약 20%는 T 세포이고; 변형된 PBMC의 적어도 약 2%는 B 세포이고; 변형된 PBMC의 적어도 약 3%는 NK 세포이고; 변형된 PBMC의 적어도 약 3%는 단핵구이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 중 어느 하나 이하는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 약 70% 이하는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 약 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50% 중 어느 하나 이하는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 약 14% 이하는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 60% 중 어느 하나 이하는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 약 35% 이하는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 약 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50% 중 어느 하나 이하는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 약 4% 이하는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC의 약 25% 이하는 T 세포이고; 투입 PBMC의 약 2.5% 이하는 B 세포이고; 투입 PBMC의 약 3.5% 이하는 NK 세포이고; 투입 PBMC의 약 4% 이하는 단핵구이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 또는 70% 중 어느 하나 이하는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 20% 이하는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 0.25%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25% 또는 30% 중 어느 하나 이하는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 2% 이하는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 또는 30% 중 어느 하나 이하는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 3% 이하는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 중 어느 하나 이하는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 3% 이하는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 20% 이하는 T 세포이고; 변형된 PBMC의 약 2% 이하는 B 세포이고; 변형된 PBMC의 약 3% 이하는 NK 세포이고; 변형된 PBMC의 약 3% 이하는 단핵구이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 또는 70% 내지 75% 중 어느 하나는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 1% 내지 2.5%, 2.5% 내지 4%, 4% 내지 6%, 6% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20%, 또는 20% 내지 25% 중 어느 하나는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 1% 내지 2%, 2% 내지 3.5%, 3.5% 내지 5%, 5% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20%, 또는 20% 내지 25% 중 어느 하나는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 2% 내지 4%, 4% 내지 6%, 6% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 또는 35% 내지 40% 중 어느 하나는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이고, 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이고, 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이고, 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%는 NK 세포이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 또는 70% 내지 75% 중 어느 하나는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 1% 내지 2.5%, 2.5% 내지 4%, 4% 내지 6%, 6% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20%, 또는 20% 내지 25% 중 어느 하나는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 1% 내지 2%, 2% 내지 3.5%, 3.5% 내지 5%, 5% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20% 또는 20% 내지 25% 중 어느 하나는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 2% 내지 4%, 4% 내지 6%, 6% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 또는 35% 내지 40% 중 어느 하나는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%는 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이고, 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이고, 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이고, 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%는 NK 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, PBMC는 또한 단핵 혈액 세포 (예컨대 림프구 및 단핵구)의 혼합 세포 집단의 조성을 조작한 후에 생성될 수 있다. 일부 경우에, 투입 PBMC는 단핵 혈액 세포의 혼합 세포 집단 내에서 특정 하위집단 (예컨대 B 세포)을 감소 (예컨대 결핍)시킨 후에 생성된다. 개체에서의 단핵 혈액 세포의 혼합 세포 집단 내의 조성은 세포 집단이 동일한 개체에서의 전혈로부터의 백혈구분리반출술 생성물과 더 근접하게 유사해지도록 조작될 수 있다. 다른 예에서, 단핵 혈액 세포 (예를 들어, 마우스 비장세포)의 혼합 세포 집단 내의 조성은 또한 세포 집단이 인간 전혈로부터의 백혈구분리반출술 생성물로부터 단리된 인간 PBMC와 더 근접하게 유사해지도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 구축-매개 전달은 유의한 방식으로 PBMC 내의 상이한 하위집단 (예컨대 B 세포, T 세포, NK 세포 또는 단핵구)의 생존율을 차등 조정하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조건화 과정은 유의한 방식으로 PBMC 내의 상이한 하위집단의 생존율을 차등 조정하지 않는다. 일부 실시양태에서, 작용제 (생물보존제 또는 PBMC의 기능 및/또는 생존율을 증진시키는 작용제 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 추가의 첨가는 유의한 방식으로 PBMC 내의 다양한 하위집단의 생존율을 차등 조정하지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 T 세포의 백분율은 수 기준으로 약 10% 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 T 세포의 백분율은 수 기준으로 약 5%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 중 어느 하나 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 B 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 B 세포의 백분율은 수 기준으로 약 10% 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 B 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 B 세포의 백분율은 수 기준으로 약 5%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 중 어느 하나 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 NK 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 NK 세포의 백분율은 수 기준으로 약 10% 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 NK 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 NK 세포의 백분율은 수 기준으로 약 5%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 중 어느 하나 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 단핵구의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 단핵구의 백분율은 수 기준으로 약 10% 이하만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 단핵구의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 단핵구의 백분율은 수 기준으로 5%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20% 중 어느 하나 이하만큼 상이하다.
항원
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 질환-연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 이환 세포로부터 단리된 펩티드 또는 mRNA로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 비-자기 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 용해물, 예컨대 이환 세포의 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 용해물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원 또는 종양 연관 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 암과 연관된다. 일부 실시양태에서, 암은 두경부암, 자궁경부암, 외음부암, 질암, 음경암, 항문암, 항문주위암, 항문생식기암, 구강암 또는 타액선암 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 항원은 두경부암 항원, 자궁경부암 항원, 외음부암 항원, 질암 항원, 음경암 항원, 항문암 항원, 항문주위암 항원, 항문생식기암 항원, 구강암 항원, 타액선암 항원, 유방암 항원, 피부암 항원, 방광암 항원, 결장암, 직장암 항원, 자궁내막암 항원, 신장암 항원, 백혈병 항원, 폐암 항원, 흑색종 항원, 비-호지킨 림프종 항원, 췌장암 항원, 전립선암 항원 또는 갑상선암 항원이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형암이다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 암은 바이러스-연관 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 HPV-연관 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 국부 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 전이성 암이다. 일부 실시양태에서, 항원은 감염성 질환과 연관된다. 일부 실시양태에서, 감염성 질환은 HIV, HPV, EBV, MCV, HBV 또는 HCV와 연관된다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 1종 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원이다. 유두종바이러스는 비리온 크기가 ~55 nm 직경인 소형 비외피보유 DNA 바이러스이다. 100종 초과의 HPV 유전자형이 완전히 특징화되어 있고, 보다 높은 수가 존재하는 것으로 추정된다. HPV는 자궁경부암, 뿐만 아니라 일부 외음부암, 질암, 음경암, 구인두암, 항문암 및 직장암의 공지된 원인이다. 대부분의 HPV 감염은 무증상이고 자발적으로 사라지지만, 종양원성 HPV 유형 중 하나에 의한 지속성 감염은 전암 또는 암으로 진행될 수 있다. 다른 HPV-연관 질환은 보통 사마귀, 족저 사마귀, 편평 사마귀, 항문생식기 사마귀, 항문 병변, 표피이형성증, 국소 상피 증식증, 구강 유두종, 사마귀양 낭, 후두 유두종증, 편평 상피내 병변 (SIL), 자궁경부 상피내 신생물 (CIN), 외음부 상피내 신생물 (VIN) 및 질 상피내 신생물 (VAIN)을 포함할 수 있다. 복수의 공지된 인간 유두종바이러스 (HPV) 유형은 하위세트가 종양원성인 양성 병변을 유발한다. 역학 및 계통발생학적 관계에 기초하여, HPV 유형은 15종의 "고위험 유형"(HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 및 82) 및 3종의 "개연성 있는 고위험 유형"(HPV 26, 53 및 66)으로 분류되며, 이들은 함께 저등급 및 고등급 자궁경부 변화 및 암, 뿐만 아니라 다른 항문생식기암, 예컨대 외음부암, 질암, 음경암, 항문암 및 항문주위암, 뿐만 아니라 두경부암으로서 나타나는 것으로 공지되어 있다. 최근에, 고위험 유형 HPV 16 및 18과 유방암과의 연관성이 또한 기재되었다. "저위험 유형"으로 분류된 11종의 HPV 유형 (HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72 및 81)은 양성 저등급 자궁경부 변화, 생식기 사마귀 및 재발성 호흡기 유두종증으로서 나타나는 것으로 공지되어 있다. 피부 HPV 유형 5, 8 및 92는 피부암과 연관된다. 일부 HPV-연관 암에서, 면역계는 저하되고, 상응하게 항종양 반응은 유의하게 손상된다. 문헌 [Suresh and Burtness, Am J Hematol Oncol 13(6):20-27 (2017)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 항원은 동일한 및 또는 상이한 항원에 대한 반응을 도출하는 다중 폴리펩티드의 풀이다. 일부 실시양태에서, 다중 항원의 풀 내의 항원은 다중 항원의 풀 내의 다른 항원에 대한 면역 반응을 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 항원 HPV 에피토프 및 1개 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 그 자체와, 다른 항원과 또는 아주반트와 복합체화된다. 일부 실시양태에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 HLA-A2-특이적 에피토프로 구성된다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 HPV E6 항원 또는 HPV E7 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 HPV E6 및/또는 E7로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 HPV E6 및/또는 E7로부터 유래된 HLA-A2-제한된 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, HLA-A2-제한 펩티드는 서열식별번호: 1-4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 서열식별번호: 19에 대해 적어도 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 서열식별번호: 23에 대해 적어도 90% 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, HPV 항원은 서열식별번호: 19의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, HPV 항원은 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, HPV 항원은 서열식별번호: 23의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 항원은 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 복수의 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열 중 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개를 포함하는 복수의 항원이다. 일부 실시양태에서, 항원은 서열식별번호: 19와 90% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열 및 서열식별번호: 23과 90% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 복수의 항원이다. 바람직한 실시양태에서, 항원은 서열식별번호: 19의 아미노산 서열 및 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 복수의 항원이다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 비-공유 연결된 펩티드의 풀 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 비-공유 연결된 펩티드의 풀 내에 함유되며, 여기서 각각의 펩티드는 1개 이하의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 항원은 비-공유 연결된 펩티드의 풀 내에 함유되고, 여기서 서열식별번호: 19의 아미노산 서열 및 서열식별번호: 23의 아미노산 서열은 별개의 펩티드 내에 함유된다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함한다. 추가 실시양태에서, 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 개체에게 투여한 후에, 복수의 면역원성 에피토프 중 어느 것도 개체에서 임의의 다른 면역원성 에피토프에 대한 면역 반응을 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이고, 면역원성 에피토프는 면역원성 펩티드 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 펩티드 에피토프는 N-말단 플랭킹 폴리펩티드 및/또는 C-말단 플랭킹 폴리펩티드에 융합된다. 일부 실시양태에서, 항원은 면역원성 펩티드 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 이종 펩티드 서열에 의해 N-말단 및/또는 C-말단 상에 플랭킹된 면역원성 펩티드 에피토프를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 플랭킹 이종 펩티드 서열은 질환-연관 면역원성 펩티드로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 플랭킹 이종 펩티드 서열은 비-자연 발생 서열이다. 일부 실시양태에서, 플랭킹 이종 펩티드 서열은 면역원성 합성 긴 펩티드 (SLP)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, N-말단 플랭킹 폴리펩티드는 서열식별번호: 5-10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/거나 C-말단 플랭킹 폴리펩티드는 서열식별번호: 11-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 MHC 클래스 I-제한 펩티드 및/또는 MHC 클래스 II-제한 펩티드로 가공될 수 있다.
아주반트
본원에 사용된 용어 "아주반트"는 면역 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 조정하고/거나 발생시키는 물질을 지칭할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 아주반트는 PBMC의 집단을 조건화하는데 사용된다 (즉, PBMC는 개체에게 투여하기 전에 아주반트와 함께 인큐베이션됨). 일부 예에서, 항원 단독과 비교하여 항원에 대한 면역 반응을 강화하도록 항원과 함께 아주반트가 투여된다. 따라서, 아주반트는 항원에 대한 면역 세포 반응 (예를 들어 T 세포 반응)의 도출을 부스팅하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 세포내 항원 (예컨대 HPV 항원) 및 세포내 아주반트를 포함하도록 변형된 PBMC를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 교란된 PBMC는 항원 및 아주반트 둘 다와 함께 인큐베이션된다. 예시적인 아주반트는, 비제한적으로, 인터페론 유전자의 자극제 (STING) 효능제, 레티노산-유도성 유전자 I (RIG-I) 효능제, 및 TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 및/또는 TLR9에 대한 효능제를 포함한다. 예시적인 아주반트는 비제한적으로 CpG ODN, 인터페론-α (IFN-α), 폴리이노신산:폴리시티딜산 (폴리I:C), 이미퀴모드 (R837), 레시퀴모드 (R848) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN, LPS, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효능제, TLR4 효능제 또는 TLR 9 효능제이다. 특정한 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG ODN이다. 일부 실시양태에서, CpG ODN은 클래스 A CpG ODN, 클래스 B CpG ODN 또는 클래스 C CpG ODN이다. 일부 실시양태에서, CpG ODN 아주반트는 CpG ODN 1018, CpG ODN 1585, CpG ODN 2216, CpG ODN 2336, CpG ODN 1668, CpG ODN 1826, CPG ODN 2006, CpG ODN 2007, CpG ODN BW006, CpG ODN D-SL01, CpG ODN 2395, CpG ODN M362, CpG ODN D-SL03의 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, CpG ODN 아주반트는 CpG ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT (서열식별번호: 30)) 또는 CpG ODN 2006 (또한 CpG 7909로도 공지됨) (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (서열식별번호: 31)) 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 CpG 7909이다. 일부 실시양태에서, RIG-I 효능제는 폴리이노신산:폴리시티딜산 (폴리I:C)을 포함한다. 다중 아주반트가 또한 면역 반응의 도출을 증진시키기 위해 항원과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 1종 초과의 아주반트를 포함한다. 다중 아주반트가 또한 면역 반응의 도출을 증진시키기 위해 항원과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 1종 초과의 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 아주반트 CpG ODN, LPS, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효능제, TLR4 효능제 또는 TLR 9 효능제의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 달리 나타내지 않는 한, 아주반트는 (a) 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되고 이를 통과하는 아주반트, (b) PBMC가 조건화되도록 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트, (c) 개체에게 변형된 PBMC와 공-투여되는 아주반트를 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 10 mM이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 10 mM 초과이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 0.1 μM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도는 1 μM이다.
일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 10 mM이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 10 mM 초과이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 0.1 μM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 1 μM이다.
일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 몰비는 약 10000:1 내지 약 1:10000 중 임의의 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 몰비는 약 10000:1, 약 1000:1, 약 100:1, 약 10:1, 약 1:1, 약 1:10, 약 1:100, 약 1:1000, 또는 약 1:10000 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 몰비는 약 10000:1 내지 약 1000:1, 약 1000:1 내지 약 100:1, 약 100:1 내지 약 10:1, 약 10:1 내지 약 1:1, 약 1:1 내지 약 1:10, 약 1:10 내지 약 1:100, 약 1:100 내지 약 1:1000, 약 1:1000 내지 약 1:10000 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 몰비는 약 200:1이다. 일부 실시양태에서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 몰비는 약 20:1이다.
일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 아주반트를 약 1 nM 내지 약 1 mM의 농도로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 아주반트를 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 중 임의의 것 미만의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 아주반트를 약 10 mM 중 임의의 것 초과의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 아주반트를 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 아주반트를 약 0.1 μM 내지 약 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 아주반트를 약 1 μM의 농도로 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 항원을 약 1 nM 내지 약 1 mM의 농도로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 항원을 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 중 임의의 것 미만의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 항원을 약 10 mM 중 임의의 것 초과의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 항원을 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 항원을 약 0.1 μM 내지 약 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 항원을 약 1 μM의 농도로 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 1 nM 내지 약 1 mM의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 0.1 nM, 약 1 nM, 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만 중 임의의 것의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 10 mM 초과의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 0.1 nM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 10 nM 내지 약 100 nM의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 1 nM 내지 약 10 nM의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 50 nM의 농도의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA이다.
일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 0.01 μg/mL 내지 약 10 mg/mL의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 0.01 μg/mL, 약 0.1 μg/mL, 약 1 μg/mL, 약 10 μg/mL, 약 100 μg/mL, 약 1 mg/mL 또는 약 10 mg/mL 미만 중 임의의 것의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 10 μg/mL 초과의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 0.001 μg/mL 내지 약 0.1 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 1 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1 mg/mL, 또는 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL 중 임의의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 0.1 μg/mL 내지 약 1 mg/mL의 농도의 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 약 1 μg/mL, 약 2 μg/mL, 약 5 μg/mL, 약 10 μg/mL, 약 20 μg/mL, 약 25 mg/mL, 약 40 μg/mL, 약 50 μg/mL, 약 70 μg/mL, 약 100 μg/mL, 약 200 μg/mL, 또는 약 300 μg/mL, 또는 약 500 μg/mL 중 어느 하나의 농도의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA이다.
일부 실시양태에서, 변형된 PBMC 내의 항원 대 아주반트의 몰비는 약 10000:1 내지 약 1:10000 중 임의의 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC 내의 항원 대 아주반트의 몰비는 약 10000:1, 약 1000:1, 약 100:1, 약 10:1, 약 1:1, 약 1:10, 약 1:100, 약 1:1000, 또는 약 1:10000 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC 내의 항원 대 아주반트의 몰비는 약 10000:1 내지 약 1000:1, 약 1000:1 내지 약 100:1, 약 100:1 내지 약 10:1, 약 10:1 내지 약 1:1, 약 1:1 내지 약 1:10, 약 1:10 내지 약 1:100, 약 1:100 내지 약 1:1000, 약 1:1000 내지 약 1:10000 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC 내의 항원 대 아주반트의 몰비는 약 200:1이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC 내의 항원 대 아주반트의 몰비는 약 20:1이다.
일부 실시양태에서, 항원은 그 자체와, 다른 항원과, 또는 아주반트와 복합체화된다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 a) 항원, b) 항원 및 적어도 1종의 다른 항원, 및/또는 c) 항원 및 아주반트를 포함하는 복합체를 포함한다.
PBMC 특징의 추가의 변형
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는, 작용제를 포함하지 않는 상응하는 복수의 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는, 작용제를 포함하지 않는 상응하는 복수의 변형된 PBMC와 비교하여 동결-해동 사이클 시에 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 동결보존제 및/또는 저체온 보존제이다. 일부 실시양태에서, 동결보존제 또는 저열 보존제는 임의의 동결-해동 주기 전에, 작용제를 포함하지 않는 상응하는 복수의 PBMC와 비교하여 작용제를 포함하는 복수의 PBMC에서 10% 또는 20% 이하의 세포 사멸을 유발한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC의 적어도 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%는 최대 1, 2, 3, 4, 5회의 동결-해동 주기 후에 생존가능하다. 일부 실시양태에서, 작용제는 세포내이입을 증진시키는 화합물, 안정화제 또는 보조-인자이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 알부민이다. 일부 실시양태에서, 알부민은 마우스, 소 또는 인간 알부민이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 인간 알부민이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 2가 금속 양이온, 글루코스, ATP, 칼륨, 글리세롤, 트레할로스, D-수크로스, PEG1500, L-아르기닌, L-글루타민 또는 EDTA 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 2가 금속 양이온은 Mg2+, Zn2+ 또는 Ca2+ 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 피루브산나트륨, 아데닌, 트레할로스, 덱스트로스, 만노스, 수크로스, 인간 혈청 알부민 (HSA), (DMSO), HEPES, 글리세롤, 글루타티온, 이노신, 이염기성 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 나트륨 금속 이온, 칼륨 금속 이온, 마그네슘 금속 이온, 클로라이드, 아세테이트, 글루코네이트, 수크로스, 수산화칼륨 또는 수산화나트륨 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 피루브산나트륨, 아데닌, 레주베솔(Rejuvesol)®, 트레할로스, 덱스트로스, 만노스, 수크로스, 인간 혈청 알부민 (HSA), 플라스마라이트(PlasmaLyte)®, DMSO, 크리오스토르(Cryostor)® CS2, 크리오스토르® CS5, 크리오스토르® CS10, 크리오스토르® CS15, HEPES, 글리세롤, 글루타티온, 하이포써모솔(HypoThermosol)® 중 1종 이상이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 공동-자극 분자 중 1종 이상의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155 또는 CD112이다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 1종 이상의 공동-자극 분자의 증가된 발현을 유발하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 1종 이상의 공동-자극 분자의 증가된 발현을 유발하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 분자는 T 세포 활성화를 자극하는데 있어서 신호 2이펙터이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 1종 이상의 시토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IL-2, IL-12, IL-21 또는 IFNα2 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 1종 이상의 시토카인의 증가된 발현 및/또는 분비를 유발하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 T 세포 활성화를 자극하는데 있어서 신호 3이펙터이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC 내의 적어도 1종의 세포는 HLA-A2의 발현에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 MHC 클래스 I 발현을 조정하기 위한 추가의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 HLA-A02 MHC 클래스 I의 발현을 조정하기 위한 추가의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC는 MHC 클래스 II 발현을 조정하기 위한 추가의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종 환경에서 변형된 PBMC의 투여에 반응하여 개체에 탑재된 선천성 면역 반응은, 동종 환경에서 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC의 투여에 반응하여 개체에 탑재된 선천성 면역 반응과 비교하여 감소된다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기는, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기와 비교하여 증가된다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기는, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기와 비교하여 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배 또는 500배 또는 그 초과 중 어느 하나만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기는, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기와 본질적으로 동일하다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 투입 PBMC 및/또는 변형된 PBMC를, 추가의 인큐베이션 단계 없이 제조된 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다.
PBMC의 조건화
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서; 복수의 변형된 PBMC는 조건화된다. 추가 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 성숙된다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 협착부 매개 전달 후에 조건화된다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC는 협착부-전달 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 제2 아주반트와 함께 인큐베이션되며, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 생성된다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC는 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에 세포 현탁액으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 협착부 매개 전달 후에 조건화된다. 일부 실시양태에서, 협착부-전달 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC는 협착부-전달 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 제2 아주반트와 함께 인큐베이션되며, 그에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 생성된다. 일부 측면에서, a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및/또는 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 c) 협착부-전달 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 협착부-전달 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 협착부-전달 아주반트는 조건화 아주반트와 동일하다. 일부 실시양태에서, 협착부-전달 아주반트는 조건화 아주반트와 상이하다.
일부 실시양태에서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 10 mM이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 10 mM 초과이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 0.1 μM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 1 μM이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간 또는 24시간 중 어느 하나의 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 4시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 협착 매개 전달 전에 조건화된다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션되고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성한다. 일부 실시양태에서, a) 복수의 투입 PBMC를 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 조건화된 복수의 투입 PBMC를 세포-변형 협착부에 통과시키기 전에, 조건화된 아주반트로부터 조건화된 복수의 투입 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 조건화 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계; b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키는 단계이며, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 c) 항원 및/또는 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및/또는 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 조건화된 복수의 투입 PBMC를 세포-변형 협착부에 통과시키기 전에, 조건화된 아주반트로부터 조건화된 복수의 투입 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 협착부-전달 아주반트는 조건화 아주반트와 동일하다. 일부 실시양태에서, 협착부-전달 아주반트는 조건화 아주반트와 상이하다.
일부 실시양태에서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 10 mM이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 10 mM 초과이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 0.1 μM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 1 μM이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 투입 PBMC가 조건화되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 투입 PBMC가 조건화되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 투입 PBMC가 조건화되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 투입 PBMC가 조건화되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간 또는 24시간 중 어느 하나의 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 투입 PBMC가 조건화되도록 약 4시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원을 PBMC에 도입하기 전에, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC가 제공된다.
상기 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 10 mM이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM 또는 약 10 mM 미만 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 10 mM 초과이다. 일부 실시양태에서, PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 0.1 μM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 1 mM 내지 약 10 mM 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시양태에서, PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도는 1 μM이다.
본원에 기재된 임의의 조건화된 복수의 PBMC에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 조건화되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 조건화되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 조건화되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 조건화되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간 또는 24시간 중 어느 하나의 시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 조건화되도록 약 4시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션된다.
본원에 기재된 조건화된 복수의 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공동-자극 분자는 조건화되지 않은 복수의 변형된 PBMC와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 상향조절된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공동-자극 분자는 조건화되지 않은 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 하위집단과 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 하위집단에서 상향조절된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공동-자극 분자는 조건화되지 않은 복수의 변형된 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절된다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 분자는 CD86이다. 일부 실시양태에서, CD80 및/또는 CD86은 조건화되지 않은 복수의 변형된 PBMC의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 상향조절된다. 일부 실시양태에서, CD80 및/또는 CD86은 조건화되지 않은 복수의 변형된 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 약 1.2배 내지 약 1.5배, 약 1.5배 내지 약 1.8배, 약 1.8배 내지 약 2배, 약 2배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 5배, 약 5배 내지 약 8배, 약 8배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 20배, 약 20배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 100배, 약 100배 내지 약 200배, 약 200배 내지 약 500배, 또는 약 500배 초과 중 임의의 배수만큼 상향조절된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 발현은 조건화되지 않은 복수의 변형된 PBMC와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 발현은 조건화되지 않은 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 하위집단과 비교하여 조건화된 복수 내의 세포의 하위집단에서 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 발현은 조건화되지 않은 복수의 변형된 PBMC와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 발현은 조건화되지 않은 복수의 변형된 PBMC와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC에서 약 1.2배 내지 약 1.5배, 약 1.5배 내지 약 1.8배, 약 1.8배 내지 약 2배, 약 2배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 5배, 약 5배 내지 약 8배, 약 8배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 20배, 약 20배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 100배, 약 100배 내지 약 200배, 약 200배 내지 약 500배, 또는 약 500배 초과 중 임의의 것만큼 증가된다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 1종 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 mRNA를 포함한다.
마이크로유체 시스템 및 그의 성분
세포-변형 협착부를 제공하는 마이크로유체 채널
일부 실시양태에서, 본 발명은 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것에 의해 면역 반응을 조정하는 방법이며, 여기서 협착부는 PBMC를 변형시키고, 이에 의해 PBMC의 교란을 유발하여 항원 및/또는 아주반트가 PBMC에 진입하고, 여기서 협착부는 마이크로유체 채널 내에 함유되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 다중 협착부가 마이크로유체 채널 내에 병렬 및/또는 직렬로 놓일 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 세포-변형 협착부를 함유하는 예시적인 마이크로유체 채널이 WO2013059343에 기술되어 있다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 세공을 갖는 예시적인 표면은 WO2017041050에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 마이크로유체 채널은 루멘을 포함하고, 완충제 중에 현탁된 PBMC가 통과할 수 있도록 구성되며, 여기서 마이크로유체 채널은 협착부를 포함한다. 마이크로유체 채널은 실리콘, 금속 (예를 들어, 스테인레스 스틸), 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌), 세라믹, 유리, 결정질 기판, 무정형 기판, 또는 중합체 (예를 들어, 폴리-메틸 메타크릴레이트 (PMMA), PDMS, 시클릭 올레핀 공중합체 (COC) 등)를 비롯한 다수의 물질 중 어느 하나로 제조될 수 있다. 마이크로유체 채널의 제작은 건식 에칭, 습식 에칭, 포토리소그래피, 사출 성형, 레이저 삭마, 또는 SU-8 마스크를 포함하는 관련 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 마이크로유체 채널 내의 협착부는 입구 부분, 중심점, 및 출구 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마이크로유체 채널 내의 협착부의 길이, 깊이, 및 폭은 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널 내의 협착부의 직경은 투입 PBMC의 직경의 함수이다. PBMC의 직경을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 예를 들어, 고함량 영상화, 세포 수기 또는 유동 세포측정법이다. 일부 실시양태에서, 마이크로유체 채널 내의 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 20% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 협착부 크기는 PBMC의 평균 직경 또는 PBMC의 하위집단의 평균 직경의 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 협착부 크기는 복수의 투입 PBMC의 최소 단면 거리의 평균의 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 2 μm 내지 약 10 μm 또는 이들 사이의 임의의 폭 또는 폭 범위의 협착부 폭을 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 3 μm 내지 약 10 μm의 협착부 폭을 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 3 μm 내지 약 6 μm의 협착부 폭을 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm의 협착부 폭을 포함한다. 예를 들어, 협착부 폭은 약 2 μm, 약 2.5 μm, 약 3 μm, 약 3.5 μm, 약 4 μm, 약 4.5 μm, 약 5 μm, 약 5.5 μm, 약 6 μm, 약 6.5 μm, 또는 약 7 μm 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 10 μm의 협착부 길이 및 약 3.5 μm의 협착부 폭을 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 10 μm의 협착부 길이 및 약 4 μm의 협착부 폭을 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 10 μm의 협착부 길이 및 약 4.5 μm의 협착부 폭을 포함한다. 채널, 입구 부분, 중심점, 및 출구 부분의 단면 또한 다양할 수 있다. 예를 들어, 단면은 형상 면에서 원형, 타원형, 긴 틈새, 정사각형, 육각형, 또는 삼각형일 수 있다. 입구 부분은 협착부 각도를 정의하고, 협착부 각도는 채널 막힘을 저하시키도록 최적화되고, 화합물의 PBMC 내로의 전달 강화를 위해 최적화된다. 출구 부분의 각도 또한 다양할 수 있다. 예를 들어, 비-층류를 초래할 수 있는 난류의 가능성을 저하시키도록 출구 부분의 각도가 구성된다. 일부 실시양태에서, 입구 부분 및/또는 출구 부분의 벽은 직선형이다. 다른 실시양태에서, 입구 부분 및/또는 출구 부분의 벽은 곡선형이다.
세포-변형 협착부를 제공하는 세공을 갖는 표면
일부 실시양태에서, 본 발명은 복수의 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것에 의해 면역 반응을 조정하는 방법이며, 여기서 협착부는 PBMC를 변형시키고 이에 의해 PBMC의 교란을 유발하여 항원 및/또는 아주반트가 PBMC에 진입하고, 여기서 협착부는 세공이거나 또는 세공 내에 함유되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세공은 표면 내에 함유된다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 세공을 갖는 예시적인 표면은 WO2017041050에 기재되어 있다.
본원에 개시된 바와 같은 표면은 복수의 물질 중 임의의 것으로 제조될 수 있고, 복수의 형태 중 임의의 것을 취할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 막이다. 일부 실시양태에서, 필터는 접선 흐름 필터이다. 일부 실시양태에서, 표면은 스폰지 또는 스폰지-유사 매트릭스이다. 일부 실시양태에서, 표면은 매트릭스이다.
일부 실시양태에서, 표면은 굴곡 경로 표면이다. 일부 실시양태에서, 굴곡 경로 표면은 셀룰로스 아세테이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 비제한적으로 합성 또는 천연 중합체, 폴리카르보네이트, 실리콘, 유리, 금속, 합금, 셀룰로스 니트레이트, 은, 셀룰로스 아세테이트, 나일론, 폴리에스테르, 폴리에테르술폰, 폴리아크릴로니트릴 (PAN), 폴리프로필렌, PVDF, 폴리테트라플루오르에틸렌, 혼합형 셀룰로스 에스테르, 자기, 및 세라믹으로부터 선택된 물질을 포함한다.
본원에 개시된 표면은 관련 분야에 공지된 임의의 형상, 예를 들어 3차원 형상일 수 있다. 표면의 2차원 형상은, 비제한적으로, 원형, 타원형, 구형, 정사각형, 성상형, 삼각형, 다각형, 오각형, 육각형, 칠각형 또는 팔각형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 형상 면에서 구형이다. 일부 실시양태에서, 표면 3차원 형상은 원통형, 원추형 또는 직육면체형이다.
표면은 단면 폭 및 두께가 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면의 단면 폭은 약 1 mm 내지 약 1 m, 또는 이들 사이의 임의의 단면 폭 또는 단면 폭 범위이다. 일부 실시양태에서, 표면은 규정된 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표면 두께는 균일하다. 일부 실시양태에서, 표면 두께는 가변적이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표면의 일부분이 표면의 다른 부분보다 더 두껍거나 또는 더 얇다. 일부 실시양태에서, 표면 두께는 약 1% 내지 약 90% 또는 이들 사이의 임의의 백분율 또는 백분율 범위만큼 다양하다. 일부 실시양태에서, 표면은 약 0.01 μm 내지 약 5 mm 두께 또는 이들 사이의 임의의 두께 또는 두께 범위이다.
세공 통로의 입구 및 출구는 각도가 다양할 수 있다. 세공 각도는 PBMC가 통과하는 동안 세공 막힘을 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면을 통한 유량은 약 0.001 mL/cm2/sec 내지 약 100 L/cm2/sec 또는 이들 사이의 임의의 속도 또는 속도 범위이다. 예를 들어, 입구 또는 출구 부분의 각도는 약 0 내지 약 90도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 입구 또는 출구 부분은 90도를 초과할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세공은 입구 및 출구 각도가 동일하다. 일부 실시양태에서, 세공은 입구 및 출구 각도가 상이하다. 일부 실시양태에서, 세공 가장자리는 매끄럽고, 예를 들어, 둥글거나 곡선형이다. 매끄러운 세공 가장자리는 혹, 융기부 또는 균일하지 않은 부분이 없으면서 표면이 연속적이고, 평평하며 균일하다. 일부 실시양태에서, 세공 가장자리는 날카롭다. 날카로운 세공 가장자리는 뾰족하거나 예각인 얇은 가장자리가 있다. 일부 실시양태에서, 세공 통로는 직선형이다. 직선형 세공 통로는 곡선, 만곡부, 각도, 또는 기타 불규칙 부분을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세공 통로는 곡선형이다. 곡선형 세공 통로는 구부러지거나 또는 직선으로부터 벗어난다. 일부 실시양태에서, 세공 통로는 다수의 곡선, 예를 들어 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 곡선이 있다.
세공은 2차원 또는 3차원 형상을 포함하여 관련 분야에 공지된 임의의 형상일 수 있다. 세공 형상 (예를 들어, 단면 형상)은, 비제한적으로, 원형, 타원형, 구형, 정사각형, 성상형, 삼각형, 다각형, 오각형, 육각형, 칠각형 및 팔각형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세공의 단면은 형상 면에서 구형이다. 일부 실시양태에서, 세공의 3차원 형상은 원통형 또는 원뿔형이다. 일부 실시양태에서, 세공은 세로 홈이 있는 입구 및 출구 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세공 형상은 소정의 표면 내의 세공들 사이에서 균질하다 (즉, 일관적이거나 규칙적이다). 일부 실시양태에서, 세공 형상은 소정의 표면 내의 세공들 사이에서 균질하지 않다 (즉, 혼합형이거나 다양하다).
본원에 기재된 표면은 총 세공 수가 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세공은 총 표면적의 약 10% 내지 약 80%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 약 1.0x105 내지 약 1.0x1030개의 총 세공 또는 그 사이의 임의의 수 또는 수 범위를 함유한다. 일부 실시양태에서, 표면은 약 10 내지 약 1.0x1015개의 세공/mm2 표면적을 포함한다.
세공은 소정의 표면 내에서 수많은 방식으로 분포될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세공은 소정의 표면 내에서 병렬로 분포된다. 하나의 이러한 예에서, 세공은 동일한 방향으로 나란히 분포되고, 소정의 표면 내에서 동일한 거리로 떨어진다. 일부 실시양태에서, 세공 분포는 정연하거나 또는 균질하다. 하나의 이러한 예에서, 세공은 규칙적이고 조직적인 패턴으로 분포되거나, 또는 소정의 표면 내에서 동일한 거리로 떨어진다. 일부 실시양태에서, 세공 분포는 무작위이거나 또는 비균질성이다. 하나의 이러한 예에서, 세공은 불규칙하고 무질서한 패턴으로 분포되거나, 또는 소정의 표면 내에서 상이한 거리로 떨어진다. 일부 실시양태에서, 다중 표면이 일렬로 분포된다. 다중 표면은 표면 크기, 형상 및/또는 조도 면에서 균질성 또는 비균질성일 수 있다. 다중 표면은 세공 크기, 형상 및/또는 수가 균질성 또는 비균질성인 세공들을 추가로 함유할 수 있으며, 이에 의해 광범위한 화합물을 상이한 PBMC 유형들 내로 동시에 전달하는 것을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 개별적인 세공은 폭 치수가 균일하다 (즉, 세공 통로의 길이를 따라 폭이 일정하다). 일부 실시양태에서, 개별적인 세공은 폭이 가변적이다 (즉, 세공 통로의 길이를 따라 폭이 증가하거나 또는 감소된다). 일부 실시양태에서, 소정의 표면 내의 세공은 개별적인 세공 깊이가 동일하다. 일부 실시양태에서, 소정의 표면 내의 세공은 개별적인 세공 깊이가 상이하다. 일부 실시양태에서, 세공은 서로 인접한다. 일부 실시양태에서, 세공은 서로 일정 거리만큼 떨어진다. 일부 실시양태에서, 세공은 약 0.001 μm 내지 약 30 mm의 거리 또는 이들 사이의 임의의 거리 또는 거리 범위만큼 서로 떨어진다.
일부 실시양태에서, 표면은 물질로 코팅된다. 물질은 비제한적으로 테플론, 접착제 코팅, 계면활성제, 단백질, 접착 분자, 항체, 항응고제, 세포 기능을 조정하는 인자, 핵산, 지질, 탄수화물 또는 막횡단 단백질을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 물질로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 폴리비닐피롤리돈 (PVP)으로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 물질은 표면에 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 물질은 표면에 비-공유 부착되거나 흡착된다. 일부 실시양태에서, 표면 분자는 PBMC가 세공을 통과할 때 방출된다.
일부 실시양태에서, 표면은 변형된 화학적 성질을 갖는다. 일부 실시양태에서, 표면은 극성이다. 일부 실시양태에서, 표면은 친수성이다. 일부 실시양태에서, 표면은 비-극성이다. 일부 실시양태에서, 표면은 소수성이다. 일부 실시양태에서, 표면은 하전된다. 일부 실시양태에서, 표면은 양으로 및/또는 음으로 하전된다. 일부 실시양태에서, 표면은 일부 영역에서는 양으로 하전되고, 다른 영역에서는 음으로 하전될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 전반적인 양전하 또는 전반적인 음전하를 띤다. 일부 실시양태에서, 표면은 매끄럽거나, 전해연마되거나, 거칠거나, 또는 플라즈마 처리된 것 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 쯔비터이온 또는 이극성 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 플라즈마 처리된 것이다.
일부 실시양태에서, 표면은 더 큰 모듈 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 시린지, 예컨대 플라스틱 또는 유리 시린지 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 플라스틱 필터 홀더 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표면은 피펫 팁 내에 함유된다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 1종 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 비히클로 운반되고, 여기서 하나 이상의 비히클은 투입 PBMC에 전달된다. 일부 실시양태에서, 비히클은 바이러스 또는 바이러스-연관 입자이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 레트로바이러스 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 AAV를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비히클은 지질-기반 비히클, 예를 들어 리포솜이다. 일부 실시양태에서, 비히클은 나노입자이다.
세포 교란
일부 실시양태에서, 본 발명은 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키는 것에 의해 면역 반응을 조정하는 방법이며, 여기서 협착부는 PBMC를 변형시키고 이에 의해 PBMC의 교란을 유발하여 항원 및/또는 아주반트가 PBMC에 진입하고, 여기서 PBMC에서의 교란은 PBMC 외부로부터의 물질이 PBMC 내로 이동하도록 하는 PBMC에서의 파괴 (예를 들어, 홀, 인열, 공동, 개구, 세공, 파단, 갭, 천공)인 방법을 제공한다. 변형은 예를 들어 기계적 변형 또는 기계적 변형 및 전단력에 의해 유발될 수 있다. 일부 실시양태에서, 교란은 PBMC 세포 막 내에서의 교란이다. 일부 실시양태에서, 교란은 일시적이다. 일부 실시양태에서, PBMC 교란은 약 1.0x10-9초 내지 약 2시간, 또는 그 사이의 임의의 시간 또는 시간 범위로 지속된다. 일부 실시양태에서, PBMC 교란은 약 1.0x10-9초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 또는 약 1분 내지 약 1시간 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, PBMC 교란은 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-2, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-3, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-4, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-5, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-6, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-7, 또는 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-8초 중 어느 하나 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, PBMC 교란은 약 1.0x10-8 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-7 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-6 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-5 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-4 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-3 내지 약 1.0x10-1, 또는 약 1.0x10-2 내지 약 1.0x10-1초 중 어느 하나 동안 지속된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 PBMC 교란 (예를 들어, 세공 또는 구멍)은 보체 또는 박테리아 용혈소에 의해 생성된 것과 같은 다량체성 세공 구조를 형성하기 위한 단백질 서브유닛의 조립의 결과로서 형성되지 않는다.
PBMC가 협착부를 통과할 때, 협착부는 PBMC 막에 손상을 일시적으로 부여하고, 이는 교란을 통한 물질의 수동 확산을 허용한다. 일부 실시양태에서, 다른 기간 (예를 들어, 나노초 내지 수 시간 범위)도 가능하지만, PBMC는 대략 100 μs의 짧은 기간 동안만 변형되어, 세포 신호전달 메카니즘을 통해 아폽토시스 경로를 활성화시킬 가능성을 최소화한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 약 1.0 x10-9초 내지 약 2시간, 또는 그 사이의 임의의 시간 또는 시간 범위 동안 변형된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 약 1.0x10-9초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 또는 약 1분 내지 약 1시간 동안 변형된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-2, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-3, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-4, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-5, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-6, 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-7, 또는 약 1.0x10-9 내지 약 1.0x10-8초 중 어느 하나 동안 변형된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 약 1.0x10-8 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-7 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-6 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-5 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-4 내지 약 1.0x10-1, 약 1.0x10-3 내지 약 1.0x10-1, 또는 약 1.0x10-2 내지 약 1.0x10-1초 중 어느 하나 동안 변형된다. 일부 실시양태에서, PBMC를 변형시키는 것은 PBMC를 비제한적으로 약 1 μs 내지 적어도 약 750 μs, 예를 들어, 적어도 약 1 μs, 10 μs, 50 μs, 100 μs, 500 μs, 또는 750 μs 범위의 시간 동안 변형시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, PBMC 내로의 항원 및/또는 아주반트의 통과는 PBMC가 PBMC의 협착부 및/또는 교란을 통과하는 것과 동시에 발생한다. 일부 실시양태에서, PBMC 내로의 화합물의 통과는 PBMC가 협착부를 통과한 후에 발생한다. 일부 실시양태에서, PBMC 내로의 화합물의 통과는 PBMC가 협착부를 통과한 후 대략 수분 내에 발생한다. 일부 실시양태에서, PBMC 내로의 화합물의 통과는 PBMC가 협착부를 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 적어도 약 30분에 발생한다. 예를 들어, PBMC 내로의 화합물의 통과는 PBMC가 협착부를 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 또는 약 1분 내지 약 30분에 발생한다. 일부 실시양태에서, PBMC 내로의 화합물의 통과는 PBMC가 협착부를 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 약 10분, 약 1.0x10-2초 내지 약 5분, 약 1.0x10-2초 내지 약 1분, 약 1.0x10-2초 내지 약 30초, 약 1.0x10-2초 내지 약 10초, 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 또는 약 1.0x10-2초 내지 약 0.1초에 발생한다. 일부 실시양태에서, PBMC 내로의 화합물의 통과는 PBMC가 협착부를 통과한 후 약 1.0x10-1초 내지 약 10분, 약 1초 내지 약 10분, 약 10초 내지 약 10분, 약 50초 내지 약 10분, 약 1분 내지 약 10분, 또는 약 5분 내지 약 10분에 발생한다. 일부 실시양태에서, PBMC가 협착부를 통과한 후의 PBMC에서의 교란은 PBMC가 협착부를 통과한 후 대략 약 5분 내에 교정된다.
일부 실시양태에서, 협착부를 통과한 후의 세포 생존율은 약 5% 내지 약 100%이다. 일부 실시양태에서, 협착부를 통과한 후의 세포 생존율은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%이다. 일부 실시양태에서, 세포 생존율은 PBMC가 협착부를 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 적어도 약 10일까지 측정된다. 예를 들어, 세포 생존율은 PBMC가 협착부를 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 약 1초 내지 약 1분, 약 1분 내지 약 30분, 또는 약 30분 내지 약 2시간에 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 생존율은 PBMC가 협착부를 통과한 후 약 1.0x10-2초 내지 약 2시간, 약 1.0x10-2초 내지 약 1시간, 약 1.0x10-2초 내지 약 30분, 약 1.0x10-2초 내지 약 1분, 약 1.0x10-2초 내지 약 30초, 약 1.0x10-2초 내지 약 1초, 또는 약 1.0x10-2초 내지 약 0.1초에 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 생존율은 PBMC가 협착부를 통과한 후 약 1.5시간 내지 약 2시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 30분 내지 약 2시간, 약 15분 내지 약 2시간, 약 1분 내지 약 2시간, 약 30초 내지 약 2시간, 또는 약 1초 내지 약 2시간에 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 생존율은 PBMC가 협착부를 통과한 후 약 2시간 내지 약 5시간, 약 5시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 또는 약 24시간 내지 약 10일 후에 측정된다.
전달 파라미터
다수의 파라미터가 본원에 기재된 방법에 의해 면역 반응을 조정하기 위한 PBMC로의 화합물의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 협착부 통과 전에, 협착부 통과와 동시에, 또는 협착부 통과 후에 화합물과 접촉된다. PBMC가 협착부를 통과한 후에 화합물이 세포 현탁액에 첨가될 수 있지만, PBMC는 전달할 화합물을 포함하는 용액에 현탁되어 협착부를 통과할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달될 화합물은 협착부 상에 코팅된다.
PBMC 내로의 화합물의 전달에 영향을 미칠 수 있는 파라미터의 예는 협착부의 치수, 협착부의 입구 각도, 협착부의 표면 성질 (예를 들어, 조도, 화학적 변형, 친수성, 소수성 등), 작업 유속 (예를 들어, 협착부를 통한 세포 통과 시간), PBMC 농도, 세포 현탁액 중 화합물의 농도를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 협착부를 통과한 후 PBMC가 회수 또는 인큐베이션되는 시간의 양이 전달된 화합물의 PBMC 내로의 통과에 영향을 미칠 수 있다. PBMC 내로의 화합물 전달에 영향을 미치는 추가적인 파라미터는 협착부 내에서의 PBMC의 속도, 협착부 내에서의 전단 속도, 세포 현탁액의 점도, 유량에 수직인 속도 성분, 및 협착부에서의 시간을 포함할 수 있다. 또한, 채널을 직렬 및/또는 병렬로 포함하는 다중 칩은 PBMC로의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 병렬의 다중 칩이 처리량을 증진시키는데 유용할 수 있다. 이러한 파라미터들은 화합물 전달을 제어하도록 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, PBMC 농도는 약 10 내지 적어도 약 1012개 세포/mL 또는 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위의 범위이다. 일부 실시양태에서, 전달 화합물 농도는 약 10 ng/ml 내지 약 1g/mL 또는 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달 화합물 농도는 약 1 pM 내지 적어도 약 2 M 또는 또는 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위의 범위일 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 온도는 화합물 전달 및 세포 생존율에 영향을 미치도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 -5℃ 내지 약 45℃에서 수행된다. 예를 들어, 방법은 실온 (예를 들어, 약 20℃), 생리학적 온도 (예를 들어, 약 37℃), 생리학적 온도보다 높은 온도 (예를 들어, 약 37℃ 초과 내지 45℃ 또는 그 초과), 또는 감소된 온도 (예를 들어, 약 -5℃ 내지 약 4℃), 또는 이들 예시적인 온도 사이의 온도에서 수행될 수 있다.
다양한 방법이 PBMC를 협착부를 통과해 구동시키는데 이용할 수 있다. 예를 들어, 압력이 입구 측 상의 펌프 (예를 들어, 컴프레서)에 의해 가해질 수 있고/거나, 진공이 출구 측 상의 진공 펌프에 의해 가해질 수 있고/거나, 모세관 작용이 튜브를 통해 가해질 수 있고/거나, 시스템에 중력 공급될 수 있다. 변위 기반 유동 시스템을 또한 사용할 수 있다 (예를 들어, 시린지 펌프, 연동 펌프, 수동 시린지 또는 피펫, 피스톤 등). 일부 실시양태에서, PBMC는 양압 또는 음압에 의해 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 일정한 압력 또는 가변성 압력에 의해 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 압력은 시린지를 사용하여 적용된다. 일부 실시양태에서, 압력은 기체를 사용하여 (예를 들어, 기체 실린더로부터) 적용되는 양압이다. 일부 실시양태에서, 압력은 펌프를 사용하여 적용된다. 일부 실시양태에서, 펌프는 연동 펌프 또는 펌프 또는 다이어프램 펌프이다. 일부 실시양태에서, 압력은 진공을 사용하여 적용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 g-힘에 의해 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 원심력에 의해 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 모세관 압력에 의해 협착부를 통과한다.
일부 실시양태에서, 유체 흐름이 PBMC가 협착부를 통과하게 지시한다. 일부 실시양태에서, 유체 흐름은 PBMC가 협착부를 통과하기 전에 난류이다. 난류는 소정의 지점에서의 속도가 규모 및 방향 면에서 불안정하게 변하는 유체 흐름이다. 일부 실시양태에서, 협착부를 통하는 유체 흐름은 층류이다. 층류는 모든 지점에서의 흐름의 방향이 일정하게 유지되는 고체 경계 근처의 유체에서의 중단되지 않은 흐름을 수반한다. 일부 실시양태에서, 유체 흐름은 PBMC가 협착부를 통과한 후에 난류이다. PBMC가 협착부를 통과하는 속도는 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, PBMC는 균일한 세포 속도로 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, PBMC는 변동되는 세포 속도로 협착부를 통과한다.
다른 실시양태에서, 조합 치료는, PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부는 PBMC를 변형시키고, 이에 의해 PBMC의 교란을 유발하여 항원 및/또는 아주반트가 PBMC에 진입하는 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 이어서 협착부의 하류에서 전기장에 노출시키는 것에 의해 면역 반응을 조정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 협착부를 통과한 후에 대해 적어도 1개의 전극에 의해 생성된 전기장을 통과한다. 일부 실시양태에서, 전기장은 화합물을 PBMC 내부의 제2 장소 예컨대 PBMC 핵에 전달하는 것을 보조한다. 예를 들어, 세포-변형 협착부 및 전기장의 조합이 항체를 코딩하는 플라스미드를 PBMC (예를 들어, 세포핵) 내로 전달하여, 항체의 신생 생산을 초래한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 전극이 세포-변형 협착부에 인접하여 전기장을 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 전기장은 약 0.1 kV/m 내지 약 100 MV/m, 또는 이들 사이의 임의의 숫자 또는 숫자 범위이다. 일부 실시양태에서, 집적 회로가 전극을 구동시키는 전기 신호를 제공하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 약 1 ns 내지 약 1 s의 펄스 폭 및 약 100 ns 내지 약 10 s 또는 이들 사이의 임의의 시간 또는 시간의 범위의 기간 동안 전기장에 노출된다.
PBMC로의 전달을 위한 세포 현탁액
세포 현탁액은 혼합 또는 정제된 집단 또는 복수의 PBMC일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 혼합 세포 집단, 예컨대 전혈이다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 정제된 세포 집단, 예컨대 PBMC의 정제된 집단 (예를 들어, 복수)이다. 다른 실시양태에서, PBMC의 집단 (예를 들어, 복수)은 1개 이상의 세포가 결핍된다. 일부 실시양태에서, PBMC의 집단은 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포 중 1종 이상이 결핍된다.
세포 현탁액의 조성 (예를 들어, 오스몰농도, 염 농도, 혈청 함량, 세포 농도, pH 등)은 면역 반응을 조정하기 위한 화합물의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 전혈을 포함한다. 대안적으로, 세포 현탁액은 생리식염수 용액 또는 혈액 이외의 생리학적 매질 내의 세포 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 수성 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용액은 세포 배양 배지, 포스페이트 완충 염수 (PBS), 염, 금속 이온, 당, 성장 인자, 동물 유래 생성물, 벌킹 물질, 계면활성제, 윤활제, 지질, 비타민, 아미노산, 단백질, 세포 주기 억제제 및/또는 액틴 중합에 영향을 미치는 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 DMEM, 옵티-MEM(Opti-MEM)®, IMDM, RPMI, 엑스-비보(X-Vivo) 10TM, 및 엑스-비보 15TM이다. 추가적으로, 용액 완충제는, 예를 들어, 협착부 또는 세공의 막힘을 감소 또는 제거하고 세포 생존율을 개선시키도록 디자인될 수 있는 하나 이상의 윤활제 (플루로닉스(Pluronics)® 또는 기타 계면활성제)를 포함할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 비제한적으로 폴록사머, 폴리소르베이트, 당 또는 당 알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 동물 유래 혈청 및 알부민 단백질을 포함한다.
특정 PBMC 유형이 있는 일부 구성에서, PBMC는 PBMC 내부로의 화합물 전달을 보조하는 하나 이상의 용액에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수성 용액은 액틴 중합에 영향을 미치는 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 액틴 중합에 영향을 미치는 작용제는 라트룬쿨린 A, 시토칼라신, 및/또는 콜키신이다. 예를 들어, PBMC를 탈중합 용액, 예컨대 라트룬쿨린 A (0.1 μg/mL) 중에서 전달 전 1시간 동안 인큐베이션하고, 이에 의해 액틴 세포골격을 탈중합시킬 수 있다. 추가의 예로서, 미세관 네트워크를 탈중합시키기 위해 전달 전에 2시간 동안 10 μM 콜키신 (시그마(Sigma))에서 PBMC를 인큐베이션할 수 있다.
세포 현탁액의 점도 또한 본원에 개시된 방법에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 현탁액의 점도는 약 8.9x10-4 Paㆍs 내지 약 4.0x10-3 Paㆍs의 범위 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위이다. 일부 실시양태에서, 점도는 약 8.9x10-4 Paㆍs 내지 약 4.0x10-3 Paㆍs, 약 8.9x10-4 Paㆍs 내지 약 3.0x10-3 Paㆍs, 약 8.9x10-4 Paㆍs 내지 약 2.0x10-3 Paㆍs, 또는 약 8.9x10-3 Paㆍs 내지 약 1.0x10-3 Paㆍs 중 어느 하나의 범위이다. 일부 실시양태에서, 점도는 약 0.89 cP 내지 약 4.0 cP, 약 0.89 cP 내지 약 3.0 cP, 약 0.89 cP 내지 약 2.0 cP, 또는 약 0.89 cP 내지 약 1.0 cP 중 임의의 것의 범위이다. 일부 실시양태에서, 전단 변형의 조건 하에 세포 현탁액의 점도가 감소되는 전단 박화 효과가 관찰된다. 점도계, 예컨대 유리 모세관 점도계, 또는 레오미터를 비제한적으로 포함하는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 점도를 측정할 수 있다. 점도계는 하나의 유동 조건 하에서의 점도를 측정하는 한편, 레오미터는 유동 조건에 따라 변하는 점도를 측정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 전단 박화 용액 예컨대 혈액에 대해 점도가 측정된다. 일부 실시양태에서, 점도는 약 -5℃ 내지 약 45℃에서 측정된다. 예를 들어, 점도는 실온 (예를 들어, 약 20℃), 생리학적 온도 (예를 들어, 약 37℃), 생리학적 온도보다 높은 온도 (예를 들어, 약 37℃초과 내지 45℃ 또는 그 초과), 감소된 온도 (예를 들어, 약 -5℃ 내지 약 4℃), 또는 이들 예시적인 온도 사이의 온도에서 측정된다.
협착 매개 전달
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 PBMC의 직경, 예컨대 복수의 PBMC의 평균 직경, 또는 복수의 PBMC 내의 하위집단의 평균 직경의 함수이다. 일부 실시양태에서, 세포의 직경은 세포 (예를 들어, 복수의 PBMC 내의 세포)의 최소 단면 거리에 의해 측정된다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 또는 약 30% 내지 약 45% 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 99% 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 중 어느 하나이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 99% 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC 내의 가장 작은 평균 직경을 갖는 세포의 하위집단은 림프구 집단이며, 여기서 림프구 집단의 직경은 약 6 μm 내지 약 10 μm이다. 일부 실시양태에서, 림프구 집단의 평균 직경은 약 7 μm이다. 일부 실시양태에서, 림프구 집단은 T 세포 집단이다. 일부 실시양태에서, 림프구는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC 내의 가장 작은 평균 직경을 갖는 세포의 하위집단은 T 세포이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60% 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 99% 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC 내의 가장 큰 평균 직경을 갖는 세포의 하위집단은 단핵구 집단이며, 여기서 단핵구 집단의 직경은 약 15 μm 내지 약 25 μm이다. 일부 실시양태에서, 단핵구 집단의 평균 직경은 약 20 μm이다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC 내의 가장 큰 평균 직경을 갖는 세포의 하위집단은 단핵구이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 15 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 4 μm 내지 약 10 μm 이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 2 μm 내지 약 14 μm, 약 4 μm 내지 약 12 μm, 약 6 μm 내지 약 9 μm, 약 4 μm 내지 약 6 μm, 약 4 μm 내지 약 5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 7 μm, 약 3.5 μm 내지 약 6.3 μm, 약 3.5 μm 내지 약 5.6 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4.9 μm, 약 4.2 μm 내지 약 6.3 μm, 약 4.2 μm 내지 약 5.6 μm, 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.9 μm 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 10.5 μm, 11 μm, 11.5 μm, 12 μm, 12.5 μm, 13 μm, 13.5 μm, 14 μm, 14.5 μm 또는 15 μm 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 4.0 μm, 4.1 μm, 4.2 μm, 4.3 μm, 4.4 μm, 4.5 μm, 4.6 μm, 4.7 μm, 4.8 μm, 4.9 μm, 또는 5.0 μm 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 직경은 약 4.5 μm이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 20 psi 내지 약 150 psi 범위의 압력 하에 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 30 psi 내지 약 120 psi 범위의 압력 하에 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 60 psi 내지 약 90 psi 범위의 압력 하에 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 30 psi 내지 약 40 psi, 약 40 psi 내지 약 50 psi, 약 50 psi 내지 약 60 psi, 약 60 psi 내지 약 70 psi, 약 70 psi 내지 약 80 psi, 약 80 psi 내지 약 90 psi, 약 90 psi 내지 약 100 psi, 약 100 psi 내지 약 110 psi, 또는 약 110 psi 내지 약 120 psi 범위의 압력 하에 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 20 psi, 25 psi, 30 psi, 35 psi, 40 psi, 45 psi, 50 psi, 55 psi, 60 psi, 65 psi, 70 psi, 75 psi, 80 psi, 85 psi, 90 psi, 95 psi, 100 psi, 105 psi, 110 psi, 115 psi, 또는 120 psi 중 어느 하나의 압력 하에 협착부를 통과한다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 150 kPa 내지 약 1000 kPa 범위의 압력 하에 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 207 kPa 내지 약 830 kPa 범위의 압력 하에 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 415 kPa 내지 약 621 kPa 범위의 압력 하에 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 200 kPa 내지 약 250kPa, 약 250 kPa 내지 약 300kPa, 300 kPa 내지 약 350kPa, 약 350 kPa 내지 약 400kPa, 400 kPa 내지 약 450kPa, 약 450 kPa 내지 약 500kPa, 500 kPa 내지 약 550kPa, 약 550 kPa 내지 약 600kPa, 600 kPa 내지 약 650kPa, 약 650 kPa 내지 약 700kPa, 700 kPa 내지 약 750kPa, 약 750 kPa 내지 약 800kPa, 800 kPa 내지 약 850kPa, 약 850 kPa 내지 약 900kPa, 900 kPa 내지 약 950kPa, 약 950 kPa 내지 약 1000kPa 범위의 압력 하에 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 200 kPa, 250 kPa, 300 kPa, 350 kPa, 400 kPa, 415 kPa, 450 kPa, 500 kPa, 550 kPa, 600 kPa, 612 kPa, 650 kPa, 700 kPa, 750 kPa, 800 kPa, 또는 850 kPa 중 어느 하나의 압력 하에 협착부를 통과한다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 0℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 0℃ 내지 약 10℃ 범위의 온도에서 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 2℃ 내지 약 6℃, 약 5℃ 내지 약 10℃, 약 10℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 20℃, 약 20℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 약 30℃ 내지 약 35℃, 또는 약 35℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃ 또는 37℃ 중 어느 하나의 온도에서 협착부를 통과한다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부에 통과시킨 후에, 변형된 PBMC가 37℃로 정규화되도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 변형된 PBMC를 37℃의 온도에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 협착부에 통과시킨 후에, 변형된 PBMC가 25℃로 정규화되도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 변형된 PBMC를 25℃의 온도에서 인큐베이션한다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 투입된 PBMC는 약 0.001 mL/분 내지 약 200 mL/분의 유량 또는 이들 사이의 임의의 속도 또는 속도의 범위로 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 유량은 약 0.001 mL/분 내지 약 175 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 150 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 125 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 100 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 50 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 25 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 7.5 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 5.0 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 2.5 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 1 mL/분, 약 0.001 mL/분 내지 약 0.1 mL/분, 또는 약 0.001 mL/분 내지 약 0.01 mL/분이다. 일부 실시양태에서, 유량은 약 0.001 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 0.01 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 0.1mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 1 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 10 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 50 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 75 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 100 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 150 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 1 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 2.5 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 5 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 7.5 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 10 mL/분 내지 약 200 mL/분, 약 25 mL/분 내지 약 200 mL/분, 또는 약 175 mL/분 내지 약 200 mL/분이다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 10 mL/분 내지 약 200 mL/분의 유량으로 협착부를 통과한다. 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC는 약 100 mL/분의 유량으로 협착부를 통과한다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부는 관련 기술분야에 공지된 임의의 형상; 예를 들어, 3차원 형상 또는 2차원 형상을 가질 수 있다. 협착부의 2차원 형상, 예컨대 단면 형상은 비제한적으로 원형, 타원형, 둥근형, 정사각형, 별형, 삼각형, 다각형, 오각형, 육각형, 칠각형 또는 팔각형일 수 있다. 협착부의 3차원 형상은 비제한적으로 원통형, 원추형 또는 직육면체형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 협착부의 단면 형상은 직사각형이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 단면 형상은 슬릿이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 단면 형상은 약 3 μm 내지 약 10 μm의 폭 및/또는 약 1 μm 내지 약 200 μm의 깊이를 포함하는 슬릿이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 단면 형상은 약 3 μm 내지 약 6 μm의 폭 및/또는 약 20 μm 내지 약 120 μm의 깊이를 포함하는 슬릿이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 단면 형상은 약 4.2 μm 내지 약 6 μm의 폭 및/또는 약 20 μm 내지 약 120 μm의 깊이를 포함하는 슬릿이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 단면 형상은 약 4.2 μm 내지 약 6 μm의 폭 및/또는 약 40 μm 내지 약 100 μm의 깊이를 포함하는 슬릿이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 단면 형상은 약 4.2 μm 내지 약 6 μm의 폭 및/또는 약 20 μm 내지 약 80 μm의 깊이를 포함하는 슬릿이다. 일부 실시양태에서, 협착부의 단면 형상은 약 4.5 μm의 폭 및/또는 약 80 μm의 깊이를 포함하는 슬릿이다. 일부 실시양태에서, 슬릿은 약 10 μm 내지 약 30 μm의 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 슬릿은 약 2 μm 내지 약 50 μm의 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 슬릿은 약 2 μm 내지 약 5 μm, 약 5 μm 내지 약 10 μm, 약 10 μm 내지 약 15 μm, 약 15 μm 내지 약 20 μm, 약 20 μm 내지 약 25 μm, 약 25 μm 내지 약 30 μm, 약 30 μm 내지 약 35 μm, 약 35 μm 내지 약 40 μm, 약 40 μm 내지 약 45 μm, 또는 약 45 μm 내지 약 50 μm 중 어느 하나의 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 슬릿은 약 10 μm의 길이를 포함한다.
협착부의 입구 및 출구는 다양한 각도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 협착부는 동일한 입구 및 출구 각도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 협착부는 상이한 입구 및 출구 각도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 협착부는 상이한 입구 및 출구 각도를 갖는다. 협착부는 PBMC가 통과하는 동안 협착부의 막힘을 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면을 통한 유량은 약 0.001 mL/분 내지 약 100 mL/분 또는 그 사이의 임의의 비율 또는 비율 범위이다. 일부 예에서, 입구 및/또는 출구 부분의 각도는 약 0 내지 약 90도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 입구 및/또는 출구 부분은 90도 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 입구 부분은 입구 각도를 규정하고, 입구 각도는 약 0도 내지 약 90도이다. 일부 실시양태에서, 입구 각도는 약 10도 내지 약 40도, 약 12도 내지 약 45도, 약 15도 내지 약 30도 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 입구 각도는 약 20도 내지 약 22도이다. 일부 실시양태에서, 출구 부분은 출구 각도를 규정하고, 출구 각도는 약 0도 내지 약 90도이다. 일부 실시양태에서, 출구 각도는 약 10도 내지 약 40도, 약 12도 내지 약 45도, 약 15도 내지 약 30도 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 출구 각도는 약 20도 내지 약 22도이다. 일부 실시양태에서, 입구 부분은 입구 각도를 규정하고, 입구 각도는 약 20도 내지 약 22도이고, 출구 부분은 출구 각도를 규정하고, 출구 각도는 약 20도 내지 약 22도이다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 협착부 가장자리는 매끄러우며, 예를 들어 둥글거나 만곡된다. 매끄러운 협착부 가장자리는 돌기부, 융기부 또는 고르지 않은 부분이 없는 연속적이고, 편평하며, 고른 표면을 갖는다. 일부 실시양태에서, 협착부 가장자리는 날카롭다. 날카로운 협착부 가장자리는 뾰족하거나 예각인 얇은 가장자리를 갖는다. 일부 실시양태에서, 협착부 통로는 직선형이다. 직선형 협착부 통로는 곡선, 굽이, 각도 또는 다른 불규칙성을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 협착부 통로는 곡선형이다. 곡선형 협착부 통로는 구부러지거나 직선으로부터 벗어난다. 일부 실시양태에서, 협착부 통로는 다수의 곡선, 예를 들어 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 곡선을 갖는다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액은 다중 협착부를 통과하고, 여기서 다중 협착부는 직렬 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 다중 협착부는 직렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 다중 협착부는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 다중 협착부는 직렬 및/또는 병렬로 배열된다. 일부 실시양태에서, 직렬로 배열된 다중 협착부는 직렬의 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 75, 100, 500, 1,000개 또는 그 초과의 협착부 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 병렬로 배열된 다중 협착부는 직렬의 약 2, 5, 10, 50, 75, 100, 500, 1,000개 또는 그 초과의 협착부 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 세포-변형 협착부를 함유하는 예시적인 마이크로유체 채널이 WO2013059343에 기술되어 있다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 세공을 갖는 예시적인 표면은 WO2017041050에 기재되어 있다.
시스템 및 키트
일부 측면에서, 본 발명은 예컨대 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서 사용하기 위한, 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 협착부, PBMC 현탁액, 항원 또는 아주반트 중 하나 이상을 포함하는 시스템을 제공한다. 시스템은 "마이크로유체 시스템 및 그의 성분"이라는 제목의 상기 섹션에 개시된 것들을 포함한, 본원에 개시된 물질의 조성물 및 방법에 대해 기재된 임의의 실시양태를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포-변형 협착부는 PBMC로의 전달을 위해 사이징된다. 일부 실시양태에서, 전달 파라미터, 예컨대 작동 유량, 세포 및 화합물 농도, 온도, 협착부에서의 세포의 속도, 및 세포 현탁액의 조성 (예를 들어, 오스몰농도, 염 농도, 혈청 함량, 세포 농도, pH 등)은 면역 반응을 조정하기 위한 화합물의 최대 반응을 위해 최적화된다.
또한, 개체에서 면역 반응을 조정하는데 사용하기 위한 키트 또는 제조 물품이 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 변형된 PBMC 중 임의의 것을 포함한, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 변형된 PBMC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 개체에서 면역 반응을 조정하는데 사용하기 위한 변형된 PBMC를 생성시키는데 사용하기 위한 협착부, PBMC 현탁액, 항원 또는 아주반트 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 적합한 패키징 내에 본원에 기재된 성분 (예를 들어 세공을 함유하는 마이크로유체 채널 또는 표면, 세포 현탁액 및/또는 화합물)을 포함한다. 적합한 포장 물질은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 바이알 (예컨대 밀봉 바이알), 용기, 앰풀, 병, 단지, 가요성 포장 (예를 들어, 밀봉 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이들 제조 물품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 방법의 성분을 포함하는 키트를 제공하고, 개체에서 면역 반응을 조정하는 상기 방법을 수행하는 것에 대한 지침서 및/또는 항원 및/또는 아주반트를 항원 PBMC 내로 도입하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 키트는 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하는 것에 대한 지침서; 예를 들어 개체에서 면역 반응을 조정하는 것에 대한 지침서 또는 항원 및/또는 아주반트를 함유하도록 PBMC를 변형시키는 것에 대한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
HPV 및 HPV-연관 질환.
본원에 기재된 시스템 및 키트 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 1종 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다.
다른 실시양태
다른 실시양태는 하기 단서 중 하나 이상을 갖는 본원에 기재된 임의의 실시양태를 제공한다:
- 항원은 HPV 항원이 아니다
- 항원은 HPV E6 항원이 아니다
- 항원은 HPV E7 항원이 아니다
- 항원은 HPV E6 항원이 아니고 HPV E7 항원이 아니다
- 아주반트는 항원과 함께 PBMC 내로 도입되지 않는다
- 아주반트는 항원을 포함하는 PBMC의 시토졸에 존재하지 않는다
- 아주반트가 개체에게 투여되지 않는다
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 HPV 항원을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 HPV 항원을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 HPV E6 항원을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 HPV E6 항원을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 HPV E7 항원을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 HPV E7 항원을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 HPV E6 항원을 포함하지 않고 HPV E7 항원을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 PBMC는 HPV E6 항원을 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, HPV E7 항원을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 발현하지 않는다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항원은 1종 이상의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 코딩되고, 하나 이상의 핵산, 예컨대 비제한적으로 DNA, cDNA, mRNA 및 플라스미드의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 코딩되고, 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 항원을 코딩하는 mRNA를 포함한다.
본원에 기재된 방법, 조성물 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 개체에서 면역관용을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 개체에서 면역 반응을 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 면역관용성 인자를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 면역관용성 인자와 조합되어 투여되지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 PBMC는 관용원성 인자의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되지 않는다.
본 출원의 일부 실시양태에서, 용어 "조건화된" 및 "성숙된"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
예시적 실시양태
본 발명은 하기 열거된 실시양태를 제공한다.
1. 항원을 포함하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성인 복수의 변형된 PBMC.
2. 항원을 포함하는 복수의 변형된 PMBC이며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이고, 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원 또는 바이러스-질환 연관 항원인 복수의 변형된 PMBC.
3. 항원을 포함하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
4. 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PMBC이며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이고, 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원 또는 바이러스-질환 연관 항원인 조건화된 복수의 변형된 PMBC.
5. 항원 및 아주반트를 포함하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
6. 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
7. 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
8. PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC.
9. 항원을 PBMC에 도입하기 전에, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC.
10. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
11. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 것인 단계.
12. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
13. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 코딩하는 핵산을 갖는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
14. 실시양태 12 또는 13에 있어서, 방법이 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함하는 것인, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
15. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고;
이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
16. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트를 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원을 코딩하는 핵산 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산 및 아주반트와 함께 인큐베이션하는 단계;
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
17. 실시양태 15 또는 16에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM인 복수의 변형된 PBMC.
18. 실시양태 15-17 중 어느 하나에 있어서, (a) 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM인 복수의 변형된 PBMC.
19. 실시양태 15-18 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 1 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 1 μM인 복수의 변형된 PBMC.
20. 실시양태 15-19 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비가 약 10000:1 내지 약 1:10000인 복수의 변형된 PBMC.
21. 실시양태 15-20 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비가 약 200:1인 복수의 변형된 PBMC.
22. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
23. 실시양태 22에 있어서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM인 복수의 변형된 PBMC.
24. 실시양태 22 또는 23에 있어서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM인 복수의 변형된 PBMC.
25. 실시양태 22-24 중 어느 하나에 있어서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 1 μM인 복수의 변형된 PBMC.
26. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
27. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 항원을 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
28. 실시양태 10-14 및 22-27 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM인 복수의 변형된 PBMC.
29. 실시양태 10-14 및 22-28 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM인 복수의 변형된 PBMC.
30. 실시양태 10-14 및 22-29 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 1 μM인 복수의 변형된 PBMC.
31. 실시양태 15-21 및 26-30 중 어느 하나에 있어서, 방법이
항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계
를 추가로 포함하는 것인, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
32. 실시양태 31에 있어서, 방법이 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함하는 것인, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
33. 실시양태 8-31 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM인 복수의 변형된 PBMC.
34. 실시양태 8-33 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM인 복수의 변형된 PBMC.
35. 실시양태 8-34 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 1 μM인 복수의 변형된 PBMC.
36. 실시양태 8-35 중 어느 하나에 있어서, 방법이 투입 PBMC 및/또는 변형된 PBMC를, 추가의 인큐베이션 단계 없이 제조된 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
37. 실시양태 10-36 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인 복수의 변형된 PBMC.
38. 실시양태 10-37 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 10% 내지 약 70%인 복수의 변형된 PBMC.
39. 실시양태 10-38 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 20% 내지 약 60%인 복수의 변형된 PBMC.
40. 실시양태 10-39 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 40% 내지 약 60%인 복수의 변형된 PBMC.
41. 실시양태 10-40 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 30% 내지 약 45%인 복수의 변형된 PBMC.
42. 실시양태 10-36 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인 복수의 변형된 PBMC.
43. 실시양태 10-36 및 42 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 70%인 복수의 변형된 PBMC.
44. 실시양태 10-36, 42 및 43 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 20% 내지 약 60%인 복수의 변형된 PBMC.
45. 실시양태 10-36 및 42-44 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 30% 내지 약 45%인 복수의 변형된 PBMC.
46. 실시양태 10-36 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 50% 내지 약 99%인 복수의 변형된 PBMC.
47. 실시양태 10-36 및 46 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 50% 내지 약 90%인 복수의 변형된 PBMC.
48. 실시양태 10-36, 46 및 47 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 50% 내지 약 80%인 복수의 변형된 PBMC.
49. 실시양태 10-36 및 46-48 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 50% 내지 약 70%인 복수의 변형된 PBMC.
50. 실시양태 10-36 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 60% 내지 약 90%인 복수의 변형된 PBMC.
51. 실시양태 10-36 및 50 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 60% 내지 약 80%인 복수의 변형된 PBMC.
52. 실시양태 10-36, 50 및 51 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 60% 내지 약 70%인 복수의 변형된 PBMC.
53. 실시양태 10-52 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인 복수의 변형된 PBMC.
54. 실시양태 10-53 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 70%인 복수의 변형된 PBMC.
55. 실시양태 10-54 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 20% 내지 약 60%인 복수의 변형된 PBMC.
56. 실시양태 10-55 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 20% 내지 약 30%인 복수의 변형된 PBMC.
57. 실시양태 10-56 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 20% 내지 약 25%인 복수의 변형된 PBMC.
58. 실시양태 10-55 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 30% 내지 약 70%인 복수의 변형된 PBMC.
59. 실시양태 10-55 및 58 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 30% 내지 약 60%인 복수의 변형된 PBMC.
60. 실시양태 10-55, 58 및 59 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 30% 내지 약 45%인 복수의 변형된 PBMC.
61. 실시양태 42-60 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단이 T 세포인 복수의 변형된 PBMC.
62. 실시양태 53-61 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단이 단핵구인 복수의 변형된 PBMC.
63. 실시양태 10-62 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 10 μm인 복수의 변형된 PBMC.
64. 실시양태 10-63 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4 μm 내지 약 10 μm인 복수의 변형된 PBMC.
65. 실시양태 10-63 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 6 μm인 복수의 변형된 PBMC.
66. 실시양태 10-65 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인 복수의 변형된 PBMC.
67. 실시양태 10-66 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4.5 μm인 복수의 변형된 PBMC.
68. 실시양태 10-67 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 30 psi 내지 약 120 psi 또는 약 60 psi 내지 약 90 psi 범위의 압력 하에 협착부를 통과하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
69. 실시양태 10-67 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 207 kPa 내지 약 830 kPa 또는 약 415 kPa 내지 약 621 kPa 범위의 압력 하에 협착부를 통과하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
70. 실시양태 10-67 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 0.001 mL/cm2/sec 내지 약 200 L/cm2/sec의 유량으로 협착부를 통과하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
71. 실시양태 10-67 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 0.1 mL/cm2/sec 내지 약 150 L/cm2/sec의 유량으로 협착부를 통과하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
72. 실시양태 10-67 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 100 mL/cm2/sec의 유량으로 협착부를 통과하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
73. 실시양태 10-72 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 0℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 협착부를 통과하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
74. 실시양태 10-73 중 어느 하나에 있어서, 협착부에 통과시킨 후에, 복수의 변형된 PBMC가, 변형된 PBMC가 37℃로 정규화되도록 하기에 충분한 시간 동안 37℃의 온도에서 인큐베이션되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
75. 실시양태 10-74 중 어느 하나에 있어서, 협착부에 통과시킨 후에, 복수의 변형된 PBMC가, 변형된 PBMC가 25℃로 정규화되도록 하기에 충분한 시간 동안 25℃의 온도에서 인큐베이션되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
76. 실시양태 10-75 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 단면 형상이 원형, 타원형, 원형, 정사각형, 직사각형, 별-형상, 삼각형, 다각형, 오각형, 육각형, 칠각형 및 팔각형으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 복수의 변형된 PBMC.
77. 실시양태 10-76 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 단면 형상이 슬릿인 복수의 변형된 PBMC.
78. 실시양태 77에 있어서, 슬릿이 약 3 μm - 6 μm의 폭 및/또는 약 20 μm - 120 μm의 깊이를 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
79. 실시양태 78에 있어서, 슬릿이 약 4.2 μm - 6 μm의 폭 및/또는 약 20 μm - 120 μm의 깊이를 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
80. 실시양태 77-79 중 어느 하나에 있어서, 슬릿이 약 4.5 μm의 폭 및/또는 약 80 μm의 깊이를 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
81. 실시양태 10-80 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액이 다중 협착부를 통과하고, 여기서 다중 협착부는 직렬 및/또는 병렬로 배열되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
82. 실시양태 10-80 중 어느 하나에 있어서, 협착부가 입구 부분 및 출구 부분을 포함하고, 여기서:
(a) 입구 부분은 입구 각도를 한정하고, 입구 각도는 약 0도 내지 약 90도 또는 약 20 내지 22도이고/거나;
(b) 출구 부분은 출구 각도를 형성하고, 출구 각도는 약 0도 내지 약 90도 또는 약 20 내지 22도이고,
바람직하게는 (a) 및 (b)에 대해 약 20-22도인
인 복수의 변형된 PBMC.
83. 실시양태 10-82 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액이 다중 협착부를 통과하고, 여기서 다중 협착부는 직렬 및/또는 병렬로 배열되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
84. 실시양태 12-14, 22-25, 31-83 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC가, 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
85. 실시양태 12-14, 22-25, 31-84 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC가, 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
86. 실시양태 12-14, 22-25, 31-85 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC가, 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
87. 실시양태 12-14, 22-25, 31-86 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC가, 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 4시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
88. 실시양태 1-87 중 어느 하나에 있어서, 항원, 항원을 코딩하는 핵산 및/또는 아주반트가 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 시토졸 및/또는 소포에 존재하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
89. 실시양태 1-88 중 어느 하나에 있어서, 항원 및/또는 항원을 코딩하는 핵산이 시토졸에 존재하고, 아주반트가 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 소포에 존재하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
90. 실시양태 88 또는 89에 있어서, 소포가 엔도솜인 복수의 변형된 PBMC.
91. 실시양태 1-90 중 어느 하나에 있어서, 항원, 항원을 코딩하는 핵산 및/또는 아주반트가 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 다중 구획에 존재하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
92. 실시양태 1-91 중 어느 하나에 있어서, 항원, 항원을 코딩하는 핵산 및/또는 아주반트가 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%에 존재하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
93. 실시양태 1-92 중 어느 하나에 있어서, 항원, 항원을 코딩하는 핵산 및/또는 아주반트가 복수의 PBMC 내의 각각의 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 적어도 약 70%에 존재하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
94. 실시양태 1-93 중 어느 하나에 있어서, 항원이 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 표면에 결합되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
95. 실시양태 5-94 중 어느 하나에 있어서, 아주반트가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효능제, TLR4 효능제 또는 TLR 9 효능제인 복수의 변형된 PBMC.
96. 실시양태 95에 있어서, 아주반트가 CpG ODN인 복수의 변형된 PBMC.
97. 실시양태 96에 있어서, CpG ODN이 클래스 A CpG ODN, 클래스 B CpG ODN 또는 클래스 C CpG ODN인 복수의 변형된 PBMC.
98. 실시양태 1-97 중 어느 하나에 있어서, 항원이 질환-연관 항원인 복수의 변형된 PBMC.
99. 실시양태 98에 있어서, 항원이 이환 세포로부터 단리된 펩티드 또는 mRNA로부터 유래된 것인 복수의 변형된 PBMC.
100. 실시양태 1-99 중 어느 하나에 있어서, 항원이 비-자기 항원인 복수의 변형된 PBMC.
101. 실시양태 1-100 중 어느 하나에 있어서, 항원이 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 복수의 변형된 PBMC.
102. 실시양태 1-5 및 8-101 중 어느 하나에 있어서, 항원이 종양 용해물로부터 유래된 것인 복수의 변형된 PBMC.
103. 실시양태 1-101 중 어느 하나에 있어서, 항원이 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원인 복수의 변형된 PBMC.
104. 실시양태 103에 있어서, HPV가 HPV-16 또는 HPV-18인 복수의 변형된 PBMC.
105. 실시양태 103 또는 104에 있어서, 항원이 HPV E6 및/또는 E7로부터 유래된 펩티드를 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
106. 실시양태 103 또는 104에 있어서, 항원이 HPV E6 및/또는 E7로부터 유래된 HLA-A2-제한된 펩티드를 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
107. 실시양태 106에 있어서, HLA-A2-제한된 펩티드가 서열식별번호: 1-4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
108. 실시양태 107에 있어서, 항원이 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
109. 실시양태 1-108 중 어느 하나에 있어서, 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
110. 실시양태 109에 있어서, 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 개체에게 투여한 후에, 복수의 면역원성 에피토프 중 어느 것도 개체에서 임의의 다른 면역원성 에피토프에 대한 면역 반응을 감소시키지 않는 것인 복수의 변형된 PBMC.
111. 실시양태 110에 있어서, 항원이 폴리펩티드이고, 면역원성 에피토프가 면역원성 펩티드 에피토프인 복수의 변형된 PBMC.
112. 실시양태 111에 있어서, 면역원성 펩티드 에피토프가 N-말단 플랭킹 폴리펩티드 및/또는 C-말단 플랭킹 폴리펩티드에 융합된 것인 복수의 변형된 PBMC.
113. 실시양태 111에 있어서, 항원이 면역원성 펩티드 에피토프 및 1개 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드인 복수의 변형된 PBMC.
114. 실시양태 111에 있어서, 항원이 이종 펩티드 서열에 의해 N-말단 및/또는 C-말단 상에 플랭킹된 면역원성 펩티드 에피토프를 포함하는 폴리펩티드인 복수의 변형된 PBMC.
115. 실시양태 114에 있어서, 플랭킹 이종 펩티드 서열이 질환-연관 면역원성 펩티드로부터 유래된 것인 복수의 변형된 PBMC.
116. 실시양태 112에 있어서, N-말단 플랭킹 폴리펩티드가 서열식별번호: 5-10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/거나 C-말단 플랭킹 폴리펩티드가 서열식별번호: 11-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
117. 실시양태 1-116 중 어느 하나에 있어서, 항원이 MHC 클래스 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 클래스 II-제한된 펩티드로 가공될 수 있는 것인 복수의 변형된 PBMC.
118. 실시양태 5, 15-21 및 26-117 중 어느 하나에 있어서, 약 1 nM 내지 약 1 mM의 농도의 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
119. 실시양태 1-118 중 어느 하나에 있어서, 약 1 nM 내지 약 1 mM의 농도의 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
120. 실시양태 1-119 중 어느 하나에 있어서, 항원 대 아주반트의 비가 약 10000:1 내지 약 1:10000인 복수의 변형된 PBMC.
121. 실시양태 1-120 중 어느 하나에 있어서, 항원 대 아주반트의 비가 약 200:1인 복수의 변형된 PBMC.
122. 실시양태 1-118 중 어느 하나에 있어서, a) 항원, b) 항원 및 적어도 1종의 다른 항원, c) 항원 및 아주반트, d) 항원을 코딩하는 핵산, e) 항원을 코딩하는 핵산 및 1종의 다른 항원을 코딩하는 적어도 1종의 다른 핵산, 및/또는 f) 항원을 코딩하는 핵산 및 아주반트를 포함하는 복합체를 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
123. 실시양태 3-5, 7-9, 12-14, 22-25 및 31-122 중 어느 하나에 있어서, 작용제를 포함하지 않는 상응하는 복수의 변형된 PBMC와 비교하여 복수의 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제를 추가로 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
124. 실시양태 3-5, 7-9, 12-14, 22-25 및 31-123 중 어느 하나에 있어서, 작용제를 포함하지 않는 상응하는 복수의 변형된 PBMC와 비교하여 동결-해동 사이클 시에 복수의 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제를 추가로 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
125. 실시양태 3-5, 7-9, 12-14, 22-25 및 31-124 중 어느 하나에 있어서, 적어도 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%의 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 최대 1, 2, 3, 4, 5회의 동결-해동 사이클 후에 생존가능한 것인 복수의 변형된 PBMC.
126. 실시양태 123-125 중 어느 하나에 있어서, 작용제가 세포내이입을 증진시키는 화합물, 안정화제 또는 보조-인자인 복수의 변형된 PBMC.
127. 실시양태 123-126 중 어느 하나에 있어서, 작용제가 알부민인 복수의 변형된 PBMC.
128. 실시양태 127에 있어서, 알부민이 마우스, 소 또는 인간 알부민인 복수의 변형된 PBMC.
129. 실시양태 123-125 중 어느 하나에 있어서, 작용제가 2가 금속 양이온, 글루코스, ATP, 칼륨, 글리세롤, 트레할로스, D-수크로스, PEG1500, L-아르기닌, L-글루타민 또는 EDTA 중 하나 이상인 복수의 변형된 PBMC.
130. 실시양태 123-125 중 어느 하나에 있어서, 작용제가 피루브산나트륨, 아데닌, 레주베솔®, 트레할로스, 덱스트로스, 만노스, 수크로스, 인간 혈청 알부민 (HSA), 플라스마라이트®, DMSO, 크리오스토르® CS2, 크리오스토르® CS5, 크리오스토르® CS10, 크리오스토르® CS15, HEPES, 글리세롤, 글루타티온, 하이포써모솔® 중 하나 이상인 복수의 변형된 PBMC.
131. 실시양태 128에 있어서, 작용제가 마우스 혈청 알부민 (MSA)을 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
132. 실시양태 128에 있어서, 작용제가 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
133. 실시양태 1-132 중 어느 하나에 있어서, 세포가 공동-자극 분자 중 1종 이상의 발현을 증가시키도록 추가로 변형되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
134. 실시양태 133에 있어서, 공동-자극 분자가 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155 또는 CD112인 복수의 변형된 PBMC.
135. 실시양태 133에 있어서, 공동-자극 분자가 신호 2 이펙터인 복수의 변형된 PBMC.
136. 실시양태 133-135 중 어느 하나에 있어서, 세포가 1종 이상의 공동-자극 분자의 증가된 발현을 유발하는 핵산 (예를 들어, mRNA)을 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
137. 실시양태 136에 있어서, 핵산이 공동자극 분자를 코딩하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
138. 실시양태 1-137 중 어느 하나에 있어서, 세포가 1종 이상의 시토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
139. 실시양태 138에 있어서, 시토카인이 IL-12, IL-2, IFN-α 또는 IL-21인 복수의 변형된 PBMC.
140. 실시양태 133에 있어서, 공동-자극 분자가 신호 3 이펙터인 복수의 변형된 PBMC.
141. 실시양태 138-140 중 어느 하나에 있어서, 세포가 1종 이상의 시토카인의 증가된 발현을 유발하는 핵산 (예를 들어, mRNA)을 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
142. 실시양태 141에 있어서, 핵산이 시토카인을 코딩하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
143. 실시양태 1-142 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC 내의 적어도 1종의 세포가 HLA-A2의 발현에 대해 양성인 복수의 변형된 PBMC.
144. 실시양태 1-142 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 I 발현을 조정하기 위한 추가의 변형을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
145. 실시양태 1-142 중 어느 하나에 있어서, HLA-A02 MHC I를 조정하기 위한 추가의 변형을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
146. 실시양태 1-145 중 어느 하나에 있어서, MHC 클래스 II 발현을 조정하기 위한 추가의 변형을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
147. 실시양태 145에 있어서, 동종 환경에서 변형된 PBMC의 투여에 반응하여 개체에 탑재된 선천성 면역 반응이, 동종 환경에서 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC의 투여에 반응하여 개체에 탑재된 선천성 면역 반응과 비교하여 감소되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
148. 실시양태 1-147 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기가, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기와 비교하여 증가되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
149. 실시양태 1-147 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기가, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기와 본질적으로 동일한 것인 복수의 변형된 PBMC.
150. 실시양태 1-147 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기가, 상응하는 비변형된 PBMC의 순환 반감기와 본질적으로 동일한 것인 복수의 변형된 PBMC.
151. 실시양태 1-150 중 어느 하나에 있어서, T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중 1종 이상을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
152. 실시양태 1-151 중 어느 하나에 있어서, T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중 2종 이상을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
153. 실시양태 1-152 중 어느 하나에 있어서, CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD14+ 단핵구, CD56+ NK 세포 중 1종 이상을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
154. 실시양태 10-153 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 여기서 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비가 전혈 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 본질적으로 동일한 것인 복수의 변형된 PBMC.
155. 실시양태 10-153 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비가 전혈로부터의 백혈구분리반출술 생성물 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 본질적으로 동일한 것인 복수의 변형된 PBMC.
156. 실시양태 10-153 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 10% 이하만큼 상이한 것인 복수의 변형된 PBMC.
157. 실시양태 10-153 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈로부터의 백혈구분리반출술 생성물 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 10% 이하만큼 상이한 것인 복수의 변형된 PBMC.
158. 실시양태 10-157 중 어느 하나에 있어서,
(a) 투입 PBMC의 적어도 약 25%가 T 세포이거나;
(b) 투입 PBMC의 적어도 약 2.5%가 B 세포이거나;
(c) 투입 PBMC의 적어도 약 3.5%가 NK 세포이거나; 또는
(d) 투입 PBMC의 적어도 약 4%가 단핵구인
복수의 변형된 PBMC.
159. 실시양태 1-158 중 어느 하나에 있어서,
(a) 변형된 PBMC의 적어도 약 20%가 T 세포이거나;
(b) 변형된 PBMC의 적어도 약 2%가 B 세포이거나;
(c) 변형된 PBMC의 적어도 약 3%가 NK 세포이거나; 또는
(d) 변형된 PBMC의 적어도 약 3%가 단핵구인
복수의 변형된 PBMC.
160. 실시양태 1-159 중 어느 하나에 있어서,
(a) 투입 PBMC의 약 70% 이하가 T 세포이거나;
(b) 투입 PBMC의 약 14% 이하가 B 세포이거나;
(c) 투입 PBMC의 약 35% 이하가 NK 세포이거나; 또는
(d) 투입 PBMC의 약 25% 이하가 단핵구인
복수의 변형된 PBMC.
161. 실시양태 1-160 중 어느 하나에 있어서,
(a) 변형된 PBMC의 약 80% 이하가 T 세포이거나;
(b) 변형된 PBMC의 약 16% 이하가 B 세포이거나;
(c) 변형된 PBMC의 약 40% 이하가 NK 세포이거나; 또는
(d) 변형된 PBMC의 약 30% 이하가 단핵구인
복수의 변형된 PBMC.
162. 실시양태 1-161 중 어느 하나에 있어서,
(a) 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%가 T 세포이거나;
(b) 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%가 B 세포이거나;
(c) 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%가 NK 세포이거나; 또는
(d) 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%가 단핵구인
복수의 변형된 PBMC.
163. 실시양태 1-162 중 어느 하나에 있어서,
(a) 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 T 세포의 백분율이 수 기준으로 약 10% 이하만큼 상이하고/거나;
(b) 복수의 변형된 PBMC 내의 B 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 B 세포의 백분율이 수 기준으로 약 10% 이하만큼 상이하고/거나;
(c) 복수의 변형된 PBMC 내의 NK 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 NK 세포의 백분율이 수 기준으로 약 10% 이하만큼 상이하고/거나;
(d) 복수의 변형된 PBMC 내의 단핵구의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 단핵구의 백분율이 수 기준으로 약 10% 이하만큼 상이한 것인
복수의 변형된 PBMC.
164. 실시양태 3-9 및 12-163 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 공동-자극 분자가 복수의 비변형된 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 공동-자극 분자는 CD80 및/또는 CD86인 복수의 변형된 PBMC.
165. 실시양태 164에 있어서, CD80 및/또는 CD86이 복수의 조건화되지 않은 PBMC의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 초과 또는 10배 초과만큼 상향조절되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
166. 실시양태 164 또는 165에 있어서, 공동-자극 분자가 CD86인 복수의 변형된 PBMC.
167. 실시양태 3-9 및 12-166 중 어느 하나에 있어서, 복수의 조건화되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 증가된 발현을 갖는 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
168. 실시양태 167에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 발현이 복수의 조건화되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과로 증가되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
169. 실시양태 1-168 중 어느 하나의 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물.
170. 의약으로서 사용하기 위한, 실시양태 1-169 중 어느 하나의 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물.
171. 수술, 요법 또는 진단에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 실시양태 1-169 중 어느 하나의 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물.
172. 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관 질환의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1-169 중 어느 하나의 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물.
173. 실시양태 172에 있어서, 암이 두경부암, 자궁경부암, 외음부암, 질암, 음경암, 항문암, 항문주위암, 항문생식기암, 구강암 또는 타액선암인 조성물.
174. 실시양태 171-173 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 면역 체크포인트 억제제의 투여 전에, 그와 공동으로 또는 투여 후에 투여되는 것인 조성물.
175. 실시양태 174에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 또는 BTLA 중 어느 하나에 대해 표적화된 것인 조성물.
176. 실시양태 175에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1에 대해 표적화된 것인 조성물.
177. 실시양태 175에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-L1에 대해 표적화된 것인 조성물.
178. 실시양태 171-177 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 치료제의 투여 전에, 그와 공동으로 또는 투여 후에 투여되는 것인 조성물.
179. 실시양태 178에 있어서, 치료제가 화학요법제인 조성물.
180. 실시양태 172에 있어서, 감염성 질환이 HIV, HPV, EBV, MCV, HBV 또는 HCV와 연관된 것인 조성물.
181. 실시양태 1-168 중 어느 하나의 변형된 PBMC 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
182. 실시양태 171-181 중 어느 하나에 있어서, 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 조성물.
183. 의약으로서 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
184. 의약으로서 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
185. 수술, 요법 또는 진단에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
186. 수술, 요법 또는 진단에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
187. 의약으로서 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
188. 의약으로서 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
189. 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
190. 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
191. 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스 연관 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
192. 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스 연관 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
193. 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
194. 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포 변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
195. 개체에서 HPV-연관 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
196. 개체에서 HPV-연관 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
197. 개체에서 HPV-연관 질환의 치료에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
198. 개체에서 HPV-연관 질환의 치료에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 조성물:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
199. 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 용도이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 용도:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
200. HPV-연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 용도이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 용도:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
201. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 4 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
202. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 4 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며,
이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
203. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 4 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
204. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 4 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며,
이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
205. 실시양태 201-204 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
206. 실시양태 201-205 중 어느 하나에 있어서, HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
207. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
208. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며,
이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
209. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
210. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며,
이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
211. 실시양태 207-210 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4 μm 내지 약 10 μm인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
212. 실시양태 207-211 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 6 μm인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
213. 실시양태 207-212 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
214. 실시양태 207-213 중 어느 하나에 있어서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC가 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
215. 개체에게 실시양태 1-168 중 어느 하나의 복수의 변형된 PBMC, 실시양태 169-180의 조성물, 또는 실시양태 181의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
216. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 개체에게 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및
b) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계.
217. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 단계;
b) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 투여하는 단계.
218. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 단계;
b) 항원을 복수의 PBMC에 도입하는 단계; 및
c) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 투여하는 단계.
219. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
220. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
221. 실시양태 220에 있어서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와의 인큐베이션 전에 세포 현탁액으로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
222. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
223. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 개체에게 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
224. 실시양태 223에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM인 방법.
225. 실시양태 222 내지 224 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM인 방법.
226. 실시양태 222-225 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 1 μM이고/거나 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 1 μM인 방법.
227. 실시양태 222-226 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비가 약 10000:1 내지 약 1:10000인 방법.
228. 실시양태 222-227 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원 대 아주반트의 비가 약 200:1인 방법.
229. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
230. 실시양태 229에 있어서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM인 방법.
231. 실시양태 229 또는 230에 있어서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM인 방법.
232. 실시양태 229 내지 231 중 어느 하나에 있어서, 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 1 μM인 방법.
233. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
234. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 항원을 포함하는 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
235. 실시양태 234에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM인 방법.
236. 실시양태 234 또는 235에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM인 방법.
237. 실시양태 234 내지 236 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 아주반트의 농도가 약 1 μM인 방법.
238. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 것인 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및
d) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계.
239. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 항원을 포함하는 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및
d) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계.
240. 실시양태 219-233, 238 및 239 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM인 방법.
241. 실시양태 219-233 및 238-240 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM인 방법.
242. 실시양태 219-233 및 238-241 중 어느 하나에 있어서, 교란된 투입 PBMC와 함께 인큐베이션되는 항원의 농도가 약 1 μM인 방법.
243. 실시양태 222-228 및 233-242 중 어느 하나에 있어서,
항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
244. 실시양태 243에 있어서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 제2 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM인 방법.
245. 실시양태 243 또는 244에 있어서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 제2 아주반트의 농도가 약 0.1 μM 내지 약 10 μM인 방법.
246. 실시양태 243 내지 245 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC와 함께 인큐베이션되는 제2 아주반트의 농도가 약 1 μM인 복수의 변형된 PBMC.
247. 개체에게 항원과 회합된 복수의 PBMC를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이며, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 방법:
a) 항원이 투입 PBMC의 세포 표면과 회합되도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원과 회합된 복수의 PBMC를 생성하는 단계; 및
b) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
248. 실시양태 215-247 중 어느 하나에 있어서, 개체에게 아주반트를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
249. 실시양태 248에 있어서, 아주반트가 개체에게 복수의 변형된 PBMC의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
250. 실시양태 215-245 및 247-249 중 어느 하나에 따라 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법에 사용하기 위한, 항원을 포함하는 복수의 PBMC.
251. PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것을 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 방법.
252. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
253. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
254. 실시양태 252에 있어서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와의 인큐베이션 전에 세포 현탁액으로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
255. 실시양태 253에 있어서, 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와의 인큐베이션 전에 세포 현탁액으로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
256. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
257. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
258. 하기 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
259. 하기 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원을 코딩하는 핵산 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
260. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
261. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
262. 하기 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
263. 하기 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
264. 하기 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 항원을 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및 b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성시키는 단계.
265. 실시양태 219-245, 247-248 및 251-264 중 어느 하나에 있어서, 투입 PBMC 및/또는 변형된 PBMC를, 추가의 인큐베이션 단계 없이 제조된 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
266. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-265 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인 방법.
267. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-265 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 10% 내지 약 70%인 방법.
268. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-267 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 20% 내지 약 60%인 방법.
269. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-268 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 30% 내지 약 45%인 방법.
270. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-269 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인 방법.
271. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-270 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 70%인 방법.
272. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-271 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 20% 내지 약 60%인 방법.
273. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-272 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 30% 내지 약 45%인 방법.
274. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-270 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 50% 내지 약 99%인 방법.
275. 실시양태 219-245, 247-249, 251-270 및 274 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 50% 내지 약 90%인 방법.
276. 실시양태 219-245, 247-249, 251-270 및 274-275 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 50% 내지 약 80%인 방법.
277. 실시양태 219-245, 247-249, 251-270 및 274-276 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 50% 내지 약 70%인 방법.
278. 실시양태 219-245, 247-249, 및 251-270 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 60% 내지 약 90%인 방법.
279. 실시양태 219-245, 247-249, 251-270 및 278 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 60% 내지 약 80%인 방법.
280. 실시양태 219-245, 247-249, 251-270 및 278-279 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 60% 내지 약 70%인 방법.
281. 실시양태 219-245, 247-249, 및 251-280 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인 방법.
282. 실시양태 219-245, 247-249, 및 251-281 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 70%인 방법.
283. 실시양태 219-245, 247-249, 및 251-282 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 20% 내지 약 60%인 방법.
284. 실시양태 219-245, 247-249, 및 251-283 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 20% 내지 약 30%인 방법.
285. 실시양태 219-245, 247-249, 및 251-284 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 20% 내지 약 25%인 방법.
286. 실시양태 219-245, 247-249, 및 251-283 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 30% 내지 약 45%인 방법.
287. 실시양태 270-286 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단이 T 세포인 방법.
288. 실시양태 281-286 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단이 단핵구인 방법.
289. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-275 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 10 μm인 방법.
290. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-289 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 6 μm인 방법.
291. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-289 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4 μm 내지 약 10 μm인 방법.
292. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-291 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인 방법.
293. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-292 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4.5 μm인 방법.
294. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-293 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 30 psi 내지 약 90 psi 범위의 압력 하에 협착부를 통과하는 것인 방법.
295. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-293 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 207 kPa 내지 약 830 kPa 또는 약 415 kPa 내지 약 621 kPa 범위의 압력 하에 협착부를 통과하는 것인 방법.
296. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-295 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 0.001 mL/cm2/sec 내지 약 200 L/cm2/sec의 유량으로 협착부를 통과하는 것인 방법.
297. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-295 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 0.1 mL/cm2/sec 내지 약 150 L/cm2/sec의 유량으로 협착부를 통과하는 것인 방법.
298. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-297 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 100 L/cm2/sec의 유량으로 협착부를 통과하는 것인 방법.
299. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-298 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 약 0℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 협착부를 통과하는 것인 방법.
300. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-299 중 어느 하나에 있어서, 협착부에 통과시킨 후에, 복수의 변형된 PBMC를, 변형된 PBMC가 약 37℃로 정규화되도록 하기에 충분한 시간 동안 약 37℃의 온도에서 인큐베이션하는 것인 방법.
301. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-300 중 어느 하나에 있어서, 협착부에 통과시킨 후에, 복수의 변형된 PBMC를, 변형된 PBMC가 약 25℃로 정규화되도록 하기에 충분한 시간 동안 약 25℃의 온도에서 인큐베이션하는 것인 방법.
302. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-301 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 단면 형상이 원형, 타원형, 원형, 정사각형, 직사각형, 별-형상, 삼각형, 다각형, 오각형, 육각형, 칠각형, 및 팔각형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
303. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-302 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 단면 형상이 슬릿인 방법.
304. 실시양태 303에 있어서, 슬릿이 약 3 μm - 6 μm의 폭 및/또는 약 20 μm - 120 μm의 깊이를 포함하는 것인 방법.
305. 실시양태 303에 있어서, 슬릿이 약 4.2 μm - 6 μm의 폭 및/또는 약 20 - 120 μm의 깊이를 포함하는 것인 방법.
306. 실시양태 303-305 중 어느 하나에 있어서, 슬릿이 4.5 μm의 폭 및/또는 80 μm의 깊이를 포함하는 것인 방법.
307. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-306 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액이 다중 협착부를 통과하고, 여기서 다중 협착부는 직렬 및/또는 병렬로 배열된 것인 방법.
308. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-307 중 어느 하나에 있어서, 협착부가 입구 부분 및 출구 부분을 포함하고, 여기서:
(a) 입구 부분은 입구 각도를 한정하고, 입구 각도는 약 0도 내지 약 90도 또는 약 20 내지 22도이고/거나;
(b) 출구 부분은 출구 각도를 형성하고, 출구 각도는 약 0도 내지 약 90도 또는 약 20 내지 22도이고,
바람직하게는 (a) 및 (b)에 대해 약 20-22도인 방법.
309. 실시양태 219-245, 247-249 및 251-308 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액이 다중 협착부를 통과하고, 여기서 다중 협착부는 직렬 및/또는 병렬로 배열되는 것인 방법.
310. 실시양태 219-221, 229-232, 243-245, 247-249, 251 및 265-309 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 약 1 내지 약 24시간 동안 인큐베이션하고, 이에 의해 변형된 PBMC를 조건화하는 것인 방법.
311. 실시양태 219-221, 229-232, 243-245, 251 및 265-310 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 약 2 내지 약 10시간 동안 인큐베이션하고, 이에 의해 변형된 PBMC를 조건화하는 것인 방법.
312. 실시양태 219-221, 229-232, 243-245, 251 및 265-311 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 약 3 내지 약 6시간 동안 인큐베이션하고, 이에 의해 변형된 PBMC를 조건화하는 것인 방법.
313. 실시양태 219-221, 229-232, 243-245, 251 및 265-312 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 약 4시간 동안 인큐베이션하고, 이에 의해 변형된 PBMC를 조건화하는 것인 방법.
314. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-313 중 어느 하나에 있어서, 항원 및/또는 아주반트가 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 시토졸 및/또는 소포에 존재하는 것인 방법.
315. 실시양태 314에 있어서, 소포가 엔도솜인 방법.
316. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-315 중 어느 하나에 있어서, 항원 및/또는 아주반트가 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 다중 구획에 존재하는 것인 방법.
317. 실시양태 222-228, 233-237, 247-249, 및 251-316 중 어느 하나에 있어서, 항원이 시토졸에 존재하고, 아주반트가 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 소포에 존재하는 것인 방법.
318. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-317 중 어느 하나에 있어서, 항원이 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 표면에 결합되는 것인 방법.
319. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-318 중 어느 하나에 있어서, 아주반트가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효능제, TLR4 효능제 또는 TLR 9 효능제인 방법.
320. 실시양태 319에 있어서, 아주반트가 CpG ODN인 방법.
321. 실시양태 320에 있어서, CpG ODN이 클래스 A CpG ODN, 클래스 B CpG ODN 또는 클래스 C CpG ODN인 방법.
322. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-315 중 어느 하나에 있어서, 항원이 질환-연관 항원인 방법.
323. 실시양태 322에 있어서, 항원이 이환 세포로부터 단리된 펩티드 또는 mRNA로부터 유래된 것인 방법.
324. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-323 중 어느 하나에 있어서, 항원이 비-자기 항원인 방법.
325. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-324 중 어느 하나에 있어서, 항원이 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 진균 항원인 방법.
326. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-325 중 어느 하나에 있어서, 항원이 종양 용해물로부터 유래된 것인 방법.
327. 실시양태 325에 있어서, 항원이 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원인 방법.
328. 실시양태 327에 있어서, HPV가 HPV-16 또는 HPV-18인 방법.
329. 실시양태 327 또는 328에 있어서, 항원이 HPV E6 및/또는 E7로부터 유래된 HLA-A2-제한된 펩티드를 포함하는 것인 방법.
330. 실시양태 329에 있어서, HLA-A2-제한된 펩티드가 서열식별번호: 1-4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
331. 실시양태 330에 있어서, 항원이 서열식별번호: 18-25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
332. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-315 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함하는 것인 방법.
333. 실시양태 332에 있어서, 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 개체에게 투여한 후에, 복수의 면역원성 에피토프 중 어느 것도 개체에서 임의의 다른 면역원성 에피토프에 대한 면역 반응을 감소시키지 않는 것인 방법.
334. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-333 중 어느 하나에 있어서, 항원이 면역원성 펩티드 에피토프를 포함하는 폴리펩티드인 방법.
335. 실시양태 334에 있어서, 면역원성 펩티드 에피토프가 N-말단 플랭킹 폴리펩티드 및/또는 C-말단 플랭킹 폴리펩티드에 융합된 것인 방법.
336. 실시양태 334 또는 335에 있어서, 항원이 면역원성 펩티드 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
337. 실시양태 334에 있어서, 항원이 이종 펩티드 서열에 의해 N-말단 및/또는 C-말단 상에 플랭킹된 면역원성 펩티드 에피토프를 포함하는 폴리펩티드인 방법.
338. 실시양태 334-337 중 어느 하나에 있어서, 플랭킹 이종 펩티드 서열이 질환-연관 면역원성 펩티드로부터 유래된 것인 방법.
339. 실시양태 334-337 중 어느 하나에 있어서, N-말단 플랭킹 폴리펩티드가 서열식별번호: 5-10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/거나 C-말단 플랭킹 폴리펩티드가 서열식별번호: 11-17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
340. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-323 중 어느 하나에 있어서, 항원이 MHC 클래스 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 클래스 II-제한된 펩티드로 가공될 수 있는 것인 방법.
341. 실시양태 217, 222-227, 233, 237, 239-245, 247-249 및 251-340 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM의 농도의 아주반트를 포함하는 것인 방법.
342. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-325 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 약 0.1 μM 내지 약 1 mM의 농도의 항원을 포함하는 것인 방법.
343. 실시양태 217, 222-227, 233, 237, 239-245, 247-249 및 251-342 중 어느 하나에 있어서, 항원 대 아주반트의 비가 약 10000:1 내지 약 1:10000인 방법.
344. 실시양태 317에 있어서, 항원 대 아주반트의 비가 약 200:1인 방법.
345. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-344 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 a) 항원, b) 항원 및 적어도 1종의 다른 항원, c) 항원 및 아주반트, d) 항원을 코딩하는 핵산, e) 항원을 코딩하는 핵산 및 1종의 다른 항원을 코딩하는 적어도 1종의 다른 핵산, 및/또는 f) 항원 및 아주반트를 코딩하는 핵산을 포함하는 복합체를 포함하는 것인 방법.
346. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-345 중 어느 하나에 있어서, 조건화된 복수의 변형된 PBMC가, 작용제를 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제를 추가로 포함하는 것인 방법.
347. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-346 중 어느 하나에 있어서, 조건화된 복수의 변형된 PBMC가, 작용제를 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 동결-해동 사이클 시에 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제를 추가로 포함하는 것인 방법.
348. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-347 중 어느 하나에 있어서, 적어도 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%의 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 최대 1, 2, 3, 4, 5회의 동결-해동 사이클 후에 생존가능한 것인 방법.
349. 실시양태 348에 있어서, 작용제가 세포내이입을 증진시키는 화합물, 안정화제 또는 보조인자인 방법.
350. 실시양태 349에 있어서, 작용제가 알부민인 방법.
351. 실시양태 350에 있어서, 알부민이 마우스, 소 또는 인간 알부민인 방법.
352. 제351항에 있어서, 작용제가 2가 금속 양이온, 글루코스, ATP, 칼륨, 글리세롤, 트레할로스, D-수크로스, PEG1500, L-아르기닌, L-글루타민 또는 EDTA 중 1종 이상인 방법.
353. 실시양태 351 또는 352에 있어서, 작용제가 피루브산나트륨, 아데닌, 레주베솔®, 트레할로스, 덱스트로스, 만노스, 수크로스, 인간 혈청 알부민 (HSA), 플라스마라이트®, DMSO, 크리오스토르® CS2, 크리오스토르® CS5, 크리오스토르® CS10, 크리오스토르® CS15, HEPES, 글리세롤, 글루타티온, 하이포써모솔® 중 1종 이상인 방법.
354. 실시양태 353에 있어서, 작용제가 마우스 혈청 알부민 (MSA)을 포함하는 것인 방법.
355. 실시양태 354에 있어서, 작용제가 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함하는 것인 방법.
356. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-355 중 어느 하나에 있어서, 세포가 공동-자극 분자 중 1종 이상의 발현을 증가시키도록 추가로 변형되는 것인 방법.
357. 실시양태 356에 있어서, 공동-자극 분자가 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, CD112 또는 scFv 항-CD28인 방법.
358. 실시양태 356에 있어서, 공동-자극 분자가 신호 2 이펙터인 방법.
359. 실시양태 356-358 중 어느 하나에 있어서, 세포가 1종 이상의 공동-자극 분자의 증가된 발현을 유발하는 핵산 (예를 들어, mRNA)을 포함하는 것인 방법.
360. 실시양태 359에 있어서, 핵산이 공동-자극 분자를 코딩하는 mRNA인 방법.
361. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-360 중 어느 하나에 있어서, 세포가 시토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형되는 것인 방법.
362. 실시양태 361에 있어서, 시토카인이 IL-12, IL-2, IFN-α 또는 IL-21인 방법.
363. 실시양태 356에 있어서, 공동-자극 분자가 신호 3 이펙터인 방법.
364. 실시양태 361-363 중 어느 하나에 있어서, 세포가 1종 이상의 시토카인의 증가된 발현을 유발하는 핵산 (예를 들어, mRNA)을 포함하는 것인 방법.
365. 실시양태 364에 있어서, 핵산이 시토카인을 코딩하는 mRNA인 방법.
366. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-365 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 MHC 클래스 I 발현을 조정하기 위한 추가의 변형을 포함하는 것인 방법.
367. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-366 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 MHC 클래스 II 발현을 조정하기 위한 추가의 변형을 포함하는 것인 방법.
368. 실시양태 366에 있어서, 동종 환경에서 변형된 PBMC의 투여에 반응하여 개체에 탑재된 선천성 면역 반응이, 동종 환경에서 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC의 투여에 반응하여 개체에 탑재된 선천성 면역 반응과 비교하여 감소되는 것인 방법.
369. 실시양태 366 또는 367에 있어서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기가, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 이들의 순환 반감기와 비교하여 증가되는 것인 방법.
370. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-369 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 NK-T 세포 중 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
371. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-370 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD14+ 단핵구, 또는 CD56+ NK 세포 중 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
372. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-371 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 여기서 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비가 전혈 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 본질적으로 동일한 것인 방법.
373. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-371 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 여기서 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비가 전혈로부터의 백혈구분리반출술 생성물 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 본질적으로 동일한 것인 방법.
374. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-373 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 여기서 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 10% 이하만큼 상이한 것인 방법.
375. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-374 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 PBMC가 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하고, 여기서 복수의 투입 PBMC 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비는 전혈 내의 PBMC의 총수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구의 비와 10% 이하만큼 상이한 것인 방법.
376. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-375 중 어느 하나에 있어서,
(a) 투입 PBMC의 적어도 약 25%가 T 세포이거나;
(b) 투입 PBMC의 적어도 약 2.5%가 B 세포이거나;
(c) 투입 PBMC의 적어도 약 3.5%가 NK 세포이거나; 또는
(d) 투입 PBMC의 적어도 약 4%가 단핵구인 방법.
377. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-376 중 어느 하나에 있어서,
(a) 변형된 PBMC의 적어도 약 20%가 T 세포이거나;
(b) 변형된 PBMC의 적어도 약 2%가 B 세포이거나;
(c) 변형된 PBMC의 적어도 약 3%가 NK 세포이거나; 또는
(d) 변형된 PBMC의 적어도 약 3%가 단핵구인 방법.
378. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-377 중 어느 하나에 있어서,
(a) 투입 PBMC의 약 70% 이하가 T 세포이거나;
(b) 투입 PBMC의 약 14% 이하가 B 세포이거나;
(c) 투입 PBMC의 약 35% 이하가 NK 세포이거나; 또는
(d) 투입 PBMC의 약 25% 이하가 단핵구인 방법.
379. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-378 중 어느 하나에 있어서,
(a) 변형된 PBMC의 약 80% 이하가 T 세포이거나;
(b) 변형된 PBMC의 약 16% 이하가 B 세포이거나;
(c) 변형된 PBMC의 약 40% 이하가 NK 세포이거나; 또는
(d) 변형된 PBMC의 약 30% 이하가 단핵구인 방법.
380. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-379 중 어느 하나에 있어서,
(a) 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%가 T 세포이거나;
(b) 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%가 B 세포이거나;
(c) 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%가 NK 세포이거나; 또는
(d) 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%가 단핵구인 방법.
381. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-380 중 어느 하나에 있어서,
(a) 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 T 세포의 백분율이 수 기준으로 10% 이하만큼 상이하고/거나;
(b) 복수의 변형된 PBMC 내의 B 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 B 세포의 백분율이 수 기준으로 10% 이하만큼 상이하고/거나;
(c) 복수의 변형된 PBMC 내의 NK 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 NK 세포의 백분율이 수 기준으로 10% 이하만큼 상이하고/거나;
(d) 복수의 변형된 PBMC 내의 단핵구의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 단핵구의 백분율이 수 기준으로 10% 이하만큼 상이한 것인 방법.
382. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-378 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 공동-자극 분자가 복수의 투입 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 공동-자극 분자는 CD80 또는 CD86인 방법.
383. 실시양태 382에 있어서, CD80 및/또는 CD86이 복수의 조건화되지 않은 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 상향조절되는 것인 방법.
384. 실시양태 382 또는 383에 있어서, 공동-자극 분자가 CD86인 방법.
385. 실시양태 382-384 중 어느 하나에 있어서, 조건화된 변형된 PBMC가 복수의 조건화되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 증가된 발현을 갖는 것인 방법.
386. 실시양태 385에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 발현이 복수의 조건화되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 증가되는 것인 방법.
387. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-385 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 개체에 대해 동종인 방법.
388. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-385 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 개체에 대해 자가인 방법.
389. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-388 중 어느 하나에 있어서, 염증 및/또는 면역 반응을 조정하도록 개체가 사전-조건화되는 것인 방법.
390. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-389 중 어느 하나에 있어서, 개체에게 제3 아주반트를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
391. 실시양태 390에 있어서, 제3 아주반트가 IFN-α 또는 CpG ODN인 방법.
392. 실시양태 390에 있어서, 제3 아주반트가 CpG 7909인 방법.
393. 실시양태 390-392 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC 및 제3 아주반트가 공동으로 또는 동시에 투여되는 것인 방법.
394. 실시양태 390-392 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC 및 제3 아주반트가 순차적으로 투여되는 것인 방법.
395. 실시양태 390-394 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC가 제3 아주반트를 투여하기 전에 투여되는 것인 방법.
396. 실시양태 390-395 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC가 제3 아주반트의 투여 후에 투여되는 것인 방법.
397. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-396 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 시토카인의 투여 전에, 그와 공동으로 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
398. 실시양태 397에 있어서, 시토카인이 IL-2, IL-7, IL-12a IL-12b, 또는 IL-15 중 1종 이상인 방법.
399. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-398 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 면역 체크포인트 억제제의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
400. 실시양태 399에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, VISTA, 및 TIM-3 중 어느 하나에 대해 표적화된 것인 방법.
401. 실시양태 400에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1에 대해 표적화된 것인 방법.
402. 실시양태 400에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-L1에 대해 표적화된 것인 방법.
403. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-402 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 치료제의 투여 전에, 그와 공동으로 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
404. 실시양태 403에 있어서, 치료제가 화학요법제인 방법.
405. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-404 중 어느 하나에 있어서, 개체에 대한 변형된 PBMC의 투여가 항원에 특이적인 세포독성 T 림프구 (CTL)의 활성화 및/또는 확장을 유발하는 것인 방법.
406. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-405 중 어느 하나에 있어서, 개체에 대한 변형된 PBMC의 투여가 항원에 특이적인 헬퍼 T (Th) 세포의 활성화 및/또는 확장을 유발하는 것인 방법.
407. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-406 중 어느 하나에 있어서, 개체에게 투여되는 변형된 PBMC의 양이 약 1 x 104 내지 약 1 x 1012개 세포인 방법.
408. 실시양태 407에 있어서, 개체에게 투여되는 변형된 PBMC의 양이 약 1 x 105 내지 약 1 x 1012 개 세포인 방법.
409. 실시양태 407 또는 408에 있어서, 개체에게 투여되는 변형된 PBMC의 양이 약 5 x 105 내지 약 2.5 x 106개 세포/kg 체중인 방법.
410. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-409 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC의 다중 투여를 포함하는 방법.
411. 실시양태 410에 있어서, 약 3 내지 약 9회의 투여를 포함하는 방법.
412. 실시양태 410 또는 411에 있어서, 복수의 변형된 PBMC의 2회 연속 투여 사이의 시간 간격이 약 1일 내지 약 30일인 방법.
413. 실시양태 410-412 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC의 2회 연속 투여 사이의 시간 간격이 약 21일인 방법.
414. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-413 중 어느 하나에 있어서, 개체가 HLA-A2의 발현에 대해 양성인 방법.
415. 실시양태 215-245, 247-249 및 251-414 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC 내의 적어도 1종의 세포가 HLA-A2의 발현에 대해 양성인 방법.
416. 하기 단계를 포함하는, 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
417. 하기 단계를 포함하는, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며,
이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
418. 하기 단계를 포함하는, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
419. 하기 단계를 포함하는, HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며,
이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
420. 실시양태 416-419 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4 μm 내지 약 10 μm인 방법.
421. 실시양태 416-420 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 6 μm인 방법.
422. 실시양태 416-421 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm인 방법.
423. 실시양태 416-422 중 어느 하나에 있어서, HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션하는 것인 방법.
424. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
425. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며,
이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
426. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
427. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며,
이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
428. 실시양태 424-427 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4 μm 내지 약 10 μm인 방법.
429. 실시양태 424-428 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 6 μm인 방법.
430. 실시양태 424-429 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm인 방법.
431. 실시양태 424-430 중 어느 하나에 있어서, HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션하는 것인 방법.
432. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 HPV 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
433. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 HPV 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서, CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
434. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 HPV 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
435. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 HPV 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 HPV 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) HPV 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 HPV 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) HPV 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서, CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
436. 실시양태 432-435 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4 μm 내지 약 10 μm인 방법.
437. 실시양태 432-436 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 6 μm인 방법.
438. 실시양태 432-437 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm인 방법.
439. 실시양태 432-438 중 어느 하나에 있어서, HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션하는 것인 방법.
440. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
441. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
442. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
443. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 약 3 μm 내지 약 10 μm이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC를 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 CpG ODN과 함께 인큐베이션하고, 여기서 CpG ODN은 CpG 7909이며, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계.
444. 실시양태 440-443 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 4 μm 내지 약 10 μm인 방법.
445. 실시양태 440-444 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 6 μm인 방법.
446. 실시양태 440-445 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 (a) 약 4.2 μm 내지 약 6 μm; 또는 (b) 약 4.5 μm인 방법.
447. 실시양태 440 내지 446 중 어느 하나에 있어서, HPV 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 (a) 약 2시간 내지 약 10시간; (b) 약 3시간 내지 약 6시간; 또는 (c) 약 4시간 동안 CpG ODN과 함께 인큐베이션하는 것인 방법.
448. 실시양태 432-447 중 어느 하나에 있어서, 개체에게 제2 아주반트를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
449. 실시양태 448에 있어서, 제2 아주반트가 IFN-α 또는 CpG ODN인 방법.
450. 실시양태 449에 있어서, 제2 아주반트가 CpG 7909인 방법.
451. 실시양태 432-450 중 어느 하나에 있어서, 조건화된 복수의 변형된 PBMC가 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제를 추가로 포함하고, 임의로 여기서 작용제는 피루브산나트륨, 아데닌, 레주베솔®, 트레할로스, 덱스트로스, 만노스, 수크로스, 인간 혈청 알부민 (HSA), 플라스마라이트®, DMSO, 크리오스토르® CS2, 크리오스토르® CS5, 크리오스토르® CS10, 크리오스토르® CS15, HEPES, 글리세롤, 글루타티온, 하이포써모솔® 중 1종 이상인 방법.
452. 실시양태 432-451 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 면역 체크포인트 억제제의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
453. 실시양태 452에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, VISTA, 및 TIM-3 중 어느 하나에 대해 표적화된 것인 방법.
454. 실시양태 453에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1에 대해 표적화된 것인 방법.
455. 실시양태 453에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-L1에 대해 표적화된 것인 방법.
456. 실시양태 440-455 중 어느 하나에 있어서, 변형된 PBMC가 치료제의 투여 전에, 그와 공동으로 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
457. 실시양태 456에 있어서, 치료제가 화학요법제인 방법.
추가의 실시양태
1. 항원을 포함하는 복수의 변형된 말초 혈액 단핵 세포 (PMBC)이며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성이고, 복수의 변형된 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중 2종 이상을 포함하고, 특히 여기서 항원은 암 항원, 감염성 질환 항원 또는 바이러스-질환 연관 항원인, 복수의 변형된 PMBC.
2. 실시양태 1에 있어서, 항원이 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%에 존재하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 조건화된 복수의 변형된 PBMC이며, 특히 여기서 변형된 PBMC는 아주반트를 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
4. 실시양태 3에 있어서, 항원이 시토졸에 존재하고, 아주반트가 복수의 변형된 PBMC 내의 세포의 소포에 존재하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
5. 실시양태 3 또는 4에 있어서, CD80 및/또는 CD86이 복수의 조건화되지 않은 PBMC의 B 세포와 비교하여 복수의 조건화된 PBMC의 B 세포에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 상향조절되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
6. 실시양태 3-5 중 어느 하나에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 발현이 복수의 조건화되지 않은 PBMC와 비교하여 복수의 조건화된 PBMC의 PBMC에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 증가되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
7. 실시양태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 복수의 변형된 PMBC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
8. 실시양태 3-7 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
9. 실시양태 1-8 중 어느 하나에 있어서,
(a) 복수의 변형된 PBMC 내의 T 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 T 세포의 백분율이 약 10% 이하만큼 상이하고/거나;
(b) 복수의 변형된 PBMC 내의 B 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 B 세포의 백분율이 약 10% 이하만큼 상이하고/거나;
(c) 복수의 변형된 PBMC 내의 NK 세포의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 NK 세포의 백분율이 약 10% 이하만큼 상이하고/거나;
(d) 복수의 변형된 PBMC 내의 단핵구의 백분율 및 복수의 투입 PBMC 내의 단핵구의 백분율이 약 10% 이하만큼 상이한 것인
복수의 변형된 PBMC.
10. 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및 임의로
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계.
11. 실시양태 7-10 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최소 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 60% 내지 약 90%이고/이거나, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC 내의 최대 직경을 갖는 세포의 하위집단의 평균 직경의 약 20% 내지 약 30%인 복수의 변형된 또는 조건화된 PBMC 또는 방법.
12. 실시양태 7-11 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 직경이 약 3 μm 내지 약 10 μm, 특히 약 3 μm 내지 약 6 μm인 복수의 변형된 또는 조건화된 PBMC 또는 방법.
13. 실시양태 8-12 중 어느 하나에 있어서, 복수의 변형된 PBMC를, 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1 내지 약 24시간 동안, 특히 약 2 내지 약 10시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC 또는 방법.
14. 실시양태 3-13 중 어느 하나에 있어서, 아주반트가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효능제, TLR4 효능제 또는 TLR 9 효능제인 조건화된 복수의 변형된 또는 조건화된 PBMC 또는 방법.
15. 실시양태 1-14 중 어느 하나에 있어서, 항원이 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원인 복수의 변형된 또는 조건화된 PBMC 또는 방법.
실시예
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 범주 및 취지 내에서 여러 실시양태가 가능하다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예를 참조하여 보다 상세히 기재될 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
개체에서 면역 반응을 자극하는데 있어서 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC의 효능을 조사하기 위해, HPV-유래 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하고 개체에게 투여한다. 치료 백신으로서 사용하기 위한 질환 항원을 포함하는 조건화된 PBMC의 효능을 단독요법으로서 또는 추가의 치료제, 예컨대 PD-L1 억제제 및/또는 화학요법제와 조합되는 경우로서 연구한다.
PBMC-HPV 약물 물질은 MHC-I 상에 HPV16의 HLA-A02 제한된 E6 및 E7 에피토프를 제시하는 자가 PBMC로 이루어진다. 대부분의 PBMC (>90%)는 T 세포, 단핵구, NK 세포, 및 B 세포로 이루어진다. PBMC-HPV의 구조의 예시는 도 1a에 제시되며, 표시된 선은 HPV16의 면역원성 에피토프를 함유하는 전장 E6 및 E7 합성 긴 펩티드 (SLP)를 나타낸다. 최소 에피토프는 각각 적색 및 녹색으로 표시되었다. 전달되면, SLP는 가공되어 최소 에피토프를 생성하고, 이는 후속적으로 MHC-I 상에 제시된다.
도 1a에서의 세포는 PBMC-HPV 세포 유형 (T 세포, 단핵구, NK 세포, 및 B 세포) 중 어느 것을 나타낸다.
PBMC-HPV 약물 물질의 생산에서 출발 물질로서 사용된 E6 SLP 및 E7 SLP는 하기에 제시된다. 이들 펩티드는 HPV16에 대한 항원성 에피토프를 함유한다 (볼드체로 나타냄).
E6 SLP: QLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL (서열식별번호: 19)
E7 SLP: QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL (서열식별번호: 23)
제조 공정 동안 세포 시토졸 내로 전달된 후, 이들 펩티드는 세포에 의해 가공되고, 항원성 에피토프를 함유하는 생성된 절편은 다양한 PBMC 세포의 MHC-I 상에 제시된다. E6 SLP는, E6 단백질에서 HLA-A2 제한된 면역우성 에피토프로서 언급된 HLA-A2 항원성 펩티드 TIHDIILECV (서열식별번호: 1)를 함유하기 때문에 선택된 천연 E6 단백질로부터의 25개 아미노산 펩티드이다. E7 SLP는 E6 단백질로부터의 플랭킹 아미노산 내에 HLA-A2 제한된 면역우성 에피토프 YMLDLQPETT (서열식별번호: 3)를 함유한다. 이러한 E7 에피토프는 항원성 E7 펩티드로서 널리 언급되었다. 천연 E7 단백질과 동일하지 않은 상기 플랭킹 서열 내의 E7 에피토프는 천연 E7 플랭킹 서열을 함유하는 SLP보다 시험관내에서 인간 항원 제시 세포에 의해 보다 효율적으로 가공되고 제시되는 것으로 밝혀졌다.
PBMC-HPV 약물 물질 제조 공정의 일부로서, PBMC-HPV 세포를 톨-유사 수용체 (TLR9) 신호전달을 자극하는 CpG 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (ODN)인 CpG 7909로 조건화시킨다. 이러한 성숙은 PBMC-HPV 세포에 의한 염증성 시토카인 (예를 들어 IL-6)의 생산 및 B 세포 상의 공동자극 분자 (예를 들어 CD86) 및 MHC-I의 상향조절을 유도한다. 성숙 기간 후, PBMC-HPV 약물 물질을 세척하여 CpG 7909 및 축적된 시토카인을 제거하고, 후속적으로 SQZ-PBMC-HPV 약물 제품으로 불리는 HPV 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 포함하는 조성물로 제제화한다.
PBMC-HPV 약물 물질은 세포질로 전달된 E6 및 E7 SLP를 갖는 세포로 이루어지고, CpG 7909가 세포를 성숙시킨 후이지만, CpG 7909를 세척 제거하기 직전이며, SQZ-PBMC-HPV 약물 제품을 제조하기 위해서는 제제화 및 충전이 필요하다.
약물 제품을 제조하기 위해, PBMC-HPV 약물 물질을 2회 세척하고, 후속적으로 용액 중에서 제제화한다. 예를 들어, 용액은 50% (v/v)의 극저온 보존 배지 (예컨대, 크리오스토르(CryoStor)® CS10), 30% (v/v)의 저온 보존 배지 (예컨대, 하이포써모졸(HypoThermosol)® FRS), 및 20% (v/v)의 알부민 (예컨대, 알부케드(Albuked)TM 25 (25% 인간 혈청 알부민); NDC #76125-0792-10))을 함유할 수 있다.
백혈구분리반출술 대략 6-8일 후에, 환자에게 SQZ-PBMC-HPV 약물 제품을 정맥내로 (IV) 투여한다. SQZ PBMC-HPV 약물 제품의 용량은 환자의 용량 코호트에 따라 달라지고, 생존 세포/kg 기준으로 투여된다.
최초 인간 대상 (FIH) 연구는 SQZ-PBMC-HPV 및 SQZ-PBMC-HPV + 아테졸리주맙에 대한 증량 상 및 확장 상으로 이루어진다.
SQZ-PBMC-HPV 증량 상은 하기 코호트를 포함한다:
(1) 저 세포 용량 코호트, SQZ-PBMC-HPV의 초기 투여에 이어 초기 용량 후 3주 1회 및 6주 1회로 2회 부스터,
(2) 저 세포 용량 초기 투여에 이어, 3주 간격으로 투여된 SQZ-PBMC-HPV의 5회 부스터,
(3) 고 세포 용량 코호트, SQZ-PBMC-HPV의 초기 투여에 이어 3개의 동등한 분취액의 초기 용량 후 3주 1회 및 6주 1회로 2회 부스터,
(4) 고 세포 용량 코호트, SQZ-PBMC-HPV의 초기 투여에 이어 초기 용량 후 3주 1회 및 6주 1회로 2회 부스터. 이 코호트에서는, CpG 7909가 SQZ-PBMC-HPV 후에 매번 공-투여될 것이다.
FIH 연구의 주요 초점은 SQZ-PBMC-HPV의 투여의 평가이지만, 연구는 하나의 코호트 (코호트 4)에서 SQZ-PBMC-HPV 및 CpG 7909의 공-투여의 평가를 포함한다. 코호트 4는 CpG7909가 후속 코호트 및 확장 상에 대해 공-투여될지 여부의 정보를 제공한다. 코호트 4에서 SQZ-PBMC-HPV가 먼저 IV 투여된 후, CpG 7909가 IV 투여된다.
CpG 7909의 안전성, 내약성 및 공-투여의 영향에 관련하여 각각의 코호트 내의 적어도 4명의 환자의 분석 후에, 연구 조사자와 함께 SQZ-PBMC-HPV + 아테졸리주맙에 대한 증량 상에서 약물 제품 SQZ-PBMC-HPV를 CpG 7909와 공-투여할지 또는 공-투여하지 않을지 여부를 결정한다. 하기 코호트를 시험한다:
(5) 저 세포 용량 코호트 + 아테졸리주맙, SQZ-PBMC-HPV + 아테졸리주맙의 초기 투여에 이어 초기 용량 후 3주 1회 및 6주 1회로 2회 부스터,
(6) 저 세포 용량 코호트 + 아테졸리주맙, SQZ-PBMC-HPV + 아테졸리주맙의 초기 투여에 이어 3주 간격으로 투여되는 적어도 5회 부스터 (수거된 세포 수에 따라 최대 9회),
(7) 고 세포 용량 코호트 + 아테졸리주맙, SQZ-PBMC-HPV + 아테졸리주맙의 초기 투여에 이어 초기 용량 후 3주 1회 및 6주 1회로 2회 부스터.
도 1b 및 도 1c는 각각 SQZ-PBMC-HPV 단독요법 및 SQZ-PBMC-HPV + 아테졸리주맙 조합 요법에 대한 코호트 치료의 대표적인 개략도를 제시한다.
확장 상 연구를 위해, 단독요법으로서 SQZ-PMBC-HPV를 투여하기 위한 최대 3개의 바스켓은 다음과 같다:
(1) 선택된 2상 권장 용량 (RP2D) 요법에서의 HPV16-양성 두경부 편평 세포암,
(2) 선택된 권장 2상 용량 (RP2D) 요법에서의 HPV16-양성 자궁경부암,
(3) 선택된 2상 권장 용량 (RP2D) 요법에서의 다른 HPV16-양성 암,
SQZ-PBMC-HPV + 아테졸리주맙에 대한 최대 3개의 바스켓은 다음과 같다:
SQZ-PBMC-HPV에 대한 선택된 2상 권장 용량 (RP2D) 요법에서의 HPV16-양성 두경부 편평 세포암,
SQZ-PBMC-HPV에 대한 선택된 2상 권장 용량 (RP2D) 요법에서의 HPV16-양성 자궁경부암,
SQZ-PBMC-HPV에 대한 선택된 2상 권장 용량 (RP2D) 요법에서의 다른 HPV16-양성 암
실시예 2
개별 면역 세포 하위세트로의 SQZ-매개 전달을 정량화하기 위해, 마우스 비장세포에 형광 추적자 분자를 로딩하고, 생존율 및 전달에 대해 평가하였다.
방법
비장세포를 C57BL/6J 암컷 마우스 (20 M/mL)로부터 단리하고, SQZ (30, 60 및 90 psi; 4 μm 협착부)를 사용하여 RPMI 중 100 μg/mL의 형광-표지된 덱스트란 (3 kDa)을 로딩하고 유동 세포측정법에 의해 혼합 비장세포 집단 내의 개별 면역 세포 하위세트로의 덱스트란의 전달 퍼센트 및 생존율을 평가하였다.
결과
도 2에 제시된 바와 같이, 비장세포로의 덱스트란의 전달 퍼센트는 압력이 증가함에 따라 유의하게 증가하였고 (P<0.001; 각각의 조건은 세포내이입과 비교), 30 및 60 psi 조건에서는 생존율이 단지 약간 감소하였고, 90 psi 조건에서는 생존율이 더 크게 감소하였다. T 세포 및 단핵구에서 여전히 주목할 만한 양의 전달이 있었지만, B 및 NK 세포가 다른 세포 집단 중에서 가장 높은 전달 수준을 가졌다. 생존율에 대해 단지 최소의 영향으로 가장 높은 전달을 제공하는 조건 (60 psi)에서, 모든 세포 하위세트는 ~15% 이내의 전달 퍼센트 (모든 세포 유형에 걸쳐 60-75% 전달)을 가졌다. 이들 데이터는 SQZ가 생존율에 대한 영향이 거의 없이 뮤린 비장세포의 혼합 집단 내의 각각의 면역 세포 하위세트에 동시에 분자를 효율적으로 전달할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3:
상이한 아주반트 전략의 영향을 평가하기 위해, 혼합 비장세포 및 단리 B 세포에 모델 항원을 로딩하고, 아주반트로 조건화 및/또는 공동-주사하고, 염증성 시토카인 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 상대 백분율을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
방법
제0일에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 면역자기 분리를 통해, 한 군에 대한 비장세포로부터 단리된 B 세포와 함께 수득하고, SQZ (60 psi; 4 μm 협착부))에 의해 Ova 단백질 (400 μg/mL)을 로딩하고, 배지 (R10) 단독 또는 CpG 1826 (1 μM) 함유 배지에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (5마리/군)에게 제1일에 100 μL의 비히클 (PBS), B 세포 (5x106개 세포/mL), 비장세포 (5x106개 세포/mL), 또는 25 μg CpG1826과 함께 공동-주사되는 비장세포를 안와후로 주사하였다. 제8일에, 비장을 수거하고, SIINFEKL (서열식별번호: 54) (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율을 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 결정하였다.
결과
도 3에 제시된 바와 같이, Ova-로딩된 비장세포로 처리된 마우스에 대한 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율은 비장세포가 16시간 동안 CpG로 조건화된 경우에 유의하게 더 높았다 (모든 다른 조건 대비 P<0.005; 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표함); 그러나, 마우스를 CpG와 함께 공동-주사하거나 또는 CpG-성숙된 B 세포 (BAPC)로 처리한 경우에 %IFN-γ+ CD8+ T 세포의 유의한 증가가 없었다. 이들 데이터는 CpG-성숙된, Ova-로딩된 비장세포로의 처리가 항원-특이적 CD8+ T 세포에서 염증성 시토카인 생산의 유의한 증가를 유도한 한편, Ova-로딩된 B 세포, 또는 CpG와 함께 공동-주사된 비장세포는 주목할 만한 반응을 유도하지 않았음을 보여준다.
실시예 4:
보다 낮은 용량의 CpG와 함께 공동-주사된 항원-로딩된 비장세포가 항원-특이적 반응을 도출할 수 있는지를 결정하기 위해, 비장세포에 모델 항원을 로딩하고, CpG로 성숙시키거나, CpG와 함께 공동-주사하거나, 또는 CpG로 성숙시키고 증가하는 용량으로 공동-주사하고, 염증성 시토카인 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 상대 백분율을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
방법
제0일에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물을 생성하였다. 이어서, 이들 혼합 비장세포에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부)에 의해 Ova 단백질 (400 μg/mL)를 로딩하고, 배지 (R10) 단독 또는 CpG 1826 (1 μM) 함유 배지에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (5마리/군)에게 제1일에 100 μL의 비히클 (PBS), CpG로 성숙된 비장세포 (1x106개 세포/마우스), 25 μg CpG1826과 함께 공동-주사된 비장세포, 또는 CpG로 성숙되고 상이한 용량의 CpG (0.1-10 μg)와 함께 공동-주사된 비장세포를 안와후로 주사하였다. 제8일에, 비장을 수거하고, SIINFEKL (서열식별번호: 54) (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율을 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 결정하였다.
결과
도 4에 제시된 바와 같이, Ova-로딩된 비장세포로 처리된 마우스에 대한 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율은 비장세포가 16시간 동안 CpG로 성숙된 경우에 유의하게 더 높았지만 (비처리 대비 P<0.05); 마우스가 CpG와 함께 공동-주사된 경우에는 대조군에 비해 %IFN-γ+ CD8+ T 세포의 유의한 증가가 없었다. 추가로, 성숙되고 임의의 용량의 CpG와 함께 공동-주사된 것과 비교하여, 비장세포가 CpG로 성숙된 경우는 %IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율의 통계적으로 유의한 증가가 없었고, 5 μg CpG 공동-주사에서는 명백한 약간의 감소가 있었다. 이들 데이터는 CpG-성숙된, Ova-로딩된 비장세포와 조합된 CpG의 공동-주사가 항원-특이적 CD8+ T 세포에서 염증성 시토카인 생산의 유의한 증가를 유도하지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 5
상이한 아주반트와 함께 공동-주사된 항원-로딩된 비장세포가 항원-특이적 반응을 도출할 수 있는지를 결정하기 위해, 비장세포에 모델 항원을 로딩하고, CpG로 성숙시키거나, CpG와 함께 공동-주사하거나, 또는 CpG로 성숙시키고 CpG 또는 IFN-α와 함께 공동-주사하고, 염증성 시토카인 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 상대 백분율을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
방법
제0일에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물을 생성하였다. 이어서, 이들 혼합 비장세포에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부)에 의해 Ova 단백질 (400 μg/mL)을 로딩하고, 배지 (R10) 단독 또는 CpG 1826 (1 μM) 함유 배지에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (5마리/군)에게 제1일에 100 μL의 비히클 (PBS), CpG로 성숙된 비장세포 (1x106개 세포/마우스), 1 μg CpG1826과 함께 공동-주사된 비장세포 또는 CpG 또는 10000 U IFN-α와 함께 공동-주사되고 CpG로 성숙된 비장세포를 안와후로 주사하였다. 제8일에, 비장을 수거하고, SIINFEKL (서열식별번호: 54) (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율을 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 결정하였다.
결과
도 5에 제시된 바와 같이, Ova-로딩된 비장세포로 처리된 마우스에 대한 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율은 비장세포가 16시간 동안 CpG로 성숙된 경우에 가장 높았고, 비처리 (P<0.0001) 뿐만 아니라 공동-주사된 CpG (P<0.005)에 비해 유의한 증가가 있었다. 비장세포를 CpG로 성숙시키고, 이들을 어느 하나의 아주반트와 함께 공동-주사하는 것에 대한 유의한 이익은 없었으며, 공동-주사된 아주반트에 대한 경향은 효과를 둔화시켰다. 이들 데이터는 CpG-성숙된, Ova-로딩된 비장세포와 조합된 CpG 또는 IFN-α의 공동-주사가 항원-특이적 CD8+ T 세포에서 염증성 시토카인 생산의 유의한 증가를 유도하지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 6
항원-특이적 비장세포 백신을 부스팅하는 것이 더 큰 항원-특이적 반응을 도출할 수 있는지를 결정하기 위해, 비장세포에 모델 항원을 로딩하고, CpG로 성숙시키고, 수용자 마우스 내로 1회 (프라임) 또는 2회 (프라임-부스트) 주사하고, 염증성 시토카인 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 상대 백분율을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
방법
제-7일에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물을 생성하였다. 이어서, 이들 혼합 비장세포에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부)에 의해 Ova 단백질 (400 μg/mL)을 로딩하고 CpG 1826 (R10 중 1 μM)로 4시간 동안 처리하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (5마리/군)에게 100 μL의 비장세포 (1x105-6개 세포/마우스)를 제-7일 및/또는 제0일에 안와후로 주사하였다. 제7일에, 비장을 수거하고, SIINFEKL (서열식별번호: 54) (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율을 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 결정하였다.
결과
도 6에 제시된 바와 같이, 비장세포 용량을 증가시키는 것은 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율의 보통의 증가를 유도한 한편, 7일 후 부스트의 추가는 시험된 모든 비장세포 용량에 대해 IFN-γ+ 세포의 유의한 (P<0.05) 증가를 유도하였다. 흥미롭게도, 부스트 증진은 보다 저 세포 용량에서 가장 현저하였고, 0.1M 용량은 항원-특이적 반응의 8배 증가를 보였다. 이들 데이터는, 시험된 모든 용량에 대해, 프라이밍 7일 후의 부스트 사용이 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응의 유의한 증진으로 이어진다는 것을 보여준다.
실시예 7:
B 세포 대 혼합 비장세포 백신의 세포 용량 및 상대 효능의 중요성을 평가하기 위해, 세포에 모델 항원을 로딩하고, 아주반트로 성숙시키고, 염증성 시토카인 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 상대적 백분율을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
방법
제0일에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물을 생성하였다. 추가로, 단리된 B 세포를 양성 면역자기 분리를 통해 암컷 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하였다. 이들 상이한 세포 조성물에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부)에 의해 Ova 단백질 (400 μg/mL)을 로딩하고, 배지 (R10) 단독 또는 CpG 1826 (1 μM) 함유 배지에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (5마리/군)에게 제1일에 100 μL의 비히클 (PBS), B 세포 또는 비장세포 (0.25-4x106개 세포/mL)를 안와후로 주사하였다. 제8일에, 비장을 수거하고, SIINFEKL (서열식별번호: 54) (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율을 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 결정하였다.
결과
도 7에 제시된 바와 같이, Ova-로딩된 B 세포 또는 비장세포로 처리된 마우스에 대한 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율이 양성 용량-반응을 나타냈고, 여기서 4M 세포 용량이 시험된 세포 유형 둘 다에 대해 가장 높은 반응을 유도하였다. 일반적으로, 모든 용량의 비장세포는 그의 BAPC 대응물보다 더 높은 평균 반응을 유도하였고, 이는 유의성 경향이 있다. 이러한 데이터는 세포 수가 높을수록 반응 증가의 경향이 있다는 것과 비장세포가 더 높은 항원-특이적 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8
항원-특이적 반응을 유도하는 혼합 비장세포의 상대 효능에 대한 CpG 성숙 시간의 영향을 평가하기 위해, 비장세포에 모델 항원을 로딩하고, 다양한 시간 동안 CpG로 성숙시키고, 염증성 시토카인 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 상대적인 백분율을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
방법
제0일에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물을 생성하였다. 비장세포에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부)에 의해 Ova 단백질 (400 μg/mL)를 로딩하고, 배지 (R10) 단독 또는 CpG 1826 (1 μM) 함유 배지에서 다양한 시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (5마리/군)에게 제1일에 100 μL의 비히클 (PBS) 또는 비장세포 (1x106개 세포/mL)를 안와후로 주사하였다. 제8일에, 비장을 수거하고, SIINFEKL (서열식별번호: 54) (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율을 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 결정하였다.
결과
도 8에 제시된 바와 같이, Ova-로딩된 비장세포로 처리된 마우스에 대한 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율은 CpG 성숙 시간이 길수록 증가하였다 (*P<0.05, **P<0.01, #P<0.005, 모든 비교는 CpG 부재와 비교함). 적어도 4시간의 모든 성숙 시간에서 관찰된 반응에서 유의한 증가가 있었다. 이들 데이터는 유의한 항원-특이적 반응을 유도하기 위해 SQZ 후 적어도 4시간의 CpG 성숙 시간이 필요함을 보여준다.
실시예 9:
치료 세팅에서 종양 성장 억제를 유도하는데 필요한 비장세포의 최소 유효 세포 용량을 결정하기 위해, 4가지 상이한 용량의 비장세포를 HPV E7-발현 TC1 종양 모델에서 시험하였고, 여기서 종양의 면적을 시간에 대해 플롯팅하였다.
방법
제0일에, C57BL/6J 암컷 마우스에게 제0일의 TC1 종양 세포 (50k 세포/마우스)를 우측 후방 측복부에 주사하였다. 제7일에 (프라임), 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 비장세포를 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물을 생성하였다. 비장세포에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부)를 통해 사전 복합체화 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25)) + 20 μM 마우스 혈청 알부민 (MSA)을 로딩하고, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (10마리/군)에게 제7일에 100 μL의 비히클 (PBS) 또는 비장세포 (0.05-1M 세포/마우스)를 안와후로 주사하였다. TC-1 종양 성장을 종양 이식 1주 후에 시작하여 1주에 2회 측정하고, 30일 동안 비처리 마우스에서의 종양 성장과 비교하였다.
결과
도 9에 제시된 바와 같이, 비처리군 (비장세포 부재) 및 증가하는 수의 HPV E7-로딩된 비장세포로 처리된 군으로부터의 마우스 사이에서 식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정된 종양 성장을 비교하였다. 비장세포 용량이 클수록 종양 성장 억제가 더 우수한 것으로 밝혀졌으며, 1M 용량은 평균적으로 완전한 종양 퇴행을 유도하였다. 30일 후, 1M 처리군에는 종양이 없는 5마리의 잔류 마우스가 있었던 반면, 0.25M 군에는 종양이 없는 3마리의 마우스가 있었다. 이들 데이터는 SQZ에 의해 로딩된 비장세포가 HPV-연관 암의 치료 모델에서 종양 퇴행을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 10:
혼합 집단 내의 B 세포에 대한 CpG 성숙의 효과를 결정하기 위해, 인간 PBMC 및 뮤린 비장세포를 CpG로 다양한 시간 동안 성숙시키고, 활성화 마커 CD86의 상대량을 유동 세포측정법에 의해 B 세포 집단에서 측정하고, 시토카인 및 케모카인의 수준을 멀티플렉스 검정에 의해 정량화하였다.
방법
뮤린 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물을 생성하였다. 인간 PBMC 및 비장세포를 다양한 시간 (2-24시간) 동안 및 농도 (1-10 μM)로 CpG (인간의 경우 2006, 뮤린의 경우 1826)와 함께 R10에서 인큐베이션하였다. CpG 인큐베이션 후에, 세포를 R10으로 세척하고, 유동 세포측정법에 의해 CD86의 수준에 대해 평가하고, 상청액을 수집하고, 시토카인의 수준을 멀티플렉스 (29-플렉스) 인간 시토카인/케모카인 검정을 사용하여 분석하였다.
결과
도 10a는 하기 결과를 보여준다: 인간 (상단) - 보다 높은 10 μM 용량의 CpG는, 인간 PBMC의 B 세포 집단에서 CD86의 수준이 2시간 후에 시간 경과에 따라 감소하였음을 보여주었다. 보다 낮은 1 μM 용량은 모든 시점에 대해 10 μM보다 더 높은 수준의 CD86을 유도했고, 이는 또한 2시간 후에 수준이 감소하고 24시간 후에 복귀하기 시작하는 이중모드 시간 경과를 나타내었다. 이들 데이터는 보다 낮은 수준의 CpG가 보다 높은 B 세포 활성화로 이어질 수 있으며, 모든 용량은 가장 이른 관찰 시점에서 피크임을 보여준다.
뮤린 (하단) - 뮤린 B 세포의 경우에, 시간 경과에 따라 및 둘 다의 농도에서 CD86 수준의 주목할 만한 변화가 없었다. 이들 데이터는 뮤린 B 세포가 CpG 성숙에 반응하여 CD86을 상향조절하지 않는다는 것을 보여준다.
도 10b에 제시된 바와 같이, 시토카인/케모카인 (도 10b) - 인간 및 마우스 케모카인/시토카인 프로파일 둘 다로부터의 결과는, IL-10 및 IL-13은 단지 뮤린 비장세포에서만 증가되었지만, 다수의 동일한 단백질이 CpG 처리에 반응하여 증가 하는 유사한 경향을 나타낸다 (IFN-γ, IL-6, MIP-1B). 이들 결과는 인간 PBMC 및 뮤린 비장세포가 CpG에 대해 유사한 케모카인/시토카인 반응을 가지며, IL-10 및 IL-13이 주목할 만한 예외임을 나타낸다.
실시예 11
세포 조성 및 MHC-I 수준에 대한 SQZing의 영향을 결정하기 위해, 인간 PBMC를 세포 스퀴징에 적용하고, 면역 세포의 상대 백분율, 뿐만 아니라 MHC-I의 표면 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
방법
HLA-A2+ 공여자로부터의 인간 PBMC를 실온에서 형광-표지된 3 kDa 덱스트란 (100 μg/mL)과 함께 인큐베이션하거나(세포내이입) 또는 SQZ (60 psi; 3.5-4 μm 폭)에 의해 로딩하였다. 이어서, 로딩된 PBMC를 유동 세포측정법을 통해 B 세포, T 세포, NK 세포 및 단핵구의 상대 조성, 뿐만 아니라 HLA-A2 MHC-I 표면 발현에 대해 분석하였다.
결과
도 11에 제시된 바와 같이, SQZ를 사용한 인간 PBMC 로딩은 B 세포 (CD20), T 세포 (CD3), NK 세포 (CD56) 및 단핵구 (CD14)에 대해 5% 미만의 변화를 유도하였고 [상단], 이는 SQZ 후의 MHC-I 수준의 약간의 (12%) 감소와 일치한다. 세포 조성 및 MHC-I 수준 둘 다에 대해, 3.5 μm 협착부 폭은 약간 더 높은 변경을 유도했다. 종합하면, 이들 데이터는 SQZ를 사용한 PBMC 로딩이 면역 세포 하위세트의 상대 존재비 및 그의 MHC-I 표면 발현을 인지가능한 정도로 변경시키지 않는다는 것을 지지한다.
실시예 12
개별 세포 하위세트에 대한 SQZing 전달 및 영향을 결정하기 위해, 인간 PBMC를 세포 스퀴징에 적용하고, 형광 화합물의 생존율 및 상이한 면역 세포 집단으로의 전달을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
방법
인간 PBMC를 실온에서 형광-표지된 3 kDa 덱스트란 (100 μg/mL)과 함께 인큐베이션하거나(세포내이입) 또는 SQZ (60 psi; 3.5-4 μm 폭)에 의해 로딩하였다. 이어서, 로딩된 PBMC를 유동 세포측정법에 의해 생존율 및 전달에 대해 분석하였다.
결과
도 12a 및 b에 제시된 바와 같이, SQZ를 사용한 인간 PBMC 로딩은 B 세포 (CD20), T 세포 (CD3), NK 세포 (CD56) 및 단핵구 (CD14)에 대해 생존율에서 10% 미만의 변화를 유도하였다 [좌측]. 덱스트란이 전달된 세포의 백분율은 3.5 μm 폭 협착부에 대해 60% (B 세포) 내지 90% (단핵구) 범위였고, 4 μm 폭 협착부는 모든 세포 유형에 걸쳐 ~10-20% 더 적은 세포가 전달되었다. 3.5 μm 폭에 대해 T 세포 및 단핵구의 경우 세포당 로딩된 덱스트란의 양은 최대 35배 증가하였고, B 세포 및 NK 세포의 경우는 ~5-10배 증가하였다. 4 μm 폭 협착부는 일반적으로 전달량이 3.5 μm 폭보다 ~2배만큼 감소하였다.
실시예 13
혼합 집단으로부터의 전체 기능적 반응에 대한 개별 세포 하위세트로의 전달의 효과를 결정하기 위해, 인간 PBMC에 질환-관련 항원 및 태그부착된 덱스트란을 SQZ에 의해 로딩하고, 항원-특이적 반응자 세포를 자극하는 능력을 측정하고, 태그부착된 화합물의 전달과 비교할 것이다.
방법
HLA-A02+ 공여자로부터의 인간 PBMC (10M 세포/mL)를 SQZ (60 psi, 실온)에 의해 50 μM E7 SLP (QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL (서열식별번호: 23)) 및 형광-표지된 3 kDa 덱스트란 (100 μg/mL)의 존재 하에 로딩하고, 상이한 협착부 폭 (3.5 및 4 μm) 사이의 세포 하위세트로의 전달 수준을 유동 세포측정법에 의해 정량화하였다. 이어서, PBMC를 E711-20-특이적 CD8+ 반응자 세포와 함께 2:1 자극자:반응자 세포의 비로 공동-배양하고, IL-2 (10 U/mL)의 존재 하에 배양하여, 비처리된 대조군 또는 최소 에피토프 (PP - 0.1 μM - YMLDLQPETT (서열식별번호: 3))와 함께 밤새 인큐베이션된 2:1 자극자:반응자 세포와 비교하였다. 24시간 후, 각각의 조건으로부터 상청액을 수거하고, IFN-γ 생산 수준을 IFN-γ ELISA에 의해 평가하였다.
결과
도 13에 제시된 바와 같이, SQZ를 사용한 인간 PBMC 로딩은 ELISA에 의해 평가된 IFN-γ 생산 수준의 최대 ~4배 증가 (3.5 μm)를 유도하였다 (상단). 4 μm 협착부를 통한 전달은 E7-특이적 반응자 T 세포에 대한 항원-특이적 반응의 수준의 약 절반을 나타냈다 (중간 및 우측 - 동일한 샘플로부터의 도 11 데이터의 재분석). 이 기능적 효과는 3.5 μm 조건에 의한 E7 SLP의 보다 높은 전달과 상관관계가 있었다. 이들 발견은 증진된 전달이 인간 PBMC의 세포 항원-제시 기능성의 증가로 이어질 수 있음을 보여준다.
실시예 14
항원-특이적 반응을 활성화시키는 면역 세포의 능력에 대한 다양한 전달 파라미터의 영향을 결정하기 위해, 인간 PBMC에 SQZ에 의해 질환-관련 항원을 로딩하고, 항원-특이적 반응자 세포를 자극하는 능력을 측정하고, 상이한 SQZ 조건에 걸쳐 비교할 것이다.
방법
HLA-A02+ 공여자로부터의 인간 PBMC (10M 세포/mL)를 50 μM pp65 SLP (PPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDAND (서열식별번호: 51))의 존재 하에 SQZ에 의해 로딩하고, 압력 (45, 60 psi), 온도 (실온 얼음) 및 협착부 폭 (3.5-4.5 μm)을 변경하였다. 이어서, PBMC를 pp65-특이적 CD8+ 반응자 세포와 함께 2:1 자극자:반응자 세포의 비로 공동-배양하고, IL-2 (10 U/mL)의 존재 하에 배양하고, 비처리된 대조군 또는 최소 에피토프 (PP - 0.1 μM - NLVPMVATV (서열식별번호: 55))와 함께 밤새 인큐베이션된 2:1 자극자:반응자 세포와 비교하였다. 24시간 후, 각각의 조건으로부터 상청액을 수거하고, IFN-γ 생산 수준을 IFN-γ ELISA에 의해 평가하였다.
결과
도 14에 제시된 바와 같이, SQZ를 사용하여 인간 PBMC에 pp65 SLP를 로딩하는 것은 ELISA에 의해 평가된 IFN-γ 생산 수준의 ~6-9배 증가를 유도하였다. 협착부 폭 (3.5 μm)이 더 좁고 압력 (60 psi)이 더 높을수록 반응이 더 높아지고, 점진적으로 더 넓은 칩이 기능 상실을 유도하며, 이러한 현상은 실온 (상단)과 얼음 (하단) 조건 사이에 보존된다. 종합하면, SQZ 동안 얼음에 대한 약간의 이익이 있을 수 있지만, 모든 조건은 IFN-γ 생산의 유의한 증가로 이어졌다.
실시예 15
항원-특이적 반응을 활성화시킬 수 있는 인간 면역 세포의 능력에 대한 CpG 성숙의 영향을 결정하고, 이러한 반응을 로딩된 T 세포 APC와 비교하기 위해, 인간 PBMC 또는 단리된 T 세포에 질환-관련 항원을 SQZ에 의해 로딩하고, 항원-특이적 반응자 세포를 자극할 수 있는 능력을 측정하고, CpG 성숙 부재과 비교하였다.
방법
HLA-A02+ 공여자의 PBMC로부터 단리된 인간 HLA-A02+ PBMC 또는 T 세포 (10M 세포/mL)에 50 μM pp65 SLP (PPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDAND (서열식별번호: 51))의 존재 하에 SQZ (45 psi; PBMC에 대해 3 μm 협착부, T 세포에 대해 4.5 μm 사용)에 의해 로딩하였다. 이어서, PBMC를 pp65-특이적 CD8+ 반응자 세포와 함께 2:1 자극자:반응자의 비로 공동-배양하고, IL-2 (10 U/mL) +/- CpG 2006 (1 μM)의 존재 하에 배양하고, 비처리된 대조군 또는 최소 에피토프 (PP - 0.1 μM - NLVPMVATV (서열식별번호: 55))와 함께 밤새 인큐베이션된 2:1 자극자:반응자 세포와 비교하였다. 24시간 후, 각각의 조건으로부터 상청액을 수거하고, IFN-γ 생산 수준을 IFN-γ ELISA에 의해 평가하였다.
결과
도 15에 제시된 바와 같이, SQZ를 사용하여 인간 PBMC에 pp65 SLP를 로딩하는 것은 CpG의 존재 및 부재 하에 둘 다 SLP와 함께 인큐베이션된 세포 (세포내이입)보다 더 큰 IFN-γ 생산을 유도하였다. 추가로, CpG와 함께 공동-배양된 SQZ 로딩 조건들 사이에, 부재인 경우 대비 반응의 30% 증가가 존재하였다 (P<0.05; 상단). T 세포는 CpG 성숙에 반응하지 않으므로, T 세포 조건을 CpG과 함께 공동-배양된 PBMC 조건과 직접 비교하였고, PBMC 조건에서 거의 2배의 반응이 존재하는 것으로 밝혀졌다 (P<0.001; 하단). 종합하면, 이들 데이터는 CpG 공동-배양이 인간 PBMC의 항원-특이적 반응을 증진시키고, CpG 존재 하의 PBMC는 로딩된 T 세포와 비교할 때 이 반응을 도출하는데 있어서 거의 2배 더 강력하다는 것을 보여준다.
실시예 16
인간 상황에서 항원-특이적 반응의 활성화에 대한 아주반트 및 항원 농도의 효과를 조사하기 위해, 인간 PBMC에 SQZ에 의해 상이한 농도의 질환-관련 항원을 로딩하고, 항원-특이적 반응자 세포를 자극하는 능력을 측정하고, 상이한 아주반트 사이에서 비교하였다.
방법
HLA-A02+ 공여자로부터의 인간 PBMC (10M 세포/mL)에 상이한 농도의 pp65 SLP (PPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDAND (서열식별번호: 51); 1, 10 및 50 μM)의 존재 하에 SQZ (60 psi; 3.5 μm 협착부)에 의해 로딩하였다. 이어서, PBMC를 pp65-특이적 CD8+ 반응자 세포와 함께 2:1 자극자:반응자의 비로 공동-배양하고, IL-2 (10 U/mL) +/- CpG 2006 (1 μM) 또는 R837 (1 μg/mL; 이미퀴모드)의 존재 하에 배양하고, 비처리 대조군 또는 최소 에피토프(PP - 0.1 μM - NLVPMVATV (서열식별번호: 55)와 함께 밤새 인큐베이션된 2:1 자극자:반응자 세포와 비교하였다. 24시간 후, 각각의 조건으로부터 상청액을 수거하고, IFN-γ 생산 수준을 IFN-γ ELISA에 의해 평가하였다.
결과
도 16에 제시된 바와 같이, 아주반트의 존재 및 부재 하에 SQZ에 의해 1 μM pp65 SLP가 로딩된 인간 PBMC의 기능 반응 사이에 유의한 차이가 없었지만, 보다 높은 농도는 아주반트와의 공동-배양에 대해 유의한 이익을 보여주었다. 10 μM pp65 SLP 조건은 CpG와 함께 공동-배양된 PBMC의 반응에서, 부재인 경우 대비 약간의 그러나 유의하지 않은 증가를 나타내었지만, PBMC가 R837과 함께 공동-배양된 경우에 아주반트 부재에 비해 유의한 증가 (P<0.0001)가 있었다. 이러한 효과는 50 μM의 SLP를 사용하는 경우에 훨씬 더 두드러졌으며, 여기서 CpG 및 R837은 항원-특이적 반응의 유의한 증진을 유도하였다 (P<0.0001). 모든 경우에, R837이 일관되게 최고 반응을 유도하였지만, 어느 하나의 아주반트와의 공동-배양에 대해 이익 증가가 있었고, 이러한 효과는 보다 높은 농도의 pp65 SLP에 의해 강화되었다. 종합하면, 이들 데이터는 공동-배양 동안 아주반트의 사용이 인간 PBMC의 항원-특이적 반응을 증진시키고, 이러한 효과가 사용된 항원의 농도에 의존성이라는 것을 보여준다.
실시예 17
인간 상황에서 항원-특이적 반응의 활성화에 대한 아주반트 조성 및 성숙 기간의 효과를 조사하기 위해, 인간 PBMC에 SQZ에 의해 질환-관련 항원을 로딩하고, 상이한 인큐베이션 시간 동안 상이한 아주반트와 함께 성숙시키고, 항원-특이적 반응자 세포를 자극하는 능력을 측정하고, 상이한 아주반트 사이에서 비교하였다.
방법
HLA-A02+ 공여자로부터의 인간 PBMC (10M 세포/mL)에 SQZ (60 psi; 3.5 μm 협착부)에 의해 50 μM pp65 SLP (PPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDAND (서열식별번호: 51))의 존재 하에 로딩하였다. 이어서, PBMC를 CpG 2006 (1 μM), R837 (1 μg/mL; 이미퀴모드) 또는 R848 (1 μg/mL; 레시퀴모드)로 3 또는 24시간 동안 성숙시킨 후, pp65-특이적 CD8+ 반응자 세포와 함께 2:1 자극자:반응자의 비로 IL-2 (10 U/mL)의 존재 하에 공동-배양하고, 비처리 대조군 또는 최소 에피토프 (PP - 0.1 μM - NLVPMVATV (서열식별번호: 55))와 함께 밤새 인큐베이션한 2:1 자극자:반응자 세포와 비교하였다. 24시간 후, 각각의 조건으로부터 상청액을 수거하고, IFN-γ 생산 수준을 IFN-γ ELISA에 의해 평가하였다.
결과
도 17에 제시된 바와 같이, 아주반트의 존재 및 부재 하에 SQZ에 의해 pp65 SLP가 로딩된 인간 PBMC의 기능 반응 사이에 유의한 차이는 없었지만, 3 또는 24시간 동안 R848로 처리된 군이 가장 높은 전체 반응을 제공하였다. 이들 데이터는 SQZ 후의 PBMC 성숙에 아주반트를 사용하는 것이 항원-특이적 반응을 증진시킬 수 있지만, 이러한 효과가 시험된 모든 아주반트 및 시점에 대한 반응의 유의한 증가로 이어지는 것으로 발견되지 않았음을 나타낸다.
실시예 18:
항원-특이적 반응에 대한 SQZ-전 또는 SQZ-후 성숙의 영향을 정량화하기 위해, 뮤린 비장세포에 모델 항원을 로딩하고, CpG로 성숙시키고, 수용자 마우스 내로 1회 (프라임) 또는 2회 (프라임-부스트) 주사하고, 염증성 시토카인 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 상대 백분율을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
방법
제-1일 (성숙→SQZ) 또는 제0일 (SQZ→성숙)에, 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 비장세포를 수득하고, 제-1일 (성숙→SQZ)에 4시간 동안 CpG 1826 (R10 중 1 μM)로 성숙시킨 다음, 제0일 (SQZ→성숙)에 SQZ (30, 60, 90 psi; 4 μm 협착부)에 의해 Ova 단백질 (400 μg/mL)를 로딩하거나, 또는 제0일에 SQZ에 의해 Ova를 로딩한 후, CpG 1826과 함께 4시간 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (5마리/군)에게 제0일에 100 μL의 비장세포 (1x106개 세포/마우스)를 안와후로 주사하였다. 제7일에, 비장을 수거하고, SIINFEKL (서열식별번호: 54) (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율을 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 결정하였다.
결과
도 18에 제시된 바와 같이, Ova를 비장세포 내로 로딩하는데 사용된 압력의 증가가 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율의 유의한 증가를 유도하였지만 (P<0.05), 성숙된 후 SQZ가 로딩되었거나 또는 SQZ가 로딩된 후 성숙된 비장세포들 사이에 유의한 변화가 없었다. 이들 데이터는 생체내에서 항원-특이적 반응을 도출하는 능력에 대한 비장세포의 로딩/성숙 순서에 유의한 차이가 없음을 보여준다.
실시예 19:
백금-기반 화학요법과 조합하여 항원-로딩된 비장세포로 동물을 공동-처리하는 것이 이익인지 결정하기 위해, 항원-연관 종양 세포의 종양 성장 억제를 생체내 치료 모델에서 측정하고, 여러 비장세포 +/- 화학요법 치료 요법을 비교하고, 각각의 군에서의 마우스의 생존을 시간에 대해 플롯팅하였다.
방법
제0일에, C57BL/6J 암컷 마우스에게 TC1 종양 세포 (50k 세포/마우스; 10마리 마우스/군)를 제0일에 우측 후방 측복부에 주사하였다. 제5일 및 제7일에, 군에 따라 마우스에게 비히클 또는 시스플라틴 (5 mg/kg)을 주사하였다. 제9일에, 일부 동물에게 또한, 사전-복합체화된 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25)) + 20 μM 마우스 혈청 알부민 (MSA)을 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부)를 통해 로딩하고 ~16시간 동안 CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 인큐베이션한 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득된 비장세포의 프라임을 제공하였다. 제27일 및 제29일에, 비처리 마우스 또는 제9일에 비장세포 단독으로 처리된 마우스에게 약술된 군에 따라 1-2회 용량의 시스플라틴을 제공하였다. TC1 종양-보유 마우스의 각각의 군의 생존을 평가하고, 120일에 걸쳐 플롯팅하였다.
결과
도 19에 제시된 바와 같이, 식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정된 바와 같은 종양 성장을 비처리, E7-로딩된 비장세포 단독, 1-2회 용량의 시스플라틴 단독 또는 다양한 조합물로 처리된 마우스 사이에서 비교하고, 카플란-마이어 생존 곡선을 플롯팅하였다. 비장세포를 포함하는 4개의 처리군은 단지 비처리 동물, 또한 시스플라틴 단독을 투여받은 것에 비해 큰 생존 이점을 나타내었고, 50일을 초과하는 중앙값 생존 시간으로 나타났다 (비장세포+시스플라틴 처리의 경우에, 중앙값 생존 시간은 120일 후에도 여전히 도달되지 않았다). 특히 주목할 것은, 비장세포 단독 처리된 마우스는 비처리 및 시스플라틴 단독 군에 비해 ~40일 생존 이점을 가졌지만, 비장세포+시스플라틴 군은 비장세포 단독 군에 비해서도 더 큰 생존 이점을 가졌다. 이들 데이터는 SQZ에 의해 로딩된 비장세포가 HPV-연관 암의 치료 모델에서 생존 이점을 유도할 수 있고, 시스플라틴 화학요법의 추가가 비장세포 백신의 생존 이점을 더욱 강화하였음을 나타낸다.
실시예 20
임상-규모로 사용하여 개별 세포 하위세트에 대한 상이한 SQZing 파라미터의 전달 및 영향을 결정하기 위해, 인간 PBMC를 상이한 온도 및 압력에서 세포 스퀴징에 적용하고, 상이한 면역 세포 집단으로의 형광 화합물의 생존율 및 전달을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
방법
인간 PBMC에 형광-표지된 3 kDa 덱스트란 (100 μg/mL)을 SQZ (50-70 psi; 4.5 μm 폭)에 의해 실온에서 및 얼음 상에서 로딩하였다. 이어서, 로딩된 PBMC를 유동 세포측정법에 의해 생존율 및 전달에 대해 분석하였다.
결과
도 20a 및 b에 제시된 바와 같이, SQZ를 사용하여 인간 PBMC를 임상 규모로 로딩하는 것은 최대 80%의 세포 (얼음 상의 단핵구 - 도 20a)의 성공적인 전달을 여전히 허용하였고, 여기서 얼음 상에서 SQZ된 세포는 모든 세포 하위세트에 걸쳐 더 높은 백분율 (30-50% 증가)의 전달된 세포를 유도하였다. 보다 높은 압력 (70 psi)은 50 psi에 비해 가장 높은 백분율의 전달된 세포를 제공하였지만, 시험된 모든 경우에 생존율은 벌크 PBMC 집단에 대해 88% 초과였다. 종합하면, 이들 데이터는 SQZ가 혼합 집단 내의 여러 세포 유형으로 전달하는데 사용될 수 있고, 약간 더 높은 압력에서 얼음 상에서의 SQZing이 최상의 전체적인 전달을 유도하였음을 나타낸다.
실시예 21
치료 세팅에서 종양 성장 억제를 유도하는 항원-로딩된 비장세포의 능력에 대한 아주반트의 성숙 +/- 공동-주사의 영향을 결정하기 위해, 비장세포를 아주반트와 함께 성숙시키거나, 아주반트와 함께 공동-주사하거나, 또는 아주반트로 성숙 및 공동-주사하고, HPV E7-발현 TC1 종양 모델에서 시험하였으며, 여기서 종양 면적 및 생존을 시간에 대해 플롯팅하였다.
방법
제0일에, C57BL/6J 암컷 마우스에게 TC1 종양 세포 (50k 세포/마우스)를 우측 후방 측복부에 주사하였다. 제10일 (프라임)에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 인간 PBMC를 보다 잘 모방하기 위해 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 비장세포에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부, 실온)에 의해 사전 복합체화된 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25)) + 20 μM 마우스 혈청 알부민 (MSA)을 로딩하고, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (10마리/군)에게 제10일에 100 μL의 비히클 (PBS), 비장세포 (1M 세포/마우스) 또는 비장세포 + CpG (1 μg/마우스)를 안와후로 주사하였다. TC-1 종양 성장을 종양 이식 1주 후에 시작하여 1주 2회 측정하고, 32일 동안 비처리 마우스에서의 종양 성장과 비교하였다.
결과
식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정된 바와 같은 종양 성장을 비처리 군 (비장세포 부재) 및 아주반트 단독 (CpG), 비장세포 또는 비장세포 + 공동-주사된 아주반트로 처리된 군으로부터의 마우스 사이에서 비교하였다. 도 21a 및 b에 제시된 바와 같이, 비처리 동물과 CpG 단독으로 처리된 동물 (각각 28일 및 32일의 중앙값 생존)의 종양 성장 사이에 관찰가능한 차이가 없었지만, E7이 로딩된 미성숙 비장세포의 경우는 종양 성장 속도에서의 약간의 억제가 있었다. 그러나, 성숙된, 로딩된 비장세포 +/- CpG의 공동-주사를 제공받은 군은 종양 퇴행을 유도하였으며, 종양은 연구 과정에 걸쳐 그의 초기 최대치에 도달하지 않았다. 추가로, 비장세포-처리 군 중 어느 것도 제32일에 중앙값 생존점에 도달하지 않았다. 이들 데이터는 SQZ에 의해 로딩되고 아주반트로 성숙된 비장세포 (아주반트 공동-주사 존재 또는 부재)가 HPV-연관 암의 치료 모델에서 종양 퇴행을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 22:
상이한 아주반트와 함께 공동-주사된 항원-로딩된 비장세포가 항원-특이적 반응을 도출할 수 있는지를 결정하기 위해, 비장세포에 모델 항원을 로딩하고, CpG로 성숙시키거나, CpG와 함께 공동-주사하거나, 또는 CpG로 성숙시키고 CpG 또는 IFN-α와 함께 공동-주사하였으며, 여기서 마우스는 프라임 및 부스트를 받고, 염증성 시토카인 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 상대 백분율을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
방법
제0일에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물을 생성하였다. 이어서, 이들 혼합 비장세포에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부)에 의해 Ova 단백질 (400 μg/mL)을 로딩하고 배지 (R10) 단독 또는 CpG 1826 함유 배지 (1 μM) 중에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (5마리/군)에게 제1일에 100 μL의 비히클 (PBS), CpG로 성숙된 비장세포 (1x106개 세포/마우스), 1 μg CpG1826과 함께 공동-주사된 비장세포 또는 CpG로 성숙되고 CpG 또는 10000 U IFN-α와 함께 공동-주사된 비장세포를 안와후로 주사하였다. 제7일에, 수용자 마우스를 제0일에 프라임과 동일한 방식으로 부스팅하였다. 제14일에, 비장을 수거하고, SIINFEKL (서열식별번호: 54) (1 μg/mL)로 재자극하고, IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율을 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 결정하였다.
결과
도 22에 제시된 바와 같이, Ova-로딩된 비장세포로 처리된 마우스에 대한 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율은 비장세포가 CpG의 공동-주사의 존재 또는 부재 하에 4시간 동안 CpG로 성숙된 경우에 가장 높았고, 비처리 (P<0.0001), 비성숙 비장세포 (P<0.005), 뿐만 아니라 비성숙 비장세포 + 공동-주사된 CpG (P<0.05)와 비교할 때 유의한 증가가 있었다. IFN-γ+ CD8+ T 세포의 백분율이 약간 증가하였지만, CpG와 함께 공동-주사된 비성숙 비장세포 또는 IFN-α와 함께 공동-주사된 성숙 비장세포에 대해서는 비처리 대비 유의한 이익이 없었다. 이들 데이터는 항원-특이적 CD8+ T 세포에서 염증성 시토카인 생산의 유의한 증가를 위해 CpG 성숙 요건이 존재하고, CpG의 공동-주사가 IFNα의 공동-주사보다 약간 더 우수하다는 것을 보여준다.
실시예 23:
SQZ 가공 후 CpG 1826로의 성숙 후 PBMC에서의 B 세포 성숙 마커의 상향조절을 평가하기 위해, SQZ-가공된 뮤린 비장세포를 CpG1826과 함께 인큐베이션한 후 유동 세포측정법에 의해 B 세포 성숙 마커의 상향조절을 측정하였다.
방법
비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 이어서, 정교화된 뮤린 비장세포를 페이로드 없이 SQZ-가공하고, CD86 및 H-2Kb의 수준을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
결과
도 23a-g에서 평균 형광 강도 (MFI)에 의해 제시된 바와 같이, 4개의 독립적인 실험은 CpG 1826 성숙 후에 정교화된 뮤린 비장세포 내의 B220+ 세포 (B 세포) 상에서 증가된 CD86 및 뮤린 MHC-I (H-2Kb) 발현을 입증하였다. CpG1826로의 성숙 후 B220+ 세포 하위세트 (B 세포)에 대한 CD86 및 H-2Kb 발현의 증가는 SQZ-가공된 정교화된 뮤린 비장세포 (회색 막대) 및 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포 (흑색 막대) 둘 다에 대해 유사하였다. 이들 데이터는 SQZ-가공이 정교화된 뮤린 비장세포 내에서 B220+ 세포 (B 세포)의 성숙에 대한 CpG의 효과를 변경시키지 않았다는 것을 나타낸다.
실시예 24
아주반트와 함께 공동-주사된 항원-로딩된 PBMC가 혈청 시토카인 수준에서 전신 효과를 도출할 것인지를 결정하기 위해, 뮤린 비장세포에 HPV 항원을 로딩하고, CpG로 성숙시키고, CpG 공동-주사의 존재 또는 부재 하에 마우스 내로 도입하고, 마우스에서의 순환 시토카인을 멀티플렉스화 시토카인 검정에 의해 측정하였다.
방법
비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 정교화된 뮤린 비장세포에 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25))을 SQZ-로딩한 후, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스에게 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 (M-SQZ-비장세포-HPV)를 주사하거나, 또는 1 μg의 CpG 1826 IV (세포 부재), 또는 둘 다의 조합 (M-SQZ-비장세포-HPV + 1 μg 공동-주사된 CpG)을 주사하고, 순환 시토카인의 수준을 뮤린 멀티플렉스 (25-플렉스) 시토카인/케모카인 검정을 통해 혈액으로부터 측정하였다.
결과
도 24a-24d에 제시된 바와 같이, SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포로 면역화된 마우스 (도 24c, 24d)에서의 혈청 시토카인 농도의 범위는 모든 시점에서 비처리 대조군 마우스 (도 24a) 및 1 μg CpG 1826 IV를 주사한 마우스 (세포 부재) (도 24b)에서 측정된 혈청 시토카인 농도의 범위와 대등하였다. 이들 결과는 CpG 1826 공동-주사의 존재 또는 부재 하의 M-SQZ-비장세포-HPV로의 면역화가 비처리 또는 CpG (세포 부재) 대조군에 비해 염증유도 시토카인의 생산 또는 혈청 농도에서의 변화를 유도하지 않았음을 나타낸다. 모든 조건에서의 혈청 시토카인의 존재는 M-SQZ-비장세포-HPV로의 면역화가 혈청 시토카인 생산 또는 분비에서 전신 효과가 없었음을 추가로 입증하였다.
실시예 25
입양 전달 시 순환 동역학에 대한 PBMC의 SQZ-매개 가공의 영향을 조사하기 위해, E7 SLP가 SQZ-로딩된 뮤린 비장세포 (M-SQZ-비장세포-HPV) 및 비가공된 뮤린 비장세포를 각각 정맥내 주사를 통해 마우스에게 투여하고, 시간 경과에 따른 혈액 중 순환 공여자 뮤린 비장세포의 수를 유동 세포측정법에 의해 결정하였다.
방법
비장세포를 암컷 C57BL/6J (CD45.1) 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 이어서, 정교화된 뮤린 비장세포에 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25))를 SQZ-로딩한 후, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 암컷 CD45.2 B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ 수용자 마우스 (5-7마리 마우스/군) 내로 안와후로 주사하고, 혈액 (100 uL)을 하기 시점에 투여후 2주의 과정에 걸쳐 수용자 마우스로부터 수집하였다: 투여후 30분, 제1일, 제3일, 제7일 및 제15일. 시간 경과에 따른 정교화된 뮤린 비장세포의 순환 개수를 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
결과
도 25에 제시된 바와 같이, 입양 전달 시, M-SQZ-비장세포-HPV 및 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포가 면역화후 2주의 과정에 걸쳐 숙주 혈액에서 유사한 지속성을 나타냈다 (4회의 독립적인 실험으로부터 누적 데이터가 디스플레이됨). 일원 ANOVA 및 터키 사후 검정에 의해, 임의의 시점에서 2개의 군 사이에 통계적 차이는 없다. 이들 연구는 M-SQZ-비장세포-HPV의 순환 동역학이 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포와 통계적으로 상이하지 않음을 입증한다.
실시예 26
본 연구의 목적은 대조군 세포와 비교하여 M-SQZ-비장세포-HPV로 면역화시킨지 12일 후에 TC-1 종양의 종양 미세환경 중의 E7-특이적 CD8+ T 세포를 정량화하고, 종양 성장 모델에서 E7-특이적 CD8+ T 세포를 종양 클리어런스와 상관시키는 것이었다.
방법
제0일에, TC-1 세포 (100 μL의 PBS 중 50k/마우스)를 암컷 C57BL/6J 마우스의 우측 후방 측복부에 피하로 주사하였다 (7마리/군). 제16일에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 정교화된 뮤린 비장세포에 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25))를 SQZ-로딩하고, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 종양 보유 마우스 내로 안와후로 주사하였다. 제28일 (면역화 12일 후)에, 종양을 절제하고, 이로부터 단일-세포 현탁액을 생성하였다. 단일-세포 현탁액을 유동 세포측정법에 의해 종양-침윤 림프구 (TIL)에 대해 평가하였다.
결과
도 26a에 제시된 바와 같이, M-SQZ-비장세포-HPV로 면역화된 마우스는 면역화 12일 후 (즉, 종양 이식 28일 후)에 종양 내의 CD8+ T 세포의 백분율에서 대조군 마우스 (비처리)에 비해 44.7배 증가를 가졌다. M-SQZ-비장세포-HPV 처리된 동물에서, 대부분의 이들 CD8+ T 세포는 사량체 염색에 의해 결정된 바와 같이 E7 항원에 대해 특이적이었다 (CD8α+ 집단의 87.2 ± 6.0%) (도 26b). 종양에서 E-7 사량체 염색에 대해 양성인 세포의 백분율을 또한 정량화하였다 (도 26c). 이는 M-SQZ-비장세포-HPV로의 면역화가 비처리군과 비교하여 면역화 12일 후에 종양 미세환경에서 E7-특이적 CD8+ T 세포의 존재를 유의하게 증가시켰음을 입증한다 (765배 증가). 도 26d 및 26e에 제시된 바와 같이, E7 특이적 CD8+ T 세포의 이러한 증가는 또한 종양 질량에 대해 정규화하였을 때 관찰되었다. 이들 데이터는 TC-1 마우스 종양 모델에서 M-SQZ-비장세포-HPV로의 면역화가, 종양에 침윤하는 E7-특이적 CD8+ T 세포의 유의한 증가를 유도하였다는 것을 입증해준다. 종양 부피의 감소 (도 26f)와 함께 E7-특이적 CD8+ T 세포의 증가 (도 26a-e)는 M-SQZ-비장세포-HPV가 E7-특이적 이펙터 CD8+ T 세포를 확장시킴으로써 종양 부담을 감소시켰음을 지지하였다.
실시예 27
모델 항원 (Ova)으로 가공된 뮤린 비장세포가 생체 내에서 SIINFEKL (서열식별번호: 54) (오브알부민의 CD8-제한된 에피토프)의 직접 제시를 통해 OT-I CD8+ T 세포 증식을 자극하는지 여부를 입증하기 위해, MHC-I -/- 마우스를 수용자로서 사용하여 수용자 마우스 내의 전문 APC에 대한 항원 핸드-오프를 디커플링시켜, OVA로 SQZ-가공된 뮤린 비장세포에 의한 직접 제시의 검사가 가능하도록 하였다.
방법
제0일에, OT-I T 세포를 면역자기 분리에 의해 암컷 OT-I 마우스의 비장세포로부터 단리하였다. 단리된 OT-I T 세포를 CFSE로 염색한 후, 암컷 수용자 마우스 (WT 또는 MHC-I -/-)에 안와후로 주사하였다 (2.5*106개 세포/마우스). 다음으로, 비장세포를 암컷 CD45.1 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 정교화된 뮤린 비장세포에 Ova (400 μg/mL)를 SQZ-로딩하고, 37℃에서 4시간 동안 CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 인큐베이션하고, 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 수용자 마우스 (5*106개 세포/마우스) 내로 안와후로 주사하였다. 제3일에, 림프절 및 비장을 수용자 마우스로부터 절제하고, 유동 세포측정법 및 CFSE 염색을 사용하여 증식에 대해 평가하였다.
결과
도 27a-d에 제시된 바와 같이, 오브알부민이 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포가 제공된 C57BL/6J (WT) 및 MHC-I-/- 마우스 둘 다는 강건한 OT-I CD8+ T 세포 증식을 나타내었으며, 증식 지수는 비장 및 림프절 둘 다에서 4-6 범위였다. 오브알부민과 함께 인큐베이션된, 정교화된 뮤린 비장세포가 제공된 WT 및 MHC-I-/- 마우스 (인큐베이션 대조군, SQZ 가공 부재)는 OT-I CD8+ T 세포 증식이 거의 없거나 전혀 없었으며, 이는 생체내에서 CD8+ T 세포로의 직접 제시를 위해 정교화된 뮤린 비장세포 내로 항원을 도입하는데 SQZ 과정이 요구된다는 것을 입증한다. OT-I T 세포만이 제공된 마우스 (비자극된 입양 전달된 OT-I CD8+ T 세포에 대한 대조군)는 CD8+ T 세포의 증식을 유도하지 않았다. 이들 결과는 MHC-I 제시가 오브알부민으로 가공된, 전달된 정교화된 뮤린 비장세포에 제한된다는 것을 입증하며, 이는 후속 CD8+ T 세포 반응에서 역할을 하는 수용자 항원 제시 세포 (APC)에 대한 항원 핸드오프 가능성을 배제한다. MHC-I-/- 수용자에서의 OT-I CD8+ T 세포의 증식은 SQZ-가공된 정교화된 뮤린 비장세포가 항원을 직접 제시한다는 것을 입증한다.
실시예 28
본 연구는 공동-배양 시 항원-특이적 T 세포의 활성화를 평가함으로써 정교화된 뮤린 비장세포 (B 세포, T 세포, NK 세포 및 단핵구) 내의 4가지 세포 유형의 항원 제시 능력을 조사하였다.
방법
제0일에, 비장세포를 암컷 CD45.1 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 이어서, 정교화된 뮤린 비장세포를 Ova (400 μg/mL)의 존재 또는 부재 하에 SQZ-가공하고, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 4시간 후에, SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포의 분취액 (5*106개 세포/마우스)을 다양한 면역자기 분리에 적용하여 단핵구, B 세포, T 세포 및 NK 세포의 정제된 하위세트를 수득하였다. 다음으로, OT-I T 세포를 면역자기 분리에 의해 암컷 OT-I 마우스의 비장세포로부터 단리하였다. OT-I (1*105개 세포/웰)를 정교화된 뮤린 비장세포 또는 각각의 개별 세포 하위세트 (OVA의 존재 또는 부재 하에 SQZ-가공됨)와 함께 공동-배양하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군 (펩티드 스파이크)의 경우, SIINFEKL (서열식별번호: 54) 펩티드 (OVA257-264 - 1 μg/mL)를 OT-I 및 비가공된 정교화된 뮤린 비장세포와 함께 현탁액에 첨가하고, 공동-배양의 전체 지속기간 동안 유지하였다. 이어서, T 세포 활성화 마커 CD69를 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
결과
세포 표면 CD69 발현을 OT-I CD8+ T 세포 활성화의 판독치로서 사용하였는데, 이는 MHC-I의 맥락에서 제시된 펩티드 항원에 의한 T 세포 수용체의 결속 후에 이러한 마커의 표면 발현이 증가하기 때문이다. 도 28a-28e에 제시된 바와 같이, 정교화된 뮤린 비장세포 내의 모든 4가지 주요 세포 유형 (B 세포, T 세포, NK 세포, 및 단핵구)이 OT-I CD8+ T 세포에 항원을 직접적으로 제시할 수 있었다. 이들 데이터는 이들 세포 유형 각각이 항원 제시 세포로서 기능할 수 있음을 나타낸다. Ova로 SQZ-가공되고 CpG 1826로 성숙된 모든 세포 유형은 항원을 OT-I CD8+ T 세포에 제시하였고, 양성 대조군 (펩티드 스파이크)과 대등한 수준에서 OT-I T 세포의 활성화를 유도하였다.
실시예 29:
이 연구는 형광 표지된 HPV E6 또는 E7 SLP, 또는 그의 조합이 SQZ 가공을 통해 세포내로 전달될 수 있는지 및 임의의 전달된 SLP가 인간 PBMC의 시토졸에 국재화되는지 여부를 결정하였다.
방법
3명의 상이한 HLA-A*02+ 공여자로부터의 인간 PBMC에 얼음 상에서 50 μM FAM-표지된 E6, E7 또는 E6+E7의 조합물을 SQZ-로딩하고, 세포를 AF647-접합된 항-CD45 항체 (형질 막 마커) 염색 및 훽스트 33342 염색 (핵 염색)으로 공동-염색하였다. RPMI 단독으로 SQZ 가공된 인간 PBMC가 음성 대조군으로서 기능을 하였다. 펩티드의 국재화를 공초점 영상화에 의해 결정하였다. 구체적으로, 임의의 FAM-E6 및/또는 FAM-E7 SLP의 국재화를 주사 디스크 공초점 현미경 상에서 가시화하였다. 세포 상에서 Z-스택 분석을 수행하여 FAM-E6 및/또는 FAM-E7 SLP의 정확한 국재화를 결정하였다. 라인 스캔 트레이스를 각각의 샘플에 대한 Z-스택의 중간으로부터의 공초점 슬라이스에 대해 수행하고 (즉, 이러한 슬라이스의 영상은 세포의 중간을 묘사함), 이들 슬라이스를 분석하여 SQZ 가공 후 SLP의 임의의 세포내 전달을 확인하였다. 라인 스캔 트레이스를 위해, 명백한 FAM 신호를 갖는 세포를 분석을 위해 선택하였고, 여기서 라인 스캔은 형광 영상 상에 디스플레이된 흰색 선을 따라 세포의 중심 (백색 원)을 가로질러 추적되었다 (도 29a-29f, 상단 패널).
결과
SQZ 가공 후, FAM 형광 신호는 검사된 광학 슬라이스 내에서 형질 막에 의해 둘러싸인 것으로 관찰된 반면 (도 29b, 29d, 29f, 상단 3개의 패널), 음성 대조군에서는 FAM 신호가 검출되지 않았다 (도 29a, 29c, 29e, 상단 3개의 패널). 대부분의 SQZ-로딩된 세포는 광시야 영상에서 다양한 강도의 가시적인 세포내 SLP를 보였지만; 현미경의 동적 범위로 인해 보다 흐릿한 신호는 가시화하기 어려울 수 있었다. 라인 스캔 트레이스는 형질 막 신호만을 보인 음성 대조군의 트레이스 (도 29a, 29c, 29e, 하단 패널)와 비교할 때 대부분의 FAM 형광 신호가 형질 막 신호의 한계 내에서 검출되었음을 보여주었고 (도 29b, 29d, 29f, 하단 패널), 이는 FAM-E6 및 FAM-E7 SLP가 SQZ 가공 후에 세포내에 존재함을 나타낸다. 이는 일부 신호가 핵에 공동국재화되는 것으로 검출되기는 하였지만 (미도시), SQZ 과정이 각 SLP를 시토졸에 로딩한다는 것을 나타낸다. 특히, FAM 분자는 전형적으로 MHC-I 상의 제시를 위해 SLP의 프로테아솜 가공 동안 면역원성 에피토프로부터 절단된다. 따라서, 살아있는 계에서, FAM-표지된 SLP로부터의 FAM 신호는 이것이 가공되고 MHC-I 상에 제시됨에 따라 SLP로부터 언커플링될 것이다. 그러나, 이들 실험에서 인간 PBMC를 고정시킨 다음, SQZ 가공 직후에 염색하여 FAM-표지된 SLP의 이러한 가공을 최소화하였다. 이 공초점 영상화 연구는 SQZ 과정에 의한 인간 PBMC 내로의 형광 표지된 E6 및 E7 SLP (FAM-E6 및 FAM-E7)의 세포내 전달을 확증한다.
실시예 30
뮤린 B 세포에 로딩된 질환-관련 항원이 항원-특이적 T 세포의 증식을 유도할 수 있는지 결정하기 위해, gp100을 SQZ-가공에 의해 B 세포에 로딩하고, gp100-특이적 T 세포 (pmel CD8+ T 세포)의 증식을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
방법
뮤린 B 세포를 비처리 상태로 두거나 (NC), 실온에서 gp100 합성 긴 펩티드 (SLP)와 함께 인큐베이션하거나 (Incub. ctrl), gp100 SLP의 존재 하에 SQZ-가공하거나 (스퀴즈), 또는 37℃에서 1시간 동안 짧은 펩티드로 펄싱하였다 (PP). B 세포 (5x106개 세포/마우스)에 3 μg LPS를 공동-주사하여 2.5x106개 CFSE 표지된 pmel CD8+ T 세포를 또한 제공받은 마우스를 면역화시켰다. 증식을 측정하기 위해, pmel CD8+ T 세포에서의 CFSE 희석을 면역화 3일 후에 평가하였다 (군당 n=5 마우스).
결과
증가된 CFSE 희석 (도 30 좌측 패널) 및 증식 지수의 후속 정량화 (도 30 우측 패널)에 의해 제시된 바와 같이, SQZ-가공에 의해 gp100이 로딩된 뮤린 B 세포는 gp100-특이적 T 세포 증식의 유의한 증가를 유도하였다. SQZ-로딩된 B 세포는 비처리 대조군, 펩티드 펄스 대조군 또는 세포내이입 대조군에 비해 증식이 거의 5배 증가하였다 (도 30 우측 패널). 이들 데이터는 B 세포 내로의 항원의 SQZ-로딩이 SLP 또는 최소 에피토프와 함께 B 세포를 인큐베이션하는 것보다 항원-특이적 T 세포 증식의 유의하게 더 효율적인 자극을 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 31
합성 긴 펩티드 (SLP)가 SQZ-로딩된 비장세포가 보호 면역 반응을 프라이밍할 수 있는지를 결정하기 위해, 정교화된 비장세포를 E7 합성 긴 펩티드 (E7 SLP)의 존재 하에 SQZ-가공한 후, HPV16 E6/E7 발현 종양 세포주 TC-1의 이식 14일 및 7일 전 둘 다에 마우스에게 투여하였다.
방법
비장세포를 암컷 CD45.1 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 이어서, 정교화된 비장세포를 HPV16 E7에 대한 CD8 에피토프를 함유하는 SLP의 존재 하에 SQZ-가공하였다. 마우스를 제-14일에 프라이밍하고, 제-7일에 E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 비장세포로 부스팅하였다. 제0일에, 마우스에게 HPV16 E6/E7-양성 TC-1 종양 세포주를 우측 측복부에 피하로 이식하였다. 식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정된 종양 성장을 비처리군 (코호트 I 및 코호트 II) 및 HPV E7-로딩된 정교화된 비장세포로 처리된 군으로부터의 마우스 사이에서 비교하였다. 모든 면역화된 마우스는 60일 동안 무종양으로 유지되었고, 후속적으로 좌측 옆구리에 피하로 이식된 TC-1 종양 세포로 리챌린지하고, 좌측 옆구리에 종양 세포가 이식된 비처리 동물의 상이한 코호트와 비교하였다.
결과
도 31에 제시된 바와 같이, SQZ-로딩된 정교화된 비장세포로 처리된 모든 마우스 (15/15)는 1차 종양 챌린지로부터 보호된 반면, 비처리 동물에서는 항상 종양이 발생하였다. 리챌린지 시, SQZ-로딩된 정교화된 비장세포로 처리된 11/15마리의 마우스가 종양 성장으로부터 완전히 보호되었고, 이는 보호 면역 기억의 형성과 일관되었다.
실시예 32:
다양한 용량의 E7 SLP-로딩된 정교화된 비장세포를 사용하여 부스팅의 효과를 검사하기 위해, E7 합성 긴 펩티드로 스퀴징하였다. 이식 후 제10일에 프라임 단독 면역화로서, 또는 제10일, 제17일, 및 제24일에 투여된 프라임/부스트/부스트 요법으로서, 마우스에게 E7 SLP가 SQZ-로딩된 스퀴징된 비장세포의 지시된 용량을 투여하였다.
방법
제0일에, C57BL/6J 암컷 마우스에게 TC1 종양 세포 (50k 세포/마우스)를 우측 후방 측복부에 주사하였다. 제10일 (프라임)에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 인간 PBMC를 보다 잘 모방하기 위해 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 정교화된 비장세포에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부, 실온)를 통해 사전 복합체화된 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25)) + 20 μM 마우스 혈청 알부민 (MSA)을 로딩하고, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (10마리/군)에게 제10일에 100 μL의 비히클 (PBS), 비장세포 (1M 세포/마우스) 또는 비장세포 (1M 세포/마우스) + CpG (1 μg/마우스)를 안와후로 주사하였다.
부스터 면역화의 효과를 검사하기 위해, 치료상 면역화된 마우스의 코호트에게 제17일 및 제24일에 SQZ-로딩된 비장세포의 추가의 용량을 제공하였다 (프라임/부스트/부스트). 식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정된 바와 같은 종양 성장을 제50일까지 비처리 마우스와 지시된 처리군 사이에서 비교하였다.
결과
도 32에 제시된 바와 같이, 제10일에 투여된 0.1 x 106개 SQZ-로딩된 비장세포의 단일 용량은 면역 반응을 프라이밍하는데 보통의 효능을 가졌지만; 0.1 x 106개 세포의 추가의 용량을 사용한 부스팅은 치료 효능을 유의하게 증진시켰다. 다른 한편으로는, 1.0 x 106 세포의 투여량(들)은 단일 프라이밍 용량 프라임으로서 또는 프라임 및 부스트 요법 하에 투여되는 경우에 종양 성장을 지연시켰다.
실시예 33:
치료 세팅에서 종양 성장 억제를 유도하는 항원-로딩된 비장세포의 능력에 대한 아주반트의 성숙 +/- 공동-주사의 영향을 결정하기 위해, 비장세포를 아주반트로 성숙시키거나, 아주반트와 함께 공동-주사하거나, 또는 아주반트로 성숙 및 공동-주사하고, HPV E7-발현 TC1 종양 모델에서 시험하였으며, 여기서 종양 면적 및 생존을 시간에 대해 플롯팅하였다.
방법
제0일에, C57BL/6J 암컷 마우스에게 TC1 종양 세포 (50k 세포/마우스)를 우측 후방 측복부에 주사하였다. 제10일 (프라임)에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 인간 PBMC를 보다 잘 모방하기 위해 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 정교화된 비장세포에 SQZ (60 psi; 4 μm 협착부, 실온)를 통해 사전 복합체화된 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25)) + 20 μM 마우스 혈청 알부민 (MSA)을 로딩하고, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 암컷 C57BL/6J 수용자 마우스 (10마리/군)에게 제10일에 100 μL의 비히클 (PBS), 비장세포 (1M 세포/마우스) 또는 비장세포 + CpG (1 μg/마우스)를 안와후로 주사하였다. TC-1 종양 성장을 종양 이식 1주 후에 시작하여 1주에 2회 측정하고, 60일 동안 비처리 마우스에서의 종양 성장과 비교하였다.
결과
식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정된 바와 같은 종양 성장을 비처리 군 (비장세포 부재) 및 아주반트 단독 (CpG), 비장세포 또는 비장세포 + 공동-주사된 아주반트로 처리된 군으로부터의 마우스 사이에서 비교하였다. 도 33a 및 b에서, 비처리 동물의 종양 성장과 CpG 단독으로 처리된 동물 (각각 28일 및 32일의 중앙값 생존) 사이에 관찰가능한 차이가 없었지만, E7이 로딩된 미성숙 비장세포에 대한 종양 성장 속도에서 약간의 억제가 있었다 (중앙값 생존 35일). 그러나, CpG의 공동-주사의 존재 또는 부재 하에 성숙된, 로딩된 비장세포를 제공받은 군은 종양 퇴행을 유도하였으며, 종양은 연구 과정에 걸쳐 그의 초기 최대치에 도달하지 않았다 (각각 53 및 56일의 중앙값 생존기간). 이들 데이터는 SQZ에 의해 로딩되고 아주반트로 성숙된 비장세포 (아주반트 공동-주사 존재 또는 부재)가 HPV-연관 암의 치료 모델에서 종양 퇴행을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 34
마우스 비장세포 내에 함유된 주요 세포 하위세트에 의한 SQZ-전달 항원의 MHC-I 제시를 평가하기 위해, 정교화된 뮤린 비장세포에 OVA를 SQZ-로딩하고, 후속적으로 하위세트에서의 제시를 25-D1.16 항체를 사용하여 유동 세포측정법을 통해 분석하였다. 25-D1.16 항체는 오브알부민 (SIINFEKL (서열식별번호: 54))으로부터의 면역우성 CD8+ T 세포 에피토프를 제시하는 경우에만 마우스 세포의 표면 상의 H-2Kb (MHC-I)에 특이적으로 결합한다.
방법
비장세포를 암컷 CD45.1 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 이어서, 정교화된 비장세포를 카고 없이 SQZ-가공하거나 (SQZ 단독) 또는 오브알부민 단백질의 존재 하에 SQZ-가공하였다 (SQZ + OVA). 지시된 시점에, 각각의 지시된 세포 유형에 대해 H-2Kb 상의 SIINFEKL (서열식별번호: 54) 제시를 평가하기 위해 25-D1.16 항체를 포함하는 항체 패널로 세포를 염색하고, 유동 세포측정법 (T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구)에 의해 분석하였다.
결과
도 34에 제시된 바와 같이, OVA의 존재 하에 SQZ-가공된 세포에 대해, 항원 제시가 단핵구, T 세포, B 세포, 및 NK 세포에 대해 2- 및 4-시간 시점에 검출가능하였다. 이는 OVA로 SQZ-가공되지 않은 세포 (SQZ 단독) 대비 25D1.16 항체 염색으로부터의 증가된 신호로부터 명백하였다. SQZ-가공 2 및 4시간 후에, ≥40%의 형광 강도의 증가가 T 세포, B 세포 및 NK 세포에 대해 검출가능하였다. 단핵구의 경우, 형광 강도의 증가는 SQZ-가공 2 및 4시간 후에 ≥10%였다.
실시예 35
종양 항원 (HPV16 E7)으로 가공된 뮤린 비장세포가 E7-특이적 T 세포 증식을 자극하는지 여부를 입증하기 위해, 마우스를 E7 SLP가 SQZ-로딩된, 정교화된 뮤린 비장세포로 면역화시키고, 항원 재자극 시의 내인성 T 세포 반응을 세포내 시토카인 염색에 의해 측정하였다.
방법
비장세포를 암컷 CD45.1 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 정교화된 뮤린 비장세포에 E7 SLP (20 μM)를 SQZ-로딩하고, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 C57BL/6J 수용자 마우스에 마우스당 1백만개, 0.25백만개 또는 0.1백만개의 세포로 안와후로 주사하였다. 대조군 마우스는 비처리 상태로 두었다. 면역화 7일 후, 비장을 수용자 마우스로부터 수거하고, 생체외에서 E7 최소 에피토프로 재자극하였다. 세포내 시토카인 염색을 수행하여 E7 인식에 반응하여 인터페론-γ를 생산한 내인성 CD8 T-세포의 백분율을 결정하였다.
결과
도 35에 제시된 바와 같이, E7 SLP가 SQZ-로딩된 1백만개의 정교화된 뮤린 비장세포가 제공된 마우스는 생체외에서 수용자 마우스 비장을 E7 최소 에피토프로 자극한 경우에 IFN-γ 분비의 유의한 유도에 의해 예시되는 바와 같이 비장에서 강건한 E7-특이적 CD8+ T 세포 증식을 나타냈다. 생체외에서 수용자 마우스 비장을 E7 최소 에피토프로 자극한 경우에 IFN-γ의 관찰가능한 유도에 의해 예시되는 바와 같이, E7 SLP가 SQZ-로딩된 0.25백만개의 정교화된 뮤린 비장세포를 제공받은 마우스는 또한 비장에서 E7-특이적 CD8+ T 세포 증식을 나타내었다. 대조적으로, 생체 외에서 비장을 E7 최소 에피토프로 자극한 경우에 IFN-γ 분비의 결여에 의해 예시된 바와 같이, 비처리 동물은 어떠한 관찰가능한 E7-특이적 CD8+ T 세포 증식도 나타내지 않았다.
실시예 36
본 연구의 목적은 대조군 세포와 비교하여 M-SQZ-비장세포-HPV, 또는 펩티드 백신 (E7 SLP + CpG)을 사용한 면역화 12일 후에 TC-1 종양의 종양 미세환경 중의 E7-특이적 CD8+ T 세포를 정량화하고, 종양 성장 모델에서 E7-특이적 CD8+ T 세포를 종양 클리어런스와 상관시키는 것이었다.
방법
제0일에, TC-1 세포 (100 μL의 PBS 중 50k/마우스)를 암컷 C57BL/6J 마우스의 우측 후방 측복부에 피하로 주사하였다 (7마리/군). 제16일에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 정교화된 뮤린 비장세포에 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25))를 SQZ-로딩하고, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 종양 보유 마우스 내로 IV (안와후) 주사하였다. 펩티드 백신을 제공받는 마우스의 경우, 150 μg의 E7 SLP 및 50 μg의 CpG를 제16일에 수용자 마우스에게 피하 주사하였다 (마우스당). 대조군 마우스는 비처리 상태로 두었다.
제28일 (면역화 12일 후)에, 종양을 절제하고, 이로부터 단일-세포 현탁액을 생성하였다. 단일-세포 현탁액을 유동 세포측정법에 의해 종양-침윤 림프구 (TIL)에 대해 평가하였다.
결과
도 36a에 도시된 바와 같이, M-SQZ-비장세포-HPV로 면역화된 마우스는 면역화 후 12일 (즉, 종양 이식 후 제28일)에 펩티드 백신을 투여받은 마우스 또는 대조군 마우스와 비교하여 종양 미세환경 내에서 생존 세포 중에서 CD45+ 백혈구의 유의한 증가를 가졌다. 종양에서의 이들 백혈구 중에서, M-SQZ-비장세포-HPV로 면역화된 마우스는 대조군 마우스 (<5%) 및 펩티드 백신을 제공받은 마우스 (<20%)와 비교하여 유의하게 더 높은 백분율의 CD8+ T 세포 (>30%)를 가졌다 (도 36b). 또한, M-SQZ-비장세포-HPV 처리된 동물에서, 대다수의 이들 CD8+ T 세포 (>80%)는 대조군 마우스 (<5%) 및 펩티드 백신이 제공된 마우스 (<40%)와 비교하여 사량체 염색에 의해 결정 시에 E7 항원에 대해 특이적이었다 (도 36c). 도 36d에 제시된 바와 같이, M-SQZ-비장세포-HPV의 투여는 비처리 마우스 또는 펩티드 백신으로 처리된 마우스 (종양 성장이 억제되지 않음)와 비교하여 면역화 4일 후에 시작되는 종양 부피의 퇴행을 유도하였다. 종합하면, 이들 데이터는 TC-1 마우스 종양 모델에서 M-SQZ-비장세포-HPV로의 면역화가 종양에 침윤하는 E7-특이적 CD8+ T 세포의 유의한 증가를 유도하였음을 입증한다. E7-특이적 CD8+ T 세포의 증가 (도 36a-c)는 종양 부피의 감소와 함께 (도 36d), M-SQZ-비장세포-HPV가 E7-특이적 이펙터 CD8+ T 세포를 확장시킴으로써 종양 부담을 감소시켰다는 것을 지지하였다.
실시예 37
본 연구의 목적은 인간 PBMC의 SQZ-로딩의 규모확장성을 입증하는 것이다. 인간 PBMC를 제조 규모에서 덱스트란의 존재 하에 SQZ-가공하고, 페이로드 전달 및 PBMC 생존율을 평가하였다.
방법
건강한 HLA-A2+ 공여자의 말초 혈액을 함유하는 류코팩(Leukopak) (헤마케어(HEMACARE) ®)을 수득하고, PBMC를 현탁분리를 통해 단리하였다. 생성된 PBMC를 120mL RPMI 중에 재현탁시켜 7.20 x 107개 세포/mL의 농도로 PBMC 현탁액을 수득하였다. 그 후, RBC 현탁액을 (i) 인큐베이션하거나, 또는 (ii) 형광 덱스트란 (3 kDa 덱스트라 AF680)의 존재 하에 SQZ-가공 (50 psi, 4 μm 직경 협착부, 2-8℃)에 적용하였다. SQZ-가공된 세포를 1000mL의 RPMI에 넣어 SQZ-가공을 후속적으로 켄칭하였다. 인큐베이션 또는 SQZ-가공 2시간 후에, PBMC에 대한, 및 B 세포 (CD20+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+) 내의 각각의 세포 유형에 대한 생존율 뿐만 아니라 형광 덱스트란 전달을 유동 세포측정법을 통해 측정하였다.
결과
도 37a는 본 실시예에 기재된 제조 세팅에서 SQZ-가공된 세포의 수가 실험 세팅에서 SQZ-가공된 세포의 수보다 3 자릿수 초과로 더 많다는 것을 보여준다. 도 37b에 제시된 바와 같이, 인큐베이션 대조군과 SQZ-가공된 PBMC 사이에 생존율의 유의한 차이가 없었고, 둘 다 80% 초과의 생존율을 등록하였다. 도 37c에 제시된 바와 같이, 3kDa 덱스트란을 SQZ-가공을 통해 모든 PBMC의 약 80% 내로, 및 각각의 세포 유형의 적어도 60% 내로 전달하였다. SQZ-가공 후에 90% 초과의 CD14+ 단핵구에 덱스트란이 로딩되었다. 대조적으로, 덱스트란과 함께 인큐베이션된 PBMC의 10% 미만이 임의의 전달을 나타내었다. 종합하면, 결과는 SQZ-매개 전달이 생존율의 임의의 유의한 손실 없이 페이로드를 PBMC 내의 모든 성분 세포 유형 내로 효율적으로 전달하기 위해 제조 규모로 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 38
SQZ 전달에 의해 도입된 mRNA가 PBMC 하위세트에서 번역 및 발현될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 PBMC를 CD86 또는 IFNα2를 코딩하는 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공에 적용하고, CD86 또는 IFNα2의 단백질 발현을 유동 세포측정법 또는 세포내 염색에 의해 평가하였다.
방법
인간 PBMC를 비처리로 두거나 (NC), 또는 CD86 또는 IFNα2를 코딩하는 mRNA (SQZ) 또는 빈 페이로드 (빈 SQZ)의 존재 하에 SQZ-가공에 적용하였다. SQZ-로딩 후에, CD86-코딩 mRNA가 로딩된 PBMC를 유동 세포측정법에 의해 B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에서의 CD86 표면 발현에 대해 분석하였다. IFNα2-코딩 mRNA로 SQZ-가공된 PBMC에 대해, 로딩된 PBMC를 GOLGIPLUG/GOLGISTOP과 함께 4시간 동안 인큐베이션하여 분비를 정지시키고, 후속적으로 세포내 염색에 의해 B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에서의 IFNα2 발현에 대해 분석하였다.
결과
38a 및 38b에 제시된 바와 같이, 모든 PBMC 하위세트 집단은 비처리된 PBMC, 또는 빈 페이로드로 SQZ-가공된 대조군 PBMC와 비교하여, 각각의 코딩 mRNA의 전달 후에 각각의 세포의 적어도 약 40%에서 CD86 또는 IFNα2의 발현을 입증하였다. CD14+ 단핵구는 고유하게 CD86을 발현한다. 결과는 코딩된 단백질의 효율적인 발현을 위해 mRNA가 SQZ 전달에 의해 PBMC 내로 도입될 수 있음을 나타내었다.
실시예 39
SQZ 전달에 의해 도입된 후보 mRNA의 발현 정도 및 지속기간의 변동을 결정하기 위해, 인간 PBMC에 CD86 또는 4-1BBL을 코딩하는 mRNA를 SQZ-로딩하고, CD86 또는 4-1BBL의 상응하는 단백질 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
방법
인간 PBMC를 CD86 또는 IFNα2를 코딩하는 mRNA (SQZ) 또는 빈 페이로드 (빈 SQZ)의 존재 하에 SQZ-가공에 적용하였다. SQZ-로딩 후에, 각각의 mRNA가 로딩된 PBMC를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 각각의 코딩된 단백질의 발현을 B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에서 유동 세포측정법에 의해 24시간마다 측정하였다.
결과
도 39a 및 39b는 각각의 mRNA가 SQZ-로딩된 PBMC 내의 T 세포 하위세트 집단에서의 CD86 및 4-1BBL의 발현을 보여준다. 도 39a에 제시된 바와 같이, CD86-코딩 mRNA가 로딩된 PBMC 내의 T 세포 하위세트는 SQZ-가공 4시간 내지 48시간 후에 대조군과 비교하여 CD86+ 세포의 백분율의 유의한 증가를 나타냈고, CD86+ 세포의 백분율은 SQZ 가공 72시간 후에야 약간 감소하였다. 도 39b에 제시된 바와 같이, 4-1BBL-코딩 mRNA가 로딩된 PBMC 내의 T 세포 하위세트는 SQZ-가공 4시간 후에 4-1BBL+ 세포의 백분율의 중등도의 증가를 나타내었고, 4-1BBL+-양성 세포의 백분율은 단지 24시간의 인큐베이션 후에 현저하게 감소하였다. 결과는 상이한 후보 mRNA의 SQZ-전달이 코딩되는 단백질의 발현에 있어서 상이한 정도 및 지속기간을 유도할 수 있음을 나타내었다.
실시예 40:
mRNA의 번역-증진 변형이 SQZ 전달에 의해 도입된 후보 mRNA의 발현에 영향을 미칠 것인지 여부를 결정하기 위해, 인간 PBMC에 비변형된 eGFP-코딩 mRNA 또는 5-메톡시우리딘 백본 (5moU)을 갖는 GFP-코딩 mRNA를 SQZ-로딩하고, 상응하는 eGFP 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
방법
인간 PBMC를 0 내지 200 μg/mL의 비변형된 eGFP-코딩 mRNA 또는 5moU 백본을 갖는 GFP-코딩 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공에 적용하였다. SQZ-로딩 후에, 각각의 mRNA가 로딩된 PBMC를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, eGFP 발현을 B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에서 유동 세포측정법을 통해 평균 형광 강도 (MFI)에 의해 측정하였다.
결과
도 40은 비변형된 eGFP mRNA 또는 5moU-변형된 eGFP mRNA가 SQZ-로딩된 PBMC 내의 T 세포 하위세트 집단에서의 eGFP의 발현을 나타낸다. 도 40에 제시된 바와 같이, 비변형된 eGFP mRNA가 로딩된 PBMC 내의 T 세포 하위세트가 5moU-변형된 eGFP mRNA가 로딩된 것과 비교하여 더 높은 MFI를 나타냈다. 결과는 5moU RNA 변형이 SQZ 가공에 의해 전달된 mRNA의 번역 증진을 유도하지 않았음을 나타냈다.
실시예 41
SQZ 전달에 의해 도입된 mRNA에 의해 코딩되는 시토카인이 PBMC 하위세트에서 번역, 발현 및 분비될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 PBMC에 각각 IL-12, IFNα 또는 IL-2를 코딩하는 mRNA를 SQZ-로딩하고, IL-12, IFNα 또는 IL-2의 상응하는 분비를 ELISA에 의해 평가하였다.
방법
인간 PBMC를 비처리로 두거나 (NC), 또는 IL-12를 코딩하는 mRNA (50 μg/mL IL-12a 및 50 μg/mL IL-12b mRNA), IFNα를 코딩하는 mRNA (100 μg/mL) 또는 IL-2를 코딩하는 mRNA (SQZ) (100 μg/mL), 또는 빈 페이로드 (빈 SQZ)의 존재 하에 SQZ-가공에 적용하였다. SQZ-로딩 후, 시토카인-코딩 mRNA가 로딩된 각각의 PBMC를 이어서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 후속적으로 상청액을 ELISA에 의해 검정하여 각각의 시토카인의 발현 및 분비를 결정하였다.
결과
도 41에 제시된 바와 같이, 시토카인-코딩 mRNA가 SQZ-로딩된 PBMC는 각각 IL-12, IFNα 또는 IL-2의 유의한 발현 및 분비를 나타내었다. 결과는 코딩된 시토카인의 효율적인 발현 및 분비를 위해 mRNA가 SQZ 전달에 의해 PBMC 내로 도입될 수 있음을 나타내었다.
실시예 42.
도 42a에 도시된 바와 같이, 항원 제시 세포에 의한 T 세포 수용체 결속 (신호 1)에 더하여, 면역 반응의 활성화는 추가의 신호, 예컨대 공동-자극 수용체 활성화 (신호 2) 및 시토카인 수용체 결합 (신호 3)에 의해 증진된다. SQZ 전달에 의해 도입된 mRNA가 이들 증진 신호에 대해 단백질 이펙터로 번역 및 발현될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 PBMC에 각각 CD70 또는 4-1BBL을 코딩하는 mRNA (신호 2의 경우) 및/또는 IFNα2 또는 IL-2를 코딩하는 mRNA (신호 3)를 SQZ-로딩하였다. CD70 또는 4-1BBL의 상응하는 발현을 유동 세포측정법에 의해 측정한 반면, IFNα2 또는 IL-2의 상응하는 분비는 ELISA를 통해 배양 상청액으로부터 측정하였다.
방법
인간 PBMC를 비처리로 두거나 (NC), 또는 CD70, 4-1BBL, IFNα2 또는 IL-2를 코딩하는 각각의 mRNA의 존재 하에 SQZ-가공에 적용하였다. CD70 또는 4-1BBL을 코딩하는 mRNA로의 SQZ-가공 후에, 각각의 mRNA가 로딩된 PBMC를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 각각의 코딩된 단백질 CD70 또는 4-1BBL의 발현을 B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에서 유동 세포측정법에 의해 24시간마다 측정하였다. IFNα2 또는 IL-2를 코딩하는 mRNA를 SQZ-로딩한 후, 각각의 mRNA가 로딩된 PBMC를 이어서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 후속적으로 상청액을 최대 24시간의 시점에 수집하고, ELISA에 의해 검정하여 각각의 시토카인 IFNα2 또는 IL-2의 발현 및 분비를 결정하였다.
결과
도 42b에 제시된 바와 같이, 모든 로딩된 PBMC 하위세트 집단은 유동 세포측정법에 의해 검정된 평균 형광 강도의 증가에 의해 제시된 바와 같이, 각각의 코딩 mRNA의 전달 후에 각각 CD70 또는 4-1BBL의 발현을 나타내었다. CD70 또는 4-1BBL의 각각의 발현은 적어도 48시간 동안 유지되었다. PBMC 하위세트 중에서, 단핵구는 CD70 또는 4-1BBL을 코딩하는 SQZ-전달 mRNA의 보다 높은 발현을 나타내었다. 도 42c에 제시된 바와 같이, 시토카인-코딩 mRNA가 SQZ-로딩된 PBMC는 각각 IFNα2 또는 IL-2의 유의한 발현 및 분비를 나타냈고, 발현 및 분비는 SQZ 가공 후 적어도 24시간 동안 유지되었다. 결과는 면역 활성화에서 증진 신호를 제공하는 분자의 효율적인 발현 및 분비를 위해 mRNA가 SQZ 전달에 의해 PBMC 내로 도입될 수 있음을 나타내었다.
실시예 43:
도 42a에 제시된 바와 같이, 항원 제시 세포에 의한 T 세포 수용체 결속 (신호 1)에 더하여, 면역 반응의 활성화가 추가적인 신호 예컨대 공동-자극 수용체 활성화 (신호 2) 및 시토카인 수용체 결합 (신호 3)에 의해 증진된다. 신호 1 활성화가 SQZ 전달에 의해 도입되는 mRNA의 번역 및 발현에 영향을 주는지 여부를 결정하기 위하여, 정교화된 마우스 비장세포에 항원-비의존성 미토겐 유도 신호 1인 콘카나발린 A (ConA)의 자극의 존재 또는 부재 하에 후보 mRNA (eGFP 또는 CD86)를 SQZ-로딩하였다. 이어서, 상응하는 eGFP 및 CD86 발현을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
방법
비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 정교화된 뮤린 비장세포를 비자극 상태로 두거나 (ConA 부재) 또는 SQZ 가공 전 또는 후에 ConA로 자극하였다 (SQZ-전 자극 또는 SQZ-후 자극). SQZ-매개 전달을 위해, 정교화된 뮤린 비장세포를 eGFP 또는 CD86을 코딩하는 각각의 mRNA (100 μg/mL) 또는 빈 페이로드 (빈 SQZ)의 존재 하에 SQZ-가공에 적용하였다. eGFP 또는 CD86을 코딩하는 mRNA로의 SQZ-가공에 이어서, 각각의 mRNA가 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 각각의 코딩된 단백질 eGFP 또는 CD86의 발현을 B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에서 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
결과
도 43a에 제시된 바와 같이, ConA 자극 부재 하의 또는 SQZ-로딩 후 ConA에 의해 자극된 정교화된 뮤린 비장세포는 중등도의 eGFP 번역 및 발현을 나타냈고, T 세포 하위세트의 15.3% 내지 17.0%가 유동 분석에서 GFP+였다. SQZ-로딩 전에 ConA를 사용한 정교화된 뮤린 비장세포의 자극은 eGFP 번역 및 발현을 극적으로 증가시켰는데, 유동 분석에서 T 세포 하위세트의 91.1%가 GFP+였다. 유사하게, 도 43b에 제시된 바와 같이, ConA 자극 부재 하의 정교화된 뮤린 비장세포는 대조군에 비해 T 세포 하위세트 집단에서 CD86 MFI의 작은 증가에 의해 입증된 바와 같이 중등도의 CD86 번역 및 발현을 나타낸 반면, SQZ-로딩 전에 ConA를 사용한 정교화된 뮤린 비장세포의 자극은 대조군에 비해 T 세포 하위세트 집단에서 CD86 MFI의 유의한 증가에 의해 입증된 바와 같이 CD86 번역 및 발현을 극적으로 증가시켰다. 이들 결과는 ConA 자극이 SQZ 가공에 의해 전달된 후보 mRNA의 번역을 증진시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 44
도 42a에 제시된 바와 같이, 항원 제시 세포에 의한 T 세포 수용체 결속 (신호 1)에 더하여, 면역 반응의 활성화가 추가적인 신호 예컨대 공동-자극 수용체 활성화 (신호 2) 및 시토카인 수용체 결합 (신호 3)에 의해 증진된다. 뮤린 세포에서 신호 2 및 신호 3 이펙터를 코딩하는 mRNA의 발현 효능 및 동역학을 결정하기 위해, 정교화된 뮤린 비장세포에 후보 mRNA (신호 2의 경우 CD70, CD80, CD86 및 OX40L; 신호 3의 경우 IL-12, IL-2 및 IFNα2)를 SQZ-로딩하였다. CD70, CD80, CD86 또는 OX40L의 상응하는 발현을 유동 세포측정법에 의해 측정한 한편, IL-12, IL-2 및 IFNα2의 상응하는 분비는 ELISA를 통해 배양 상청액으로부터 측정하였다.
방법
비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. SQZ-매개 전달을 위해, 정교화된 뮤린 비장세포를 CD70, CD80, CD86 또는 OX40L을 코딩하는 각각의 mRNA, 또는 IL-12, IL-2 및 IFNα2를 코딩하는 mRNA (모두 100 μg/mL); 또는 빈 페이로드 (빈 SQZ)의 존재 하에 SQZ-가공에 적용하였다. 신호 2 이펙터를 코딩하는 mRNA로의 SQZ-가공에 이어서, 각각의 mRNA가 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 각각의 코딩된 단백질 CD70, CD80, CD86 또는 OX40L의 발현을 B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에서 48시간 동안 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 신호 2 이펙터를 코딩하는 mRNA로의 SQZ-가공에 이어서, 각각의 mRNA가 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 각각의 코딩된 단백질 CD70, CD80, CD86 또는 OX40L의 발현을 B 세포 (CD19+), T 세포 (CD3+), NK 세포 (CD56+) 및 단핵구 (CD14+)의 성분 세포 유형에서 48시간 동안 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 신호 3 이펙터 (시토카인)를 코딩하는 mRNA로의 SQZ-가공 후, 각각의 mRNA가 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 상청액을 48시간까지의 시점에 수집하고, 검정하여 각각의 시토카인 IL-12, IL-2 및 IFNα2의 발현 및 분비를 결정하였다 (도 44a).
결과
도 44b에 제시된 바와 같이, 신호 2 이펙터 (CD70, CD80, CD86 또는 OX40L)가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포는 각각 MFI의 주목할 만한 증가에 의해 예시된 바와 같이 각각의 단백질의 유의한 번역 및 발현을 나타냈다. CD86 발현은 SQZ 후 적어도 48시간까지 지속되는 것으로 관찰되었고, CD70 발현은 SQZ 48시간 후에 소멸된 반면, CD80 및 OX40K는 SQZ 24시간 후에 소멸되었다. 도 44c에 제시된 바와 같이, 신호 3 이펙터 (IL-12, IL-2 또는 IFNα2)가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포는 ELISA 검정에서 검출된 신호의 주목할 만한 증가에 의해 예시된 바와 같이 각각의 시토카인의 유의한 발현 및 분비를 나타내었다. IL-12 및 IL-2 분비는 SQZ 4시간 후에 유의하게 유도되었고, SQZ 24시간 후에 약간 증가하였고, 48시간에 약간 감소하였다. 대조적으로, IFNα2 분비는 SQZ 4시간 후에서 SQZ 24시간 후까지 유의하게 증가하였고, SQZ 48시간 후에 추가로 증가하였다. 이들 결과는 신호 2 및 신호 3 이펙터를 코딩하는 mRNA가 SQZ-매개 세포내 전달 후에 효과적으로 번역 및 발현되었음을 나타내었다. 그러나, 이들 이펙터의 발현의 지속기간 및 규모는 이펙터 분자에 의해 달라졌다.
실시예 45
뮤린 세포에서 신호 2 및 신호 3 이펙터를 코딩하는 mRNA가 시험관내 항원-특이적 면역 반응을 증진시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, ConA-활성화된 정교화된 뮤린 비장세포에 OVA 항원 뿐만 아니라 후보 mRNA (신호 2의 경우 CD70, CD80, CD86; 신호 3의 경우 IL-2)를 SQZ-로딩하였다. SQZ-로딩된 정교화된 비장세포를 후속적으로 OVA-특이적 OT-I CD8+ T 세포와 함께 공동-배양하고, OT-I T 세포의 활성화를 IFN-γ 분비의 ELISA를 통해 측정하였다.
방법
비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하고, 후속적으로 ConA로 활성화시켰다. SQZ-매개 전달을 위해, 정교화된 뮤린 비장세포를 (i) OVA (5 μg/mL) 뿐만 아니라 (ii) CD70, CD80, 또는 CD86을 코딩하는 각각의 mRNA, 또는 IL-12를 코딩하는 mRNA (모두 100 μg/mL)의 존재 하에; 또는 mRNA 부재 하에 SQZ-가공에 적용하였다. 신호 2 또는 신호 3 이펙터를 코딩하는 mRNA로의 SQZ-가공에 이어서, 각각의 mRNA가 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, OT-I CD8+ T 세포와 1:2 또는 1:4 비로 24시간 동안 공동-배양하였다. T 세포 활성화를 검정하기 위해, 상청액을 공동-배양물로부터 수집하고, IFN-γ ELISA 검정에 적용하였다 (도 45a).
결과
도 45b 및 45c에 제시된 바와 같이, 신호 2 이펙터 (CD70, CD80, 또는 CD86) 또는 신호 3 이펙터 (IL-12)와 조합된 OVA가 SQZ-로딩된 ConA-활성화된, 정교화된 뮤린 비장세포는 OVA-특이적 OT-I CD8+ T 세포의 활성화에서의 유의한 증가를 나타냈다. OVA-특이적 T 세포 반응의 증가는 CD86 mRNA 또는 IL-12 mRNA가 OVA와 함께 정교화된 뮤린 비장세포 내로 공동-전달된 경우에 특히 유의하였다. 이들 결과들은 신호 2 및 신호 3 이펙터를 코딩하는 mRNA가, 번역 및 발현될 수 있는 것에 더하여 항원-특이적 T 세포 반응을 활성화시키는데 있어서 항원 제시 세포로서의 뮤린 비장세포의 기능 능력을 증진시킬 수 있다는 것을 나타냈다.
실시예 46:
인간 PBMC에서 항원을 코딩하는 mRNA가 시험관내 항원-특이적 면역 반응을 증진시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 PBMC를 다양한 이용가능한 항원과 함께 SQZ-로딩하고, 후속적으로 각각의 항원-특이적 ASTARTE 반응자 T 세포와 함께 공동-배양하였으며, 여기서 반응자 T 세포의 활성화를 IFN-γ 분비의 ELISA를 통해 측정하였다.
방법
인간 PBMC를 (i) 비처리로 두거나 (NC), (ii) 1 μg/mL의 각각의 펩티드 항원 (PP, 양성 대조군)으로 펄싱하거나, (iii) 각각의 항원 (E7, HSV GF1, MART-1, pp65 또는 인플루엔자 M1)을 코딩하는 100 μg/mL mRNA의 존재 하에 SQZ-가공하거나, 또는 (iv) 빈 페이로드 (빈 SQZ)로 SQZ-가공하였다. 웨스턴 블롯을 사용하여 SQZ-가공 4시간 및 24시간 후에 로딩된 mRNA의 번역을 분석하였다. 면역 활성화를 검정하기 위해, SQZ-로딩 후에, 각각의 항원-코딩 mRNA가 로딩된 PBMC를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 각각의 항원-특이적 ASTARTE 반응자 T 세포와 함께 24시간 동안 공동-배양하였다. T 세포 활성화를 측정하기 위해, 상청액을 공동-배양물로부터 수집하고, IFN-γ ELISA에 적용하였다.
결과
도 46b 및 46c에 제시된 바와 같이, HPV16-E7 및 인플루엔자 M1을 코딩하는 mRNA의 SQZ-매개 전달 후에, 웨스턴 블롯 상의 명확한 밴드에 의해 제시된 바와 같이 각각의 항원이 번역되고 발현되었다. T 세포 활성화 검정 (도 46a)의 경우, E7, HSV GD1, MART-1 또는 pp65 항원을 코딩하는 mRNA가 SQZ-로딩된 PBMC는, 공동-배양 후 IFN-γ 분비의 결여에 의해 입증된 바와 같이, 펩티드 펄스 (PP)에 적용된 PBMC와 비교하여 관찰가능한 반응자 T 세포 활성화를 유도하지 않았지만; 인플루엔자 M1을 코딩하는 mRNA가 SQZ-로딩된 PBMC는, 펩티드 펄스 (PP)에 적용된 PBMC와 비교하여 공동-배양 후 IFN-γ 분비의 유의한 유도에 의해 관찰된 바와 같이, M1-특이적 T 세포 활성화를 강하게 유도하였다. 이들 결과는, 현재의 프로토콜을 사용하여, 항원-코딩 mRNA가 SQZ-매개 전달에 사용되어 항원 제시를 용이하게 하고 전부는 아니지만 일부 항원에 대한 항원-특이적 T 세포 반응을 자극할 수 있음을 나타내었다.
실시예 47
뮤린 면역 세포가 시험관내에서 항원-특이적 반응을 활성화시키는 것을 용이하게 하는데 있어서 SQZ-전달된 항원 코딩 mRNA 및 펩티드 항원의 효능을 비교하기 위해, 전체 뮤린 비장세포에 OVA 단백질 또는 OVA-코딩 mRNA를 SQZ-로딩하고, 후속적으로 OVA-특이적 OT-I CD8+ T 세포와 함께 공동-배양하였으며, 여기서 OT-I T 세포의 활성화를 CD69 발현을 통해 측정하였다.
방법
비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, (i) OVA을 코딩하는 mRNA (0 내지 250 nM), 또는 OVA 단백질 (0 내지 1250nM)의 존재 하에, 실온 하에 60 psi에서 3.5 μm 폭, 30 μm 높이 협착부를 사용하여 SQZ-가공에 적용하였다. 웨스턴 블롯을 사용하여 SQZ-가공 4시간 및 24시간 후에 로딩된 mRNA의 번역을 분석하였다. 면역 활성화를 검정하기 위해, SQZ-로딩 후, 각각의 OVA-코딩 mRNA 또는 OVA 단백질이 로딩된 비장세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, OT-I CD8+ T 세포와 함께 24시간 동안 공동-배양하였다. T 세포 활성화를 측정하기 위해, OT-I CD8+ T 세포 상의 CD69 발현을 유동 세포측정법을 통해 측정하였다 (도 47a).
결과
도 47b에 제시된 바와 같이, 뮤린 비장세포에서 동일한 각각의 몰농도로 SQZ-로딩된 경우, OVA-코딩 mRNA가 OT-I CD8+ T 세포의 활성화를 용이하게 하는데 있어서 OVA 단백질보다 훨씬 더 강력하였다 (~20배 더 강력하였다). < 50nM OVA mRNA의 존재 하에 SQZ-가공된 비장세포는 공동-배양 시 유의한 백분율의 CD69 발현 OT-I CD8+ T 세포를 유도하였다. 비교하면, 적어도 1000 nM OVA 단백질의 존재 하에 SQZ-가공된 비장세포는 공동-배양 시 유사한 백분율의 CD69-발현 OT-I CD8+ T 세포를 달성하였다. 이들 결과는 적어도 OVA 항원에 대해, 항원-코딩 mRNA의 비장세포 로딩이 항원-특이적 T 세포 반응의 시험관내 활성화를 용이하게 하는 것에서 단백질보다 더 효과적임을 나타냈다.
실시예 48
치료 세팅에서 종양 성장 억제에 대한 항원-로딩된 비장세포의 능력에 대한 면역 체크포인트 억제제와의 조합의 효과를 결정하기 위해, HPV E7-발현 TC1 종양 모델이 이식된 마우스에게 항-CTLA4 주사를 투여하거나, E7 SLP가 SQZ-로딩된 정교화된 뮤린 비장세포 (M-SQZ-비장세포-HPV)를 투여하거나, 또는 둘 다의 조합물을 투여하고, 종양 부피 및 생존을 시간에 대해 플롯팅하였다.
방법
제0일에, C57BL/6J 암컷 마우스에게 TC1 종양 세포 (50k 세포/마우스)를 우측 후방 측복부에 주사하였다. 제10일 (프라임)에, 비장세포를 암컷 C57BL/6J 공여자 마우스의 비장으로부터 수득하고, 인간 PBMC를 보다 잘 모방하기 위해 음성 면역자기 분리에 의해 그의 B 세포가 고갈된 비장세포와 조합하여, 인간 PBMC를 보다 대표하는 비장세포 조성물 (즉, 정교화된 비장세포)을 생성하였다. 정교화된 비장세포에 20 μM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (서열식별번호: 25))를 SQZ-로딩하고, CpG 1826 (R10 중 1 μM)과 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 로딩된 정교화된 뮤린 비장세포를 종양 보유 마우스 (M-SQZ-PBMC-HPV) 내로 IV (안와후) 주사하였다 (마우스당 1x106개 세포). 그 후, 로딩된 비장세포가 제공된 마우스 및 로딩된 비장세포 부재 하의 마우스의 코호트에게 항-CTLA4 주사를 지시된 스케줄로 투여하였다 (TC-1 이식 후, Sch.1: 제11일, 제14일, 제17일; Sch. 2: 제17일, 제20일, 제24일; Sch.3: 제24일, 제28일, 제31일). 대조군 마우스는 비처리 상태로 두었다. (군당 10마리의 마우스) (도 48a, 48b). TC-1 종양 성장을 종양 이식 1주 후에 시작하여 1주에 2회 측정하고, 60일 동안 비처리 마우스에서의 종양 성장과 비교하였다.
결과
식 ((길이 x 폭2)/2)에 의해 측정된 바와 같은 종양 성장을 대조군 마우스 (비처리)와 정교화된 E7-로딩된 비장세포로 처리된 군 (M-SQZ-PBMC-HPV), 항-CTLA4로 처리된 군 (α-CTLA4) 및 둘 다의 조합물로 처리된 군 (M-SQZ-PBMC-HPV + α-CTLA4) 사이에 비교하였다. 도 48c에 제시된 바와 같이, 대조군 마우스 및 항-CTLA4 단독으로 처리된 마우스 (Sch. 1 α-CTLA4; Sch. 2 α-CTLA4; Sch. 3 α-CTLA4)에서의 종양 성장 사이에 관찰가능한 차이가 없었지만, E7-로딩된 비장세포 (M-SQZ-PBMC-HPV)로 프라이밍된 마우스에 대해서는 종양 성장 속도에서의 주목할 만한 억제가 있었다. 특히, E7-로딩된 비장세포 및 항-CTLA4 투여의 조합이 TC-1 종양 성장을 억제하는데 있어서 유의한 상가적 효과를 나타냈다 (M-SQZ-PBMC-HPV + α-CTLA4) (도 48c).
비처리 마우스, 항-CTLA4 단독으로 처리된 마우스 (Sch. 1 α-CTLA4; Sch. 2 α-CTLA4; Sch. 3 α-CTLA4) 또는 E7-로딩된 비장세포 (M-SQZ-PBMC-HPV)로 프라이밍된 마우스는 모두 제40일 또는 그 이전에 종양이 발생하였다 (도 48d). 비교해 보면, E7-로딩된 비장세포 및 항-CTLA4 투여의 조합 (M-SQZ-PBMC-HPV + α-CTLA4)을 제공받은 마우스는 억제된 또는 지연된 종양 발생을 나타냈는데, 2, 1, 및 3마리의 마우스가 각각 M-SQZ-PBMC-HPV + Sch.1 α-CTLA4, M-SQZ-PBMC-HPV + Sch.2 α-CTLA4, 및 M-SQZ-PBMC-HPV + Sch.3 α-CTLA4에 대해 제60일에 종양이 없었다 (도 48e).
종양 성장 억제에서의 결과와 일치하게, E7-로딩된 비장세포 및 항-CTLA4 투여의 조합은 또한 TC-1 보유 마우스의 생존을 개선시키는데 있어서 상가적 효과를 나타내었다. 비처리된 마우스는 38일의 중앙값 생존을 나타낸 반면, 항-CTLA4 단독으로 처리된 마우스(Sch. 1 α-CTLA4; Sch. 2 α-CTLA4; Sch. 3 α-CTLA4)는 각각 32, 33 및 35.5일의 중앙값 생존을 나타내었다. E7-로딩된 비장세포 (M-SQZ-PBMC-HPV)로 프라이밍된 마우스는 50일의 약간 개선된 중앙값 생존을 나타내었다. 주목할만하게, TC-1 이식 후 제60일에 E7-로딩된 비장세포 및 항-CTLA4 투여 (M-SQZ-PBMC-HPV + α-CTLA4)의 조합을 제공받은 마우스는 중앙값 생존이 도달되지 않았다 (도 48f).
이들 결과는 항원-로딩된 비장세포 및 면역 체크포인트 억제제의 치료 조합이 종양 성장을 억제하고 생존을 개선하는데 있어서 상가적 이익을 제공하였음을 나타내었다.
서열 목록
SEQUENCE LISTING
<110> SQZ BIOTECHNOLOGIES COMPANY
<120> DELIVERY OF BIOMOLECULES TO PBMCs TO MODIFY AN IMMUNE RESPONSE
<130> 75032-20022.41
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/948,732
<151> 2019-12-16
<150> US 62/933,304
<151> 2019-11-08
<150> US 62/886,799
<151> 2019-08-14
<150> US 62/841,089
<151> 2019-04-30
<150> EP 19161964.2
<151> 2019-03-11
<150> US 62/812,225
<151> 2019-02-28
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 39
Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
20 25 30
Ile Val Thr
35
<210> 40
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 40
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 41
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 41
Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser
20 25 30
Gln Lys Pro
35
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 42
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 43
Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 44
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 45
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 45
Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys
1 5 10 15
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
20 25
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 46
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr
1 5 10 15
Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
20 25
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 47
His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg
20 25
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 48
Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu
1 5 10 15
Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 49
Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg
1 5 10 15
His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 50
Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
1 5 10 15
Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
20 25 30
<210> 51
<211> 35
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val
1 5 10 15
Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu Phe Phe Trp Asp
20 25 30
Ala Asn Asp
35
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg
1 5 10
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp
1 5 10 15
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 54
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 55
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
Claims (93)
- 항원을 포함하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성인 복수의 변형된 PBMC.
- 제1항에 있어서, 항원이 암 항원, 감염성 질환 항원 또는 바이러스-질환 연관 항원인 복수의 변형된 PMBC.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중 2종 이상을 포함하는 복수의 변형된 PBMC.
- 항원을 포함하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
- 제4항에 있어서, 항원이 암 항원, 감염성 질환 항원 또는 바이러스-질환 연관 항원인 조건화된 복수의 변형된 PMBC.
- 항원 및 아주반트를 포함하며, 여기서 항원은 변형된 PBMC에 대해 외인성인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포, B 세포, NK 세포 또는 단핵구 중 2종 이상을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 조건화된 복수의 PBMC.
- PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션한 다음, 항원을 PBMC에 도입하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC.
- 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원을 코딩하는 핵산이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원을 코딩하는 핵산과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고,
여기서 핵산은 PBMC에서 발현되어 항원을 생산하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 제12항 또는 제13항에 있어서, 방법이 변형된 PBMC를 조건화하기 위해 아주반트와 함께 인큐베이션하기 전에, 세포 현탁액으로부터 항원 또는 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 단리하는 것을 추가로 포함하는 것인, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
- 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고;
이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC:
a) 항원을 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 제10항, 제11항, 제15항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이
항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계
를 추가로 포함하는 것인, 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 투입 PBMC 및/또는 변형된 PBMC를, 추가의 인큐베이션 단계 없이 제조된 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
- 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 직경이 복수의 투입 PBMC의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인 복수의 변형된 PBMC.
- 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 직경이 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인 복수의 변형된 PBMC.
- 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 직경이 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm인 복수의 변형된 PBMC.
- 제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액이 다중 협착부를 통과하고, 여기서 다중 협착부는 직렬 및/또는 병렬로 배열되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
- 제8항, 제9항, 제12항 내지 제14항, 제16항 및 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC가, 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
- 제8항, 제9항, 제12항 내지 제14항, 제16항 및 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC가, 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 2시간 내지 약 10시간 동안 또는 약 3시간 내지 약 6시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 및/또는 아주반트가 복수의 PBMC 내의 세포의 적어도 약 70%에 존재하는 것인 복수의 변형된 PBMC.
- 제6항 내지 제9항 및 제12항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효능제, TLR4 효능제 또는 TLR 9 효능제인 복수의 변형된 PBMC.
- 제6항 내지 제9항 및 제12항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)인 복수의 변형된 PBMC.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 질환-연관 항원인 복수의 변형된 PBMC.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원인 복수의 변형된 PBMC.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 공동-자극 분자 중 1종 이상의 발현을 증가시키도록 추가로 변형되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
- 제32항에 있어서, 공동-자극 분자가 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155 또는 CD112인 복수의 변형된 PBMC.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1종 이상의 시토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
- 제34항에 있어서, 시토카인이 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α 또는 IL-21인 복수의 변형된 PBMC.
- 제4항 내지 제9항, 제12항 내지 제14항, 제16항 및 제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공동-자극 분자가 복수의 비변형된 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 공동-자극 분자는 CD80 및/또는 CD86인 복수의 변형된 PBMC.
- 제36항에 있어서, CD80 및/또는 CD86이 복수의 조건화되지 않은 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 상향조절되는 것인 복수의 변형된 PBMC.
- 제4항 내지 제9항, 제12항 내지 제14항, 제16항 및 제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 조건화되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 증가된 발현을 갖는 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
- 제38항에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 발현이 복수의 조건화되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 증가되는 것인 조건화된 복수의 변형된 PBMC.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물.
- 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물.
- 수술, 요법 또는 진단에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물.
- 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관 질환의 치료에 사용하기 위한, 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항의 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물.
- 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 PBMC가 면역 체크포인트 억제제의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 투여 후에 투여하기 위한 것인 조성물.
- 제44항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) 또는 BTLA 중 어느 하나에 대해 표적화된 것인 조성물.
- 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 PBMC가 치료제의 투여 전에, 그와 공동으로 또는 투여 후에 투여되는 것인 조성물.
- 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스-연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 포함하는 조성물의 용도이며, 여기서 조건화된 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 용도:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 단계;
b) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 투여하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 단계;
b) 항원을 복수의 PBMC에 도입하는 단계; 및
c) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 투여하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계. - 제50항에 있어서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와의 인큐베이션 전에 세포 현탁액으로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
d) 개체에게 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 항원을 포함하는 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 것인 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및
d) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법:
a) 항원을 포함하는 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계;
c) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계; 및
d) 개체에게 아주반트를 투여하는 단계. - 제52항 및 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 방법. - 개체에게 항원과 회합된 복수의 PBMC를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이며, 여기서 복수의 변형된 PBMC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 방법:
a) 항원이 투입 PBMC의 세포 표면과 회합되도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원과 회합된 복수의 PBMC를 생성하는 단계; 및
b) 개체에게 복수의 변형된 PBMC를 투여하는 단계. - 제48항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응의 자극이 개체에서 암, 감염성 질환 또는 바이러스 연관 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인 방법.
- 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 PBMC가 시토카인의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
- 제61항에 있어서, 시토카인이 IL-15인 방법.
- 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 또는 조건화된 복수의 PBMC가 면역 체크포인트 억제제의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
- 제63항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, VISTA, 및 TIM-3 중 어느 하나에 대해 표적화된 것인 방법.
- 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 또는 조건화된 복수의 PBMC가 치료제의 투여 전에, 그와 공동으로, 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법.
- 제65항에 있어서, 치료제가 화학요법제인 방법.
- PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 것을 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 PBMC를 생성하는 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계;
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계; 및
c) 항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 제68항에 있어서, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 아주반트와의 인큐베이션 전에 세포 현탁액으로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원 및 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원 및 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원 및 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 투입 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 복수의 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 조건화된 복수의 투입 PBMC를 생성하는 단계;
b) 조건화된 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
c) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 조건화된 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원을 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 아주반트를 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 항원이 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 항원과 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 방법:
a) 항원을 포함하는 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부에 통과시키고, 여기서 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 PBMC의 직경의 함수이며, 이에 의해 아주반트가 통과하기에 충분히 큰 투입 PBMC의 교란을 유발하여 복수의 교란된 투입 PBMC를 형성하는 단계; 및
b) 아주반트가 교란된 투입 PBMC에 진입하도록 하기에 충분한 시간 동안 복수의 교란된 투입 PBMC를 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계. - 제70항, 제71항, 제73항 및 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
항원을 포함하는 변형된 PBMC가 조건화되기에 충분한 시간 동안 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 복수의 변형된 PBMC를 제2 아주반트와 함께 인큐베이션하고, 이에 의해 항원 및/또는 아주반트를 포함하는 조건화된 복수의 변형된 PBMC를 생성하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제48항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 투입 PBMC 및/또는 변형된 PBMC를, 추가의 인큐베이션 단계 없이 제조된 상응하는 변형된 PBMC와 비교하여 변형된 PBMC의 생존율 및/또는 기능을 증진시키는 작용제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제50항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 직경이 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인 방법.
- 제50항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 직경이 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm인 방법.
- 제50항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 PBMC를 포함하는 세포 현탁액이 다중 협착부를 통과하고, 여기서 다중 협착부는 직렬 및/또는 병렬로 배열되는 것인 방법.
- 제48항 내지 제51항, 제53항, 제58항, 제60항 내지 제69항, 제72항 및 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC를, 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 1시간 내지 약 24시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것인 방법.
- 제48항 내지 제51항, 제53항, 제58항, 제60항 내지 제69항, 제72항 및 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 PBMC를, 변형된 PBMC가 조건화되도록 약 2시간 내지 약 10시간 또는 약 3시간 내지 약 6시간 동안 아주반트와 함께 인큐베이션하는 것인 방법.
- 제48항, 제50항 내지 제58항, 제60항 내지 제69항 및 제71항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), LPS, IFN-α, STING 효능제, RIG-I 효능제, 폴리 I:C, R837, R848, TLR3 효능제, TLR4 효능제 또는 TLR 9 효능제인 방법.
- 제48항, 제50항 내지 제58항, 제60항 내지 제69항 및 제71항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)인 방법.
- 제48항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 질환-연관 항원인 방법.
- 제84항에 있어서, 항원이 인간 유두종바이러스 (HPV) 항원인 방법.
- 제48항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 공동-자극 분자 중 1종 이상의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된 것인 방법.
- 제86항에 있어서, 공동-자극 분자가 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, CD112 또는 scFv 항-CD28인 방법.
- 제48항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 시토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형되는 것인 방법.
- 제88항에 있어서, 시토카인이 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, 또는 IL-21인 방법.
- 제48항 내지 제51항, 제53항, 제58항, 제60항 내지 제69항, 제71항 및 제73항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공동-자극 분자가 복수의 투입 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 상향조절되고, 여기서 공동-자극 분자는 CD80 또는 CD86인 방법.
- 제90항에 있어서, CD80 및/또는 CD86이 복수의 조건화되지 않은 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 조건화된 복수의 변형된 PBMC의 B 세포에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 상향조절되는 것인 방법.
- 제48항 내지 제51항, 제53항, 제58항, 제60항 내지 제69항, 제71항 및 제73항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 조건화된 변형된 PBMC가 복수의 조건화되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 증가된 발현을 갖는 것인 방법.
- 제92항에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10 또는 TNF-α 중 1종 이상의 발현이 복수의 조건화되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배 또는 10배 초과만큼 증가되는 것인 방법.
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