TW202045717A - 投遞生物分子至周邊血液單核細胞（ｐｂｍｃ）以調節免疫反應 - Google Patents
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Abstract
本申請案提供包含抗原之周邊血液單核細胞(PBMC)、製造該PBMC之方法及使用該PBMC以諸如調節個體之免疫反應之方法。在一些實施態樣中，該PBMC係藉由在佐劑存在下培育該PBMC而經調理。
Description
本揭露大抵關於包含抗原及/或佐劑之周邊血液單核細胞(PBMC)、製造該PBMC細胞之方法及使用該PBMC以諸如調節個體之免疫反應之方法。
[相關申請案的交互參照]
本申請案主張2019年2月28日提出之美國臨時申請案第62/812,225號、2019年3月11日提出之歐洲專利申請案申請案第19161964.2號、2019年4月30日提出之美國臨時申請案第62/841,089號、2019年8月14日提出之美國臨時申請案第62/886,799號、2019年11月8日提出之美國臨時申請案第62/933,304號、及2019年12月16日提出之美國臨時申請案第62/948,732號之權益，該等申請案各者之全部內容皆以引用方式併入本文中。
[提交ASCII文字檔案序列表]
下列提交之ASCII文字檔案的內容全文係以引用方式併入本文中：電腦可讀形式(CRF)之序列表(檔案名稱：750322002241SEQLIST.TXT，記錄日期：2020年2月24日，大小：15 KB)。
免疫療法可分成二種主要介入類型，即被動或主動。被動規程包括投予預先活化及/或經工程改造之細胞、疾病特異性治療性抗體及/或細胞介素。主動免疫療法策略係針對刺激體內免疫系統效應功能。數種目前的主動規程包括用疾病相關肽、溶解物或同種異體全細胞的免疫接種策略、輸注自體DC作為腫瘤抗原投遞之媒劑及輸注免疫檢查點調節劑。見Papaioannou, Nikos E., et al. Annals of translational medicine 4.14 (2016)。
藉由疾病相關抗原刺激之CD8+
細胞毒性T淋巴細胞(CTL)及CD4+
輔助T (Th)細胞具有靶向及摧毀患病細胞的潛力；然而，目前誘導內源性T細胞反應的方法面臨挑戰。
本文所引證之所有參考文獻包括專利申請案及公開案皆以引用方式完整併入本文中。
本發明提供包含用於刺激個體免疫反應之抗原的周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施態樣中，抗原係使用Cell Squeeze®平台投遞到細胞內。本發明人未預期地發現PBMC的混合族群比起純的B細胞及T細胞族群具有較高療效。此外，本發明至少部分基於使用佐劑調理PBMC增加PBMC之抗原呈現細胞活化的非預期發現，導致當向個體投予PBMC時增加的免疫刺激。
在一些態樣中，本發明提供複數個經修飾之周邊血液單核細胞(PBMC)，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。在一些實施態樣中，本發明提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性，其中該抗原係癌症抗原、傳染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。在一些態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之周邊血液單核細胞(PBMC)，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性，其中該抗原係癌症抗原、傳染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之周邊血液單核細胞(PBMC)，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。
在一些態樣中，本發明提供經調理之複數個PBMC，該經調理之複數個PBMC包含抗原，其藉由使包含該抗原之該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供包含抗原之經調理之複數個PBMC，其藉由在將該抗原導入該PBMC之前使該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
在一些態樣中，本發明提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含：在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC；藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
在一些態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，該複數個經修飾之PBMC根據本文所述包含抗原及/或佐劑，其中過程進一步包含：使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含：在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原及/或該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含使該輸入PBMC及/或該經修飾之PBMC與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC之存活及/或功能。
在一些態樣中，本發明提供包含本文所述之複數個經修飾之PBMC之組成物，其用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法。在一些實施態樣中，本發明提供包含如本文所述之複數個經修飾之PBMC且用於治療癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之組成物。
在一些態樣中，本發明提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療人體或動物體之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體之癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體之癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體之HPV相關疾病之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體之HPV相關疾病之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
在一些態樣中，本發明提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC之組成物於製造用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病的藥物之用途，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC之組成物於製造用於治療HPV相關疾病的藥物之用途，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
在一些態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該佐劑係CpG ODN，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該佐劑係CpG ODN，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在較佳實施態樣中，該佐劑係CPG 7909。
在一些態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含人類乳突病毒(HPV)抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
在一些態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約34 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約34 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
在一些態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
在一些態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)向該個體投予包含抗原之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列；及b)向該個體投予佐劑。
在一些態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)向該個體投予包含抗原之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及b)向該個體投予佐劑。在一些態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)向該個體投予包含抗原之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；及b)向該個體投予佐劑。在一些態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)向該個體投予包含複數個抗原之複數個經修飾之PBMC，該複數個抗原包含SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：23之胺基酸序列；及b)向該個體投予佐劑。在一些態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)向該個體投予包含複數個抗原之複數個經修飾之PBMC，該複數個抗原係由SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成；及b)向該個體投予佐劑。在一些實施態樣中，複數個抗原係含有在非共價連接肽池之內。在一些實施態樣中，複數個抗原係含有在非共價連接肽池之內，其中各肽包含不超過一個抗原。在一些實施態樣中，複數個抗原係含有在非共價連接肽池之內，其中SEQ ID NO：19之胺基酸序列及SEQ ID NO：23之胺基酸序列係含有在分開肽之內。
在一些態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)使包含抗原之複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個PBMC；b)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)使複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個PBMC；b)將抗原導入該複數個PBMC；及c)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，方法進一步包含在與該佐劑培育之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。
在一些態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予佐劑。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予佐劑。
在一些態樣中，本發明提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：向個體投予與抗原相關之複數個PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之過程製備：a)使複數個輸入PBMC與抗原培育足夠的時間，以允許該抗原與該輸入PBMC之細胞表面連結，藉此產製與該抗原相關之該複數個PBMC；及b)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，該方法進一步包含向該個體投予佐劑。
在一些態樣中，本發明提供一種用於產製包含抗原之經調理之複數個PBMC之方法，該方法包含使包含該抗原之該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC；藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，方法進一步包含在與該佐劑培育之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於產製複數個經修飾之PBMC之方法，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於產製複數個經修飾之PBMC之方法，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於產製複數個經修飾之PBMC之方法，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，本發明提供一種用於產製複數個經修飾之PBMC之方法，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，方法進一步包含使該輸入PBMC及/或該經修飾之PBMC與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC之存活及/或功能。
抗原呈現細胞(APC)在誘導CTL的內源性活化上扮演關鍵角色。在本發明中，描述實施Cell Squeeze®平台以工程改造用於調節對各種適應症(包括癌症及傳染性疾病)的免疫反應之周邊血液單核細胞(PBMC)。藉由將目標抗原及/或佐劑有效地胞質液投遞至PBMC，此平台顯示誘導高度有效的體內MHC-I呈現目標抗原及刺激CTL的能力。本發明人未預期地發現PBMC的混合族群比起單獨純的B細胞及T細胞族群具有較高療效。此外，發明人未預期地發現使用佐劑調理PBMC增加抗原呈現細胞之活化，導致當向個體投予時相較於非調理之抗原裝載PBMC較高的免疫刺激。
在一些態樣中，本申請案提供包含抗原及佐劑之經修飾之PBMC，且其中該抗原存在於細胞內。在一些實施態樣中，包含抗原之PBMC在向個體投予之前在佐劑存在下培育一段時間(即，PBMC係經調理)。在一些實施態樣中，在將抗原導入PBMC之前，PBMC在佐劑存在下培育一段時間。
在一些實施態樣中，經修飾之PBMC係藉由以下製備：a)使輸入PBMC細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經擾動的輸入PBMC；及b)使該經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC；藉此產製包含該抗原之該經修飾之PBMC。亦提供使用經修飾之PBMC以調節個體之免疫反應之方法，例如增強個體之免疫反應。在一些實施態樣中，該增強的免疫反應係針對該抗原。在一些實施態樣中，細胞變形縊縮包含在微流體通道中，諸如本文所述之任何微流體通道。
一般技術
在本文中描述或指涉之技術及程序通常為所屬技術領域中具有通常知識者所廣為理解且經常使用習知方法採用，諸如例如以下描述之廣為運用之方法：Molecular Cloning：A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003)；The Series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；PCR 2：A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995)；Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988)；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th
ed., J. Wiley and Sons, 2010)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998)；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8)；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002)；Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies：A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；及Cancer：Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)。
定義
出於闡釋本說明書之目的，將應用以下定義且每當適當時，以單數形式使用之用語亦將包括複數且反之亦然。若以下闡述之任何定義與以引用方式併入本文中之任何文獻相悖，則將以以下闡述之定義為準。
如本文中所使用之單數形式「一(a, an)」及「該(the)」包括複數引用，除非另外說明。
應理解本文所述之本發明的態樣及實施態樣包括「包含(comprising)」、「組成(consisting)」及「基本上由 組成(consisting essentially of)」態樣及實施態樣。
如本文中所使用之用語「約(about)」係指所屬技術領域中具有通常知識者所廣為周知之各別值的通常錯誤範圍。在本文中指涉「約」某數值或參數時，其包括(且描述)與該數值或參數本身相關之實施態樣。
如本文中所使用，「周邊血液單核細胞」或「PBMC」係指具有圓形核的血液細胞異質性族群。可在PBMC族群中發現的細胞實例包括淋巴細胞諸如T細胞、B細胞、NK細胞(包括NKT細胞及CIK細胞)及單核球諸如巨噬細胞及樹突細胞。如本文中所使用之「複數個PBMC」係指包含至少二種血液細胞類型之細胞的PBMC製劑。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞中二種或超過二種。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞中三種或超過三種。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞中四種或超過四種。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞及樹突細胞。
PBMC可藉由所屬技術領域中已知之手段單離。例如，PBMC可基於PBMC相較於其他血液細胞之密度而衍生自個體之周邊血液。在一些實施態樣中，PBMC係使用Ficoll(例如，ficoll梯度)衍生自個體之周邊血液。在一些實施態樣中，PBMC係使用ELUTRA®細胞分離系統衍生自個體之周邊血液。
在一些實施態樣中，PBMC族群係單離自個體。在一些實施態樣中，複數個PBMC係自體PBMC族群，其中該族群係衍生自特定個體、藉由任何本文所述之方法操作且回到特定個體。在一些實施態樣中，複數個PBMC係同種異體PBMC族群，其中該族群係衍生自一個個體、藉由任何本文所述之方法操作且向第二個體投予。
在一些實施態樣中，複數個PBMC係重構的PBMC製劑。在一些實施態樣中，複數個PBMC可藉由將一般在PBMC族群中發現之細胞混合而產製；例如，藉由混合T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中二種或超過二種之族群。在一些實施態樣中，脾細胞族群中的細胞比例係經調整(例如精製)以更佳地反映人PBMC之族群輪廓。例如，可將B細胞自脾細胞族群除盡以更佳地反映人PBMC族群。
如本文中所使用之用語「孔(pore)」係指開口，包括但不限於材料內的洞(hole)、裂口(tear)、腔(cavity)、口(aperture)、破裂(break)、縫隙(gap)或穿孔(perforation)。在一些實例中，(適用時)用語係指本揭露之表面內的孔。在其他實例中，(適用時)孔可指細胞膜中的孔。
如本文中所使用之用語「膜(membrane)」係指含有孔的選擇性屏障或片材。用語包括作為界限或襯料的可彎曲片狀結構。在一些實例中，用語係指含有孔的表面或過濾器。此用語與用語「細胞膜(cell membrane)」不同。
如本文中所使用之用語「過濾器(filter)」係指允許選擇性通過孔之有孔物品。在一些實例中，用語係指含有孔的表面或膜。
如本文中所使用之用語「異質性(heterogeneous)」係指結構或組成係混合或不均勻的某物。在一些實例中，用語係指在給定表面內具有變化大小、形狀或分布的孔。
如本文中所使用之用語「同質性(homogeneous)」係指整個結構或組成係一致或均勻的某物。在一些實例中，用語係指在給定表面內具有一致大小、形狀或分布的孔。
用語「異源性(heterologous)」關於核酸序列諸如編碼序列及控制序列時，表示正常不連接在一起及/或正常不與特定細胞相關之序列。因此，核酸建構體或載體的「異源性」區域係位在另一核酸分子內或連接至另一核酸分子且在天然中未被發現與該另一分子相關的核酸區段。例如，核酸建構體的異源性區域可能包括旁側連接在天然中未發現與編碼序列相關之序列的編碼序列。另一異源性編碼序列的實例係其中該編碼序列本身在天然中未被發現(例如，具有不同於天然基因之密碼子的合成序列)的建構體。相似地，經正常不存在於細胞中之建構體轉形的細胞就本發明之目的而言將被視為異源性。等位變異或天然發生突變事件不產生如本文中所使用之異源性DNA。
用語「異源性」關於胺基酸序列諸如肽序列及多肽序列時，表示正常不連接在一起及/或正常不與特定細胞相關之序列。因此，肽序列的「異源性」區域係位在另一胺基酸分子內或連接至另一胺基酸分子且在天然中未被發現與該另一分子相關的胺基酸區段。例如，肽建構體的異源性區域可能包括旁側連接在天然中未發現與肽胺基酸序列相關之序列的肽胺基酸序列。另一異源性肽序列的實例係其中該肽序列本身在天然中未被發現(例如，具有不同於天然基因所編碼之胺基酸的合成序列)的建構體。相似地，經正常不存在於細胞中之載體(其表現胺基酸建構體)轉形的細胞就本發明之目的而言將被視為異源性。等位變異或天然發生突變事件不產生如本文中所使用之異源性肽。
當用語「外源性(exogenous)」用於指涉與細胞有關之藥劑(諸如抗原或佐劑)時，係指從細胞外投遞(也就是來自細胞外)之藥劑。細胞可能已經具有或不具有該藥劑存在，且在該外源性藥劑投遞後可能產生或不產生該藥劑。
如本文中所使用，用語「抑制(inhibit)」可指阻斷、減少、清除或以其他方式拮抗特定目標之存在或活性的動作。抑制可指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫反應可指任何導致阻斷、減少、清除或任何其他拮抗免疫反應之動作。在其他實例中，抑制核酸表現可包括但不限於減少核酸轉錄、減少mRNA豐度(例如，靜默mRNA轉錄)、降解mRNA、抑制mRNA轉譯等。
如本文中所使用，用語「壓制(suppress)」可指降低、減少、禁止、限制、減輕或以其他方式縮小特定目標之存在或活性的動作。壓制可指部分壓制或完全壓制。例如，壓制免疫反應可指任何導致降低、減少、禁止、限制、減輕或以其他方式縮小免疫反應之動作。在其他實例中，壓制核酸表現可包括但不限於減少核酸轉錄、減少mRNA豐度(例如，靜默mRNA轉錄)、降解mRNA、抑制mRNA轉譯等。
如本文中所使用，用語「增強(enhance)」可指改善、追加、強調或以其他方式增加特定目標之存在或活性的動作。例如，增強免疫反應可指任何導致改善、追加、強調或以其他方式增加免疫反應之動作。在一例示性實例中，增強免疫反應可指採用抗原及/或佐劑以改善、追加、強調或以其他方式增加免疫反應。在其他實例中，增强核酸表現可包括但不限於增加核酸轉錄、增加mRNA豐度(例如，增加mRNA轉錄)、降低mRNA降解、增加mRNA轉譯等。
如本文中所使用，用語「調節(modulate)」可指變更、改變、變化或以其他方式修改特定目標之存在或活性的動作。例如，調節免疫反應可指任何導致變更、改變、變化或以其他方式修改免疫反應之動作。在其他實例中，調節核酸表現可包括但不限於變更核酸轉錄、變更mRNA豐度(例如，增加mRNA轉錄)、對應變更mRNA降解、變更mRNA轉譯等。
如本文中所使用，用語「誘導(induce)」可指起始、提示、刺激、建立或以其他方式產生結果之動作。例如，誘導免疫反應可指任何導致起始、提示、刺激、建立或以其他方式產生所欲免疫反應之動作。在其他實例中，誘導核酸表現可包括但不限於起始核酸轉錄、起始mRNA轉譯等。
如本文中所使用之用語「同源性(homologous)」係指衍生自相同有機體之分子。在一些實例中，該用語係指正常在給定有機體內發現或表現之核酸或蛋白質。
如本文中所使用之用語「多核苷酸(polynucleotide)」或「核酸分子(nucleic acid)」係指任何長度之聚合形式的核苷酸，不論核糖核苷酸或去氧核醣核苷酸。因此，此用語包括但不限於單股、雙股或多股DNA或RNA、基因體DNA、cDNA、DNA-RNA雜交、或包含嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、經化學或生化修改、非天然或衍生性核苷酸鹼基之聚合物。多核苷酸之主鏈可包含糖及磷酸鹽基團(如同一般可在RNA或DNA中發現者)、或經修改或經取代的糖或磷酸鹽基團。替代地，多核苷酸之主鏈可包含合成次單位諸如胺基磷酸酯及硫代磷酸酯之聚合物，且因此可為寡去氧核苷胺基磷酸酯(P-NH2)或混合的胺基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，雙股多核苷酸可自化學合成的單股多核苷酸產物，使用DNA聚合酶與適當引子藉由合成互補股並在適當條件下黏合該等股，或藉由重新(de novo)合成互補股獲得。
用語「多肽(polypeptide)」及「蛋白質(protein)」可交換使用以指涉胺基酸殘基之聚合物，並不限於最小長度。該等胺基酸殘基之聚合物可包含天然或非天然胺基酸殘基，且包括但不限於胺基酸殘基之肽、寡肽、二聚物、三聚物及多聚物。全長蛋白質及彼之片段均包含於此定義中。該等用語亦包括多肽之表現後修改，例如糖基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化及該類似修改。另外，就本發明之目的而言，「多肽」係指包括對天然序列加以修改諸如刪除、添加及取代(通常在天然中為保守性)之蛋白質，只要該蛋白質維持該所欲之活性。這些修改可經過考慮，諸如透過定點突變形成，或可為意外發生，諸如經由宿主之突變，該宿主產生蛋白質或因為PCR擴增之錯誤。
如本文中所使用，用語「佐劑(adjuvant)」係指直接或間接調節及/或導致免疫反應之物質。通常，佐劑係搭配抗原投予，以相較於單獨抗原致效對抗原之免疫反應的增強。在一些實施態樣中，佐劑係用於調理複數個PBMC(例如，如實例中顯示)。各種佐劑係在本文中描述。
用語「CpG寡去氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide)」及「CpG ODN」係指含有藉由磷酸鹽分離之胞嘧啶及鳥嘌呤的二核苷酸之DNA分子(在本文中亦稱為「CpG」二核苷酸或「CpG」)。本揭露之CpG ODN含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸。也就是說，CpG二核苷酸中的胞嘧啶未經甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可具有部分或完全硫代磷酸酯(PS)主鏈。
如本文中所使用，所謂「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」或「藥學上可相容(pharmacologically compatible)」係指不是生物非所欲或以其他方式非所欲之材料，例如可併入向患者投予之醫藥組成物中，且不造成任何顯著非所欲生物效應或不以有害方式與該組成物中所含有的任何其他組分交互作用之材料。醫藥上可接受之載劑或賦形劑較佳地符合毒性及製造測試所需標準及/或包括於美國食品藥物管理局制定的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)。
就本文中描述之任何結構及功能特徵而言，判定這些特徵之方法係所屬技術領域中已知。
經修飾之PBMC、組成物及產製經修飾之PBMC之方法
經修飾之PBMC
在某些態樣中，提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。在其他態樣中，提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性，其中該抗原係癌症抗原、傳染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性，其中該抗原係癌症抗原、傳染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。在某些態樣中，有一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之核酸。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之mRNA。在一些實施態樣中，一或多種核酸係經攜帶於一或多種媒劑中，其中一或多種媒劑係經投遞至輸入PBMC。在一些實施態樣中，媒劑係病毒或病毒相關粒子。在一些實施態樣中，病毒包含下列一或多者：腺病毒、腺相關病毒(AAV)、桿狀病毒、疱疹病毒或反轉錄病毒。在一些實施態樣中，病毒包含AAV。在一些實施態樣中，媒劑係基於脂質之媒劑，例如脂質體。在一些實施態樣中，媒劑係奈米粒子。
在一些態樣中，提供包含抗原之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列。在其他態樣中，提供包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列。
在一些態樣中，提供包含抗原之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。在其他態樣中，提供包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。在一些態樣中，提供包含抗原之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。在其他態樣中，提供包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。
在一些態樣中，提供經調理之複數個PBMC，該經調理之複數個PBMC包含抗原，其藉由使包含該抗原之該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。在其他態樣中，提供包含抗原之經調理之複數個PBMC，其藉由在將該抗原導入該PBMC之前使該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個PBMC，該經調理之複數個PBMC包含編碼抗原之核酸(例如mRNA)，其藉由使包含該抗原之該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。在其他態樣中，提供包含編碼抗原之核酸(例如mRNA)之經調理之複數個PBMC，其藉由在將該抗原導入該PBMC之前使該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
抗原及/或佐劑可使用縊縮媒介之投遞(SQZ)導入PBMC中。因此在一些態樣中，提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。在一些實施態樣中，一或多種核酸係經攜帶於一或多種媒劑中，其中一或多種媒劑係經投遞至輸入PBMC。在一些實施態樣中，媒劑係病毒或病毒相關粒子。在一些實施態樣中，病毒包含下列一或多者：腺病毒、腺相關病毒(AAV)、桿狀病毒、疱疹病毒或反轉錄病毒。在一些實施態樣中，病毒包含AAV。在一些實施態樣中，媒劑係基於脂質之媒劑，例如脂質體。在一些實施態樣中，媒劑係奈米粒子。
在一些態樣中，提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC；藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在某些態樣中，提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在其他態樣中，提供複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含人類乳突病毒(HPV)抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該佐劑係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，HPV抗原係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，HPV抗原係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，包含HPV抗原之經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，包含HPV抗原之經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，抗原係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，HPV抗原係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，包含抗原之經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，包含HPV抗原之經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係約1 µM及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係約1 µM。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係介於約10000：1至約1：10000之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係約200：1。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係約20：1。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，過程進一步包含：使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原及/或該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
在根據本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原係存在於複數個經修飾之PBMC之胞質液中且佐劑係存在於細胞囊泡中。在一些實施態樣中，該囊泡係胞內體。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞中的多個隔室中。在進一步實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%的細胞中。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%的細胞中任一者。在一些實施態樣中，該抗原係與複數個經修飾之PBMC之細胞的表面結合。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球各者的至少約70%的細胞中。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球各者的約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%的細胞中至少任一者。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC之T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中一或多者的至少約70%的細胞中。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC之T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中一或多者的約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%的細胞中至少任一者。
在一些實施態樣中，提供包含本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之組成物。在一些實施態樣中，提供包含本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者且用於作為藥物之組成物。在一些實施態樣中，提供包含本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之組成物，其用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法。在一些實施態樣中，提供用於治療癌症或傳染性疾病且包含本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者之組成物。在一些實施態樣中，提供包含本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者且用於治療癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之組成物。在一些實施態樣中，癌症係頭頸癌、子宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、肛門周圍癌症、肛門生殖器癌症、口腔癌或唾腺癌。在一些實施態樣中，傳染性疾病係與HIV、HPV、EBV、MCV、HBV或HCV相關。在一些實施態樣中，有一種包含本文所述之複數個經修飾之PBMC中任一者及醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物。在一些實施態樣中，組成物係用於治療癌症或傳染性疾病。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之核酸。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之mRNA。
組成物
在某些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療人體或動物體之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體之癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體之癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體之HPV相關疾病之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體之HPV相關疾病之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC之組成物於製造用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病的藥物之用途，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供包含經調理之複數個經修飾之PBMC之組成物於製造用於治療HPV相關疾病的藥物之用途，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之組成物中任一者之一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係約1 µM及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係約1 µM。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係介於約10000：1至約1：10000之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係約200：1。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係約20：1。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之組成物中任一者之一些實施態樣中，過程進一步包含：使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原及/或該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
在根據本文所述之組成物中任一者之一些實施態樣中，抗原係存在於複數個經修飾之PBMC之胞質液中且佐劑係存在於細胞囊泡中。在一些實施態樣中，該囊泡係胞內體。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞中的多個隔室中。在進一步實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%的細胞中。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%的細胞中任一者。在一些實施態樣中，該抗原係與複數個經修飾之PBMC之細胞的表面結合。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之核酸。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之mRNA。
產製複數個經修飾之PBMC之方法
在一些態樣中，亦提供一種用於產製包含抗原之經調理之複數個PBMC之方法，該方法包含使包含該抗原之該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
在一些態樣中，有一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製複數個經修飾之PBMC之方法，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製複數個經修飾之PBMC之方法，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在某些態樣中，提供一種用於產製複數個經修飾之PBMC之方法，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製複數個經修飾之PBMC之方法，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
在某些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在某些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含人類乳突病毒(HPV)抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該佐劑係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，包含HPV抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，包含抗原之複數個經修飾之PBMC係與佐劑培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在一些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於產製經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，包含抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，包含抗原之複數個經修飾之PBMC係與佐劑培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係約1 µM及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係約1 µM。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係介於約10000：1至約1：10000之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係約200：1。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係約20：1。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，過程進一步包含：使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原及/或該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，抗原係存在於複數個經修飾之PBMC之胞質液中且佐劑係存在於細胞囊泡中。在一些實施態樣中，該囊泡係胞內體。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞中的多個隔室中。在進一步實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%的細胞中。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%的細胞中任一者。在一些實施態樣中，該抗原係與複數個經修飾之PBMC之細胞的表面結合。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC內之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球各者的約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%的細胞中至少任一者。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC內之T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中一或多者的約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%的細胞中至少任一者。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，該過程進一步包含使該輸入PBMC及/或該經修飾之PBMC與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC的存活及/或功能。
刺激個體之反應之方法
在一些態樣中，本發明提供用於治療及預防癌症或傳染性疾病及/或調節患有癌症或傳染性疾病之個體的免疫反應之方法，該方法包含向個體投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物，其中該經修飾之PBMC在細胞內包含與癌症或與傳染性疾病相關之抗原。
在一些實施態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含向該個體投予如本文所述之複數個經修飾之PBMC、組成物或醫藥組成物中任一者。
在某些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)向該個體投予包含抗原之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列；及b)向該個體投予佐劑。
在某些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)使包含抗原之複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個PBMC；b)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：a)使複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個PBMC；b)將抗原導入該複數個PBMC；及c)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，方法進一步包含在與該佐劑培育之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在某些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予佐劑。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予佐劑。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的對抗HPV抗原之免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的對抗HPV抗原之免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的對抗HPV抗原之免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的對抗HPV抗原之免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，HPV抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，包含HPV抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在一些態樣中，提供一種用於刺激個體的免疫反應之方法，該方法包含：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。在一些實施態樣中，包含抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係約1 µM及/或與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係約1 µM。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係介於約10000：1至約1：10000之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係約200：1。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之比例係約20：1。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，過程進一步包含：使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原及/或該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，抗原係存在於複數個經修飾之PBMC之胞質液中且佐劑係存在於細胞囊泡中。在一些實施態樣中，該囊泡係胞內體。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞中的多個隔室中。在進一步實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%的細胞中。在一些實施態樣中，該抗原及/或該佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%、約75%、約80%、約85%、約95%或約99%或100%的細胞中任一者。在一些實施態樣中，該抗原係與複數個經修飾之PBMC之細胞的表面結合。在一些實施態樣中，該抗原係存在於複數個經修飾之PBMC之約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約95%、約99%或100%的細胞中至少任一者。在一些實施態樣中，該抗原係存在於複數個經修飾之PBMC內之T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中一或多者的約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約95%、約99%或100%的細胞中至少任一者。在一些實施態樣中，該抗原係存在於複數個經修飾之PBMC內之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球各者的約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約95%、約99%或100%的細胞中至少任一者。在一些實施態樣中，該抗原係存在於複數個經修飾之PBMC內之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球中一或多者的約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約95%、約99%或100%的細胞中至少任一者。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，該過程進一步包含使該輸入PBMC及/或該經修飾之PBMC與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC的存活及/或功能。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，該方法進一步包含向個體投予第三佐劑。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及第三佐劑係同時投予。在一些實施態樣中，第三佐劑係在向該個體投予複數個經修飾之PBMC之前、之同時或之後投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及第三佐劑係依序投予。在一些實施態樣中，第三佐劑與縊縮投遞佐劑相同。在一些實施態樣中，第三佐劑與調理佐劑相同。在一些實施態樣中，第三佐劑與縊縮投遞佐劑不同。在一些實施態樣中，第三佐劑與調理佐劑不同。
在一些實施態樣中，方法包含多次投予該經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，方法包含約3次至約9次投予該經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，方法包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次投予該經修飾之PBMC中任一者。在一些實施態樣中，方法包含視需要連續投予該經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，該複數個經修飾之PBMC之二次連續投予之間的時間間隔係介於約1天與約30天之間。在一些實施態樣中，該複數個經修飾之PBMC之二次連續投予之間的時間間隔係約21天。在一些實施態樣中，經修飾之免疫細胞二次連續投予之間的時間間隔係約1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或150天中任一者。在一些實施態樣中，個體係HLA-A2表現陽性。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC中至少一個細胞係HLA-A2表現陽性。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC中至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中任一者係HLA-A2表現陽性。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC內至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中任一者的T細胞係HLA-A2表現陽性。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC內至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中任一者的B細胞係HLA-A2表現陽性。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC內至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中任一者的NK細胞係HLA-A2表現陽性。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC內至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%中任一者的單核球係HLA-A2表現陽性。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予第三佐劑之前投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予第三佐劑之前約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予第三佐劑之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予第三佐劑之前自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予第三佐劑之後投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予第三佐劑之後約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予第三佐劑之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予第三佐劑之後自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施態樣中，第三佐劑係IFN-α或CpG ODN任一者。在一些實施態樣中，第三佐劑係CpG 7909。
在根據本文所述之方法中任一者之一些實施態樣中，該複數個經修飾之PBMC係於投予治療劑之前、同期或之後投予。在一些實施態樣中，治療劑包含免疫檢查點抑制劑、化學療法或放射療法中一或多者。在一些實施態樣中，治療劑包含一或多種細胞介素。
免疫檢查點係免疫系統之調節劑且保持免疫反應受到控制。可採用免疫檢查點抑制劑以促進免疫反應的增強。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係與免疫檢查點抑制劑之投予組合投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及免疫檢查點抑制劑係同時投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及免疫檢查點抑制劑係依序投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之前投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之後投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之前約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之前自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之前約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之前自介於約7天至約10天之間、自介於約10天與約14天之間、自介於約14天與約18天之間、自介於約18天與約21天之間、自介於約21天與約24天之間、自介於約24天與約28天之間、自介於約28天與約30天之間、自介於約30天與約35天之間、自介於約35天與約40天之間、自介於約40天與約45天之間、自介於約45天與約50天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之後投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之後約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之後自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之後約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予免疫檢查點抑制劑之後自介於約7天至約10天之間、自介於約10天與約14天之間、自介於約14天與約18天之間、自介於約18天與約21天之間、自介於約21天與約24天之間、自介於約24天與約28天之間、自介於約28天與約30天之間、自介於約30天與約35天之間、自介於約35天與約40天之間、自介於約40天與約45天之間、自介於約45天與約50天之間投予。
在一些實施態樣中，方法包含多次投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物及/或多次投予免疫檢查點抑制劑。例如，在一些實施態樣中，方法包含二次投予、三次投予、四次投予、五次投予、六次投予、七次投予、八次投予、九次投予、十次投予、十一次投予、十二次投予、十三次投予、十四次投予或十五次投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物及/或免疫檢查點抑制劑。例如，在一些實施態樣中，方法包含小於五次投予、小於十次投予、小於十五次投予、小於二十次投予、小於二十五次投予、小於三十次投予、小於五十次投予、小於七十五次投予、小於一百次或小於二百次投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物及/或免疫檢查點抑制劑。
例示性免疫檢查點抑制劑靶向(但不限於)PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA。在一些實施態樣中，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者。在一些實施態樣中，免疫檢查點抑制劑係下列一或多者：與PD-1結合之抗體、與PD-L1結合之抗體、與CTLA-4結合之抗體、與LAG3結合之抗體或與TIM-3結合之抗體、與TIGIT結合之抗體、與VISTA結合之抗體、與TIM-1結合之抗體、與B7-H4結合之抗體或與BTLA結合之抗體。在進一步實施態樣中，抗體可為全長抗體或任何變體，例如但不限於抗體片段、單鏈可變片段(ScFv)或抗原結合片段(Fab)。在進一步實施態樣中，抗體可為雙特異性、三特異性或多特異性。在一些實施態樣中，免疫檢查點抑制劑係與PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者結合及/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者之一或多種化學化合物。在一些實施態樣中，免疫檢查點抑制劑係與PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者結合及/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者之一或多種肽。在一些實施態樣中，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1。在一些實施態樣中，免疫檢查點抑制劑靶向PD-L1。
細胞介素可與任何本文所述之複數個經修飾之PBMC組合使用，以達成對抗癌症(例如HPV相關癌症)之累加或協同效應。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係與一或多種細胞介素之投予組合投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及細胞介素係同時投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及細胞介素係依序投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之前投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之後投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之前約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之前自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之前約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之前自介於約7天至約10天之間、自介於約10天與約14天之間、自介於約14天與約18天之間、自介於約18天與約21天之間、自介於約21天與約24天之間、自介於約24天與約28天之間、自介於約28天與約30天之間、自介於約30天與約35天之間、自介於約35天與約40天之間、自介於約40天與約45天之間、自介於約45天與約50天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之後投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之後約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予細胞介素之後自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
例示性細胞介素包括但不限於趨化激素、干擾素、介白素、淋巴激素及腫瘤壞死因子。在一些實施態樣中，細胞介素增強細胞性免疫反應。在一些實施態樣中，細胞介素增強抗體反應。在一些實施態樣中，細胞介素係第一型細胞介素。在一些實施態樣中，細胞介素係第2型細胞介素。在一些實施態樣中，細胞介素包含下列一或多者：IL-2、IL-15、IL-10、IL-12、IFN-a或IL-21。在一些實施態樣中，細胞介素包含IL-15。
化學療法可與任何本文所述之複數個經修飾之PBMC組合使用，以達成對抗癌症(例如HPV相關癌症)之累加或協同效應。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係與化學療法之投予組合投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及化學療法係同時投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及化學療法係依序投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之前投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之後投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之前約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之前自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之後投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之後約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之後自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之後約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予化學療法之後自介於約7天至約10天之間、自介於約10天與約14天之間、自介於約14天與約18天之間、自介於約18天與約21天之間、自介於約21天與約24天之間、自介於約24天與約28天之間、自介於約28天與約30天之間、自介於約30天與約35天之間、自介於約35天與約40天之間、自介於約40天與約45天之間、自介於約45天與約50天之間投予。
在一些實施態樣中，方法包含多次投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物及/或多次投予化學療法。例如，在一些實施態樣中，方法包含二次投予、三次投予、四次投予、五次投予、六次投予、七次投予、八次投予、九次投予、十次投予、十一次投予、十二次投予、十三次投予、十四次投予或十五次投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物及/或化學療法。例如，在一些實施態樣中，方法包含小於五次投予、小於十次投予、小於十五次投予、小於二十次投予、小於二十五次投予、小於三十次投予、小於五十次投予、小於七十五次投予、小於一百次或小於二百次投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物及/或化學療法。
例示性化學療法可為細胞週期依賴性或細胞週期非依賴性。在一些實施態樣中，化學療法包含一或多種化學治療劑。在一些實施態樣中，化學治療劑可靶向細胞分裂、DNA或癌症代謝中之一或多者。在一些實施態樣中，化學治療劑係鉑基底藥劑，諸如但不限於順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)或卡鉑(carboplatin)。在一些實施態樣中，化學治療劑係紫杉烷(諸如多西他賽(docetaxel)或太平洋紫杉醇(paclitaxel))。在一些實施態樣中，化學治療劑係5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、多柔比星(doxorubicin)或伊立替康(irinotecan)。在一些實施態樣中，化學治療劑係以下一或多種：烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑或有絲分裂抑制劑。在一些實施態樣中，化學療法包含順鉑。
放射療法可與任何本文所述之複數個經修飾之PBMC組合使用，以達成對抗癌症(例如HPV相關癌症)之累加或協同效應。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係與放射療法之投予組合投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及放射療法係同時投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物及放射療法係依序投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係與放射療法之投予組合、與化學療法組合及/或與免疫檢查點抑制劑組合投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之前投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之後投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之前約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之前自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之後投予。例如，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之後約1小時至約1週投予。例如，在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之後自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之後約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投予。在一些實施態樣中，包含複數個經修飾之PBMC之組成物係於投予放射療法之後自介於約7天至約10天之間、自介於約10天與約14天之間、自介於約14天與約18天之間、自介於約18天與約21天之間、自介於約21天與約24天之間、自介於約24天與約28天之間、自介於約28天與約30天之間、自介於約30天與約35天之間、自介於約35天與約40天之間、自介於約40天與約45天之間、自介於約45天與約50天之間投予。
在一些實施態樣中，方法包含多次投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物及/或多次投予放射療法。例如，在一些實施態樣中，方法包含二次投予、三次投予、四次投予、五次投予、六次投予、七次投予、八次投予、九次投予、十次投予、十一次投予、十二次投予、十三次投予、十四次投予或十五次投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物及/或放射療法。例如，在一些實施態樣中，方法包含小於五次投予、小於十次投予、小於十五次投予、小於二十次投予、小於二十五次投予、小於三十次投予、小於五十次投予、小於七十五次投予、小於一百次或小於二百次投予包含複數個經修飾之PBMC之組成物及/或放射療法。
在一些實施態樣中，提供用於根據本文所述之方法中任一者刺激個體之免疫反應之方法中的包含抗原之複數個PBMC。
在根據本文所述之方法中任一者之一些方法中，該方法刺激個體的對抗HPV抗原之免疫反應。乳突病毒係小型無外膜DNA病毒，其病毒粒子大小為直徑約55 nm。超過100種HPV基因型已經完全表徵且假設存在更高數量。HPV係子宮頸癌以及一些外陰癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌、肛門癌及直腸癌的已知病因。雖然大多數HPV感染係無症狀且自發清除，但持續感染致癌性HPV類型中之一者可進展成前癌或癌症。其他HPV相關疾病可包括尋常疣、掌疣、扁平疣、肛門生殖器疣、肛門病灶、表皮發育異常、局部表皮增生、口腔乳突瘤、疣狀囊腫、喉部乳突瘤病、鱗狀細胞上皮內病變(SIL)、子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)、外陰上皮內瘤樣病變(VIN)及陰道上皮內瘤樣病變(VAIN)。許多已知的人乳突病毒(HPV)類型造成良性病變，其中一子集為致癌性。基於流行病學及親源關係，HPV類型係分類成十五種「高風險類型」(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73及82)及三種「可能高風險類型」(HPV 26、53及66)，彼等一起已知表現為低度及高度子宮頸病變及癌症以及其他肛門生殖器癌症諸如陰門癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、及肛門周圍癌以及頭頸癌。最近，高風險類型HPV 16及18與乳癌的相關性亦經描述。十一種分類為「低風險類型」的HPV類型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72及81)已知表現為良性低度子宮頸病變、生殖器疣及復發性呼吸道乳突瘤病。皮膚的HPV類型5、8及92與皮膚癌相關。在一些HPV相關癌症中，免疫系統受到壓抑且對應地抗腫瘤反應受到顯著損害。見Suresh and Burtness, Am J Hematol Oncol 13(6)：20-27 (2017)。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之核酸。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之mRNA。
PBMC組成物
如本文中所使用，PBMC可藉由白血球分離術自獲自個體之全血單離。亦提供PBMC組成物，其係藉由混合來自相同個體或不同個體之不同PBMC池而重構。在其他實例中，PBMC亦可藉由將不同細胞族群混合成為具有產製輪廓之混合細胞組成物而重構。在一些實施態樣中，用於重構PBMC之細胞族群係混合的細胞族群(諸如T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中一或多種之混合物)。在一些實施態樣中，用於重構PBMC之細胞族群係經純化之細胞族群(諸如經純化之T細胞、B細胞、NK細胞或單核球)。在額外實例中，用於重構PBMC組成物之不同細胞族群可單離自相同個體(例如自體)或單離自不同個體(例如同種異體及/或異源性)。
因此在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突細胞或NK-T細胞中一或多種。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突細胞或NK-T細胞。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC包含CD3+ T細胞、CD20+ B細胞、CD14+單核球、CD56+ NK細胞中一或多者。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例基本上與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對全血中PBMC總數之比例相同。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例基本上與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對來自全血之白血球分離術產物中PBMC總數之比例相同。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對全血中PBMC總數之比例的差異不超過1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%中任一者。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對全血中PBMC總數之比例的差異不超過10%中任一者。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對來自全血之白血球分離術產物中PBMC總數之比例的差異不超過1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%中任一者。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對來自全血之白血球分離術產物中PBMC總數之比例的差異不超過10%中任一者。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，約25%至約70%之經修飾之PBMC係T細胞。在一些實施態樣中，約2.5%至約14%之經修飾之PBMC係B細胞。在一些實施態樣中，約3.5%至約35%之經修飾之PBMC係NK細胞。在一些實施態樣中，約4%至約25%之經修飾之PBMC係NK細胞。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，至少約90%至約99%之輸入PBMC係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。在一些實施態樣中，約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%或約95%至約99%之輸入PBMC中至少任一者係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。在一些實施態樣中，至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之輸入PBMC中任一者係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。在一些實施態樣中，至少約90%之輸入PBMC係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。在一些實施態樣中，輸入PBMC係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，至少約90%至約99%之經修飾之PBMC係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。在一些實施態樣中，約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%或約95%至約99%之經修飾之PBMC中至少任一者係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。在一些實施態樣中，至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之經修飾之PBMC中任一者係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。在一些實施態樣中，至少約90%之經修飾之PBMC係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC係由T細胞、B細胞、NK細胞及單核球組成。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，至少約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之輸入PBMC中任一者係T細胞。在一些實施態樣中，至少約25%之輸入PBMC係T細胞。在一些實施態樣中，至少約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%之輸入PBMC中任一者係B細胞。在一些實施態樣中，至少約2.5%之輸入PBMC係B細胞。在一些實施態樣中，至少約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%之輸入PBMC中任一者係NK細胞。在一些實施態樣中，至少約3.5%之輸入PBMC係NK細胞。在一些實施態樣中，至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、35%或40%之輸入PBMC中任一者係單核球。在一些實施態樣中，至少約4%之輸入PBMC係單核球。在一些實施態樣中，至少約25%之輸入PBMC係T細胞；至少約2.5%之輸入PBMC係B細胞；至少約3.5%之輸入PBMC係NK細胞；及至少約4%之輸入PBMC係單核球。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%之經修飾之PBMC中任一者係T細胞。在一些實施態樣中，至少約20%之經修飾之PBMC係T細胞。在一些實施態樣中，至少約0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%之經修飾之PBMC中任一者係B細胞。在一些實施態樣中，至少約2%之經修飾之PBMC係B細胞。在一些實施態樣中，至少約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%之經修飾之PBMC中任一者係NK細胞。在一些實施態樣中，至少約3%之經修飾之PBMC係NK細胞。在一些實施態樣中，至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、35%或40%之經修飾之PBMC中任一者係單核球。在一些實施態樣中，至少約3%之經修飾之PBMC係單核球。在一些實施態樣中，至少約20%之經修飾之PBMC係T細胞；至少約2%之經修飾之PBMC係B細胞；至少約3%之經修飾之PBMC係NK細胞；及至少約3%之經修飾之PBMC係單核球。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，不超過約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%之輸入PBMC中任一者係T細胞。在一些實施態樣中，不超過約70%之輸入PBMC係T細胞。在一些實施態樣中，不超過約5%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、25%、30%、35%、40%或50%之輸入PBMC中任一者係B細胞。在一些實施態樣中，不超過約14%之輸入PBMC係B細胞。在一些實施態樣中，不超過約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或60%之輸入PBMC中任一者係NK細胞。在一些實施態樣中，不超過約35%之輸入PBMC係NK細胞。在一些實施態樣中，不超過約5%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、25%、30%、35%、40%或50%之輸入PBMC中任一者係單核球。在一些實施態樣中，不超過約4%之輸入PBMC係單核球。在一些實施態樣中，不超過約25%之輸入PBMC係T細胞；不超過約2.5%之輸入PBMC係B細胞；不超過約3.5%之輸入PBMC係NK細胞；及不超過約4%之輸入PBMC係單核球。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，不超過約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%之經修飾之PBMC中任一者係T細胞。在一些實施態樣中，不超過約20%之經修飾之PBMC係T細胞。在一些實施態樣中，不超過約0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%之經修飾之PBMC中任一者係B細胞。在一些實施態樣中，不超過約2%之經修飾之PBMC係B細胞。在一些實施態樣中，不超過約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%之經修飾之PBMC中任一者係NK細胞。在一些實施態樣中，不超過約3%之經修飾之PBMC係NK細胞。在一些實施態樣中，不超過約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、35%或40%之經修飾之PBMC中任一者係單核球。在一些實施態樣中，不超過約3%之經修飾之PBMC係單核球。在一些實施態樣中，不超過約20%之經修飾之PBMC係T細胞；不超過約2%之經修飾之PBMC係B細胞；不超過約3%之經修飾之PBMC係NK細胞；及不超過約3%之經修飾之PBMC係單核球。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，約20%至25%、25%至30%、30%至35%、35%至40%、40%至45%、45%至50%、50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%或70%至75%之經修飾之PBMC中任一者係T細胞。在一些實施態樣中，約25%至約70%之經修飾之PBMC係T細胞。在一些實施態樣中，約1%至2.5%、2.5%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%或20%至25%之經修飾之PBMC中任一者係B細胞。在一些實施態樣中，約2.5%至約14%之經修飾之PBMC係B細胞。在一些實施態樣中，約1%至2%、2%至3.5%、3.5%至5%、5%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%或20%至25%之經修飾之PBMC中任一者係B細胞。在一些實施態樣中，約3.5%至約35%之經修飾之PBMC係NK細胞。在一些實施態樣中，約2%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%、20%至25%、25%至30%、30%至35%或35%至40%之經修飾之PBMC中任一者係單核球。在一些實施態樣中，約4%至約25%之經修飾之PBMC係單核球。在一些實施態樣中，約25%至約70%之經修飾之PBMC係T細胞、約2.5%至約14%之經修飾之PBMC係B細胞、約3.5%至約35%之經修飾之PBMC係NK細胞及約4%至約25%之經修飾之PBMC係NK細胞。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，約20%至25%、25%至30%、30%至35%、35%至40%、40%至45%、45%至50%、50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%或70%至75%之經修飾之PBMC中任一者係T細胞。在一些實施態樣中，約25%至約70%之經修飾之PBMC係T細胞。在一些實施態樣中，約1%至2.5%、2.5%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%或20%至25%之經修飾之PBMC中任一者係B細胞。在一些實施態樣中，約2.5%至約14%之經修飾之PBMC係B細胞。在一些實施態樣中，約1%至2%、2%至3.5%、3.5%至5%、5%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%或20%至25%之經修飾之PBMC中任一者係NK細胞。在一些實施態樣中，約3.5%至約35%之經修飾之PBMC係NK細胞。在一些實施態樣中，約2%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%、20%至25%、25%至30%、30%至35%或35%至40%之經修飾之PBMC中任一者係單核球。在一些實施態樣中，約4%至約25%之經修飾之PBMC係單核球。在一些實施態樣中，約25%至約70%之經修飾之PBMC係T細胞、約2.5%至約14%之經修飾之PBMC係B細胞、約3.5%至約35%之經修飾之PBMC係NK細胞及約4%至約25%之經修飾之PBMC係NK細胞。
如本文中所使用，PBMC亦可在操作單核血液細胞(諸如淋巴細胞及單核球)之混合細胞族群的組成之後產製。在一些情況下，輸入PBMC係在減少(諸如除盡)單核血液細胞之混合細胞族群內的某些亞群(諸如B細胞)之後產製。個體的單核血液細胞之混合細胞族群的組成可經操作以使該細胞族群更密切地相似於來自相同個體的全血之白血球分離術產物。在其他實例中，單核血液細胞(例如，小鼠脾細胞)之混合細胞族群的組成亦可經操作以使該細胞族群更密切地相似於自人全血的白血球分離術產物所單離之人PBMC。
在一些實施態樣中，縊縮媒介之投遞並不以顯著方式差別地調節PBMC內不同亞群(諸如B細胞、T細胞、NK細胞或單核球)之存活性。在一些實施態樣中，調理過程並不以顯著方式差別地調節PBMC內不同亞群之存活性。在一些實施態樣中，進一步添加藥劑(包括但不限於下列任一者：生物保存劑或增強PBMC之功能及/或存活性的藥劑)並不以顯著方式差別地調節PBMC內各種亞群之存活性因此在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC內T細胞之百分比及複數個輸入PBMC內T細胞之百分比在數字上的差異不大於約10%。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC內T細胞之百分比及複數個輸入PBMC內T細胞之百分比在數字上的差異不大於約5%、8%、10%、12%、14%、16%、18%或20%中任一者。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC內B細胞之百分比及複數個輸入PBMC內B細胞之百分比在數字上的差異不大於約10%。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC內B細胞之百分比及複數個輸入PBMC內B細胞之百分比在數字上的差異不大於約5%、8%、10%、12%、14%、16%、18%或20%中任一者。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC內NK細胞之百分比及複數個輸入PBMC內NK細胞之百分比在數字上的差異不大於約10%。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC內NK細胞之百分比及複數個輸入PBMC內NK細胞之百分比在數字上的差異不大於約5%、8%、10%、12%、14%、16%、18%或20%中任一者。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC內單核球之百分比及複數個輸入PBMC內單核球之百分比在數字上的差異不大於約10%。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC內單核球之百分比及複數個輸入PBMC內單核球之百分比在數字上的差異不大於約5%、8%、10%、12%、14%、16%、18%或20%中任一者。
抗原
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原係疾病相關抗原。在一些實施態樣中，抗原係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。在一些實施態樣中，抗原係非自身抗原。在一些實施態樣中，抗原係腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。在一些實施態樣中，抗原係衍生自溶解物，諸如疾病細胞之溶解物。在一些實施態樣中，抗原係衍生自腫瘤溶解物。在一些實施態樣中，抗原係腫瘤抗原或腫瘤相關抗原。在一些實施態樣中，抗原係與癌症相關。在一些實施態樣中，癌症係頭頸癌、子宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、肛門周圍癌症、肛門生殖器癌症、口腔癌或唾腺癌。在一些實施態樣中，抗原係頭頸癌抗原、子宮頸癌抗原、外陰癌抗原、陰道癌抗原、陰莖癌抗原、肛門癌抗原、肛門周圍癌症抗原、肛門生殖器癌症抗原、口腔癌抗原、唾液腺癌症抗原、乳癌抗原、皮膚癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌、直腸癌抗原、子宮內膜癌抗原、腎癌抗原、白血病抗原、肺癌抗原、黑色素瘤抗原、非霍奇金氏淋巴瘤抗原、胰癌抗原、前列腺癌抗原或甲狀腺癌抗原。在一些實施態樣中，癌症係實質癌症。在一些實施態樣中，癌症係血液性癌。在一些實施態樣中，癌症係病毒相關癌症。在一些實施態樣中，癌症係HPV相關癌症。在一些實施態樣中，癌症係局部癌症。在一些實施態樣中，癌症係轉移癌。在一些實施態樣中，抗原係與傳染性疾病相關。在一些實施態樣中，傳染性疾病係與HIV、HPV、EBV、MCV、HBV或HCV相關。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原係人類乳突病毒(HPV)抗原。乳突病毒係小型無外膜DNA病毒，其病毒粒子大小為直徑約55 nm。超過100種HPV基因型已經完全表徵且假設存在更高數量。HPV係子宮頸癌以及一些外陰癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌、肛門癌及直腸癌的已知病因。雖然大多數HPV感染係無症狀且自發清除，但持續感染致癌性HPV類型中之一者可進展成前癌或癌症。其他HPV相關疾病可包括尋常疣、掌疣、扁平疣、肛門生殖器疣、肛門病灶、表皮發育異常、局部表皮增生、口腔乳突瘤、疣狀囊腫、喉部乳突瘤病、鱗狀細胞上皮內病變(SIL)、子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)、外陰上皮內瘤樣病變(VIN)及陰道上皮內瘤樣病變(VAIN)。許多已知的人乳突病毒(HPV)類型造成良性病變，其中一子集為致癌性。基於流行病學及親源關係，HPV類型係分類成十五種「高風險類型」(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73及82)及三種「可能高風險類型」(HPV 26、53及66)，彼等一起已知表現為低度及高度子宮頸病變及癌症以及其他肛門生殖器癌症諸如陰門癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、及肛門周圍癌以及頭頸癌。最近，高風險類型HPV 16及18與乳癌的相關性亦經描述。十一種分類為「低風險類型」的HPV類型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72及81)已知表現為良性低度子宮頸病變、生殖器疣及復發性呼吸道乳突瘤病。皮膚的HPV類型5、8及92與皮膚癌相關。在一些HPV相關癌症中，免疫系統受到壓抑且對應地抗腫瘤反應受到顯著損害。見Suresh and Burtness, Am J Hematol Oncol 13(6)：20-27 (2017)。在一些實施態樣中，抗原係多個多肽池，該多個多肽池誘發對抗相同及或不同抗原之反應。在一些實施態樣中，多個抗原池中之抗原不降低針對多個抗原池中之其他抗原的免疫反應。在一些實施態樣中，HPV抗原係包含抗原性HPV表位及一或多個異源性肽序列之多肽。在一些實施態樣中，HPV抗原與自己本身、與其他抗原或與佐劑複合。在一些實施態樣中，HPV係HPV-16或HPV-18。在一些實施態樣中，HPV抗原包含HLA-A2特異性表位。在一些實施態樣中，HPV抗原係HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些實施態樣中，抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之肽。在一些實施態樣中，抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。在一些實施態樣中，HLA-A2限制肽包含SEQ ID NO：1至4中任一者之胺基酸序列。在一些實施態樣中，HPV抗原包含與SEQ ID NO：18至25中任一者具有至少90%相似性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，HPV抗原包含與SEQ ID NO：19具有至少90%相似性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，HPV抗原包含與SEQ ID NO：23具有至少90%相似性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，HPV抗原包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。在較佳實施態樣中，HPV抗原係由SEQ ID NO：19之胺基酸序列組成。在一些實施態樣中，HPV抗原包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。在較佳實施態樣中，HPV抗原係由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成。在一些實施態樣中，抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列。在一些實施態樣中，抗原係複數個抗原，該複數個抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列之至少一者。在一些實施態樣中，抗原係複數個抗原，該複數個抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列之2、3、4、5、6、7或8者。在一些實施態樣中，抗原係複數個抗原，該複數個抗原包含與SEQ ID NO：19具有至少90%類似性之胺基酸序列及與SEQ ID NO：23具有至少90%類似性之胺基酸序列。在較佳實施態樣中，抗原係複數個抗原，該複數個抗原包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列及SEQ ID NO：23之胺基酸序列。在一些實施態樣中，複數個抗原係含有在非共價連接肽池之內。在一些實施態樣中，複數個抗原係含有在非共價連接肽池之內，其中各肽包含不超過一個抗原。在一些實施態樣中，複數個抗原係含有在非共價連接肽池之內，其中SEQ ID NO：19之胺基酸序列及SEQ ID NO：23之胺基酸序列係含有在分開肽之內。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。在進一步實施態樣中，在向個體投予包含該複數個抗原的該經修飾之PBMC之後，其中該複數個抗原包含該複數個免疫原性表位，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。在一些實施態樣中，該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。在一些實施態樣中，免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。在一些實施態樣中，該抗原係包含免疫原性肽表位及一或多個異源性肽序列之多肽。在一些實施態樣中，該抗原係包含在N端及/或C端側接異源性肽序列的免疫原性肽表位之多肽。在一些實施態樣中，該側接異源性肽序列係衍生自疾病相關免疫原性肽。在一些實施態樣中，該側接異源性肽序列係非天然存在序列。在一些實施態樣中，該側接異源性肽序列係衍生自免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施態樣中，該N端側接多肽包含SEQ ID NO：5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO：11至17中任一者之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該抗原能夠被處理成MHC第一型限制性肽及/或MHC第二型限制性肽。
佐劑
如本文中所使用，用語「佐劑(adjuvant)」可指直接或間接調節及/或導致免疫反應之物質。在本發明之一些實施態樣中，佐劑係用於調理PBMC族群(即，PBMC在向個體投予之前係與佐劑培育)。在一些情況下，佐劑係搭配抗原投予，以相較於單獨抗原致效對抗原之免疫反應的增強。因此，佐劑可用於追加誘發對抗原之免疫細胞反應(例如T細胞反應)。在一些實施態樣中，本發明提供經修飾以包含在細胞內之抗原(諸如HPV抗原)及在細胞內之佐劑的PBMC。在一些實施態樣中，經如本文所述之擾動之PBMC係與抗原及佐劑兩者培育。例示性佐劑包括但不限於干擾素基因刺激子(STING)促效劑、視黃酸可誘導基因I (RIG-I)促效劑及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及/或TLR9之促效劑。例示性佐劑包括但不限於CpG ODN、干擾素-α (IFN-α)、聚肌苷酸：聚胞苷酸(polyI：C)、咪喹莫特(imiquimod) (R837)、雷西喹莫特(resiquimod) (R848)或脂多醣(LPS)。在一些實施態樣中，佐劑係CpG ODN、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I：C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑。在具體實施態樣中，佐劑係CpG ODN。在一些實施態樣中，該佐劑係CpG ODN。在一些實施態樣中，該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。在一些實施態樣中，CpG ODN佐劑包含來自CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03之群組的選擇。在一些實施態樣中，CpG ODN佐劑係CpG ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO：30))或CpG ODN 2006(亦稱為CpG 7909)(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO：31))寡核苷酸。在一些實施態樣中，佐劑係CpG 7909。在一些實施態樣中，RIG-I促效劑包含聚肌苷酸：聚胞苷酸(polyI：C)。多種佐劑亦可搭配抗原使用以增強免疫反應的誘發。在一些實施態樣中，經修改的PBMC包含超過一種佐劑。多種佐劑亦可搭配抗原使用以增強免疫反應的誘發。在一些實施態樣中，經修改的PBMC包含超過一種佐劑。在一些實施態樣中，經修改的PBMC包含佐劑CpG ODN、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I：C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑之任何組合。
在任何本文所述之實施態樣中，除非以其他方式指示，否則佐劑可指(a)與經擾動的輸入PBMC培育且通過其之佐劑、(b)與PBMC培育而調理該PBMC之佐劑、(c)與經修飾之PBMC向個體共投之佐劑。
在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.01 µM與約10 mM之間。例如，在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑濃度係小於約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑濃度係大於約10 mM。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑濃度係介於約0.01 µM與約0.1 µM之間、介於約0.1 µM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之佐劑濃度係1 µM。
在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.01 µM與約10 mM之間。例如，在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係小於約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係大於約10 mM。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.01 µM與約0.1 µM之間、介於約0.1 µM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原的濃度係1 µM。
在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000：1與約1：10000之間中任一者。例如，在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之莫耳比係約10000：1、約1000：1、約100：1、約10：1、約1：1、約1：10、約1：100、約1：1000或約1：10000中任一者。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000：1與約1000：1之間、介於約1000：1與約100：1之間、介於約100：1與約10：1之間、介於約10：1與約1：1之間、介於約1：1與約1：10之間、介於約1：10與約1：100之間、介於約1：100與約1：1000之間、介於約1：1000與約1：10000之間中任一者。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之莫耳比係約200：1。在一些實施態樣中，與經擾動的輸入PBMC培育之抗原對佐劑之莫耳比係約20：1。
在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含佐劑的濃度介於約1 nM與約1 mM之間。例如，在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含佐劑的濃度係小於約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含佐劑的濃度高於約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含佐劑的濃度係介於約1 nM至約10 nM之間、約0.1 µM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含佐劑的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含佐劑的濃度為約1 µM。
在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含抗原的濃度介於約1 nM與約1 mM之間。例如，在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含抗原的濃度係小於約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含該抗原的濃度高於約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含抗原的濃度係介於約1 nM至約10 nM之間、約0.1 µM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含抗原的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含抗原的濃度為約1 µM。
在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度介於約1 nM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度係小於約0.1 nM、約1 nM、約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度高於約10 mM。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度係介於約0.1 nM至約1 nM之間、約1 nM至約10 nM、約10 nM至約100 nM之間、約0.1 µM與約1 µM、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度介於約10 nM與約100 nM之間。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度介於約1 nM與約10 nM之間。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含抗原的濃度為約50 nM。在一些實施態樣中，核酸係mRNA。
在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度介於約0.01 µg/mL至約10 mg/mL之間。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度係小於約0.01 µg/mL、約0.1 µg/mL、約1 µg/mL、約10 µg/mL、約100 µg/mL、約1 mg/mL或約10 mg/mL中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度高於約10 µg/mL。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度介於約0.001 µg/mL至約0.1 µg/mL之間、約0.1 µg/mL及約1 µg/mL、介於約1 µg/mL與約10 µg/mL之間、介於約10 µg/mL與約100 µg/mL之間、介於約100 µg/mL與約1 mg/mL之間或介於1 mg/mL與約10 mg/mL之間中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含編碼抗原之核酸的濃度介於約0.1 µg/mL與約1 mg/mL之間。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含抗原的濃度係約1 µg/mL、約2 µg/mL、約5 µg/mL、約10 µg/mL、約20 µg/mL、約25 µg/mL、約40 µg/mL、約50 µg/mL、約70 µg/mL、約100 µg/mL、約200 µg/mL或約300 µg/mL或約500 µg/mL中任一者。在一些實施態樣中，核酸係mRNA。
在一些實施態樣中，經修飾之PBMC中之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000：1與約1：10000之間中任一者。例如，在一些實施態樣中，經修飾之PBMC中之抗原對佐劑之莫耳比係約10000：1、約1000：1、約100：1、約10：1、約1：1、約1：10、約1：100、約1：1000或約1：10000中任一者。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC中之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000：1與約1000：1之間、介於約1000：1與約100：1之間、介於約100：1與約10：1之間、介於約10：1與約1：1之間、介於約1：1與約1：10之間、介於約1：10與約1：100之間、介於約1：100與約1：1000之間、介於約1：1000與約1：10000之間中任一者。在一些實施態樣中，在經修飾之PBMC中抗原對佐劑之莫耳比係約200：1。在一些實施態樣中，在經修飾之PBMC中抗原對佐劑之莫耳比係約20：1。
在一些實施態樣中，抗原與自己本身、與其他抗原或與佐劑複合。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
PBMC特徵之進一步修飾
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應複數個經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC之存活及/或功能。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應複數個經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC在冷凍-解凍循環中的存活及/或功能。在一些實施態樣中，藥劑係冷凍保存劑及/或低溫保存劑。在一些實施態樣中，相較於在任何冷凍解凍循環之前不包含該藥劑的對應複數個PBMC，冷凍保存劑或低溫保存劑造成包含該藥劑之複數個PBMC不超過10%或20%的細胞死亡。在一些實施態樣中，至少約70%、約80%或約90%的複數個經修飾之PBMC在至多1、2、3、4、5次冷凍解凍循環之後係存活。在一些實施態樣中，藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。在一些實施態樣中，藥劑係白蛋白。在一些實施態樣中，白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。在一些實施態樣中，藥劑係人白蛋白。在一些實施態樣中，藥劑係以下一或多者：二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。在一些實施態樣中，二價金屬陽離子係Mg2+
、Zn2+
或Ca2+
中之一或多者。在一些實施態樣中，藥劑係以下一或多者：丙酮酸鈉、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鈉金屬離子、鉀金屬離子、鎂金屬離子、氯化物、乙酸鹽、葡萄糖酸鹽、蔗糖、氫氧化鉀或氫氧化鈉。在一些實施態樣中，藥劑係以下一或多者：丙酮酸鈉、腺嘌呤、Rejuvesol®、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、PlasmaLyte®、DMSO、Cryostor® CS2、Cryostor® CS5、Cryostor® CS10、Cryostor® CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、HypoThermosol®。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，經修飾之PBMC係經進一步修飾以增加一或多種共刺激分子之表現。在一些實施態樣中，該共刺激分子係B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC包含導致該一或多種共刺激分子表現增加的核酸。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC包含導致該一或多種共刺激分子表現增加的mRNA。在一些實施態樣中，共刺激分子係刺激T細胞活化中之信號2效應物。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，經修飾之PBMC係經進一步修飾以增加一或多種細胞介素之表現。在一些實施態樣中，細胞介素係IL-2、IL-12、IL-21或IFNα2中一或多者。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC包含導致該一或多種細胞介素表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施態樣中，細胞介素係刺激T細胞活化中之信號3效應物。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC中至少一個細胞係HLA-A2表現陽性。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含進一步修飾以調節MHC第一型表現。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含進一步修飾以調節HLA-A02 MHC第I型表現。在一些實施態樣中，經修飾之PBMC包含進一步修飾以調節MHC第II型表現。在一些實施態樣中，相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修飾的對應經修飾之PBMC所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修飾之PBMC所起始之先天免疫反應係減少。在一些實施態樣中，相較於不包含該進一步修飾的對應經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。在一些實施態樣中，相較於不包含該進一步修飾的對應經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期係增加約10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或超過500倍中任一者。在一些實施態樣中，該經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期基本上係與不包含該進一步修飾的對應經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期相同。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，該過程進一步包含使該輸入PBMC及/或該經修飾之PBMC與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC的存活及/或功能。
PBMC之調理
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC係經調理。在進一步實施態樣中，複數個經修飾之PBMC係經成熟。在一些實施態樣中，複數個PBMC係在縊縮媒介之投遞之後經調理。在一些實施態樣中，包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC係與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該縊縮投遞抗原及/或佐劑之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，在與該第二佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原及/或該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC係在縊縮媒介之投遞之後經調理。在一些實施態樣中，包含該縊縮投遞抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC係與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該縊縮投遞抗原及/或佐劑之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原及/或佐劑且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及/或該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及/或該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及c)使包含該縊縮投遞抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該縊縮投遞抗原及/或佐劑之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含在與該第二佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原及/或該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，縊縮投遞佐劑與調理佐劑相同。在一些實施態樣中，縊縮投遞佐劑與調理佐劑不同。
在一些實施態樣中，與經修飾之PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.01 µM與約10 mM之間。例如，在一些實施態樣中，與經修飾之PBMC培育之抗原的濃度係小於約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，與經修飾之PBMC培育之抗原的濃度係大於約10 mM。在一些實施態樣中，與經修飾之PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.01 µM與約0.1 µM之間、介於約0.1 µM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施態樣中，與經修飾之PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，與經修飾之PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施態樣中，與經修飾之PBMC培育之抗原的濃度係1 µM。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC係與佐劑培育約1至約24小時而調理該經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC係與佐劑培育約2至約10小時而調理該經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC係與佐劑培育約3至約6小時而調理該經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC係與佐劑培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中任一者而調理該經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC係與佐劑培育約4小時而調理該經修飾之PBMC。
在一些實施態樣中，複數個PBMC係在縊縮媒介之投遞之前經調理。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC係與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC。在一些實施態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含在使該經調理之複數個輸入PBMC通過細胞變形縊縮之前，自該調理佐劑單離該經調理之複數個輸入PBMC。在一些實施態樣中，提供經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原及/或佐劑且藉由包含下列步驟之製程製備：a)使複數個輸入PBMC與調理佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；b)使包含經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及/或該佐劑通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及/或該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及/或該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，過程進一步包含在使該經調理之複數個輸入PBMC通過細胞變形縊縮之前，自該調理佐劑單離該經調理之複數個輸入PBMC。在一些實施態樣中，縊縮投遞佐劑與調理佐劑相同。在一些實施態樣中，縊縮投遞佐劑與調理佐劑不同。
在一些實施態樣中，與輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.01 µM與約10 mM之間。例如，在一些實施態樣中，與輸入PBMC培育之抗原的濃度係小於約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，與輸入PBMC培育之抗原的濃度係大於約10 mM。在一些實施態樣中，與輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.01 µM與約0.1 µM之間、介於約0.1 µM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施態樣中，與輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，與輸入PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施態樣中，與輸入PBMC培育之抗原的濃度係1 µM。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個輸入PBMC係與佐劑培育約1至約24小時而調理該輸入PBMC。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC係與佐劑培育約2至約10小時而調理該輸入PBMC。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC係與佐劑培育約3至約6小時而調理該輸入PBMC。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC係與佐劑培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中任一者而調理該輸入PBMC。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC係與佐劑培育約4小時而調理該輸入PBMC。
在一些實施態樣中，提供經調理之複數個PBMC，該經調理之複數個PBMC包含抗原，其藉由使包含該抗原之該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。在一些實施態樣中，提供包含抗原之經調理之複數個PBMC，其藉由在將該抗原導入該PBMC之前使該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
在根據以上所述之方法、組成物或複數個PBMC中任一者之一些實施態樣中，與PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.01 µM與約10 mM之間。例如，在一些實施態樣中，與PBMC培育之抗原的濃度係小於約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM中任一者。在一些實施態樣中，與PBMC培育之抗原的濃度係大於約10 mM。在一些實施態樣中，與PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.01 µM與約0.1 µM之間、介於約0.1 µM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施態樣中，與PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施態樣中，與PBMC培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施態樣中，與PBMC培育之抗原的濃度係1 µM。
在根據本文所述之經調理之複數個PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個PBMC係與佐劑培育約1至約24小時而調理該PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC係與佐劑培育約2至約10小時而調理該PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC係與佐劑培育約3至約6小時而調理該PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC係與佐劑培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中任一者而調理該PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC係與佐劑培育約4小時而調理該PBMC。
在根據本文所述之經調理之複數個PBMC中任一者之一些實施態樣中，該經調理之複數個經修飾之PBMC中一或多個共刺激分子相較於未經調理之複數個經修飾之PBMC係經上調。在一些實施態樣中，經調理之複數個經修飾之PBMC的細胞亞族群中一或多個共刺激分子相較於未經調理之複數個經修飾之PBMC的細胞亞族群係經上調。在一些實施態樣中，經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中一或多個共刺激分子相較於未經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞係經上調。在一些實施態樣中，共刺激分子係CD80及/或CD86。在一些實施態樣中，共刺激分子係CD86。在一些實施態樣中，該CD80及/或CD86在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在未經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中係經上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。在一些實施態樣中，該CD80及/或CD86在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在未經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中係經上調約1.2倍至約1.5倍、約1.5倍至約1.8倍、約1.8倍至約2倍、約2倍至約3倍、約3倍至約4倍、約4倍至約5倍、約5倍至約8倍、約8倍至約10倍、約10倍至約20倍、約20倍至約50倍、約50倍至約100倍、約100倍至約200倍、約200倍至約500倍或超過約500倍中任一者。在一些實施態樣中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者在經調理之複數個經修飾之PBMC中的表現相較於未經調理之複數個經修飾之PBMC中係經增加。在一些實施態樣中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者在經調理之複數個經修飾之PBMC的細胞亞族群中的表現相較於未經調理之複數個經修飾之PBMC的細胞亞族群中係經增加。在一些實施態樣中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者在經調理之複數個經修飾之PBMC中的表現相較於未經調理之複數個經修飾之PBMC中增加約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。在一些實施態樣中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者在該經調理之複數個經修飾之PBMC中的表現相較於在未經調理之複數個經修飾之PBMC中增加約1.2倍至約1.5倍、約1.5倍至約1.8倍、約1.8倍至約2倍、約2倍至約3倍、約3倍至約4倍、約4倍至約5倍、約5倍至約8倍、約8倍至約10倍、約10倍至約20倍、約20倍至約50倍、約50倍至約100倍、約100倍至約200倍、約200倍至約500倍或超過約500倍中任一者。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之核酸。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之mRNA。
微流體系統及其組分
微流體通道提供細胞變形縊縮
在一些實施態樣中，本發明提供藉由使包含PBMC之細胞懸浮液通過縊縮來調節免疫反應之方法，其中該縊縮使PBMC變形，藉此造成PBMC的擾動以使抗原及/或佐劑進入PBMC，其中該縊縮係含有在微流體通道中。在一些實施態樣中，多個縊縮可被平行及/或串聯放置在微流體通道中。含有在本文中揭示之方法所使用的細胞變形縊縮之例示性微流體通道係描述於WO2013059343。具有在本文中揭示之方法所使用的孔之例示性表面係描述於WO2017041050。
在一些實施態樣中，微流體通道包括管腔且經組態以使懸浮於緩衝劑中之PBMC可通過，其中微流體通道包括縊縮。微流體通道可由一些材料中任一者製成，包括矽、金屬(例如不鏽鋼)、塑膠(例如聚苯乙烯)、陶瓷、玻璃、結晶基材、非晶基材或聚合物(例如聚-甲基甲基丙烯酸酯(PMMA)、PDMS、環烯共聚物(COC)等)。微流體通道的製造可藉由任何所屬技術領域中已知方法執行，包括乾蝕刻、濕蝕刻、光微影術、射出成型、雷射剝蝕或SU-8遮罩。
在一些實施態樣中，微流體通道中之縊縮包括入口部分、中點及出口部分。在一些實施態樣中，微流體通道中之縊縮的長度、深度及寬度可變化。在一些實施態樣中，微流體通道中之縊縮之直徑隨著輸入PBMC的直徑變化。判定PBMC直徑之方法係係所屬技術領域中已知；例如，高內涵成像、細胞計數器或流動式細胞測量術。在一些實施態樣中，微流體通道中之縊縮之直徑係複數個輸入PBMC平均直徑的約20%至約99%。在一些實施態樣中，縊縮大小係PBMC平均直徑或PBMC亞族群平均直徑的約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約99%。在一些實施態樣中，縊縮大小係複數個輸入PBMC平均最小橫截面距離的約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約99%。在一些實施態樣中，通道包含介於約2 μm與約10 μm之間或其間的任何寬度或寬度範圍的縊縮寬度。在一些實施態樣中，通道包含介於約3 μm與約10 μm之間。在一些實施態樣中，通道包含介於約3 μm與約6 μm之間。在一些實施態樣中，通道包含介於約4.2 μm與約4.8 μm之間。例如，縊縮寬度可為約2μm、約2.5μm、約3μm、約3.5μm、約4μm、約4.5μm、約5μm、約5.5μm、約6μm、約6.5μm或約7μm中任一者。在一些實施態樣中，通道包含約10 µm的縊縮長度及約3.5 µm的縊縮寬度。在一些實施態樣中，通道包含約10 µm的縊縮長度及約4 µm的縊縮寬度。在一些實施態樣中，通道包含約10 µm的縊縮長度及約4.5 µm的縊縮寬度。通道的橫截面、入口部分、中點及出口部分亦可變化。例如，橫截面的形狀可為環狀、橢圓形、伸長裂縫、正方形、六角形或三角形。入口部分定義縊縮角度，其中縊縮角度經最佳化以減少通道堵塞並經最佳化以增強投遞化合物至PBMC中。出口部分的角度也可變化。例如，出口部分的角度經組態以減少可導致非層流之紊流的可能性。在一些實施態樣中，入口部分及/或出口部分的壁係直線。在其他實施態樣中，入口部分及/或出口部分的壁係彎曲。
具有孔的表面提供細胞變形縊縮
在一些實施態樣中，本發明提供藉由使包含複數個PBMC之細胞懸浮液通過縊縮來調節免疫反應之方法，其中該縊縮使PBMC變形，藉此造成PBMC的擾動以使抗原及/或佐劑進入PBMC，其中該縊縮係孔或含有在孔中。在一些實施態樣中，孔係含有在表面中。具有在本文中揭示之方法所使用的孔之例示性表面係描述於WO2017041050。
在本文中揭示之表面可由一些材料中任一者製成且採取一些形式中任一者。在一些實施態樣中，表面係過濾器。在一些實施態樣中，表面係膜。在一些實施態樣中，過濾器係切向流過濾器。在一些實施態樣中，表面係海綿或海綿樣基質。在一些實施態樣中，表面係基質。
在一些實施態樣中，表面係曲折路徑表面。在一些實施態樣中，曲折路徑表面包含乙酸纖維素。在一些實施態樣中，表面包含選自但不限於合成或天然聚合物、聚碳酸酯、矽、玻璃、金屬、合金、硝酸纖維素、銀、乙酸纖維素、尼龍、聚酯、聚醚碸、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合纖維素酯、瓷及陶瓷的材料。
在本文中揭示之表面可具有所屬技術領域中已知之任何形狀；例如3維形狀。表面的2維形狀可為但不限於環狀、橢圓形、圓形、正方形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形或八角形。在一些實施態樣中，表面係圓形形狀。在一些實施態樣中，表面3維形狀係圓柱狀、錐狀或立方形。
表面可具有各種橫截面寬度及厚度。在一些實施態樣中，表面橫截面寬度係介於約1 mm與約1 m之間或其間的任何橫截面寬度或橫截面寬度範圍。在一些實施態樣中，表面具有定義厚度。在一些實施態樣中，表面厚度係均勻。在一些實施態樣中，表面厚度係可變。例如，在一些實施態樣中，表面的部分比起表面的其他部分更厚或更薄。在一些實施態樣中，表面厚度變化約1%至約90%或其間的任何百分比或百分比範圍。在一些實施態樣中，表面係介於約0.01 µm至約5 mm厚之間或其間的任何厚度或厚度範圍。
孔通道的入口及出口可具有多種角度。可選擇孔的角度，以最小化當PBMC通過孔時的堵塞。在一些實施態樣中，通過表面的流速係介於約0.001 mL/cm2
/sec至約100 L/cm2
/sec之間或其間的任何速率或速率範圍。例如，入口或出口部分的角度可介於約0與約90度之間。在一些實施態樣中，入口或出口部分可大於90度。在一些實施態樣中，孔具有相同的入口及出口角度。在一些實施態樣中，孔具有不同的入口及出口角度。在一些實施態樣中，孔邊緣係平滑，例如圓化或彎曲。平滑孔邊緣具有連續、扁平且平整的表面，沒有突起、嵴或不平整部分。在一些實施態樣中，孔邊緣係銳利。銳利孔邊緣具有尖的或呈銳角的薄邊緣。在一些實施態樣中，孔通道係直的。直孔通道不含有彎曲、折彎、角度或其他不規則。在一些實施態樣中，孔通道係彎曲。彎曲孔通道被折彎或偏離直線。在一些實施態樣中，孔通道具有多個彎曲，例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個彎曲。
孔可具有所屬技術領域中已知之任何形狀，包括2維或3維形狀。孔形狀(例如橫截面形狀)可為但不限於環狀、橢圓形、圓形、正方形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形及八角形。在一些實施態樣中，孔的橫截面係圓形形狀。在一些實施態樣中，孔的3維形狀係圓柱狀或錐狀。在一些實施態樣中，孔具有波形入口及出口形狀。在一些實施態樣中，在給定表面內的孔之孔形狀係同質性(即一致或規則)。在一些實施態樣中，在給定表面內的孔之孔形狀係異質性(即混合或變化)。
本文所述之表面可具有各種孔總數。在一些實施態樣中，孔涵蓋約10%至約80%的總表面積。在一些實施態樣中，表面含有約1.0×105
至約1.0×1030
個孔總數或其間的任何數量或數量範圍。在一些實施態樣中，表面包含介於約10與約1.0×1015
個孔/mm2
表面積。
孔可以許多方式分布在給定表面內。在一些實施態樣中，孔係平行分布在給定表面內。在一該實例中，孔在給定表面內係以相同方向並排分布且相隔相同距離。在一些實施態樣中，孔分布係有順序或同質性。在一該實例中，孔在給定表面內係以規則、系統性模式分布或相隔相同距離。在一些實施態樣中，孔分布係隨機或異質性。在一該實例中，孔在給定表面內係以不規則、無序模式分布或相隔不同距離。在一些實施態樣中，多個表面係以系列分布。多個表面的表面大小、形狀及/或粗糙度可為同質性或異質性。多個表面可進一步含有具有同質性或異質性孔大小、形狀及/或數量的孔，藉此得以同時投遞各種化合物至不同PBMC類型中。
在一些實施態樣中，個別孔具有均勻的寬度尺寸(即，沿著孔通道的長度為恆定寬度)。在一些實施態樣中，個別孔具有可變的寬度(即，沿著孔通道的長度增加或降低寬度)。在一些實施態樣中，在給定表面內的孔具有相同的個別孔深度。在一些實施態樣中，在給定表面內的孔具有不同的個別孔深度。在一些實施態樣中，孔係彼此緊鄰。在一些實施態樣中，孔係彼此分離一距離。在一些實施態樣中，孔係彼此分離約0.001 µm至約30 mm的距離或其間的任何距離或距離範圍。
在一些實施態樣中，表面係經材料塗佈。材料可選自任何所屬技術領域中已知之材料，包括但不限於鐵氟龍、黏著劑塗層、界面活性劑、蛋白質、黏著性分子、抗體、抗凝血劑、調節細胞功能之因子、核酸、脂質、碳水化合物或跨膜蛋白質。在一些實施態樣中，表面係經聚乙烯吡咯烷酮(PVP)塗佈。在一些實施態樣中，材料係共價連接至表面。在一些實施態樣中，材料係非共價連接或吸附至表面。在一些實施態樣中，當PBMC通過孔時，表面分子係經釋放。
在一些實施態樣中，表面具有經修改的化學性質。在一些實施態樣中，表面係極性。在一些實施態樣中，表面係親水性。在一些實施態樣中，表面係非極性。在一些實施態樣中，表面係疏水性。在一些實施態樣中，表面係帶電。在一些實施態樣中，表面係帶正電及/或帶負電。在一些實施態樣中，表面可在一些區域帶正電且在其他區域帶負電。在一些實施態樣中，表面具有整體正電或整體負電。在一些實施態樣中，表面可為平滑、經電拋光、粗糙或經電漿處理。在一些實施態樣中，表面包含兩性離子或雙極化合物。在一些實施態樣中，表面係經電漿處理。
在一些實施態樣中，表面係含有在較大模組中。在一些實施態樣中，表面係含有在注射器中，諸如塑膠或玻璃注射器。在一些實施態樣中，表面係含有在塑膠過濾器固定器中。在一些實施態樣中，表面係含有在微量吸管尖中。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。在一些實施態樣中，一或多種核酸係經攜帶於一或多種媒劑中，其中一或多種媒劑係經投遞至輸入PBMC。在一些實施態樣中，媒劑係病毒或病毒相關粒子。在一些實施態樣中，病毒包含下列一或多者：腺病毒、腺相關病毒(AAV)、桿狀病毒、疱疹病毒或反轉錄病毒。在一些實施態樣中，病毒包含AAV。在一些實施態樣中，媒劑係基於脂質之媒劑，例如脂質體。在一些實施態樣中，媒劑係奈米粒子。
細胞擾動
在一些實施態樣中，本發明提供藉由使包含PBMC之細胞懸浮液通過縊縮來調節免疫反應之方法，其中該縊縮使PBMC變形，藉此造成PBMC的擾動以使抗原及/或佐劑進入PBMC，其中PBMC的擾動係允許PBMC外的材料移動至PBMC中的PBMC之缺口(例如洞、裂口、腔、口、孔、破裂、縫隙或穿孔)。變形可藉由例如機械應變或機械應變及剪力造成。在一些實施態樣中，擾動係PBMC細胞膜內的擾動。在一些實施態樣中，擾動係短暫的。在一些實施態樣中，PBMC擾動持續約1.0×10-9
秒至約2小時或其間的任何時間或時間範圍。在一些實施態樣中，PBMC擾動持續約1.0×10‑9
秒至約1秒、約1秒至約1分鐘或約1分鐘至約1小時。在一些實施態樣中，PBMC擾動持續介於約1.0×10-9
至約1.0×10-1
、約1.0×10-9
至約1.0× 10-2
、約1.0×10-9
至約1.0×10-3
、約1.0×10-9
至約1.0×10-4
、約1.0×10-9
至約1.0×10-5
、約1.0×10-9
至約1.0×10-6
、約1.0×10-9
至約1.0×10-7
或約1.0×10-9
至約1.0×10-8
秒中任一者之間。在一些實施態樣中，PBMC擾動持續約1.0×10-8
至約1.0×10-1
、約1.0×10-7
至約1.0×10-1
、約1.0×10-6
至約1.0×10-1
、約1.0×10-5
至約1.0×10-1
、約1.0×10-4
至約1.0×10-1
、約1.0×10-3
至約1.0×10-1
或約1.0×10‑2
至約1.0×10-1
秒中任一者。藉由本文所述之方法所產生的PBMC擾動(例如孔或洞)不是因為形成多聚體孔結構(諸如補體或細菌溶血素所產生者)之蛋白質次單位總成形成。
當PBMC通過縊縮時，縊縮暫時授予損傷至PBMC膜，允許材料被動擴散通過擾動。在一些實施態樣中，PBMC僅變形短暫的時間期間，大約100 μs以最小化經由細胞傳訊機制活化細胞凋亡途徑的機會，但其他持續時間也是可能的(例如從數奈秒至數小時不等)。在一些實施態樣中，PBMC變形約1.0×10-9
秒至約2小時或其間的任何時間或時間範圍。在一些實施態樣中，PBMC變形約1.0×10-9
秒至約1秒、約1秒至約1分鐘或約1分鐘至約1小時。在一些實施態樣中，PBMC變形係介於約1.0×10-9
至約1.0×10-1
、約1.0×10-9
至約1.0×10-2
、約1.0×10-9
至約1.0×10-3
、約1.0×10-9
至約1.0×10-4
、約1.0×10-9
至約1.0×10-5
、約1.0×10-9
至約1.0×10-6
、約1.0×10-9
至約1.0×10-7
或約1.0×10-9
至約1.0×10-8
秒中任一者之間。在一些實施態樣中，PBMC變形係約1.0×10-8
至約1.0×10-1
、約1.0×10-7
至約1.0×10-1
、約1.0×10-6
至約1.0×10-1
、約1.0×10-5
至約1.0×10-1
、約1.0×10-4
至約1.0×10-1
、約1.0×10-3
至約1.0×10-1
或約1.0×10-2
至約1.0×10-1
秒中任一者。在一些實施態樣中，使PBMC變形包括使PBMC變形從(但不限於)約1 μs至至少約750 µs不等的時間，例如至少約1 µs、10 μs、50 μs、100 μs、500 μs或750 μs。
在一些實施態樣中，抗原及/或佐劑進入PBMC中與PBMC通過縊縮及/或PBMC擾動同時發生。在一些實施態樣中，化合物進入PBMC中發生在PBMC通過縊縮之後。在一些實施態樣中，化合物進入PBMC中發生在PBMC通過縊縮之後大約數分鐘。在一些實施態樣中，化合物進入PBMC中發生在PBMC通過縊縮之後約1.0×10-2
秒至至少約30分鐘。例如，化合物進入PBMC中發生在PBMC通過縊縮之後約1.0×10-2
秒至約1秒、約1秒至約1分鐘或約1分鐘至約30分鐘。在一些實施態樣中，化合物進入PBMC中發生在PBMC通過縊縮之後約1.0×10-2
秒至約10分鐘、約1.0×10-2
秒至約5分鐘、約1.0×10-2
秒至約1分鐘、約1.0×10-2
秒至約30秒、約1.0×10-2
秒至約10秒、約1.0×10-2
秒至約1秒或約1.0×10-2
秒至約0.1秒。在一些實施態樣中，化合物進入PBMC中發生在PBMC通過縊縮之後約1.0×10-1
秒至約10分鐘、約1秒至約10分鐘、約10秒至約10分鐘、約50秒至約10分鐘、約1分鐘至約10分鐘或約5分鐘至約10分鐘。在一些實施態樣中，在PBMC通過縊縮之後的擾動在大約PBMC通過縊縮之後約五分鐘之內修正。
在一些實施態樣中，在通過縊縮之後的細胞存活性係約5%至約100%。在一些實施態樣中，在通過縊縮之後的細胞存活性係至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施態樣中，細胞存活性係在PBMC通過縊縮之後約1.0×10-2
秒至至少約10天測量。例如，細胞存活性係在PBMC通過縊縮之後約1.0×10-2
秒至約1秒、約1秒至約1分鐘、約1分鐘至約30分鐘或約30分鐘至約2小時測量。在一些實施態樣中，細胞存活性係在PBMC通過縊縮之後約1.0×10-2
秒至約2小時、約1.0×10-2
秒至約1小時、約1.0×10-2
秒至約30分鐘、約1.0×10-2
秒至約1分鐘、約1.0×10-2
秒至約30秒、約1.0×10-2
秒至約1秒或約1.0×10-2
秒至約0.1秒測量。在一些實施態樣中，細胞存活性係在PBMC通過縊縮之後約1.5小時至約2小時、約1小時至約2小時、約30分鐘至約2小時、約15分鐘至約2小時、約1分鐘至約2小時、約30秒至約2小時或約1秒至約2小時測量。在一些實施態樣中，細胞存活性係在PBMC通過縊縮之後約2小時至約5小時、約5小時至約12小時、約12小時至約24小時或約24小時至約10天測量。
投遞參數
一些參數可影響化合物的投遞至藉由本文所述之方法用於調節免疫反應之PBMC。在一些實施態樣中，細胞懸浮液在通過縊縮之前、之同時或之後與化合物接觸。PBMC可懸浮在包括待投遞化合物的溶液中通過縊縮，儘管化合物可在PBMC通過縊縮之後添加至細胞懸浮液。在一些實施態樣中，待投遞的化合物係塗佈在縊縮上。
可影響化合物的投遞至PBMC中之參數實例包括但不限於縊縮的尺寸、縊縮的入口角度、縊縮的表面性質(例如粗糙度、化學修改、親水性、疏水性等)、作業流速(例如通過縊縮的細胞通過時間)、PBMC濃度、細胞懸浮液中的化合物濃度及在通過縊縮之後回收或培育PBMC的時間量可影響投遞化合物進入PBMC中。影響化合物投遞至PBMC中之額外參數可包括PBMC在縊縮中的流速、縊縮中的剪切速率、細胞懸浮液的黏度、垂直於流流速之流速組分及在縊縮中的時間。此外，呈串聯及/或平行之多個包含通道之晶片可影響投遞至PBMC。呈平行之多個晶片可用於增強通量。該等參數可經設計以控制化合物的投遞。在一些實施態樣中，PBMC濃度從約10至至少約1012
個細胞/mL或其間的任何濃度或濃度範圍不等。在一些實施態樣中，投遞化合物濃度可從約10 ng/mL至約1 g/mL不等或其間的任何濃度或濃度範圍。在一些實施態樣中，投遞化合物濃度可從約1 pM至至少約2 M不等或其間的任何濃度或濃度範圍。
本揭露之方法所使用的溫度可經調整以影響化合物投遞及細胞存活性。在一些實施態樣中，方法係在介於約-5℃與約45℃之間執行。例如，方法可在室溫(例如，約20℃)、生理溫度(例如，約37℃)、高於生理溫度(例如，大於約37℃至45℃或更高)或減少溫度(例如，約-5℃至約4℃)或這些例示性溫度之間的溫度下進行。
可利用各種方法驅動PBMC通過縊縮。例如，可藉由泵施加壓力在入口側(例如，壓縮機)、可藉由真空泵施加真空在出口側、可經由管施加毛細作用及/或系統可為重力供給。亦可使用基於位移的流系統(例如，注射泵、蠕動泵、手動注射器或吸量管、活塞等)。在一些實施態樣中，PBMC藉由正壓或負壓通過縊縮。在一些實施態樣中，PBMC藉由恆定壓力或可變壓力通過縊縮。在一些實施態樣中，使用注射器施加壓力。在一些實施態樣中，壓力係使用氣體施加的正壓(例如來自氣體鋼瓶)。在一些實施態樣中，使用泵施加壓力。在一些實施態樣中，泵係蠕動泵或隔膜泵。在一些實施態樣中，使用真空施加壓力。在一些實施態樣中，PBMC藉由重力通過縊縮。在一些實施態樣中，PBMC藉由離心力通過縊縮。在一些實施態樣中，PBMC藉由毛細壓力通過縊縮。
在一些實施態樣中，流體流引導PBMC通過縊縮。在一些實施態樣中，流體流在PBMC通過縊縮之前係紊流。紊流係其中給定點的流速在量值及方向上不穩定變化的流體流。在一些實施態樣中，通過縊縮的流體流係層流。層流涉及流體中靠近固體界限不間斷的流，其中流在每個點的方向維持恆定。在一些實施態樣中，流體流在PBMC通過縊縮之後係紊流。PBMC通過縊縮的流速可變化。在一些實施態樣中，PBMC以均勻的細胞速度通過縊縮。在一些實施態樣中，PBMC以波動的細胞速度通過縊縮。
在其他實施態樣中，使用組合處理來調節免疫反應，藉由使包含PBMC之細胞懸浮液通過縊縮，其中該縊縮使PBMC變形，藉此造成PBMC的擾動以使抗原及/或佐劑進入PBMC，例如本文所述之方法，接著暴露至縊縮下游的電場。在一些實施態樣中，PBMC在通過縊縮之後通過藉由至少一個電極產製的電場。在一些實施態樣中，電場協助化合物投遞至PBMC內的第二位置，諸如PBMC細胞核。例如，細胞變形縊縮與電場之組合投遞編碼抗體之質體至PBMC中(例如細胞核)，導致重新(de novo)產生抗體。在一些實施態樣中，一或多個電極靠近細胞變形縊縮以產製電場。在一些實施態樣中，電場係介於約0.1 kV/m至約100 MV/m之間或其間的任何數量或數量範圍。在一些實施態樣中，使用積體電路以提供驅動電極的電信號。在一些實施態樣中，將PBMC暴露至脈衝寬度介於約1 ns至約1 s之間及期間介於約100 ns至約10 s之間或其間的任何時間或時間範圍的電場。
用於投遞至PBMC之細胞懸浮液
細胞懸浮液可為混合或經純化的族群或複數個PBMC。在一些實施態樣中，細胞懸浮液係混合細胞族群，諸如全血。在一些實施態樣中，細胞懸浮液係經純化的細胞族群，諸如經純化的PBMC族群(例如複數個PBMC)。在其他實施態樣中，PBMC族群(例如複數個PBMC)除盡一或多種細胞。在一些實施態樣中，PBMC族群除盡T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突細胞中一或多種。
細胞懸浮液的組成(例如滲透壓、鹽濃度、血清含量、細胞濃度、pH等)可影響用於調節免疫反應之化合物的投遞。在一些實施態樣中，懸浮液包含全血。替代地，細胞懸浮液係細胞於生理鹽水溶液或除血液以外的生理介質中之混合物。在一些實施態樣中，細胞懸浮液包含水溶液。在一些實施態樣中，水溶液包含細胞培養基、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、鹽、金屬離子、糖、生長因子、動物衍生產物、增量材料、界面活性劑、潤滑劑、脂質、維生素、胺基酸、蛋白質、細胞週期抑制劑及/或影響肌動蛋白聚合之藥劑。在一些實施態樣中，細胞培養基係DMEM、Opti-MEM®
、IMDM、RPMI、X-Vivo 10™及X-Vivo 15™。此外，溶液緩衝劑可包括一或多種潤滑劑(Pluronics®
或其他界面活性劑)，其可經設計以例如減少或清除縊縮或孔的堵塞並改善細胞存活性。例示性界面活性劑包括但不限於泊洛沙姆(poloxamer)、聚山梨醇酯、糖或糖醇諸如甘露醇、山梨醇、動物衍生血清及白蛋白蛋白質。
在某些PBMC類型的一些組態中，PBMC可培育於有助於投遞化合物至PBMC內部的一或多種溶液中。在一些實施態樣中，水溶液包含影響肌動蛋白聚合的藥劑。在一些實施態樣中，影響肌動蛋白聚合的藥劑係拉春庫林A (Latrunculin A)、細胞鬆弛素(Cytochalasin)及/或秋水仙鹼。例如，PBMC可先培育於去聚合化溶液諸如拉春庫林A (0.1 μg/mL)中1小時，然後才經投遞以去聚合化肌動蛋白細胞骨架。作為額外實例，PBMC可先培育於10 μM秋水仙鹼(Sigma)中2小時，然後才經投遞以去聚合化微管網絡。
細胞懸浮液的黏度亦可影響在本文中揭示之方法。在一些實施態樣中，細胞懸浮液的黏度從約8.9×10-4
Pa·s至約4.0×10-3
Pa·s或其間的任何數值或數值範圍不等。在一些實施態樣中，黏度介於約8.9×10-4
Pa·s至約4.0×10-3
Pa·s、約8.9×10-4
Pa·s至約3.0×10-3
Pa·s、約8.9×10-4
Pa·s至約2.0×10-3
Pa·s或約8.9×10-3
Pa·s至約1.0 ×10-3
Pa·s中任一者之間不等。在一些實施態樣中，黏度介於約0.89 cP至約4.0 cP、約0.89 cP至約3.0 cP、約0.89 cP至約2.0 cP或約0.89 cP至約1.0 cP中任一者之間不等。在一些實施態樣中，觀察到剪切稀化效應，其中細胞懸浮液的黏度在剪切應變的條件下降低。黏度可藉由所屬技術領域中已知之任何方法測量，包括但不限於黏度計，諸如玻璃毛細黏度計或流變計。黏度計測量一種流動條件下的黏度，然而流變計用於測量隨流動條件而異的黏度。在一些實施態樣中，測量剪切稀化溶液諸如血液的黏度。在一些實施態樣中，黏度係在介於約-5℃與約45℃之間測量。例如，方法可在室溫(例如，約20℃)、生理溫度(例如，約37℃)、高於生理溫度(例如，大於約37℃至45℃或更高)、減少溫度(例如，約-5℃至約4℃)或這些例示性溫度之間的溫度下進行。
縊縮媒介之投遞
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑隨著PBMC的直徑(諸如複數個PBMC之平均直徑或複數個PBMC內亞族群之平均直徑)變化。在一些實施態樣中，細胞的直徑係藉由細胞(例如複數個PBMC內之細胞)的最小橫截面距離測量。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC之平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%或約30%至約45%中任一者。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC之平均直徑的約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%或約90%至約99%中任一者。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC之平均直徑的約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%中任一者。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中任一者。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%或約90%至約99%中任一者。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%中任一者。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC內具有最小平均直徑之細胞亞族群係淋巴細胞族群，其中淋巴細胞族群的直徑係約6 µm至約10 µm。在一些實施態樣中，淋巴細胞族群之平均直徑係約7 µm。在一些實施態樣中，淋巴細胞族群係T細胞族群。在一些實施態樣中，淋巴細胞係T細胞。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC內具有最小平均直徑之細胞亞族群係T細胞。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約15%至約30%、約15%至約20%、約20%至約25%、約25%至約30%、約20%至約30%、約30%至約70%或約30%至約60%中任一者。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約5%至約10%、約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%或約90%至約99%中任一者。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%中任一者。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC內具有最大平均直徑之細胞亞族群係單核球族群，其中單核球族群的直徑係約15 µm至約25 µm。在一些實施態樣中，單核球族群之平均直徑係約20 µm。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC內具有最大平均直徑之細胞亞族群係單核球。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約15 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約4.2 µm至約6 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約4.2 µm至約4.8 µm。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約2 µm至約14 µm、約4 µm至約12 µm、約6 µm至約9 µm、約4 µm至約6 µm、約4 µm至約5 µm、約3.5 µm至約7 µm、約3.5 µm至約6.3 µm、約3.5 µm至約5.6 µm、約3.5 µm至約4.9 µm、約4.2 µm至約6.3 µm、約4.2 µm至約5.6 µm或約4.2 µm至約4.9 µm中任一者。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約2 µm、2.5 µm、3 µm、3.5 µm、4 µm、4.5 µm、5 µm、5.5 µm、6 µm、6.5 µm、7 µm、7.5 µm、8 µm、8.5 µm、9 µm、9.5 µm、10 µm、10.5 µm、11 µm、11.5 µm、12 µm、12.5 µm、13 µm、13.5 µm、14 µm、14.5 µm或15 µm中任一者。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約4.0 µm、4.1 µm、4.2 µm、4.3 µm、4.4 µm、4.5 µm、4.6 µm、4.7 µm、4.8 µm、4.9 µm或5.0 µm中任一者。在一些實施態樣中，縊縮之直徑係約4.5 µm。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約20 psi至約150 psi之範圍的壓力下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約30 psi至約120 psi之範圍的壓力下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約60 psi至約90 psi之範圍的壓力下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約30 psi至約40 psi、約40 psi至約50 psi、約50 psi至約60 psi、約60 psi至約70 psi、約70 psi至約80 psi、約80 psi至約90 psi、約90 psi至約100 psi、約100 psi至約110 psi或約110psi至約120 psi中任一者之範圍的壓力下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約20 psi、25 psi、30 psi、35 psi、40 psi、45 psi、50 psi、55 psi、60 psi、65 psi、70 psi、75 psi、80 psi、85 psi、90 psi、95 psi、100 psi、105 psi、110 psi、115 psi或120 psi中任一者的壓力下通過縊縮。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約150 kPa至約1000 kPa之範圍的壓力下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約207 kPa至約830 kPa之範圍的壓力下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約415 kPa至約621 kPa之範圍的壓力下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約200 kPa至約250kPa、約250 kPa至約300kPa、300 kPa至約350kPa、約350 kPa至約400kPa、400 kPa至約450kPa、約450 kPa至約500kPa、500 kPa至約550kPa、約550 kPa至約600kPa、600 kPa至約650kPa、約650 kPa至約700kPa、700 kPa至約750kPa、約750 kPa至約800kPa、800 kPa至約850kPa、約850 kPa至約900kPa、900 kPa至約950kPa、約950 kPa至約1000kPa中任一者之範圍的壓力下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約200 kPa、250 kPa、300 kPa、350 kPa、400 kPa、415 kPa、450 kPa、500 kPa、550 kPa、600 kPa、612 kPa、650 kPa、700 kPa、750 kPa、800 kPa或850 kPa中任一者的壓力下通過縊縮。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約0℃至約37℃之範圍的溫度下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約0℃至約10℃之範圍的溫度下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約2℃至約8℃之範圍的溫度下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約2℃至約6℃、約5℃至約10℃、約10℃至約15℃、約15℃至約20℃、約20℃至約25℃、約25℃至約30℃、約30℃至約35℃或約35℃至約37℃中任一者之範圍的溫度下通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC在約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或37℃中任一者之溫度下通過縊縮。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，在通過縊縮之後，複數個經修飾之PBMC係在37℃之溫度下培育足夠的時間，以允許該經修飾之PBMC標準化至37℃。在一些實施態樣中，在通過縊縮之後，複數個經修飾之PBMC係在25℃之溫度下培育足夠的時間，以允許該經修飾之PBMC標準化至25℃。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，輸入PBMC以介於約0.001 mL/min至約200 mL/min之間的流速或其間的任何速率或速率範圍通過縊縮。在一些實施態樣中，流速係介於約0.001 mL/min至約175 mL/min、約0.001 mL/min至約150 mL/min、約0.001 mL/min至約125 mL/min、約0.001 mL/min至約100 mL/min、約0.001 mL/min至約50 mL/min、約0.001 mL/min至約25 mL/min、約0.001 mL/min至約10 mL/min、約0.001 mL/min至約7.5 mL/min、約0.001 mL/min至約5.0 mL/min、約0.001 mL/min至約2.5 mL/min、約0.001 mL/min至約1 mL/min、約0.001 mL/min至約0.1 mL/min或約0.001 mL/min至約0.01 mL/min之間。在一些實施態樣中，流速係介於約0.001 mL/min至約200 mL/min、約0.01 mL/min至約200 mL/min、約0.1mL/min至約200 mL/min、約1 mL/min至約200 mL/min、約10 mL/min至約200 mL/min、約50 mL/min至約200 mL/min、約75 mL/min至約200 mL/min、約100 mL/min至約200 mL/min、約150 mL/min至約200 mL/min、約0.5 mL/min至約200 mL/min、約1 mL/min至約200 mL/min、約2.5 mL/min至約200 mL/min、約5 mL/min至約200 mL/min、約7.5 mL/min至約200 mL/min、約10 mL/min至約200 mL/min、約25 mL/min至約200 mL/min或約175 mL/min至約200 mL/min之間。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC以介於約10 mL/min至約200 mL/min之間的流速通過縊縮。在一些實施態樣中，複數個輸入PBMC以約100 mL/min的流速通過縊縮。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮可具有所屬技術領域中已知之任何形狀；例如3維形狀或2維形狀。縊縮的2維形狀諸如橫截面形狀可為但不限於環狀、橢圓形、圓形、正方形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形或八角形。縊縮的3維形狀可為但不限於圓柱狀、錐狀或立方形。在一些實施態樣中，縊縮的橫截面形狀係長方形。在一些實施態樣中，縊縮的橫截面形狀係裂縫。在一些實施態樣中，縊縮的橫截面形狀係包含約3 µm至約10 µm的寬度及/或約1 µm至約200 µm的深度的裂縫。在一些實施態樣中，縊縮的橫截面形狀係包含約3 µm至約6 µm的寬度及/或約20 µm至約120 µm的深度的裂縫。在一些實施態樣中，縊縮的橫截面形狀係包含約4.2 µm至約6 µm的寬度及/或約20 µm至約120 µm的深度的裂縫。在一些實施態樣中，縊縮的橫截面形狀係包含約4.2 µm至約6 µm的寬度及/或約40 µm至約100 µm的深度的裂縫。在一些實施態樣中，縊縮的橫截面形狀係包含約4.2 µm至約6 µm的寬度及/或約20 µm至約80 µm的深度的裂縫。在一些實施態樣中，縊縮的橫截面形狀係包含約4.5 µm的寬度及/或約80 µm的深度的裂縫。在一些實施態樣中，裂縫包含約10 µm至約30 µm的長度。在一些實施態樣中，裂縫包含約2 µm至約50 µm的長度。在一些實施態樣中，裂縫包含約2 µm至約5 µm、約5 µm至約10 µm、約10 µm至約15 µm、約15 µm至約20 µm、約20 µm至約25 µm、約25 µm至約30 µm、約30 µm至約35 µm、約35µm至約40 µm、約40 µm至約45 µm或約45µm至約50 µm中任一者的長度。在一些實施態樣中，裂縫包含約10 µm的長度。
在一些實施態樣中，縊縮包含入口部分及出口部分。縊縮的入口及出口可具有多種角度。在一些實施態樣中，縊縮具有相同的入口及出口角度。在一些實施態樣中，縊縮具有不同的入口及出口角度。可選擇縊縮的角度，以最小化當PBMC通過縊縮時的堵塞。在一些實施態樣中，通過表面的流速係介於約0.001 mL/min至約100 mL/min之間或其間的任何速率或速率範圍。在一些實例中，入口及/或出口部分的角度可介於約0與約90度之間。在一些實施態樣中，入口及/或出口部分可大於90度。在一些實施態樣中，入口部分定義入口角度且入口角度係介於約0度至約90度之間。在一些實施態樣中，入口角度係介於約10度至約40度中任一者、約12度至約45度、介於約15度至約30度之間。在一些實施態樣中，入口角度係介於約20度至約22度之間。在一些實施態樣中，出口部分定義出口角度且出口角度係介於約0度至約90度之間。在一些實施態樣中，出口角度係介於約10度至約40度中任一者、約12度至約45度、介於約15度至約30度之間。在一些實施態樣中，出口角度係介於約20度至約22度之間。在一些實施態樣中，入口部分定義入口角度且入口角度係介於約20度至約22度之間，且出口部分定義出口角度且出口角度係介於約20度至約22度之間。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，縊縮邊緣係平滑，例如圓化或彎曲。平滑縊縮邊緣具有連續、扁平且平整的表面，沒有突起、嵴或不平整部分。在一些實施態樣中，縊縮邊緣係銳利。銳利縊縮邊緣具有尖的或呈銳角的薄邊緣。在一些實施態樣中，縊縮通道係直的。直縊縮通道不含有彎曲、折彎、角度或其他不規則。在一些實施態樣中，縊縮通道係彎曲。彎曲縊縮通道被折彎或偏離直線。在一些實施態樣中，縊縮通道具有多個彎曲，例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個彎曲。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，包含該複數個輸入PBMC之該細胞懸浮液通過多個縊縮，其中該多個縊縮係呈串聯及/或平行排列。在一些實施態樣中，多個縊縮係呈串聯排列。在一些實施態樣中，多個縊縮係呈平行排列。在一些實施態樣中，多個縊縮係呈串聯及/或平行排列。在一些實施態樣中，呈串聯排列之多個縊縮包含呈串聯之約2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、75、100、500、1,000或超過1,000個縊縮中任一者。在一些實施態樣中，呈平行排列之多個縊縮可包含呈串聯之約2、5、10、50、75、100、500、1,000或超過1,000個縊縮中任一者。
含有在本文中揭示之方法所使用的細胞變形縊縮之例示性微流體通道係描述於WO2013059343。具有在本文中揭示之方法所使用的孔之例示性表面係描述於WO2017041050。
系統及套組
在一些態樣中，本發明提供一種包含根據本文所述之任何實施態樣諸如用於本文所述之任何方法的縊縮、PBMC懸浮液、抗原或佐劑中之一或多者的系統。系統可包括在本文中揭示之物質的組成物及方法描述的任何實施態樣，包括該些揭示於以上標題為「微流體系統及其組分」的章節。在一些實施態樣中，細胞變形縊縮的大小適用於投遞至PBMC。在一些實施態樣中，投遞參數諸如作業流速、細胞及化合物濃度、溫度、縊縮中的細胞流速及細胞懸浮液的組成(例如，滲透壓、鹽濃度、血清含量、細胞濃度、pH等)係經最佳化以達調節免疫反應之化合物的最大反應。
亦提供用於調節個體之免疫反應的套組或製造物品。在一些實施態樣中，套組包含經修飾之PBMC，該經修飾之PBMC包含抗原及/或佐劑，包括任何本文所述之經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，套組包含縊縮、PBMC懸浮液、抗原或佐劑中之一或多者，以用於產製用於調節個體之免疫反應之經修飾之PBMC。在一些實施態樣中，套組包含於合適包裝中之本文所述之組分(例如含有孔之微流體通道或表面、細胞懸浮液及/或化合物)。合適包裝材料係所屬技術領域中已知且包括例如小瓶(諸如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、可撓性包裝(例如，密封Mylar或塑膠袋)及類似物。這些製造物品可進一步經滅菌及/或密封。
本發明亦提供包含本文所述之方法的組分之套組且可進一步包含執行該方法以調節個體之免疫反應的指示及/或將抗原及/或佐劑導入PBMC中之指示。本文所述之套組可進一步包括其他材料，包括緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器及具有執行任何本文所述之方法的指示(例如，調節個體之免疫反應的指示或修飾PBMC以含有抗原及/或佐劑的指示)之包裝仿單。
HPV及HPV相關疾病。
在根據本文所述之系統及套組中任一者之一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。
其他實施態樣
其他實施態樣提供具有下列一或多個前提之任何本文所述之實施態樣：
-抗原不是HPV抗原
-抗原不是HPV E6抗原
-抗原不是HPV E7抗原
-抗原不是HPV E6抗原且不是HPV E7抗原
-佐劑不與抗原一起導入PBMC中
-佐劑不存在於包含抗原之PBMC的胞質液中
-不向個體投予佐劑
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC不表現HPV抗原。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC不包含編碼HPV抗原之核酸。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC不包含HPV E6抗原。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC不包含編碼HPV E6抗原之核酸。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC不包含HPV E7抗原。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC不包含編碼HPV E7抗原之核酸。
在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC不包含HPV E6抗原且不包含HPV E7抗原。在一些實施態樣中，複數個經修飾之PBMC不包含編碼HPV E6抗原之核酸且不包含編碼HPV E7抗原之核酸。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個PBMC不包含編碼抗原之核酸。在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個PBMC不表現抗原。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，抗原包含一或多種蛋白質。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸之形式諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體進入PBMC。在一些實施態樣中，抗原係由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA之形式進入PBMC。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之核酸。在一些實施態樣中，複數個PBMC包含編碼抗原之mRNA。
在根據本文所述之方法、組成物或複數個經修飾之PBMC中任一者之一些實施態樣中，複數個PBMC不誘導個體的耐受性。在一些實施態樣中，複數個PBMC不壓制個體的免疫反應。在一些實施態樣中，複數個PBMC不包含耐受原(tolerogenic)因子。在一些實施態樣中，複數個PBMC不與耐受原因子組合投予。在一些實施態樣中，複數個PBMC不在投予耐受原因子之前、之同時或之後投予。
在本申請案之一些實施態樣中，用語「調理」及「成熟」可交換使用。
例示性實施態樣
本發明提供以下列舉實施態樣。
1. 一種複數個經修飾之周邊血液單核細胞(PBMC)，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。
2. 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性，其中該抗原係癌症抗原、傳染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。
3. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。
4. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性，其中該抗原係癌症抗原、傳染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。
5. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。
6. 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，該抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列。
7. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，該抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列。
8. 一種經調理之複數個PBMC，該經調理之複數個PBMC包含抗原且藉由使包含該抗原之該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
9. 一種包含抗原之經調理之複數個PBMC，其藉由在將該抗原導入該PBMC之前使該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
10. 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
11. 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC。
12. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
13. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
14. 如實施態樣12或13之包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該過程進一步包含：在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
15. 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC；
藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
16. 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸及該佐劑培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC；
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
17. 如實施態樣15或16之複數個經修飾之PBMC，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與該經擾動的輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
18. 如實施態樣15至17中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：(a)與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間及/或與該經擾動的輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。
19. 如實施態樣15至18中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係約1 µM及/或與該經擾動的輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係約1 µM。
20. 如實施態樣15至19中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原對該佐劑之比例係介於約10000：1至約1：10000之間。
21. 如實施態樣15至20中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原對該佐劑之比例係約200：1。
22. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；
b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及
c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
23. 如實施態樣22之複數個經修飾之PBMC，其中與該輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
24. 如實施態樣22或23之複數個經修飾之PBMC，其中與該輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。
25. 如實施態樣22至24中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該輸入PBMC培育之該佐劑之濃度係約1 µM。
26. 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含該佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
27. 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含該抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
28. 如實施態樣10至14及22至27中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
29. 如實施態樣10至14及22至28中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。
30. 如實施態樣10至14及22至29中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係約1 µM。
31. 如實施態樣15至21及26至30中任一項之複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含該抗原及/或該佐劑，其中該過程進一步包含：
使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
32. 如實施態樣31之包含抗原及/或佐劑之複數個經修飾之PBMC，其中該過程進一步包含：在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原及/或該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
33. 如實施態樣8至31中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經修飾之PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
34. 如實施態樣8至33中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經修飾之PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。
35. 如實施態樣8至34中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經修飾之PBMC培育之該佐劑之濃度係約1 µM。
36. 如實施態樣8至35中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該過程進一步包含使該輸入PBMC及/或該經修飾之PBMC與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC的存活及/或功能。
37. 如實施態樣10至36中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約10%至約99%。
38. 如實施態樣10至37中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約10%至約70%。
39. 如實施態樣10至38中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約20%至約60%。
40. 如實施態樣10至39中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約40%至約60%。
41. 如實施態樣10至40中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約30%至約45%。
42. 如實施態樣10至36中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約99%。
43. 如實施態樣10至36及42中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約70%。
44. 如實施態樣10至36、42及43中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約20%至約60%。
45. 如實施態樣10至36及42至44中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約30%至約45%。
46. 如實施態樣10至36中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約50%至約99%。
47. 如實施態樣10至36及46中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約50%至約90%。
48. 如實施態樣10至36、46及47中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約50%至約80%。
49. 如實施態樣10至36、46至48中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約50%至約70%。
50. 如實施態樣10至36中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約60%至約90%。
51. 如實施態樣10至36及50中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約60%至約80%。
52. 如實施態樣10至36、50及51中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約60%至約70%。
53. 如實施態樣10至52中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約99%。
54. 如實施態樣10至53中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約70%。
55. 如實施態樣10至54中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約20%至約60%。
56. 如實施態樣10至55中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約20%至約30%。
57. 如實施態樣10至56中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約20%至約25%。
58. 如實施態樣10至55中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約30%至約70%。
59. 如實施態樣10至55及58中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約30%至約60%。
60. 如實施態樣10至55、58及59中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約30%至約45%。
61. 如實施態樣42至60中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群係T細胞。
62. 如實施態樣53至61中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群係單核球。
63. 如實施態樣10至62中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm。
64. 如實施態樣10至63中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。
65. 如實施態樣10至63中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。
66. 如實施態樣10至65中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係約4.2 µm至約6 µm。
67. 如實施態樣10至66中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係約4.5 µm。
68. 如實施態樣10至67中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC在約30 psi至約120 psi或約60 psi至約90 psi之範圍的壓力下通過縊縮。
69. 如實施態樣10至67中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC在約207 kPa至約830 kPa或約415 kPa至約621 kPa之範圍的壓力下通過縊縮。
70. 如實施態樣10至67中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC以介於約0.001 mL/cm2
/sec至約200 L/cm2
/sec之間的流速通過縊縮。
71. 如實施態樣10至67中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC以介於約0.1 mL/cm2
/sec至約150 L/cm2
/sec之間的流速通過縊縮。
72. 如實施態樣10至67中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC以約100 mL/cm2
/sec的流速通過縊縮。
73. 如實施態樣10至72中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC在約0℃至約37℃之範圍的溫度下通過縊縮。
74. 如實施態樣10至73中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中在通過縊縮之後，該複數個經修飾之PBMC係在37℃之溫度下培育足夠的時間，以允許該經修飾之PBMC標準化至37℃。
75. 如實施態樣10至74中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中在通過縊縮之後，該複數個經修飾之PBMC係在25℃之溫度下培育足夠的時間，以允許該經修飾之PBMC標準化至25℃。
76. 如實施態樣10至75中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮的橫截面形狀係選自由下列所組成之群組：環狀、橢圓形、圓形、正方形、矩形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形及八角形。
77. 如實施態樣10至76中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮的橫截面形狀係裂縫。
78. 如實施態樣77之複數個經修飾之PBMC，其中裂縫包含約3 µm至6 µm的寬度及/或約20 µm至120 µm的深度。
79. 如實施態樣78之複數個經修飾之PBMC，其中裂縫包含約4.2 µm至6 µm的寬度及/或約20 µm至120 µm的深度。
80. 如實施態樣77至79中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中裂縫包含約4.5 µm的寬度及/或約80 µm的深度。
81. 如實施態樣10至80中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中包含該複數個輸入PBMC之該細胞懸浮液通過多個縊縮，其中該多個縊縮係呈串聯及/或平行排列。
82. 如實施態樣10至80中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮包含入口部分及出口部分，其中：
(a)入口部分定義入口角度且入口角度係介於約0度至約90度之間或介於約20至22度之間；及/或
(b)出口部分定義出口角度且出口角度係介於約0度至約90度之間或介於約20至22度之間；
較佳地(a)及(b)介於約20至22度之間。
83. 如實施態樣10至82中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中包含該複數個輸入PBMC之該細胞懸浮液通過多個縊縮，其中該多個縊縮係呈串聯及/或平行排列。
84. 如實施態樣12至14、22至25、31至83中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約1至約24小時而調理該經修飾之PBMC。
85. 如實施態樣12至14、22至25、31至84中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約2至約10小時而調理該經修飾之PBMC。
86. 如實施態樣12至14、22至25、31至85中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約3至約6小時而調理該經修飾之PBMC。
87. 如實施態樣12至14、22至25、31至86中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約4小時而調理該經修飾之PBMC。
88. 如實施態樣1至87中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中抗原、編碼抗原之核酸及/或佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞胞質液及/或囊泡中。
89. 如實施態樣1至88中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中抗原及/或編碼抗原之核酸係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞胞質液中且佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞囊泡中。
90. 如實施態樣88或89之複數個經修飾之PBMC，其中該囊泡係胞內體。
91. 如實施態樣1至90中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中抗原、編碼抗原之核酸及/或佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞中的多個隔室中。
92. 如實施態樣1至91中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中抗原、編碼抗原之核酸及/或佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%的細胞中。
93. 如實施態樣1至92中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中抗原、編碼抗原之核酸及/或佐劑係存在於複數個PBMC中至少約70%的T細胞、B細胞、NK細胞及單核球各者中。
94. 如實施態樣1至93中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係與複數個經修飾之PBMC之細胞的表面結合。
95. 如實施態樣5至94中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I：C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑。
96. 如實施態樣95之複數個經修飾之PBMC，其中該佐劑係CpG ODN。
97. 如實施態樣96之複數個經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。
98. 如實施態樣1至97中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係疾病相關抗原。
99. 如實施態樣98之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。
100. 如實施態樣1至99中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係非自身抗原。
101. 如實施態樣1至100中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。
102. 如實施態樣1至5及8至101中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係衍生自腫瘤溶解物。
103. 如實施態樣1至101中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係人類乳突病毒(HPV)抗原。
104. 如實施態樣103之複數個經修飾之PBMC，其中該HPV係HPV-16或HPV-18。
105. 如實施態樣103或104之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之肽。
106. 如實施態樣103或104之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。
107. 如實施態樣106之複數個經修飾之PBMC，其中該HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO：1至4中任一者之胺基酸序列。
108. 如實施態樣107之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列。
109. 如實施態樣1至108中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。
110. 如實施態樣109之複數個經修飾之PBMC，其中在向個體投予包含該複數個抗原的該經修飾之PBMC之後，其中該複數個抗原包含該複數個免疫原性表位，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。
111. 如實施態樣110之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。
112. 如實施態樣111之複數個經修飾之PBMC，其中該免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。
113. 如實施態樣111之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係包含免疫原性肽表位及一或多個異源性肽序列之多肽。
114. 如實施態樣111之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係包含在N端及/或C端側接異源性肽序列的免疫原性肽表位之多肽。
115. 如實施態樣114之複數個經修飾之PBMC，其中該側接異源性肽序列係衍生自疾病相關免疫原性肽。
116. 如實施態樣112之複數個經修飾之PBMC，其中該N端側接多肽包含SEQ ID NO：5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO：11至17中任一者之胺基酸序列。
117. 如實施態樣1至116中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。
118. 如實施態樣5、15至21及26至117中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC包含該佐劑的濃度介於約1 nM與約1 mM之間。
119. 如實施態樣1至118中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC包含該抗原的濃度介於約1 nM與約1 mM之間。
120. 如實施態樣1至119中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原對該佐劑之比例係介於約10000：1至約1：10000之間。
121. 如實施態樣1至120中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原對該佐劑之比例係約200：1。
122. 如實施態樣1至118中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原、c)該抗原及該佐劑、d)編碼該抗原之該核酸、e)編碼該抗原之該核酸及編碼一個其他抗原之至少一個其他核酸及/或f)編碼該抗原之該核酸及該佐劑。
123. 如實施態樣3至5、7至9、12至14、22至25及31至122中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應複數個經修飾之PBMC，該藥劑增強該複數個經修飾之PBMC之存活及/或功能。
124. 如實施態樣3至5、7至9、12至14、22至25及31至123中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應複數個經修飾之PBMC，該藥劑增強該複數個經修飾之PBMC在冷凍-解凍循環中的存活及/或功能。
125. 如實施態樣3至5、7至9、12至14、22至25及31至124中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中至少約70%、約80%或約90%的經調理之複數個經修飾之PBMC在至多1、2、3、4、5次冷凍解凍循環之後係存活。
126. 如實施態樣123至125中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。
127. 如實施態樣123至126中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該藥劑係白蛋白。
128. 如實施態樣127之複數個經修飾之PBMC，其中該白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。
129. 如實施態樣123至125中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該藥劑係以下一或多者：二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。
130. 如實施態樣123至125中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該藥劑係以下一或多者：丙酮酸鈉、腺嘌呤、Rejuvesol®、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、PlasmaLyte®、DMSO、Cryostor® CS2、Cryostor® CS5、Cryostor® CS10、Cryostor® CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、HypoThermosol®。
131. 如實施態樣128之複數個經修飾之PBMC，其中該藥劑包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
132. 如實施態樣128之複數個經修飾之PBMC，其中該藥劑包含人血清白蛋白(HSA)。
133. 如實施態樣1至132中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該等細胞係經進一步修飾以增加一或多種共刺激分子的表現。
134. 如實施態樣133之複數個經修飾之PBMC，其中該共刺激分子係B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
135. 如實施態樣133之複數個經修飾之PBMC，其中該共刺激分子係信號2效應物。
136. 如實施態樣133至135中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該細胞包含導致該一或多種共刺激分子表現增加的核酸(例如，mRNA)。
137. 如實施態樣136之複數個經修飾之PBMC，其中該核酸編碼該共同刺激分子。
138. 如實施態樣1至137中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該等細胞係經進一步修飾以增加一或多種細胞介素的表現。
139. 如實施態樣138之複數個經修飾之PBMC，其中該細胞介素係IL-12、IL-2、IFN-α或IL-21。
140. 如實施態樣133之複數個經修飾之PBMC，其中該共刺激分子係信號3效應物。
141. 如實施態樣138至140中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該細胞包含導致該一或多種細胞介素表現增加的核酸(例如，mRNA)。
142. 如實施態樣141之複數個經修飾之PBMC，其中該核酸編碼該細胞介素。
143. 如實施態樣1至142中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中複數個經修飾之PBMC中至少一個細胞係HLA-A2表現陽性。
144. 如實施態樣1至142中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC包含進一步修飾以調節MHC第一型表現。
145. 如實施態樣1至142中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC包含進一步修飾以調節HLA-A02 MHC I。
146. 如實施態樣1至145中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC包含進一步修飾以調節MHC第二型表現。
147. 如實施態樣145之複數個經修飾之PBMC，其中相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修飾的對應經修飾之PBMC所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修飾之PBMC所起始之先天免疫反應係減少。
148. 如實施態樣1至147中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中相較於不包含該進一步修飾的對應經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
149. 如實施態樣1至147中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期基本上係與不包含該進一步修飾的對應經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期相同。
150. 如實施態樣1至147中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期基本上係與對應未經修飾之PBMC的循環半衰期相同。
151. 如實施態樣1至150中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突細胞或NK-T細胞中一或多者。
152. 如實施態樣1至151中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突細胞或NK-T細胞中二者或超過二者。
153. 如實施態樣1至152中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個PBMC包含CD3+ T細胞、CD20+ B細胞、CD14+單核球、CD56+ NK細胞中一或多者。
154. 如實施態樣10至153中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且其中T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例基本上與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對全血中PBMC總數之比例相同。
155. 如實施態樣10至153中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且其中T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例基本上與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對來自全血之白血球分離術產物中PBMC總數之比例相同。
156. 如實施態樣10至153中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且其中T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對全血中PBMC總數之比例的差異不超過10%。
157. 如實施態樣10至153中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且其中T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對來自全血之白血球分離術產物中PBMC總數之比例的差異不超過10%。
158. 如實施態樣10至157中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：
(a)至少約25%之輸入PBMC係T細胞；
(b)至少約2.5%之輸入PBMC係B細胞；
(c)至少約3.5%之輸入PBMC係NK細胞；或
(d)至少約4%之輸入PBMC係單核球。
159. 如實施態樣1至158中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：
(a)至少約20%之經修飾之PBMC係T細胞；
(b)至少約2%之經修飾之PBMC係B細胞；
(c)至少約3%之經修飾之PBMC係NK細胞；或
(d)至少約3%之經修飾之PBMC係單核球。
160. 如實施態樣1至159中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：
(a)不超過約70%之輸入PBMC係T細胞；
(b)不超過約14%之輸入PBMC係B細胞；
(c)不超過約35%之輸入PBMC係NK細胞；或
(d)不超過約25%之輸入PBMC係單核球。
161. 如實施態樣1至160中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：
(a)不超過約80%之經修飾之PBMC係T細胞；
(b)不超過約16%之經修飾之PBMC係B細胞；
(c)不超過約40%之經修飾之PBMC係NK細胞；或
(d)不超過約30%之經修飾之PBMC係單核球。
162. 如實施態樣1至161中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：
(a)約25%至約70%之經修飾之PBMC係T細胞；
(b)約2.5%至約14%之經修飾之PBMC係B細胞；
(c)約3.5%至約35%之經修飾之PBMC係NK細胞；或
(d)約4%至約25%之經修飾之PBMC係單核球。
163. 如實施態樣1至162中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：
(a)複數個經修飾之PBMC內T細胞之百分比及複數個輸入PBMC內T細胞之百分比在數字上的差異不大於約10%；
(b)複數個經修飾之PBMC內B細胞之百分比及複數個輸入PBMC內B細胞之百分比在數字上的差異不大於約10%；
(c)複數個經修飾之PBMC內NK細胞之百分比及複數個輸入PBMC內NK細胞之百分比在數字上的差異不大於約10%；及/或
(d)複數個經修飾之PBMC內單核球之百分比及複數個輸入PBMC內單核球之百分比在數字上的差異不大於約10%。
164. 如實施態樣3至9及12至163中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：一或多種共刺激分子在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在該複數個未經修飾之PBMC的B細胞中係經上調，其中該共刺激分子係CD80及/或CD86。
165. 如實施態樣164之複數個經修飾之PBMC，其中該CD80及/或CD86在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在複數個未經調理之PBMC的B細胞中係經上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
166. 如實施態樣164或165之複數個經修飾之PBMC，其中該共刺激分子係CD86。
167. 如實施態樣3至9及12至166中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC相較於複數個未經調理之PBMC具有增加表現的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者。
168. 如實施態樣167之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者的表現相較於該複數個未經調理之PBMC增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
169. 一種組成物，其包含如實施態樣1至168中任一項之複數個經修飾之PBMC。
170. 一種組成物，其包含如實施態樣1至169中任一項之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物。
171. 一種組成物，其包含如實施態樣1至169中任一項之複數個經修飾之PBMC且用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法。
172. 一種組成物，其包含如實施態樣1至169中任一項之複數個經修飾之PBMC且用於治療癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病。
173. 如實施態樣172之組成物，其中癌症係頭頸癌、子宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、肛門周圍癌症、肛門生殖器癌症、口腔癌或唾腺癌。
174. 如實施態樣171至173中任一項之組成物，其中該經修飾之PBMC係於投予免疫檢查點抑制劑之前、同期或之後投予。
175. 如實施態樣174之組成物，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中任一者。
176. 如實施態樣175之組成物，其中免疫檢查點抑制劑靶向PD-1。
177. 如實施態樣175之組成物，其中免疫檢查點抑制劑靶向PD-L1。
178. 如實施態樣171至177中任一項之組成物，其中該經修飾之PBMC係於投予治療劑之前、同期或之後投予。
179. 如實施態樣178之組成物，其中該治療劑係化學治療劑。
180. 如實施態樣172之組成物，其中傳染性疾病係與HIV、HPV、EBV、MCV、HBV或HCV相關。
181. 一種醫藥組成物，其包含如實施態樣1至168中任一項之經修飾之PBMC及醫藥上可接受之載劑。
182. 如實施態樣171至181中任一實施態樣之組成物，其中組成物係用於治療癌症或傳染性疾病。
183. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
184. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
185. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
186. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
187. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；
b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及
c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
188. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；
b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及
c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
189. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療人體或動物體之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；
b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及
c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
190. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療人體或動物體之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；
b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及
c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
191. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
192. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
193. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
194. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含編碼抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
195. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體的HPV相關疾病之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
196. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體的HPV相關疾病之方法之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
197. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體的HPV相關疾病之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
198. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC且用於治療個體的HPV相關疾病之組成物，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
199. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC之組成物於製造用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病的藥物之用途，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
200. 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC之組成物於製造用於治療HPV相關疾病的藥物之用途，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
201. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含人類乳突病毒(HPV)抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
202. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，
藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
203. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
204. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含HPV抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，
藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
205. 如實施態樣201至204中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。
206. 如實施態樣201至205中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中包含HPV抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
207. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
208. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，
藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
209. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
210. 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，
藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
211. 如實施態樣207至210中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。
212. 如實施態樣207至211中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，該縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。
213. 如實施態樣207至212中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。
214. 如實施態樣207至213中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中包含抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
215. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含向該個體投予如實施態樣1至168中任一項之複數個經修飾之PBMC、如實施態樣169至180之組成物或如實施態樣181之醫藥組成物。
216. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)向該個體投予包含抗原之複數個經修飾之PBMC，該抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列；及
b)向該個體投予佐劑。
217. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含抗原之複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個PBMC；
b)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
218. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個PBMC；
b)將抗原導入該複數個PBMC；及
c)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
219. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
220. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
221. 如實施態樣220之方法，其進一步包含：在與該佐劑培育之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
222. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC；及
c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。
223. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼抗原之核酸及佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸及該佐劑培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及
c)向該個體投予包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
224. 如實施態樣223之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與該經擾動的輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
225. 如實施態樣222至224中任一項之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間及/或與該經擾動的輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。
226. 如實施態樣222至225中任一項之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係約1 µM及/或與該經擾動的輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係約1 µM。
227. 如實施態樣222至226中任一項之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原對該佐劑之比例係介於約10000：1至約1：10000之間。
228. 如實施態樣222至227中任一項之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原對該佐劑之比例係約200：1。
229. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；
b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；
c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予該經調理之複數個經修飾之PBMC。
230. 如實施態樣229之方法，其中與該輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
231. 如實施態樣229或230之方法，其中與該輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。
232. 如實施態樣229至231中任一項之方法，其中與該輸入PBMC培育之該佐劑之濃度係約1 µM。
233. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及
c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。
234. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及
c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。
235. 如實施態樣234之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
236. 如實施態樣234或235之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。
237. 如實施態樣234至236中任一項之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該佐劑之濃度係約1 µM。
238. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予佐劑。
239. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及
c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予佐劑。
240. 如實施態樣219至233、238及239中任一項之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
241. 如實施態樣219至233及238至240中任一項之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。
242. 如實施態樣219至233及238至241中任一項之方法，其中與該經擾動的輸入PBMC培育之該抗原的濃度係約1 µM。
243. 如實施態樣222至228及233至242中任一項之方法，其中該過程進一步包含：
使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
244. 如實施態樣243之方法，其中與該經修飾之PBMC培育之該第二佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
245. 如實施態樣243或244之方法，其中與該經修飾之PBMC培育之該第二佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 µM之間。
246. 如實施態樣243至245中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中與該經修飾之PBMC培育之該第二佐劑之濃度係約1 µM。
247. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：向該個體投予與抗原連結之複數個PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使複數個輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原與該輸入PBMC之細胞表面連結，藉此產製與該抗原連結之該複數個PBMC；及
b)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。
248.如實施態樣215至247中任一項之方法，其進一步包含向該個體投予佐劑。
249.如實施態樣248之方法，其中該佐劑係在向該個體投予複數個經修飾之PBMC之前、之同時或之後投予。
250. 一種用於根據實施態樣215至245及247至249中任一項所述之刺激個體之免疫反應之方法中的包含抗原之複數個PBMC。
251. 一種用於產製包含抗原之經調理之複數個PBMC之方法，該方法包含使包含該抗原之該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
252. 一種用於產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
253. 一種用於產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
254. 如實施態樣252之方法，其進一步包含：在與該佐劑培育之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
255. 如實施態樣253之方法，其進一步包含：在與該佐劑培育之前，自該細胞懸浮液單離包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC。
256. 一種用於產製包含抗原之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
257. 一種用於產製包含抗原之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
258. 一種用於產製包含抗原及佐劑之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
259. 一種用於產製包含抗原及佐劑之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸及該佐劑培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
260. 一種產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；
b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及
c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
261. 一種產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC；
b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及
c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
262. 一種用於產製包含抗原及佐劑之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
263. 一種用於產製包含抗原及佐劑之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，
其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
264. 一種用於產製包含抗原及佐劑之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
265. 如實施態樣219至245、247至248及251至264中任一項之方法，其中該過程進一步包含使該輸入PBMC及/或該經修飾之PBMC與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC的存活及/或功能。
266. 如實施態樣219至245、247至249及251至265中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約10%至約99%。
267. 如實施態樣219至245、247至249及251至265中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約10%至約70%。
268. 如實施態樣219至245、247至249及251至267中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約20%至約60%。
269. 如實施態樣219至245、247至249及251至268中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約30%至約45%。
270. 如實施態樣219至245、247至249及251至269中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約99%。
271. 如實施態樣219至245、247至249及251至270中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約70%。
272. 如實施態樣219至245、247至249及251至271中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約20%至約60%。
273. 如實施態樣219至245、247至249及251至272中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約30%至約45%。
274. 如實施態樣219至245、247至249及251至270中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約50%至約99%。
275. 如實施態樣219至245、247至249、251至270及274中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約50%至約90%。
276. 如實施態樣219至245、247至249、251至270及274至275中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約50%至約80%。
277. 如實施態樣219至245、247至249、251至270及274至276中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約50%至約70%。
278. 如實施態樣219至245、247至249及251至270中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約60%至約90%。
279. 如實施態樣219至245、247至249、251至270及278中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約60%至約80%。
280. 如實施態樣219至245、247至249、251至270及278至279中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約60%至約70%。
281. 如實施態樣219至245、247至249及251至280中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約99%。
282. 如實施態樣219至245、247至249及251至281中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約10%至約70%。
283. 如實施態樣219至245、247至249及251至282中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約20%至約60%。
284. 如實施態樣219至245、247至249及251至283中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約20%至約30%。
285. 如實施態樣219至245、247至249及251至284中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約20%至約25%。
286. 如實施態樣219至245、247至249及251至283中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約30%至約45%。
287. 如實施態樣270至286中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群係T細胞。
288. 如實施態樣281至286中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群係單核球。
289. 如實施態樣219至245、247至249及251至275中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm。
290. 如實施態樣219至245、247至249及251至289中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。
291. 如實施態樣219至245、247至249及251至289中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。
292. 如實施態樣219至245、247至249及251至291中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約4.2 µm至約6 µm。
293. 如實施態樣219至245、247至249及251至292中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約4.5 µm。
294. 如實施態樣219至245、247至249及251至293中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC在約30 psi至約90 psi之範圍的壓力下通過縊縮。
295. 如實施態樣219至245、247至249及251至293中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC在約207 kPa至約830 kPa或約415 kPa至約621 kPa之範圍的壓力下通過縊縮。
296. 如實施態樣219至245、247至249及251至295中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC以介於約0.001 mL/cm2
/sec至約200 L/cm2
/sec之間的流速通過縊縮。
297. 如實施態樣219至245、247至249及251至295中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC以介於約0.1 mL/cm2
/sec至約150 L/cm2
/sec之間的流速通過縊縮。
298. 如實施態樣219至245、247至249及251至297中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC以約100 L/cm2
/sec的流速通過縊縮。
299. 如實施態樣219至245、247至249及251至298中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC在約0℃至約37℃之範圍的溫度下通過縊縮。
300. 如實施態樣219至245、247至249及251至299中任一項之方法，其中在通過縊縮之後，該複數個經修飾之PBMC係在約37℃之溫度下培育足夠的時間，以允許該經修飾之PBMC標準化至約37℃。
301. 如實施態樣219至245、247至249及251至300中任一項之方法，其中在通過縊縮之後，該複數個經修飾之PBMC係在約25℃之溫度下培育足夠的時間，以允許該經修飾之PBMC標準化至約25℃。
302. 如實施態樣219至245、247至249、251至301中任一項之方法，其中該縊縮的橫截面形狀係選自由下列所組成之群組：環狀、橢圓形、圓形、正方形、矩形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形及八角形。
303. 如實施態樣219至245、247至249及251至302中任一項之方法，其中該縊縮的橫截面形狀係裂縫。
304. 如實施態樣303之方法，其中裂縫包含約3 µm至6 µm的寬度及/或約20 µm至120 µm的深度。
305. 如實施態樣303之方法，其中裂縫包含約4.2 µm至6 µm的寬度及/或約20至120 µm的深度。
306. 如實施態樣303至305之方法，其中裂縫包含4.5 µm的寬度及/或80 µm的深度。
307. 如實施態樣219至245、247至249及251至306中任一項之方法，其中包含該複數個輸入PBMC之該細胞懸浮液通過多個縊縮，其中該多個縊縮係呈串聯及/或平行排列。
308. 如實施態樣219至245、247至249及251至307中任一項之方法，其中該縊縮包含入口部分及出口部分，其中：
(a)入口部分定義入口角度且入口角度係介於約0度至約90度之間或約20至22度；及/或
(b)出口部分定義出口角度且出口角度係介於約0度至約90度之間或約20至22度；
較佳地(a)及(b)約20至22度。
309. 如實施態樣219至245、247至249及251至308中任一項之方法，其中包含該複數個輸入PBMC之該細胞懸浮液通過多個縊縮，其中該多個縊縮係呈串聯及/或平行排列。
310. 如實施態樣219至221、229至232、243至245、247至249、251及265至309中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約1至約24小時而調理該經修飾之PBMC。
311. 如實施態樣219至221、229至232、243至245、251及265至310中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約2至約10小時而調理該經修飾之PBMC。
312. 如實施態樣219至221、229至232、243至245、251及265至311中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約3至約6小時而調理該經修飾之PBMC。
313. 如實施態樣219至221、229至232、243至245、251及265至312中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約4小時而調理該經修飾之PBMC。
314. 如實施態樣215至245、247至249及251至313中任一項之方法，其中抗原及/或佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞胞質液及/或囊泡中。
315. 如實施態樣314之方法，其中該囊泡係胞內體。
316. 如實施態樣215至245、247至249及251至315中任一項之方法，其中抗原及/或佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞中的多個隔室中。
317. 如實施態樣222至228、233至237、247至249及251至316中任一項之方法，其中抗原係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞胞質液中且佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞囊泡中。
318. 如實施態樣251至245、247至249及251至317中任一項之方法，其中該抗原係與複數個經修飾之PBMC之細胞的表面結合。
319. 如實施態樣215至245、247至249及251至318中任一項之方法，其中該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I：C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑。
320. 如實施態樣319之方法，其中該佐劑係CpG ODN。
321. 如實施態樣320之方法，其中該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。
322. 如實施態樣215至245、247至249及251至315中任一項之方法，其中該抗原係疾病相關抗原。
323. 如實施態樣322之方法，其中該抗原係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。
324. 如實施態樣215至245、247至249及251至323中任一項之方法，其中該抗原係非自身抗原。
325. 如實施態樣215至245、247至249及251至324中任一項之方法，其中該抗原係腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。
326. 如實施態樣215至245、247至249及251至325中任一項之方法，其中該抗原係衍生自腫瘤溶解物。
327. 如實施態樣325之方法，其中該抗原係人類乳突病毒(HPV)抗原。
328. 如實施態樣327之方法，其中該HPV係HPV-16或HPV-18。
329. 如實施態樣327或328之方法，其中該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制性肽。
330. 如實施態樣329之方法，其中該HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO：1至4中任一者之胺基酸序列。
331. 如實施態樣330之方法，其中該抗原包含SEQ ID NO：18至25中任一者之胺基酸序列。
332. 如實施態樣215至245、247至249及251至315中任一項之方法，其中該經修飾之PBMC包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。
333. 如實施態樣332之方法，其中在向個體投予包含該複數個抗原的該經修飾之PBMC之後，其中該複數個抗原包含該複數個免疫原性表位，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。
334. 如實施態樣215至245、247至249及251至333中任一項之方法，其中該抗原係多肽，該多肽包含免疫原性肽表位。
335. 如實施態樣334之方法，其中該免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。
336. 如實施態樣334或335之方法，其中該抗原係包含免疫原性肽表位及一或多個異源性肽序列之多肽。
337. 如實施態樣334之方法，其中該抗原係包含在N端及/或C端側接異源性肽序列的免疫原性肽表位之多肽。
338. 如實施態樣334至337中任一項之方法，其中該側接異源性肽序列係衍生自疾病相關免疫原性肽。
339. 如實施態樣334至337中任一項之方法，其中該N端側接多肽包含SEQ ID NO：5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO：11至17中任一者之胺基酸序列。
340. 如實施態樣215至245、247至249及251至323中任一項之方法，其中該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。
341. 如實施態樣217、222至227、233、237、239至245、247至249及251至340中任一項之方法，其中該經修飾之PBMC包含該佐劑的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
342. 如實施態樣215至245、247至249及251至325中任一項之方法，其中該經修飾之PBMC包含該抗原的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
343. 如實施態樣217、222至227、233、237、239至245、247至249及251至342中任一項之方法，其中該抗原對該佐劑之比例係介於約10000：1至約1：10000之間。
344. 如實施態樣317之方法，其中該抗原對該佐劑之比例係約200：1。
345. 如實施態樣215至245、247至249及251至344中任一項之方法，其中該經修飾之PBMC包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原、c)該抗原及該佐劑、d)編碼該抗原之該核酸、e)編碼該抗原之該核酸及編碼一個其他抗原之至少一個其他核酸及/或f)編碼該抗原之該核酸及該佐劑。
346. 如實施態樣215至245、247至249及251至345中任一項之方法，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC的存活及/或功能。
347. 如實施態樣215至245、247至249及251至346中任一項之方法，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC在冷凍-解凍循環中的存活及/或功能。
348. 如實施態樣215至245、247至249及251至347中任一項之方法，其中至少約70%、約80%或約90%的經調理之複數個經修飾之PBMC在至多1、2、3、4、5次冷凍解凍循環之後係存活。
349. 如實施態樣348之方法，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。
350. 如實施態樣349之方法，其中該藥劑係白蛋白。
351. 如實施態樣350之方法，其中該白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。
352. 如實施態樣351之方法，其中藥劑係以下一或多者：二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。
353. 如實施態樣351或352之方法，其中藥劑係以下一或多者：丙酮酸鈉、腺嘌呤、Rejuvesol®、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、PlasmaLyte®、DMSO、Cryostor® CS2、Cryostor® CS5、Cryostor® CS10、Cryostor® CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、HypoThermosol®。
354. 如實施態樣353之方法，其中該藥劑包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
355. 如實施態樣354之方法，其中該藥劑包含人血清白蛋白(HSA)。
356. 如實施態樣215至245、247至249及251至355中任一項之方法，其中該細胞係經進一步修飾以增加一或多種共刺激分子的表現。
357. 如實施態樣356之方法，其中該共刺激分子係B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112或scFv抗CD28。
358. 如實施態樣356之方法，其中該共刺激分子係信號2效應物。
359. 如實施態樣356至358中任一項之方法，其中該細胞包含導致該一或多種共刺激分子表現增加的核酸(例如，mRNA)。
360. 如實施態樣359之方法，其中該核酸係編碼共刺激分子之mRNA。
361. 如實施態樣215至245、247至249及251至360中任一項之方法，其中該細胞係經進一步修飾以增加細胞介素的表現。
362. 如實施態樣361之方法，其中該細胞介素係IL-12、IL-2、IFN-α或IL-21。
363. 如實施態樣356之方法，其中該共刺激分子係信號3效應物。
364. 如實施態樣361至363中任一項之方法，其中該細胞包含導致該一或多種細胞介素表現增加的核酸(例如，mRNA)。
365. 如實施態樣364之方法，其中該核酸係編碼細胞介素之mRNA。
366. 如實施態樣215至245、247至249及251至365中任一項之方法，其中該經修飾之PBMC包含進一步修飾以調節MHC第一型表現。
367. 如實施態樣215至245、247至249及251至366中任一項之方法，其中該經修飾之PBMC包含進一步修飾以調節MHC第二型表現。
368. 如實施態樣366之方法，其中相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修飾的對應經修飾之PBMC所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修飾之PBMC所起始之先天免疫反應係減少。
369. 如實施態樣366或367之方法，其中相較於不包含該進一步修飾的對應經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修飾之PBMC在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
370. 如實施態樣215至245、247至249及251至369中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突細胞或NK-T細胞中一或多者。
371. 如實施態樣215至245、247至249及251至370中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC包含CD3+ T細胞、CD20+ B細胞、CD14+單核球或CD56+ NK細胞中一或多者。
372. 如實施態樣215至245、247至249及251至371中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且其中T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例基本上與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對全血中PBMC總數之比例相同。
373. 如實施態樣215至245、247至249及251至371中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且其中T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例基本上與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對來自全血之白血球分離術產物中PBMC總數之比例相同。
374. 如實施態樣215至245、247至249及251至373中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且其中T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對全血中PBMC總數之比例的差異不超過10%。
375. 如實施態樣215至245、247至249及251至374中任一項之方法，其中該複數個輸入PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且其中T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對複數個輸入PBMC中PBMC總數之比例與T細胞、B細胞、NK細胞及單核球對全血中PBMC總數之比例的差異不超過10%。
376. 如實施態樣215至245、247至249及251至375中任一項之方法，其中：
(a)至少約25%之輸入PBMC係T細胞；
(b)至少約2.5%之輸入PBMC係B細胞；
(c)至少約3.5%之輸入PBMC係NK細胞；或
(d)至少約4%之輸入PBMC係單核球。
377. 如實施態樣215至245、247至249及251至376中任一項之方法，其中：
(a)至少約20%之經修飾之PBMC係T細胞；
(b)至少約2%之經修飾之PBMC係B細胞；
(c)至少約3%之經修飾之PBMC係NK細胞；或
(d)至少約3%之經修飾之PBMC係單核球。
378. 如實施態樣215至245、247至249及251至377中任一項之方法，其中：
(a)不超過約70%之輸入PBMC係T細胞；
(b)不超過約14%之輸入PBMC係B細胞；
(c)不超過約35%之輸入PBMC係NK細胞；或
(d)不超過約25%之輸入PBMC係單核球。
379. 如實施態樣215至245、247至249及251至378中任一項之方法，其中：
(a)不超過約80%之經修飾之PBMC係T細胞；
(b)不超過約16%之經修飾之PBMC係B細胞；
(c)不超過約40%之經修飾之PBMC係NK細胞；或
(d)不超過約30%之經修飾之PBMC係單核球。
380. 如實施態樣215至245、247至249及251至379中任一項之方法，其中：
(a)約25%至約70%之經修飾之PBMC係T細胞；
(b)約2.5%至約14%之經修飾之PBMC係B細胞；
(c)約3.5%至約35%之經修飾之PBMC係NK細胞；或
(d)約4%至約25%之經修飾之PBMC係單核球。
381. 如實施態樣215至245、247至249及251至380中任一項之方法，其中：
(a)複數個經修飾之PBMC內T細胞之百分比及複數個輸入PBMC內T細胞之百分比在數字上的差異不大於10%；
(b)複數個經修飾之PBMC內B細胞之百分比及複數個輸入PBMC內B細胞之百分比在數字上的差異不大於10%；
(c)複數個經修飾之PBMC內NK細胞之百分比及複數個輸入PBMC內NK細胞之百分比在數字上的差異不大於10%；及/或
(d)複數個經修飾之PBMC內單核球之百分比及複數個輸入PBMC內單核球之百分比在數字上的差異不大於10%。
382. 如實施態樣215至245、247至249及251至378中任一項之方法，其中：
一或多種共刺激分子在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在該複數個輸入PBMC的B細胞中係經上調，其中該共刺激分子係CD80或CD86。
383. 如實施態樣382之方法，其中該CD80及/或CD86在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在複數個未經調理之PBMC的B細胞中係經上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
384. 如實施態樣382或383之方法，其中該共刺激分子係CD86。
385. 如實施態樣382至384中任一項之方法，其中該經調理之經修飾之PBMC相較於複數個未經調理之PBMC具有增加表現的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者。
386. 如實施態樣385之方法，其中該IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者的表現相較於該複數個未經調理之PBMC增加約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
387. 如實施態樣215至245、247至249及251至385中任一項之方法，其中該經修飾之PBMC對該個體係同種異體。
388. 如實施態樣215至245、247至249及251至385中任一項之方法，其中該經修飾之PBMC對該個體係自體。
389. 如實施態樣215至245、247至249及251至388中任一項之方法，其中該個體係經預先調理以調節發炎及/或免疫反應。
390. 如實施態樣215至245、247至249及251至389中任一項之方法，其進一步包含向該個體投予第三佐劑。
391. 如實施態樣390之方法，其中該第三佐劑係IFN-α或CpG ODN。
392. 如實施態樣390之方法，其中該第三佐劑係CpG 7909。
393. 如實施態樣390至392中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC及該第三佐劑係同期或同時投予。
394. 如實施態樣390至392中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC及該第三佐劑係依序投予。
395. 如實施態樣390至394中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC係於投予該第三佐劑之前投予。
396. 如實施態樣390至395中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC係於投予該第三佐劑之後投予。
397. 如實施態樣215至245、247至249及251至396之方法，其中該經修飾之PBMC係於投予細胞介素之前、同期或之後投予。
398. 如實施態樣397之方法，其中該細胞介素係下列一或多者：IL-2、IL-7、IL-12a、IL-12b或IL-15。
399. 如實施態樣215至245、247至249及251至398之方法，其中該經修飾之PBMC係於投予免疫檢查點抑制劑之前、同期或之後投予。
400. 如實施態樣399之方法，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、VISTA及TIM-3中任一者。
401. 如實施態樣400之方法，其中免疫檢查點抑制劑靶向PD-1。
402. 如實施態樣400之方法，其中免疫檢查點抑制劑靶向PD-L1。
403. 如實施態樣215至245、247至249及251至402之方法，其中該經修飾之PBMC係於投予治療劑之前、同期或之後投予。
404. 如實施態樣403之方法，其中該治療劑係化學治療劑。
405. 如實施態樣215至245、247至249及251至404中任一項之方法，其中向該個體投予該經修飾之PBMC導致對該抗原具特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活化及/或擴增。
406. 如實施態樣215至245、247至249及251至405中任一項之方法，其中向該個體投予該經修飾之PBMC導致對該抗原具特異性的輔助T (Th)細胞活化及/或擴增。
407. 如實施態樣215至245、247至249及251至406中任一項之方法，其中向該個體投予之該經修飾之PBMC的量係介於約1×104
與約1×1012
個細胞之間。
408. 如實施態樣407之方法，其中向該個體投予之該經修飾之PBMC的量係介於約1×105
與約1×1012
個細胞之間。
409. 如實施態樣407或408之方法，其中向該個體投予之該經修飾之PBMC的量係介於約5×105
與約2.5×106
個細胞/kg體重之間。
410. 如實施態樣215至245、247至249及251至409中任一項之方法，其中該方法包含多次投予該經修飾之PBMC。
411. 如實施態樣410之方法，其中該方法包含約3次至約9次投予。
412. 如實施態樣410或411之方法，其中該複數個經修飾之PBMC之二次連續投予之間的時間間隔係介於約1天與約30天之間。
413. 如實施態樣410至412中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC之二次連續投予之間的時間間隔係約21天。
414. 如實施態樣215至245、247至249及251至413中任一項之方法，其中該個體係HLA-A2表現陽性。
415. 如實施態樣215至245、247至249及251至414中任一項之方法，其中複數個經修飾之PBMC中至少一個細胞係HLA-A2表現陽性。
416. 一種用於產製包含人類乳突病毒(HPV)抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
417. 一種用於產製包含HPV抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，
藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
418. 一種用於產製包含HPV抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
419. 一種用於產製包含HPV抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，
藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
420. 如實施態樣416至419中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。
421. 如實施態樣416至420中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。
422. 如實施態樣416至421中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。
423. 如實施態樣416至422中任一項之方法，其中包含HPV抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
424. 一種用於產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
425. 一種用於產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，
藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
426. 一種用於產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
427. 一種用於產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，
藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
428. 如實施態樣424至427中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。
429. 如實施態樣424至428中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。
430. 如實施態樣424至429中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。
431. 如實施態樣424至430中任一項之方法，其中包含HPV抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
432. 一種用於刺激個體的對抗HPV抗原之免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
433. 一種用於刺激個體的對抗HPV抗原之免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
434. 一種用於刺激個體的對抗HPV抗原之免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
435. 一種用於刺激個體的對抗HPV抗原之免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該HPV抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該HPV抗原培育足夠的時間，以允許該HPV抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含該HPV抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該HPV抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該HPV抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
436. 如實施態樣432至435中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。
437. 如實施態樣432至436中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。
438. 如實施態樣432至437中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。
439. 如實施態樣432至438中任一項之方法，其中包含HPV抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
440. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
441. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
442. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
443. 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與CpG ODN培育約1小時至約24小時而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，其中該CpG ODN係CpG 7909，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及
d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
444. 如實施態樣440至443中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。
445. 如實施態樣440至444中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約6 µm。
446. 如實施態樣440至445中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係(a)約4.2 µm至約6 µm；或(b)約4.5 µm。
447. 如實施態樣440至446中任一項之方法，其中包含HPV抗原之複數個經修飾之PBMC係與CpG ODN培育(a)約2小時至約10小時；(b)約3小時至約6小時；或(c)約4小時。
448. 如實施態樣432至447中任一項之方法，其進一步包含向該個體投予第二佐劑。
449. 如實施態樣448之方法，其中該第二佐劑係IFN-α或CpG ODN。
450. 如實施態樣449之方法，其中該第二佐劑係CpG 7909。
451. 如實施態樣432至450中任一項之方法，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC進一步包含藥劑，該藥劑增強該經修飾之PBMC的存活及/或功能，可選地其中該藥劑係以下一或多者：丙酮酸鈉、腺嘌呤、Rejuvesol®、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、PlasmaLyte®、DMSO、Cryostor® CS2、Cryostor® CS5、Cryostor® CS10、Cryostor® CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、HypoThermosol®。
452. 如實施態樣432至451之方法，其中該經修飾之PBMC係於投予免疫檢查點抑制劑之前、同期或之後投予。
453. 如實施態樣452之方法，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、VISTA及TIM-3中任一者。
454. 如實施態樣453之方法，其中免疫檢查點抑制劑靶向PD-1。
455. 如實施態樣453之方法，其中免疫檢查點抑制劑靶向PD-L1。
456. 如請求項440至455之方法，其中該經修飾之PBMC係於投予治療劑之前、同期或之後投予。
457. 如實施態樣456之方法，其中該治療劑係化學治療劑。
額外實施態樣
1. 一種複數個經修飾之周邊血液單核細胞(PBMC)，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性且其中該複數個經修飾之PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中二種或超過二種，特別是其中該抗原係癌症抗原、傳染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。
2. 如實施態樣1之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係存在於該複數個PBMC中至少約70%的細胞中。
3. 如實施態樣1或2之複數個經修飾之PBMC，其係經調理之複數個經修飾之PBMC，特別是其中該經修飾之PBMC包含佐劑。
4. 如實施態樣3之複數個經修飾之PBMC，其中抗原係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞胞質液中且佐劑係存在於複數個經修飾之PBMC之細胞囊泡中。
5. 如實施態樣3或4中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該CD80及/或CD86在該複數個經調理之PBMC的B細胞中相較於在複數個未經調理之PBMC的B細胞中係經上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
6. 如實施態樣3至5中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者在該複數個經調理之PBMC的PBMC中的表現相較於該複數個未經調理之PBMC增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
7. 如實施態樣1至6中任一項之複數個經修飾之PBMC，其係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
8. 如實施態樣3至7中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其係藉由包含下列步驟之過程製備：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與該佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
9. 如實施態樣1至8中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：
(a)複數個經修飾之PBMC內T細胞之百分比及複數個輸入PBMC內T細胞之百分比的差異不大於約10%；
(b)複數個經修飾之PBMC內B細胞之百分比及複數個輸入PBMC內B細胞之百分比的差異不大於約10%；
(c)複數個經修飾之PBMC內NK細胞之百分比及複數個輸入PBMC內NK細胞之百分比的差異不大於約10%；及/或
(d)複數個經修飾之PBMC內單核球之百分比及複數個輸入PBMC內單核球之百分比的差異不大於約10%。
10. 一種用於產製包含抗原之複數個經修飾之PBMC之方法，該方法包含：
a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；
b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及可選地
c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC。
11. 如實施態樣7至9中任一項之複數個經修飾或經調理之PBMC或如實施態樣10之方法，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC內具有最小直徑之細胞亞族群之平均直徑的約60%至約90%，及/或其中該縊縮之直徑係約該複數個輸入PBMC內具有最大直徑之細胞亞族群之平均直徑的約20%至約30%。
12. 如實施態樣7至9或11中任一項之複數個經修飾或經調理之PBMC或實施態樣10或11之方法，其中該縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm，特別是約3 µm至約6 µm。
13. 如實施態樣8至9或11至12中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC或如實施態樣10至12中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約1至約24小時而調理該經修飾之PBMC，特別是約2至約10小時。
14. 如實施態樣3至9或11至13中任一項之經調理之複數個經修飾或經調理之PBMC或實施態樣10至13中任一項之方法，其中該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I：C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑。
15. 如實施態樣1至9或11至14中任一項之複數個經修飾或經調理之PBMC或如實施態樣10至14中任一項之方法，其中該抗原係人類乳突病毒(HPV)抗原。
實例
所屬技術領域中具有通常知識者將認可數種實施態樣在本發明之範疇及精神內係可能的。本發明現將參照下列非限制性實例更詳細地描述。下列實例進一步說明本發明，但當然不應被解讀為以任何方式限制其範疇。
實例1
為了探討包含抗原之經調理之複數個PBMC於刺激個體之免疫反應的療效，包含HPV衍生性抗原之經調理之複數個PBMC係經產製及投予至個體。作為治療性疫苗之用的包含疾病抗原之經調理之PBMC作為單一療法或與額外治療劑諸如PD-L1抑制劑及/或化學治療劑組合時的療效係經研究。
PBMC-HPV原料藥係由在MHC-I上呈現HPV16之HLA-A02限制性E6及E7表位之自體PBMC組成。大部分PBMC (＞90%)係由T細胞、單核球、NK細胞及B細胞組成。PBMC-HPV的結構說明係呈現於圖1A，其中所示線條代表含有HPV16免疫原性表位之全長E6及E7合成長肽(SLP)。最小表位分別以紅色及綠色標示。一旦投遞之後，SLP係經處理以產製最小表位，該最小表位後續呈現在MHC-I上。
圖1A中的細胞代表任何PBMC-HPV細胞類型(T細胞、單核球、NK細胞及B細胞)。
用來作為生產PBMC-HPV原料藥之起始材料的E6 SLP及E7 SLP係如下所示。這些肽含有HPV16的抗原性表位(以粗體字母顯示)。
E6 SLP：QLCTELQTTIHDIILECV
YCKQQLL (SEQ ID NO：19)
E7 SLP：QLCTELQTYMLDLQPETT
YCKQQLL (SEQ ID NO：23)
在製程期間被投遞至細胞胞質液之後，這些肽係藉由細胞處理且所得之含有抗原性表位之區段係呈現在各種PBMC細胞的MHC-I上。E6 SLP係來自天然E6蛋白質之25個胺基酸肽，選擇E6 SLP是因為其含有HLA-A2抗原性肽TIHDIILECV (SEQ ID NO：1)，其被引述為E6蛋白質中之HLA-A2限制性免疫優勢表位。E7 SLP在來自E6蛋白質之側接胺基酸之內含有HLA-A2限制性免疫優勢表位YMLDLQPETT (SEQ ID NO：3)。此E7表位被廣泛引述為抗原性E7肽。發現在此側接序列中之E7表位(與天然E7蛋白質不同)比起含有天然E7側接序列之SLP被人抗原呈現細胞更有效地活體外處理及呈現。
作為PBMC-HPV原料藥製程之一部分，PBMC-HPV細胞係經CpG 7909(一種刺激類鐸受體(TLR9)傳訊之CpG寡去氧核糖核苷酸(ODN))調理。此成熟導致PBMC-HPV細胞產生發炎性細胞介素(例如IL-6)及B細胞上共刺激分子(例如CD86)及MHC-I的上調。在成熟期之後，PBMC-HPV原料藥係經洗滌以移除CpG 7909及累積的細胞介素，且後續經調配成包含經調理之複數個包含HPV抗原之PBMC之組成物，稱為SQZ-PBMC-HPV藥品。
PBMC-HPV原料藥係由細胞及產製SQZ-PBMC-HPV藥品所需之調配及填充組成，該等細胞具有經投遞至胞質液之E6及E7 SLP且在CpG 7909成熟該等細胞之後但在馬上要將CpG 7909洗滌掉之前。
為了製造藥品，將PBMC-HPV原料藥洗滌二次且後續經調配於溶液中。例如，溶液可含有50% (v/v)的冷凍保存培養基(諸如CryoStor® CS10)、30% (v/v)的低溫保存培養基(諸如HypoThermosol® FRS)及20% (v/v)的白蛋白(諸如Albuked™ 25(25%人血清白蛋白)；NDC #76125-0792-10)。
在白血球分離術後大約6至8天，病患經靜脈內(IV)接受SQZ-PBMC-HPV藥品。SQZ PBMC-HPV藥品的劑量根據病患的劑量研究世代而異且係基於活細胞/kg給藥。
首度人體(FIH)研究係由SQZ-PBMC-HPV及SQZ-PBMC-HPV +阿特珠單抗的遞增階段及擴增階段組成。
SQZ-PBMC-HPV遞增階段包含下列研究世代：
(1)低細胞劑量研究世代，為SQZ-PBMC-HPV的初始投予及隨後的二次追加(一次在初始劑量之後3週及一次在初始劑量之後6週)，
(2) SQZ-PBMC-HPV的低細胞劑量初始投予及隨後間隔3週投予之5次追加，
(3)高細胞劑量研究世代，為SQZ-PBMC-HPV的3個相等等分之初始投予及隨後的二次追加(一次在初始劑量之後3週及一次在初始劑量之後6週)，
(4)高細胞劑量研究世代，為SQZ-PBMC-HPV的初始投予及隨後的二次追加(一次在初始劑量之後3週及一次在初始劑量之後6週)。在此研究世代中，每次在SQZ-PBMC-HPV之後將共投CpG 7909。
雖然FIH研究的主要焦點在於評估SQZ-PBMC-HPV之投予，但該研究包括在一個研究世代(研究世代4)評估SQZ-PBMC-HPV與CpG 7909之共投。研究世代4提供後續研究世代及擴增階段是否共投CpG7909之資訊。在研究世代4中，首先藉由IV投予SQZ-PBMC-HPV，隨後IV投予CpG 7909。
在分析各研究世代中至少4名病患關於共投CpG 7909之安全性、耐受性及影響之後，與研究計劃主持人一起做出在SQZ-PBMC-HPV +阿特珠單抗之遞增階段中藥品SQZ-PBMC-HPV是否與CpG 7909共投的決定。測試下列研究世代：
(5)低細胞劑量研究世代+阿特珠單抗，為SQZ-PBMC-HPV +阿特珠單抗的初始投予及隨後的二次追加(一次在初始劑量之後3週及一次在初始劑量之後6週)，
(6)低細胞劑量研究世代+阿特珠單抗，為SQZ-PBMC-HPV +阿特珠單抗的初始投予及隨後間隔3週投予之至少5次追加(最多9次取決於收集細胞的數量)，
(7)高細胞劑量研究世代+阿特珠單抗，為SQZ-PBMC-HPV +阿特珠單抗的初始投予及隨後的二次追加(一次在初始劑量之後3週及一次在初始劑量之後6週)。
圖1B及圖1C分別顯示SQZ-PBMC-HPV單一療法及SQZ-PBMC-HPV +阿特珠單抗組合療法之研究世代治療的代表性示意圖。
以擴增階段研究而言，至多3組給藥SQZ-PBMC-HPV作為單一療法係：
(1)接受選定的建議第2期劑量(RP2D)方案之HPV16陽性頭頸鱗狀細胞癌，
(2)接受選定的建議第2期劑量(RP2D)方案之HPV16陽性子宮頸癌，
(3)接受選定的建議第2期劑量(RP2D)方案之其他HPV16陽性癌症，
至多3組使用SQZ-PBMC-HPV +阿特珠單抗係：
接受選定的SQZ-PBMC-HPV建議第2期劑量(RP2D)方案之HPV16陽性頭頸鱗狀細胞癌，
接受選定的SQZ-PBMC-HPV建議第2期劑量(RP2D)方案之HPV16陽性子宮頸癌，
接受選定的SQZ-PBMC-HPV建議第2期劑量(RP2D)方案之其他HPV16陽性癌症。
實例2
為了定量對個別免疫細胞子集的SQZ媒介投遞，將小鼠脾細胞裝載螢光示蹤劑分子且評估存活性及投遞。
方法
脾細胞係自C57BL/6J雌性小鼠單離(20 M/mL)且使用SQZ(30、60及90 psi；4 µm縊縮)裝載100 µg/mL於RPMI中之螢光標示右旋糖苷(3 kDa)並藉由流動式細胞測量術測量混合脾細胞族群內之個別免疫細胞子集的存活性及右旋糖苷投遞百分比。
結果
如圖2所示，右旋糖苷投遞至脾細胞之百分比隨著遞增壓力而顯著增加(P＜0.001；各條件相對於胞飲作用)，且30及60 psi條件的存活性僅稍微降低及90 psi條件的存活性降低較大。B及NK細胞相較於其他細胞族群具有最高的投遞量，雖然在T細胞及單核球中仍有可觀的投遞量。在給出最高投遞且對存活性僅最小影響的條件(60 psi)下，所有細胞子集具有在約15%內的投遞百分比(所有細胞類型60至75%投遞)。這些資料顯示SQZ可同時有效投遞分子至鼠脾細胞混合族群中之各免疫細胞子集，且對存活性的影響極小。
實例3
為了評估不同佐劑策略的影響，將混合的脾細胞及單離的B細胞裝載模型抗原且經佐劑調理及/或與佐劑共注射並藉由流動式細胞測量術測量發炎性細胞介素IFN-γ+ CD8+ T細胞的相對百分比。
方法
在第0天，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟，連同一組經由免疫磁性分離自脾細胞單離之B細胞，藉由SQZ(60 psi；4 μm縊縮)裝載Ova蛋白質(400 μg/mL)且在單獨培養基(R10)或含有CpG 1826 (1 μM)之培養基中培育16h。雌性C57BL/6J受者小鼠(5隻/組)在第1天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)、B細胞(5×106
個細胞/mL)、脾細胞(5×106
個細胞/mL)或與25 μg CpG1826共注射之脾細胞。在第8天，收集脾臟、用SIINFEKL (SEQ ID NO：54) (1 µg/mL)再刺激且藉由細胞內細胞介素染色(ICS)判定IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比。
結果
如圖3所示，經Ova裝載脾細胞處理之小鼠的IFN-γ+ CD8+ T細胞百分比在脾細胞經CpG調理16h時顯著較高(P＜0.005相對於所有其他條件；資料代表3個非依賴性實驗)；然而，當小鼠經CpG共注射或經CpG成熟B細胞(BAPC
)處理時，%IFN-γ+ CD8+ T細胞並無顯著增加。這些資料顯示CpG成熟、Ova裝載脾細胞處理導致抗原特異性CD8+ T細胞中發炎性細胞介素產生的顯著增加，然而Ova裝載B細胞或與CpG共注射之脾細胞不誘導可觀反應。
實例4
為了判定與較低劑量的CpG共注射之抗原裝載脾細胞是否可誘發抗原特異性反應，將脾細胞裝載模型抗原且經CpG成熟、與CpG共注射或成熟且與遞增劑量之CpG共注射，並藉由流動式細胞測量術測量發炎性細胞介素IFN-γ+ CD8+ T細胞之相對百分比。
方法
在第0天，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物。接著將這些混合的脾細胞藉由SQZ(60 psi；4 μm縊縮)裝載Ova蛋白質(400 μg/mL)且在單獨培養基(R10)或含有CpG 1826 (1 μM)之培養基中培育16h。雌性C57BL/6J受者小鼠(5隻/組)在第1天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)、經CpG成熟之脾細胞(1×106
個細胞/小鼠)、與25 μg CpG1826共注射之脾細胞或經CpG成熟且與不同劑量之CpG(0.1至10 μg)共注射之脾細胞。在第8天，收集脾臟、用SIINFEKL (SEQ ID NO：54) (1 µg/mL)再刺激且藉由細胞內細胞介素染色(ICS)判定IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比。
結果
如圖4所示，經Ova裝載脾細胞處理之小鼠的IFN-γ+ CD8+ T細胞百分比在脾細胞經CpG成熟16h時顯著較高(P＜0.05相對於未處理)；然而，當小鼠經CpG共注射時，相對於對照，%IFN-γ+ CD8+ T細胞並無顯著增加。此外，當脾細胞經CpG成熟相較於成熟且與任何劑量之CpG共注射時，%IFN-γ+ CD8+ T細胞百分比無統計顯著性增加，且5 μg CpG共注射明顯稍微降低。這些資料顯示共注射CpG與CpG成熟、Ova裝載脾細胞之組合不導致抗原特異性CD8+ T細胞中發炎性細胞介素產生的顯著增加。
實例5
為了判定與不同佐劑共注射之抗原裝載脾細胞是否可誘發抗原特異性反應，將脾細胞裝載模型抗原且經CpG成熟、與CpG共注射或經CpG成熟且與CpG或IFN-α共注射，並藉由流動式細胞測量術測量發炎性細胞介素IFN-γ+ CD8+ T細胞之相對百分比。
方法
在第0天，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物。接著將這些混合的脾細胞藉由SQZ(60 psi；4 μm縊縮)裝載Ova蛋白質(400 μg/mL)且在單獨培養基(R10)或含有CpG 1826 (1 μM)之培養基中培育16h。雌性C57BL/6J受者小鼠(5隻/組)在第1天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)、經CpG成熟之脾細胞(1×106
個細胞/小鼠)、與1 μg CpG1826共注射之脾細胞或經CpG成熟且與CpG或10000 U IFN-α共注射之脾細胞。在第8天，收集脾臟、用SIINFEKL (SEQ ID NO：54) (1 µg/mL)再刺激且藉由細胞內細胞介素染色(ICS)判定IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比。
結果
如圖5所示，經Ova裝載脾細胞處理之小鼠的IFN-γ+ CD8+ T細胞百分比在脾細胞經CpG成熟16h時最高，相較於未處理(P＜0.0001)以及共注射CpG (P＜0.005)顯著增加。經CpG成熟脾細胞且將它們與任一佐劑共注射並無顯著優點，且有共注射之佐劑使效應鈍化之趨勢。這些資料顯示共注射CpG或IFN-α與CpG成熟、Ova裝載脾細胞之組合不導致抗原特異性CD8+ T細胞中發炎性細胞介素產生的顯著增加。
實例6
為了判定抗原特異性脾細胞疫苗追加是否可誘發較高抗原特異性反應，將脾細胞裝載模型抗原、經CpG成熟且注射至受者小鼠一次(初免)或二次(初免-追加)，並藉由流動式細胞測量術測量發炎性細胞介素IFN-γ+ CD8+ T細胞之相對百分比。
方法
在第-7天，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物。接著將這些混合的脾細胞藉由SQZ(60 psi；4 μm縊縮)裝載Ova蛋白質(400 μg/mL)且在CpG 1826(1 μM於R10中)中4h。雌性C57BL/6J受者小鼠(5隻/組)在第-7天及/或第0天經眼後注射100 μL之脾細胞(1×105 至 6
個細胞/小鼠)。在第7天，收集脾臟、用SIINFEKL (SEQ ID NO：54) (1 µg/mL)再刺激且藉由細胞內細胞介素染色(ICS)判定IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比。
結果
如圖6所示，雖然增加脾細胞劑量確實導致IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比的中度增加，但在7天後增加一次追加在所有測試的脾細胞劑量導致IFN-γ+細胞顯著(P＜0.05)增加。有趣的是，追加的增強在較低細胞劑量中最為明顯，其中0.1M劑量展示抗原特異性反應增加8倍。這些資料顯示在所有測試劑量中，使用在初免後7天追加導致顯著增強抗原特異性CD8+ T細胞反應。
實例7
為了評估細胞劑量之重要性及B細胞相對於混合脾細胞疫苗之相對療效，將細胞裝載模型抗原且經佐劑成熟，並藉由流動式細胞測量術測量發炎性細胞介素IFN-γ+ CD8+ T細胞之相對百分比。
方法
在第0天，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物。此外，單離的B細胞係經由正向免疫磁性分離獲自雌性供體小鼠的脾臟。接著將這些不同的細胞組成物藉由SQZ(60 psi；4 μm縊縮)裝載Ova蛋白質(400 μg/mL)且在單獨培養基(R10)或含有CpG 1826 (1 μM)之培養基中培育16h。雌性C57BL/6J受者小鼠(5隻/組)在第1天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)、B細胞或脾細胞(0.25至4×106
個細胞/mL)。在第8天，收集脾臟、用SIINFEKL (SEQ ID NO：54) (1 µg/mL)再刺激且藉由細胞內細胞介素染色(ICS)判定IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比。
結果
如圖7所示，經Ova裝載B細胞或脾細胞處理之小鼠的IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比展現正向劑量反應，其中4M細胞劑量在測試的二種細胞類型中皆導致最高反應。大致上，脾細胞的所有劑量相較於彼等之BAPC對應物導致較高平均反應且有傾向顯著性之趨勢。此資料顯示較高細胞數量具有增加反應之趨勢且脾細胞可誘導較高抗原特異性反應。
實例8
為了評估CpG成熟時間對於混合的脾細胞誘導抗原特異性反應之相對療效的影響，將脾細胞裝載模型抗原且經CpG成熟不同時間，並藉由流動式細胞測量術測量發炎性細胞介素IFN-γ+ CD8+ T細胞之相對百分比。
方法
在第0天，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物。將脾細胞藉由SQZ(60 psi；4 μm縊縮)裝載Ova蛋白質(400 μg/mL)且在單獨培養基(R10)或含有CpG 1826 (1 μM)之培養基中培育不同時間。雌性C57BL/6J受者小鼠(5隻/組)在第1天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)或脾細胞(1×106
個細胞/mL)。在第8天，收集脾臟、用SIINFEKL (SEQ ID NO：54) (1 µg/mL)再刺激且藉由細胞內細胞介素染色(ICS)判定IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比。
結果
如圖8所示，經Ova裝載脾細胞處理之小鼠的IFN-γ+ CD8+ T細胞百分比隨著較長CpG成熟時間而增加(*P＜0.05，**P＜0.01，#P＜0.005，所有皆與無CpG比較)。所有成熟時間至少4小時者皆觀察到反應的顯著增加。這些資料顯示至少4小時的SQZ後CpG成熟時間係誘導顯著抗原特異性反應所需。
實例9
為了判定在治療場域中導致腫瘤生長抑制所需的脾細胞之最小有效細胞劑量，在HPV E7表現性TC1腫瘤模型中，以腫瘤對時間作圖的面積測試四種不同劑量的脾細胞。
方法
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部。在第7天(初免)，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物。將脾細胞經由SQZ(60 psi；4 μm縊縮)裝載預先複合的20 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO：25)) + 20 µM小鼠血清白蛋白(MSA)並與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時。雌性C57BL/6J受者小鼠(10隻/組)在第7天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)或脾細胞(0.05至1M個細胞/小鼠)。從腫瘤植入後1週開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較30天。
結果
如圖9所示，比較來自未治療組(無脾細胞)與經遞增數量之HPV E7裝載脾細胞治療組之小鼠之間的腫瘤生長(如公式((長度×寬度2)/2)所測量)。發現脾細胞劑量越高，腫瘤生長抑制越佳，其中1M劑量平均導致完全腫瘤消退。在30天後，1M治療組有5隻剩餘小鼠為無腫瘤，然而0.25M組具有3隻無腫瘤的小鼠。這些資料顯示藉由SQZ裝載之脾細胞可在HPV相關癌症治療性模型中誘導腫瘤消退。
實例10
為了判定CpG成熟對於混合族群內之B細胞的效應，將人PBMC及鼠脾細胞經CpG成熟各種時間，藉由流動式細胞測量術測量B細胞族群中活化標誌CD86之相對量且藉由多工測定來定量細胞介素及趨化激素的量。
方法
鼠脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物。將人PBMC及脾細胞在含有CpG(2006用於人，1826用於鼠)之R10中培育不同時間(2至24h)及濃度(1至10 μM)。在CpG培育後，將細胞用R10洗滌並藉由流動式細胞測量術評估CD86的量，同時收集上清液並使用多工(29工)人細胞介素/趨化激素測定分析細胞介素的量。
結果
圖10A顯示下列結果：人(上圖)-CpG較高的10 μM劑量顯示在2小時後人PBMC之B細胞族群中CD86的量隨時間降低。較低的1 μM劑量比起10 μM在所有時間點導致較高量的CD86，且其亦展現雙模態時間進程，即量在2h後降低且在24h後開始回復。這些資料顯示較低量的CpG可導致較高的B細胞活化，所有劑量的尖峰在最早觀察的時間點。
鼠(下圖)-對於鼠B細胞而言，隨時間且在兩種濃度下CD86的量並無可觀變化。這些資料顯示鼠B細胞不因應CpG成熟而上調CD86。
如圖10B所示，細胞介素/趨化激素(圖10B)–來自人及小鼠兩者之趨化激素/細胞介素輪廓的結果皆展現類似趨勢，其中許多相同蛋白質(IFN-γ, IL-6, MIP-1B)因應CpG治療而增加，雖然IL-10及IL-13僅在鼠脾細胞中增加。這些結果指示人PBMC及鼠脾細胞對CpG具有類似的趨化激素/細胞介素反應，但IL-10及IL-13為明顯例外。
實例11
為了判定SQZ對於細胞組成及MHC-I的量的影響，使人PBMC進行細胞擠壓並藉由流動式細胞測量術評估免疫細胞之相對百分比以及MHC-I之表面表現。
方法
在室溫下使來自HLA-A2+供體之人PBMC與(胞飲作用)培育或藉由SQZ(60 psi；3.5至4 μm寬度)裝載3 kDa螢光標示右旋糖苷(100 μg/mL)。接著分析經裝載之PBMC的B細胞、T細胞、NK細胞及單核球相對組成，以及經由流動式細胞測量術分析HLA-A2 MHC-I表面表現。
結果
如圖11所示，使用SQZ裝載人PBMC導致B細胞(CD20)、T細胞(CD3)、NK細胞(CD56)及單核球(CD14)小於5%的變化[上圖]，與SQZ後MHC-I的量稍微(12%)降低一致。以細胞組成及MHC-I的量兩者而言，3.5 μm縊縮寬度導致略為較高的改變。綜上所述，這些資料支持使用SQZ裝載PBMC不明顯地改變免疫細胞子集的相對豐度及彼等之MHC-I表面表現。
實例12
為了判定SQZ對於個別細胞子集的投遞及影響，使人PBMC進行細胞擠壓並藉由流動式細胞測量術評估存活性及投遞螢光化合物至不同的免疫細胞族群。
方法
在室溫下使人PBMC與(胞飲作用)培育或藉由SQZ(60 psi；3.5至4 μm寬度)裝載3 kDa螢光標示右旋糖苷(100 μg/mL)。接著藉由流動式細胞測量術分析經裝載之PBMC的存活性及投遞。
結果
如圖12A及B所示，使用SQZ裝載人PBMC導致B細胞(CD20)、T細胞(CD3)、NK細胞(CD56)及單核球(CD14)存活性小於10%的變化[左圖]。在3.5 μm寬度縊縮中，經右旋糖苷投遞之細胞百分比介於60%(B細胞)至90%(單核球)之間，而4 μm寬度縊縮在所有細胞類型導致經投遞之細胞減少約10至20%。在3.5 μm寬度中，T細胞及單核球每細胞裝載之右旋糖苷的量增加至多35倍且B細胞及NK細胞增加約5至10倍。4 μm寬度縊縮相較於3.5 μm寬度大致上降低約2倍投遞的量。
實例13
為了判定投遞至個別細胞子集對於混合族群之整體功能反應的效應，將人PBMC藉由SQZ裝載疾病相關抗原及標籤化右旋糖苷且測量刺激抗原特異性應答細胞之能力並與標籤化化合物之投遞比較。
方法
將來自HLA-A02+供體之人PBMC(10M個細胞/mL)藉由SQZ(60 psi，室溫)在50 μM E7 SLP (QLCTELQTYMLDLQPETT
YCKQQLL (SEQ ID NO：23))及3 kDa螢光標示右旋糖苷(100 μg/mL)存在下裝載，並藉由流動式細胞測量術定量不同縊縮寬度(3.5及4 μm)之間投遞至細胞子集的量。接著將PBMC與E711-20特異性CD8+應答細胞以2：1刺激細胞：應答細胞之比例共培養且在IL-2 (10 U/mL)存在下培養，並與未處理對照或與最小表位(PP - 0.1 μM - YMLDLQPETT (SEQ ID NO：3))隔夜培育之2：1刺激細胞：應答細胞比較。在24h後，收集各條件的上清液，並藉由IFN-γ ELISA評估IFN-γ生產的量。
結果
如圖13所示，使用SQZ裝載人PBMC導致藉由ELISA評估之IFN-γ生產的量至多增加約4倍(3.5 μm)(上圖)。經由4 μm縊縮之投遞展現E7特異性應答T細胞大約一半量的抗原特異性反應(中間及右圖–重新分析來自相同樣本之圖11資料)。此功能效應與3.5 μm條件的E7 SLP較高投遞有關。這些發現顯示增強投遞可導致人PBMC之細胞抗原呈現功能性的增加。
實例14
為了判定各種投遞參數對於免疫細胞活化抗原特異性反應之能力的影響，將人PBMC藉由SQZ裝載疾病相關抗原且測量刺激抗原特異性應答細胞之能力並比較不同的SQZ條件。
方法
將來自HLA-A02+供體之人PBMC(10M個細胞/mL)藉由SQZ在50 μM pp65 SLP
(PPWQAGILARNLVPMVATV
QGQNLKYQEFFWDAND (SEQ ID NO：51))存在下裝載，並改變壓力(45、60 psi)、溫度(室溫、冰)及縊縮寬度(3.5至4.5 μm)。接著將PBMC與pp65特異性CD8+應答細胞以2：1刺激細胞：應答細胞之比例共培養，在IL-2 (10 U/mL)存在下培養，並與未處理對照或與最小表位(PP - 0.1 μM - NLVPMVATV (SEQ ID NO：55))隔夜培育之2：1刺激細胞：應答細胞比較。在24h後，收集各條件的上清液，並藉由IFN-γ ELISA評估IFN-γ生產的量。
結果
如圖14所示，使用SQZ以pp65 SLP裝載人PBMC導致藉由ELISA評估之IFN-γ生產的量增加約6至9倍。越窄的縊縮寬度(3.5 μm)及越高的壓力(60 psi)導致較高反應，逐漸較寬的晶片導致喪失功能性，且此現象在室溫(上圖)與冰(下圖)條件之間保留。綜上所述，在SQZ期間冰可能帶來少許優點，但所有條件導致IFN-γ生產顯著增加。
實例15
為了判定CpG成熟對於人免疫細胞活化抗原特異性反應之能力的影響，並比較經裝載之T細胞APC的此反應，將人PBMC或經單離之T細胞藉由SQZ裝載疾病相關抗原且測量刺激抗原特異性應答細胞之能力並與無CpG成熟比較。
方法
將人HLA-A02+ PBMC或單離自HLA-A02+供體之PBMC的T細胞(10M個細胞/mL)藉由SQZ(45 psi；3 μm縊縮用於PBMC，4.5 μm縊縮用於T細胞)在50 μM的pp65 SLP (PPWQAGILARNLVPMVATV
QGQNLKYQEFFWDAND (SEQ ID NO：51))存在下裝載。接著將PBMC與pp65特異性CD8+應答細胞以2：1刺激細胞：應答細胞之比例共培養，在IL-2 (10 U/mL) +/- CpG 2006 (1 μM)存在下培養，並與未處理對照或與最小表位(PP - 0.1 μM - NLVPMVATV (SEQ ID NO：55))隔夜培育之2：1刺激細胞：應答細胞比較。在24h後，收集各條件的上清液，並藉由IFN-γ ELISA評估IFN-γ生產的量。
結果
如圖15所示，使用SQZ以pp65 SLP裝載人PBMC比起與SLP(胞飲作用)培育之細胞導致較高IFN-γ生產，有及無CpG皆然。此外，與CpG共培養之SQZ裝載條件之間的反應相對於無CpG者增加30%(P＜0.05；上圖)。T細胞對CpG成熟無反應，因此T細胞條件直接與以CpG條件共培養之PBMC比較，且發現PBMC條件的反應近乎兩倍(P＜0.001；下圖)。綜上所述，這些資料顯示CpG共培養增強人PBMC的抗原特異性反應，且當與經裝載之T細胞比較時，PBMC加上CpG在誘發此反應上近乎兩倍有效。
實例16
為了檢查在人情況中佐劑及抗原濃度對於活化抗原特異性反應的效應，將人PBMC藉由SQZ裝載不同濃度的疾病相關抗原，且測量刺激抗原特異性應答細胞的能力並在不同的佐劑間比較。
方法
將來自HLA-A02+供體之人PBMC(10M個細胞/mL)藉由SQZ(60 psi；3.5 μm縊縮)在不同濃度的pp65 SLP(PPWQAGILARNLVPMVATV
QGQNLKYQEFFWDAND (SEQ ID NO：51)；1、10及50 μM)存在下裝載。接著將PBMC與pp65特異性CD8+應答細胞以2：1刺激細胞：應答細胞之比例共培養，在IL-2 (10 U/mL) +/- CpG 2006 (1 μM)或R837(1 μg/mL；咪喹莫特)存在下培養，並與未處理對照或與最小表位(PP - 0.1 μM - NLVPMVATV (SEQ ID NO：55))隔夜培育之2：1刺激細胞：應答細胞比較。在24h後，收集各條件的上清液，並藉由IFN-γ ELISA評估IFN-γ生產的量。
結果
如圖16所示，雖然藉由SQZ在有及無佐劑下裝載1 μM pp65 SLP之人PBMC的功能反應之間無顯著差異，但較高濃度確實顯示與佐劑共培養的顯著優點。10 μM pp65 SLP條件顯示與CpG共培養相對於無CpG共培養之PBMC的反應稍微增加但非顯著增加，但當PBMC與R837共培養時相較於無佐劑則有顯著增加(P＜0.0001)。當使用50 μM之SLP時，此效應甚至更為明顯，其中CpG及R837導致抗原特異性反應顯著增強(P＜0.0001)。在所有情況下，與任一佐劑共培養有增加之優點，雖然R837一致性地導致最高反應，且此效應受到較高濃度之pp65 SLP的加強。綜上所述，這些資料顯示在共培養期間使用佐劑增強人PBMC之抗原特異性反應且此效應取決於所使用之抗原的濃度。
實例17
為了檢查在人情況中佐劑組成物及成熟持續時間對於活化抗原特異性反應的效應，將人PBMC藉由SQZ裝載疾病相關抗原、經不同佐劑成熟不同培育時間，且測量刺激抗原特異性應答細胞的能力並在不同的佐劑間比較。
方法
將來自HLA-A02+供體之人PBMC(10M個細胞/mL)藉由SQZ(60 psi；3.5 μm縊縮)在50 μM的pp65 SLP (PPWQAGILARNLVPMVATV
QGQNLKYQEFFWDAND (SEQ ID NO：51))存在下裝載。接著將PBMC經CpG 2006 (1 μM)、R837(1 μg/mL；咪喹莫特)或R848(1 μg/mL；雷西喹莫特)成熟3或24h，隨後與pp65特異性CD8+應答細胞以2：1刺激細胞：應答細胞之比例在IL-2 (10 U/mL)存在下共培養，並與未處理對照或與最小表位(PP - 0.1 μM - NLVPMVATV (SEQ ID NO：55))隔夜培育之2：1刺激細胞：應答細胞比較。在24h後，收集各條件的上清液，並藉由IFN-γ ELISA評估IFN-γ生產的量。
結果
如圖17所示，藉由SQZ在有及無佐劑下裝載pp65 SLP之人PBMC的功能反應之間無顯著差異，雖然經R848處理3或24h之組確實提供最高的整體反應。這些資料顯示使用佐劑在SQZ後成熟PBMC可增強抗原特異性反應，但並未發現此效應在測試的所有佐劑及時間點導致反應的顯著增加。
實例18
為了定量SQZ前或SQZ後成熟對於抗原特異性反應的影響，將鼠脾細胞裝載模型抗原、經CpG成熟且注射至受者小鼠一次(初免)或二次(初免-追加)，並藉由流動式細胞測量術測量發炎性細胞介素IFN-γ+ CD8+ T細胞之相對百分比。
方法
在第-1天(成熟→SQZ)或第0天(SQZ→成熟)，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟，且經CpG 1826 (1 μM於R10中)在第-1天成熟4h(成熟→SQZ)，接著藉由SQZ(30、60、90 psi；4 μm縊縮)在第0天裝載Ova蛋白質(400 μg/mL)(SQZ→成熟)，或藉由SQZ在第0天裝載Ova，隨後與CpG 1826培育4h。雌性C57BL/6J受者小鼠(5隻/組)在第0天經眼後注射100 μL之脾細胞(1×106
個細胞/小鼠)。在第7天，收集脾臟、用SIINFEKL (SEQ ID NO：54) (1 µg/mL)再刺激且藉由細胞內細胞介素染色(ICS)判定IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比。
結果
如圖18所示，雖然增加用於裝載Ova至脾細胞中之壓力導致IFN-γ+ CD8+ T細胞百分比之顯著增加(P＜0.05)，但經成熟接著SQZ裝載或經SQZ裝載接著成熟的脾細胞之間並無顯著變化。這些資料顯示裝載/成熟脾細胞的順序對於誘發活體內抗原特異性反應之能力無顯著差異。
實例19
為了判定用抗原裝載脾細胞與基於鉑之化學療法的組合共治療動物是否有優點，在活體內治療性模型中測量抗原相關腫瘤細胞的腫瘤生長抑制，其中比較多個脾細胞+/-化學療法治療方案，並將各組小鼠的生存對時間作圖。
方法
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠；10隻小鼠/組)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部。在第5及7天，小鼠根據組別注射媒劑或順鉑(5 mg/kg)。在第9天，一些動物亦接受脾細胞的初免，該脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟且經由SQZ(60 psi；4 μm縊縮)裝載預先複合的20 µM E7 SLP
(GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO：25)) + 20 µM小鼠血清白蛋白(MSA)並與CpG 1826(1 μM於R10中)培育約16h。在第27及29天，根據組別概述給予未治療小鼠或僅第9天經脾細胞治療小鼠1至2劑順鉑。各組TC1荷瘤小鼠的生存在120天內評估及作圖。
結果
如圖19所示，比較未治療、經E7裝載脾細胞單獨治療、經1至2劑順鉑單獨治療或經各種組合治療之小鼠之間的腫瘤生長如公式((長度×寬度2)/2)所測量)且作出Kaplan-Meier生存曲線圖。包括脾細胞之四個治療組展現不僅大幅優於未治療動物之生存優點，但亦大幅優於該些單獨接受順鉑者，其中中位數生存時間超過50天(且在脾細胞+順鉑治療之情況下，120天後仍未達到中位數生存時間)。特別值得注意的是，經脾細胞單獨治療之小鼠相較於未治療及單獨順鉑組具有約40天的生存優點，但脾細胞+順鉑組相較於單獨脾細胞組具有甚至更大幅的生存優點。這些資料顯示藉由SQZ裝載之脾細胞可在HPV相關癌症治療性模型中誘導生存優點，且增加順鉑化學療法進一步加強脾細胞疫苗之生存優點。
實例20
為了判定不同SQZ參數對於在臨床規模上使用之個別細胞子集的投遞及影響，使人PBMC在不同溫度及壓力下進行細胞擠壓並藉由流動式細胞測量術評估存活性及投遞螢光化合物至不同的免疫細胞族群。
方法
在室溫下及在冰上將人PBMC藉由SQZ(50至70 psi；4.5 μm寬度)裝載3 kDa螢光標示右旋糖苷(100 μg/mL)。接著藉由流動式細胞測量術分析經裝載之PBMC的存活性及投遞。
結果
如圖20A及B所示，在臨床規模上使用SQZ裝載人PBMC仍允許成功投遞至多80%的細胞(在冰上之單核球，圖20A)，在冰上經SQZ處理之細胞在所有細胞子集中導致較高百分比(30至50%增加)的投遞細胞。較高壓力(70 psi)相對於50 psi提供最高百分比的投遞細胞，但在所有測試中主體PBMC族群的存活性超過88%。綜上所述，這些資料顯示SQZ可用於投遞至混合族群中之多個細胞類型，且在稍微較高壓力下在冰上SQZ導致最佳整體投遞。
實例21
為了判定成熟+/-共注射佐劑對於抗原裝載脾細胞在治療場域中導致腫瘤生長抑制之能力的影響，脾細胞係經佐劑成熟、與佐劑共注射或經佐劑成熟且與佐劑共注射並在HPV E7表現性TC1腫瘤模型中測試，且作出腫瘤面積及生存對時間之圖。
方法
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部。在第10天(初免)，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合以更佳地模擬人PBMC，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。將脾細胞經由SQZ(60 psi；4 μm縊縮，室溫)裝載預先複合的20 µM E7 SLP
(GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO：25)) + 20 µM小鼠血清白蛋白(MSA)並與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時。雌性C57BL/6J受者小鼠(10隻/組)在第10天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)、脾細胞(1M個細胞/小鼠)或脾細胞+ CpG(1 μg/小鼠)。從腫瘤植入後1週開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較32天。
結果
比較來自未治療組(無脾細胞)與經佐劑單獨(CpG)、脾細胞或脾細胞+共注射佐劑治療組之小鼠之間的腫瘤生長(如公式((長度×寬度2
)/2)所測量)。如圖21A及B所示，雖然未治療動物與該些經CpG單獨治療者的腫瘤生長之間並無可觀察到的差異(中位數生存分別為28及32天)，未成熟之裝載E7之脾細胞的腫瘤生長速率有稍微抑制。然而，接受成熟、裝載脾細胞+/-共注射CpG之組導致腫瘤消退，其中在研究的時間內腫瘤未達到其初始最大值。此外，到第32天脾細胞治療組無一達到中位數生存點。這些資料顯示藉由SQZ裝載且經佐劑成熟之脾細胞(在有或無佐劑共注射下)可在HPV相關癌症治療性模型中誘導腫瘤消退。
實例22
為了判定與不同佐劑共注射之抗原裝載脾細胞是否可誘發抗原特異性反應，將脾細胞裝載模型抗原且經CpG成熟、與CpG共注射或經CpG成熟且與CpG或IFN-α共注射，且小鼠接受初免及追加，並藉由流動式細胞測量術測量發炎性細胞介素IFN-γ+ CD8+ T細胞之相對百分比。
方法
在第0天，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物。接著將這些混合的脾細胞藉由SQZ(60 psi；4 μm縊縮)裝載Ova蛋白質(400 μg/mL)且在單獨培養基(R10)或含有CpG 1826 (1 μM)之培養基中培育4h。雌性C57BL/6J受者小鼠(5隻/組)在第1天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)、經CpG成熟之脾細胞(1×106
個細胞/小鼠)、與1 μg CpG1826共注射之脾細胞或經CpG成熟且與CpG或10000 U IFN-α共注射之脾細胞。在第7天，受者小鼠以和第0天初免相同的方式追加。在第14天，收集脾臟、用SIINFEKL (SEQ ID NO：54) (1 µg/mL)再刺激且藉由細胞內細胞介素染色(ICS)判定IFN-γ+ CD8+ T細胞之百分比。
結果
如圖22所示，在有或無共注射CpG下，經Ova裝載脾細胞處理之小鼠的IFN-γ+ CD8+ T細胞百分比在脾細胞經CpG成熟4h時最高，相較於未處理(P＜0.0001)、未成熟脾細胞(P＜0.005)以及未成熟脾細胞+共注射CpG (P＜0.05)顯著增加。雖然IFN-γ+ CD8+ T細胞百分比有稍微增加，但與CpG共注射之未成熟脾細胞或與IFN-α共注射之成熟脾細胞相對於未治療並無顯著優點。這些資料顯示需要CpG成熟才能讓抗原特異性CD8+ T細胞之發炎性細胞介素的產生有顯著增加，且共注射CpG稍微優於共注射IFN‑α。
實例23
為了評估在SQZ處理後的CpG 1826成熟之後PBMC中B細胞成熟標誌的上調，在經SQZ處理之鼠脾細胞與CpG1826培育之後藉由流動式細胞測量術測量B細胞成熟標誌的上調。
方法
脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。接著將精製鼠脾細胞在無載荷物下經SQZ處理並藉由流動式細胞測量術測量CD86及H-2Kb
的量。
結果
如圖23A至G之平均螢光強度(MFI)所示，四個獨立實驗顯示在CpG 1826成熟之後精製鼠脾細胞內的B220+細胞(B細胞)上CD86及鼠MHC-I (H-2Kb)表現增加。B220+細胞子集(B細胞)在經CpG1826成熟之後的CD86及H-2Kb表現增加在經SQZ處理之精製鼠脾細胞(灰色長條)及未經處理之精製鼠脾細胞(黑色長條)兩者中皆類似。這些資料指示SQZ處理不改變CpG對於精製鼠脾細胞內之B220+細胞(B細胞)成熟的效應。
實例24
為了判定與佐劑共注射之抗原裝載PBMC是否會對於血清細胞介素的量誘發全身性效應，將鼠脾細胞裝載HPV抗原且經CpG成熟且在有或無CpG共注射下導入小鼠中，並藉由多工細胞介素測定測量小鼠的循環細胞介素。
方法
脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。精製鼠脾細胞係經SQZ裝載20 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO：25))，隨後在37℃下與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時。雌性C57BL/6J受者小鼠經注射經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞(M-SQZ-Spleno-HPV)或注射1 μg之CpG 1826 IV(無細胞)或兩者之組合(M-SQZ-Spleno-HPV + 1 μg共注射CpG)，且經由鼠多工(25工)細胞介素/趨化激素測定測量血液中循環細胞介素的量。
結果
如圖24A至24D所示，在所有時間點，經SQZ裝載之精製鼠脾細胞免疫之小鼠的血清細胞介素濃度範圍(圖24C、24D)與在無治療對照小鼠(圖24A)及注射1 μg CpG 1826 IV之小鼠(無細胞)(圖24B)中測量之血清細胞介素濃度範圍係可相比的。這些結果指示在有或無CpG 1826共注射下免疫接種M-SQZ-Spleno-HPV不導致促發炎細胞介素的產生或血清濃度相對於無治療或CpG(無細胞)對照的變化。血清細胞介素存在於所有條件下進一步顯示免疫接種M-SQZ-Spleno-HPV對於血清細胞介素產生或分泌不具有全身性效應。
實例25
為了探討SQZ媒介處理PBMC對於過繼性轉移時之循環動力學的影響，將經SQZ裝載E7 SLP之鼠脾細胞(M-SQZ-Spleno-HPV)及未經處理之鼠脾細胞分別經由靜脈注射投予至小鼠並藉由流動式細胞測量術隨時間判定血液中循環供體鼠脾細胞之數量。
方法
脾細胞係獲自雌性C57BL/6J (CD45.1)供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。精製鼠脾細胞接著係經SQZ裝載20 µM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR (SEQ ID NO：25))，隨後在37℃下與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時，並將經裝載之精製鼠脾細胞眼後注射至雌性CD45.2 B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ受者小鼠(5至7隻小鼠/組)，在投予後二週的期間內在下列時間點自受者小鼠收集血液(100 uL)：投予後30分鐘、第1天、第3天、第7天及第15天。隨時間之循環精製鼠脾細胞係藉由流動式細胞測量術評估。
結果
如圖25所示，在過繼性轉移後，M-SQZ-Spleno-HPV及未經處理之精製鼠脾細胞在免疫接種後二週的期間內展現類似在在宿主血液中的持續性(自4個獨立實驗展示的累積資料)。藉由單因子ANOVA及Tukey事後檢定，二組之間在任何時間點皆無統計差異。這些研究顯示M-SQZ-Spleno-HPV之循環動力學與未經處理之精製鼠脾細胞並無統計上的差異。
實例26
本研究的目的在於定量經M-SQZ-Spleno-HPV免疫接種後12天TC-1腫瘤之腫瘤微環境中相較於對照細胞的E7特異性CD8+ T細胞，且將E7特異性CD8+ T細胞與腫瘤生長模型中的腫瘤廓清相關。
方法
在第0天，將TC-1細胞(50k/小鼠於100 μL之PBS中)皮下注射至雌性C57BL/6J小鼠的右後脇部(7隻/組)。在第16天，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。精製鼠脾細胞係經SQZ裝載20 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO：25))，在37℃下與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時且將經裝載之精製鼠脾細胞眼後注射至荷瘤小鼠中。在第28天(免疫接種後12天)，切除腫瘤且自腫瘤產製單一細胞懸浮液。藉由流動式細胞測量術評估單一細胞懸浮液中的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
結果
如圖26A所見，在免疫接種後12天(即腫瘤植入後第28天)，經M-SQZ-Spleno-HPV免疫之小鼠相較於對照小鼠(無治療)之腫瘤中的CD8+ T細胞百分比具有44.7倍增加。在經M-SQZ-Spleno-HPV治療之動物中，這些CD8+ T細胞大部分對於E7抗原具有特異性，如藉由四聚體染色所判定(87.2 ± 6.0%的CD8α+族群)(圖26B)。亦定量腫瘤中E7四聚體染色陽性之細胞百分比(圖26C)。此顯示經M-SQZ-Spleno-HPV免疫接種相較於無治療組顯著增加免疫接種後12天存在於腫瘤微環境中之E7特異性CD8+ T細胞(增加765倍)。如圖26D及26E所示，當標準化至腫瘤質量時，亦觀察到此E7特異性CD8+ T細胞的增加。這些資料顯示在TC-1小鼠腫瘤模型中經M-SQZ-Spleno-HPV免疫接種導致E7特異性CD8+ T細胞浸潤腫瘤的顯著增加。E7特異性CD8+ T細胞的增加(圖26A至E)加上腫瘤體積降低(圖26F)支援M-SQZ-Spleno-HPV藉由擴增E7特異性效應物CD8+ T細胞而減少腫瘤負荷。
實例27
為了顯示經模型抗原(Ova)處理之鼠脾細胞是否經由直接呈現SIINFEKL (SEQ ID NO：54)(卵白蛋白之CD8限制表位)刺激OT-I CD8+ T細胞活體內增生，使用MHC-I -/-小鼠作為受者以解耦受者小鼠中之抗原交遞至專業APC，以允許檢查經OVA進行SQZ處理之鼠脾細胞的直接呈現。
方法
在第0天，OT-I T細胞係藉由免疫磁性分離自雌性OT-I小鼠的脾細胞單離。將經單離之OT-I T細胞用CFSE染色，然後注射至雌性受者小鼠(WT或MHC-I -/-)眼後(2.5*106
個細胞/小鼠)。接著，脾細胞係獲自雌性CD45.1 C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。精製鼠脾細胞係經SQZ裝載Ova (400 µg/mL)，在37℃下與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時且將經裝載之精製鼠脾細胞眼後注射至受者小鼠(5*106
個細胞/小鼠)。在第3天，切除受者小鼠之淋巴結及脾臟並使用流動式細胞測量術及CFSE染色評估增生。
結果
如圖27A至D所示，接受經SQZ裝載卵白蛋白之精製鼠脾細胞的C57BL/6J (WT)及MHC-I-/-小鼠兩者皆展現強健的OT-I CD8+ T細胞增生，脾臟及淋巴結兩者中之增生指數範圍為4至6。接受與卵白蛋白培育之精製鼠脾細胞的WT及MHC-I-/-小鼠(培育對照，無SQZ處理)具有極小至無的OT-I CD8+ T細胞增生，顯示SQZ過程係導入抗原至精製鼠脾細胞中以直接呈現給活體內CD8+ T細胞所必要。僅接受OT-I T細胞之小鼠(未刺激之過繼性轉移OT-I CD8+ T細胞之對照)不誘導CD8+ T細胞之增生。這些結果顯示MHC-I呈現侷限於經卵白蛋白處理之轉移精製鼠脾細胞，排除抗原交遞至受者抗原呈現細胞(APC)在後續CD8+ T細胞反應中扮演角色的可能性。OT-I CD8+ T細胞在MHC-I-/-受者中增生顯示經SQZ處理之精製鼠脾細胞直接呈現抗原。
實例28
本研究檢查精製鼠脾細胞內之四種細胞類型(B細胞、T細胞、NK細胞及單核球)的抗原呈現能力，其係藉由評估共培養後抗原特異性T細胞的活化來檢查。
方法
在第0天，脾細胞係獲自雌性CD45.1 C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。接著精製鼠脾細胞在有或無Ova (400 µg/mL)下經SQZ處理，並在37℃下與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時。在4小時後，使經SQZ裝載之精製鼠脾細胞的等分試樣(5*106
個細胞/小鼠)進行各種免疫磁性分離以獲得經純化的單核球、B細胞、T細胞及NK細胞子集。接著，OT-I T細胞係藉由免疫磁性分離自雌性OT-I小鼠的脾細胞單離。將OT-I(1*105
個細胞/孔)與精製鼠脾細胞或分別與個別細胞子集(在有或無OVA下經SQZ處理)共培養並在37℃下培育24h。以陽性對照(肽添加)而言，將SIINFEKL (SEQ ID NO：54)肽(OVA257-264
- 1 μg/mL)添加至含有OT-I及未經處理之精製鼠脾細胞之懸浮液中且保持在整個共培養持續時間。接著藉由流動式細胞測量術評估T細胞活化標誌CD69。
結果
細胞表面CD69表現係用來作為OT-I CD8+ T細胞活化的讀數，因為此標誌的表面表現在T細胞受體被MHC-I所呈現之肽抗原佔據(engagement)之後增加。如圖28A至28E所示，精製鼠脾細胞內的所有四種主要細胞類型(B細胞、T細胞、NK細胞及單核球)能夠直接呈現抗原給OT-I CD8+ T細胞。這些資料指示這些細胞類型之各者可作用為抗原呈現細胞。經Ova進行SQZ處理且經CpG 1826成熟之所有細胞類型呈現抗原給OT-I CD8+ T細胞且誘導OT-I T細胞活化的量與陽性對照(肽添加)係可相比的。
實例29
本研究判定經螢光標示之HPV E6或E7 SLP或其組合是否可經由SQZ處理投遞到細胞內及任何經投遞之SLP是否位於人PBMC之胞質液中。
方法
來自3名不同HLA-A*02+供體之人PBMC係在冰上經SQZ裝載50 µM經FAM標示之E6、E7或E6+E7之組合並將細胞使用經AF647接合之抗CD45抗體(漿膜標誌)染料及Hoechst 33342染料(核染色)共染色。經僅RPMI SQZ處理之人PBMC作為陰性對照組。肽的定位係藉由共焦成像判定。具體而言，在掃描轉盤共焦顯微鏡上觀測任何FAM-E6及/或FAM-E7 SLP的定位。在細胞上執行Z堆疊分析以判定FAM-E6及/或FAM-E7 SLP之精確定位。在來自各樣本之Z堆疊中間的共焦切片上執行線掃描軌跡(即該切片之影像描繪細胞的中間)且分析這些切片以證實在SQZ處理之後的任何SLP細胞內投遞。以線掃描軌跡而言，選擇具有清楚FAM信號之細胞進行分析，其中線掃描的軌跡通過細胞中心(白色圓圈)，沿著展示在螢光影像上的白色線條(圖29A至29F，上圖)。
結果
在SQZ處理之後，在檢查的光學切片內觀察到FAM螢光信號被漿膜圍繞(圖29B、29D、29F，上方三圖)，然而陰性對照未偵測到FAM信號(圖29A、29C、29E，上方三圖)。大部分SQZ裝載細胞在廣視野影像中展示不同強度之可見的細胞內SLP；然而，較暗信號可能因為顯微鏡的動態範圍而難以觀測。線掃描軌跡顯示當與僅顯示漿膜信號之陰性對照之軌跡比較時(圖29A、29C、29E，下圖)，大部分FAM螢光信號在漿膜信號的界限內偵測到(圖29B、29D、29F，下圖)，表示FAM-E6及FAM-E7 SLP在SQZ處理之後位於細胞內。這表示SQZ過程將各別SLP裝載至胞質液中，雖然偵測到一些信號與核共定位(未圖示)。重要的是，FAM分子一般係在蛋白酶體處理SLP以呈現在MHC-I上之期間自免疫原性表位切割。因此，在活系統中，來自經FAM標示之SLP的FAM信號將在SLP經處理且呈現在MHC-I上時與SLP脫離。然而，在這些實驗中人PBMC係經固定，接著在SQZ處理後立即染色以最小化對經FAM標示之SLP的這類處理。此共焦成像研究證實經螢光標示之E6及E7 SLP(FAM-E6及FAM-E7)藉由SQZ過程細胞內投遞至人PBMC中。
實例30
為了判定裝載至鼠B細胞中之疾病相關抗原是否可導致抗原特異性T細胞增生，將gp100藉由SQZ處理裝載至B細胞，且藉由流動式細胞測量術分析gp100特異性T細胞(pmel CD8+
T細胞)的增生。
方法
鼠B細胞係未經處理(NC)、在室溫下與gp100合成長肽(SLP)培育(培育對照)、在gp100 SLP存在下經SQZ處理(擠壓)或在37℃下用短肽脈衝1h (PP)。將B細胞(5×106
個細胞/小鼠)與3 µg LPS共注射以免疫接種亦接受2.5×106
個經CFSE標示之pmel CD8+
T細胞之小鼠。為了測量增生，在免疫接種後3天評估pmel CD8+
T細胞中的CFSE稀釋(每組n=5隻小鼠)。
結果
藉由SQZ處理裝載gp100之鼠B細胞導致gp100特異性T細胞增生的顯著增加，如CFSE稀釋增加(圖30左圖)及增生指數之後續定量(圖30右圖)所示。經SQZ裝載之B細胞相對於未處理對照、肽脈衝對照或胞飲作用對照具有近乎5倍的增生增加(圖30右圖)。這些資料顯示SQZ裝載抗原至B細胞中比起用SLP或最小表位培育B細胞導致顯著更有效地刺激抗原特異性T細胞增生。
實例31
為了判定經合成長肽(SLP) SQZ裝載之脾細胞是否可初免保護性免疫反應，使精製脾細胞在E7合成長肽(E7 SLP)存在下經SQZ處理且後續在植入HPV16 E6/E7表現性腫瘤細胞系TC-1之前14天及7天投予至小鼠。
方法
脾細胞係獲自雌性CD45.1 C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。接著使精製脾細胞在含有HPV16 E7之CD8表位的SLP存在下經SQZ處理。使用經SQZ裝載E7 SLP之精製脾細胞將小鼠在第-14天初免及在第-7天追加。在第0天，小鼠的右脇部經皮下植入HPV16 E6/E7陽性TC-1腫瘤細胞系。比較來自未治療組(研究世代I及研究世代II)與經HPV E7裝載之精製脾細胞治療組之小鼠之間的腫瘤生長(如公式((長度×寬度2)/2)所測量)。所有經免疫之小鼠維持無腫瘤60天且後續使用TC-1腫瘤細胞皮下植入左脇部再挑戰，並與左脇部植入腫瘤細胞之未治療動物的不同研究世代比較。
結果
如圖31所示，所有經SQZ裝載之精製脾細胞治療之小鼠(15/15)受保護而免於原發性腫瘤挑戰，然而未治療動物不變地發展腫瘤。在再挑戰時，11/15隻經SQZ裝載之精製脾細胞治療之小鼠受完全保護而免於腫瘤生長，此與形成保護性免疫記憶是一致的。
實例32
為了檢查使用不同劑量之經E7 SLP裝載之精製脾細胞追加之效應，使用E7合成長肽擠壓。小鼠係經投予所示劑量之經SQZ裝載E7 SLP之經擠壓之脾細胞，作為在植入後第10天僅初免之免疫接種或在第10、17及24天投予作為初免/追加/追加方案。
方法
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部。在第10天(初免)，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合以更佳地模擬人PBMC，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。將精製脾細胞經由SQZ(60 psi；4 μm縊縮，室溫)裝載預先複合的20 µM E7 SLP
(GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO：25)) + 20 µM小鼠血清白蛋白(MSA)並與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時。雌性C57BL/6J受者小鼠(10隻/組)在第10天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)、脾細胞(1M個細胞/小鼠)或脾細胞(1M個細胞/小鼠)+ CpG(1 μg/小鼠)。
為了檢查追加免疫接種之效應，經治療性免疫之小鼠研究世代在第17及24天接受額外劑量的經SQZ裝載之脾細胞(初免/追加/追加)。比較未治療小鼠與所示治療組之間的腫瘤生長(如公式((長度×寬度2)/2)所測量)直到第50天。
結果
如圖32所示，在第10天投予單次劑量之0.1×106
個經SQZ裝載之脾細胞具有中度初免性免疫反應療效；然而，使用0.1×106
個細胞之額外劑量追加顯著增強治療療效。另一方面，1.0×106
個細胞之劑量作為單一初免性劑量初免或以初免及追加方案投予時延遲腫瘤生長。
實例33
為了判定成熟+/-共注射佐劑對於抗原裝載脾細胞在治療場域中導致腫瘤生長抑制之能力的影響，脾細胞係經佐劑成熟、與佐劑共注射或經佐劑成熟且與佐劑共注射並在HPV E7表現性TC1腫瘤模型中測試，且作出腫瘤面積及生存對時間之圖。
方法
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部。在第10天(初免)，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合以更佳地模擬人PBMC，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。將精製脾細胞經由SQZ(60 psi；4 μm縊縮，室溫)裝載預先複合的20 µM E7 SLP
(GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO：25)) + 20 µM小鼠血清白蛋白(MSA)並與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時。雌性C57BL/6J受者小鼠(10隻/組)在第10天經眼後注射100 μL之媒劑(PBS)、脾細胞(1M個細胞/小鼠)或脾細胞+ CpG(1 μg/小鼠)。從腫瘤植入後1週開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較60天。
結果
比較來自未治療組(無脾細胞)與經佐劑單獨(CpG)、脾細胞或脾細胞+共注射佐劑治療組之小鼠之間的腫瘤生長(如公式((長度×寬度2
)/2)所測量)。如圖33A及B所示，雖然未治療動物與該些經CpG單獨治療者的腫瘤生長之間並無可觀察到的差異(中位數生存分別為28及32天)，未成熟之裝載E7之脾細胞的腫瘤生長速率有稍微抑制(中位存活期35天)。然而，接受成熟、裝載脾細胞在有或無共注射CpG下之組導致腫瘤消退，其中在研究的時間內腫瘤未達到其初始最大值(中位存活期分別為53及56天)。這些資料顯示藉由SQZ裝載且經佐劑成熟之脾細胞(在有或無佐劑共注射下)可在HPV相關癌症治療性模型中誘導腫瘤消退。
實例34
為了評估經SQZ投遞之抗原藉由小鼠脾細胞內所含有之主要細胞子集的MHC-I呈現，精製鼠脾細胞係經SQZ裝載OVA且後續使用25-D1.16抗體經由流動式細胞測量術分析子集中之呈現。只有當小鼠細胞表面上之H-2Kb (MHC-I)呈現來自卵白蛋白之免疫優勢CD8+
T細胞表位(SIINFEKL (SEQ ID NO：54))時，25-D1.16抗體才與其特異性結合。
方法
脾細胞係獲自雌性CD45.1 C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。精製脾細胞接著在無貨物下經SQZ處理(僅SQZ)或在卵白蛋白存在下經SQZ處理(SQZ + OVA)。在所示時間點，細胞係經包括25-D1.16抗體之抗體組染色以評估各所示細胞類型(T細胞、B細胞、NK細胞及單核球)之H-2Kb上的SIINFEKL (SEQ ID NO：54)呈現並藉由流動式細胞測量術分析。
結果
如圖34所示，以在OVA存在下經SQZ處理之細胞而言，單核球、T細胞、B細胞及NK細胞的抗原呈現在2及4小時時間點係可偵測的。此由來自25‑D1.16抗體染色之信號相對於未經OVA進行SQZ處理之細胞(僅SQZ)增加而明顯可見。在SQZ處理2及4小時後，可偵測到T細胞、B細胞及NK細胞的螢光強度增加≥ 40%。以單核球而言，在SQZ處理2及4小時後螢光強度增加≥ 10%。
實例35
為了顯示經腫瘤抗原(HPV16 E7)處理之鼠脾細胞是否刺激E7特異性T細胞增生，使用經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞免疫小鼠，且在抗原再刺激後之內源性T細胞反應係藉由細胞內細胞介素染色測量。
方法
脾細胞係獲自雌性CD45.1 C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。精製鼠脾細胞係經SQZ裝載E7 SLP (20 µM)，在37℃下與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時且將經裝載之精製鼠脾細胞以每隻小鼠1百萬、0.25百萬或0.1百萬個細胞眼後注射至C57BL/6J受者小鼠。對照小鼠係未經治療。在免疫接種7天後，收集受者小鼠的脾臟並使用E7最小表位離體再刺激。執行細胞內細胞介素染色以判定因應E7辨識而產生干擾素-γ之內源性CD8 T細胞的百分比。
結果
如圖35所示，接受1百萬個經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞之小鼠的脾臟中展現強健E7特異性CD8+ T細胞增生，如當受者小鼠脾臟受到E7最小表位離體刺激時顯著誘導IFN-γ分泌所示。接受0.25百萬個經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞之小鼠的脾臟中亦展現E7特異性CD8+ T細胞增生，如當受者小鼠脾臟受到E7最小表位離體刺激時可觀察的誘導IFN-γ所示。相對地，未治療動物不展現任何可觀察的E7特異性CD8+ T細胞增生，如當脾臟受到E7最小表位離體刺激時缺乏IFN-γ分泌所示。
實例36
本研究的目的在於定量經M-SQZ-Spleno-HPV或經肽疫苗(E7 SLP + CpG)免疫接種後12天TC-1腫瘤之腫瘤微環境中相較於對照細胞的E7特異性CD8+ T細胞，且將E7特異性CD8+ T細胞與腫瘤生長模型中的腫瘤廓清相關。
方法
在第0天，將TC-1細胞(50k/小鼠於100 μL之PBS中)皮下注射至雌性C57BL/6J小鼠的右後脇部(7隻/組)。在第16天，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。精製鼠脾細胞係經SQZ裝載20 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO：25))，在37℃下與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時且將經裝載之精製鼠脾細胞IV注射(眼後)至荷瘤小鼠中。以接受肽疫苗之小鼠而言，在第16天將150 μg之E7 SLP及50 μg之CpG皮下注射(每小鼠)至受者小鼠。對照小鼠係未經治療。
在第28天(免疫接種後12天)，切除腫瘤且自腫瘤產製單一細胞懸浮液。藉由流動式細胞測量術評估單一細胞懸浮液中的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
結果
如圖36A所見，在免疫接種後12天(即腫瘤植入後第28天)，經M-SQZ-Spleno-HPV免疫之小鼠相較於接受肽疫苗之小鼠或對照小鼠在腫瘤微環境內的活細胞之間CD45+白血球顯著增加。在腫瘤中的這些白血球中，經M-SQZ-Spleno-HPV免疫之小鼠相較於對照小鼠(＜5%)及接受肽疫苗之小鼠(＜20%)具有顯著較高百分比之CD8+ T細胞(＞30%)(圖36B)。另外，在經M-SQZ-Spleno-HPV治療之動物中，這些CD8+ T細胞大部分(＞80%)(相較於對照小鼠(＜5%)及接受肽疫苗之小鼠(＜40%))對於E7抗原具有特異性(圖36C)。如圖36D所見，投予M-SQZ-Spleno-HPV導致始於免疫接種後4天的腫瘤體積消退，相較之下，未治療小鼠或經肽疫苗治療之小鼠的腫瘤生長未受到抑制。綜上所述，這些資料顯示在TC-1小鼠腫瘤模型中經M-SQZ-Spleno-HPV免疫接種導致E7特異性CD8+ T細胞浸潤腫瘤的顯著增加。E7特異性CD8+ T細胞的增加(圖36A至C)加上腫瘤體積降低(圖36D)支援M-SQZ-Spleno-HPV藉由擴增E7特異性效應物CD8+ T細胞而減少腫瘤負荷。
實例37
本研究的目的在於顯示人PBMC之SQZ裝載的規模可擴充性。使人PBMC在右旋糖苷存在下進行製造規模的SQZ處理，並評估載荷物投遞及PBMC存活性。
方法
獲得含有健康HLA-A2+供體之周邊血液的Leukopaks (HEMACARE®)，並將PBMC經由淘析單離。將所得PBMC重懸於120mL RPMI以獲得PBMC懸浮液，濃度為7.20×107
個細胞/mL。接著將RBC懸浮液在螢光右旋糖苷存在下(3 kDa Dextra AF680) (i)培育或(ii)進行SQZ處理(50 psi，4 µm直徑縊縮，2至8℃)。SQZ處理後續藉由將經SQZ處理之細胞放入1000mL之RPMI中淬熄。在培育或SQZ處理之後2小時，經由流動式細胞測量術測量PBMC及其中各種細胞類型(B細胞(CD20+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+))的存活性以及螢光右旋糖苷投遞。
結果
圖37A顯示在此實例中描述之製造場域中經SQZ處理之細胞的數量高於在實驗場域中經SQZ處理之細胞的數量超過3個數量級。如圖37B所示，培育對照與經SQZ處理之PBMC之間的存活性無顯著差異，兩者均顯示超過80%存活性。如圖37C所示，3kDa右旋糖苷係經由SQZ處理投遞至約80%的所有PBMC中，且至少投遞至60%的各種細胞類型中。超過90%的CD14+單核球在SQZ處理後裝載右旋糖苷。相對地，小於10%的與右旋糖苷培育之PBMC顯示任何投遞。綜上所述，結果顯示SQZ媒介投遞可用於製造規模以有效投遞載荷物至PBMC中的所有組分細胞類型，且存活性並無任何顯著喪失。
實例38
為了判定藉由SQZ投遞導入之mRNA是否可在PBMC子集中被轉譯及表現，使人PBMC在編碼CD86或IFNα2之mRNA存在下進行SQZ處理並藉由流動式細胞測量術或細胞內染色評估CD86或IFNα2的蛋白質表現。
方法
人PBMC係未經處理(NC)或在編碼CD86或IFNα2之mRNA (SQZ)或空白載荷物(空白SQZ)存在下進行SQZ處理。在SQZ裝載之後，藉由流動式細胞測量術在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)之組分細胞類型中分析裝載編碼CD86之mRNA之PBMC的CD86表面表現。至於經編碼IFNα2之mRNA進行SQZ處理之PBMC，將經裝載之PBMC與GOLGIPLUG/GOLGISTOP培育4小時以停止分泌，且後續藉由細胞內染色在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)之組分細胞類型中分析IFNα2表現。
結果
如圖38A及38B所示，相較於未處理PBMC或經空白載荷物SQZ處理之對照PBMC，所有PBMC子集族群在投遞各別編碼mRNA之後顯示在至少約40%的各別細胞中表現CD86或IFNα2。CD14+單核球固有地表現CD86。結果指示mRNA可藉由SQZ投遞導入至PBMC中以有效表現經編碼之蛋白質。
實例39
為了判定藉由SQZ投遞導入之候選mRNA在表現的程度及持續時間上的變異，人PBMC係經SQZ裝載編碼CD86或4-1BBL之mRNA，且藉由流動式細胞測量術評估CD86或4-1BBL之對應蛋白質表現。
方法
使人PBMC在編碼CD86或IFNα2之mRNA (SQZ)或空白載荷物(空白SQZ)存在下進行SQZ處理。在SQZ裝載之後，將裝載各別mRNA之PBMC在37℃下培育4小時，且藉由流動式細胞測量術每24小時在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)之組分細胞類型中測量各別經編碼之蛋白質的表現。
結果
圖39A及39B顯示在經SQZ裝載各別mRNA之PBMC內，T細胞子集族群中之CD86及4-1BBL的表現。如圖39A所示，在裝載編碼CD86之mRNA之PBMC內之T細胞子集顯示，CD86+細胞之百分比在SQZ處理後4小時至48小時相較於對照顯著增加，且CD86+細胞之百分比僅在SQZ處理後72小時稍微降低。如圖39B所示，在裝載編碼4-1BBL之mRNA之PBMC內之T細胞子集顯示，4-1BBL+細胞之百分比在SQZ處理後4小時中度增加，且4-1BBL+陽性細胞之百分比僅在培育24小時後可注意地降低。結果指示SQZ投遞不同候選mRNA可導致經編碼之蛋白質不同程度及持續時間的表現。
實例40
為了判定mRNA之轉譯增強修飾是否將影響藉由SQZ投遞導入之候選mRNA的表現，人PBMC係經SQZ裝載未經修飾之編碼eGFP之mRNA或具有5-甲氧基尿苷(metoxyuridine)主鏈(5moU)之編碼GFP之mRNA，且藉由流動式細胞測量術評估對應eGFP表現。
方法
使人PBMC在0至200 µg/mL之未經修飾之編碼eGFP之mRNA或編碼GFP之mRNA及5moU主鏈存在下進行SQZ處理。在SQZ裝載之後，將裝載各別mRNA之PBMC在37℃下培育4小時，且經由流動式細胞測量術在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)之組分細胞類型中藉由平均螢光強度(MFI)測量eGFP的表現。
結果
圖40顯示在經SQZ裝載未經修飾之eGFP mRNA或經5moU修飾之eGFP mRNA之PBMC內T細胞子集族群中之eGFP的表現。如圖40所示，在裝載未經修飾之eGFP mRNA之PBMC內之T細胞子集相較於裝載經5moU修飾之eGFP mRNA者顯示較高之MFI。結果指示5moU RNA修飾不導致藉由SQZ處理投遞之mRNA的轉譯增強。
實例41
為了判定藉由SQZ投遞導入之mRNA所編碼之細胞介素是否可在PBMC子集中轉譯、表現及分泌，人PBMC係經SQZ裝載分別編碼IL-12、IFNα或IL-2之mRNA，且IL-12、IFNα或IL-2之對應分泌係藉由ELISA評估。
方法
人PBMC係未經處理(NC)或在編碼IL-12之mRNA(50 µg/mL IL-12a及50 µg/mL IL-12b mRNA)、編碼IFNα之mRNA (100 µg/mL)或編碼IL-2之mRNA (SQZ) (100 µg/mL)或空白載荷物(空白SQZ)存在下進行SQZ處理。在SQZ裝載後，接著將裝載編碼細胞介素之mRNA的各別PBMC在37℃下培育4小時，且後續藉由ELISA測定上清液以判定各別細胞介素的表現及分泌。
結果
如圖41所示，經SQZ裝載編碼細胞介素之mRNA之PBMC分別展現IL-12、IFNα或IL-2的顯著表現及分泌。結果指示mRNA可藉由SQZ投遞導入至PBMC中以有效表現及分泌經編碼之細胞介素。
實例42
如圖42A所示，除了T細胞受體被抗原呈現細胞佔據之外(信號1)，免疫反應的活化係藉由額外信號諸如共刺激受體活化(信號2)及細胞介素受體結合(信號3)增強。為了判定藉由SQZ投遞導入之mRNA是否可被轉譯及表現成這些增強信號的蛋白質效應物，人PBMC係分別經SQZ裝載編碼CD70或4-1BBL之mRNA(用於信號2)及/或編碼IFNα2或IL-2之mRNA(信號3)。CD70或4-1BBL之對應表現係藉由流動式細胞測量術測量，而IFNα2或IL-2之對應分泌係經由ELISA自培養上清液測量。
方法
人PBMC係未經處理(NC)或在編碼CD70、4-1BBL、IFNα2或IL-2之各別mRNA存在下進行SQZ處理。在經編碼CD70或4-1BBL之mRNA進行SQZ處理之後，將裝載各別mRNA之PBMC在37℃下培育4小時，且藉由流動式細胞測量術每24小時在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)之組分細胞類型中測量各別經編碼之蛋白質CD70或4-1BBL的表現。在SQZ裝載編碼IFNα2或IL-2之mRNA後，接著將裝載各別mRNA之PBMC在37℃下培育4小時，且後續在至多24小時的時間點收集上清液，並藉由ELISA測定以判定各別細胞介素IFNα2或IL-2的表現及分泌。
結果
如圖42B所示，所有經裝載之PBMC子集族群在投遞各別編碼mRNA之後分別展現CD70或4-1BBL的表現，如藉由流動式細胞測量術所測定之平均螢光強度增加所示。CD70或4-1BBL之各別表現維持至少48小時。在PBMC子集之間，單核球展現經SQZ投遞之編碼CD70或4-1BBL之mRNA的較高表現。如圖42C所示，經SQZ裝載編碼細胞介素之mRNA之PBMC分別展現IFNα2或IL-2的顯著表現及分泌，且表現及分泌在SQZ處理後維持至少24小時。結果指示mRNA可藉由SQZ投遞導入至PBMC中以有效表現及分泌在免疫活化中提供增強信號之分子。
實例43
如圖42A所示，除了T細胞受體被抗原呈現細胞佔據之外(信號1)，免疫反應的活化係藉由額外信號諸如共刺激受體活化(信號2)及細胞介素受體結合(信號3)增強。為了判定信號1活化是否將影響藉由SQZ投遞導入之mRNA的轉譯及表現，在有或無刀豆球蛋白A (ConA)(一種抗原非依賴性致裂物質誘導信號1)刺激下，使精製小鼠脾細胞經SQZ裝載候選mRNA(eGFP或CD86)。接著藉由流動式細胞測量術測量對應eGFP及CD86表現。
方法
脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。精製鼠脾細胞係未經刺激(無ConA)或在SQZ處理之前或之後經ConA刺激(SQZ刺激前或SQZ刺激後)。以SQZ媒介投遞而言，使精製鼠脾細胞在編碼eGFP或CD86(100 µg/mL)或空白載荷物(空白SQZ)之各別mRNA存在下進行SQZ處理。在經編碼eGFP或CD86之mRNA進行SQZ處理之後，將裝載各別mRNA之精製鼠脾細胞在37℃下培育4小時，且藉由流動式細胞測量術在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)之組分細胞類型中測量各別經編碼之蛋白質eGFP或CD86的表現。
結果
如圖43A所示，無ConA刺激或在SQZ裝載後經ConA刺激之精製鼠脾細胞顯示中度eGFP轉譯及表現，在流動分析中15.3%至17.0%之T細胞子集為GFP+。在SQZ裝載前使用ConA刺激精製鼠脾細胞大幅增加eGFP轉譯及表現，在流動分析中91.1%之T細胞子集為GFP+。類似地，如圖43B所示，無ConA刺激之精製鼠脾細胞顯示中度CD86轉譯及表現，如T細胞子集族群相較於對照中之CD86 MFI的小幅增加所示，然而在SQZ裝載之前使用ConA刺激精製鼠脾細胞大幅增加CD86轉譯及表現，如T細胞子集族群相較於對照中之CD86 MFI的顯著增加所示。這些結果指示ConA刺激增強藉由SQZ處理投遞之候選mRNA的轉譯。
實例44
如圖42A所示，除了T細胞受體被抗原呈現細胞佔據之外(信號1)，免疫反應的活化係藉由額外信號諸如共刺激受體活化(信號2)及細胞介素受體結合(信號3)增強。為了判定編碼信號2及信號3效應物之mRNA在鼠細胞中之表現效率及動力學，將精製鼠脾細胞經SQZ裝載候選mRNA(用於信號2的CD70、CD80、CD86及OX40L；用於信號3之IL-12、IL-2及IFNα2)。CD70、CD80、CD86或OX40L之對應表現係藉由流動式細胞測量術測量，而IL-12、IL-2及IFNα2之對應分泌係經由ELISA自培養上清液測量。
方法
脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。以SQZ媒介投遞而言，使精製鼠脾細胞在編碼CD70、CD80、CD86或OX40L之各別mRNA或編碼IL-12、IL-2及IFNα2之mRNA(所有皆為100 µg/mL)；或空白載荷物(空白SQZ)存在下進行SQZ處理。在經編碼信號2效應物之mRNA進行SQZ處理之後，將裝載各別mRNA之精製鼠脾細胞在37℃下培育4小時，且藉由流動式細胞測量術在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)之組分細胞類型中測量各別經編碼之蛋白質CD70、CD80、CD86或OX40L的表現達48小時。在經編碼信號2效應物之mRNA進行SQZ處理之後，將裝載各別mRNA之精製鼠脾細胞在37℃下培育4小時，且藉由流動式細胞測量術在B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)之組分細胞類型中測量各別經編碼之蛋白質CD70、CD80、CD86或OX40L的表現達48小時。在經編碼信號3效應物(細胞介素)之mRNA SQZ處理後，接著將裝載各別mRNA之精製鼠脾細胞在37℃下培育4小時，且後續在至多48小時的時間點收集上清液，並測定以判定各別細胞介素IL-12、IL-2及IFNα2的表現及分泌(圖44A)。
結果
如圖44B所示，經SQZ裝載信號2效應物(CD70、CD80、CD86或OX40L)之精製鼠脾細胞顯示各別蛋白質的顯著轉譯及表現，如MFI分別可觀增加所示。在SQZ後至多至少48小時觀察到CD86表現持續存在，CD70表現在SQZ後48小時消退，而CD80及OX40K在SQZ後24小時消退。如圖44C所示，經SQZ裝載信號3效應物(IL-12、IL-2或IFNα2)之精製鼠脾細胞顯示各別細胞介素的顯著表現及分泌，如ELISA測定中所偵測到的信號可觀增加所示。IL-12及IL-2分泌在SQZ後4小時係經顯著誘導、在SQZ後24小時稍微增加且在48小時稍微減少。相對地，IFNα2分泌自SQZ後4小時至SQZ後24小時顯著增加且在SQZ後48小時進一步增加。這些結果指示編碼信號2及信號3效應物之mRNA在SQZ媒介的細胞內投遞之後有效轉譯及表現。然而，這些效應物的表現持續時間及量值隨著效應物分子而異。
實例45
為了判定鼠細胞中編碼信號2及信號3效應物之mRNA是否可增強活體外抗原特異性免疫反應，經ConA活化之精製鼠脾細胞係經SQZ裝載OVA抗原以及候選mRNA(信號2的CD70、CD80、CD86；信號3的IL-2)。後續將經SQZ裝載之精製脾細胞與OVA特異性OT-I CD8+ T細胞共培養，且OT-I T細胞的活化係經由IFN-γ分泌之ELISA測量。
方法
脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)，且後續使用ConA活化。以SQZ媒介投遞而言，使精製鼠脾細胞在(i) OVA (5 µg/mL)以及(ii)編碼CD70、CD80或CD86之各別mRNA，或編碼IL-12之mRNA(所有皆為100 µg/mL)；或無mRNA存在下進行SQZ處理。在經編碼信號2或信號3效應物之mRNA進行SQZ處理之後，將裝載各別mRNA之精製鼠脾細胞在37℃下培育4小時，且與OT-I CD8+ T細胞以1：2或1：4比例共培養24小時。為了測定T細胞活化，自共培養收集上清液並進行IFN-γ ELISA測定(圖45A)。
結果
如圖45B及45C所示，經SQZ裝載OVA與信號2效應物(CD70、CD80或CD86)或信號3效應物(IL-12)之組合的經ConA活化之精製鼠脾細胞顯示OVA特異性OT-I CD8+ T細胞的活化顯著增加。當CD86 mRNA或IL-12 mRNA與OVA共同投遞至精製鼠脾細胞中，OVA特異性T細胞反應的增加特別顯著。這些結果指示除了能夠轉譯及表現之外，編碼信號2及信號3效應物之mRNA可增強鼠脾細胞作用為活化抗原特異性T細胞反應之抗原呈現細胞的能力。
實例46
為了判定人PBMC中編碼抗原之mRNA是否可增強活體外抗原特異性免疫反應，人PBMC係經SQZ裝載多種可用抗原，且後續與各別抗原特異性ASTARTE應答T細胞共培養，其中應答T細胞的活化係經由IFN-γ分泌之ELISA測量。
方法
人PBMC係(i)未經處理(NC)、(ii)用1 µg/mL之各別肽抗原脈衝(PP，陽性對照)或(iii)在編碼各別抗原(E7、HSV GF1、MART-1、pp65或流感M1)之100 µg/mL mRNA存在下進行SQZ處理或(iv)經空白載荷物SQZ處理(空白SQZ)。西方墨點轉漬法係用於分析經裝載之mRNA在SQZ處理後4小時及24小時的轉譯。以測定免疫活化而言，在SQZ裝載後，將裝載各別編碼抗原之mRNA之PBMC在37℃下培育4小時，且與各別抗原特異性ASTARTE應答T細胞共培養24小時。為了測量T細胞活化，自共培養收集上清液並進行IFN-γ ELISA。
結果
如圖46B及46C所示，在SQZ媒介投遞編碼HPV16-E7及流感M1之mRNA之後，各別抗原係經轉譯及表現，如西方墨點轉漬法上之透明條帶所示。以T細胞活化測定而言(圖46A)，經SQZ裝載編碼E7、HSV GD1、MART-1或pp65抗原之mRNA之PBMC相較於進行肽脈衝(PP)之PBMC不誘導可觀察到的應答T細胞活化，如共培養後缺乏IFN-γ分泌所示；但經SQZ裝載編碼流感M1之mRNA之PBMC強烈誘導M1特異性T細胞活化，如共培養後相較於進行肽脈衝(PP)之PBMC顯著誘導IFN-γ分泌所觀察。這些結果指示，可在SQZ媒介投遞使用目前規程採用編碼抗原之mRNA，以促進抗原呈現且刺激針對一些但非所有抗原的抗原特異性T細胞反應。
實例47
為了比較SQZ所投遞之編碼抗原之mRNA及肽抗原於促進鼠免疫細胞以活化活體外抗原特異性反應的療效，全鼠脾細胞係經SQZ裝載OVA蛋白質或編碼OVA之mRNA且後續與OVA特異性OT-I CD8+ T細胞共培養，其中OT-I T細胞的活化係經由CD69表現測量。
方法
脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟，且使用3.5 µm寬度、30 µm高度縊縮，在60 psi下在室溫下、在(i)編碼OVA之mRNA(0至250 nM)或OVA蛋白質(0至1250nM)存在下進行SQZ處理。西方墨點轉漬法係用於分析經裝載之mRNA在SQZ處理後4小時及24小時的轉譯。以測定免疫活化而言，在SQZ裝載後，將裝載各別編碼OVA之mRNA或OVA蛋白質之脾細胞在37℃下培育4小時，且與OT-I CD8+ T細胞共培養24小時。為了測量T細胞活化，經由流動式細胞測量術測量OT-I CD8+ T細胞上的CD69表現(圖47A)。
結果
如圖47B所示，當SQZ在鼠脾細胞中裝載相同的各別莫耳濃度時，編碼OVA之mRNA比起OVA蛋白質遠遠更有效地(約20倍更有效)促進OT-I CD8+ T細胞的活化。在＜ 50nM OVA mRNA存在下經SQZ處理之脾細胞導致顯著百分比的OT-I CD8+ T細胞在共培養後表現CD69。相較之下，在至少1000 nM OVA蛋白質存在下經SQZ處理之脾細胞導致達到類似百分比的共培養後表現CD69之OT-I CD8+ T細胞。這些結果指示至少對於OVA抗原而言，脾細胞裝載編碼抗原之mRNA比起裝載蛋白質更為有效地促進活體外抗原特異性T細胞反應的活化。
實例48
為了判定在治療場域中組合免疫檢查點抑制劑對於抗原裝載脾細胞的腫瘤生長抑制能力的效應，植入HPV E7表現性TC1腫瘤模型之小鼠係經投予抗CTLA4注射、投予經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞(M-SQZ-Spleno-HPV)或投予兩者之組合，且將腫瘤體積及生存對時間作圖。
方法
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部。在第10天(初免)，脾細胞係獲自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟並與已經藉由負向免疫磁性分離除盡B細胞之脾細胞組合以更佳地模擬人PBMC，導致更具人PBMC代表性之脾細胞組成物(即，精製脾細胞)。精製脾細胞係經SQZ裝載20 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF
SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO：25))，在37℃下與CpG 1826(1 μM於R10中)培育4小時且將經裝載之精製鼠脾細胞IV注射(眼後)至荷瘤小鼠中(M-SQZ-PBMC-HPV)(每隻小鼠1×106
個細胞)。接受裝載脾細胞之小鼠及不具有裝載脾細胞之小鼠的研究世代接著在所示時程(時程1：TC-1植入後第11、14、17天；時程2：第17、20、24天；時程3：第24、28、31天)投予抗CTLA4注射。對照小鼠係未經治療。(每組10隻小鼠)(圖48A、48B)。從腫瘤植入後1週開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較60天。
結果
比較對照小鼠(未治療)與經精製E7裝載脾細胞治療組(M-SQZ-PBMC-HPV)、經抗CTLA4治療組(α-CTLA4)及經兩者組合治療之組(M-SQZ-PBMC-HPV + α-CTLA4)之間的腫瘤生長(如公式((長度×寬度2
)/2)所測量)。如圖48C所示，雖然對照小鼠與僅經抗CTLA4治療小鼠(Sch. 1 α-CTLA4；Sch. 2 α-CTLA4；Sch. 3 α-CTLA4)之間的腫瘤生長無可觀察到的差異，但經E7裝載脾細胞初免小鼠(M-SQZ-PBMC-HPV)的腫瘤生長速率有可觀的抑制。可注意的是，E7裝載脾細胞與抗CTLA4投予之組合顯示抑制TC-1腫瘤生長的顯著累加效應(M-SQZ-PBMC-HPV + α-CTLA4)(圖48C)。
未治療小鼠、僅經抗CTLA4治療小鼠(Sch. 1 α-CTLA4；Sch. 2 α-CTLA4；Sch. 3 α-CTLA4)或經E7裝載脾細胞初免小鼠(M-SQZ-PBMC-HPV)所有皆在第40天或更早發展腫瘤(圖48D)。相較之下，接受E7裝載脾細胞與抗CTLA4投予之組合之小鼠(M-SQZ-PBMC-HPV + α-CTLA4)顯示抑制或延遲腫瘤發展，其中在第60天M-SQZ-PBMC-HPV + Sch.1 α-CTLA4、M-SQZ-PBMC-HPV + Sch.2 α-CTLA4及M-SQZ-PBMC-HPV + Sch.3 α-CTLA4分別有2、1及3隻小鼠無腫瘤(圖48E)。
與腫瘤生長抑制結果一致的是，E7裝載脾細胞與抗CTLA4投予之組合亦顯示改善攜帶TC-1小鼠生存的累加效應。未治療小鼠顯示38天之中位數生存，然而僅經抗CTLA4治療小鼠(Sch. 1 α-CTLA4；Sch. 2 α-CTLA4；Sch. 3 α-CTLA4)分別顯示32、33及35.5天之中位數生存。經E7裝載脾細胞初免小鼠(M-SQZ-PBMC-HPV)顯示稍微改善的中位數生存50天。可注意的是，接受E7裝載脾細胞與抗CTLA4投予之組合的小鼠(M-SQZ-PBMC-HPV + α-CTLA4)在TC-1植入之後第60天尚未達到中位數生存(圖48F)。
這些結果指示抗原裝載脾細胞與免疫檢查點抑制劑之治療性組合在抑制腫瘤生長及改善生存上提供累加優點。
序列表
| SEQ ID NO | 序列 | 說明 |
| 1 | TIHDIILECV | HPV16-E6(29-38)，人表位 |
| 2 | EVYDFAFRDL | HPV16-E6(48-57)，鼠表位 |
| 3 | YMLDLQPETT | HPV16-E7(11-20)，人表位 |
| 4 | RAHYNIVTF | HPV16-E7(49-57)，鼠表位 |
| 5 | LPQL S TELQT | HPV16-E6(19-28) N端多肽，人 |
| 6 | QLCTELQT | HPV16-E6(21-28) N端多肽，人 |
| 7 | KQQLLRR | HPV16-E6(41-47) N端多肽，天然鼠 |
| 8 | VYSKQQLLRR | HPV16-E6(38-47) N端多肽，經典鼠 |
| 9 | MHGDTPTLHE | HPV16-E7(1-10) N端 多肽，人 |
| 10 | GQAEPD | HPV16-E7(43-48) N端多肽，鼠 |
| 11 | Y S KQQLLRREVYDFAF | HPV16-E6(39-54) C端多肽，人 |
| 12 | YCKQQLL | HPV16-E6(39-45) C端多肽，人 |
| 13 | CIVYRDGN | HPV16-E6(58-65) C端多肽，天然鼠 |
| 14 | SIVYRDGNPYAVSDK | HPV16-E6(58-72) C端多肽，經典鼠 |
| 15 | DLYCYEQLNDSSEEE | HPV16-E7(21-35) C端多肽，人 |
| 16 | CCKCDSTLRLCVQSTHVDIR | HPV16-E7(58-77 C端多肽，天然鼠 |
| 17 | SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR | HPV16-E7(58-77) C端多肽，經典鼠 |
| 18 | LPQLSTELQTTIHDIILECVYSKQQLLRREVYDFAF | HPV16-E6(19-54) SLP，人 |
| 19 | QLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL | HPV16-E6(21-45) SLP，人 |
| 20 | KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN | HPV16-E6(41-65) SLP，天然鼠 |
| 21 | VYSKQQLLRREVYDFAFRDLSIVYRDGNPYAVSDK | HPV16-E6(38-72) SLP，經典鼠 |
| 22 | MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE | HPV16-E7(1-35) SLP，人 |
| 23 | QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL | HPV16-E7.6 SLP，人 |
| 24 | GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR | HPV16-E7(43-77) SLP，天然鼠 |
| 25 | GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR | HPV16-E7(43-77) SLP，經典鼠 |
| 26 | ggGGTCAACGTTGAgggggg 以大寫字母顯示的鹼基是磷酸二酯，且以小寫顯示的是硫代磷酸酯 | ODN 1585(A型，小鼠特異性) |
| 27 | ggGGGACGA：TCGTCgggggg 以大寫字母顯示的鹼基是磷酸二酯，且以小寫顯示的是硫代磷酸酯 | ODN 2216(A型，人選擇性) |
| 28 | gggGACGAC：GTCGTGgggggg 以大寫字母顯示的鹼基是磷酸二酯，且以小寫顯示的是硫代磷酸酯 | ODN 2336(A型，較佳是人) |
| 29 | tccatgacgttcctgatgct 以大寫字母顯示的鹼基是磷酸二酯，且以小寫顯示的是硫代磷酸酯 | ODN 1668(B型，小鼠特異性) |
| 30 | tccatgacgttcctgacgtt 鹼基是硫代磷酸酯 | ODN 1826(B 型，小鼠特異性 ) |
| 31 | tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 鹼基是硫代磷酸酯 | ODN 2006(B 型，人選擇性 ) |
| 32 | tcg tcg ttg tcg ttt tgt cgt t 鹼基是硫代磷酸酯 | ODN 2007(B型，牛/豬) |
| 33 | tcg acg ttc gtc gtt cgt cgt tc 鹼基是硫代磷酸酯 | ODN BW006(B型，人及小鼠) |
| 34 | tcg cga cgt tcg ccc gac gtt cgg ta 鹼基是硫代磷酸酯 | ODN D-SL01(B型，多物種) |
| 35 | tcgtcgttttcggcgc：gcgccg 鹼基是硫代磷酸酯 | ODN 2395(C型，人/小鼠) |
| 36 | tcgtcgtcgttc：gaacgacgttgat 鹼基是硫代磷酸酯 | ODN M362(C型，人/小鼠) |
| 37 | tcg cga acg ttc gcc gcg ttc gaa cgc gg 鹼基是硫代磷酸酯 | ODN D-SL03(C型，多物種) |
| 38 | MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE | E7 |
| 39 | LYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVT | E7 |
| 40 | GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR | E7 |
| 41 | TLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | E7 |
| 42 | MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHD | E6 |
| 43 | LPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVY | E6 |
| 44 | KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN | E6 |
| 45 | RDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKI | E6 |
| 46 | DKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTL | E6 |
| 47 | HYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIR | E6 |
| 48 | YGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEK | E6 |
| 49 | RCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWT | E6 |
| 50 | DKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL | E6 |
| 51 | PPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDAND | pp65 SLP，人 |
| 52 | PPWQAGILAR | pp65 N端多肽，人 |
| 53 | QGQNLKYQEFFWDAND | pp65 C端多肽，人 |
[圖1A]係複數個PBMC內之代表性細胞示意圖，展示SQZ媒介投遞E6及/或E7 SLP；及後續分別處理及呈現E6及E7表位在MHC-I上。代表性細胞可為PBMC細胞類型中任一者(諸如T細胞、單核球、NK細胞及B細胞)。
[圖1B]係向個體單一療法投予包含HPV抗原之PBMC且共投或不共投CpG佐劑之遞增階段研究世代的代表性示意圖。圓圈的量描繪經修飾之PBMC的相對劑量，箭頭描繪投予，雙股螺旋代表CpG佐劑及「AVB」指示額外疫苗追加。
[圖1C]係向個體組合投予包含HPV抗原之PBMC與阿特珠單抗(atezolizumab)之遞增階段研究世代的代表性示意圖。圓圈的量描繪經修飾之PBMC的相對劑量，箭頭描繪投予及「AVB」指示額外疫苗追加。
[圖2A]顯示在右旋糖苷培育(胞飲作用)及在30、60及90 psi驅動壓力下SQZ媒介投遞右旋糖苷之後脾細胞亞群的存活性。[圖2B]顯示具有藉由胞飲作用投遞或在30、60及90 psi驅動壓力下經SQZ媒介投遞之右旋糖苷之細胞百分比。
[圖3]顯示細胞調理及共投CpG對於經SQZ裝載OVA之B細胞或脾細胞所誘發之抗原特異性免疫反應之效應。
[圖4]顯示脾細胞調理及共投各種濃度CpG對於經SQZ裝載OVA之精製脾細胞所誘發之抗原特異性免疫反應之效應。
[圖5]顯示脾細胞調理及共投CpG或IFNα對於經SQZ裝載OVA之精製脾細胞所誘發之抗原特異性免疫反應之效應。
[圖6]顯示經SQZ裝載OVA且經調理之精製脾細胞當以不同細胞劑量投予且一次投予(初免)或二次投予(初免-追加)時所誘發之抗原特異性免疫反應。
[圖7]顯示(a)經SQZ裝載OVA之經調理之B細胞或(b)經SQZ裝載OVA且經調理之精製脾細胞當以不同劑量投予且一次投予(初免)或二次投予(初免-追加)時所誘發之抗原特異性免疫反應。
[圖8]顯示調理(CpG培育)持續時間(duration)對於經SQZ裝載OVA之成熟脾細胞所誘發之抗原特異性免疫反應之效應。
[圖9]顯示經SQZ裝載E7 HPV抗原之成熟脾細胞於抑制E7表現性TC1腫瘤的劑量依賴性效應。
[圖10A]顯示CpG培育對於人PBMC(上圖)及鼠脾細胞(下圖)內之B細胞亞族群的活化標誌的效應。
[圖10B]顯示當人PBMC或鼠脾細胞與CpG進行培育時細胞介素/趨化激素輪廓的變化。
[圖11]顯示當人PBMC以60 psi驅動壓力及3.5 μm或4 μm縊縮寬度進行SQZ媒介投遞時，細胞組成及MHC-I的量的變化。
[圖12A]顯示在以60 psi驅動壓力及3.5 μm或4 μm縊縮寬度進行SQZ媒介投遞之人PBMC內CD3+
T細胞或CD14+
單核球的存活性及載荷物投遞。
[圖12B]顯示在以60 psi驅動壓力及3.5 μm或4 μm縊縮寬度進行SQZ媒介投遞之人PBMC內CD20+
B細胞或CD56+
NK細胞的存活性及載荷物投遞。
[圖13]顯示顯示PBMC族群子集中之投遞(下圖)與當與經由使用3.5 μm或4 μm縊縮寬度之SQZ媒介過程裝載E7 HPV抗原之成熟人PBMC共培養時E7特異性應答細胞之刺激(上圖)的相關性。
[圖14]顯示E7特異性應答細胞當與成熟、經由SQZ媒介過程裝載E7 HPV抗原之人PBMC共培養時之刺激，該SQZ媒介過程的驅動壓力為45 psi或60psi、縊縮寬度為3.5 μm、4 μm或4.5 μm且該過程在RT下(上圖)或在冰上(下圖)進行。
[圖15]上圖顯示pp65特異性應答細胞當與經SQZ裝載pp65之人PBMC或經SQZ裝載pp65且經佐劑成熟之人PBMC共培養時(在1µM CpG存在或不存在下)之刺激。
[圖15]下圖顯示pp65特異性應答細胞(a)當與經SQZ裝載pp65之人PBMC或經SQZ裝載pp65且經佐劑成熟之人PBMC在1µM CpG存在下共培養時；或(b)當與經SQZ裝載pp65之人T細胞或經SQZ裝載pp65且經佐劑成熟之人T細胞共培養時之刺激。
[圖16]顯示(a)以各種佐劑進行PBMC成熟及(b) SQZ裝載所使用之pp65抗原濃度對於pp65特異性應答細胞刺激之效應(當應答細胞與經SQZ裝載pp65 CMV抗原之成熟人PBMC共培養時)。
[圖17]顯示以不同佐劑CpG、R837及R848及3或24小時之培育時間進行PBMC成熟對於pp65特異性應答細胞當與經SQZ裝載pp65 CMV抗原之成熟人PBMC共培養時刺激之效應。
[圖18]顯示在SQZ媒介裝載之前與之後調理脾細胞對於經調理之經SQZ裝載pp65 CMV抗原之鼠脾細胞所誘發之抗原特異性反應之效應。
[圖19]顯示當攜帶E7表現性腫瘤之小鼠經投予僅裝載pp65脾細胞 (B組)；僅化學療法(順鉑)(C、D、G組)；或裝載pp65脾細胞與化學療法之組合(E、F、H組)時對腫瘤抑制之效應。
[圖20A]顯示在室溫下或在冰上SQZ媒介投遞3kDa右旋糖苷至人PBMC亞群之效率。[圖20B]顯示在50 psi或70 psi驅動壓力下SQZ媒介投遞3kDa右旋糖苷至人PBMC亞群之效率。
[圖21A及B]顯示當攜帶E7表現性腫瘤之小鼠經投予SQZ裝載E7 HPV抗原之精製鼠脾細胞時，脾細胞調理或CpG共投對於腫瘤抑制(圖21A)及生存改善(圖21B)之效應。
[圖22]顯示在有或無共投CpG或IFNα下，脾細胞調理對於經SQZ裝載OVA抗原之精製鼠脾細胞所誘發之抗原特異性反應之效應。
[圖23A至23H]顯示在有或無CpG 1826培育下，脾細胞調理對於B細胞標誌CD86(圖23A至D)及H-2Kb(圖23E至H)在精製鼠脾細胞內之表現之效應，該精製鼠脾細胞係經SQZ處理或未經處理。
[圖24A至24D]顯示未治療小鼠(圖24A)、僅注射1 μg CpG 1826 IV小鼠(圖24B)、經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞免疫之小鼠(圖24C)或共注射經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞且共注射1 μg CpG 1826 IV之小鼠(圖24D)中循環細胞介素的量。
[圖25]顯示經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞(M-SQZ-Spleno-HPV)及未經處理之精製鼠脾細胞之循環動力學。
[圖26A至26E]顯示在經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞或未經處理之精製鼠脾細胞免疫接種後E7特異性T細胞浸潤的量及圖26F顯示腫瘤體積隨時間之變化。腫瘤環境中每活細胞中CD8+ T細胞之百分比及每腫瘤質量中CD8+ T細胞數量分別顯示於圖26A及26D。腫瘤環境中每活細胞中E7特異性T細胞之百分比及每腫瘤質量中E7特異性T細胞數量分別顯示於圖26C及26E。腫瘤環境中每CD8+ T細胞中E7特異性T細胞百分比顯示於圖26B。
[圖27A至27D]顯示OVA特異性T細胞(OT-I CD8+
T細胞)在WT或MHC-I -/-小鼠活體內增生的量，其中小鼠藉由經SQZ裝載OVA之精製鼠脾細胞刺激或經OVA培育之精製鼠脾細胞刺激(培育對照)或無刺激(OT-I對照)。圖27A及27C顯示2個重複實驗中受者淋巴結中各別OT-I增生。圖27B及27D顯示2個重複實驗中受者脾臟中各別OT-I增生。
[圖28A至28E]顯示在與經SQZ裝載OVA之精製鼠脾細胞(圖28A)或與經SQZ裝載OVA之精製鼠脾細胞之所示子集(B細胞、T細胞、單核球、NK細胞子集分別為圖28B、28C、28D、28E)共培養後活化標誌CD69於OT-I CD8+
T細胞之增生及表現。
[圖29A至29F]為於RPMI中經SQZ處理之人PBMC(圖29A、29C、29E)或經SQZ裝載經FAM標示之E6、E7或E6+E7 SLP之人PBMC(分別為圖29B、29D、29F)，其上圖顯示來自各樣本之Z堆疊中間的共焦成像，顯示漿膜之定位(CD45染色，PM，上圖)；經FAM標示之HPV SLP之定位(SLP，自上方的第二圖)；及顯示彼等之相對定位之覆蓋(覆蓋圖，自上方的第三圖)，然而圖29之下圖顯示各別覆蓋圖中顯示之穿過細胞中心沿著白色線條之線軌跡。
[圖30]顯示在共注射未經處理(NC)、與gp100 SLP培育(培育對照)、經SQZ裝載gp100 SLP(擠壓)或用gp100 SLP脈衝(PP)之B細胞後gp100特異性T細胞之增生，如藉由CFSE稀釋(左圖)及後續定量(右圖)所測量。
[圖31]顯示經植入之TC-1腫瘤於未經治療或經SQZ裝載E7 SLP之精製脾細胞預防性投予小鼠中的腫瘤體積變化。未治療研究世代I係於第0天植入TC-1腫瘤。未治療研究世代II係於第60天植入TC-1腫瘤。經SQZ裝載脾細胞治療小鼠於第0天及第60天皆植入TC-1腫瘤。
[圖32]顯示經植入之TC-1腫瘤在經SQZ裝載E7 SLP之精製脾細胞治療性治療之後的腫瘤體積變化。小鼠係經0.1×106
個或1.0×106
個SQZ裝載脾細胞以單次劑量之初免(植入後第10天)或以初免及追加方案(植入後第10天初免、第17及24天追加)投予治療。
[圖33A及B]顯示當攜帶E7表現性腫瘤之小鼠經投予SQZ裝載HPV E7抗原之精製鼠脾細胞時，脾細胞調理或CpG共投對於腫瘤抑制(圖33A)及生存改善(圖33B)之效應。
[圖34]顯示精製脾細胞在無貨物下經SQZ處理(僅SQZ)或在OVA存在下經SQZ處理(SQZ+OVA)後，在T細胞、B細胞、NK細胞及單核球之脾細胞亞群中自OVA處理之表位SIINFEKL (SEQ ID NO：54)的MHC-I呈現程度。
[圖35]顯示脾細胞投予對於SQZ裝載HPV16 E7抗原之精製鼠脾細胞所誘發之抗原特異性反應而言的劑量依賴性療效。
[圖36A至36C]顯示在經SQZ裝載E7 SLP之精製鼠脾細胞或肽疫苗免疫接種後或未經治療之E7特異性T細胞浸潤的量及圖36D顯示腫瘤體積隨時間之變化。腫瘤環境中每活細胞中CD45+白血球之百分比、CD45+細胞中CD8+ T細胞數量及腫瘤環境中每CD8+ T細胞中E7特異性T細胞之百分比分別顯示於圖36A、36B及36C。
[圖37A]顯示在典型研究場域中進行SQZ處理之細胞的數量相對於在製造場域中進行SQZ處理之細胞的數量。[圖37B]顯示在與右旋糖苷培育後或在右旋糖苷存在下經SQZ處理後PBMC的存活性。[圖37C]顯示在經右旋糖苷培育或SQZ處理後PBMC以及B細胞(CD20+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)之組分細胞類型中為右旋糖苷陽性之細胞百分比。
[圖38A]顯示在PBMC未經處理(NC)、經空白載荷物SQZ處理(空白SQZ)或經SQZ裝載編碼CD86之mRNA (SQZ)之後，PBMC亞群B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)內的CD86表現性細胞百分比。[圖38B]顯示在PBMC經空白載荷物SQZ處理(空白SQZ)或經SQZ裝載編碼IFNα2之mRNA (SQZ)之後，PBMC亞群B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)內的IFNα2表現性細胞百分比。
[圖39A]顯示在PBMC經空白載荷物SQZ處理(空白SQZ)或經SQZ裝載編碼CD86之mRNA (SQZ)之後，在72小時內PBMC亞群T細胞(CD3+)內的CD86表現百分比。[圖39B]顯示在PBMC經空白載荷物SQZ處理(空白SQZ)或經SQZ裝載編碼4-1BBL之mRNA (SQZ)之後，在72小時內PBMC亞群T細胞(CD3+)內的4-1BBL表現性細胞百分比。
[圖40]顯示在PBMC經未經修飾之eGFP mRNA或攜帶5-甲氧基尿苷主鏈修飾(5moU)之eGFP mRNA以0 µg/mL至200 µg/mL之mRNA濃度進行SQZ處理後PBMC亞群T細胞(CD3+)內的eGFP表現量。
[圖41]顯示在PBMC未經處理(NC)或經分別編碼IL-12、IFNα或IL-2之mRNA進行SQZ處理後(SQZ)，PBMC的IL-12、IFNα或IL-2細胞介素分泌程度。
[圖42A]顯示增強的抗原呈現細胞在刺激效應物免疫細胞反應上之信號1、2、3的示意圖。[圖42B]顯示PBMC分別經編碼CD70或4-1BBL之mRNA進行SQZ處理後PBMC亞族群B細胞(CD19+)、T細胞(CD3+)、NK細胞(CD56+)及單核球(CD14+)內在48小時內信號2效應物表現的量。[圖42C]顯示PBMC分別經編碼IFNα2或IL-2之mRNA進行SQZ處理後PBMC在24小時內分泌信號3效應物的量。
[圖43A]顯示在未經刺激、在SQZ處理之前經ConA刺激、在SQZ處理之後經conA刺激的PBMC中eGFP轉譯及表現的量，其中PBMC在編碼eGFP之mRNA存在下經SQZ處理。[圖43B]顯示當PBMC在編碼CD86之mRNA存在下經SQZ處理時，在未經刺激或在SQZ處理之前經ConA刺激的PBMC中CD86表現的量。
[圖44A]顯示研究信號2及信號3效應物mRNA在SQZ裝載之後是否在精製小鼠脾細胞中轉譯之實驗示意圖。[圖44B]顯示精製脾細胞在分別編碼CD70、CD80、CD86或OX40L之mRNA存在下經SQZ處理後，CD70、CD80、CD86或OX40L在精製鼠脾細胞中表現的量。[圖44C]顯示精製脾細胞在分別編碼IL-12、IL-2或IFNα2之mRNA存在下經SQZ處理後，精製鼠脾細胞所分泌之IL-12、IL-2或IFNα2的量。
[圖45A]顯示研究SQZ裝載信號2及信號3效應物mRNA於精製鼠脾細胞中是否可促進增強的刺激抗原特異性T細胞反應的能力之實驗示意圖。[圖45B]顯示OVA特異性T細胞在與經SQZ裝載OVA肽及編碼信號2效應物(CD70、CD80或CD86)之mRNA之精製鼠脾細胞共培養後的活化程度。[圖45C]顯示OVA特異性T細胞在與經SQZ裝載OVA肽及編碼信號3效應物IL-2之mRNA之精製鼠脾細胞共培養後的活化程度。
[圖46A]顯示抗原特異性應答T細胞在與經SQZ裝載編碼各別抗原(E7、HSV GD1、MART-1、pp65或流感M1)之mRNA的人PBMC共培養後活化的量。[圖46B及46C]顯示PBMC在分別編碼E7或M1之mRNA存在下經SQZ處理之後PBMC中E7或M1轉譯及表現的量。
[圖47A]顯示比較SQZ裝載抗原之mRNA相較於蛋白質形式在經裝載之鼠脾細胞刺激抗原特異性T細胞反應的效力方面之實驗示意圖。[圖47B]顯示在與經SQZ裝載OVA蛋白質或編碼OVA之mRNA之鼠脾細胞共培養後經活化之OVA特異性T細胞的量。
[圖48A及48B]分別顯示研究E7裝載精製脾細胞與抗CTLA4投予之組合是否將導致針對攜帶E7腫瘤TC1改善的治療效應之實驗的實驗設計及示意圖。[圖48C、48D、48E及48F]顯示當攜帶E7表現性腫瘤之小鼠經投予經SQZ裝載HPV E7抗原之精製鼠脾細胞且進一步投予或不投予抗CTLA4抗體時，腫瘤抗原裝載脾細胞與免疫檢查點抑制劑之組合對於腫瘤生長抑制(圖48C)、延遲或抑制腫瘤發生(圖48D及48E)及生存改善(圖48F)的累加治療效應。
Claims (93)
- 一種複數個經修飾之周邊血液單核細胞(PBMC)，該複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。
- 如請求項1之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係癌症抗原、傳染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。
- 如請求項1或2之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中二者或超過二者。
- 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。
- 如請求項4之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係癌症抗原、傳染性疾病抗原或病毒疾病相關抗原。
- 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑，其中該抗原對該經修飾之PBMC係外源性。
- 如請求項4至6中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中二者或超過二者。
- 如請求項4至7中任一項之經調理之複數個PBMC，其藉由使包含該抗原之該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
- 一種包含抗原之經調理之複數個PBMC，其藉由使該複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC且隨後將該抗原導入該PBMC來製備，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
- 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
- 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC。
- 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC；及 c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使編碼該抗原之核酸通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與編碼該抗原之該核酸培育足夠的時間，以允許編碼該抗原之該核酸進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含編碼該抗原之該核酸之複數個經修飾之PBMC；及 c)使包含編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含編碼該抗原之該核酸之該經修飾之PBMC， 其中該核酸係於該PBMC中表現以產生該抗原，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 如請求項12或13之包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該過程進一步包含：在與該佐劑培育以調理該經修飾之PBMC之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原或編碼該抗原之該核酸之該複數個經修飾之PBMC。
- 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之過程製備： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及 b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC； 藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
- 一種經調理之複數個經修飾之PBMC，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原且藉由包含下列步驟之過程製備： a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC； b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及 c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之過程製備： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含該佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及 b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
- 一種複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含抗原及佐劑且藉由包含下列步驟之過程製備： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含該抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及 b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
- 如請求項10、11、15、17及18中任一項之複數個經修飾之PBMC，該複數個經修飾之PBMC包含該抗原及/或該佐劑，其中該過程進一步包含： 使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 如請求項1至19中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該過程進一步包含使該輸入PBMC及/或該經修飾之PBMC與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC的存活及/或功能。
- 如請求項10至20中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係該複數個輸入PBMC之平均直徑的約10%至約99%。
- 如請求項10至21中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係約4.2 µm至約6 µm。
- 如請求項10至22中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該縊縮之直徑係約4.2 µm至約4.8 µm。
- 如請求項10至23中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中包含該複數個輸入PBMC之該細胞懸浮液通過多個縊縮，其中該多個縊縮係呈串聯及/或平行排列。
- 9、12至14、16及19至24中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約1小時至約24小時而調理該經修飾之PBMC。
- 9、12至14、16及19至24中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約2小時至約10小時或約3小時至約6小時而調理該經修飾之PBMC。
- 如請求項1至26中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原及/或該佐劑係存在於該複數個PBMC中至少約70%的細胞中。
- 如請求項6至9及12至27中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑。
- 如請求項6至9及12至28中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
- 如請求項1至29中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係疾病相關抗原。
- 如請求項1至30中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該抗原係人類乳突病毒(HPV)抗原。
- 如請求項1至31中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該等細胞係經進一步修飾以增加一或多種共刺激分子的表現。
- 如請求項32之複數個經修飾之PBMC，其中該共刺激分子係B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
- 如請求項1至33中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中該等細胞係經進一步修飾以增加一或多種細胞介素的表現。
- 如請求項34之複數個經修飾之PBMC，其中該細胞介素係IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α或IL-21。
- 如請求項4至9、12至14、16及19至35中任一項之複數個經修飾之PBMC，其中：一或多種共刺激分子在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在該複數個未經修飾之PBMC的B細胞中係經上調，其中該共刺激分子係CD80及/或CD86。
- 如請求項36之複數個經修飾之PBMC，其中該CD80及/或CD86在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在複數個未經調理之PBMC的B細胞中係經上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
- 如請求項4至9、12至14、16及19至37中任一項之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該經修飾之PBMC相較於複數個未經調理之PBMC具有增加表現的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者。
- 如請求項38之經調理之複數個經修飾之PBMC，其中該IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者的表現相較於該複數個未經調理之PBMC增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
- 一種組成物，其包含如請求項1至39中任一項之複數個經修飾之PBMC。
- 一種組成物，其包含如請求項1至39中任一項之複數個經修飾之PBMC且用於作為藥物。
- 一種組成物，其包含如請求項1至39中任一項之複數個經修飾之PBMC且用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法。
- 一種組成物，其包含如請求項40至42中任一項之複數個經修飾之PBMC且用於治療癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病。
- 如請求項40至43中任一項之組成物，其中該經修飾之PBMC係於投予免疫檢查點抑制劑之前、同期或之後投予。
- 如請求項44之組成物，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中任一者。
- 如請求項40至43中任一項之組成物，其中該經修飾之PBMC係於投予治療劑之前、同期或之後投予。
- 一種包含經調理之複數個經修飾之PBMC之組成物於製造用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病的藥物之用途，該經調理之複數個經修飾之PBMC包含抗原，其中該經調理之複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及 c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含： a)使包含抗原之複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個PBMC； b)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含： a)使複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該佐劑之經調理之複數個PBMC； b)將抗原導入該複數個PBMC；及 c)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC； c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC；及 d)向該個體投予包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 如請求項50之方法，其進一步包含：在與該佐劑培育之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及 c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含： a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC； b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC； c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC；及 d)向該個體投予該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及 c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含： a)使包含輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及 c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC； c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC；及 d)向該個體投予佐劑。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含： a)使包含輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之複數個經修飾之PBMC；及 c)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC；及 d)向該個體投予佐劑。
- 如請求項52及54至57中任一項之方法，其中該過程進一步包含： 使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於刺激個體的免疫反應之方法，其包含：向該個體投予與抗原連結之複數個PBMC，其中該複數個經修飾之PBMC係藉由包含下列步驟之過程製備： a)使複數個輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原與該輸入PBMC之細胞表面連結，藉此產製與該抗原連結之該複數個PBMC；及 b)向該個體投予該複數個經修飾之PBMC。
- 如請求項48至59中任一項之方法，其中該免疫反應的刺激係用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病。
- 如請求項48至60之方法，其中該經修飾之PBMC係於投予細胞介素之前、同期或之後投予。
- 如請求項61之方法，其中該細胞介素係IL-15。
- 如請求項48至60之方法，其中該複數個PBMC或該經調理之複數個PBMC係於投予免疫檢查點抑制劑之前、同期或之後投予。
- 如請求項63之方法，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、VISTA及TIM-3中任一者。
- 如請求項48至60之方法，其中該複數個PBMC或該經調理之複數個PBMC係於投予治療劑之前、同期或之後投予。
- 如請求項65之方法，其中該治療劑係化學治療劑。
- 一種用於產製包含抗原之經調理之複數個PBMC之方法，其包含使包含該抗原之複數個PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個PBMC。
- 一種用於產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，其包含： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC； b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之複數個經修飾之PBMC；及 c)使包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 如請求項68之方法，其進一步包含：在與該佐劑培育之前，自該細胞懸浮液單離包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於產製包含抗原之複數個經修飾之PBMC之方法，其包含： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及 b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於產製包含抗原及佐劑之複數個經修飾之PBMC之方法，其包含： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及 b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
- 一種產製包含抗原之經調理之複數個經修飾之PBMC之方法，其包含： a)使複數個輸入PBMC與佐劑培育足夠的時間而調理該輸入PBMC，藉此產製經調理之複數個輸入PBMC； b)使包含該經調理之複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經調理之複數個經擾動的輸入PBMC；及 c)使該經調理之複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於產製包含抗原及佐劑之複數個經修飾之PBMC之方法，其包含： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及 b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
- 一種用於產製包含抗原及佐劑之複數個經修飾之PBMC之方法，其包含： a)使包含複數個輸入PBMC之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該複數個輸入PBMC包含抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入PBMC的直徑變化，藉此造成該輸入PBMC的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成複數個經擾動的輸入PBMC；及 b)使該複數個經擾動的輸入PBMC與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入PBMC，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該複數個經修飾之PBMC。
- 如請求項70、71、73及74中任一項之方法，其中該方法進一步包含： 使包含該抗原及/或佐劑之該複數個經修飾之PBMC與第二佐劑培育足夠的時間而調理包含該抗原之該經修飾之PBMC，藉此產製包含該抗原及/或該佐劑之該經調理之複數個經修飾之PBMC。
- 如請求項48至75中任一項之方法，其中該過程進一步包含使該輸入PBMC及/或該經修飾之PBMC與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修飾之PBMC，該藥劑增強該經修飾之PBMC的存活及/或功能。
- 如請求項50至76中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約4.2 µm至約6 µm。
- 如請求項50至77中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係約4.2 µm至約4.8 µm。
- 如請求項50至78中任一項之方法，其中包含該複數個輸入PBMC之該細胞懸浮液通過多個縊縮，其中該多個縊縮係呈串聯及/或平行排列。
- 如請求項48至51、53、58、60至69、72及75至79中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約1小時至約24小時而調理該經修飾之PBMC。
- 如請求項48至51、53、58、60至69、72及75至80中任一項之方法，其中該複數個經修飾之PBMC係與該佐劑培育約2小時至約10小時或約3小時至約6小時而調理該經修飾之PBMC。
- 如請求項48、50至58、60至69及71至81中任一項之方法，其中該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑。
- 如請求項48、50至58、60至69及71至82中任一項之方法，其中該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
- 如請求項48至83中任一項之方法，其中該抗原係疾病相關抗原。
- 如請求項84之方法，其中該抗原係人類乳突病毒(HPV)抗原。
- 如請求項48至85中任一項之方法，其中該細胞係經進一步修飾以增加一或多種共刺激分子的表現。
- 如請求項86之方法，其中該共刺激分子係B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112或scFv抗CD28。
- 如請求項48至87中任一項之方法，其中該細胞係經進一步修飾以增加細胞介素的表現。
- 如請求項88之方法，其中該細胞介素係IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α或IL-21。
- 如請求項48至51、53、58、60至69、71及73至89中任一項之方法，其中一或多種共刺激分子在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在該複數個輸入PBMC的B細胞中係經上調，其中該共刺激分子係CD80或CD86。
- 如請求項90之方法，其中該CD80及/或CD86在該經調理之複數個經修飾之PBMC的B細胞中相較於在複數個未經調理之PBMC的B細胞中係經上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
- 如請求項48至51、53、58、60至69、71及73至91中任一項之方法，其中該經調理之經修飾之PBMC相較於複數個未經調理之PBMC具有增加表現的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者。
- 如請求項92之方法，其中該IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α之一或多者的表現相較於該複數個未經調理之PBMC增加約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
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