TW202003019A - 細胞內投遞生物分子以修改免疫反應之方法 - Google Patents

細胞內投遞生物分子以修改免疫反應之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202003019A
TW202003019A TW108108098A TW108108098A TW202003019A TW 202003019 A TW202003019 A TW 202003019A TW 108108098 A TW108108098 A TW 108108098A TW 108108098 A TW108108098 A TW 108108098A TW 202003019 A TW202003019 A TW 202003019A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cell
modified
cells
antigen
adjuvant
Prior art date
Application number
TW108108098A
Other languages
English (en)
Inventor
史考特 羅漢
李安 塔拉瑞
阿爾方索 維森特蘇雅斯
馬特 布蒂
霍華德 柏恩斯坦
卡塔琳娜 布拉格威
阿蒙 沙里
柯蘭 拉維堤
Original Assignee
美商Ｓｑｚ生物科技公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商Ｓｑｚ生物科技公司 filed Critical 美商Ｓｑｚ生物科技公司
Publication of TW202003019A publication Critical patent/TW202003019A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/55—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes

Abstract

本申請案提供包含抗原及佐劑之T細胞、製造該T細胞之方法及使用該T細胞以諸如調節個體之免疫反應之方法。

Description

細胞內投遞生物分子以修改免疫反應之方法
本揭露大抵關於包含抗原及/或佐劑之T細胞、製造該T細胞之方法及使用該T細胞以諸如調節個體之免疫反應之方法。
免疫療法可分成二種主要介入類型，即被動或主動。被動規程包括投予預先活化及/或經工程改造之細胞、疾病特異性治療性抗體及/或細胞介素。主動免疫療法策略係針對刺激體內免疫系統效應功能。數種目前的主動規程包括用疾病相關肽、溶解物或同種異體全細胞的免疫接種策略、輸注自體DC作為腫瘤抗原投遞之媒劑及輸注免疫檢查點調節劑。見Papaioannou, Nikos E., et al.Annals of translational medicine 4.14 (2016)。
藉由疾病相關抗原刺激之CD8+ 細胞毒性T淋巴細胞(CTL)及CD4+ 輔助T (Th)細胞具有靶向及摧毀患病細胞的潛力，然而，目前誘導內源性T細胞反應的方法面臨挑戰。
本文所引證之所有參考文獻包括專利申請案及公開案皆以引用方式完整併入本文中。
在一些態樣中，本發明提供一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原對該經修改的T細胞係外源性且包含免疫原性表位，且其中該佐劑存在於細胞內。在一些實施例中，本發明提供一種包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
在一些態樣中，本發明提供一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞(input T cell)之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞(perturbed input T cell)；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞；藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原對佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。
在一些態樣中，本發明提供一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含該佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
在一些態樣中，本發明提供一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含該抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
在一些實施例中，變形力係於輸入T細胞通過縊縮時施加至輸入T細胞，藉此造成輸入T細胞之擾動。在一些實施例中，該製程進一步包含使該輸入T細胞及/或該經修改的T細胞與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。在一些實施例中，該藥劑係增強胞飲作用之化合物或作為穩定劑或輔助因子。在一些實施例中，縊縮之直徑係小於該輸入T細胞之直徑。在一些實施例中，縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約99%。在一些實施例中，縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約60%。
在一些實施例中，該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。在一些實施例中，該囊泡係胞內體。在一些實施例中，該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。在一些實施例中，該抗原或免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。
在一些實施例中，該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑或聚I:C。在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。
在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自疾病相關抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自非自身抗原。在一些實施例中，其中該免疫原性表位係衍生自腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自人類乳突病毒(HPV)抗原。在一些實施例中，該HPV係HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。在一些實施例中，該HLA-A2限制肽包含SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。在一些實施例中，在向個體投予包含該複數個抗原的該經修改的T細胞之後，其中該複數個抗原包含該複數個免疫原性表位，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。在一些實施例中，該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。在一些實施例中，免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。在一些實施例中，該抗原係包含免疫原性肽表位及一或多個異源性肽序列之多肽。在一些實施例中，該抗原係包含在N端及/或C端側接異源性肽序列的免疫原性肽表位之多肽。在一些實施例中，該側接異源性肽序列係衍生自疾病相關免疫原性肽。在一些實施例中，該N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。
在一些實施例中，經修改的T細胞包含該佐劑的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含該抗原的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施例中，該抗原對該佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
在一些實施例中，該經修改的T細胞進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。在一些實施例中，藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。在一些實施例中，藥劑係白蛋白。在一些實施例中，白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。在一些實施例中，藥劑係二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。在一些實施例中，該藥劑包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
在一些實施例中，該細胞係經進一步修改以增加一或多種共刺激分子的表現。在一些實施例中，該共刺激分子係B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，該細胞包含導致該一或多種共刺激分子表現增加的核酸。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第一型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第二型表現。
在一些實施例中，相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修改的T細胞所起始之先天免疫反應係減少。在一些實施例中，相較於不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞或天然殺手T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞或γδ-T細胞。
在一些態樣中，本發明提供一種組成物，其包含任何本文所述之經修改的T細胞。在一些態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含如本文所述之經修改的T細胞及醫藥上可接受之載劑。
在一些態樣中，本發明提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含向該個體投予如本文所述之經修改的T細胞、如本文所述之組成物或如本文所述之醫藥組成物。
在一些態樣中，本發明提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)向該個體投予包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列；及b)向該個體投予佐劑。
在一些態樣中，本發明提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原對佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。
在一些態樣中，本發明提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
在一些態樣中，本發明提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含抗原，其中該抗原包含免疫原性表位，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含該抗原的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施例中，經修改的T細胞包含該佐劑的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原對佐劑之比例係介於約10000:1與約1:10000之間。
在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
在一些態樣中，本發明提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原之經修改的T細胞；c)向該個體投予該經修改的T細胞；及d)向該個體投予佐劑。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
在一些實施例中，變形力係於輸入T細胞通過縊縮時施加至輸入T細胞，藉此造成輸入T細胞之擾動。在一些實施例中，該方法進一步包含使該輸入T細胞及/或經修改的T細胞與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。在一些實施例中，該藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。在方法的一些實施例中，該免疫反應係經增強。在一些實施例中，該增強的免疫反應係針對該抗原。在一些實施例中，縊縮之直徑係小於該輸入T細胞之直徑。在一些實施例中，縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約99%。在一些實施例中，縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約60%。
在一些實施例中，該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。在一些實施例中，該囊泡係胞內體。在一些實施例中，該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。在一些實施例中，該抗原或免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。
在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑或聚I:C。在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。
在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自疾病相關抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自非自身抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自人類乳突病毒(HPV)抗原。在一些實施例中，該HPV係HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。在一些實施例中，該HLA-A2限制肽包含SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。在一些實施例中，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。在一些實施例中，該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。在一些實施例中，免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。在一些實施例中，與該N端側接多肽及/或該C端側接多肽融合之該免疫原性肽表位係非天然發生序列。在一些實施例中，該N端及/或C端側接多肽係衍生自免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施例中，該N端及/或C端側接多肽係衍生自疾病相關免疫原性SLP。在一些實施例中，該N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。
在一些實施例中，該經修改的T細胞進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。在一些實施例中，藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。在一些實施例中，藥劑係白蛋白。在一些實施例中，白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。在一些實施例中，藥劑係二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第一型表現。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第二型表現。
在一些實施例中，相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞所起始之先天免疫反應，在該個體中因應投予同種異體來源的該經修改的T細胞所起始之先天免疫反應係減少。在一些實施例中，相較於不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞或天然殺手T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞或γδ-T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞對該個體係同種異體。在一些實施例中，該經修改的T細胞對該個體係自體。在一些實施例中，該個體係經預先調理以調節發炎及/或免疫反應。
在一些實施例中，本方法進一步包含向該個體投予第二佐劑。在一些實施例中，第二佐劑係IFN-α或CpG ODN。在一些實施例中，經修改的T細胞及第二佐劑係同期(concurrently)或同時(simultaneously)投予。在一些實施例中，該經修改的T細胞及該第二佐劑係依序投予。在一些實施例中，經修改的T細胞係於投予第二佐劑之前投予。在一些實施例中，該經修改的T細胞係於投予該第二佐劑之後投予。
在一些實施例中，經修改的T細胞係於投予免疫檢查點抑制劑之前、同期或之後投予。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4及TIM-3中任一者。在一些實施例中，向該個體投予該經修改的T細胞導致對該抗原具特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活化及/或擴增。在一些實施例中，向該個體投予該經修改的T細胞導致對該抗原具特異性的輔助T (Th)細胞活化及/或擴增。在一些實施例中，向該個體投予之該經修改的T細胞的量係介於約1 x 106 與約1 x 1012 個細胞之間。
在一些實施例中，方法包含多次投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞之二次連續投予之間的時間間隔係介於約1天與約30天之間。
在一些態樣中，本發明提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：向該個體投予與抗原相關之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：
a)使輸入T細胞與抗原及/或佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原與該輸入T細胞之細胞表面連結，其中該抗原包含免疫原性表位，藉此產製與該抗原相關之經修改的T細胞；及b)向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，該HPV抗原包含與SEQ ID NO: 18至25中任一者具有至少90%相似性之胺基酸序列。在一些實施例中，該HPV抗原包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列。在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，該CpG ODN係CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
抗原呈現細胞(APC)在誘導CTL的內源性活化上扮演關鍵角色。在本發明中，描述實施CellSqueeze®平台，以工程改造用於調節對各種適應症(包括癌症及傳染性疾病)的免疫反應之T細胞APC (TAPC )。藉由將目標抗原及/或佐劑有效地胞質液投遞至T細胞，此平台顯示誘導有效的體內MHC-I呈現目標抗原及刺激CTL的能力。
本申請案的一些態樣提供包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，且其中該佐劑存在於細胞內。在一些實施例中，經修改的T細胞係藉由以下製備：a)將輸入T細胞通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞；藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。亦提供使用經修改的T細胞以調節個體之免疫反應之方法，例如增強個體之免疫反應。在一些實施例中，該增強的免疫反應係針對該抗原。在一些實施例中，細胞變形縊縮包含在微流體通道中，諸如本文所述之任何微流體通道。
在其他態樣中，提供一種調節個體之免疫反應之方法，其包含向該個體投予a)包含抗原之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；及b)佐劑。在一些實施例中，經修改的T細胞係藉由以下製備：a)將輸入T細胞通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞；藉此產製包含該抗原之該經修改的T細胞。在一些實施例中，該免疫反應係經增強。在一些實施例中，該增強的免疫反應係針對該抗原。在一些實施例中，細胞變形縊縮包含在微流體通道中，諸如本文所述之任何微流體通道。 一般技術
在本文中描述或指涉之技術及程序通常為所屬技術領域中具有通常知識者所廣為理解且經常使用習知方法採用，諸如例如以下描述之廣為運用之方法：Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrooket al ., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel,et al . eds., 2003)；系列Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995)；Antibodies, A Laboratory Manual ( Harlow and Lane, eds., 1988)；Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology , Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998)；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8)；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction , (Mulliset al ., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coliganet al ., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Ausubelet al ., eds., J. Wiley and Sons, 2002)；Immunobiology (C.A. Janewayet al ., 2004)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；及Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVitaet al ., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)。定義
出於闡釋本說明書之目的，將應用以下定義且每當適當時，以單數形式使用之用語亦將包括複數且反之亦然。若以下闡述之任何定義與以引用方式併入本文中之任何文獻相悖，則將以以下闡述之定義為準。
如本文中所使用之單數形式「一(a, an)」及「該(the)」包括複數引用，除非另外說明。
應理解本文所述之本發明的態樣及實施例包括「包含(comprising)」、「組成(consisting)」及「實質上由組成(consisting essentially of)」態樣及實施例。
如本文中所使用之用語「約(about)」係指所屬技術領域中具有通常知識者所廣為周知之各別值的通常錯誤範圍。在本文中指涉「約」某數值或參數時，其包括(且描述)與該數值或參數本身相關之實施態樣。
如本文中所使用之用語「孔(pore)」係指開口，包括但不限於材料內的洞(hole)、裂口(tear)、腔(cavity)、口(aperture)、破裂(break)、縫隙(gap)或穿孔(perforation)。在一些實例中，(適用時)用語係指本揭露之表面內的孔。在其他實例中，(適用時)孔可指細胞膜中的孔。
如本文中所使用之用語「膜(membrane)」係指含有孔的選擇性屏障或片材。用語包括作為界限或襯料的可彎曲片狀結構。在一些實例中，用語係指含有孔的表面或過濾器。此用語與用語「細胞膜(cell membrane)」不同。
如本文中所使用之用語「過濾器(filter)」係指允許選擇性通過孔之有孔物品。在一些實例中，用語係指含有孔的表面或膜。
如本文中所使用之用語「異質性(heterogeneous)」係指結構或組成係混合或不均勻的某物。在一些實例中，用語係指在給定表面內具有變化大小、形狀或分布的孔。
如本文中所使用之用語「同質性(homogeneous)」係指整個結構或組成係一致或均勻的某物。在一些實例中，用語係指在給定表面內具有一致大小、形狀或分布的孔。
用語「異源性(heterologous)」關於核酸序列諸如編碼序列及控制序列時，表示正常不連接在一起及/或正常不與特定細胞相關之序列。因此，核酸建構體或載體的「異源性」區域係位在另一核酸分子內或連接至另一核酸分子且在天然中未被發現與該另一分子相關的核酸區段。例如，核酸建構體的異源性區域可能包括旁側連接在天然中未發現與編碼序列相關之序列的編碼序列。另一異源性編碼序列的實例係其中該編碼序列本身在天然中未被發現(例如，具有不同於天然基因之密碼子的合成序列)的建構體。相似地，經正常不存在於細胞中之建構體轉形的細胞就本發明之目的而言將被視為異源性。等位變異或天然發生突變事件不產生如本文中所使用之異源性DNA。
用語「異源性」關於胺基酸序列諸如肽序列及多肽序列時，表示正常不連接在一起及/或正常不與特定細胞相關之序列。因此，肽序列的「異源性」區域係位在另一胺基酸分子內或連接至另一胺基酸分子且在天然中未被發現與該另一分子相關的胺基酸區段。例如，肽建構體的異源性區域可能包括旁側連接在天然中未發現與肽胺基酸序列相關之序列的肽胺基酸序列。另一異源性肽序列的實例係其中該肽序列本身在天然中未被發現(例如，具有不同於天然基因所編碼之胺基酸的合成序列)的建構體。相似地，經正常不存在於細胞中之載體(其表現胺基酸建構體)轉形的細胞就本發明之目的而言將被視為異源性。等位變異或天然發生突變事件不產生如本文中所使用之異源性肽。
當用語「外源性(exogenous)」用於指涉與細胞有關之藥劑(諸如抗原或佐劑)時，係指從細胞外投遞(也就是來自細胞外)之藥劑。細胞可能已經具有或不具有該藥劑存在，且在該外源性藥劑投遞後可能產生或不產生該藥劑。
如本文中所使用，用語「抑制(inhibit)」可指阻斷、減少、清除或以其他方式拮抗特定目標之存在或活性的動作。抑制可指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫反應可指任何導致阻斷、減少、清除或任何其他拮抗免疫反應之動作。在其他實例中，抑制核酸表現可包括但不限於減少核酸轉錄、減少mRNA豐度(例如，靜默mRNA轉錄)、降解mRNA、抑制mRNA轉譯等。
如本文中所使用，用語「壓制(suppress)」可指降低、減少、禁止、限制、減輕或以其他方式縮小特定目標之存在或活性的動作。壓制可指部分壓制或完全壓制。例如，壓制免疫反應可指任何導致降低、減少、禁止、限制、減輕或以其他方式縮小免疫反應之動作。在其他實例中，壓制核酸表現可包括但不限於減少核酸轉錄、減少mRNA豐度(例如，靜默mRNA轉錄)、降解mRNA、抑制mRNA轉譯等。
如本文中所使用，用語「增強(enhance)」可指改善、加強、強調或以其他方式增加特定目標之存在或活性的動作。例如，增強免疫反應可指任何導致改善、加強、強調或以其他方式增加免疫反應之動作。在一例示性實例中，增強免疫反應可指採用抗原及/或佐劑以改善、加強、強調或以其他方式增加免疫反應。在其他實例中，增强核酸表現可包括但不限於增加核酸轉錄、增加mRNA豐度(例如，增加mRNA轉錄)、降低mRNA降解、增加mRNA轉譯等。
如本文中所使用，用語「調節(modulate)」可指變更、改變、變化或以其他方式修改特定目標之存在或活性的動作。例如，調節免疫反應可指任何導致變更、改變、變化或以其他方式修改免疫反應之動作。在其他實例中，調節核酸表現可包括但不限於變更核酸轉錄、變更mRNA豐度(例如，增加mRNA轉錄)、對應變更mRNA降解、變更mRNA轉譯等。
如本文中所使用，用語「誘導(induce)」可指起始、提示、刺激、建立或以其他方式產生結果之動作。例如，誘導免疫反應可指任何導致起始、提示、刺激、建立或以其他方式產生所欲免疫反應之動作。在其他實例中，誘導核酸表現可包括但不限於起始核酸轉錄、起始mRNA轉譯等。
如本文中所使用之用語「同源性(homologous)」係指衍生自相同有機體之分子。在一些實例中，該用語係指正常在給定有機體內發現或表現之核酸或蛋白質。
如本文中所使用之用語「多核苷酸(polynucleotide)」或「核酸分子(nucleic acid)」係指任何長度之聚合形式的核苷酸，不論核糖核苷酸或去氧核醣核苷酸。因此，此用語包括但不限於單股、雙股或多股DNA或RNA、基因體DNA、cDNA、DNA-RNA雜交、或包含嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、經化學或生化修改、非天然或衍生性核苷酸鹼基之聚合物。多核苷酸之主鏈可包含糖及磷酸鹽基團(如同一般可在RNA或DNA中發現者)、或經修改或經取代的糖或磷酸鹽基團。替代地，多核苷酸之主鏈可包含合成次單位諸如胺基磷酸酯及硫代磷酸酯之聚合物，且因此可為寡去氧核苷胺基磷酸酯(P-NH2)或混合的胺基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，雙股多核苷酸可自化學合成的單股多核苷酸產物，使用DNA聚合酶與適當引子藉由合成互補股並在適當條件下黏合該等股，或藉由重新(de novo )合成互補股獲得。
用語「多肽(polypeptide)」及「蛋白質(protein)」可交換使用以指涉胺基酸殘基之聚合物，並不限於最小長度。該等胺基酸殘基之聚合物可包含天然或非天然胺基酸殘基，且包括但不限於胺基酸殘基之肽、寡肽、二聚物、三聚物及多聚物。全長蛋白質及彼之片段均包含於此定義中。該等用語亦包括多肽之表現後修改，例如糖基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化及該類似修改。另外，就本發明之目的而言，「多肽」係指包括對天然序列加以修改諸如刪除、添加及取代(通常在天然中為保守性)之蛋白質，只要該蛋白質維持該所欲之活性。這些修改可經過考慮，諸如透過定點突變形成，或可為意外發生，諸如經由宿主之突變，該宿主產生蛋白質或因為PCR擴增之錯誤。
如本文中所使用，用語「佐劑(adjuvant)」係指直接或間接調節及/或導致免疫反應之物質。通常，佐劑係搭配抗原投予，以相較於單獨抗原致效增強對抗原之免疫反應。各種佐劑係在本文中描述。
用語「CpG寡去氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide)」及「CpG ODN」係指含有藉由磷酸鹽分離之胞嘧啶及鳥嘌呤的二核苷酸之DNA分子(在本文中亦稱為「CpG」二核苷酸或「CpG」)。本揭露之CpG ODN含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸。也就是說，CpG二核苷酸中的胞嘧啶未經甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可具有部分或完全硫代磷酸酯(PS)主鏈。
如本文中所使用，所謂「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」或「藥學上可相容(pharmacologically compatible)」係指不是生物非所欲或以其他方式非所欲之材料，例如可併入向患者投予之醫藥組成物中，且不造成任何顯著非所欲生物效應或不以有害方式與該組成物中所含有的任何其他組分交互作用之材料。醫藥上可接受之載劑或賦形劑較佳地符合毒性及製造測試所需標準及/或包括於美國食品藥物管理局制定的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)。
就本文中描述之任何結構及功能特徵而言，判定這些特徵之方法係所屬技術領域中已知。經修改的 T 細胞
在某些態樣中，提供一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原對該經修改的T細胞係外源性且包含免疫原性表位，且其中該佐劑存在於細胞內。外源性抗原係一或多種來自T細胞外且經導入待修改的T細胞之來源的抗原，且包括在導入外源性抗原之前或之後可存在於T細胞中(即，係內源性)之抗原，且從而可因此由該T細胞產生(例如，由T細胞之基因體編碼)。例如，在一些實施例中，經修改的T細胞包含二池抗原，第一池包含內源性來源的抗原，且第二池包含在待修改的T細胞外產生且經導入該待修改的T細胞中之外源性來源的抗原。在一些實施例中，抗原在個體的疾病細胞中異位地表現或過度表現，且經修改的T細胞係衍生自個體並包含在該待修改的T細胞外產生且經導入該待修改的T細胞中之外源性來源的抗原或其中含有的免疫原性表位。在一些實施例中，抗原係包含新表位之新抗原(例如，經改變的自身蛋白質或其部分)，且經修改的T細胞包含在該待修改的T細胞外產生且經導入該待修改的T細胞中之外源性來源的抗原或包含新表位之其片段。在一些實施例中，佐劑對該經修改的T細胞係外源性。在一些實施例中，該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。在一些實施例中，該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。在一些實施例中，該囊泡係胞內體。在一些實施例中，該抗原或免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞或天然殺手T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞或γδ-T細胞。
在某些態樣中，提供一種包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗原係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。在一些實施例中，該抗原係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。在一些實施例中，該囊泡係胞內體。在一些實施例中，該抗原或其中含有的免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞及天然殺手T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞及γδ-T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞進一步包含佐劑。
在一些實施例中，根據任何本文所述之經修改的T細胞，該經修改的T細胞包含佐劑。在一些實施例中，該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑或聚I:C。在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，該CpG ODN的長度係不大於約50個(諸如不大於約45、40、35、30、25、20或更少個中任一者)核苷酸。在一些實施例中，該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。在一些實施例中，該CpG ODN包含SEQ ID NO: 26至37中任一者之核苷酸序列。在一些實施例中，該CpG ODN包含SEQ ID NO:30之核苷酸序列。在一些實施例中，該CpG ODN包含SEQ ID NO:31之核苷酸序列。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複數個不同的CpG ODN。例如，在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複數個選自A型、B型及C型CpG ODN之不同的CpG ODN。
在一些實施例中，佐劑係CpG ODN、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑。在具體實施例中，佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。在一些實施例中，CpG ODN佐劑包含來自CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03之群組的選擇。在一些實施例中，CpG ODN佐劑係CpG ODN 1826 (SEQ: TCCATGACGTTCCTGACGTT)或CpG ODN 2006(亦稱為CpG ODN 7909)(SEQ: TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)寡核苷酸。在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN 7909。在一些實施例中，RIG-I促效劑包含聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyI:C)。多種佐劑亦可搭配抗原使用以增強免疫反應的誘發。在一些實施例中，經修改的T細胞包含超過一種佐劑。多種佐劑亦可搭配抗原使用以增強免疫反應的誘發。在一些實施例中，經修改的T細胞包含超過一種佐劑。在一些實施例中，經修改的T細胞包含佐劑CpG ODN、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑之任何組合。
在一些實施例中，根據任何本文所述之經修改的T細胞，該經修改的T細胞包含抗原，該抗原包含免疫原性表位。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自疾病相關抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自在疾病細胞中異位地表現或過度表現的蛋白質。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自新抗原，例如癌症相關新抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位包含新表位，例如癌症相關新表位。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自非自身抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自經突變或以其他方式改變之自身抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。在一些實施例中，抗原包含與異源性肽序列融合之免疫原性表位。在一些實施例中，抗原包含複數個免疫原性表位。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中的一些係衍生自相同來源。例如，在一些實施例中，複數個免疫原性表位中的一些係衍生自相同病毒抗原。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中所有皆衍生自相同來源。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中無一衍生自相同來源。在一些實施例中，經修改的T細胞包含複數個不同的抗原。
在一些實施例中，根據任何本文所述之包含免疫原性表位之抗原，該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。在一些實施例中，免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。在一些實施例中，與該N端側接多肽及/或該C端側接多肽融合之該免疫原性肽表位係非天然發生序列。在一些實施例中，該N端及/或C端側接多肽係衍生自免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施例中，該N端及/或C端側接多肽係衍生自疾病相關免疫原性SLP。在一些實施例中，該N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，根據任何本文所述之包含免疫原性表位之抗原，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自人類乳突病毒(HPV)抗原。在一些實施例中，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73及82中任一者。在一些實施例中，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自HPV-16抗原或HPV-18抗原。在進一步實施例中，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自HPV E6抗原(例如，HPV-16或HPV-18 E6抗原)或HPV E7抗原(例如，HPV-16或HPV-18 E7抗原)。在一些實施例中，該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。在一些實施例中，抗原包含HPV-16 E6蛋白質介於殘基29與38之間的片段(即HPV-16 E629-38 )。在一些實施例中，抗原包含HPV-16 E6蛋白質介於殘基48與57之間的片段(即HPV-16 E648-57 )。在一些實施例中，抗原包含HPV-16 E7蛋白質介於殘基11與20之間的片段(即HPV-16 E711-20 )。在一些實施例中，抗原包含HPV-16 E7蛋白質介於殘基49與57之間的片段(即HPV-16 E749-57 )。在一些實施例中，抗原包含SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原包含經N端多肽(其包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列)及C端多肽(其包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列)側接的SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，根據任何本文所述之包含免疫原性表位之抗原，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自人類巨細胞病毒(HCMV)抗原。在一些實施例中，抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自Merlin、Toledo、Davis、Esp、Kerr、Smith、TB40E、TB40F、AD169或Towne HCMV株中任一者。在一些實施例中，抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自AD169 HCMV株抗原或Merlin HCMV株抗原。在進一步實施例中，抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自pUL48、pUL47、pUL32、pUL82、pUL83及pUL99、pUL69、pUL25、pUL56、pUL94、pUL97、pUL144或pUL128。在一些實施例中，抗原包含衍生自HCMV pUL83之HLA-A2限制肽。
在一些實施例中，根據任何本文所述之包含免疫原性表位之抗原，該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。在一些實施例中，抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽。在一些實施例中，抗原能夠被處理成MHC第二型限制肽。在一些實施例中，抗原包含複數個免疫原性表位，且能夠被處理成MHC第一型限制肽及MHC第二型限制肽。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中的一些係衍生自相同來源。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中所有皆衍生自相同來源。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中無一衍生自相同來源。
在一些實施例中，根據任何本文所述之經修改的T細胞，該經修改的T細胞包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。在一些實施例中，在向個體投予包含該複數個抗原的該經修改的T細胞之後，其中該複數個抗原包含該複數個免疫原性表位，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。
在一些實施例中，根據任何本文所述之經修改的T細胞，該經修改的T細胞包含抗原及佐劑。在一些實施例中，經修改的T細胞包含佐劑的濃度介於約1 pM與約10 mM之間。在一些實施例中，經修改的T細胞包含該佐劑的濃度介於約0.1 µM與約10 mM之間。例如，在一些實施例中，經修改的T細胞中之佐劑濃度係小於約1 pM、約10 pM、約100 pM、約1 nM、約10 nM、約100 nM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM、或約10 mM中任一者。在一些實施例中，經修改的T細胞中之佐劑濃度係大於約10 mM。在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原濃度係介於約1 pM與約10 pM之間、介於約10 pM與約100 pM之間、介於約100 pM與約1 nM之間、介於約1 nM與約10 nM之間、介於約10 nM與約100 nM之間、介於約100 nM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於約1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000:1與約1:10000之間中任一者。例如，在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原對佐劑之莫耳比係約10000:1、約1000:1、約200:1、約100:1、約10:1、約1:1、約1:10、約1:100、約1:1000或約1:10000中任一者。在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000:1與約1000:1之間、介於約1000:1與約100:1之間、介於約100:1與約10:1之間、介於約10:1與約1:1之間、介於約1:1與約1:10之間、介於約1:10與約1:100之間、介於約1:100與約1:1000之間、介於約1:1000與約1:10000之間中任一者。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
在一些實施例中，根據任何本文所述之經修改的T細胞，該經修改的T細胞進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。在一些實施例中，藥劑係穩定劑或輔助因子。在一些實施例中，藥劑係白蛋白。在一些實施例中，白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。在一些實施例中，藥劑係二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。
在一些實施例中，根據任何本文所述之方法或組成物，經修改的T細胞進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應複數個經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。在一些實施例中，經修改的T細胞進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞在冷凍-解凍循環中的存活性及/或功能。在一些實施例中，藥劑係冷凍保存劑及/或低溫保存劑。在一些實施例中，相較於在任何冷凍解凍循環之前不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，不論冷凍保存劑或低溫保存劑皆不造成包含該藥劑之經修改的T細胞超過10%或20%的細胞死亡。在一些實施例中，至少約70%、約80%或約90%的經修改的T細胞在至多1、2、3、4、5次冷凍解凍循環之後係存活。在一些實施例中，藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。在一些實施例中，藥劑係白蛋白。在一些實施例中，白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。在一些實施例中，藥劑係人白蛋白。在一些實施例中，藥劑係以下一或多者：二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。在一些實施例中，二價金屬陽離子係Mg2+ 、Zn2+ 或Ca2+ 中之一或多者。在一些實施例中，藥劑係以下一或多者：丙酮酸鈉、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鈉金屬離子、鉀金屬離子、鎂金屬離子、氯化物、乙酸鹽、葡萄糖酸鹽、蔗糖、氫氧化鉀或氫氧化鈉。在一些實施例中，藥劑係以下一或多者：丙酮酸鈉、腺嘌呤、Rejuvesol®、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、PlasmaLyte®、DMSO、Cryostor® CS2、Cryostor® CS5、Cryostor® CS10、Cryostor® CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、HypoTherosol®。
在一些實施例中，根據任何本文所述之經修改的T細胞，該經修改的T細胞包含進一步修改。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第一型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改，以降低MHC第一型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改，以增加MHC第一型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第二型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改，以降低MHC第二型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改，以增加MHC第二型表現。在一些實施例中，相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修改的T細胞所起始之先天免疫反應係減少。在一些實施例中，相較於不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
在某些態樣中，提供一種包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗原係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。在一些實施例中，該抗原係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。在一些實施例中，該囊泡係胞內體。在一些實施例中，該抗原或其中含有的免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞或天然殺手T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞或γδ-T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞進一步包含佐劑。在一些實施例中，經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞；藉此產製包含該抗原之該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。在一些實施例中，經修改的T細胞進一步包含佐劑，諸如任何本文所述之佐劑。
在某些態樣中，提供一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞(input T cell)之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞(perturbed input T cell)；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞；藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約1 pM至10 mM之間及/或與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約0.1 µM至10 mM之間及/或與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM至10 mM之間。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原對佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。
在某些態樣中，提供一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含該佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。
在某些態樣中，提供一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含該抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。
本文所述之經修改的T細胞在一些實施例中係藉由採用使輸入T細胞通過細胞變形縊縮之製程製備。在一些實施例中，縊縮之直徑係小於該輸入T細胞之直徑。在一些實施例中，縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約99%。在一些實施例中，縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約60%。在一些實施例中，細胞變形縊縮包含在微流體通道中，諸如本文所述之任何微流體通道。微流體通道可含有在任何本文所述之微流體裝置中，諸如以下標題「微流體裝置」一節中所述。因此，在一些實施例中，根據任何本文所述藉由採用使輸入T細胞通過包括細胞變形縊縮之微流體通道之製程所製備的經修改的T細胞，該製程包含使輸入T細胞通過任何本文所述之微流體系統含有的包括細胞變形縊縮之微流體通道。在一些實施例中，變形力係於輸入T細胞通過縊縮時施加至輸入T細胞，藉此造成輸入T細胞之擾動。
輸入T細胞可自數種來源獲得，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位之組織、腹水、胸膜滲液、脾臟組織及腫瘤。在本發明之一些實施例中，任何數量之該領域可取得之T細胞系皆可被使用。在本發明之一些實施例中，T細胞可使用該領域之技藝人士所知之任何數量之技術諸如Ficoll™分離，自收集自個體之一單位血液獲得。在一些實施例中，來自個體之循環血液中的細胞係藉由血球分離獲得。血球分離產物一般含有淋巴細胞包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球、及血小板。在一些實施例中，藉由血球分離所收集之細胞可經洗滌以去除血漿部分且將細胞放置於適當緩衝液或培養基以供進行後續處理步驟。在一些實施例中，細胞係經磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。在一些實施例中，洗滌溶液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多若非所有二價陽離子。如同該領域之技藝人士將輕易瞭解的，洗滌步驟可藉由該領域之技藝人士已知之方法進行，諸如根據製造商指示使用半自動化「流經(flow-through)」離心(例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗滌後，細胞可經重懸於各種生物相容性緩衝液，諸如無Ca2+ 、無Mg2+ PBS、PlasmaLyte A或其他有或無緩衝液之鹽水溶液。替代地，血球分離樣本之非所欲組分可經移除且將細胞直接重懸於培養基中。
在一些實施例中，T細胞係自周邊血液淋巴細胞單離，其可藉由例如離心通過PERCOLL™梯度或藉由逆流離心淘析以溶解紅血球並除盡單核球。T細胞之特定亞群(諸如CD3+ 、CD28+ 、CD4+ 、CD8+ 、CD45RA+ 、CD45RO+ T細胞及γδ-T細胞)可藉由正向或負向選擇技術進一步單離。例如，在一些實施例中，T細胞係藉由與抗CD3/抗CD28(即3×28)接合珠(諸如 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)培育足以正向選擇所欲T細胞的時間期間來單離。在一些實施例中，時間期間係約30分鐘。在一些實施例中，時間期間從30分鐘至36小時或更長及其間的所有整數數值不等。在一些實施例中，時間期間係至少一、2、3、4、5或6小時。在一些實施例中，時間期間係10至24小時。在一些實施例中，培育時間期間係24小時。以自白血病患者單離T細胞而言，使用較長的培育時間諸如24小時可增加細胞產率。在任何其中T細胞相較於其他細胞類型較少的狀況中，可使用較長的培育時間單離T細胞，諸如自腫瘤組織或自免疫不全個體單離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。另外，使用較長的培育時間可增加捕捉CD8+ T細胞的效率。因此，藉由簡單地縮短或延長允許T細胞與CD3/CD28珠結合的時間，及/或藉由增加或降低珠對T細胞的比例，可在培養起始時或製程期間的其他時間點優先正向或負向選擇T細胞亞群。此外，藉由增加或降低珠或其他表面上抗CD3及/或抗CD28抗體的比例，可在培養起始時或其他所欲時間點優先正向或負向選擇T細胞亞群。該領域之技藝人士將明瞭，多重選擇回合亦可用於本發明之情況中。在一些實施例中，所欲的是進行選擇程序並且在活化及擴增製程中使用「未經選擇(unselected)」之細胞(負向選擇)。「未經選擇」之細胞亦可經進一步選擇回合之處理。
藉由負向選擇來富集T細胞族群，可利用針對負向選擇細胞所特有之表面標誌之抗體組合來完成。一種方法係經由負向磁免疫黏附或流式細胞分析之細胞分選及/或選擇，使用針對負向選擇細胞之細胞表面標誌的單株抗體之雞尾酒進行。舉例來說，要藉由負向選擇富集CD4+細胞，則單株抗體雞尾酒一般來說包括針對CD 14、CD20、CD11b、CD 16、HLA-DR及CD8之抗體。在一些實施例中，所欲的是富集或正向選擇通常表現CD4+ 、CD25+ 、CD62Lhi、GITR+ 及FoxP3+ 之調節T細胞。替代地，在一些實施例中，T調節細胞係藉由抗CD25接合珠或其他相似選擇方法除盡。
以藉由正向或負向選擇單離所欲細胞族群而言，細胞及表面(例如顆粒諸如珠)的濃度可變化。在一些實施例中，所欲的是顯著降低珠與細胞混合在一起的體積(即增加細胞濃度)，以確保細胞與珠的最大接觸。例如，在一些實施例中，使用約20億個細胞/mL的濃度。在一些實施例中，使用約10億個細胞/mL的濃度。在一些實施例中，使用大於約1億個細胞/mL。在一些實施例中，使用約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千萬個細胞/mL中任一者的細胞濃度。在一些實施例中，使用約7.5、8、8.5、9、9.5千萬個或1億個細胞/mL中任一者的細胞濃度。在一些實施例中，使用約1.25或約1.5億個細胞/mL的濃度。使用高濃度可導致增加的細胞產率、細胞活化及細胞擴增。另外，使用高細胞濃度允許更有效地捕捉可能微弱表現受到關注之目標抗原的細胞，諸如CD28陰性T細胞，或自其中有許多腫瘤細胞存在的樣本(即白血病血液、腫瘤組織等)更有效地捕捉細胞。該等細胞族群可能具有治療價值且獲得該等細胞族群是所欲的。例如，使用高濃度的細胞允許更有效地選擇正常具有較微弱CD28表現的CD8+ T細胞。組成物
在某些態樣中，提供一種包含根據任何本文所述之實施例之經修改的T細胞之組成物(例如醫藥組成物)，該經修改的T細胞包含抗原及佐劑。在一些實施例中，組成物係一種包含經修改的T細胞及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。用於調節免疫反應之方法
在某些態樣中，提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含向該個體投予根據任何本文所述之實施例之經修改的T細胞、根據任何本文所述之實施例之組成物或根據任何本文所述之實施例之醫藥組成物。
在某些態樣中，提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約1 pM至10 mM之間及/或與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原對佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約10 mM之間。例如，在一些實施例中，與經擾動的T細胞培育之佐劑濃度係小於約1 pM、約10 pM、約100 pM、約1 nM、約10 nM、約100 nM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM、或約10 mM中任一者。在一些實施例中，與經擾動的T細胞培育之佐劑濃度係大於約10 mM。在一些實施例中，與經擾動的T細胞培育之抗原濃度係介於約1 pM與約10 pM之間、介於約10 pM與約100 pM之間、介於約100 pM與約1 nM之間、介於約1 nM與約10 nM之間、介於約10 nM與約100 nM之間、介於約100 nM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於約1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施例中，與經擾動的T細胞培育之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000:1與約1:10000之間中任一者。例如，在一些實施例中，與經擾動的T細胞培育之抗原對佐劑之莫耳比係約10000:1、約1000:1、約100:1、約10:1、約1:1、約1:10、約1:100、約1:1000或約1:10000中任一者。在一些實施例中，與經擾動的T細胞培育之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000:1與約1000:1之間、介於約1000:1與約100:1之間、介於約100:1與約10:1之間、介於約10:1與約1:1之間、介於約1:1與約1:10之間、介於約1:10與約1:100之間、介於約1:100與約1:1000之間、介於約1:1000與約1:10000之間中任一者。在一些實施例中，抗原及/或佐劑係包封於奈米粒子中。
在某些態樣中，提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。在一些實施例中，抗原係包封於奈米粒子中。
在某些態樣中，提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含抗原，其中該抗原包含免疫原性表位，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。在一些實施例中，佐劑係包封於奈米粒子中。
在一些實施例中，根據任何採用經修改的T細胞之用於調節免疫反應的方法，該經修改的T細胞包含抗原及佐劑。在一些實施例中，經修改的T細胞包含抗原的濃度介於約1 pM與約10 mM之間。在一些實施例中，經修改的T細胞包含佐劑的濃度介於約1 pM與約10 mM之間。在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原對佐劑之比例係介於約10000:1與約1:10000之間。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
在某些態樣中，提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)向該個體投予包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列；及b)向該個體投予佐劑。在一些實施例中，佐劑與經修改的T細胞係同期或同時投予。在一些實施例中，佐劑及經修改的T細胞係依序投予。在一些實施例中，佐劑係於投予經修改的T細胞之前投予。在一些實施例中，佐劑係於投予經修改的T細胞之後投予。在一些實施例中，佐劑係經全身性投予，例如靜脈投予。在一些實施例中，佐劑係經局部投予，例如腫瘤內投予。在一些實施例中，佐劑不含有在細胞中，例如佐劑係游離在溶液中。在一些實施例中，佐劑係含有在細胞諸如T細胞中。在一些實施例中，佐劑係根據任何本文所述之細胞內投遞方法投遞至T細胞中。在一些實施例中，包含抗原之經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：c)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著細胞懸浮液中輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞；及d)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原之該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。在一些實施例中，抗原係包封於奈米粒子中。在一些實施例中，該經修改的T細胞進一步包含佐劑。在一些實施例中，含有在經修改的T細胞中之佐劑及步驟b)之佐劑係相同化合物。在一些實施例中，含有在經修改的T細胞中之佐劑及步驟b)之佐劑係不同化合物。
在某些態樣中，提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原之經修改的T細胞；c)向該個體投予該經修改的T細胞；及d)向該個體投予佐劑。在一些實施例中，佐劑與經修改的T細胞係同期或同時投予。在一些實施例中，佐劑及經修改的T細胞係依序投予。在一些實施例中，佐劑係於投予經修改的T細胞之前投予。在一些實施例中，佐劑係於投予經修改的T細胞之後投予。在一些實施例中，佐劑係經全身性投予，例如靜脈投予。在一些實施例中，佐劑係經局部投予，例如腫瘤內投予。在一些實施例中，佐劑不含有在細胞中，例如佐劑係游離在溶液中。在一些實施例中，佐劑係含有在細胞諸如T細胞中。在一些實施例中，佐劑係根據任何本文所述之細胞內投遞方法投遞至T細胞中。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之抗原的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。在一些實施例中，抗原係包封於奈米粒子中。
在一些實施例中，根據任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該免疫反應係經增強。在一些實施例中，該增強的免疫反應係針對該抗原。
在一些實施例中，根據任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該方法採用使輸入T細胞通過其中的細胞變形縊縮。在一些實施例中，縊縮之直徑係小於該輸入T細胞之直徑。在一些實施例中，縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約99%。在一些實施例中，縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約60%。在一些實施例中，細胞變形縊縮包含在微流體通道中，諸如本文所述之任何微流體通道。微流體通道可含有在任何本文所述之微流體裝置中，諸如以下標題「微流體裝置」一節中所述。因此，在一些實施例中，根據採用使輸入T細胞通過包括細胞變形縊縮之微流體通道之任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該方法包含使輸入T細胞通過任何本文所述之微流體系統含有的包括細胞變形縊縮之微流體通道。在一些實施例中，變形力係於輸入T細胞通過縊縮時施加至輸入T細胞，藉此造成輸入T細胞之擾動。
在一些實施例中，根據任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該方法採用經修改的T細胞，該經修改的T細胞包含抗原及佐劑。在一些實施例中，該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。在一些實施例中，該囊泡係胞內體。在一些實施例中，該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。在一些實施例中，該抗原或免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞或天然殺手T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞或γδ-T細胞。
在一些實施例中，根據任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該方法採用經修改的T細胞，該經修改的T細胞包含佐劑。在一些實施例中，該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑或聚I:C。在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，該CpG ODN的長度係不大於約50個(諸如不大於約45、40、35、30、25、20或更少個中任一者)核苷酸。在一些實施例中，該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。在一些實施例中，該CpG ODN包含SEQ ID NO: 26至37中任一者之核苷酸序列。在一些實施例中，該CpG ODN包含SEQ ID NO:30之核苷酸序列。在一些實施例中，該CpG ODN包含SEQ ID NO:31之核苷酸序列。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複數個不同的CpG ODN。例如，在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複數個選自A型、B型及C型CpG ODN之不同的CpG ODN。
例示性佐劑包括但不限於干擾素基因刺激子(STING)促效劑、視黃酸可誘導基因I (RIG-I)促效劑及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及/或TLR9之促效劑。例示性佐劑包括但不限於CpG ODN、干擾素-α(IFN-α)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(R837)、雷西喹莫特(resiquimod) (R848)或脂多醣(LPS)。在一些實施例中，佐劑係CpG ODN、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑。在具體實施例中，佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，佐劑係CpG ODN。在一些實施例中，該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。在一些實施例中，CpG ODN佐劑包含來自CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03之群組的選擇。在一些實施例中，CpG ODN佐劑係CpG ODN 1826 (SEQ: TCCATGACGTTCCTGACGTT)或CpG ODN 2006(亦稱為CpG ODN 7909)(SEQ: TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)寡核苷酸。在一些實施例中，該佐劑係CpG ODN 7909。在一些實施例中，RIG-I促效劑包含聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyI:C)。多種佐劑亦可搭配抗原使用以增強免疫反應的誘發。在一些實施例中，經修改的PBMC包含超過一種佐劑。多種佐劑亦可搭配抗原使用以增強免疫反應的誘發。在一些實施例中，經修改的PBMC包含超過一種佐劑。在一些實施例中，經修改的PBMC包含佐劑CpG ODN、LPS、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、R837、R848、TLR3促效劑、TLR4促效劑或TLR 9促效劑之任何組合。
在任何本文所述之實施例中，除非以其他方式指示，否則佐劑可指(a)與經擾動的輸入T細胞培育且通過其之佐劑、或(b)與經修改的T細胞共投至個體之佐劑。
在一些實施例中，根據任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該方法採用包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含免疫原性表位。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自疾病相關抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自在疾病細胞中異位地表現或過度表現的蛋白質。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自新抗原，例如癌症相關新抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位包含新表位，例如癌症相關新表位。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自非自身抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自經突變或以其他方式改變之自身抗原。在一些實施例中，該免疫原性表位係衍生自腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。在一些實施例中，抗原包含複數個免疫原性表位。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中的一些係衍生自相同來源。例如，在一些實施例中，複數個免疫原性表位中的一些係衍生自相同病毒抗原。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中所有皆衍生自相同來源。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中無一衍生自相同來源。在一些實施例中，經修改的T細胞包含複數個不同的抗原。
在一些實施例中，根據採用包含抗原之經修改的T細胞之任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該抗原包含免疫原性表位，該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。在一些實施例中，免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。在一些實施例中，與該N端側接多肽及/或該C端側接多肽融合之該免疫原性肽表位係非天然發生序列。在一些實施例中，該N端及/或C端側接多肽係衍生自免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施例中，該N端及/或C端側接多肽係衍生自疾病相關免疫原性SLP。在一些實施例中，該N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，根據採用包含抗原之經修改的T細胞之任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該抗原包含免疫原性表位，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自人類乳突病毒(HPV)抗原。在一些實施例中，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73及82中任一者。在一些實施例中，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自HPV-16抗原或HPV-18抗原。在進一步實施例中，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自HPV E6抗原(例如，HPV-16或HPV-18 E6抗原)或HPV E7抗原(例如，HPV-16或HPV-18 E7抗原)。在一些實施例中，該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。在一些實施例中，抗原包含HPV-16 E6蛋白質介於殘基29與38之間的片段(即HPV-16 E629-38 )。在一些實施例中，抗原包含HPV-16 E6蛋白質介於殘基48與57之間的片段(即HPV-16 E648-57 )。在一些實施例中，抗原包含HPV-16 E7蛋白質介於殘基11與20之間的片段(即HPV-16 E711-20 )。在一些實施例中，抗原包含HPV-16 E7蛋白質介於殘基49與57之間的片段(即HPV-16 E749-57 )。在一些實施例中，抗原包含SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原包含經N端多肽(其包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列)及C端多肽(其包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列)側接的SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，根據採用包含抗原之經修改的T細胞之任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該抗原包含免疫原性表位，該抗原或其中含有的免疫原性表位係衍生自人類巨細胞病毒(HCMV)抗原。在一些實施例中，HCMV係AD169株或Merlin HCMV株。在一些實施例中，抗原包含衍生自HCMV pUL83之HLA-A2限制肽。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。在一些實施例中，在向個體投予包含該複數個抗原的該經修改的T細胞之後，其中該複數個抗原包含該複數個免疫原性表位，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。在一些實施例中，該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。在一些實施例中，免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。在一些實施例中，該抗原係包含免疫原性肽表位及一或多個異源性肽序列之多肽。在一些實施例中，該抗原係包含在N端及/或C端側接異源性肽序列的免疫原性肽表位之多肽。在一些實施例中，該側接異源性肽序列係衍生自疾病相關免疫原性肽。
在一些實施例中，根據採用包含抗原之經修改的T細胞之任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該抗原包含免疫原性表位，該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。在一些實施例中，抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽。在一些實施例中，抗原能夠被處理成MHC第二型限制肽。在一些實施例中，抗原包含複數個免疫原性表位，且能夠被處理成MHC第一型限制肽及MHC第二型限制肽。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中的一些係衍生自相同來源。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中所有皆衍生自相同來源。在一些實施例中，複數個免疫原性表位中無一衍生自相同來源。
在一些實施例中，根據採用經修改的T細胞之任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該經修改的T細胞包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。在一些實施例中，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。
在一些實施例中，根據採用經修改的T細胞之任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該經修改的T細胞包含抗原及佐劑。在一些實施例中，經修改的T細胞包含佐劑的濃度介於約1 pM與約10 mM之間。例如，在一些實施例中，經修改的T細胞中之佐劑濃度係小於約1 pM、約10 pM、約100 pM、約1 nM、約10 nM、約100 nM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM、或約10 mM中任一者。在一些實施例中，經修改的T細胞中之佐劑濃度係大於約10 mM。在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原濃度係介於約1 pM與約10 pM之間、介於約10 pM與約100 pM之間、介於約100 pM與約1 nM之間、介於約1 nM與約10 nM之間、介於約10 nM與約100 nM之間、介於約100 nM與約1 µM之間、介於約1 µM與約10 µM之間、介於約10 µM與約100 µM之間、介於約100 µM與約1 mM之間或介於約1 mM與約10 mM之間中任一者。在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000:1與約1:10000之間中任一者。例如，在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原對佐劑之莫耳比係約10000:1、約1000:1、約100:1、約10:1、約1:1、約1:10、約1:100、約1:1000或約1:10000中任一者。在一些實施例中，經修改的T細胞中之抗原對佐劑之莫耳比係介於約10000:1與約1000:1之間、介於約1000:1與約100:1之間、介於約100:1與約10:1之間、介於約10:1與約1:1之間、介於約1:1與約1:10之間、介於約1:10與約1:100之間、介於約1:100與約1:1000之間、介於約1:1000與約1:10000之間中任一者。在一些實施例中，該經修改的T細胞包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
在一些實施例中，根據採用經修改的T細胞之任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該經修改的T細胞進一步包含藥劑，相較於不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。在一些實施例中，藥劑係穩定劑或輔助因子。在一些實施例中，藥劑係白蛋白。在一些實施例中，白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。在一些實施例中，藥劑係二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。
在一些實施例中，根據採用經修改的T細胞之任何本文所述之用於調節個體之免疫反應的方法，該經修改的T細胞包含進一步修改。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第一型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改，以降低MHC第一型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改，以增加MHC第一型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第二型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改，以降低MHC第二型表現。在一些實施例中，經修改的T細胞包含進一步修改，以增加MHC第二型表現。在一些實施例中，相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修改的T細胞所起始之先天免疫反應係減少。在一些實施例中，相較於不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
在一些實施例中，根據任何本文所述之採用經修改的T細胞之用於調節個體之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，該經修改的T細胞對該個體係同種異體。在一些實施例中，該經修改的T細胞對該個體係自體。在一些實施例中，該個體係經預先調理以調節發炎及/或免疫反應。在一些實施例中，該個體係經預先調理以降低發炎及/或免疫反應。在一些實施例中，該個體係經預先調理以增加發炎及/或免疫反應。在一些實施例中，向該個體投予該經修改的T細胞導致對該抗原具特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活化及/或擴增。在一些實施例中，向該個體投予該經修改的T細胞導致對該抗原具特異性的輔助T (Th)細胞活化及/或擴增。在一些實施例中，向該個體投予之該經修改的T細胞的量係介於約1 x 106 與約1 x 1012 個細胞之間。在一些實施例中，向該個體投予之該經修改的T細胞的量係小於約1 x 106 、1 x 107 、1 x 108 、1 x 109 、1 x 1010 、1 x 1011 及約1 x 1012 個細胞中任一者。在一些實施例中，向該個體投予之該經修改的T細胞的量係介於約1 x 106 與1 x 107 、1 x 107 與1 x 108 、1 x 108 與1 x 109 、1 x 109 與1 x 1010 、1 x 1010 與1 x 1011 及1 x 1011 與1 x 1012 個細胞之間中任一者。在一些實施例中，方法包含多次投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，方法包含約2、3、4、5、6、7、8、9、10次或超過約10次投予中任一者。在一些實施例中，該經修改的T細胞之二次連續投予之間的時間間隔係介於約1天與約1個月之間。在一些實施例中，投予係每天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每週一次、每二週一次或每個月一次。在一些實施例中，連續投予係給予至多一年或更久。
在一些實施例中，根據任何本文所述之採用經修改的T細胞之用於調節個體之免疫反應的方法，該方法進一步包含向該個體投予第二佐劑。在一些實施例中，第二佐劑係經全身性投予，例如靜脈投予。在一些實施例中，第二佐劑係經局部投予，例如腫瘤內投予。在一些實施例中，第二佐劑不含有在細胞中，例如第二佐劑係游離在溶液中。在一些實施例中，第二佐劑係IFN-α或CpG ODN。在一些實施例中，含有在經修改的T細胞中之佐劑及第二佐劑係相同化合物。例如，在實施例中，經修改的T細胞包含CpG ODN，且第二佐劑也是CpG ODN。在一些實施例中，含有在經修改的T細胞中之佐劑及第二佐劑係不同化合物。例如，在一些實施例中，經修改的T細胞包含CpG ODN，且第二佐劑係IFN-α。在一些實施例中，經修改的T細胞及第二佐劑係同期或同時投予。在一些實施例中，該經修改的T細胞及該第二佐劑係依序投予。在一些實施例中，經修改的T細胞係於投予第二佐劑之前投予。在一些實施例中，該經修改的T細胞係於投予該第二佐劑之後投予。
在一些實施例中，根據任何本文所述之採用經修改的T細胞之用於調節個體之免疫反應的方法，該方法進一步包含向該個體投予免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，經修改的T細胞及免疫檢查點抑制劑係向個體同期投予。在一些實施例中，經修改的T細胞及免疫檢查點抑制劑係向個體同時投予。在一些實施例中，經修改的T細胞及免疫檢查點抑制劑係向個體依序投予。在一些實施例中，經修改的T細胞係於向個體投予免疫檢查點抑制劑之後向個體投予。在一些實施例中，經修改的T細胞係於向個體投予免疫檢查點抑制劑之前向個體投予。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4及TIM-3中任一者。例示性免疫檢查點抑制劑靶向(但不限於)PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3中之一或多者。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係以下一或多者：與PD-1結合之抗體、與PD-L1結合之抗體、與CTLA-4結合之抗體、與LAG3結合之抗體或與TIM-3結合之抗體。在進一步實施例中，抗體可為全長抗體或任何變體，例如但不限於抗體片段、單鏈可變片段(ScFv)或抗原結合片段(Fab)。在進一步實施例中，抗體可為雙特異性、三特異性或多特異性。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係與PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3中之一或多者結合及/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3中之一或多者之一或多種化學化合物。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係與PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3中之一或多者結合及/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3中之一或多者之一或多種肽。
其他例示性免疫檢查點抑制劑靶向(但不限於)TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑靶向TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係以下一或多者：與TIGIT結合之抗體、與VISTA結合之抗體、與TIM1結合之抗體、與B7-H4 (VTCN1)結合之抗體或與BTLA結合之抗體。在進一步實施例中，抗體可為全長抗體或任何變體，例如但不限於抗體片段、單鏈可變片段(ScFv)或抗原結合片段(Fab)。在進一步實施例中，抗體可為雙特異性、三特異性或多特異性。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係與PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者結合及/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者之一或多種化學化合物。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係與PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者結合及/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者之一或多種肽。
化學療法可與任何本文所述之經修改的T細胞組合使用，以達成對抗癌症(例如HPV相關癌症)之加成或協同效應。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係與化學療法之投予組合投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物及化學療法係同時投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物及化學療法係依序投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係與化學療法之投予組合並與免疫檢查點抑制劑組合投予。
在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予化學療法之前投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予化學療法之後投予。例如，包含經修改的T細胞之組成物係於投予化學療法之前約1小時至約1週投予。例如，在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予化學療法之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予化學療法之前自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予化學療法之後投予。例如，包含經修改的T細胞之組成物係於投予化學療法之後約1小時至約1週投予。例如，在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予化學療法之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予化學療法之後自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施例中，方法包含多次投予包含經修改的T細胞之組成物及/或多次投予化學療法。例如，在一些實施例中，方法包含二次投予、三次投予、四次投予、五次投予、六次投予、七次投予、八次投予、九次投予、十次投予、十一次投予、十二次投予、十三次投予、十四次投予或十五次投予包含經修改的T細胞之組成物及/或化學療法。例如，在一些實施例中，方法包含小於五次投予、小於十次投予、小於十五次投予、小於二十次投予、小於二十五次投予、小於三十次投予、小於五十次投予、小於七十五次投予、小於一百次或小於二百次投予包含經修改的T細胞之組成物及/或化學療法。
例示性化學療法可為細胞週期依賴性或細胞週期非依賴性。在一些實施例中，化學療法包含一或多種化學治療劑。在一些實施例中，化學治療劑可靶向細胞分裂、DNA或癌症代謝中之一或多者。在一些實施例中，化學治療劑係鉑基底藥劑，諸如但不限於順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)或卡鉑(carboplatin)。在一些實施例中，化學治療劑係紫杉烷(諸如多西他賽(docetaxel)或太平洋紫杉醇(paclitaxel))。在一些實施例中，化學治療劑係5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、多柔比星(doxorubicin)或伊立替康(irinotecan)。在一些實施例中，化學治療劑係以下一或多種：烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑或有絲分裂抑制劑。在一些實施例中，化學療法包含順鉑。
放射療法可與任何本文所述之經修改的T細胞組合使用，以達成對抗癌症(例如HPV相關癌症)之加成或協同效應。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係與放射療法之投予組合投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物及放射療法係同時投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物及放射療法係依序投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係與放射療法之投予組合、與化學療法組合及/或與免疫檢查點抑制劑組合投予。
在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予放射療法之前投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予放射療法之後投予。例如，包含經修改的T細胞之組成物係於投予放射療法之前約1小時至約1週投予。例如，在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予放射療法之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予放射療法之前自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予放射療法之後投予。例如，包含經修改的T細胞之組成物係於投予放射療法之後約1小時至約1週投予。例如，在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予放射療法之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投予。在一些實施例中，包含經修改的T細胞之組成物係於投予放射療法之後自介於約1小時與約2小時之間、自介於約2小時與約3小時之間、自介於約3小時與約4小時之間、自介於約4小時與約6小時之間、自介於約6小時與約8小時之間、自介於約8小時與約10小時之間、自介於約10小時與約12小時之間、自介於約12小時與約14小時之間、自介於約14小時與約16小時之間、自介於約16小時與約18小時之間、自介於約18小時與約20小時之間、自介於約20小時與約24小時之間、自介於約24小時與約30小時之間、自介於約30小時與約36小時之間、自介於約36小時與約42小時之間、自介於約42小時與約48小時之間、自介於約48小時與約60小時之間、自介於約60小時與約3天之間、自介於約3天與約4天之間、自介於約4天與約5天之間、自介於約5天與約6天之間、自介於約6天與約7天之間投予。
在一些實施例中，方法包含多次投予包含經修改的T細胞之組成物及/或多次投予放射療法。例如，在一些實施例中，方法包含二次投予、三次投予、四次投予、五次投予、六次投予、七次投予、八次投予、九次投予、十次投予、十一次投予、十二次投予、十三次投予、十四次投予或十五次投予包含經修改的T細胞之組成物及/或放射療法。例如，在一些實施例中，方法包含小於五次投予、小於十次投予、小於十五次投予、小於二十次投予、小於二十五次投予、小於三十次投予、小於五十次投予、小於七十五次投予、小於一百次或小於二百次投予包含經修改的T細胞之組成物及/或放射療法。
在某些態樣中，提供一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：向個體投予與抗原相關之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞藉由包含下列步驟之製程製備：a)使輸入T細胞與i )抗原、或ii )抗原及佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原與該輸入T細胞之細胞表面連結，其中該抗原包含免疫原性表位，藉此產製與抗原相關之經修改的T細胞；及b)向該個體投予該經修改的T細胞。
在某些態樣中，提供一種用於醫學治療方法中之經修改的T細胞，該方法包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含抗原，其中該抗原包含免疫原性表位，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。在一些實施例中，佐劑係包封於奈米粒子中。
在某些態樣中，提供一種用於治療個體的癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病之經修改的T細胞，該方法包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含抗原，其中該抗原包含免疫原性表位，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。在一些實施例中，抗原係與癌症、傳染性疾病或病毒相關疾病相關。在一些實施例中，與經擾動的輸入T細胞培育之佐劑的濃度係介於約1 pM至10 mM之間。在一些實施例中，佐劑係包封於奈米粒子中。
在一些實施例中，本發明之經修改的T細胞不誘導個體的耐受性。在一些實施例中，經修改的T細胞不壓制個體的免疫反應。在一些實施例中，經修改的T細胞不包含耐受原(tolerogenic)因子。在一些實施例中，經修改的T細胞不與耐受原因子組合投予。在一些實施例中，經修改的T細胞不在投予耐受原因子之前、之同時或之後投予。 抗原
在一些實施例中，本發明採用抗原投遞以調節免疫反應，其中抗原係藉由任何本文所述之方法投遞至T細胞。在一些實施例中，抗原係單一抗原。在一些實施例中，抗原係抗原的混合物。抗原係一種刺激特異性免疫反應諸如細胞或抗體媒介之免疫反應的物質。抗原與免疫細胞表現之受體結合，諸如對特定抗原具有特異性之T細胞受體(TCR)。抗原-受體結合後續引發細胞內傳訊途徑，導致下游免疫效應細胞途徑，諸如細胞活化、細胞介素產生、細胞遷移、細胞毒性因子分泌及抗體產生。
在一些實施例中，抗原係多肽抗原。在一些實施例中，抗原係疾病相關抗原。在一些實施例中，抗原係衍生自外來來源，諸如細菌、真菌、病毒或過敏原。在一些實施例中，抗原係衍生自內在來源，諸如自身蛋白質(即自身抗原)或一部分的自身蛋白質。在一些實施例中，該抗原係經突變或以其他方式改變之自身抗原。在一些實施例中，抗原係腫瘤抗原。在一些實施例中，抗原係在細胞溶解物中。自身抗原係存在於有機體自己的細胞之上或之中的抗原。自身抗原正常不刺激免疫反應，但在自體免疫疾病的情況中(諸如第一型糖尿病或類風濕性關節炎)或當過度表現或異常/異位地表現時可能會。
在一些實施例中，抗原係與病毒相關。在一些實施例中，抗原係病毒抗原。例示性病毒抗原包括HPV抗原、HCMV抗原、SARS-CoV抗原及流感抗原。
在一些實施例中，抗原係與微生物(例如細菌)相關。在一些實施例中，經調節的免疫反應包含增加對微生物(例如細菌)的致病性免疫反應。
在某些態樣中，本發明採用用於投遞抗原至T細胞中之方法，該方法包含使包含T細胞之細胞懸浮液通過縊縮，其中該縊縮使T細胞變形，藉此造成細胞的擾動以使抗原進入細胞，其中該細胞懸浮液與抗原接觸。在一些實施例中，抗原係於體外(in vitro )、離體(ex vivo )或體內(in vivo )投遞至T細胞。
在一些實施例中，待投遞的抗原係經純化。在一些實施例中，抗原係至少約60重量%(乾重)受到關注之抗原。在一些實施例中，經純化的抗原係至少約75%、90%或99%受到關注之抗原。在一些實施例中，經純化的抗原係至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、98%、99%或100% (w/w)受到關注之抗原。純度係藉由任何已知方法判定，包括但不限於管柱層析法、薄層層析法(TLC)、高效液相層析法(HPLC)、核磁共振(NMR)光譜學、質譜法或SDS-PAGE凝膠電泳。經純化的DNA或RNA係定義為不含外源性核酸、碳水化合物及脂質之DNA或RNA。 佐劑
佐劑可用於加強免疫細胞反應(例如T細胞反應)，諸如對抗原的免疫反應。多種佐劑亦可用於增強免疫反應，且可搭配抗原使用，以例如相較於對單獨抗原之免疫反應，增強對抗原之免疫反應。在一些實施例中，本發明採用佐劑投遞以增強免疫反應，其中佐劑係藉由任何本文所述之方法投遞至T細胞。在一些實施例中，佐劑增強對抗原之免疫反應。例如，佐劑可促進抗原呈現細胞對抗原的免疫原性呈現。在一些實施例中，佐劑係與抗原同時導入。在一些實施例中，佐劑及抗原係依序導入。在一些實施例中，佐劑係在導入抗原之前導入。在一些實施例中，佐劑係在導入抗原之後導入。在一些實施例中，相較於在佐劑不存在下的T細胞歸巢，佐劑改變T細胞歸巢(例如，T細胞歸巢至目標組織，諸如腫瘤)。在一些實施例中，相較於在佐劑不存在下的T細胞增生，佐劑增加T細胞增生。
在某些態樣中，本發明採用用於自輸入T細胞產製包含抗原之免疫原性抗原呈現T細胞之方法，其中輸入T細胞通過縊縮，其中該縊縮使輸入T細胞變形，藉此造成細胞的擾動以使抗原進入輸入T細胞，藉此產製包含抗原之免疫原性抗原呈現T細胞。
在某些態樣中，本發明採用用於投遞佐劑至T細胞中之方法，該方法包含使包含T細胞之細胞懸浮液通過縊縮，其中該縊縮使T細胞變形，藉此造成T細胞的擾動以使佐劑進入細胞，其中該細胞懸浮液與佐劑接觸。在一些實施例中，佐劑係於體外、離體或體內投遞至T細胞中。微流體系統及其組分 微流體通道提供細胞變形縊縮
在一些實施例中，本發明提供藉由使包含T細胞之細胞懸浮液通過縊縮來調節免疫反應之方法，其中該縊縮使T細胞變形，藉此造成T細胞的擾動以使抗原及/或佐劑進入T細胞，其中該縊縮係含有在微流體通道中。在一些實施例中，多個縊縮可被平行及/或串聯放置在微流體通道中。含有在本文中揭示之方法所使用的細胞變形縊縮之例示性微流體通道係描述於WO2013059343。具有在本文中揭示之方法所使用的孔之例示性表面係描述於WO2017041050。
在一些實施例中，微流體通道包括管腔且經組態以使懸浮於緩衝劑中之T細胞可通過，其中微流體通道包括縊縮。微流體通道可由一些材料中任一者製成，包括矽、金屬(例如不鏽鋼)、塑膠(例如聚苯乙烯)、陶瓷、玻璃、結晶基材、非晶基材或聚合物(例如聚-甲基甲基丙烯酸酯(PMMA)、PDMS、環烯共聚物(COC)等)。微流體通道的製造可藉由任何所屬技術領域中已知方法執行，包括乾蝕刻、濕蝕刻、光微影術、射出成型、雷射剝蝕或SU-8遮罩。
在一些實施例中，微流體通道中之縊縮包括入口部分、中點及出口部分。在一些實施例中，微流體通道中之縊縮的長度、深度及寬度可變化。在一些實施例中，微流體通道中之縊縮之直徑隨著T細胞的直徑變化。在一些實施例中，微流體通道中之縊縮之直徑係T細胞直徑的約20%至約99%。在一些實施例中，縊縮大小係T細胞直徑的約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約99%。在一些實施例中，縊縮大小係T細胞最小橫截面距離的約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約99%。在一些實施例中，通道包含介於約2 μm與約10 μm之間或其間的任何寬度或寬度範圍的縊縮寬度。例如，縊縮寬度可為約2μm、約3μm、約4μm、約5μm、約6μm或約7μm中任一者。在一些實施例中，通道包含約10 µm的縊縮長度及約4 µm的縊縮寬度。通道的橫截面、入口部分、中點及出口部分亦可變化。例如，橫截面的形狀可為環狀、橢圓形、伸長裂縫、正方形、六角形或三角形。入口部分定義縊縮角度，其中縊縮角度經最佳化以減少通道堵塞並經最佳化以增強投遞化合物至T細胞中。出口部分的角度也可變化。例如，出口部分的角度經組態以減少可導致非層流之紊流的可能性。在一些實施例中，入口部分及/或出口部分的壁係直線。在其他實施例中，入口部分及/或出口部分的壁係彎曲。
在一些實施例中，根據任何本文所述之方法或組成物，縊縮之直徑隨著T細胞直徑變化。在一些實施例中，T細胞的直徑係藉由T細胞的最小橫截面距離測量。
在一些實施例中，根據任何本文所述之方法或組成物，縊縮之直徑係輸入T細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，縊縮之直徑係輸入T細胞之平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%或約30%至約45%中任一者。在一些實施例中，縊縮之直徑係輸入T細胞之平均直徑的約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%或約90%至約99%中任一者。在一些實施例中，縊縮之直徑係輸入T細胞之平均直徑的約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%中任一者。
在一些實施例中，根據任何本文所述之方法或組成物，縊縮之直徑係約1.5 µm至約10 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約2 µm至約8 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約2.5 µm至約6 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約3 µm至約5 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約3 µm至約4 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約1.5 µm至約10 µm、約1.75 µm至約9 µm、約2 µm至約8 µm、約2.25 µm至約7 µm、約2.5 µm至約6 µm、約2.75 µm至約5.5 µm、約3 µm至約5 µm、約3 µm至約4 µm、約3.1 µm至約3.9 µm、約3.2 µm至約3.8 µm、約3.3 µm至約3.7 µm或約3.4 µm至約3.6 µm中任一者。在一些實施例中，縊縮之直徑係約1.0 µm、1.2 µm、1.4 µm、1.6 µm、1.8 µm、2.0 µm、2.2 µm、2.4 µm、2.6 µm、2.8 µm、3.0 µm、3.2 µm、3.4 µm、3.6 µm、3.8 µm、4.0 µm、4.2 µm、4.4 µm、4.6 µm、4.8 µm、5.0 µm、5.5 µm、6.0 µm、6.5 µm、7.0 µm、8.0 µm、9.0 µm或約10.0 µm中任一者。在一些實施例中，縊縮之直徑係約3.5 µm。
在一些實施例中，根據任何本文所述之方法或組成物，縊縮之直徑係約3 µm至約15 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約3 µm至約10 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約4 µm至約10 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約4.2 µm至約6 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約4.2 µm至約4.8 µm。在一些實施例中，縊縮之直徑係約2 µm至約14 µm、約4 µm至約12 µm、約6 µm至約9 µm、約4 µm至約6 µm、約4 µm至約5 µm、約3.5 µm至約7 µm、約3.5 µm至約6.3 µm、約3.5 µm至約5.6 µm、約3.5 µm至約4.9 µm、約4.2 µm至約6.3 µm、約4.2 µm至約5.6 µm或約4.2 µm至約4.9 µm中任一者。在一些實施例中，縊縮之直徑係約2 µm、2.5 µm、3 µm、3.5 µm、4 µm、4.5 µm、5 µm、5.5 µm、6 µm、6.5 µm、7 µm、7.5 µm、8 µm、8.5 µm、9 µm、9.5 µm、10 µm、10.5 µm、11 µm、11.5 µm、12 µm、12.5 µm、13 µm、13.5 µm、14 µm、14.5 µm或15 µm中任一者。在一些實施例中，縊縮之直徑係約4.0 µm、4.1 µm、4.2 µm、4.3 µm、4.4 µm、4.5 µm、4.6 µm、4.7 µm、4.8 µm、4.9 µm或5.0 µm中任一者。在一些實施例中，縊縮之直徑係約4.5 µm。
在一些實施例中，根據任何本文所述之方法或組成物，輸入T細胞以介於約0.001 mL/min至約200 mL/min之間的流速或其間的任何速率或速率範圍通過縊縮。在一些實施例中，流速係介於約0.001 mL/min至約175 mL/min、約0.001 mL/min至約150 mL/min、約0.001 mL/min至約125 mL/min、約0.001 mL/min至約100 mL/min、約0.001 mL/min至約50 mL/min、約0.001 mL/min至約25 mL/min、約0.001 mL/min至約10 mL/min、約0.001 mL/min至約7.5 mL/min、約0.001 mL/min至約5.0 mL/min、約0.001 mL/min至約2.5 mL/min、約0.001 mL/min至約1 mL/min、約0.001 mL/min至約0.1 mL/min或約0.001 mL/min至約0.01 mL/min之間。在一些實施例中，流速係介於約0.001 mL/min至約200 mL/min、約0.01 mL/min至約200 mL/min、約0.1mL/min至約200 mL/min、約1 mL/min至約200 mL/min、約10 mL/min至約200 mL/min、約50 mL/min至約200 mL/min、約75 mL/min至約200 mL/min、約100 mL/min至約200 mL/min、約150 mL/min至約200 mL/min、約0.5 mL/min至約200 mL/min、約1 mL/min至約200 mL/min、約2.5 mL/min至約200 mL/min、約5 mL/min至約200 mL/min、約7.5 mL/min至約200 mL/min、約10 mL/min至約200 mL/min、約25 mL/min至約200 mL/min或約175 mL/min至約200 mL/min之間。在一些實施例中，輸入T細胞以介於約10 mL/min至約200 mL/min之間的流速通過縊縮。在一些實施例中，輸入T細胞以約100 mL/min的流速通過縊縮。
在一些實施例中，根據任何本文所述之方法或組成物，縊縮可具有所屬技術領域中已知之任何形狀；例如3維形狀或2維形狀。縊縮的2維形狀諸如橫截面形狀可為但不限於環狀、橢圓形、圓形、正方形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形或八角形。縊縮的3維形狀可為但不限於圓柱狀、錐狀或立方形。在一些實施例中，縊縮的橫截面形狀係長方形。在一些實施例中，縊縮的橫截面形狀係裂縫。在一些實施例中，縊縮的橫截面形狀係包含約2.5 µm至約10 µm的寬度及/或約1 µm至約200 µm的深度的裂縫。在一些實施例中，縊縮的橫截面形狀係包含約3 µm至約6 µm的寬度及/或約40 µm至約120 µm的深度的裂縫。在一些實施例中，縊縮的橫截面形狀係包含約3.2 µm至約4 µm的寬度及/或約20 µm至約80 µm的深度的裂縫。在一些實施例中，縊縮的橫截面形狀係包含約3.5 µm的寬度及/或約80 µm的深度的裂縫。在其他實施例中，縊縮的橫截面形狀係包含約4 µm至約10 µm的寬度及/或約1 µm至約200 µm的深度的裂縫。在一些實施例中，縊縮的橫截面形狀係包含約4.2 µm至約6 µm的寬度及/或約40 µm至約120 µm的深度的裂縫。在一些實施例中，縊縮的橫截面形狀係包含約4.2 µm至約6 µm的寬度及/或約20 µm至約80 µm的深度的裂縫。在一些實施例中，縊縮的橫截面形狀係包含約4.5 µm的寬度及/或約80 µm的深度的裂縫。在一些實施例中，裂縫包含約10 µm至約30 µm的長度。在一些實施例中，裂縫包含約2 µm至約50 µm的長度。在一些實施例中，裂縫包含約2 µm至約5 µm、約5 µm至約10 µm、約10 µm至約15 µm、約15 µm至約20 µm、約20 µm至約25 µm、約25 µm至約30 µm、約30 µm至約35 µm、約35µm至約40 µm、約40 µm至約45 µm或約45µm至約50 µm中任一者的長度。在一些實施例中，裂縫包含約10 µm的長度。 具有孔的表面提供細胞變形縊縮
在一些實施例中，本發明提供藉由使包含T細胞之細胞懸浮液通過縊縮來調節免疫反應之方法，其中該縊縮使T細胞變形，藉此造成T細胞的擾動以使抗原及/或佐劑進入T細胞，其中該縊縮係孔或含有在孔中。在一些實施例中，孔係含有在表面中。具有在本文中揭示之方法所使用的孔之例示性表面係描述於WO2017041050。
在本文中揭示之表面可由一些材料中任一者製成且採取一些形式中任一者。在一些實施例中，表面係過濾器。在一些實施例中，表面係膜。在一些實施例中，過濾器係切向流過濾器。在一些實施例中，表面係海綿或海綿樣基質。在一些實施例中，表面係基質。
在一些實施例中，表面係曲折路徑表面。在一些實施例中，曲折路徑表面包含乙酸纖維素。在一些實施例中，表面包含選自但不限於合成或天然聚合物、聚碳酸酯、矽、玻璃、金屬、合金、硝酸纖維素、銀、乙酸纖維素、尼龍、聚酯、聚醚碸、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合纖維素酯、瓷及陶瓷的材料。
在本文中揭示之表面可具有所屬技術領域中已知之任何形狀；例如3維形狀。表面的2維形狀可為但不限於環狀、橢圓形、圓形、正方形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形或八角形。在一些實施例中，表面係圓形形狀。在一些實施例中，表面3維形狀係圓柱狀、錐狀或立方形。
表面可具有各種橫截面寬度及厚度。在一些實施例中，表面橫截面寬度係介於約1 mm與約1 m之間或其間的任何橫截面寬度或橫截面寬度範圍。在一些實施例中，表面具有定義厚度。在一些實施例中，表面厚度係均勻。在一些實施例中，表面厚度係可變。例如，在一些實施例中，表面的部分比起表面的其他部分更厚或更薄。在一些實施例中，表面厚度變化約1%至約90%或其間的任何百分比或百分比範圍。在一些實施例中，表面係介於約0.01 µm至約5 mm厚之間或其間的任何厚度或厚度範圍。
在一些實施例中，縊縮係孔或含有在孔中。孔的橫截面寬度與待處理的T細胞之類型有關。在一些實施例中，孔大小隨著待處理的T細胞或T細胞叢聚的直徑變化。在一些實施例中，孔大小使得T細胞通過該孔時受到擾動。在一些實施例中，孔大小係小於T細胞之直徑。在一些實施例中，孔大小係T細胞之直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，孔大小係T細胞直徑的約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約99%。最佳孔大小或孔橫截面寬度可基於應用及/或T細胞類型變化。在一些實施例中，孔大小係約2 µm至約14 µm。在一些實施例中，孔大小係約2 µm、約3 µm、約4 µm、約5 µm、約8 µm、約10 µm、約12 µm或約14 µm。在一些實施例中，橫截面寬度係約2 µm至約14 µm。在一些實施例中，孔橫截面係約2 µm、約3 µm、約4 µm、約5 µm、約8 µm、約10 µm、約12 µm或約14 µm。
孔通道的入口及出口可具有多種角度。可選擇孔的角度，以最小化當T細胞通過孔時的堵塞。在一些實施例中，通過表面的流速係介於約0.001 mL/cm2 /sec至約100 L/cm2 /sec之間或其間的任何速率或速率範圍。例如，入口或出口部分的角度可介於約0與約90度之間。在一些實施例中，入口或出口部分可大於90度。在一些實施例中，孔具有相同的入口及出口角度。在一些實施例中，孔具有不同的入口及出口角度。在一些實施例中，孔邊緣係平滑，例如圓化或彎曲。平滑孔邊緣具有連續、扁平且平整的表面，沒有突起、嵴或不平整部分。在一些實施例中，孔邊緣係銳利。銳利孔邊緣具有尖的或呈銳角的薄邊緣。在一些實施例中，孔通道係直的。直孔通道不含有彎曲、折彎、角度或其他不規則。在一些實施例中，孔通道係彎曲。彎曲孔通道彎被折彎或偏離直線。在一些實施例中，孔通道具有多個彎曲，例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個彎曲。
孔可具有所屬技術領域中已知之任何形狀，包括2維或3維形狀。孔形狀(例如橫截面形狀)可為但不限於環狀、橢圓形、圓形、正方形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形及八角形。在一些實施例中，孔的橫截面係圓形形狀。在一些實施例中，孔的3維形狀係圓柱狀或錐狀。在一些實施例中，孔具有波形入口及出口形狀。在一些實施例中，在給定表面內的孔之孔形狀係同質性(即一致或規則)。在一些實施例中，在給定表面內的孔之孔形狀係異質性(即混合或變化)。
本文所述之表面可具有各種孔總數。在一些實施例中，孔涵蓋約10%至約80%的總表面積。在一些實施例中，表面含有約1.0x105 至約1.0x1030 個孔總數或其間的任何數量或數量範圍。在一些實施例中，表面包含介於約10與約1.0x1015 個孔/mm2 表面積。
孔可以許多方式分布在給定表面內。在一些實施例中，孔係平行分布在給定表面內。在一該實例中，孔在給定表面內係以相同方向並排分布且相隔相同距離。在一些實施例中，孔分布係有順序或同質性。在一該實例中，孔在給定表面內係以規則、系統性模式分布或相隔相同距離。在一些實施例中，孔分布係隨機或異質性。在一該實例中，孔在給定表面內係以不規則、無序模式分布或相隔不同距離。在一些實施例中，多個表面係以系列分布。多個表面的表面大小、形狀及/或粗糙度可為同質性或異質性。多個表面可進一步含有具有同質性或異質性孔大小、形狀及/或數量的孔，藉此得以同時投遞各種化合物至不同T細胞類型中。
在一些實施例中，個別孔具有均勻的寬度尺寸(即，沿著孔通道的長度為恆定寬度)。在一些實施例中，個別孔具有可變的寬度(即，沿著孔通道的長度增加或降低寬度)。在一些實施例中，在給定表面內的孔具有相同的個別孔深度。在一些實施例中，在給定表面內的孔具有不同的個別孔深度。在一些實施例中，孔係彼此緊鄰。在一些實施例中，孔係彼此分離一距離。在一些實施例中，孔係彼此分離約0.001 µm至約30 mm的距離或其間的任何距離或距離範圍。
在一些實施例中，表面係經材料塗佈。材料可選自任何所屬技術領域中已知之材料，包括但不限於鐵氟龍、黏著劑塗層、界面活性劑、蛋白質、黏著性分子、抗體、抗凝血劑、調節細胞功能之因子、核酸、脂質、碳水化合物或跨膜蛋白質。在一些實施例中，表面係經聚乙烯吡咯烷酮(PVP)塗佈。在一些實施例中，材料係共價連接至表面。在一些實施例中，材料係非共價連接或吸附至表面。在一些實施例中，當T細胞通過孔時，表面分子係經釋放。
在一些實施例中，表面具有經修改的化學性質。在一些實施例中，表面係極性。在一些實施例中，表面係親水性。在一些實施例中，表面係非極性。在一些實施例中，表面係疏水性。在一些實施例中，表面係帶電。在一些實施例中，表面係帶正電及/或帶負電。在一些實施例中，表面可在一些區域帶正電且在其他區域帶負電。在一些實施例中，表面具有整體正電或整體負電。在一些實施例中，表面可為平滑、經電拋光、粗糙或經電漿處理。在一些實施例中，表面包含兩性離子或雙極化合物。在一些實施例中，表面係經電漿處理。
在一些實施例中，表面係含有在較大模組中。在一些實施例中，表面係含有在注射器中，諸如塑膠或玻璃注射器。在一些實施例中，表面係含有在塑膠過濾器固定器中。在一些實施例中，表面係含有在微量吸管尖中。 細胞擾動
在一些實施例中，本發明提供藉由使包含T細胞之細胞懸浮液通過縊縮來調節免疫反應之方法，其中該縊縮使T細胞變形，藉此造成T細胞的擾動以使抗原及/或佐劑進入T細胞，其中T細胞的擾動係允許T細胞外的材料移動至T細胞中的T細胞之缺口(例如洞、裂口、腔、口、孔、破裂、縫隙或穿孔)。變形可藉由例如機械應變及/或剪力造成。在一些實施例中，擾動係T細胞膜內的擾動。在一些實施例中，擾動係短暫的。在一些實施例中，T細胞擾動持續約1.0x10-9 秒至約2小時或其間的任何時間或時間範圍。在一些實施例中，T細胞擾動持續約1.0x10-9 秒至約1秒、約1秒至約1分鐘或約1分鐘至約1小時。在一些實施例中，T細胞擾動持續介於約1.0x10-9 至約1.0x10-1 、約1.0x10-9 至約1.0x10-2 、約1.0x10-9 至約1.0x10-3 、約1.0x10-9 至約1.0x10-4 、約1.0x10-9 至約1.0x10-5 、約1.0x10-9 至約1.0x10-6 、約1.0x10-9 至約1.0x10-7 或約1.0x10-9 至約1.0x10-8 秒中任一者之間。在一些實施例中，T細胞擾動持續約1.0x10-8 至約1.0x10-1 、約1.0x10-7 至約1.0x10-1 、約1.0x10-6 至約1.0x10-1 、約1.0x10-5 至約1.0x10-1 、約1.0x10-4 至約1.0x10-1 、約1.0x10-3 至約1.0x10-1 或約1.0x10-2 至約1.0x10-1 秒中任一者。藉由本文所述之方法所產生的T細胞擾動(例如孔或洞)不是因為形成多聚體孔結構(諸如補體或細菌溶血素所產生者)之蛋白質次單位總成形成。
當T細胞通過縊縮時，縊縮暫時授予損傷至T細胞膜，允許材料被動擴散通過擾動。在一些實施例中，T細胞僅變形短暫的時間期間，大約100 μs以最小化經由細胞傳訊機制活化細胞凋亡途徑的機會，儘管其他期間是可能的(例如從數奈秒至數小時不等)。在一些實施例中，T細胞變形約1.0 x10-9 秒至約2小時或其間的任何時間或時間範圍。在一些實施例中，T細胞變形約1.0x10-9 秒至約1秒、約1秒至約1分鐘或約1分鐘至約1小時。在一些實施例中，T細胞變形係介於約1.0x10-9 至約1.0x10-1 、約1.0x10-9 至約1.0x10-2 、約1.0x10-9 至約1.0x10-3 、約1.0x10-9 至約1.0x10-4 、約1.0x10-9 至約1.0x10-5 、約1.0x10-9 至約1.0x10-6 、約1.0x10-9 至約1.0x10-7 或約1.0x10-9 至約1.0x10-8 秒中任一者之間。在一些實施例中，T細胞變形係約1.0x10-8 至約1.0x10-1 、約1.0x10-7 至約1.0x10-1 、約1.0x10-6 至約1.0x10-1 、約1.0x10-5 至約1.0x10-1 、約1.0x10-4 至約1.0x10-1 、約1.0x10-3 至約1.0x10-1 或約1.0x10-2 至約1.0x10-1 秒中任一者。在一些實施例中，使T細胞變形包括使T細胞變形從(但不限於)約1 μs至至少約750 µs不等的時間，例如至少約1 µs、10 μs、50 μs、100 μs、500 μs或750 μs。
在一些實施例中，抗原及/或佐劑進入T細胞中與T細胞通過縊縮及/或T細胞擾動同時發生。在一些實施例中，化合物進入T細胞中發生在T細胞通過縊縮之後。在一些實施例中，化合物進入T細胞中發生在T細胞通過縊縮之後大約數分鐘。在一些實施例中，化合物進入T細胞中發生在T細胞通過縊縮之後約1.0x10-2 秒至至少約30分鐘。例如，化合物進入T細胞中發生在T細胞通過縊縮之後約1.0x10-2 秒至約1秒、約1秒至約1分鐘或約1分鐘至約30分鐘。在一些實施例中，化合物進入T細胞中發生在T細胞通過縊縮之後約1.0x10-2 秒至約10分鐘、約1.0x10-2 秒至約5分鐘、約1.0x10-2 秒至約1分鐘、約1.0x10-2 秒至約30秒、約1.0x10-2 秒至約10秒、約1.0x10-2 秒至約1秒或約1.0x10-2 秒至約0.1秒。在一些實施例中，化合物進入T細胞中發生在T細胞通過縊縮之後約1.0x10-1 秒至約10分鐘、約1秒至約10分鐘、約10秒至約10分鐘、約50秒至約10分鐘、約1分鐘至約10分鐘或約5分鐘至約10分鐘。在一些實施例中，在T細胞通過縊縮之後的擾動在大約T細胞通過縊縮之後約五分鐘之內修正。
在一些實施例中，在通過縊縮之後的細胞存活性係約5%至約100%。在一些實施例中，在通過縊縮之後的細胞存活性係至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，細胞存活性係在T細胞通過縊縮之後約1.0x10-2 秒至至少約10天測量。例如，細胞存活性係在T細胞通過縊縮之後約1.0x10-2 秒至約1秒、約1秒至約1分鐘、約1分鐘至約30分鐘或約30分鐘至約2小時測量。在一些實施例中，細胞存活性係在T細胞通過縊縮之後約1.0x10-2 秒至約2小時、約1.0x10-2 秒至約1小時、約1.0x10-2 秒至約30分鐘、約1.0x10-2 秒至約1分鐘、約1.0x10-2 秒至約30秒、約1.0x10-2 秒至約1秒或約1.0x10-2 秒至約0.1秒測量。在一些實施例中，細胞存活性係在T細胞通過縊縮之後約1.5小時至約2小時、約1小時至約2小時、約30分鐘至約2小時、約15分鐘至約2小時、約1分鐘至約2小時、約30秒至約2小時或約1秒至約2小時測量。在一些實施例中，細胞存活性係在T細胞通過縊縮之後約2小時至約5小時、約5小時至約12小時、約12小時至約24小時或約24小時至約10天測量。 投遞參數
一些參數可影響化合物的投遞至藉由本文所述之方法用於調節免疫反應之T細胞。在一些實施例中，細胞懸浮液在通過縊縮之前、之同時或之後與化合物接觸。T細胞可懸浮在包括待投遞化合物的溶液中通過縊縮，儘管化合物可在T細胞通過縊縮之後添加至細胞懸浮液。在一些實施例中，待投遞的化合物係塗佈在縊縮上。
可影響化合物的投遞至T細胞中之參數實例包括但不限於縊縮的尺寸、縊縮的入口角度、縊縮的表面性質(例如粗糙度、化學修改、親水性、疏水性等)、作業流速(例如通過縊縮的細胞通過時間)、T細胞濃度、細胞懸浮液中的化合物濃度及在通過縊縮之後回收或培育T細胞的時間量可影響投遞化合物進入T細胞中。影響化合物投遞至T細胞中之額外參數可包括T細胞在縊縮中的流速、縊縮中的剪切速率、細胞懸浮液的黏度、垂直於流速之流速組分及在縊縮中的時間。該等參數可經設計以控制化合物的投遞。在一些實施例中，T細胞濃度從約10至至少約1012 個細胞/mL或其間的任何濃度或濃度範圍不等。在一些實施例中，投遞化合物濃度可從約10 ng/mL至約1 g/mL不等或其間的任何濃度或濃度範圍。在一些實施例中，投遞化合物濃度可從約1 pM至至少約2 M不等或其間的任何濃度或濃度範圍。
本揭露之方法所使用的溫度可經調整以影響化合物投遞及細胞存活性。在一些實施例中，方法係在介於約-5℃與約45℃之間執行。例如，方法可在室溫(例如，約20℃)、生理溫度(例如，約37℃)、高於生理溫度(例如，大於約37℃至45℃或更高)或減少溫度(例如，約-5℃至約4℃)或這些例示性溫度之間的溫度下進行。
可利用各種方法驅動T細胞通過縊縮。例如，可藉由泵施加壓力在入口側(例如，壓縮機)、可藉由真空泵施加真空在出口側、可經由管施加毛細作用及/或系統可為重力供給。亦可使用基於位移的流系統(例如，注射泵、蠕動泵、手動注射器或吸量管、活塞等)。在一些實施例中，T細胞藉由正壓或負壓通過縊縮。在一些實施例中，T細胞藉由恆定壓力或可變壓力通過縊縮。在一些實施例中，使用注射器施加壓力。在一些實施例中，壓力係使用氣體施加的正壓(例如來自氣體鋼瓶)。在一些實施例中，使用泵施加壓力。在一些實施例中，泵係蠕動泵或隔膜泵。在一些實施例中，使用真空施加壓力。在一些實施例中，T細胞藉由重力通過縊縮。在一些實施例中，T細胞藉由離心力通過縊縮。在一些實施例中，T細胞藉由毛細壓力通過縊縮。
在一些實施例中，流體流引導T細胞通過縊縮。在一些實施例中，流體流在T細胞通過縊縮之前係紊流。紊流係其中給定點的流速在量值及方向上不穩定變化的流體流。在一些實施例中，通過縊縮的流體流係層流。層流涉及流體中靠近固體界限不間斷的流，其中流在每個點的方向維持恆定。在一些實施例中，流體流在T細胞通過縊縮之後係紊流。T細胞通過縊縮的流速可變化。在一些實施例中，T細胞以均勻的細胞速度通過縊縮。在一些實施例中，T細胞以波動的細胞速度通過縊縮。
在其他實施例中，使用組合處理來調節免疫反應，藉由使包含T細胞之細胞懸浮液通過縊縮，其中該縊縮使T細胞變形，藉此造成T細胞的擾動以使抗原及/或佐劑進入T細胞，例如本文所述之方法，接著暴露至縊縮下游的電場。在一些實施例中，T細胞在通過縊縮之後通過藉由至少一個電極產製的電場。在一些實施例中，電場協助化合物投遞至T細胞內的第二位置，諸如T細胞核。例如，細胞變形縊縮與電場之組合投遞編碼抗體之質體至T細胞中(例如細胞核)，導致重新(de novo )產生抗體。在一些實施例中，一或多個電極靠近細胞變形縊縮以產製電場。在一些實施例中，電場係介於約0.1 kV/m至約100 MV/m之間或其間的任何數量或數量範圍。在一些實施例中，使用積體電路以提供驅動電極的電信號。在一些實施例中，將T細胞暴露至脈衝寬度介於約1 ns至約1 s之間及期間介於約100 ns至約10 s之間或其間的任何時間或時間範圍的電場。 用於投遞至T細胞之細胞懸浮液
細胞懸浮液可為混合或經純化的T細胞族群。在一些實施例中，細胞懸浮液係混合細胞族群，諸如全血。在一些實施例中，細胞懸浮液係經純化的細胞族群，諸如經純化的T細胞族群。
細胞懸浮液的組成(例如滲透壓、鹽濃度、血清含量、細胞濃度、pH等)可影響用於調節免疫反應之化合物的投遞。在一些實施例中，懸浮液包含全血。替代地，細胞懸浮液係細胞於生理鹽水溶液或除血液以外的生理介質中之混合物。在一些實施例中，細胞懸浮液包含水溶液。在一些實施例中，水溶液包含細胞培養基、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、鹽、金屬離子、糖、生長因子、動物衍生產物、增量材料、界面活性劑、潤滑劑、脂質、維生素、胺基酸、蛋白質、細胞週期抑制劑及/或影響肌動蛋白聚合之藥劑。在一些實施例中，細胞培養基係DMEM、Opti-MEM®、IMDM、RPMI、X-Vivo 10及X-Vivo 15。此外，溶液緩衝劑可包括一或多種潤滑劑(pluronics或其他界面活性劑)，其可經設計以例如減少或清除縊縮或孔的堵塞並改善細胞存活性。例示性界面活性劑包括但不限於泊洛沙姆(poloxamer)、聚山梨醇酯、糖或糖醇諸如甘露醇、山梨醇、動物衍生血清及白蛋白蛋白質。
在某些T細胞類型的一些組態中，T細胞可培育於有助於投遞化合物至T細胞內部的一或多種溶液中。在一些實施例中，水溶液包含影響肌動蛋白聚合的藥劑。在一些實施例中，影響肌動蛋白聚合的藥劑係拉春庫林A (Latrunculin A)、細胞鬆弛素(Cytochalasin)及/或秋水仙鹼。例如，T細胞可先培育於去聚合化溶液諸如拉春庫林A (0.1 μg/mL)中1小時，然後才經投遞以去聚合化肌動蛋白細胞骨架。作為額外實例，T細胞可先培育於10 μM秋水仙鹼(Sigma)中2小時，然後才經投遞以去聚合化微管網絡。
在一些實施例中，細胞族群係先經濃化，然後才使用於揭示方法。例如，細胞係獲自體液，例如周邊血液，且可選地經濃化或純化以濃縮T細胞。細胞可藉由任何所屬技術領域中已知之方法濃化，包括但不限於磁細胞分離、螢光激活細胞分選(FACS)或密度梯度離心。
細胞懸浮液的黏度亦可影響在本文中揭示之方法。在一些實施例中，細胞懸浮液的黏度從約8.9x10-4 Pa·s至約4.0x10-3 Pa·s或其間的任何數值或數值範圍不等。在一些實施例中，黏度介於約8.9x10-4 Pa·s至約4.0 x10-3 Pa·s、約8.9x10-4 Pa·s至約3.0 x10-3 Pa·s、約8.9x10-4 Pa·s至約2.0 x10-3 Pa·s或約8.9x10-3 Pa·s至約1.0 x10-3 Pa·s中任一者之間不等。在一些實施例中，黏度介於約0.89 cP至約4.0 cP、約0.89 cP至約3.0 cP、約0.89 cP至約2.0 cP或約0.89 cP至約1.0 cP中任一者之間不等。在一些實施例中，觀察到剪切稀化效應，其中細胞懸浮液的黏度在剪切應變的條件下降低。黏度可藉由所屬技術領域中已知之任何方法測量，包括但不限於黏度計，諸如玻璃毛細黏度計或流變計。黏度計測量一種流動條件下的黏度，然而流變計用於測量隨流動條件而異的黏度。在一些實施例中，測量剪切稀化溶液諸如血液的黏度。在一些實施例中，黏度係在介於約-5℃與約45℃之間測量。例如，黏度係在室溫(例如，約20℃)、生理溫度(例如，約37℃)、高於生理溫度(例如，大於約37℃至45℃或更高)、減少溫度(例如，約-5℃至約4℃)或這些例示性溫度之間的溫度下測量。系統及套組
在一些態樣中，本發明提供一種包含根據本文所述之任何實施例諸如用於本文所述之任何方法的縊縮、T細胞懸浮液、抗原或佐劑中之一或多者的系統。系統可包括在本文中揭示之物質的組成物及方法描述的任何實施態樣，包括該些揭示於以上標題為「微流體系統及其組分」的章節。在一些實施例中，細胞變形縊縮的大小適用於投遞至T細胞。在一些實施例中，投遞參數諸如作業流速、細胞及化合物濃度、溫度、縊縮中的細胞流速及細胞懸浮液的組成(例如，滲透壓、鹽濃度、血清含量、細胞濃度、pH等)係經最佳化以達調節免疫反應之化合物的最大反應。
亦提供用於調節個體之免疫反應的套組或製造物品。在一些實施例中，套組包含經修改的T細胞，該經修改的T細胞包含抗原及/或佐劑，包括任何本文所述之經修改的T細胞。在一些實施例中，套組包含縊縮、T細胞懸浮液、抗原或佐劑中之一或多者，以用於產製用於調節個體之免疫反應之經修改的T細胞。在一些實施例中，套組包含於合適包裝中之本文所述之組分(例如含有孔之微流體通道或表面、細胞懸浮液及/或化合物)。合適包裝材料係所屬技術領域中已知且包括例如小瓶(諸如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、可撓性包裝(例如，密封Mylar或塑膠袋)及類似物。這些製造物品可進一步經滅菌及/或密封。
本發明亦提供包含本文所述之方法的組分之套組且可進一步包含執行該方法以調節個體之免疫反應的指示及/或將抗原及/或佐劑導入T細胞中之指示。本文所述之套組可進一步包括其他材料，包括緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器及具有執行任何本文所述之方法的指示(例如，調節個體之免疫反應的指示或修改T細胞以含有抗原及/或佐劑的指示)之包裝仿單。例示性實施例
實施例1。一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原對該經修改的T細胞係外源性且包含免疫原性表位，且其中該佐劑存在於細胞內。
實施例2。一種包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
實施例3。一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞(input T cell)之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞(perturbed input T cell)；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞；藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。
實施例4。如實施例3之經修改的T細胞，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與該經擾動的輸入T細胞培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例5。如實施例3或4之經修改的T細胞，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原對該佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。
實施例6。一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含該佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。
實施例7。如實施例6之經修改的T細胞，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例8。一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含該抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；及b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。
實施例9。如實施例8之經修改的T細胞，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例10。如實施例3至9中任一項之經修改的T細胞，其中變形力係於該輸入T細胞通過該縊縮時施加至該輸入T細胞，藉此造成該輸入T細胞之擾動。
實施例11。如實施例3至10中任一項之經修改的T細胞，其中該製程進一步包含使該輸入T細胞及/或該經修改的T細胞與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。
實施例12。如實施例11之經修改的T細胞，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物或作為穩定劑或輔助因子。
實施例13。如實施例3至12中任一項之經修改的T細胞，其中該縊縮之直徑係小於該輸入T細胞之直徑。
實施例14。如實施例13之經修改的T細胞，其中該縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約99%。
實施例15。如實施例14之經修改的T細胞，其中該縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約60%。
實施例16。如實施例1至15中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。
實施例17。如實施例1至16中任一項之經修改的T細胞，其中該囊泡係胞內體。
實施例18。如實施例1至17中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。
實施例19。如實施例1至18中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原或免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。
實施例20。如實施例1至19中任一項之經修改的T細胞，其中該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、咪喹莫特(imiquimod)、雷西喹莫特(resiquimod)或脂多醣(LPS)。
實施例21。如實施例20之經修改的T細胞，其中該佐劑係CpG ODN。
實施例22。如實施例21之經修改的T細胞，其中該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。
實施例23。如實施例1至22中任一項之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自疾病相關抗原。
實施例24。如實施例23之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。
實施例25。如實施例1至24中任一項之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自非自身抗原。
實施例26。如實施例1至25中任一項之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。
實施例27。如實施例26之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自人類乳突病毒(HPV)抗原。
實施例28。如實施例27之經修改的T細胞，其中該HPV係HPV-16或HPV-18。
實施例29。如實施例27或28之經修改的T細胞，其中該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。
實施例30。如實施例29之經修改的T細胞，其中該HLA-A2限制肽包含SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。
實施例31。如實施例30之經修改的T細胞，其中該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
實施例32。如實施例1至30中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。
實施例33。如實施例32之經修改的T細胞，其中在向個體投予包含該複數個抗原的該經修改的T細胞之後，其中該複數個抗原包含該複數個免疫原性表位，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。
實施例34。如實施例1至33中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。
實施例35。如實施例30之經修改的T細胞，其中該免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。
實施例36。如實施例30之經修改的T細胞，其中該抗原係包含免疫原性肽表位及一或多個異源性肽序列之多肽。
實施例37。如實施例34之經修改的T細胞，其中該抗原係包含在N端及/或C端側接異源性肽序列的免疫原性肽表位之多肽。
實施例38。如實施例35之經修改的T細胞，其中該側接異源性肽序列係衍生自疾病相關免疫原性肽。
實施例39。如實施例35之經修改的T細胞，其中該N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列。
實施例40。如實施例1至39中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。
實施例41。如實施例1至40中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含該佐劑的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例42。如實施例1至41中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含該抗原的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例43。如實施例1至42中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原對該佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。
實施例44。如實施例1至43中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
實施例45。如實施例1至44中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞進一步包含藥劑，其中相較於不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。
實施例46。如實施例45之經修改的T細胞，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。
實施例47。如實施例45之經修改的T細胞，其中該藥劑係白蛋白。
實施例48。如實施例47之經修改的T細胞，其中該白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。
實施例49。如實施例45之經修改的T細胞，其中該藥劑係二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。
實施例50。如實施例49之經修改的T細胞，其中該藥劑包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
實施例51。如實施例1至50中任一項之經修改的T細胞，其中該細胞係經進一步修改以增加一或多種共刺激分子的表現。
實施例52。如實施例51之經修改的T細胞，其中該共刺激分子係B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
實施例53。如實施例51或52之經修改的T細胞，其中該細胞包含導致該一或多種共刺激分子表現增加的核酸。
實施例54。如實施例1至53中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第一型表現。
實施例55。如實施例1至54中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第二型表現。
實施例56。如實施例54之經修改的T細胞，其中相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修改的T細胞所起始之先天免疫反應係減少。
實施例57。如實施例54或56之經修改的T細胞，其中相較於不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
實施例58。如實施例1至57中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞或天然殺手T細胞。
實施例59。如實施例1至58中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞或γδ-T細胞。
實施例60。一種組成物，其包含如實施例1至59中任一項之經修改的T細胞。實施例61。一種醫藥組成物，其包含如實施例1至59中任一項之經修改的T細胞及醫藥上可接受之載劑。
實施例62。一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含向該個體投予如實施例1至59中任一項之經修改的T細胞、如實施例60之組成物或如實施例62之醫藥組成物。
實施例63。一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)向該個體投予包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列；及b)向該個體投予佐劑。
實施例64。一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。
實施例65。如實施例64之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與該經擾動的輸入T細胞培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例66。如實施例64或65之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原對該佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。
實施例67。一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。
實施例68。如實施例67之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例69。一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含抗原，其中該抗原包含免疫原性表位，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及c)向該個體投予該經修改的T細胞。
實施例70。如實施例69之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例71。如實施例64至70中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含該抗原的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例72。如實施例64至71中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含該佐劑的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例73。如實施例64至72中任一項之方法，其中該經修改的T細胞中該抗原對該佐劑之比例係介於約10000:1與約1:10000之間。
實施例74。如實施例64至73中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
實施例75。一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原之經修改的T細胞；c)向該個體投予該經修改的T細胞；及d)向該個體投予佐劑。
實施例76。如實施例75之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
實施例77。如實施例64至76中任一項之方法，其中變形力係於該輸入T細胞通過該縊縮時施加至該輸入T細胞，藉此造成該輸入T細胞之擾動。
實施例78。如實施例64至77中任一項之方法，其進一步包含使該輸入T細胞及/或經修改的T細胞與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。
實施例79。如實施例78之方法，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。
實施例80。如實施例64至79中任一項之方法，其中該免疫反應係經增強。
實施例81。如實施例80之方法，其中該增強的免疫反應係針對該抗原。
實施例82。如實施例64至81中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係小於該輸入T細胞之直徑。
實施例83。如實施例82之方法，其中該縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約99%。
實施例84。如實施例83之方法，其中該縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約60%。
實施例85。如實施例64至84中任一項之方法，其中該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。
實施例86。如實施例64至85中任一項之方法，其中該囊泡係胞內體。
實施例87。如實施例64至86中任一項之方法，其中該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。
實施例88。如實施例64至87中任一項之方法，其中該抗原或免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。
實施例89。如實施例64至88中任一項之方法，其中該佐劑係CpG ODN、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、咪喹莫特、雷西喹莫特及/或脂多醣(LPS)。
實施例90。如實施例89之方法，其中該佐劑係CpG ODN。
實施例91。如實施例90之方法，其中該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。
實施例92。如實施例64至91中任一項之方法，其中該免疫原性表位係衍生自疾病相關抗原。
實施例93。如實施例92之方法，其中該免疫原性表位係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。
實施例94。如實施例64至93中任一項之方法，其中該免疫原性表位係衍生自非自身抗原。
實施例95。如實施例64至94中任一項之方法，其中該免疫原性表位係衍生自腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。
實施例96。如實施例95之方法，其中該免疫原性表位係衍生自人類乳突病毒(HPV)抗原。
實施例97。如實施例96之方法，其中該HPV係HPV-16或HPV-18。
實施例98。如實施例96或97之方法，其中該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。
實施例99。如實施例98之方法，其中該HLA-A2限制肽包含SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。
實施例100。如實施例99之方法，其中該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
實施例101。如實施例64至100中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。
實施例102。如實施例64至101之方法，其中該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。
實施例103。如實施例64至102中任一項之方法，其中該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。
實施例104。如實施例103之方法，其中該免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。
實施例105。如實施例104之方法，其中與該N端側接多肽及/或該C端側接多肽融合之該免疫原性肽表位係非天然發生序列。
實施例106。如實施例105之方法，其中該N端及/或C端側接多肽係衍生自免疫原性合成長肽(SLP)。
實施例107。如實施例105之方法，其中該N端及/或C端側接多肽係衍生自疾病相關免疫原性SLP。
實施例108。如實施例105之方法，其中該N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列。
實施例109。如實施例64至108中任一項之方法，其中該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。
實施例110。如實施例64至109中任一項之方法，其中該經修改的T細胞進一步包含藥劑，其中相較於不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。
實施例111。如實施例110之方法，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。
實施例112。如實施例111之方法，其中該藥劑係白蛋白。
實施例113。如實施例112之方法，其中該白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。
實施例114。如實施例110之方法，其中該藥劑係二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。
實施例115。如實施例64至114中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第一型表現。
實施例116。如實施例64至115中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第二型表現。
實施例117。如實施例115之方法，其中相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修改的T細胞所起始之先天免疫反應係減少。
實施例118。如實施例115或117之方法，其中相較於不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
實施例119。如實施例64至118中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞或天然殺手T細胞。
實施例120。如實施例64至119中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞或γδ-T細胞。
實施例121。如實施例64至120中任一項之方法，其中該經修改的T細胞對該個體係同種異體。
實施例122。如實施例64至121中任一項之方法，其中該經修改的T細胞對該個體係自體。
實施例123。如實施例64至122中任一項之方法，其中該個體係經預先調理以調節發炎及/或免疫反應。
實施例124。如實施例64至123中任一項之方法，其進一步包含向該個體投予第二佐劑。
實施例125。如實施例124之方法，其中該第二佐劑係IFN-α、LPS或CpG ODN。
實施例126。如實施例124或125之方法，其中該經修改的T細胞及該第二佐劑係同期或同時投予。
實施例127。如實施例124或125之方法，其中該經修改的T細胞及該第二佐劑係依序投予。
實施例128。如實施例124至127之方法，其中該經修改的T細胞係於投予該第二佐劑之前投予。
實施例129。如實施例124至128之方法，其中該經修改的T細胞係於投予該第二佐劑之後投予。
實施例130。如實施例64至129之方法，其中該經修改的T細胞係於投予免疫檢查點抑制劑之前、同期或之後投予。
實施例131。如實施例130之方法，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中任一者。
實施例132。如實施例64至131之方法，其中該經修改的T細胞係於投予化學療法之前、同期或之後投予。
實施例133。如實施例132之方法，其中該化學療法包含順鉑。
實施例134。如實施例64至133中任一項之方法，其中向該個體投予該經修改的T細胞導致對該抗原具特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活化及/或擴增。
實施例135。如實施例64至134中任一項之方法，其中向該個體投予該經修改的T細胞導致對該抗原具特異性的輔助T (Th)細胞活化及/或擴增。
實施例136。如實施例64至135中任一項之方法，其中向該個體投予之該經修改的T細胞的量係介於約1 x 106 與約1 x 1012 個細胞之間。
實施例137。如實施例64至136中任一項之方法，其中該方法包含多次投予該經修改的T細胞。
實施例138。如實施例137之方法，其中該經修改的T細胞之二次連續投予之間的時間間隔係介於約1天與約30天之間。
實施例139。一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：向個體投予與抗原相關之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞藉由包含下列步驟之製程製備：a)使輸入T細胞與抗原及/或佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原與該輸入T細胞之細胞表面連結，其中該抗原包含免疫原性表位，藉此產製與抗原相關之經修改的T細胞；及b)向該個體投予該經修改的T細胞。
實施例140。如實施例139之方法，其中該HPV抗原包含與SEQ ID NO: 18至25中任一者具有至少90%相似性之胺基酸序列。
實施例141。如實施例140之方法，其中該HPV抗原包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列。
實施例142。如實施例139至141中任一項之方法，其中該佐劑係CpG ODN或LPS。
實施例143。如實施例142之方法，其中該CpG ODN係CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
實施例144。一種包含如實施例1至59中任一項之經修改的T細胞之組成物，其用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法。
實施例145。一種包含如實施例1至59中任一項之經修改的T細胞之組成物，其用於調節個體的免疫反應之方法，該方法包含向該個體投予該經修改的T細胞。
實施例146。一種包含經修改的T細胞之組成物，其用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法，其中該經修改的T細胞包含抗原，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
實施例147。一種包含經修改的T細胞之組成物，其用於調節個體的免疫反應之方法，其中該經修改的T細胞包含抗原，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
實施例148。一種包含經修改的T細胞之組成物，其用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法，其中該經修改的T細胞係藉由方法製備，該方法包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞。
實施例148。一種包含該經修改的T細胞之組成物，其用於調節個體的免疫反應之方法，其中該經修改的T細胞係藉由方法製備，該方法包含：a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位；b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞。實例
所屬技術領域中具有通常知識者將認可數種實施例在本發明之範疇及精神內係可能的。本發明現將參照下列非限制性實例更詳細地描述。下列實例進一步說明本發明，但當然不應被解讀為以任何方式限制其範疇。 實例1
為了判定在治療場域中導致腫瘤生長抑制所需的TAPC 之最小有效細胞劑量，在TC1腫瘤模型中，以腫瘤對時間作圖的面積測試四種不同劑量的初免/加強TAPC 。
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部。在第4天(初免)及第7天(加強)，將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ裝載200 µg/mL CpG ODN 1826及預先複合的40 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF SSKSDSTLRLSVQSTHV DIR)+40 µM小鼠血清白蛋白(MSA)。動物(10隻小鼠/組)經靜脈內注射相關劑量的E7+MSA+CpG裝載T細胞(50M個細胞/mL)並從腫瘤植入後1週開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖1A。
未治療組(無T細胞過繼性轉移)小鼠與圖1A概述之治療組B至E小鼠的腫瘤生長(以公式((長x寬2 )/2)測量)比較係顯示於圖1B。所有處理條件皆導致完全腫瘤減少，表示最低測試細胞劑量(2.5M細胞初免，1M細胞加強)仍能夠達成與較高細胞劑量相同的腫瘤減少，各者相對於未治療在第18天達到統計顯著性(#P＜0.0001 )。 實例2
為了判定E7 SLP設計，將二種不同的E7 SLP(天然E7 SLP及其中天然序列的所有半胱胺酸經置換為絲胺酸的E7 SLP)經SQZ處理至T APC中連同CpG共投，且各種條件以ICS評估IFN-γ產生。
將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ裝載不同劑量(左-200 µg/mL，右-25 µg/mL)的CpG ODN 1826及預先複合的40 µM E7天然或經典SLP + 40 µM小鼠血清白蛋白(MSA)，或將T細胞用相同條件在SQZ不存在下培育作為陰性對照組(Endo-B及D組)。動物(5隻小鼠/組)經100 µL體積(50M個細胞/mL)靜脈注射5M裝載或培育T細胞。在第8天，收集脾臟並以ICS定量產生IFN-γ之CD8+ T細胞的%。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖2A。
產生IFN-γ之CD8+ T細胞的%在使用cE7的Endo對照組中最高，其與SQZ加cE7或Endo加nE7並無顯著不同。未預期的是，SQZ相較於Endo並無獲益，但SQZ nE7條件相對於所有其它者明顯降低產生IFN-γ之CD8+ T細胞的%。此資料顯示，SLP序列對於因應T APC免疫接種所產製的產生IFN-γ之CD8+ T細胞的%有所影響，特別是使用SQZ裝載抗原至T細胞中時。 實例3
為了判定E6 SLP在體外人類模型中誘導E6應答T細胞的抗原特異性免疫反應的能力，將初代人T細胞裝載E6 SLP並用ELISA測量應答細胞的IFN-γ分泌。
人T細胞係單離自HLA-A02+供體的PBMC (10M個細胞/mL)並將50 µM含有HLA-A02-限制最小E629-38 表位的E6 SLP (LPQLSTELQTTIHDIILECV YSKQQLLRRE VYDFAF)藉由SQZ投遞到細胞內，且比較SQZ條件與對照組(其中將E6 SLP與TAPC 在SQZ不存在下培育(Endo))用ELISA測量的IFN-γ水準。TAPC 接著係與E6特異性CD8+應答細胞以1:1刺激細胞：效應細胞的比例共培養且在IL-2 (100 U/mL)存在下培養。在18小時後，收集各條件的上清液，並用IFN-γ ELISA (Biolegend)評估IFN-γ產生水準。
當與E6應答CD8+ T細胞共培養時，使用SQZ投遞所測試的E6 SLP到細胞內導致IFN-γ生產＞10倍增加(#P ＜0.0001)，如圖3所示。這些發現顯示T APC誘發對多種HPV抗原(E6及E7)之抗原特異性免疫反應的能力。 實例4
為了判定E7 SLP在體外人類模型中誘導E711-20 應答T細胞的抗原特異性免疫反應的能力以及SLP序列對於SQZ T細胞APC (Tapc )活化的影響，將來自多個供體的初代人T細胞裝載不同的E7 SLP並用ELISA測量應答細胞的IFN-γ分泌。
人T細胞係單離自HLA-A02+供體的PBMC (10M個細胞/mL)並將50 µM OL-E71-35 (MHGDTPTLHEYM LDLQPETT DLYCYEQLNDSSEEE)或E7.6 (QLCTELQTYM LDLQPETT YCKQQLL)SLP藉由SQZ投遞到細胞內，且比較SQZ條件與對照組(其中將E7 SLP與Tapc 在SQZ不存在下培育(Endo))用ELISA測量的IFN-γ水準。TAPC 接著係與E711-20 特異性CD8+應答細胞以4:1刺激細胞：效應細胞的比例共培養且在IL-2 (100 U/mL)存在下培養。在24小時後，收集各條件的上清液，並用IFN-γ ELISA (Biolegend)評估IFN-γ產生水準。
天然OL-E71-35 SLP使用SQZ投遞時相較於Endo誘發最小IFN-γ反應(圖4)。然而，當相較於Endo對照組，E7.6 (其包含插入另一反應性SLP (E621-45 -QLCTELQTXXXXXXXXXYCKQQLL)的側接區域之間的E7最小表位(YMLDLQPETT))在所有三個測試供體中誘導相對於匹配的Endo對照組較大的IFN-γ反應(*P ＜0.05，**P ＜0.01，#P ＜0.0001)。此發現強調側接區域序列在SLP免疫原性上的重要性且提供支持其他SLP之側接區域(已知具反應性)可搭配正交最小表位使用以達成增加的免疫反應。 實例5
為了評估在體外人類模型中用於SQZ T細胞APC的抗原劑量，將初代人T細胞裝載不同劑量的E7 SLP並用ELISA評估IFN-γ。
人T細胞係單離自HLA-A02+供體的PBMC(10M個細胞/mL)並將不同劑量(50及100 µM)的E7 SLP (QLCTELQTYMLDLQPETT YCKQQLL)藉由SQZ投遞到細胞內，且比較SQZ條件與對照組(其中將E7 SLP與T APC在SQZ不存在下培育(Endo))用ELISA測量的IFN-γ水準。T APC接著係與E711-20 特異性CD8+應答細胞以4:1刺激細胞：效應細胞的比例共培養且在IL-2 (100 U/mL)存在下培養。在24小時後，收集各條件的上清液，並用IFN-γ ELISA (Biolegend)評估IFN-γ產生水準。此外，採用肽脈衝陽性對照，其中B-LCL細胞在進行ELISA之前在最小E7表位(YMLDLQPETT)存在下培育1小時。
在三個測試供體中，所有SQZ條件相對於可相比對照(Endo)(其中將SLP與T細胞在SQZ不存在下培育)皆發生IFN-γ的一致增加(圖5)。供體1及3的50 µM E7 SLP展現有統計顯著性的增加(8668-*P ＜0.05；8299- #P ＜0.0001)且較高的100 µM E7 SLP展現有顯著性的趨勢。雖然任一供體的50與100 µM之間皆無統計顯著差異，但50 µM E7 SLP有一致相等或較高的IFN-γ反應。 實例6
為了判定在體外人類模型中用於SQZ T細胞APC的供體變異性，同時識別誘導顯著抗E7免疫反應之E6及E7 SLP的最佳組合及劑量，將來自多個HLA-A02+供體的初代人T細胞裝載E6及E7 SLP並用ELISA評估IFN-γ。
人T細胞係單離自HLA-A02+供體的PBMC (10M個細胞/mL)並將25或50 µM E6 SLP (QLCTELQTTIHDIILECV YCKQQLL)及E7.6 SLP (QLCTELQTYMLDL QPETT YCKQQLL)藉由SQZ投遞到細胞內，且比較SQZ條件與對照組(其中將SLP與TAPC 在SQZ不存在下培育(Endo))用ELISA測量的IFN-γ水準。採用肽脈衝陽性對照，其中B-LCL細胞在TAPC 產製同時在最小E7表位(YMLDLQPETT)存在下培育。TAPC 及陽性對照接著係與E711-20 特異性CD8+應答細胞以4:1刺激細胞：效應細胞的比例共培養且在IL-2 (100 U/mL)存在下培養。在24小時後，收集各條件的上清液，並用IFN-γ ELISA (Biolegend)評估IFN-γ產生水準。
七個顯示供體中的五個當用SQZ E6+E7 SLP處理時相對於可相比對照(Endo)(其中將SLP與T細胞在SQZ不存在下培育)展現IFN-γ的一致增加(供體1至3、5至6：*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.005)，如圖6所示。在二個當用經SQZ處理的T APC處理時相對於Endo對照不具有統計顯著性增加的供體中，二個供體(供體4及7)的所測試之經SQZ處理的T APC的一個劑量(供體4 - 50 µM，供體7 - 25 µM)具有可偵測、有顯著性趨勢的增加。綜上所述，這些資料顯示雖然不同的供體T APC具有不同的免疫刺激活性，我們仍然可以在多個供體中見到IFN-γ生產的一致增加，且當與多個抗原/SLP組合時(在本例中為HPV特異性E6抗原)，E7特異性免疫反應仍具顯著性。 實例7
為了協助判定導致最強健免疫反應的佐劑，我們測試二種作用在不同途徑之佐劑對於T APC誘導體內抗原特異性反應之能力的效應。此效應係藉由流動式細胞測量術以四聚體及ICS染色定量。
將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ裝載400 µg/mL Ova+各種濃度的高分子量及低分子量聚I:C(10、30、100、300、1000 µg/mL)且與用相同條件在SQZ不存在下培育作為陰性對照組的T細胞比較(Endo-C及E組)。使用經Ova+200 µg/mL CpG SQZ處理的T細胞作為陽性對照(F組)。在第0天，將小鼠(5隻/組，3隻未治療)以100 µL體積(50M個細胞/mL)注射5M裝載或培育T細胞。在第7天，收集脾臟並使用流動式細胞測量術以四聚體染色定量Ova特異性T細胞，同時將一些脾細胞通透化並固定整夜。隔天(第8天)，以ICS判定IFN-γ水準，用PMA/離子黴素作為陽性對照。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖7A。
四聚體或產生IFN-γ之CD8+ T細胞的%在CpG佐劑組中最高，然而相較於未治療，所有LMW或HMW聚I:C佐劑條件並未增加Ova特異性或產生IFN γ之CD8+ T細胞的百分比(圖7B)。由於聚I:C是一種TLR3促效劑，而CpG是一種TLR9促效劑，此資料支持CpG作為T APC免疫接種的佐劑優於聚I:C，因此暗示TLR3活化在此場域可能不具有益處。 實例8
為了協助判定導致最強健免疫反應的CpG佐劑的濃度，我們測試多種劑量的CpG對於T APC誘導體內抗原特異性反應之能力的效應。此效應係藉由流動式細胞測量術以四聚體及ICS染色定量。
將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ裝載400 µg/mL Ova + 各種濃度的CpG 1826 (50、100、200 µg/mL)且與用相同條件在SQZ不存在下培育作為陰性對照組的T細胞比較(Endo-B、D及F組)。在第0天，將小鼠(5隻/組，3隻未治療)以100 µL體積(50M個細胞/mL)注射5M裝載或培育T細胞。在第7天，收集脾臟並使用流動式細胞測量術以四聚體染色定量Ova特異性T細胞，同時將一些脾細胞通透化並固定整夜。隔天(第8天)，以ICS判定IFN-γ水準，用PMA/離子黴素作為陽性對照。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖8A。
四聚體或產生IFN-γ之CD8+ T細胞的%在200 µg/mL CpG組中最高且與第I型肽/MHC-I的相關Endo對照組有顯著不同(*四聚體的P ＜0.05，#IFN-γ的P ＜0.0001)，然而所有其他條件皆不誘發與未治療或彼等之各別Endo對照組相比顯著之反應(圖8B)。僅在第I型肽觀察到Ova特異性T細胞的活化，支持直接呈現Ova抗原以致效CD8+ T細胞反應。 實例9
為了協助評估導致強健免疫反應的CpG佐劑投予時程，我們測試CpG的多種給藥時程對於T APC誘導體內抗原特異性反應之能力的效應。此效應係藉由流動式細胞測量術以四聚體及ICS染色定量。
將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ裝載400 µg/mL Ova且將小鼠(5隻/組，3隻未治療)以100 µL體積(50M個細胞/mL)注射5M裝載或培育T細胞。CpG 1826 (25 µg/mL)全身性共投供體小鼠發生在T APC初免(第0天)的相同時間或初免後1或2天(分別為第1天或第2天)且與用相同條件在SQZ不存在下培育作為陰性對照組的T細胞比較(B、D及F組)。使用經(Ova+200 µg/mL CpG) SQZ處理的T細胞作為陽性對照(H組)。在第7天，收集脾臟並使用流動式細胞測量術以四聚體染色定量Ova特異性T細胞，同時將一些脾細胞通透化並固定整夜。隔天(第8天)，以ICS判定IFN-γ水準，用PMA/離子黴素作為陽性對照。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖9A。
四聚體或產生IFN-γ之CD8+ T細胞的%在其中Ova及CpG共同投遞至T APC的組中最高，然而與初免同一天共投(B組)是唯一顯示一些水準、有顯著性趨勢的Ova特異性活化之共投CpG組(圖9B)。然而，此資料支持抗原+CpG共同投遞可導致Ova特異性CD8+ T細胞最大活化的觀察，而延緩CpG全身性投予相較於同時初免及共投佐劑導致降低反應。 實例10
為了判定細胞內與全身性佐劑投予之組合的T APC抗腫瘤功能，在預防性TC-1鼠腫瘤模型中比較CpG和IFN-α的多種投予途徑搭配我們的E7特異性T APC。藉由四聚體染色及流動式細胞測量術測量抗原特異性T細胞反應，而抗腫瘤效應係藉由腫瘤生長預防測量。
在第-14天(初免)及第-7天(加強)，將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ裝載預先複合的40 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF SSKSDSTLRL SVQSTHVDIR)+40 µM小鼠血清白蛋白(MSA)(B及C組)或E7 SLP+MSA+200 µg/mL CpG ODN 1826(D、E及F組)。C57BL/6J雌性受者小鼠(10隻小鼠/組)經100 µL的裝載T細胞(5M個細胞/動物)靜脈注射，而B及E組動物亦接受靜脈內CpG (25 µg)且C及F組接受IV IFN-α (10k IU)。在第-8天及第-3天，收集100 µL的鼠血液且藉由四聚體染色及流動式細胞測量術定量E7特異性CD8+ T細胞的%。在第0天，用TC1腫瘤細胞(100k個細胞/小鼠)注射受者小鼠的右後脇部並從第11天開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖10A。
藉由E7四聚體染色，在用經E7+MSA或E7+MSA+CpG SQZ處理的T細胞+/-共投CpG或IFN-α進行初免(第-8天)及加強(第-3天)後測量小鼠之E7特異性T細胞的百分比(圖10B)。在SQZ E7+CpG共投及SQZ (E7+CpG)+ IFN-α共投組中觀察到最高相對比例的E7特異性T細胞。E7特異性初免後CD8+ T細胞的相對數量在SQZ (E7+CpG) +共投CpG相對於SQZ E7+共投CpG意外地較低(*P ＜0.05)，然而共投IFN-α與SQZ (E7+CpG) T細胞比起共投CpG與SQZ (E7+CpG) T細胞導致顯著較高數量的E7特異性T細胞(*P ＜0.05)。在加強(第-3天)後觀察到相似趨勢，其中SQZ E7+CpG共投及SQZ (E7+CpG)+IFN-α共投組導致最高%的E7特異性T細胞。然而，最高反應來自SQZ (E7+CpG)+ IFN-α共投組，其顯著高於SQZ E7+IFN-α共投及SQZ (E7+CpG)+共投CpG，顯示當與SQZ (E7+CpG) T細胞組合使用時，IFN-α共投導致較高百分比的抗原特異性T細胞。比較未治療組(無T細胞過繼性轉移)小鼠與圖10C概述之治療組B至F小鼠的腫瘤生長(以公式((長x寬2 )/2)測量)。SQZ (E7+CpG)+IFN-α共投組的高腫瘤生長減少及存活優點與四聚體染色對應良好，顯示E7特異性T細胞的最高誘導導致最佳的抗腫瘤活性。有趣的是，儘管E7特異性T細胞在SQZ (E7+CpG)組的%低，此治療亦提供非常高水準的抗腫瘤活性，此為唯一其他延長所有小鼠存活超過60天之組(除SQZ (E7+CpG)+IFN-α共投之外)。雖然稍微低於先前提到的D及F組，C及E組有可辨別的存活延長及腫瘤生長抑制。在第78天，來自D組的7隻無腫瘤小鼠用50k個細胞再挑戰對側(左側)脇部並與年齡相符的未治療動物比較(10隻小鼠)(圖10D)。相較於已接受彼等之第一次挑戰的未治療小鼠，來自D組的小鼠在再挑戰後的腫瘤生長具有顯著減少(***P ＜0.005)，提供此抗腫瘤效應持久超過2個月的支持。 實例11
為了判定組合多個HPV抗原對於T APC抗腫瘤功能的效應，在預防性TC-1鼠腫瘤模型中將E6及E7合成長肽(SLP)單獨使用及與我們的E7特異性T APC組合使用。藉由四聚體染色及流動式細胞測量術測量E7特異性T細胞反應，而抗腫瘤效應係藉由腫瘤生長預防測量。
在第-14天(初免)及第-8天(加強)，將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ根據表XX裝載預先複合的20 µM小鼠血清白蛋白(MSA) + 20 µM E6 (VYSKQQLLRREVYDFAFRDLSIVYRDGNPYAVSDK)及/或E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)或二者之組合+/- 200 µg/mL CpG ODN 1826。使用與B組相同條件在SQZ不存在下培育的T細胞作為陰性對照組(C組)。C57BL/6J雌性受者小鼠(5至10隻小鼠/組)經100 µL的裝載T細胞(5M個細胞/動物)靜脈注射。在第-3天，收集100 µL的鼠血液且藉由四聚體染色及流動式細胞測量術定量E7特異性CD8+ T細胞的%。在第0天，用TC1腫瘤細胞(100k個細胞/小鼠)注射受者小鼠的右後脇部並從第11天開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖11A。
藉由E7四聚體染色，在加強(第-3天)後測量小鼠之E7特異性T細胞的百分比，最大效應在CpG+E7 SQZ T APC (B組)中觀察到，如圖11B所示。有趣的是，B組反應顯著高於未治療及E7與E6之組合(F組-#P ＜0.0001)，提供添加E6 SLP鈍化E7特異性反應的證據。B組與其他治療組有顯著差異，明顯例外的是Endo對照組(C組)，其中B組明顯較高且有統計顯著性趨勢。如圖11C所示，比較未治療組(無T細胞過繼性轉移)小鼠與圖11A概述之治療組B至G小鼠的腫瘤生長(以公式((長x寬2 )/2)測量)。高度腫瘤生長預防發生在經E7+CpG SQZ處理的T細胞組，以及在E7+CpG存在下在SQZ不存在下培育的T細胞組。D至F組相對於未治療(A組)及經E6+CpG SQZ處理T細胞(G組)顯示一些水準的腫瘤生長抑制，但皆不及B及C組有效。 實例12
為了判定CpG佐劑之投予途徑對於E7特異性T APC抗腫瘤效應的重要性，E7 SLP係與CpG組合投遞至T細胞，不論是投遞至T細胞或全身性共投至受者動物，且抗腫瘤效應藉由腫瘤生長抑制測量。
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射受者小鼠的右後脇部。在第10天(初免)及第20天(加強)，將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ裝載預先複合的20 µM小鼠血清白蛋白(MSA) + 20 µM E7 (GQAEPDRAHYNIVTF SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)且ODN 1826係以200 µg/mL藉由SQZ共同投遞(D組)或以25 µg/小鼠全身性共投至動物(C組)且與未治療(A組)及單獨全身性投予CpG(B組)比較。受者小鼠(8至10隻小鼠/組)經100 µL的裝載T細胞(5M個細胞/動物)治療。從第10天開始測量TC-1腫瘤生長每週二次。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖12A。
在HPV相關癌症(TC-1)的治療模型中，經E7 SLP SQZ處理的T APC相對於未治療及僅注射CpG導致顯著減少腫瘤負荷(第17天：C組-P ＜0.05；第20天：C及D組 -P ＜0.0001)(圖12B)。這些資料顯示在治療場域中，全身性共投及細胞內投遞CpG佐劑相對於未治療或僅佐劑皆導致腫瘤負荷顯著減少。 實例13
為了評估共投佐劑導致E7特異性T細胞腫瘤浸潤的能力，在治療性TC-1鼠腫瘤模型中比較CpG和IFN-α與我們的E7特異性T APC之組合。抗原特異性T細胞反應藉由四聚體染色及流動式細胞測量術在腫瘤浸潤淋巴細胞中測量。
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射受者小鼠的右後脇部。在第10天，將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ裝載預先複合的20 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR) + 20 µM小鼠血清白蛋白(MSA)。經SQZ裝載T細胞(5M個細胞/動物)係經單獨(C組)、與CpG ODN 1826(25 µg/小鼠-D組)、或與IFN-α(10k IU/小鼠-E組)投予且經100 µL總體積靜脈注射。小鼠亦經全身性CpG(25 µg-A組)或IFN-α(10k IU-B組)單獨注射。在第17天，收集腫瘤並單離CD8+腫瘤浸潤T細胞且藉由四聚體染色評估E7特異性反應性。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖13。
藉由E7四聚體染色，在初免7天後(第17天)測量小鼠之E7特異性CD8+ T細胞的百分比，且E7特異性T細胞佔CD8+細胞的代表性百分比實例顯示於圖13之下圖。雖然單獨注射佐劑不產製可觀量的E7特異性T細胞，SQZ投遞E7 SLP提供E7特異性T細胞40%增加且E7投遞T細胞與CpG及IFN-α之組合導致甚至更高百分比的抗原特異性T細胞(分別70及80%)。此資料顯示當E7 SLP裝載T細胞與全身性佐劑諸如CpG或IFN-α組合投予時，產製更強健的E7特異性T細胞反應。 實例14
為了判定裝載E7合成長肽(SLP)+CpG之T APC的初免及加強免疫接種時程，我們使用治療性TC-1鼠腫瘤模型，該模型用我們的T APC疫苗在不同時間點及不同加強次數處理。抗腫瘤效應係藉由腫瘤生長抑制測量。
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射受者小鼠的右後脇部並從第11天開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較。在第3天或第6天，將來自C57BL/6J雌性供體小鼠的T細胞單離並使用SQZ根據表XX裝載預先複合的20 µM小鼠血清白蛋白(MSA) + 20 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF SSKSDSTLR LSVQSTHVDIR) + 200 µg/mL CpG ODN 1826，隨後用100 µL的裝載T細胞(5M個細胞/動物)靜脈注射受者小鼠。治療組及時程的代表性示意圖概述於圖14A。
腫瘤生長抑制發生在T細胞經E7+CpG SQZ處理的所有組中，相較於未治療之統計顯著性發生在第20天(第20天-所有組，P ＜0.05；第24天-所有組P ＜0.0001)。此資料顯示當在第6天及第3天初免時，T APC疫苗的給藥時程可同樣有效，且在第21天新增第二次加強並無可辨別的獲益。 實例15
為了較佳地理解藉由SQZ投遞細胞內抗原之T細胞的抗原呈現機制，將Ova投遞至野生型T細胞或在SQZ不存在下與野生型T細胞培育，該野生型T細胞經注射至野生型小鼠或MHC-I基因剔除小鼠。收集脾臟並藉由CFSE染色定量Ova特異性T細胞(OT-I)增生的量。
在第0天，將來自OT-I雌性供體小鼠的T細胞單離並用2 µM CFSE標示且將2.5M個細胞以100 µL PBS經眼後(RO)注射至野生型或MHC-I基因剔除小鼠。同樣在第0天，將400 µg/mL Ova裝載至單離自CD45.1供體小鼠(4隻小鼠/組)的T細胞中或與T細胞培育，並將5M個T細胞經RO注射。在第3天，收集脾臟並藉由CFSE染色評估Ova特異性T細胞增生水準。
Ova特異性T細胞增生的量係藉由CFSE標示Ova反應性OT-I CD8+ T細胞來評估。為了判定抗原裝載TAPC 的呈現機制，使用缺乏MHC-I的小鼠作為受者小鼠。此將排除由於間接攝取垂死的經SQZ處理之T細胞的抗原及在MHC-I上交叉呈現給經過繼轉移的OT-I細胞之內源性鼠APC的Ova抗原呈現。發現到，當受者小鼠缺乏MHC-I時，Ova特異性OT-I細胞增生仍然發生，提供經SQZ處理之T APC直接呈現抗原的證據(圖15)。這些資料支持直接呈現SQZ媒介之細胞內投遞抗原。 實例16
為了評估SQZ改變細胞介素產生的傾向，T細胞經SQZ投遞CpG且在體外鼠模型中評估改變T細胞之細胞介素水準的能力。使用多重細胞介素套組，分析上清液中的細胞介素水準。
C57BL/6J雌性受者小鼠係經單離自C57BL/6J雌性供體小鼠且經200 µg/mL CpG SQZ處理之T細胞初免，在24小時後收集上清液(N=2)。藉由Millipore Milliplex多重細胞介素套組評估上清液的細胞介素水準，且表示為相對於未治療T細胞之倍數變化差異。
經由SQZ裝載CpG之T細胞上清液與未治療細胞之間的細胞介素水準並無顯著變化(圖16)。此資料顯示SQZ投遞佐劑不顯著改變體外T細胞之細胞介素水準。 實例17
為了評估SQZ改變細胞介素產生的傾向，在體內鼠模型中評估經SQZ投遞Ova或Ova+CpG之T細胞改變血清細胞介素水準的能力。使用多重細胞介素套組，分析血清細胞介素。
C57BL/6J雌性受者小鼠係經單離自C57BL/6J雌性供體小鼠且經400 µg/mL Ova或Ova+200 µg/mL CpG SQZ處理之T細胞初免，在初免後6小時自尾靜脈抽血且在24小時經由心臟穿刺抽血。藉由Millipore Milliplex多重細胞介素套組評估血清的細胞介素水準，且表示為相較於未治療T細胞之倍數變化。
用經由SQZ裝載Ova或Ova+CpG之T細胞初免的小鼠之血清中的細胞介素水準並無顯著變化(圖17)。此外，初免後6小時及24小時之間並未觀察到顯著差異。這些資料顯示SQZ投遞抗原+/-佐劑不顯著改變體內血清細胞介素水準。 實例18
此實例部分地顯示，經導入T細胞(T-APC)中之抗原被快速加工及直接呈現。
為了判定T細胞作為抗原呈現細胞(T-APC)的抗原呈現動力學，將抗原藉由SQZ投遞至T細胞，並藉由免疫染色及流動式細胞測量術隨時間評估與MHC-I結合之最小肽的存在。
具體而言，將來自C56BL/6J小鼠的鼠T細胞單離並藉由SQZ無酬載處理(SQZ：無抗原)或用SQZ裝載200 µg/mL Ova蛋白質(SQZ：卵白蛋白(Ovalbumin)-N=3個技術複製)。在2小時到24小時之間的各個時間點，將經處理的T細胞用特異性辨識Ova最小表位(SIINFEKL)之抗體(25-D1.16)染色，隨後進行流動式細胞測量術。任何處理自OVA蛋白質且呈現在MHC-I上的最小表位將藉由免疫染色偵測且抗原呈現的量係藉由流動式細胞測量術判定。
在MHC-I上呈現各種SIINFEKL水準之相對細胞族群係以在0、2、4及24小時疊加的直方圖繪示(深灰色表示SQZ：無抗原；淺灰色表示SQZ：卵白蛋白)(圖18A)。相較於SQZ：無抗原對照，在直方圖中表示SQZ：卵白蛋白的向右偏移指示具有增加SIINFEKL染色之族群及因此在MHC-I上呈現經加工抗原的細胞族群增加。在抗原裝載T-APC中的所述偏移在2小時明確，僅在24小時後觀察到抗原呈現的小量降低。在每細胞MHC-I上隨時間之SIINFEKL呈現的相對量係藉由細胞的平均螢光強度(MFI)測量(圖18B)。SQZ：卵白蛋白族群在2小時後顯示SIINFEKL的可觀呈現，最大呈現在4小時觀察到，隨後在4與24小時之間觀察到隨時間稍微降低。在整個測量時間進程中，並未觀察到SQZ：無抗原對照的抗原呈現差異。綜上所述，此資料支持SQZ媒介之裝載抗原至T細胞導致抗原快速呈現(2至4小時)。 實例19
此實例部分地顯示，經SQZ裝載疾病相關抗原的T細胞(T-APC)有效刺激體外抗原特異性T細胞反應。
為了判定經SQZ裝載疾病相關抗原的人T細胞(T-APC)之刺激抗原特異性T細胞反應的能力，T細胞經SQZ裝載CMV相關抗原、與抗原特異性應答T細胞共培養並用ELISA測量發炎性細胞介素分泌水準。
具體而言，將來自HLA-A2+供體的人T細胞單離並將CMV pp65 SLP (50 µM)與T細胞培育(Endo)或藉由SQZ投遞至T細胞(SQZ)。接著將Endo T細胞或SQZ T細胞(60k個細胞/孔)與pp65應答T細胞(30k個細胞/孔)以2:1比例培育，且在IL-2 (100 U/mL)及CpG 2006 (1 µM)存在下共培養24小時。接著收集上清液並藉由ELISA分析IFN-γ分泌水準，其指示體外抗原特異性免疫刺激的量。
當相較於與pp65 SLP培育的T細胞(Endo)時，經SQZ裝載T細胞對pp65特異性反應細胞的刺激有可觀且有統計顯著性的增加，如藉由IFN-γ ELISA所測量(P＜0.005)。這些資料顯示，藉由SQZ裝載疾病相關抗原，人T細胞可經修改變成體外刺激疾病相關抗原特異性T細胞反應的有效APC。 實例20
為了評估佐劑對於經SQZ裝載疫苗誘導抗原特異性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)能力的重要性，將細胞裝載模型抗原、經佐劑成熟並注射至荷瘤小鼠。經招募至腫瘤之抗原特異性T細胞的相對百分比藉由流動式細胞測量術測量。
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部。在第15天(初免)，自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟獲得鼠T細胞並經由SQZ(40 psi，3.5 μm縊縮，室溫)裝載預先複合的5 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+5 µM小鼠血清白蛋白(MSA)且在37℃下培育1小時。在第15天以100 μL的媒劑(PBS-未治療)或E7裝載T細胞(1M個細胞/小鼠)+/- CpG 1826(25 μg/小鼠)眼後注射雌性C57BL/6J受者小鼠(10隻/組)。在第25天，收集腫瘤並藉由流動式細胞測量術測量E7特異性TIL的量。
單獨經SQZ裝載T APC導致E7特異性TIL的數量小量(約15%)但統計無顯著性的增加，但當與CpG共注射時，TIL數量有較高且顯著增加(約55%，**P＜0.01相較於單獨T APC；***P＜0.0005相較於未治療)。此資料顯示，共注射CpG連同E7裝載T APC相較於單獨T APC導致遠遠較高的TIL招募。 實例21
為了評估預防性場域中T APC + 佐劑疫苗的持久性，在HPV E7表現性TC1腫瘤模型中，以腫瘤對時間作圖的面積比較T APC治療小鼠與未治療小鼠之初始反應以及60天後再挑戰的腫瘤生長。
在第-14天，自C57BL/6J雌性供體小鼠收集脾細胞並將T細胞藉由免疫磁性分離單離。接下來，將鼠T細胞經由SQZ(45 psi；3.5 μm縊縮)裝載預先複合的20 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF SSKSDSTLRLSVQSTHVDI R)+20 µM小鼠血清白蛋白(MSA)且在37℃下培育1小時。以100 μL的媒劑(PBS-未治療)或E7裝載T細胞(1M個細胞/小鼠)+CpG 1826(25 μg/小鼠)眼後注射雌性C57BL/6J受者小鼠(10隻小鼠/組，未治療研究世代I除外為20隻小鼠/組)[初免]。在第-7天，完全如同在第-14天般，自C57BL/6J雌性供體小鼠收集脾臟並將T細胞單離且經SQZ處理並注射至受者小鼠[加強]。在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部(除了10隻未治療研究世代2，這些直到第64天才植入腫瘤細胞)。從腫瘤植入後1週開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較至多120天。
比較在第0天經腫瘤細胞挑戰的未治療組小鼠與T APC治療組小鼠之腫瘤生長(以公式((長x寬2)/2)測量)，且雖然所有未治療組小鼠在第47天前達到人道終點，T APC組中除了2隻小鼠以外的所有T APC小鼠皆有顯著腫瘤生長延遲，剩餘小鼠(8)在用腫瘤再挑戰之前皆維持無腫瘤。有趣的是，當未治療小鼠在第64天植入腫瘤並與經腫瘤再植入彼等之對側脇部的T APC治療小鼠比較時，仍然有腫瘤生長延遲，其中3隻小鼠從未生長出可測量的腫瘤，即使在二次腫瘤挑戰之後。這些資料暗示，儘管經過二次腫瘤挑戰，用E7裝載T APC+佐劑之治療不僅可導致抗原特異性腫瘤生長抑制，且亦可導致甚至持久超過＞100天的腫瘤預防。 實例22
為了評估治療性疫苗場域中不同T APC濃度以及初免-加強時程的影響，以腫瘤對時間作圖的面積比較T APC治療小鼠(多個濃度及初免-加強時程)與未治療小鼠的HPV E7表現性TC1腫瘤模型的腫瘤生長。
在第0天，用TC1腫瘤細胞(50k個細胞/小鼠)注射C57BL/6J雌性小鼠的右後脇部。在第10天(初免)，自雌性C57BL/6J供體小鼠的脾臟藉由免疫磁性分離獲得鼠T細胞並經由SQZ(45 psi；3.5 μm縊縮)裝載預先複合的20 µM E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTF SSKSDSTLRLSVQSTHV DIR)+20 µM小鼠血清白蛋白(MSA)且在37℃下培育1小時。接著，以100 μL的媒劑(PBS)或T APC(0.25或1M個細胞/小鼠)+CpG 1826(25 μg/小鼠)眼後注射雌性C57BL/6J受者小鼠(10隻/組)。在第17天，初免/加強組以和第10天相同的方式接受T APC第二次注射。從腫瘤植入後1週開始測量TC-1腫瘤生長每週二次且與未治療小鼠中的腫瘤生長比較至多66天。
腫瘤生長(以公式((長x寬2)/2測量)及低劑量T APC組(0.25M個細胞/小鼠)+CpG(僅初免)僅導致腫瘤生長速率相較於未治療稍微延遲。包括第17天以低劑量T APC+CpG(0.25M初免/加強)加強見到相對於相同濃度僅初免條件增強的腫瘤生長抑制及相對於未治療遠遠較大的抑制。增加抗原裝載T APC的劑量至1M/小鼠(僅初免)相對於較低劑量T APC+CpG(僅初免)導致稍微腫瘤生長抑制。有趣的是，使用高劑量T APC+CpG(僅初免)導致防止腫瘤生長的最佳保護，其中腫瘤消退發生在第20至40天及任何觀察組中最高水準的生長抑制。綜上所述，這些資料強調增加細胞劑量、包括佐劑或初免+加強給藥時程可增強T APC疫苗的療效。 序列表
Figure 108108098-A0304-0001
圖1A顯示治療組及時程的代表性示意圖。圖1B顯示未治療組(無T細胞過繼性轉移)小鼠與圖1A概述之治療組B至E小鼠的腫瘤生長(以公式((長x寬2 )/2)測量)比較。
圖2A顯示評估E7抗原之代表性示意圖。圖2B顯示SLP序列對於因應TAPC 免疫接種所產製的產生IFN-γ之CD8+ T細胞的影響。
圖3的圖表顯示E6 SLP在體外人類模型中誘導E6應答T細胞的抗原特異性免疫反應的能力。
圖4顯示E7 SLP在體外人類模型中誘導E711-20 應答T細胞的抗原特異性免疫反應的能力以及SLP序列對於SQZ T細胞APC (Tapc )活化的影響。
圖5顯示評估在體外人類模型中用於SQZ T細胞APC的抗原劑量之研究結果。
圖6顯示判定在體外人類模型中用於SQZ T細胞APC的供體變異性之研究結果。
圖7A係比較使用不同佐劑之免疫反應強健性的實驗示意圖。圖7B顯示比較使用聚I:C及CpG ODN之免疫反應強健性的實驗結果。
圖8A係評估CpG ODN濃度對免疫反應之效應的實驗示意圖。圖8B顯示評估CpG ODN濃度對免疫反應之效應的實驗結果。
圖9A顯示評估CpG ODN給藥時程影響免疫反應之實驗的示意圖。圖9B顯示評估CpG ODN給藥時程影響免疫反應之實驗的結果。
圖10A係評估細胞內與全身性佐劑投予之組合的TAPC 抗腫瘤功能的實驗示意圖。圖10B顯示各實驗組的T細胞反應且圖10C顯示各實驗組的腫瘤生長。圖10D顯示用SQZ (E7+CpG)處理之動物相對於未治療動物在再挑戰之後的腫瘤生長。
圖11A係評估組合多個HPV抗原對於TAPC 抗腫瘤功能的效應之實驗示意圖。圖11B顯示各實驗組的T細胞反應且圖11C顯示各實驗組的腫瘤生長。
圖12A顯示評估CpG佐劑之投予途徑對於E7特異性TAPC 抗腫瘤效應的重要性之實驗結果。提供給藥時程。圖12B顯示各治療組內之個別小鼠的腫瘤體積隨時間之變化。
圖13顯示評估共投佐劑導致E7特異性T細胞腫瘤浸潤的能力之實驗示意圖。T細胞反應係顯示於下方之圖。
圖14A係判定裝載E7合成長肽(SLP) + CpG之TAPC 的初免及加強免疫接種時程的實驗示意圖。圖14B顯示各實驗組的腫瘤生長。
圖15顯示實驗結果，該結果顯示經SQZ處理之TAPC 可直接呈現抗原。
圖16顯示SQZ投遞佐劑不顯著改變體外T細胞之細胞介素水準。
圖17顯示SQZ投遞抗原+/-佐劑不顯著改變體內血清細胞介素水準。
圖18A顯示直方圖，該直方圖表示具有相對量的呈現在MHC-I上的最小表位之細胞族群。圖18B顯示藉由平均螢光強度測量之每細胞的抗原呈現量。
圖19顯示裝載CMV pp65抗原之T細胞在體外模型中誘導pp65應答T細胞的抗原特異性免疫反應的能力。
圖20顯示投予經SQZ裝載HPV16 E7 SLP之TAPC 且共投或不共投佐劑的情況下，腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)招募至腫瘤的相對量。
圖21顯示在判定經SQZ裝載T細胞作為APC用於預防性治療HPV相關腫瘤的短期(右脇部腫瘤，第0天注射)以及長期保護(左脇部腫瘤，第60天注射)能力之實驗中，腫瘤體積隨時間之變化。
圖22顯示在判定T細胞劑量、共投佐劑以及投予次數(初免相較於初免/加強)對於經SQZ裝載T細胞作為APC用於治療性治療HPV相關腫瘤之能力的效應之實驗中，腫瘤體積隨時間之變化。在圖22中，「P」指示初免，且「B」指示加強。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012

Claims (149)

  1. 一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原對該經修改的T細胞係外源性且包含免疫原性表位，且其中該佐劑存在於細胞內。
  2. 一種包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
  3. 一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備： a)將包含輸入T細胞(input T cell)之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原及該佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞(perturbed input T cell)；及 b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞； 藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。
  4. 如請求項3之經修改的T細胞，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與該經擾動的輸入T細胞培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  5. 如請求項3或4之經修改的T細胞，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原對該佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。
  6. 一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備： a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含該佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞；及 b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。
  7. 如請求項6之經修改的T細胞，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  8. 一種包含抗原及佐劑之經修改的T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位，該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備： a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含該抗原，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使該佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞；及 b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。
  9. 如請求項8之經修改的T細胞，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  10. 如請求項3至9中任一項之經修改的T細胞，其中變形力係於該輸入T細胞通過該縊縮時施加至該輸入T細胞，藉此造成該輸入T細胞之擾動。
  11. 如請求項3至10中任一項之經修改的T細胞，其中該製程進一步包含使該輸入T細胞及/或該經修改的T細胞與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。
  12. 如請求項11之經修改的T細胞，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物或作為穩定劑或輔助因子。
  13. 如請求項3至12中任一項之經修改的T細胞，其中該縊縮之直徑係小於該輸入T細胞之直徑。
  14. 如請求項13之經修改的T細胞，其中該縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約99%。
  15. 如請求項14之經修改的T細胞，其中該縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約60%。
  16. 如請求項1至15中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。
  17. 如請求項1至16中任一項之經修改的T細胞，其中該囊泡係胞內體。
  18. 如請求項1至17中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。
  19. 如請求項1至18中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原或免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。
  20. 如請求項1至19中任一項之經修改的T細胞，其中該佐劑係CpG寡去氧核苷酸(ODN)、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、咪喹莫特(imiquimod)、雷西喹莫特(resiquimod)或脂多醣(LPS)。
  21. 如請求項20之經修改的T細胞，其中該佐劑係CpG ODN。
  22. 如請求項21之經修改的T細胞，其中該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。
  23. 如請求項1至22中任一項之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自疾病相關抗原。
  24. 如請求項23之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。
  25. 如請求項1至24中任一項之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自非自身抗原。
  26. 如請求項1至25中任一項之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。
  27. 如請求項26之經修改的T細胞，其中該免疫原性表位係衍生自人類乳突病毒(HPV)抗原。
  28. 如請求項27之經修改的T細胞，其中該HPV係HPV-16或HPV-18。
  29. 如請求項27或28之經修改的T細胞，其中該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。
  30. 如請求項29之經修改的T細胞，其中該HLA-A2限制肽包含SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。
  31. 如請求項30之經修改的T細胞，其中該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
  32. 如請求項1至30中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。
  33. 如請求項32之經修改的T細胞，其中在向個體投予包含該複數個抗原的該經修改的T細胞之後，其中該複數個抗原包含該複數個免疫原性表位，該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。
  34. 如請求項1至33中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。
  35. 如請求項30之經修改的T細胞，其中該免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。
  36. 如請求項30之經修改的T細胞，其中該抗原係包含免疫原性肽表位及一或多個異源性肽序列之多肽。
  37. 如請求項34之經修改的T細胞，其中該抗原係包含在N端及/或C端側接異源性肽序列的免疫原性肽表位之多肽。
  38. 如請求項35之經修改的T細胞，其中該側接異源性肽序列係衍生自疾病相關免疫原性肽。
  39. 如請求項35之經修改的T細胞，其中該N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列。
  40. 如請求項1至39中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。
  41. 如請求項1至40中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含該佐劑的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  42. 如請求項1至41中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含該抗原的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  43. 如請求項1至42中任一項之經修改的T細胞，其中該抗原對該佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。
  44. 如請求項1至43中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
  45. 如請求項1至44中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞進一步包含藥劑，其中相較於不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。
  46. 如請求項45之經修改的T細胞，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。
  47. 如請求項45之經修改的T細胞，其中該藥劑係白蛋白。
  48. 如請求項47之經修改的T細胞，其中該白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。
  49. 如請求項45之經修改的T細胞，其中該藥劑係二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。
  50. 如請求項49之經修改的T細胞，其中該藥劑包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
  51. 如請求項1至50中任一項之經修改的T細胞，其中該細胞係經進一步修改以增加一或多種共刺激分子的表現。
  52. 如請求項51之經修改的T細胞，其中該共刺激分子係B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
  53. 如請求項51或52之經修改的T細胞，其中該細胞包含導致該一或多種共刺激分子表現增加的核酸。
  54. 如請求項1至53中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第一型表現。
  55. 如請求項1至54中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第二型表現。
  56. 如請求項54之經修改的T細胞，其中相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修改的T細胞所起始之先天免疫反應係減少。
  57. 如請求項54或56之經修改的T細胞，其中相較於不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
  58. 如請求項1至57中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞或天然殺手T細胞。
  59. 如請求項1至58中任一項之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞或γδ-T細胞。
  60. 一種組成物，其包含如請求項1至59中任一項之經修改的T細胞。
  61. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至59中任一項之經修改的T細胞及醫藥上可接受之載劑。
  62. 一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含向該個體投予如請求項1至59中任一項之經修改的T細胞、如請求項60之組成物或如請求項62之醫藥組成物。
  63. 一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含： a)向該個體投予包含抗原之經修改的T細胞，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列；及 b)向該個體投予佐劑。
  64. 一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含： a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位； b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及 c)向該個體投予該經修改的T細胞。
  65. 如請求項64之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間及/或與該經擾動的輸入T細胞培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  66. 如請求項64或65之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原對該佐劑之比例係介於約10000:1至約1:10000之間。
  67. 一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含： a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含佐劑，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位； b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及 c)向該個體投予該經修改的T細胞。
  68. 如請求項67之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  69. 一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含： a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，該輸入T細胞包含抗原，其中該抗原包含免疫原性表位，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞； b)使該經擾動的輸入T細胞與該佐劑培育足夠的時間，以允許該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞；及 c)向該個體投予該經修改的T細胞。
  70. 如請求項69之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該佐劑的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  71. 如請求項64至70中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含該抗原的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  72. 如請求項64至71中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含該佐劑的濃度介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  73. 如請求項64至72中任一項之方法，其中該經修改的T細胞中該抗原對該佐劑之比例係介於約10000:1與約1:10000之間。
  74. 如請求項64至73中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含複合物，該複合物包含：a)該抗原、b)該抗原及至少一種其他抗原及/或c)該抗原及該佐劑。
  75. 一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含： a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位； b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原培育足夠的時間，以允許該抗原進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原之經修改的T細胞； c)向該個體投予該經修改的T細胞；及 d)向該個體投予佐劑。
  76. 如請求項75之方法，其中與該經擾動的輸入T細胞培育之該抗原的濃度係介於約0.1 µM與約1 mM之間。
  77. 如請求項64至76中任一項之方法，其中變形力係於該輸入T細胞通過該縊縮時施加至該輸入T細胞，藉此造成該輸入T細胞之擾動。
  78. 如請求項64至77中任一項之方法，其進一步包含使該輸入T細胞及/或經修改的T細胞與藥劑培育之步驟，其中相較於未經該進一步培育步驟製備的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。
  79. 如請求項78之方法，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。
  80. 如請求項64至79中任一項之方法，其中該免疫反應係經增強。
  81. 如請求項80之方法，其中該增強的免疫反應係針對該抗原。
  82. 如請求項64至81中任一項之方法，其中該縊縮之直徑係小於該輸入T細胞之直徑。
  83. 如請求項82之方法，其中該縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約99%。
  84. 如請求項83之方法，其中該縊縮之直徑係該輸入T細胞之直徑的約20%至約60%。
  85. 如請求項64至84中任一項之方法，其中該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之胞質液及/或囊泡中。
  86. 如請求項64至85中任一項之方法，其中該囊泡係胞內體。
  87. 如請求項64至86中任一項之方法，其中該抗原及/或該佐劑係存在於該經修改的T細胞之多個隔室中。
  88. 如請求項64至87中任一項之方法，其中該抗原或免疫原性表位係與該經修改的T細胞之表面結合。
  89. 如請求項64至88中任一項之方法，其中該佐劑係CpG ODN、IFN-α、STING促效劑、RIG-I促效劑、聚I:C、咪喹莫特、雷西喹莫特及/或脂多醣(LPS)。
  90. 如請求項89之方法，其中該佐劑係CpG ODN。
  91. 如請求項90之方法，其中該CpG ODN係A型CpG ODN、B型CpG ODN或C型CpG ODN。
  92. 如請求項64至91中任一項之方法，其中該免疫原性表位係衍生自疾病相關抗原。
  93. 如請求項92之方法，其中該免疫原性表位係衍生自患病細胞所單離的肽或mRNA。
  94. 如請求項64至93中任一項之方法，其中該免疫原性表位係衍生自非自身抗原。
  95. 如請求項64至94中任一項之方法，其中該免疫原性表位係衍生自腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或真菌抗原。
  96. 如請求項95之方法，其中該免疫原性表位係衍生自人類乳突病毒(HPV)抗原。
  97. 如請求項96之方法，其中該HPV係HPV-16或HPV-18。
  98. 如請求項96或97之方法，其中該抗原包含衍生自HPV E6及/或E7之HLA-A2限制肽。
  99. 如請求項98之方法，其中該HLA-A2限制肽包含SEQ ID NO: 1至4中任一者之胺基酸序列。
  100. 如請求項99之方法，其中該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
  101. 如請求項64至100中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含複數個抗原，該複數個抗原包含複數個免疫原性表位。
  102. 如請求項64至101之方法，其中該複數個免疫原性表位無一降低該個體對任何其他該等免疫原性表位的免疫反應。
  103. 如請求項64至102中任一項之方法，其中該抗原係多肽且該免疫原性表位係免疫原性肽表位。
  104. 如請求項103之方法，其中該免疫原性肽表位係與N端側接多肽及/或C端側接多肽融合。
  105. 如請求項104之方法，其中與該N端側接多肽及/或該C端側接多肽融合之該免疫原性肽表位係非天然發生序列。
  106. 如請求項105之方法，其中該N端及/或C端側接多肽係衍生自免疫原性合成長肽(SLP)。
  107. 如請求項105之方法，其中該N端及/或C端側接多肽係衍生自疾病相關免疫原性SLP。
  108. 如請求項105之方法，其中該N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5至10中任一者之胺基酸序列及/或該C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11至17中任一者之胺基酸序列。
  109. 如請求項64至108中任一項之方法，其中該抗原能夠被處理成MHC第一型限制肽及/或MHC第二型限制肽。
  110. 如請求項64至109中任一項之方法，其中該經修改的T細胞進一步包含藥劑，其中相較於不包含該藥劑的對應經修改的T細胞，該藥劑增強該經修改的T細胞之存活性及/或功能。
  111. 如請求項110之方法，其中該藥劑係增強胞飲作用之化合物、穩定劑或輔助因子。
  112. 如請求項111之方法，其中該藥劑係白蛋白。
  113. 如請求項112之方法，其中該白蛋白係小鼠、牛或人白蛋白。
  114. 如請求項110之方法，其中該藥劑係二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。
  115. 如請求項64至114中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第一型表現。
  116. 如請求項64至115中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包含進一步修改以調節MHC第二型表現。
  117. 如請求項115之方法，其中相較於在個體中因應投予同種異體來源的不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞所起始之先天免疫反應，在個體中因應投予同種異體來源的該經修改的T細胞所起始之先天免疫反應係減少。
  118. 如請求項115或117之方法，其中相較於不包含該進一步修改的對應經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期，該經修改的T細胞在所投予之個體體內的循環半衰期係增加。
  119. 如請求項64至118中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包括一或多種輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞或天然殺手T細胞。
  120. 如請求項64至119中任一項之方法，其中該經修改的T細胞包括一或多種CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD45RA+ T細胞、CD45RO+ T細胞或γδ-T細胞。
  121. 如請求項64至120中任一項之方法，其中該經修改的T細胞對該個體係同種異體。
  122. 如請求項64至121中任一項之方法，其中該經修改的T細胞對該個體係自體。
  123. 如請求項64至122中任一項之方法，其中該個體係經預先調理以調節發炎及/或免疫反應。
  124. 如請求項64至123中任一項之方法，其進一步包含向該個體投予第二佐劑。
  125. 如請求項124之方法，其中該第二佐劑係IFN-α、LPS或CpG ODN。
  126. 如請求項124或125之方法，其中該經修改的T細胞及該第二佐劑係同期(concurrently)或同時(simultaneously)投予。
  127. 如請求項124或125之方法，其中該經修改的T細胞及該第二佐劑係依序投予。
  128. 如請求項124至127之方法，其中該經修改的T細胞係於投予該第二佐劑之前投予。
  129. 如請求項124至128之方法，其中該經修改的T細胞係於投予該第二佐劑之後投予。
  130. 如請求項64至129之方法，其中該經修改的T細胞係於投予免疫檢查點抑制劑之前、同期或之後投予。
  131. 如請求項130之方法，其中該免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中任一者。
  132. 如請求項64至131之方法，其中該經修改的T細胞係於投予化學療法之前、同期或之後投予。
  133. 如請求項132之方法，其中該化學療法包含順鉑(cisplatin)。
  134. 如請求項64至133中任一項之方法，其中向該個體投予該經修改的T細胞導致對該抗原具特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活化及/或擴增。
  135. 如請求項64至134中任一項之方法，其中向該個體投予該經修改的T細胞導致對該抗原具特異性的輔助T (Th)細胞活化及/或擴增。
  136. 如請求項64至135中任一項之方法，其中向該個體投予之該經修改的T細胞的量係介於約1 x 106 與約1 x 1012 個細胞之間。
  137. 如請求項64至136中任一項之方法，其中該方法包含多次投予該經修改的T細胞。
  138. 如請求項137之方法，其中該經修改的T細胞之二次連續投予之間的時間間隔係介於約1天與約30天之間。
  139. 一種用於調節個體的免疫反應之方法，其包含：向該個體投予與抗原相關之經修改的T細胞，其中該經修改的T細胞係藉由包含下列步驟之製程製備： a)使輸入T細胞與抗原及/或佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原與該輸入T細胞之細胞表面連結，其中該抗原包含免疫原性表位，藉此產製與該抗原相關之經修改的T細胞；及 b)向該個體投予該經修改的T細胞。
  140. 如請求項139之方法，其中該HPV抗原包含與SEQ ID NO: 18至25中任一者具有至少90%相似性之胺基酸序列。
  141. 如請求項140之方法，其中該HPV抗原包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列。
  142. 如請求項139至141中任一項之方法，其中該佐劑係CpG ODN或LPS。
  143. 如請求項142之方法，其中該CpG ODN係CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
  144. 一種包含如請求項1至59中任一項之經修改的T細胞之組成物，其用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法。
  145. 一種包含如請求項1至59中任一項之經修改的T細胞之組成物，其用於調節個體的免疫反應之方法，該方法包含向該個體投予該經修改的T細胞。
  146. 一種包含經修改的T細胞之組成物，其用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法，其中該經修改的T細胞包含抗原，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
  147. 一種包含經修改的T細胞之組成物，其用於調節個體的免疫反應之方法，其中該經修改的T細胞包含抗原，該抗原包含SEQ ID NO: 18至25中任一者之胺基酸序列。
  148. 一種包含經修改的T細胞之組成物，其用於藉由手術、療法或診斷以治療人體或動物體之方法，其中該經修改的T細胞係藉由方法製備，該方法包含： a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位； b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之該經修改的T細胞。
  149. 一種包含經修改的T細胞之組成物，其用於調節個體的免疫反應之方法，其中該經修改的T細胞係藉由方法製備，該方法包含： a)將包含輸入T細胞之細胞懸浮液通過細胞變形縊縮，其中該縊縮之直徑隨著該懸浮液中該輸入T細胞的直徑變化，藉此造成該輸入T細胞的擾動，該擾動大到足以使抗原及佐劑通過以形成經擾動的輸入T細胞，其中該抗原包含免疫原性表位； b)使該經擾動的輸入T細胞與該抗原及該佐劑培育足夠的時間，以允許該抗原及該佐劑進入該經擾動的輸入T細胞，藉此產製包含該抗原及該佐劑之經修改的T細胞。
TW108108098A 2018-03-12 2019-03-11 細胞內投遞生物分子以修改免疫反應之方法 TW202003019A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862641987P 2018-03-12 2018-03-12
US62/641,987 2018-03-12
US201862738941P 2018-09-28 2018-09-28
US62/738,941 2018-09-28
US201962794516P 2019-01-18 2019-01-18
US62/794,516 2019-01-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202003019A true TW202003019A (zh) 2020-01-16

Family

ID=66102189

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108108098A TW202003019A (zh) 2018-03-12 2019-03-11 細胞內投遞生物分子以修改免疫反應之方法

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP3765068A2 (zh)
JP (1) JP2021517813A (zh)
KR (1) KR20200130835A (zh)
CN (1) CN112135627A (zh)
AU (1) AU2019234550A1 (zh)
BR (1) BR112020018612A2 (zh)
CA (1) CA3093828A1 (zh)
CO (1) CO2020012584A2 (zh)
CR (1) CR20200460A (zh)
IL (1) IL277188A (zh)
MA (1) MA52010A (zh)
MX (1) MX2020009439A (zh)
PH (1) PH12020551436A1 (zh)
RU (1) RU2020132504A (zh)
SG (1) SG11202008864VA (zh)
TW (1) TW202003019A (zh)
WO (1) WO2019178006A2 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11613759B2 (en) 2015-09-04 2023-03-28 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
WO2020166729A1 (ja) * 2019-02-14 2020-08-20 学校法人獨協学園獨協医科大学 Ｔ細胞ワクチン
AU2020228648A1 (en) 2019-02-28 2021-10-14 Sqz Biotechnologies Company Delivery of biomolecules to PBMCs to modify an immune response
US11679388B2 (en) 2019-04-08 2023-06-20 Sqz Biotechnologies Company Cartridge for use in a system for delivery of a payload into a cell
TW202207975A (zh) 2020-05-11 2022-03-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用經修飾之ｐｂｍｃ及免疫結合體之組合療法
CN116322752A (zh) 2020-07-29 2023-06-23 Sqz生物技术公司 使用无核细胞刺激对突变体ras的免疫应答的方法
WO2022026620A1 (en) 2020-07-29 2022-02-03 Sqz Biotechnologies Company Methods to stimulate immune responses to mutant ras using nucleated cells
CA3203356A1 (en) 2020-12-29 2022-07-07 Oliver Rosen Methods for treating cancers with activating antigen carriers
US20220233677A1 (en) 2020-12-29 2022-07-28 Sqz Biotechnologies Company Methods for treating cancers with modified pbmcs
CN116847880A (zh) 2020-12-29 2023-10-03 Sqz生物技术公司 活化抗原载体的调配物
CN116801719A (zh) 2020-12-29 2023-09-22 Sqz生物技术公司 用于pbmc冷冻保存的调配物
CN115252772A (zh) * 2021-04-30 2022-11-01 华普生物技术(江苏)股份有限公司 人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸在疫苗中的应用
WO2023010090A1 (en) 2021-07-29 2023-02-02 Sqz Biotechnologies Company Methods to generate enhanced tumor infiltrating lymphocytes through microfluidic delivery
WO2023087009A1 (en) 2021-11-11 2023-05-19 Sqz Biotechnologies Company Methods to generate enhanced tumor infiltrating lymphocytes through microfluidic delivery
WO2024026491A2 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Sqz Biotechnologies Company Enhanced antigen presenting cell formulations
WO2024026492A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Sqz Biotechnologies Company Methods for treating cancer with enhanced antigen presenting cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003290460A1 (en) * 2003-12-24 2005-07-14 Leiden University Medical Center Synthetic protein as tumor-specific vaccine
WO2009002159A2 (en) * 2007-05-31 2008-12-31 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Intradermal hpv peptide vaccination
ES2679043T3 (es) * 2009-05-15 2018-08-21 Irx Therapeutics, Inc. Inmunoterapia de vacuna
RS59898B1 (sr) 2011-10-17 2020-03-31 Massachusetts Inst Technology Intraćelijsko davanje
CN107109362A (zh) * 2014-10-31 2017-08-29 麻省理工学院 递送生物分子至免疫细胞
ES2930017T3 (es) 2015-09-04 2022-12-05 Sqz Biotechnologies Co Suministro intracelular de biomoléculas mediado por una superficie con poros
US20190017072A1 (en) * 2016-01-12 2019-01-17 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of complexes

Also Published As

Publication number Publication date
MA52010A (fr) 2021-01-20
WO2019178006A3 (en) 2019-11-07
RU2020132504A3 (zh) 2022-04-13
WO2019178006A2 (en) 2019-09-19
SG11202008864VA (en) 2020-10-29
IL277188A (en) 2020-10-29
PH12020551436A1 (en) 2021-09-06
CO2020012584A2 (es) 2020-11-20
CN112135627A (zh) 2020-12-25
EP3765068A2 (en) 2021-01-20
AU2019234550A1 (en) 2020-10-01
CR20200460A (es) 2020-11-23
CA3093828A1 (en) 2019-09-19
RU2020132504A (ru) 2022-04-13
MX2020009439A (es) 2021-01-08
KR20200130835A (ko) 2020-11-20
JP2021517813A (ja) 2021-07-29
BR112020018612A2 (pt) 2020-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW202003019A (zh) 細胞內投遞生物分子以修改免疫反應之方法
TW202003025A (zh) 用於治療ｈｐｖ相關疾病之方法
AU2017259988B2 (en) Intracellular delivery of biomolecules to induce tolerance
US11692168B2 (en) Delivery of biomolecules to PBMCs to modify an immune response
US20210388390A1 (en) Intracellular delivery of biomolecules to enhance antigen presenting cell function
CA3127665A1 (en) Anucleate cell-derived vaccines
RU2799784C2 (ru) Способы лечения заболеваний, ассоциированных с впч
US20240132839A1 (en) DELIVERY OF BIOMOLECULES TO PBMCs TO MODIFY AN IMMUNE RESPONSE
CN116261465A (zh) 使用有核细胞刺激对突变体ras的免疫应答的方法