CN116322752A - 使用无核细胞刺激对突变体ras的免疫应答的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了包括突变的Ras抗原(如突变的K‑Ras抗原)的无核细胞，制备包括所述突变的Ras抗原的此类无核细胞的方法，以及使用此类经修饰的无核细胞以刺激免疫应答、治疗和/或对患有与Ras突变相关的癌症的个体进行疫苗接种的方法。
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相关申请交叉引用
本申请要求于2020年7月29日提交的美国临时申请第63/058,438号的优先权，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。
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技术领域
本公开总体上涉及包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡，制备此类无核细胞源性囊泡的方法，以及使用此类无核细胞源性囊泡用于治疗与突变的Ras蛋白相关的癌症的方法。
背景技术
Ras是最著名的原癌基因之一。它的功能获得突变发生在大约30％的人类癌症中。作为最常见的突变的Ras同种型，K-Ras在过去几年中得到了广泛的研究。尽管其在癌症恶性肿瘤中的重要性得到公认，但在过去三十年中的持续努力未能开发出K-Ras突变体癌症的疗法，并且迄今为止，尚未批准此类恶性肿瘤的疗法。因此，K-Ras一直被认为是无成药性的。
Ras超家族的成员基于其结构、序列和功能分为家族和亚家族。K-Ras属于被称为Ras超家族或RAS样GTP酶的一组小的三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白。在人类中，三种RAS基因编码高度同源的RAS蛋白，H-Ras、N-Ras和K-Ras。K-Ras是引发信号传导分子阵列的激活的前线传感器之一，允许将转导信号从细胞表面传递到细胞核，并影响一系列基本的细胞过程，如细胞分化、生长、趋化和凋亡。K-Ras同种型是突变最频繁的同种型，并且占RAS突变的86％。K-Ras同种型中有两种已知的同种型剪接变体：K-Ras4A和K-Ras4B。K-Ras4B剪接变体是人类癌症中具有突变的主要同种型，并且其存在于大约90％的胰腺癌、30％至40％的结肠癌和15％至20％的肺癌中，大多数是非小细胞肺癌(NSCLC)(Liu,P.等人,《药学学报(Acta Pharmaceutica Sinica B)》,2019,9(5):871-879)。其也存在于胆道恶性肿瘤、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌、骨髓性白血病和乳腺癌中。尽管其很流行，但数十年来在发现RAS靶向疗法方面的努力一再未能产生临床批准的药物。
免疫疗法可以分为两种主要类型的干预，被动或主动。被动方案包含施用预激活和/或工程化细胞(例如，CAR T细胞)、疾病特异性治疗抗体和/或细胞因子。主动免疫疗法策略旨在刺激体内免疫系统效应子功能。若干种目前主动方案包含使用疾病相关肽、裂解物或同种异体全细胞的疫苗接种策略，输注自体树突细胞(DC)作为肿瘤抗原递送的媒剂，以及输注免疫检查点调节剂。参见Papaioannou,Nikos E.等人《转化医学年鉴(Annals oftranslational medicine)》4.14(2016)。过继免疫疗法可以用于调节免疫应答，增强抗肿瘤活性，并实现治疗或预防与Ras突变相关的癌症的目标。
由疾病相关抗原刺激的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助性T(Th)细胞具有靶向和破坏患病细胞的潜力；然而，目前用于诱导内源性T细胞应答的方法已经面临挑战。本文所描述的方法用于以高通量方式有效地产生包括突变的Ras抗原的有核细胞，所述有核细胞可以用于诱导对突变的Ras抗原的强有力的T细胞应答。
在本文中引用的所有文献，包含专利申请和出版物，通过引用整体并入本文。专利公开WO 2016070136、US 20180142198、WO 2017/008063、US 20180201889、WO 2019/178005以及WO 2019178006和PCT/US2020/020194特此通过引用整体并入本文。
发明内容
在一些方面，本发明提供了用于刺激对个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些方面，本发明提供了用于减少个体的肿瘤生长的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些方面，本发明提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些方面，本发明提供了包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物的方法，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。
在本文所描述的方法的一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原、突变的H-Ras抗原或突变的N-Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras4A抗原或突变的K-Ras4B抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是单个多肽，所述单个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原与其它抗原或佐剂复合。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变。在一些实施例中，突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:9-15中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:9-15的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29、G12V1-16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42抗原中的一种或多种。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHCI类限制性肽。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在本文所描述的方法的一些实施例中，所述无核细胞进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述组合物与佐剂联合施用。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
在本文所描述的方法的一些实施例中，包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，包括所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施例中，包括多个输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
在本文所描述的方法的一些实施例中，所述无核细胞是红细胞或血小板。在一些实施例中，所述无核细胞是红细胞或网织红细胞。在一些实施例中，包括所述无核细胞源性囊泡的所述组合物被施用多次。在一些实施例中，所述组合物是被静脉内施用。在一些实施例中，所述个体是人。
在本文所描述的方法的一些实施例中，在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。在一些实施例中，另一种疗法是化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或用于免疫肿瘤疗法的双特异性多肽。
在一些方面，本发明提供了组合物，其包括无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
在一些方面，本发明提供了组合物，其包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂，其中包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些方面，本发明提供了组合物，其包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原，其中包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞，其中所述核酸表达所述突变的Ras抗原；由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。在一些方面，本发明提供了组合物，其包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原和佐剂，其中包括所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞通过以下制备：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施例中，包括输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
在本文所描述的组合物的一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞或血小板。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞或网织红细胞。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡是网织红细胞源性囊泡或红细胞源性囊泡。
在本文所描述的组合物的一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原、突变的H-Ras抗原或突变的N-Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras4A抗原或突变的K-Ras4B抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是单个多肽，所述单个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原与其它抗原或佐剂复合。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:9-15中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:9-15的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29抗原、G12V1-16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42抗原中的一种或多种。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ IDNO:1-8的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在本文所描述的组合物的一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
在一些方面，本发明提供了用于本文所描述的方法中任何方法的试剂盒。在一些方面，本发明提供了包括本文所描述的组合物中的任一种组合物的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器或具有用于向个体施用所述组合物以刺激对突变的Ras的免疫应答、减少肿瘤生长和/或治疗癌症的说明的包装插页中一种或多种。
在一些方面，本发明提供了用于产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法；所述方法包括将所述突变的Ras抗原细胞内引入到所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。在一些实施例中，将所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂细胞内引入到无核细胞源性囊泡包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，将所述突变的Ras抗原细胞内引入到所述无核细胞源性囊泡包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞，其中所述核酸表达所述突变的Ras抗原；由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡进一步细胞内包括佐剂，其中将所述突变的Ras抗原和所述佐剂细胞内引入到所述无核细胞包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施例中，包括多个输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
附图说明
图1示出了通过在25℃(RT)、37℃和4℃下进行的收缩介导的递送(挤压)，将荧光标记的突变体Ras合成长肽细胞内递送到RBC中的功效。
图2示出了通过收缩介导的递送(挤压)，将两个荧光标记的突变体Ras合成长肽细胞内递送到RBC中的功效。
图3A是给药组和方案的示意图，示出了在鼠模型中施用IFA/HBV/G12V7-16(肽乳液)和/或ACG12V1-16/poly I:C(包括与poly I:C共同施用的KRas-G12V1-16的抗原载体)，以及随后的组织采集和免疫活性测定(IFN-γELISPOT)。图3B展示了施用IFA/HBV/G12V7-16或AACG12V1-16/poly I:C的剂量组成。图3C展示了从鼠模型中采集组织后的体外扩增流程。图3D示出了挤压加工后或挤压加工和富集后，所指示的红细胞源性载体(抗原载体)中的影泡群体的百分比。图3E示出了RBC的挤压加工后抗原载体的回收百分比。图3F示出了展示出细胞表面磷脂酰丝氨酸(膜联蛋白V染色)的富集AC群体(单峰群体-左侧；影泡群体-右侧)。图3G示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入后，在杀死时采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中每5e5个细胞的斑点形成单位(SFU)。图3H示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入，以及进行6天体外培养之后，在采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中每2e4个细胞的SFU(上图)或每1e6个细胞的SFU(下图)。
图4A是示出了在鼠模型中施用ACG12V1-16/poly I:C，以及随后的组织采集和免疫活性(IFN-γELISPOT)的测定的给药组和方案的示意图。图4B示出了挤压加工后或挤压加工和富集后，所指示的红细胞源性载体(抗原载体)中的影泡群体的百分比。图4C示出了RBC的挤压加工后抗原载体的回收百分比。图4D示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入之后，在杀死时采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中每5e5个细胞的SFU(上图)或每1e6个细胞的SFU(下图)。图4E示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入后，在杀死时采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中的斑点强度(上图)和斑点大小(下图)。图4F示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入，以及进行6天体外培养之后，在采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中每2e4个细胞的SFU(上图)或每1e6个细胞的SFU(下图)。图4G示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入，以及进行6天体外培养之后，在采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中的斑点强度(上图)和斑点大小(下图)。
图5A是示出了在鼠模型中施用ACG12V1-16/poly I:C或AACG12V1-16(内部包括KRas-G12V1-16+polyI:C的活化抗原载体)，以及随后的组织采集和免疫活性测定(IFN-γELISPOT)的给药组和方案的示意图。图5B示出了挤压加工后或挤压加工和富集后，所指示的红细胞源性载体(AC或AAC)中的影泡群体的百分比。图5C示出了RBC的挤压加工后AC和AAC的回收百分比。图5D示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入后，在杀死时采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中每1e6个细胞的SFU。图5E示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入，以及进行6天体外培养之后，在采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中每1e6个细胞的SFU。
图6A是示出了在鼠模型中施用AACG12V1-16(内部包括KRas-G12V1-16+polyI:C的活化抗原载体)，以及随后的组织采集和免疫活性测定(IFN-γELISPOT)的给药组和方案的示意图。图6B示出了挤压加工后或挤压加工和富集后，所指示的红细胞源性载体(AAC)中的影泡群体的百分比。图6C示出了RBC的挤压加工后AAC的回收百分比。图6D示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入后，在杀死时采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中每1e6个细胞的SFU。图6E示出了在用所指示的蛋白质(G12V7-16或MART-1)或对照(培养基)掺入后，在杀死时采集的鼠细胞的IFN-γELISPOT测定中每1e6个细胞的SFU。
具体实施方式
在一些方面，本发明提供了用于治疗或预防与Ras突变相关的癌症和/或刺激患有与Ras突变相关的癌症的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用包括无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)的组合物，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原。在一些方面，本发明提供了用于治疗与Ras突变相关的癌症和/或刺激患有与Ras突变相关的癌症的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，所述无核细胞源性囊泡包括细胞内递送的突变的Ras抗原；其中所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：首先使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩物，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原通过以形成扰动的输入无核细胞；并且然后将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原进入所述扰动的输入细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。本公开的某些方面涉及用于产生包括无核细胞源性囊泡的组合物的方法，所述无核细胞源性囊泡包括细胞内递送的突变的Ras抗原，其中输入无核细胞通过收缩，其中所述收缩使所述细胞变形，由此使得所述细胞扰动，使得突变的Ras抗原和/或佐剂进入无核细胞，由此产生包括Ras抗原和/或佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些方面，本发明提供了用于治疗或预防与Ras突变相关的癌症(如与K-Ras突变相关的癌症)和/或调节患有与Ras突变相关的癌症的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡细胞内包括突变的Ras抗原。在一些方面，本发明提供了用于治疗或防止与Ras突变相关的癌症和/或调节患有与Ras突变相关的癌症的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡细胞内包括突变的Ras抗原，其中所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：首先使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩物，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原通过以形成扰动的输入无核细胞；并且然后将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。本公开的某些方面涉及用于产生包括无核细胞源性囊泡的组合物的方法，其中输入无核细胞通过收缩，其中所述收缩使输入无核细胞变形，由此引起输入无核细胞的扰动，使得突变的Ras抗原进入扰动的输入无核细胞，由此产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。在一些另外的实施例中，用于治疗与Ras突变相关的癌症和/或刺激对患有与Ras突变相关的癌症的个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的方法进一步包括向所述个体施用佐剂。
通用技术
本文所述或所引用的技术和程序总体上被本领域的技术人员充分理解并通常用于使用常规方法，例如，以下中描述的广泛使用的方法：《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》(Sambrook等人,第4版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.),2012)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编辑,2003)；丛书《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；《聚合酶链反应2：一种实用方法(PCR 2:A Practical Approach)》(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995)；《抗体实验室手册(Antibodies,ALaboratory Manual)》(Harlow和Lane编辑,1988)；《动物细胞的培养：基础技术和专门应用手册(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and SpecializedApplications)》(R.I.Freshney,第6版,约翰威利父子出版公司(J.Wiley和Sons),2010)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis编辑,学术出版社(AcademicPress),1998)；《细胞和组织培养概论(Introduction to Cell and Tissue Culture)(J.P.Mather和P.E.Roberts,普莱纽姆出版社(Plenum Press),1998)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,约翰威利父子出版公司,1993-8)；《实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1996)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》,(Mullis等人编辑,1994)；《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols inMolecular Biology)》(Ausubel等人编辑,约翰威利父子出版公司,2002)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway等人,2004)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:A Practical Approach)》(D.Catty.编辑,IRL出版社(IRLPress),1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal Antibodies:A PracticalApproach)》(P.Shepherd和C.Dean编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:A Laboratory Manual)》(E.Harlow和D.Lane,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1999)；《抗体(The Antibodies)》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,哈伍德学术出版社(Harwood AcademicPublishers),1995)；以及《癌症：肿瘤学原理和实践(Cancer:Principles and Practiceof Oncology)》(V.T.DeVita等人编辑,J.B.利平科特出版公司(J.B.LippincottCompany),2011)
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且每当适当时，以单数形式使用的术语也将包含复数形式，并且反之亦然。如果以下阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，则以以下阐述的定义为准。
除非另有说明，否则如本文所用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。
如本文所用，术语“包括(comprising)”、“具有(having)”、“含有(containing)”和“包含(including)”以及其它类似的形式及其语法上的等效物，旨在意思上是等效的，并且是开放式的，因为这些词语中的任何一个后面的一个或多个项目并不意味着是此类一个或多个项目的详尽列举，或者意味着仅局限于所列出的一个或多个项目。例如，“包括”组分A、B和C的制品可以由组分A、B和C组成(即，仅含有)，或者可以不仅含有组分A、B和C，还含有一种或多种其它组分。因此，意图和理解“包括”及其类似形式，以及其语法等效物，包含“基本上由…组成”或“由…组成”的实施例的公开内容。
在提供值的范围的情况下，应理解在该范围的上限与下限之间的每个插入值(到下限的十分之一单位，除非上下文清楚地另外指明)以及在所陈述范围内的任何其它所陈述的值或插入值均被涵盖在本公开内，服从所述范围中任何具体排除的限制。在所陈述的范围包含限值中的一个或两个限值的情况下，排除被包含在内的限值中的任一个或两个限值的范围也包含在本公开内。
如本文所用，术语“约”是指所属技术领域的技术人员易于知晓的相应值的常见偏差范围。本文中提到“约”一个值或参数包含(并且描述)针对所述值或参数本身的实施例。例如，提及“大约X”的描述包含对“X”的描述。
如本文所用，“无核细胞”是指缺少细胞核的细胞。此类细胞可以包含但不限于血小板、红细胞(RBC)，如红细胞和网织红细胞。网织红细胞是未成熟的(例如，尚未双凹的)红细胞，通常占人体中红细胞的约1％。网织红细胞也是无核的。在某些实施例中，本文所描述的系统和方法用于处理和/或加工富集的(例如，包括比在自然界中发现的更大百分比的总细胞群体)、纯化的或分离的(例如，从其自然环境中，以基本上纯的或均质的形式)无核细胞群体(例如，红细胞、网织红细胞和/或血小板)。在某些实施例中，本文所描述的系统和方法用于处理和/或加工含有RBC(例如，红细胞或网织红细胞)、血小板以及其它血细胞的全血。这些细胞类型的纯化或富集是使用已知方法完成的，如密度梯度系统(例如，Ficoll-Hypaque)、荧光激活细胞分选(FACS)、磁性细胞分选或成红细胞和红系前体的体外分化。
如本文所用，术语“囊泡”是指包括被脂质双层封闭的液体的结构。在一些实例中，脂质双层来源于天然存在的脂质组合物。在一些实例中，脂质双层可以来源于细胞膜。在一些实例中，囊泡可以源自各种实体，如细胞。在此类实例中，囊泡可以保留来自原始实体的分子(如细胞内蛋白质或膜组分)。例如，源自红细胞的囊泡可以含有红细胞和/或红细胞的膜组分中的任何数量的细胞内蛋白质。在一些实例中，除了期望的有效载荷之外，囊泡可以在细胞内含有任何数量的分子。
如本文所用，“有效载荷”是指被递送到(如装载在)无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)中的物质。“有效载荷”、“货物”、“递送材料”和“化合物”在本文中可互换使用。在一些实施例中，有效载荷可以指蛋白质、小分子、核酸(例如，RNA和/或DNA)、脂质、碳水化合物、大分子、维生素、聚合物、荧光染料和荧光团、碳纳米管、量子点、纳米颗粒和类固醇。在一些实施例中，有效载荷可以指蛋白质或小分子药物。在一些实施例中，有效载荷可以包括一种或多种化合物。
如本文所用，术语“孔”是指开口，包含但不限于材料内的洞、裂缝、空腔、开孔、裂缝、间隙或穿孔。在一些实例中，(在所指示的地方)所述术语是指本公开的表面内的孔。在其它实例中，(在所指示的地方)孔可以指细胞膜中的孔。
如本文所用，术语“膜”是指含有孔的选择性屏障或薄片。所述术语包含作为边界或衬里的柔韧片状结构。在一些实例中，所述术语是指含有孔的表面或过滤器。该术语不同于术语“细胞膜”。
如本文所用，术语“过滤器”是指允许选择性通过孔的多孔制品。在一些实例中，所述术语是指含有孔的表面或膜。
术语“异源”在其涉及如编码序列和控制序列等核酸序列时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在自然界中未发现与其它分子缔合的另一个核酸分子内或与其附着的核酸区段。例如，核酸构建体的异源区域可以包含由在自然界中未发现与编码序列缔合的序列侧接的编码序列。异源编码序列的另一实例是其中编码序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，对于本发明的目的，将用通常不存在于细胞中的构建体转化的细胞视为异源的。如本文所用，等位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源DNA。
术语“异源”在其涉及如肽序列和多肽序列等氨基酸序列时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，肽序列的“异源”区是在另一个氨基酸分子内或与其连接的氨基酸片段，未发现其在自然界中与其它分子相关。例如，肽构建体的异源区可以包含肽的氨基酸序列，所述肽侧接未发现与自然界中的肽的氨基酸序列相关的序列。异源肽序列的另一实例是其中肽序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因编码的氨基酸的合成序列)。类似地，对于本发明的目的，将用表达通常不存在于细胞中的氨基酸构建体的载体转化的细胞视为异源的。如本文所用，等位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源肽。
术语“外源”在用于指如抗原或佐剂等与细胞或细胞源性囊泡相关的药剂时，是指细胞外的药剂或从细胞外递送至细胞内的药剂。所述细胞可能已经存在或可能不存在药剂，并且在外源药剂被递送后可能产生或可能不产生药剂。
如本文所用，术语“同源”是指源自相同生物体的分子。在一些实例中所述术语是指通常在给定生物体内发现或表达的核酸或蛋白质。
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益或期望的结果(包含临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包含但不限于以下一项或多项：减轻由疾病引起的一种或多种症状；减轻疾病的程度；稳定疾病(例如，预防或延缓疾病的恶化)；预防或延缓疾病的传播(例如，转移)；防止或延缓疾病的复发；延缓或减慢疾病的进展；改善疾病状态；缓解疾病(部分或全部)；降低治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量；延缓疾病的发展；提高或改善生活质量；增加体重增加；和/或延长生存期。“治疗”还涵盖减少癌症的病理学结果(如例如，肿瘤体积)。本发明的方法设想了治疗的这些方面中的任何一个或多个。
如本文所用，术语“预防性治疗”是指治疗，其中已知或怀疑个体患有某种病症或处于患有所述病症的风险，但没有表现出所述病症的症状或轻微症状。接受预防性治疗的个体可以在症状发作之前接受治疗。在一些实施例中，如果个体患有癌前病变，尤其是具有Ras突变的癌前病变，则可以对所述个体进行治疗。
如本文所用，“组合疗法”意指第一药剂与另一种药剂联合施用。“与…联合”是指除了另一种治疗模式之外还施用一种治疗模式，如除了对同一个体施用如本文所描述的免疫缀合物之外还施用如本文所描述的有核细胞的组合物。因此，“与…联合”是指在向个体递送另一种治疗模式之前、期间或之后施用一种治疗模式。
如本文所用，术语“同时施用”意指组合疗法中的第一疗法和第二疗法的施用时间间隔不超过约15分钟，如不超过约10、5或1分钟中的任一个。当同时施用第一疗法和第二疗法时，第一疗法和第二疗法可以包含在相同组合物(例如，包括第一疗法和第二疗法两者的组合物)中或包含在单独的组合物中(例如，第一疗法包含在一种组合物中并且第二疗法包含在另一种组合物中)。
如本文所用，术语“顺序施用”是指组合疗法中的第一疗法和第二疗法的施用时间间隔超过约15分钟，如超过约20、30、40、50、60或更多分钟中的任一个。可以首先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法包含在单独的组合物中，所述单独的组合物可以包含在相同或不同的包装或试剂盒中。
如本文所用，术语“同时施用”意指在组合疗法中的第一疗法的施用和第二疗法的施用相互重叠。
在癌症的情况下，术语“治疗”包含杀伤癌细胞、抑制癌细胞生长、抑制癌细胞复制、减轻整体肿瘤负担和改善一种或多种与疾病相关的症状中的任何一种或全部。
如本文所用，术语“调节”可以指更改、改变、变化或以其它方式修改特定靶标的存在或活性的行为。例如，调节免疫应答可以指引起更改、改变、变化或以其它方式修饰免疫应答的任何行为。在一些实例中，“调节”是指增强特定靶标的存在或活性。在一些实例中，“调节”是指抑制特定靶标的存在或活性。在其它实例中，调节核酸表达可以包含但不限于核酸转录的变化、mRNA丰度的变化(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的对应变化、mRNA翻译的变化等。
如本文所用，术语“抑制”可以指阻断、减少、消除或以其它方式拮抗特定靶标的存在或活性的行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫应答可以指引起免疫应答的阻断、减少、消除或任何其它拮抗作用的任何行为。在其它实例中，核酸表达的抑制可以包含但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制、基因编辑等。在其它实例中，蛋白质表达的抑制可以包含但不限于，编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的减少、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的减少等。在另一个实例中，抑制可以指减缓或停止生长的行为；例如，延缓或防止肿瘤细胞的生长。
如本文所用，术语“压制”可以指降低、减少、禁止、限制、减轻或以其它方式减弱特定靶标的存在或活动的行为。压制可以指部分压制或完全压制。例如，压制免疫应答可以指引起降低、减少、禁止、限制、减轻或以其它方式减弱免疫应答的任何行为。在其它实例中，核酸表达的压制可以包含但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。在其它实例中，蛋白质表达的压制可以包含但不限于，编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的减少、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的减少等。
如本文所用，术语“增强”可以指改善、加强、提高或以其它方式增加特定靶标的存在或活性的行为。例如，增强免疫应答可以指引起改善、加强、提高或以其它方式增加免疫应答的任何行为。在一个示例性实例中，增强免疫应答可以指使用抗原和/或佐剂来改善、加强、提高或以其它方式增加免疫应答。在其它实例中，核酸表达的增强可以包含但不限于核酸转录的增加、mRNA丰度的增加(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的减少、mRNA翻译的增加等。在其它实例中，增强蛋白质的表达可以包含但不限于增加编码蛋白质的核酸的转录、增加编码蛋白质的mRNA的稳定性、增加蛋白质的翻译、增加蛋白质的稳定性等。
如本文所用，术语“诱导”可以指引发、提示、刺激、建立或以其它方式产生结果的行为。例如，诱导免疫应答可以指引起引发、促使、刺激、建立或以其它方式产生期望的免疫应答的任何行为。在其它实例中，诱导核酸表达可以包含但不限于引发核酸转录、引发mRNA翻译等。在其它实例中，诱导蛋白质的表达可以包含但不限于增加编码蛋白质的核酸的转录、增加编码蛋白质的mRNA的稳定性、增加蛋白质的翻译、增加蛋白质的稳定性等。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，该术语包含但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可以包括糖和磷酸基(如通常可以存在于RNA或DNA中的)，或经修饰的或经取代的糖或磷酸基。多核苷酸的主链可以包括由肽键连接的重复单元，如N-(2-氨基乙基)-甘氨酸(即，肽核酸)。可替代地，多核苷酸的主链可以包括合成亚基的聚合物，如氨基磷酸酯和硫代磷酸酯，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的硫代磷酸酯-磷酸二酯低聚物或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。另外，通过合成互补链并在适当条件下退火链，或通过使用具有适当引物的DNA聚合酶从头合成互补链，可以从化学合成的单链多核苷酸产物中获得双链多核苷酸。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。此类氨基酸残基的聚合物可以含有天然或非天然的氨基酸残基，并且包含但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖了全长蛋白质和其片段两者。所述术语还包含多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，为了本发明的目的，“多肽”是指包含对天然序列进行如缺失、添加和取代等修饰的蛋白质，(通常本质上是保守的)，只要所述蛋白质维持期望的活性。这些修饰可能是故意的，如通过定点诱变，或者可能是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增而产生的错误。
如本文所用，术语“佐剂”是指调节和/或产生免疫应答的物质。通常，与抗原单独施用相比，佐剂与抗原联合施用增强对抗原的免疫应答。本文描述了各种佐剂。
术语“CpG寡脱氧核苷酸”和“CpG ODN”在本文中是指长度为10至30个核苷酸的DNA分子，含有由磷酸盐分离的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸(在本文中也被称为“CpG”二核苷酸或“CpG”)。本公开的CpG ODN含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。也就是说，CpG二核苷酸中的胞嘧啶没有甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可以具有部分或完全的硫代磷酸酯(PS)主链。
如本文所用，“药学上可接受的”或“药理上相容的”是指非生物学上或其它方面不期望的材料，例如，所述材料可以并入到施用于患者的药物组合物中，而不会引起任何显著的不期望的生物学效应或以有害的方式与含有所述材料的组合物中的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选地符合毒理学和制造测试的所需标准和/或包含在由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)编写的《非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)》中。
对于本文所描述的结构和功能特性中的任何结构和功能特性，确定这些特性的方法是本领域已知的。
如本文所用，“微流体系统”是指其中低体积(例如，m\L、nL、pL、fL)的流体被加工以实现小体积液体的离散处理的系统。本文所描述的某些实施方案包含多路复用、自动化和高通量筛选。流体(例如，缓冲液、溶液、含有效载荷的溶液或细胞悬浮液)可以被移动、混合、分离或以其它方式加工。在本文所描述的某些实施例中，微流体系统用于对悬浮在缓冲液中的细胞施加机械收缩，诱导细胞中的扰动(例如，孔)，允许有效载荷或化合物进入细胞的细胞质。
如本文所用，“收缩”可以指由入口部分、中心点和出口部分限定的微流体通道的一部分，其中中心点由宽度、长度和深度限定。在其它实例中，收缩可以指孔或者可以是孔的一部分。孔可以包含在表面上(例如，过滤器和/或膜)。
除非另有说明，否则如本文所用的术语“Ras”是指被称为Ras超家族或Tas样GTP酶的一组小的三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白中的任何成员，并且包含所有同源物，包含哺乳动物如灵长类动物(例如人类)、非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)中的同源物。术语涵盖“全长”，未处理的Ras以及由细胞中处理产生的任何形式的Ras。所述术语还涵盖Ras的野生型出现同种型变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在人类中，三种Ras基因编码高度同源的Ras蛋白，H-Ras、N-Ras和K-Ras。K-RAS包含两种形式：K-RasA和K-RasB。人K-Ras的氨基酸序列如UniProt(全球web.uniprot.org)登录号P01116(版本241)所示。具体地，人K-Ras同种型a(被称为K-Ras4A)的氨基酸序列如UniProt(全球web.uniprot.org)登录号P01116-1(版本241)和NCBI(全球web.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_203524.1所示。人K-Ras同种型b(被称为K-Ras4B)的氨基酸序列如UniProt(全球web.uniprot.org)登录号P01116-2(版本241)和NCBI(全球web.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004976.2所示。人K-Ras的N末端结构域从氨基酸位置1延伸到86。
对于本文所描述的结构和功能特性中的任何结构和功能特性，确定这些特性的方法是本领域已知的。
与Ras突变相关的疾病的治疗方法
在一些方面，提供了用于刺激对个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内(即，囊泡内)递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述个体患有癌症。
在一些方面，提供了用于减少个体的肿瘤生长的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述个体患有癌症。
在一些方面，提供了对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述个体患有癌症。
在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的组合物中的任何组合物。
在一些方面，提供了一种用于刺激对个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的方法，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的所述无核细胞源性囊泡。
在一些方面，提供了一种用于降低个体的肿瘤生长的方法，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的所述无核细胞源性囊泡。
在一些方面，提供了一种对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的所述无核细胞源性囊泡。
在一些方面，提供了一种用于治疗个体的癌症的方法，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何方法、用途或组合物的一些实施例中，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡；以及c)向所述个体施用治疗有效量的包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何方法、用途或组合物的一些实施例中，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞，其中所述核酸表达所述突变的Ras抗原；由此产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。
在一些实施例中，在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何方法、用途或组合物的一些实施例中，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
在一些实施例中，提供了一种用于刺激对个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述有核细胞包括如本文所描述的突变的Ras抗原。在一些实施例中，提供了一种用于减少肿瘤生长的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述有核细胞包括本文所描述的突变的Ras抗原。在一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，提供了一种用于治疗个体的癌症的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述有核细胞包括本文所描述的突变的Ras抗原。在一些实施例中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。
在一些实施例中，提供了一种用于刺激对个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述有核细胞包括如本文所描述的突变的Ras抗原和佐剂。在一些实施例中，提供了一种用于减少肿瘤生长的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述有核细胞包括本文所描述的突变的Ras抗原和佐剂。在一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，提供了一种用于治疗个体的癌症的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述有核细胞包括本文所描述的突变的Ras抗原和佐剂。在一些实施例中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。
在一些实施例中，提供了包括有效量的无核细胞源性囊泡的组合物在制备用于刺激对突变的Ras蛋白的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的组合物无核细胞源性囊泡中的任何一种，所述无核细胞源性囊泡包括本文所描述的突变的Ras抗原。在一些实施例中，提供了包括有效量的无核细胞源性囊泡的组合物在制备用于减少个体的肿瘤生长的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述无核细胞源性囊泡包括本文所描述的突变的Ras抗原。在一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，提供了包括有效量的无核细胞源性囊泡的组合物在制备用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述无核细胞源性囊泡包括本文所描述的突变的Ras抗原。
在一些实施例中，提供了包括有效量的无核细胞源性囊泡的组合物在制备用于刺激对突变的Ras蛋白的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的组合物无核细胞源性囊泡中的任何一种，所述无核细胞源性囊泡包括本文所描述的突变的Ras抗原和佐剂。在一些实施例中，提供了包括有效量的无核细胞源性囊泡的组合物在制备用于减少个体的肿瘤生长的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述无核细胞源性囊泡包括本文所描述的突变的Ras抗原和佐剂。在一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，提供了包括有效量的无核细胞源性囊泡的组合物在制备用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物中的任何一种，所述无核细胞源性囊泡包括本文所描述的突变的Ras抗原和佐剂。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物的一些实施例中，所述个体患有癌症。在一些实施例中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、肺癌(包含但不限于非小细胞肺癌)、胆道癌、膀胱癌、肝癌、骨髓性白血病和乳腺癌。在一些实施例中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。在一些实施例中，所述癌症是实体肿瘤。在一些实施例中，所述癌症是液体癌。在一些实施例中，所述癌症是血液癌。在一些实施例中，所述癌症是与Ras突变相关的癌症。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是在与Ras突变相关的癌症中发现的癌症抗原。在一些实施例中，所述癌症是局限性癌症。在一些实施例中，所述癌症是转移性癌症。
在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为输入无核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约0.25μm至约4μm、约1μm至约4μm、约1.2μm至约3μm、约1.4μm至约2.6μm、约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约2.0μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.0μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm中的任一个。在一些实施例中，包括输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
在一些实施例中，所述无核细胞是RBC或血小板。在一些实施例中，所述无核细胞是红细胞或网织红细胞。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡是RBC源性囊泡或血小板源性囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
在一些实施例中，其中所述无核细胞源性囊泡包括佐剂，用于调节的所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)。
在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原与其它抗原或佐剂复合。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端没有侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29、G12V1-16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42抗原中的一种或多种。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少80％、85％、90％或95％相似性中的任一种的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:9-15中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:9-15的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHCI类限制性肽。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述方法包括约3至约9次施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述方法包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次中的任一种施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述方法包括根据需要连续施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，两次连续施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡之间的时间间隔为约1天至约30天。在一些实施例中，两次连续施用包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡之间的时间间隔为约21天。在一些实施例中，两次连续施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡之间的时间时间间隔为约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或150天中的任一种。在一些实施例中，首次两次连续施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡之间的时间间隔为1天或2天。在一些实施例中，首次两次连续施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡之间的时间间隔为1天或2天，其中所述方法包括超过2次施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡(如但不限于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次施用)。在一些实施例中，静脉内、肿瘤内和/或皮下施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，静脉内施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸。在一些实施例中，所述佐剂是polyI:C。
在一些实施例中，同时施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述佐剂。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述佐剂。在一些实施例中，静脉内、肿瘤内和/或皮下施用所述佐剂和/或包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，静脉内施用所述佐剂和/或包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。
在一些实施例中，在施用所述佐剂之前施用包括包含所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述佐剂之前约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述佐剂之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述佐剂之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述佐剂之后施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述佐剂后约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述佐剂之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述佐剂之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，所述个体对HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16的表达呈阳性。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，在施用治疗剂之前、同时或之后施用包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述治疗剂包括免疫检查点抑制剂、化学疗法或放射疗法中的一种或多种。在一些实施例中，所述治疗剂包括一种或多种细胞因子。在一些实施例中，所述治疗剂包括一种或多种抗体。在一些实施例中，所述治疗剂包括用于免疫肿瘤学的一种或多种双特异性多肽(例如，免疫缀合物)。
免疫检查点是所述免疫系统的调节器并且保持免疫应答处于检查。免疫检查点抑制剂可以用于促进免疫应答的增强。在一些实施例中，包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物与免疫检查点抑制剂的施用组合施用。在一些实施例中，同时施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，静脉内、肿瘤内和/或皮下施用所述免疫检查点抑制剂和/或包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，静脉内施用所述免疫检查点抑制剂和/或包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和/或多次施用所述免疫检查点抑制剂。例如，在一些实施例中，所述方法包括两次施用、三次施用、四次施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和/或所述免疫检查点抑制剂。例如，在一些实施例中，所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十五次施用、少于一百次施用或少于两百次施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和/或所述免疫检查点抑制剂。
示例性免疫检查点抑制剂靶向但不限于PD-1,PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是以下中的一种或多种：与PD-1结合的抗体、与PD-L1结合的抗体、与CTLA-4结合的抗体、与LAG3结合的抗体、或与TIM-3结合的抗体、与TIGIT结合的抗体、与VISTA结合的抗体、与TIM-1结合的抗体、与B7-H4结合的抗体或与BTLA结合的抗体。在另外的实施例中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)或抗原结合片段(Fab)。在另外的实施例中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个结合和/或抑制其的一种或多种化学化合物。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个结合和/或抑制其的一种或多种肽。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。
细胞因子可以与本文所描述的具有包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合中的任一种组合使用以实现针对癌症，例如突变的Ras相关癌症的累加或协同效应。在一些实施例中，包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物与一种或多种细胞因子的施用组合施用。在一些实施例中，同时施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述细胞因子。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述细胞因子。
在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述细胞因子之后施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述细胞因子之前约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述细胞因子之后施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述细胞因子后约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述细胞因子之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述细胞因子之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
示例性细胞因子包含但不限于趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子或其功能衍生物。在一些实施例中，所述细胞因子增强细胞免疫应答。在一些实施例中，所述细胞因子增强抗体应答。在一些实施例中，所述细胞因子是I型细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子是2型细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子包括以下中的一种或多种：IL-2、IL-15、IL-10、IL-12、IFN-a或IL-21。在一些实施例中，所述细胞因子包括IL-15。
在一些实施例中，在施用包括细胞因子部分的双特异性多肽之前施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用包括细胞因子部分和免疫检查点抑制剂部分的双特异性多肽之前施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，所述双特异性多肽包括CD3靶向部分和肿瘤抗原靶向部分。在一些实施例中，双特异性多肽包括靶向两个免疫检查点的部分。在一些实施例中，双特异性多肽包括靶向在间质中发现的或在癌症相关成纤维细胞上表达的抗原的部分。在一些实施例中，双特异性多肽包括靶向在间质中发现的或在癌症相关成纤维细胞上表达的抗原的部分和细胞因子部分。
化学疗法可以与本文所描述的具有包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合中的任一种组合使用以实现针对癌症，例如Ras相关癌症的累加或协同效应。在一些实施例中，包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物与化学疗法的施用组合施用。在一些实施例中，同时施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述化学疗法。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述化学疗法。
在一些实施例中，在施用所述化学疗法之前施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述化学疗法之前约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述化学疗法之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述化学疗法之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述化学疗法之后约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和/或多次施用所述化学疗法。例如，在一些实施例中，所述方法包括两次施用、三次施用、四次施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和/或所述化学疗法。例如，在一些实施例中，所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十五次施用、少于一百次施用或少于两百次施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和/或所述化学疗法。
示例性化学疗法可以是细胞周期依赖性的或细胞周期非依赖性的。在一些实施例中，所述化学疗法包括一种或多种化学治疗剂。在一些实施例中，化学治疗剂可以靶向癌症中的细胞分裂、DNA或代谢中的一种或多种。在一些实施例中，所述化学治疗剂是基于铂的药剂，如但不限于顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(奥沙利铂)或卡铂(carboplatin)。在一些实施例中，所述化学治疗剂是紫杉烷(taxane)(如多西他赛(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel))。在一些实施例中，所述化学治疗剂是5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿霉素(doxorubicin)或伊立替康(irinotecan)。在一些实施例中，所述化学治疗剂是以下中的一种或多种：烷化剂、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂或有丝分裂抑制剂。在一些实施例中，所述化学疗法包括顺铂。
放射疗法可以与本文所描述的具有包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合中的任一种组合使用以实现针对癌症，例如Ras相关癌症的累加或协同效应。在一些实施例中，包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物与放射疗法的施用组合施用。在一些实施例中，同时施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述放射疗法。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和所述放射疗法。在一些实施例中，包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物与放射疗法的施用组合施用、与化学疗法的施用组合施用和/或与免疫检查点抑制剂的施用组合施用。
在一些实施例中，在施用所述放射疗法之前施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述放射疗法之前约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述放射疗法之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述放射疗法之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在施用所述放射疗法之后约1小时至约1周施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和/或多次施用所述放射疗法。例如，在一些实施例中，所述方法包括两次施用、三次施用、四次施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和/或所述放射疗法。例如，在一些实施例中，所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十五次施用、少于一百次施用或少于两百次施用包括包含所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡的所述组合物和/或所述放射疗法。
在一些实施例中，提供了包括突变的Ras抗原的多个无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)，用于根据本文所描述的方法中的任何一种方法刺激个体的免疫应答的方法。
Ras抗原
在一些实施例中，提供了用于刺激个体对突变的Ras蛋白的免疫应答的方法，所述方法包括a)向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括细胞内收缩递送的突变的Ras抗原。
在一些实施例中，与对应的野生型Ras蛋白相比，所述突变的Ras抗原包括一个或多个突变。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原(例如，突变的K-Ras4A或突变的K-Ras4B)、突变的H-Ras抗原或突变的N-Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是疾病相关抗原(如癌症相关抗原)。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原源自从患病细胞(如癌细胞)中分离的肽或mRNA。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是非自身抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原源自裂解物，如疾病细胞的裂解物。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原源自肿瘤裂解物。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原与癌症相关。在一些实施例中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是胰腺癌抗原、结肠癌抗原、小肠癌抗原、胆道癌抗原、子宫内膜癌抗原、肺癌抗原、皮肤癌抗原、卵巢癌抗原、胃癌抗原、食道癌抗原、宫颈癌抗原或泌尿道癌抗原。在一些实施例中，所述癌症是实体肿瘤。在一些实施例中，所述癌症是液体癌。在一些实施例中，所述癌症是血液癌。在一些实施例中，所述癌症是病毒相关癌症。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是在Ras相关癌症中发现的癌症抗原。在一些实施例中，所述癌症是局限性癌症。在一些实施例中，所述癌症是转移性癌症。
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括一种或多种蛋白质。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原由一种或多种核酸编码并以一种或多种核酸的形式进入所述无核细胞，如但不限于DNA、cDNA、mRNA和质粒。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原由一种或多种mRNA编码并以一种或多种mRNA的形式进入所述无核细胞。
K-Ras属于被称为RAS超家族或RAS样GTP酶的一组小的三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白。RAS超家族的成员基于其结构、序列和功能分为家族和亚家族。在人类中，三种RAS基因编码高度同源的RAS蛋白，H-Ras、N-Ras和K-Ras。Ras是人类癌症中最常见的突变的癌基因之一，并且K-Ras是最常见突变的同种型，占RAS突变的86％。K-Ras-4B剪接变体是人类癌症中具有突变的主要同种型，并且其存在于大约90％的胰腺癌、30％至40％的结肠癌和15％至20％的肺癌中，大多数是非小细胞肺癌(NSCLC)。其也存在于胆道恶性肿瘤、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌、骨髓性白血病和乳腺癌中。K-Ras基因中最常见的突变主要位于密码子12、13或61处。K-Ras突变也发生在密码子63、117、119和146中，但频率较低。具体而言，甘氨酸12(G12)的突变通过干扰GAP结合和GAP刺激的GTP水解引起RAS激活。残基13处的突变与精氨酸发生空间冲突并降低GAP结合和水解。据报道，残基12、13和61处的突变也降低了RAF的RAS结合结构域(RBD)的亲和力，但程度不同。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原、突变的H-Ras抗原和/或突变的N-Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的K-Ras抗原是突变的K-Ras-4A抗原和/或K-Ras-4B抗原。
在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。在一些实施例中，多抗原的池中的抗原不会降低针对多抗原的池中的其它抗原的免疫应答。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括抗原性突变体Ras表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原与其自身、其它抗原或所述佐剂复合。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包含HLA-A2特异性表位。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包含HLA-A11特异性表位。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包含HLA-B7特异性表位。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包含HLA-C8特异性表位。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是在其N末端包括突变的突变的Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是包括G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变的突变的Ras抗原中的一种或多种。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括全长突变的Ras蛋白的部分或全部N末端结构域。如本文所用，N末端结构域中的第12个残基从甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)的突变体Ras蛋白(如突变体K-Ras)被称为Ras-G12D。如本文所用，N末端结构域中的第12个残基从甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)的突变体K-Ras蛋白被称为K-Ras-G12D。如本文所用，N末端结构域中的第12个残基从(G)突变为缬氨酸(V)的突变体Ras蛋白(如突变体K-Ras)被称为Ras-G12V。如本文所用，N末端结构域中的第12个残基从甘氨酸(G)突变为缬氨酸(V)的突变体K-Ras蛋白被称为K-Ras-G12V。如本文所用，N末端结构域中的第12个残基从(G)突变为半胱氨酸(C)的突变体Ras蛋白(如突变体K-Ras)被称为Ras-G12C。如本文所用，N末端结构域中的第12个残基从甘氨酸(G)突变为半胱氨酸(C)的突变体K-Ras蛋白被称为K-Ras-G12C。如本文所用，N末端结构域中的第13个残基从甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)的突变体Ras蛋白(如突变体K-Ras)被称为Ras-G13D。如本文所用，N末端结构域中的第13个残基从甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)的突变体K-Ras蛋白被称为K-Ras-G13D。
在一些实施例中，包括突变体Ras-G12D蛋白的N末端结构域的残基X至残基Y的抗原或抗原性表位的序列被称为G12DX-Y或Ras-G12DX-Y。作为非限制性实例，包括突变体K-Ras-G12D蛋白的N末端结构域的残基1至残基16的抗原或抗原表位的序列被称为G12D1-16或K-Ras-G12D1-16。在一些实施例中，包括突变体Ras-G12V蛋白的N末端结构域的残基X至残基Y的抗原或抗原性表位的序列被称为G12VX-Y或Ras-G12VX-Y。作为非限制性实例，包括突变体K-Ras-G12V蛋白的N末端结构域的残基2至残基22的抗原或抗原表位的序列被称为G12V2-22或K-Ras-G12V2-22。相同的原理适用于本文所描述的G12CX-Y或Ras-G12DX-Y、或野生型Ras X-Y的任何公开。
在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括以下中的一种或多种的：源自包括G12D突变(K-Ras-G12D)K-Ras的肽、源自包括G12V突变(K-Ras-G12V)的K-Ras的肽、源自包括G12C突变(K-Ras-G12C)的K-Ras的肽或源自包括G13D突变(K-Ras-G13D)的K-Ras的肽。在一些实施例中，所述抗原包括源自K-Ras-G12D的HLA-A2限制性肽、源自K-Ras-G12V的HLA-A2限制性肽、源自K-Ras-G12C的HLA-A2限制性肽和/或源自K-Ras-G13D的HLA-A2限制性肽。在一些实施例中，所述抗原包括G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29、G12V1-16、G12V2-19、G12V3 -17或G12V3-42序列。在一些实施例中，所述HLA-A2限制性肽包括SEQ ID NO:1-8中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括来自对应的突变的K-Ras蛋白的N末端结构域的氨基酸序列(例如K-Ras-G12D、K-Ras-G12V、K-Ras-G12C或K-Ras-G13D)。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、或G12D2 -29、G12V1-16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42抗原中的一种或多种。在一些实施例中，N末端结构域在K-Ras、N-Ras和H-Ras的三种Ras同种型中是相同的。在一些实施例中，其中所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原，所述突变的K-Ras抗原包括来自对应的突变的K-Ras蛋白(例如，K-Ras-G12D、K-Ras-G12V、K-Ras-G12C或K-Ras-G13D)的N末端结构域的氨基酸序列，所述氨基酸序列与来自对应的突变的H-Ras蛋白(例如，H-Ras-G12D或H-Ras-G12V)或突变的N-Ras蛋白(例如，N-Ras-G12D、K-Ras-G12V、K-Ras-G12C或K-Ras-G13D)的N末端结构域的氨基酸序列相同。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少80％、85％、90％或95％相似性中的任一种的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某个实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原由SEQID NO:8的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:9-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多个突变的Ras表位。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是包括SEQ ID NO:9-15中的任一个的氨基酸序列中的至少一个的多个突变的Ras表位。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括多个Ras表位，其中所述突变的Ras抗原包括约9至约200个氨基酸。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是包括SEQ ID NO:1-8中的任一个的氨基酸序列中的至少一个的多个抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括约9至约200个氨基酸。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是包括SEQ ID No:1-8中的任一个的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7或8个的多个抗原。在一些实施例中，所述多个抗原包含在非共价连接的肽的池内。在一些实施例中，所述多个抗原包含在非共价连接的肽的池内，其中每个肽包括不超过一个抗原。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)包括包含多个免疫原性表位的多个Ras抗原。在另外的实施例中，在向个体施用包括包含所述多个免疫原性表位的所述多个抗原的所述无核细胞源性囊泡之后，所述多个免疫原性表位中没有一个降低所述个体对其它免疫原性表位中的任何免疫原性表位的免疫应答。在一些实施例中，所述Ras抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施例中，所述免疫原性肽表位与N末端侧接多肽和/或C末端侧接多肽融合。在一些实施例中，所述突变体Ras抗原是多肽，所述多肽包括免疫原性肽表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变体Ras抗原是多肽，所述多肽包括免疫原性肽表位，所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端侧接异源肽序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。在一些实施例中，侧接异源肽序列是非天然存在的序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法
在一些方面，提供了用于产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例，提供了一种用于产生包括突变的Ras-G12D抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，其中所述突变的Ras-G12D抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例，提供了一种用于产生包括突变的Ras-G12V抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，其中所述突变的Ras-G12V抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例，提供了一种用于产生包括突变的Ras-G12C抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，其中所述突变的Ras-G12C抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例，提供了一种用于产生包括突变的Ras-G13D抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，其中所述突变的Ras-G13D抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，提供了一种用于产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡，其中所述Ras抗原包括SEQ ID No:1-15中的任一个的氨基酸序列。
在一些方面，提供了一种用于产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID No:1-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID No:1-15中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，提供了一种用于产生包括突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQID No:9-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ IDNo:9-15中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID No:1-8中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID No:1-8中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，提供了一种用于产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞；其中表达所述编码所述突变的Ras抗原的核酸，由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。在一些方面，提供了一种用于产生包括突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡的组合物的方法，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ IDNo:9-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ IDNo:9-15中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID No:1-8中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID No:1-8中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述无核细胞是RBC或血小板。在一些实施例中，所述无核细胞是红细胞或网织红细胞。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡是RBC源性囊泡或血小板源性囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为输入无核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约0.25μm至约4μm、约1μm至约4μm、约1.2μm至约3μm、约1.4μm至约2.6μm、约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约2.0μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.0μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm中的任一个。在一些实施例中，包括输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原与其它抗原或佐剂复一起递送。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括以下中的一种或多种：G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29、G12V1-16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42中的一种或多种。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少80％、85％、90％或95％相似性中的任一种的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:9-15中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:9-15中的任一个具有至少90相似性中的任一种的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:9-15的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中(I-C)，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)。
包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物
在一些方面，提供了包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例，提供了一种包括突变的Ras-G12D抗原的无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述突变的Ras-G12D抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例，提供了一种包括突变的Ras-G12V抗原的无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述突变的Ras-G12V抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例，提供了一种包括突变的Ras-G12C抗原的无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述突变的Ras-G12C抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例，提供了一种包括突变的Ras-G13D抗原的无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述突变的Ras-G13D抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，提供了一种包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡，其中所述Ras抗原包括SEQ ID No:1-8中的任一个的氨基酸序列。
在一些方面，提供了一种包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物，其中包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID No:9-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID No:9-15中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID No:1-8中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID No:1-8中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，提供了一种包括突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡的组合物，其中包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID No:9-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID No:9-15中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID No:1-8中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID No:1-8中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，提供了一种包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物，其中包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是突变的Ras抗原。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID No:9-15中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID No:9-15中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID No:1-8中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID No:1-8中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述无核细胞是RBC或血小板。在一些实施例中，所述无核细胞是红细胞或网织红细胞。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡是RBC源性囊泡或血小板源性囊泡。在一些实施例中，所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或网织红细胞源性囊泡。
在一些实施例中，所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩的宽度为输入无核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约0.25μm至约4μm、约1μm至约4μm、约1.2μm至约3μm、约1.4μm至约2.6μm、约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约2.0μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.0μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm中的任一个。在一些实施例中，包括输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原与其它抗原或佐剂复合。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括以下中的一种或多种：G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原是G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29、G12V1-16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42中的一种或多种。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少80％、85％、90％或95％相似性中的任一种的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:9-15中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:9-15的氨基酸序列。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中(I-C)，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)。
包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的另外的修饰
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，无核源性囊泡(例如，RBC源性囊泡)的所述组合物进一步包括药剂，与不包括所述药剂的对应的无核源性囊泡的组合物相比，所述药剂增强所述无核源性囊泡的活力和/或功能。在一些实施例中，无核源性囊泡的所述组合物进一步包括药剂，与不包括所述药剂的对应的无核源性囊泡的组合物相比，所述药剂增强冻融循环后所述无核源性囊泡的活力和/或功能。在一些实施例中，所述药剂是冷冻保存剂和/或低温保存剂。在一些实施例中，在任何冻融循环之前不包括所述药剂的对应的无核源性囊泡的组合物相比，冷冻保存剂和低温保存剂都不会导致包括所述药剂的无核源性囊泡的组合物中不超过10％或20％的细胞死亡。在一些实施例中，在至多1、2、3、4、5次冻融循环之后，至少约70％、约80％或约90％的所述无核源性囊泡是活的。在一些实施例中，所述药剂是增强胞吞作用的化合物、稳定剂或辅因子。在一些实施例中，所述药剂是白蛋白。在一些实施例中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施例中，所述药剂是人白蛋白。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。在一些实施例中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、钠金属离子、钾金属离子、镁金属离子、氯化物、乙酸盐、谷氨酸盐、蔗糖、氢氧化钾或氢氧化钠。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、
海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、/>
DMSO、/>
CS2、/>
CS5、
CS10、/>
CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、/>
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述方法进一步包括将无核细胞的所述组合物与药剂一起温育的步骤，与没有另外的温育步骤而制备的对应的无核细胞相比，所述药剂增强所述无核细胞的活力和/或功能。
佐剂
如本文所用，术语“佐剂”可以指直接或间接调节和/或产生免疫应答的物质。在本发明的一些实施例中，将佐剂细胞内递送到无核细胞或无核源性囊泡群体，如RBC或RBC源性囊泡群体(即，在收缩加工之前、期间和/或之后，但在施用于个体之前，将细胞或囊泡与佐剂一起温育)，以形成包括佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些情况下，与突变的Ras抗原单独施用相比，佐剂与突变的Ras抗原联合施用增强对突变的Ras抗原的免疫应答。因此，佐剂可以用于加强对突变的Ras抗原的免疫细胞应答(例如T细胞应答)的引发。示例性佐剂包含但不限于干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、维甲酸诱导基因I(RIG-I)激动剂和TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9的激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(imiquimod)(R837)、瑞喹莫德(resiquimod)(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(polyI:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在特定实施例中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施例中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施例中，所述CpG ODN是A类CpGODN、B类CpG ODN或C类CpG ODN。在一些实施例中，所述CpG ODN佐剂包括选自CpG ODN1018、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpGODN D-SL03的组。在一些实施例中，所述CpG ODN佐剂是CpG ODN 1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:16))或CpG ODN 2006(也被称为CpG 7909)(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:17))寡核苷酸。在一些实施例中，所述佐剂是CpG7909。在一些实施例中，所述RIG-I激动剂包括聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)。多种佐剂也可与突变的Ras抗原联合使用以增强免疫应答的引发。在一些实施例中，包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡进一步包括多于一种佐剂。多种佐剂也可与突变的Ras抗原联合使用以增强免疫应答的引发。在一些实施例中，包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡进一步包括多于一种佐剂。在一些实施例中，包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡进一步包括所述佐剂CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(polyI:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂的任何组合。
用于产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的收缩
在一些实施例中，本发明提供了包括用于刺激免疫应答的突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物。在一些实施例中，所述无核细胞是RBC或血小板。在一些实施例中，所述无核细胞是红细胞或网织红细胞。在一些实施例中，所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞。将有效载荷引入到无核细胞的方法是本领域已知的。
在一些实施例中，所述突变的Ras抗原通过使所述细胞通过收缩而被引入到所述无核细胞中，使得瞬时孔被引入所述细胞膜，由此允许所述突变的Ras抗原进入所述细胞。WO 2013/059343、WO 2015/023982、WO 2016/070136、WO 2017041050、WO 2017008063、WO2017/192785、WO 2017/192786、WO 2019/178005、WO 2019/178006、WO 2020/072833、PCT/US2020/15098和PCT/US2020/020194提供了基于收缩将化合物递送到细胞中的实例。
在一些实施例中，通过使包括所述无核细胞(例如，RBC)的细胞悬浮液通过收缩，将所述突变的Ras抗原递送到所述无核细胞中以产生本发明的无核细胞源性囊泡，其中所述收缩使所述细胞变形，由此使得所述细胞扰动，使得突变的Ras抗原进入所述细胞。在一些实施例中，所述收缩包含在微流体通道内。在一些实施例中，可以在微流体通道内并联和/或串联放置多个收缩。
在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩包含入口部分、中心点和出口部分。在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩的宽度是所述无核细胞的直径的函数。确定无核细胞的直径的方法是本领域已知的；例如，高含量成像、细胞计数器或流式细胞术。
在基于收缩将突变的Ras抗原递送到无核细胞源性囊泡的一些实施例中，所述收缩的宽度为约0.5μm至约10μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约1μm至约4μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约1μm至约3μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约1.5μm至约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约1.2μm至约2.8μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约0.5μm至约5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约2μm至约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约1.5μm至约2μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约0.5μm至约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.2μm至约3.8μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3.8μm至约4.3μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约或小于0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm中的任一个。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约2μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约2.5μm。在一些实施例中，所述收缩的宽度为约3μm。
可能影响将所述化合物递送到所述无核源性囊泡中的参数的实例包含但不限于收缩的尺寸、收缩的进入角度、收缩的表面性质(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，细胞通过所述收缩的时间)、细胞浓度、细胞悬浮液中的化合物的浓度、细胞悬浮液中的缓冲液以及无核源性囊泡在通过收缩之后恢复或温育的时间量可以影响递送的化合物进入无核源性囊泡的通道。影响将所述化合物递送到所述无核源性囊泡中的另外的参数可以包含输入无核细胞在收缩中的速度、收缩中的剪切速率、细胞悬浮液的粘度、垂直于流速的速度分量以及收缩中的时间。另外，包括串联和/或并联通道的多个芯片可能影响对无核源性囊泡的递送。并联的多个芯片可能有助于增强吞吐量。这些参数可以设计成控制化合物的递送。在一些实施例中，细胞浓度的范围为约10至至少约1012个细胞/mL或其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施例中，递送化合物浓度的范围可以为约10ng/mL至约1g/mL或其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施例中，递送化合物浓度的范围可以为约1pM至至少约2M或其间的任何浓度或浓度范围。
在一些实施例中，与所述无核细胞或无核细胞源性囊泡一起温育的突变的Ras抗原的浓度介于约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施例中，与所述无核细胞或无核细胞源性囊泡一起温育的突变的Ras抗原的浓度为小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一种。在一些实施例中，与所述无核细胞或无核细胞源性囊泡一起温育的突变的Ras抗原的浓度大于约10mM。在一些实施例中，与所述无核细胞或无核细胞源性囊泡一起温育的突变的Ras抗原的浓度为约0.01μM至约0.1μM、约0.1μM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约100μM、约100μM至约1mM或1mM至约10mM中的任一种。在一些实施例中，与所述无核细胞或无核细胞源性囊泡一起温育的突变的Ras抗原的浓度介于约0.1μM与约1mM之间。在一些实施例中，与所述无核细胞或无核细胞源性囊泡一起温育的突变的Ras抗原的浓度介于约0.1μM与约10μM之间。在一些实施例中，与所述无核细胞或无核细胞源性囊泡一起温育的突变的Ras抗原的浓度为1μM。
在一些实施例中，所述无核细胞或无核细胞源性囊泡包括浓度介于约1nM与约1mM之间的所述编码突变的Ras抗原的核酸。在一些实施例中，所述无核细胞或无核细胞源性囊泡包括浓度为小于约0.1nM、约1nM、约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一种的所述编码突变的Ras抗原的核酸。在一些实施例中，所述无核细胞或无核细胞源性囊泡包括浓度大于约10mM的所述编码突变的Ras抗原的核酸。在一些实施例中，所述无核细胞或无核细胞源性囊泡包括浓度为约0.1nM至约1nM、约1nM至约10nM、约10nM至约100nM、约0.1μM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约100μM、约100μM至约1mM或1mM至约10mM中的任一种的所述编码突变的Ras抗原的核酸。在一些实施例中，所述无核细胞或无核细胞源性囊泡包括浓度介于约10nM与约100nM之间的所述编码突变的Ras抗原的核酸。在一些实施例中，所述无核细胞或无核细胞源性囊泡包括浓度介于约1nM与约10nM之间的所述编码突变的Ras抗原的核酸。在一些实施例中，所述无核细胞或无核细胞源性囊泡包括浓度为约50nM的所述突变的Ras抗原。在一些实施例中，所述核酸是mRNA。
无核细胞源性囊泡的特性以及抗原呈递细胞的内化
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的实施例中，所述方法包括：a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，包括有效载荷(如突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂)的无核细胞源性囊泡显示出与输入无核细胞相比不同的特性。在一些实施例中，与包含通过其它递送方法(如溶血装载或电穿孔)引入的有效载荷的无核细胞相比，包括有效载荷(如突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂)的无核细胞源性囊泡显示出不同的特性。在一些实施例中，包括有效载荷(如突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂)的无核细胞源性囊泡是包括有效载荷的无核细胞源性囊泡。在一些实施例中，包括抗原(如突变的Ras抗原)的无核细胞源性囊泡被称为抗原载体(AC)。在一些实施例中，包括抗原(如突变的Ras抗原)和佐剂的无核细胞源性囊泡被称为活化抗原载体(AAC)。PCT/US2020/15098中公开了无核细胞源性囊泡，所述文献的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，与输入无核细胞在施用于哺乳动物之后的半衰期相比，施用于哺乳动物之后的无核细胞源性囊泡的半衰期减少。在一些实施例中，与输入无核细胞的血红蛋白含量相比，无核细胞源性囊泡的血红蛋白含量减少。在一些实施例中，与输入无核细胞的ATP产生相比，无核细胞源性囊泡的ATP产生减少。在一些实施例中，无核细胞源性囊泡表现出球形形态。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞，并且其中与所述输入无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。在一些实施例中，无核细胞源性囊泡是红细胞影泡。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布在表面上表现出更高的平均磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡的群体分布的至少50％在表面上表现出更高的磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在组织或细胞中表现出优先摄取。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中表现出优先摄取。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡被修饰以增强组织或细胞中的摄取。在一些实施例中，与未经修饰的无核细胞源性囊泡相比，无核细胞源性囊泡被修饰以增强吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的摄取。在一些实施例中，吞噬细胞和/或抗原呈递细胞包括树突细胞或巨噬细胞中的一种或多种。在一些实施例中，组织或细胞包括肝或脾中的一种或多种。在一些实施例中，无核细胞源性囊泡在其表面上包括CD47。
在用于产生无核细胞源性囊泡的上述方法的一些实施例中，所述收缩包含在微流体通道内。在一些实施例中，微流体通道包括多个收缩。在一些实施例中，多个收缩串联和/或并联布置。在一些实施例中，收缩位于多个微支柱之间；在被配置成阵列的多个微支柱之间；或者在一个或多个可移动板之间。在一些实施例中，所述收缩是孔或包含在孔内。在一些实施例中，所述孔包含在表面中。在一些实施例中，所述表面是过滤器。在一些实施例中，所述表面是膜。在一些实施例中，收缩大小是悬浮的输入无核细胞的直径的函数。在一些实施例中，收缩大小是悬浮的输入无核细胞的直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％。在一些实施例中，收缩的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施例中，收缩的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm或约0.25μm。在一些实施例中，收缩的宽度为约2.2μm。在一些实施例中，输入无核细胞在范围为约10psi至约90psi的压力下通过收缩。在一些实施例中，所述细胞悬浮液在通过所述收缩之前、同时或之后与所述抗原接触。
在一些实施例中，其中由输入无核细胞制备包括有效载荷(例如，突变的Ras抗原，或突变的Ras抗原和佐剂)的无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡具有以下性质中的一项或多项：(a)与输入无核细胞相比，哺乳动物的循环半衰期减少，(b)与输入无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与输入无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与输入无核细胞相比，ATP产生减少。
在一些实施例中，所述输入无核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述输入无核细胞是人细胞。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞或血小板。在一些实施例中，所述红细胞(red blood cell)是红细胞(erythrocyte)或网织红细胞。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，哺乳动物中的无核细胞源性囊泡的循环半衰期减少。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，哺乳动物中的循环半衰期减少超过约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。
在一些实施例中，输入无核细胞是人细胞，并且其中无核细胞源性囊泡的循环半衰期小于约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约10天、约25天、约50天、约75天、约100天、约120天。
在一些实施例中，输入无核细胞是红细胞，其中与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约100％。在一些实施例中，无核细胞源性囊泡中的血红蛋白水平是输入无核细胞的血红蛋白水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。
在一些实施例中，输入无核细胞是红细胞，并且其中无核细胞源性囊泡在形态学上是球形的。在一些实施例中，所述输入无核细胞是红细胞，并且其中与所述输入无核细胞相比，所述无核细胞源性囊泡具有减小的双凹形状。
在一些实施例中，输入无核细胞是红细胞或红细胞，并且其中无核细胞源性囊泡是红细胞影泡(RBC影泡)。
在一些实施例中，无核细胞源性囊泡在其表面上包括CD47。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有增加的表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，通过所述方法制备的无核细胞源性囊泡在其表面上具有大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。在一些实施例中，与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在其表面上具有多约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％、约100％或超过约100％的磷脂酰丝氨酸。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡具有减少的ATP产生。在一些实施例中，无核细胞源性囊泡产生的ATP水平低于由输入无核细胞产生的ATP水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。在一些实施例中，无核细胞源性囊泡不产生ATP。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡在组织或细胞中表现出增强的摄取。在一些实施例中，与输入无核细胞的摄取相比，无核细胞源性囊泡表现出在肝或脾中或由吞噬细胞或抗原呈递细胞优先摄取。
在一些实施例中，与输入无核细胞相比，无核细胞源性囊泡被进一步修饰以增强组织或细胞中的摄取。在一些实施例中，与输入无核细胞的摄取相比，无核细胞源性囊泡被进一步修饰以增强肝或脾中的摄取或吞噬细胞或抗原呈递细胞的摄取。
在一些实施例中，其中无核细胞源性囊泡表现出在肝或脾中的增强的摄取或吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的增强的摄取，无核细胞源性囊泡的内化导致吞噬细胞或抗原呈递细胞的成熟标志物的表达增加。在一些实施例中，吞噬细胞和/或抗原呈递细胞是单核细胞源性树突状细胞(MODC)。在一些实施例中，所述成熟标志物是CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种。在一些实施例中，与没有与包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中，CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施例中，与和输入无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中，CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。
在一些实施例中，其中包括突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡表现出在肝或脾中或吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的增强的摄取，无核细胞源性囊泡的内化导致无核细胞源性囊泡内包含的突变的Ras抗原的呈递增加。在一些实施例中，与和包括通过其它递送方法(如但不限于溶血装载)引入的相同突变的Ras抗原的对应无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中，突变的Ras抗原的呈递增加以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。
在一些实施例中，其中包括突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡表现出在肝或脾中或吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的增强的摄取，无核细胞源性囊泡的内化导致吞噬细胞和/或抗原呈递细胞诱导抗原特异性免疫应答的能力增加。在一些实施例中，与和输入无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，由与包括突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞所介导的抗原特异性免疫应答增加了以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施例中，与和包括通过其它递送方法(如但不限于溶血装载)引入的相同突变的Ras抗原的无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，由与包括突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞所介导的抗原特异性免疫应答增加了以下中的至少约任一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施例中，所述抗原特异性免疫应答是抗原特异性CD4+T细胞应答。在一些实施例中，所述抗原特异性免疫应答是抗原特异性CD8+T细胞应答。
在根据本文所描述的方法、组合物或用途中的任何一种方法、组合物或用途的一些实施例中，吞噬细胞是具有HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16的单倍型的人细胞。在一些实施例中，抗原呈递细胞是具有HLA-A*02、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*08的单倍型的人细胞。在一些实施例中，本文所描述的由吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的突变的Ras抗原包含HLA-A2特异性表位。在一些实施例中，本文所描述的由吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的突变的Ras抗原包含HLA-A11特异性表位。在一些实施例中，本文所描述的由吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的突变的Ras抗原包含HLA-B7特异性表位。在一些实施例中，本文所描述的由吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的突变的Ras抗原包含HLA-C8特异性表位。
在一些实施例中，在制备无核细胞源性囊泡期间，输入无核细胞没有(a)热加工，(b)化学处理，和/或(c)经受低渗或高渗条件。在一些实施例中，在由输入无核细胞制备无核细胞源性囊泡的期间，维持渗透压。在一些实施例中，渗透压维持在约200mOsm与约600mOsm之间。在一些实施例中，渗透压维持在约200mOsm与约400mOsm之间。
系统和试剂盒
在一些方面，本发明提供了一种系统，所述系统包括用于本文所公开的方法的收缩、无核细胞悬浮液、突变的Ras抗原或佐剂中的一种或多种。所述系统可以包含针对上文所公开的方法描述的任何实施例，包含微流体通道或具有孔的表面，以提供细胞变形收缩、细胞悬浮液、细胞扰动、递送参数、化合物和/或应用等。在某个实施例中，细胞变形收缩的大小适于递送至无核细胞。在一些实施例中，优化递送参数，如操作流速、细胞和化合物浓度、收缩中的细胞的速度和细胞悬浮液的组成(例如，渗透压、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)用于压制免疫应答或诱导耐受性的化合物的最大应答。
还提供了用于治疗患有与Ras突变相关的癌症的个体的试剂盒或制品。在一些实施例中，所述试剂盒包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括细胞内突变的抗原和细胞内佐剂。在一些实施例中，所述试剂盒包括收缩、无核细胞悬浮液、突变的Ras抗原或佐剂中的一种或多种，用于产生无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡用于治疗患有如癌症等与Ras突变相关的癌症的个体。在一些实施例中，所述试剂盒包括在合适包装中的本文所描述的组合物(例如含有孔、细胞悬浮液和/或化合物的微流体通道或表面)。合适包装材料在本领域中是已知的，并且包含例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。可以进一步灭菌和/或密封这些制品。
本发明还提供了包含本文所描述的方法的组合物的试剂盒并且可以进一步包括用于实施治疗患有与Ras突变相关的癌症的个体的所述方法的说明书和/或用于将突变的Ras抗原和佐剂引入到无核细胞中的说明书。本文所描述的试剂盒可以进一步包含其它材料，包含其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有本文所描述的任何方法的执行说明的包装插页；例如，用于治疗患有与Ras突变相关的癌症的个体的说明书或用于产生无核细胞源性囊泡以含有细胞内突变的Ras抗原和细胞内佐剂的说明书。
示例性实施例
实施例1.一种用于刺激对个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
实施例2.一种用于减少个体的肿瘤生长的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
实施例3.一种用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中所述个体患有癌症。
实施例5.一种用于治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
实施例6.根据实施例4或5所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。
实施例7.根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原、突变的H-Ras抗原或突变的N-Ras抗原。
实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras4A抗原或突变的K-Ras4B抗原。
实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是单个多肽，所述单个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。
实施例10.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。
实施例11.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位和一个或多个异源肽序列。
实施例12.根据实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原与其它抗原或佐剂复合。
实施例13.根据实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变。
实施例14.根据实施例1至13中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:9-15中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施例15.根据实施例1至14中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:9-15的氨基酸序列。
实施例16.根据实施例1至15中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29、G12V1-16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42抗原中的一种或多种。
实施例17.根据实施例1至16中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施例18.根据实施例1至17中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列。
实施例19.根据实施例1至18中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。
实施例20.根据实施例1至19中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
实施例21.根据实施例1至20中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
实施例22.根据实施例1至21中任一项所述的方法，其中所述无核细胞进一步包括佐剂。
实施例23.根据实施例1至22中任一项所述的方法，其中所述组合物与佐剂联合施用。
实施例24.根据实施例22或23所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
实施例25.根据实施例22至24中任一项所述的方法，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
实施例26.根据实施例1至25中任一项所述的方法，其中包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施例27.根据实施例1至25中任一项所述的方法，其中包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。
实施例28.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中包括所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施例29.根据实施例26至28中任一项所述的方法，其中所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。
实施例30.根据实施例26至29中任一项所述的方法，其中所述收缩的宽度为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
实施例31.根据实施例26至30中任一项所述的方法，其中包括多个输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
实施例32.根据实施例1至31中任一项所述的方法，其中所述无核细胞是红细胞或血小板。
实施例33.根据实施例1至32中任一项所述的方法，其中所述无核细胞是红细胞或网织红细胞。
实施例34.根据实施例1至33中任一项所述的方法，其中包括所述无核细胞源性囊泡的所述组合物被施用多次。
实施例35.根据实施例1至34中任一项所述的方法，其中所述组合物被静脉内施用。
实施例36.根据实施例1至35中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
实施例37.根据实施例1至36中任一项所述的方法，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
实施例38.根据实施例37所述的方法，其中所述另一种疗法是化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或用于免疫肿瘤疗法的双特异性多肽。
实施例39.一种组合物，其包括无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
实施例40.根据实施例39所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
实施例41.根据实施例40所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
实施例42.根据实施例40或41所述的组合物，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
实施例43.一种组合物，其包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂，其中包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施例44.一种组合物，其包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原，其中包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞，其中所述核酸表达所述突变的Ras抗原；由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。
实施例45.一种组合物，其包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原和佐剂，其中包括所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施例46.根据实施例43至44中任一项所述的组合物，其中所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。
实施例47.根据实施例43至46中任一项所述的组合物，其中所述收缩的宽度为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
实施例48.根据实施例43至47中任一项所述的组合物，其中包括所述输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
实施例49.根据实施例43至48中任一项所述的组合物，其中所述输入无核细胞是红细胞或血小板。
实施例50.根据实施例43至48中任一项所述的组合物，其中所述输入无核细胞是红细胞或网织红细胞。
实施例51.根据实施例38至48中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡
实施例52.根据实施例38至48中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡是网织红细胞源性囊泡或红细胞源性囊泡。
实施例53.根据实施例38至52中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原、突变的H-Ras抗原或突变的N-Ras抗原。
实施例54.根据实施例38至53中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras4A抗原或突变的K-Ras4B抗原。
实施例55.根据实施例38至54中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是单个多肽，所述单个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。
实施例56.根据实施例38至55中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。
实施例57.根据实施例38至56中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原与其它抗原或佐剂复合。
实施例58.根据实施例38至57中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变。
实施例59.根据实施例38至58中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:9-15中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施例60.根据实施例38至59中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:9-15的氨基酸序列。
实施例61.根据实施例51至60中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是G12D1 16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29抗原、G12V1 16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42抗原中的一种或多种。
实施例62.根据实施例38至61中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施例63.根据实施例38至62中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列。
实施例64.根据实施例38至63中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。
实施例65.根据实施例38至64中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
实施例66.根据实施例38至65中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
实施例67.根据实施例38至66中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
实施例68.根据实施例67所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
实施例69.根据实施例67或68所述的组合物，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
实施例70.一种用于刺激对个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据实施例39至69中任一项所述的组合物。
实施例71.一种用于减少个体的肿瘤生长的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据实施例39至69中任一项所述的组合物。
实施例72.根据实施例70或71所述的组合物，其中所述个体患有癌症。
实施例73.一种用于治疗个体的癌症的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据实施例39至69中任一项所述的组合物。
实施例74.根据实施例72或73所述的组合物，其中所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。
实施例75.根据实施例71至74中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
实施例76.根据实施例71至74中任一项所述的组合物，其中所述组合物与佐剂联合施用。
实施例77.根据实施例76所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
实施例78.根据实施例76或77所述的组合物，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
实施例79.根据实施例70至78中任一项所述的组合物，其中包括无核细胞的所述组合物被多次施用。
实施例80.根据实施例70至79中任一项所述的组合物，其中所述组合物被静脉内施用。
实施例81.根据实施例70至80中任一项所述的组合物，其中所述个体是人。
实施例82.根据实施例70至81中任一项所述的组合物，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
实施例83.根据实施例82所述的组合物，其中另一种疗法是、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或用于免疫肿瘤疗法的化学疗法双特异性多肽。
实施例84.一种包括有效量的无核细胞的组合物在制备用于刺激对突变的Ras的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据实施例39至69中任一项所述的组合物。
实施例85.一种包括有效量的无核细胞的组合物在制备用于减少个体的肿瘤生长的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据实施例39至69中任一项所述的组合物。
实施例86.根据实施例84或85所述的用途，其中所述个体患有癌症。
实施例87.一种包括有效量的无核细胞源性囊泡的组合物在制备用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据实施例38至61中任一项所述的组合物。
实施例88.根据实施例86或87所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。
实施例89.根据实施例84至88中任一项所述的用途，其中所述组合物进一步包括佐剂。
实施例90.根据实施例84至89中任一项所述的用途，其中所述组合物被调配用于与佐剂联合施用。
实施例91.根据实施例90所述的用途，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
实施例92.根据实施例84至89中任一项所述的用途，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
实施例93.根据实施例84至92中任一项所述的用途，其中包括无核细胞源性囊泡的所述组合物被施用多次。
实施例94.根据实施例84至93中任一项所述的用途，其中所述组合物被静脉内施用。
实施例95.根据实施例84至94中任一项所述的用途，其中所述个体是人。
实施例96.根据实施例84至95中任一项所述的用途，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
实施例97.根据实施例96所述的用途，其中另一种疗法是化学疗法、或放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或用于免疫肿瘤疗法的双特异性多肽。
实施例98.一种试剂盒，其用于根据实施例1至38中任一项所述的方法。
实施例99.一种试剂盒，其包括根据实施例39至69中任一项所述的组合物。
实施例100.根据实施例98或99所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器或具有用于向个体施用所述组合物以刺激对突变的Ras的免疫应答、减少肿瘤生长和/或治疗癌症的说明的包装插页中一种或多种。
实施例101.一种用于产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法；所述方法包括将所述突变的Ras抗原细胞内引入到所述无核细胞源性囊泡。
实施例102.根据实施例101所述的方法，其中所述无核细胞进一步包括佐剂。
实施例103.根据实施例102所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
实施例104.根据实施例102或103所述的方法，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
实施例105.根据实施例104所述的方法，其中将所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂细胞内引入到无核细胞源性囊泡包括：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施例106.根据实施例104所述的方法，其中将所述突变的Ras抗原细胞内引入到所述无核细胞源性囊泡包括：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞，其中所述核酸表达所述突变的Ras抗原；由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞。
实施例107.根据实施例104所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡进一步细胞内包括佐剂，其中将所述突变的Ras抗原和所述佐剂细胞内引入到所述无核细胞包括：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
实施例108.根据实施例105至107中任一项所述的方法，其中所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。
实施例109.根据实施例105至108中任一项所述的方法，其中所述收缩的宽度为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
实施例110.根据实施例105至109中任一项所述的方法，其中包括多个输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
实例
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内若干个实施例是可能的。将参考以下非限制性实例更详细地描述本发明。以下实例进一步说明了本发明，但是当然不应被解释为以任何方式限制其范围。
实例1
为了确定挤压装载有突变体K-Ras抗原的无核细胞囊泡是否可被人抗原呈递细胞(APC)内化，在存在一种或多种突变的K-Ras抗原的情况下挤压加工来自健康人供体的红细胞，并且测试所得装载抗原的无核囊泡的由树突状细胞进行的体外摄取。
方法
单核细胞源性树突状细胞(MODC)由HLA供体通过从CD14+单核细胞进行五天GM-CSF/IL-4分化而产生。这些MODC可以用作人APC的体外模型(在本申请的此实例和其它实例中)。HLA供体可以来自任何亚群，包含亚群HLA-A*02、HLA-A*11、HLA-B*07、HLA-C*08。
PKH26标记的AAC-K-Ras(包括K-Ras抗原和佐剂的活化抗原载体)通过以下产生：从健康人供体中取出红细胞(RBC)并将其用PKH26(一种亲脂性荧光膜染料)标记，然后用包括突变的K-Ras抗原和佐剂的两种合成长肽(SLP)挤压加工RBC，以形成经PKH26标记的包括突变的K-Ras抗原和佐剂(AAC-K-Ras)的无核细胞囊泡。这两种SLP可以是1种或多种G12DSLP、1种或多种G12V SLP、或者选自至少1种G12D SLP和至少1种G12V SLP的2种或多种SLP的组合。佐剂可以是本领域已知的佐剂，包含聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)。然后将人类供体MODC与经PKH26标记的AAC-K-Ras在37℃或4℃下共培养过夜，并用FACS缓冲液洗涤3次。为了测定AAC-K-Ras内化，通过流式细胞术测定MODC样品，并使用FlowJo软件分析与MODC相关的PKH26荧光。
结果
在37℃和4℃下，从与经PKH26标记的AAC-K-Ras共培养的MODC中检测到PKH26荧光(生物复制或一式三份的平均值的平均值±标准偏差)，以证明人APC对Squeeze-AAC-K-Ras的体外摄取。
实例2
为了确定在由RBC产生的AAC-K-Ras内化之后抗原呈递细胞是否诱导抗原特异性应答，在体外与AAC-K-Ras和MODC共培养之后，通过IFN-γ表达或分泌测定来测量抗原特异性应答T细胞的活化。
方法
AAC-K-Ras功能的读数可以通过测量含有AAC-K-Ras、MODC和抗原特异性CD8+T细胞应答者的体外共培养物的条件培养基中的IFN-γ分泌来确定。用两种合成长肽(SLP)(1种或多种来自G12D，1种或多种来自G12V，或G12D和G12V肽的组合)和佐剂聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)的混合物挤压加工来自2名健康人供体的红细胞(RBC)，以产生AAC-KRAS。G12D和G12V SLP含有HLA限制性表位，所述表位的呈递可以诱导针对含有相应K-Ras突变体的细胞的抗原特异性T细胞应答。不同批次的AAC-K-Ras单独地与HLA+MODC和HLA+限制性CD8+T细胞共培养，并且IFN-γ表达和/或分泌的水平可以通过ELISA、ELISPOT或基于流式细胞术的测定来测量。
通过用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4刺激从HLA单倍型健康供体分离的CD14+单核细胞持续五天而产生MODC。将在培养基(不含AAC)中与K-Ras突变体特异性CD8+T细胞共培养的MODC用作阴性对照。为了区分AAC-K-Ras依赖性活性与周围培养基的活性，将含有AAC-K-Ras液相的溶液与MODC和K-Ras突变体特异性CD8+T细胞共培养。将在存在游离K-Ras突变体SLP的情况下温育的并与K-Ras突变体特异性CD8+T细胞共培养的MODC用作阳性对照。脂多糖(LPS)用于在体外增强AAC-K-Ras的MODC加工，并应用于所有共培养组用于对照目的。使用人IFN-γELISA确定分泌的IFN-γ的量。
结果
将由MODC和应答者与由供体RBC产生的AAC-K-Ras共培养诱导的应答者的IFN-γ表达和/或分泌的变化与来自与野生型K-Ras对照、液相溶液对照和未经处理对照共培养的变化进行比较，以证明人抗原呈递细胞(APC)对AAC-K-Ras的任何体外摄取，这导致由MODC呈递HLA限制性突变体K-Ras表位，进而引发CD8+T细胞的识别突变体K-Ras最小表位的功能性抗原特异性应答。
实例3
为了确定与AAC-K-Ras一起温育是否可以介导抗原呈递细胞的体外成熟，将AAC-K-Ras与MODC共培养，并且使用流式细胞术评估MODC的成熟标志物的变化。
方法
单核细胞源性树突状细胞(MODC)由HLA供体通过CD14+单核细胞的五天GM-CSF/IL-4分化而产生。这些MODC被用作人APC的体外模型。HLA供体来自任何亚群，包含亚群HLA-A*02、HLA-A*11、HLA-B*07、HLA-C*08。
AAC-K-Ras通过以下产生：从3个健康人供体中取出RBC，并将其用两种合成长肽(SLP)(1种或多种G12D SLP，1种或多种G12V SLP，或2种或更多种G12D和G12V SLP的组合)和佐剂聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)的混合物挤压加工，以产生包括佐剂和相应SLP混合物的AAC-K-Ras。G12D和G12V SLP含有HLA限制性表位，所述表位的呈递可以诱导针对含有相应K-Ras突变体的细胞的抗原特异性T细胞应答。将三个批次的AAC-K-Ras单独地与HLA+MODC共培养，并且在共培养约46小时之后，通过流式细胞术评估成熟标志物(CD80、CD86、CD83、MHC-II)的上调。将数据与培养基和空白对照进行比较。
结果
在AAC-K-Ras与人MODC抗原呈递细胞(APC)一起温育之后，测量MODC上的成熟标志物(CD80、CD86、CD83、MHC-II)水平的变化，所述成熟标志物中的一种或多种成熟标记物的上调可以表明相应的AAC-K-Ras可以介导MODC的体外成熟。
实例4
为了确定用突变体K-Ras-G12D抗原挤压加工的人RBC是否能够在体外激活抗原特异性应答T细胞，将人RBC用G12D抗原挤压加工，并且在与和用G12D抗原挤压装载的RBC接触的APC共培养之后，G12D特异性应答T细胞的活性(例如，IFN-γ表达和/或分泌)可以通过ELISPOT、ELISA或基于流式细胞术的测定来测量。
方法
分离人供体RBC。在RPMI中，将细胞在室温下通过微流体芯片在2×109个RBC/mL的密度下，在60psi下，用100μM合成长肽(G12D)或媒剂(DMSO)对照进行挤压加工。挤压加工之后，将RBC离心，并丢弃上清液。将细胞在R10培养基中洗涤一次，并且然后在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中洗涤两次，然后重新悬浮在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中。
包括G12D抗原和佐剂(AAC)的挤压加工的RBC然后在ELISPOT板上与APC和K-RasG12D应答T细胞一起温育。在包括G12D抗原的AAC的任何内化之后，呈递HLA限制性G12D表位的APC对K-Ras G12D应答T细胞的作用可以通过ELISPOT测定来测量。作为阳性对照，将含有最小表位的K-Ras G12D肽直接添加到ELISPOT板中未经处理的MODC和应答细胞中。将板在37℃下温育过夜并且根据制造商的说明进行显影/定量。
结果
在将APC与用G12D抗原挤压装载的AAC以及G12D特异性应答T细胞一起温育之后，通过ELISPOT测定测量IFN-γ表达性T细胞的量，其上调表明用G12D抗原挤压装载的AAC能够被APC内化，并且随后介导抗原特异性T细胞应答的激活。
实例5
为了确定用突变体K-Ras抗原挤压加工的人RBC是否能够在体外激活抗原特异性应答T细胞，将人RBC用G12D抗原挤压加工，并且在与和用G12D抗原挤压装载的RBC接触的APC共培养之后，G12D特异性应答T细胞的活性(例如，IFN-γ表达和/或分泌)可以通过ELISPOT、ELISA或基于流式细胞术的测定来测量。
方法
在RPMI中，在室温下通过微流体芯片在60psi下用100μM合成长肽(野生型K-Ras或K-Ras G12D)或媒剂(DMSO)对照分离和挤压加工人供体RBC。挤压加工之后，将RBC离心，并丢弃上清液。将细胞在R10培养基中洗涤一次，并且然后在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中洗涤两次，然后重新悬浮在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中。包括佐剂以及WT K-Ras或G12D抗原(AAC)的挤压加工的RBC然后在ELISPOT板上与APC和K-Ras G12D应答T细胞一起温育。在包括WT K-Ras或G12D抗原的AAC的任何内化之后，呈递HLA限制性WT K-Ras或G12D表位的APC对K-Ras G12D应答T细胞的作用可以通过ELISPOT测定来测量。作为对照，将含有最小表位的WT或G12D版本的肽直接添加到ELISPOT板中未经处理的MODC和应答细胞中。将板在37℃下温育过夜并且根据制造商的说明进行显影/定量。
结果
在将APC与用G12D抗原挤压装载的AAC以及G12D特异性应答T细胞一起温育之后，通过ELISPOT测定测量IFN-γ表达性T细胞的量，其上调表明用G12D抗原挤压装载的AAC能够被APC内化，并且随后介导抗原特异性T细胞应答的激活。进一步地，由用G12D挤压装载的AAC介导的IFN-γ表达性T细胞的量的上调与用野生型K-Ras抗原挤压装载的AAC缺乏可比较的效果形成对比，可以进一步说明抗原特异性T细胞应答的激活是突变特异性的。
实例6
为了确定用突变体K-Ras-G12V抗原挤压加工的人RBC是否能够在体外激活抗原特异性应答T细胞，将人RBC用G12V抗原挤压加工，并且在与和用G12V抗原挤压装载的RBC接触的APC共培养之后，G12V特异性应答T细胞的活性(例如，IFN-γ表达和/或分泌)可以通过ELISPOT、ELISA或基于流式细胞术的测定来测量。
方法
分离人供体RBC。在RPMI中，将细胞在室温下通过微流体芯片在2×109个RBC/mL的密度下，在60psi下，用100μM合成长肽(G12V)或媒剂(DMSO)对照进行挤压加工。挤压加工之后，将RBC离心，并丢弃上清液。将细胞在R10培养基中洗涤一次，并且然后在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中洗涤两次，然后重新悬浮在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中。
包括G12V抗原和佐剂(AAC)的挤压加工的RBC然后在ELISPOT板上与APC和K-RasG12V应答T细胞一起温育。在包括G12V抗原的AAC的任何内化之后，呈递HLA限制性G12V表位的APC对K-Ras G12V应答T细胞的作用可以通过ELISPOT测定来测量。作为阳性对照，将含有最小表位的K-Ras G12V肽直接添加到ELISPOT板中未经处理的MODC和应答细胞中。将板在37℃下温育过夜并且根据制造商的说明进行显影/定量。
结果
在将APC与用G12V抗原挤压装载的AAC并且随后与G12V特异性应答T细胞一起温育之后，通过ELISPOT测定测量IFN-γ表达性T细胞的量，其上调表明用G12V抗原挤压装载的AAC能够被APC内化，并且随后介导抗原特异性T细胞应答的激活。
实例7
为了确定用G12D和G12V抗原的组合挤压加工的人RBC是否可以介导在体外激活抗原特异性应答T细胞，将人RBC用G12D和G12V抗原的组合挤压加工，并且在与和用G12D和G12V抗原的组合抗原挤压装载的RBC接触的APC共培养之后，G12D特异性应答T细胞的活性(例如，IFN-γ表达和/或分泌)通过ELISPOT、ELISA或基于流式细胞术的测定来测量。
方法
在RPMI中，在室温下通过微流体芯片在60psi下用单个G12D合成长肽(SLP)、1G12DSLP和1G12V SLP的组合或媒剂(DMSO)对照分离和挤压加工人供体RBC。挤压加工之后，将RBC离心，并丢弃上清液。将细胞在R10培养基中洗涤一次，并且然后在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中洗涤两次，然后重新悬浮在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中。
将包括相应抗原的挤压加工的RBC(AAC)与APC和K-Ras G12D应答T细胞在ELISPOT板上一起温育。在包括G12D抗原的AAC的任何内化之后，呈递HLA限制性G12D表位的APC对K-Ras G12D应答T细胞的作用可以通过ELISPOT测定来测量。作为阳性对照，将含有最小表位的K-Ras G12D肽直接添加到ELISPOT板中未经处理的MODC和应答细胞中。将板在37℃下温育过夜并且根据制造商的说明进行显影/定量。
结果
在将APC与AAC(用G12D抗原或G12D和G12V抗原的组合挤压装载的)并且与G12D特异性应答T细胞一起温育之后，通过ELISPOT测定测量IFN-γ表达性应答者的量，其中由与任一AAC样品接触的APC诱导的可比较的上调将表明用K-Ras-G12突变体SLP的组合挤压加工的RBC可以在体外激活G12D应答T细胞，激活程度与仅用G12D挤压加工的RBC相似，并且向包括G12D SLP的AAC中添加G12V SLP有效载荷不会对由包括G12D SLP的AAC介导的G12D特异性T细胞的应答产生显著变化。
实例8
为了确定用G12D和G12V抗原的组合挤压加工的人RBC是否可以介导在体外激活抗原特异性应答T将人RBC用G12D和G12V抗原的组合挤压加工，并且在与和用G12D和G12V抗原的组合抗原挤压装载的RBC接触的APC共培养之后，G12V特异性应答T细胞的活性(例如，IFN-γ表达和/或分泌)通过ELISPOT测定来测量。
方法
在RPMI中，在室温下通过微流体芯片在60psi下用单个G12V合成长肽(SLP)、1G12DSLP和1G12V SLP的组合或媒剂(DMSO)对照分离和挤压加工人供体RBC。挤压加工之后，将RBC离心，并丢弃上清液。将细胞在R10培养基中洗涤一次，并且然后在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中洗涤两次，然后重新悬浮在CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中。
将包括相应抗原的挤压加工的RBC(AAC)与APC和K-Ras G12V应答T细胞在ELISPOT板上一起温育。在包括G12V抗原的AAC的任何内化之后，呈递HLA限制性G12V表位的APC对K-Ras G12V应答T细胞的作用可以通过ELISPOT测定来测量。作为阳性对照，将含有最小表位的K-Ras G12V肽直接添加到ELISPOT板中未经处理的MODC和应答细胞中。将板在37℃下温育过夜并且根据制造商的说明进行显影/定量。
结果
在将APC与AAC(用G12V抗原或G12D和G12V抗原的组合挤压装载的)并且与G12V特异性应答T细胞一起温育之后，通过ELISPOT测定测量IFN-γ表达性T细胞的量，其中由与任一AAC样品接触的APC诱导的可比较的上调将表明用K-Ras-G12突变体SLP的组合挤压加工的RBC可以在体外激活G12V应答T细胞，激活程度与仅用G12V挤压加工的RBC相似，并且向包括G12D SLP的AAC中添加G12V SLP有效载荷不会对由包括G12V SLP的AAC介导的G12V特异性T细胞的应答产生显著变化。
实例9
为了确定人RBC是否可以用K-Ras合成长肽挤压装载，将人RBC通过用K-Ras G12V1 -16 SLP标记的FAM挤压加工。然后使用流式细胞术分析挤压装载的RBC(AAC)的FAM荧光。
方法
分离人RBC，并在室温(RT)、37℃或冰下在RPMI中与合成长肽一起温育至少15分钟。然后将RBC在存在60psi和100μM FAM标记的K-Ras G12V1-16的情况下，通过2.2μm宽、10μm长和70μm深的微流体收缩物以2×109个细胞/mL的密度挤压加工。将细胞重新悬浮于补充有DMSO至最终浓度为5％的RPMI中。挤压加工之后，将RBC在相同温度(分别为RT、37℃或冰)下保持20分钟，用PBS洗涤五次，富集AAC(通过离心并收集形成的沉淀物的顶部浅色层)，并且然后重新悬浮于PBS中。将所得的AAC也用膜联蛋白V染色(数据未显示)。然后使用流式细胞术分析包括FAM标记的SLP的AAC，以记录FAM+事件。
结果
如图1所示，FAM标记荧光的增加表明人AAC可以装载有G12V1-16SLP。另外，挤压介导的装载在所有测试的挤压/保持温度下(包含在RT(25℃)、37℃和冰上(4℃)时)都有效。
实例10
为了确定人RBC是否可以用K-Ras合成长肽挤压装载，在存在FAM标记的K-RasG12D1-16或K-Ras G12D2-19SLP的情况下，将人RBC进行挤压加工。然后使用流式细胞术分析AAC的FAM+事件。
方法
然后将人RBC分离并且在存在60psi和100μM FAM标记的K-Ras G12D1-16或K-Ras-G12D2-19的情况下，通过2.2μm宽、10μm长和70μm深的微流体收缩物以2×109个细胞/mL的密度挤压加工。将细胞重新悬浮于补充有DMSO至最终浓度为5％的RPMI中。挤压加工之后，将样品在室温下温育20分钟，用PBS洗涤五次，富集AAC(通过离心并收集形成的沉淀物的顶部浅色层)，并且然后重新悬浮于PBS中。然后使用流式细胞术分析包括FAM标记的SLP的AAC，以记录FAM+事件。
结果
如图2所示，FAM标记荧光的增加表明人AAC可以有效地装载有G12D1-16或G12D2-19SLP，并递送到至少40％的AAC中。
实例11
为了确定共同施用抗原载体(AC)和佐剂作为在体内引发抗原特异性应答T细胞的加强接种的功效，用G12V抗原挤压加工鼠RBC，并以各种加强方案与poly I:C共同施用于HLA-A*11转基因小鼠。通过ELISPOT测量用G12V抗原刺激之后从经免疫的小鼠采集的特异性应答细胞的活性(例如，IFN-γ表达和/或分泌)。
方法
分离鼠供体RBC。在RPMI中，在存在200μM合成长肽(G12V1-16 SLP)的情况下，在室温下通过微流体芯片(2.2μm宽，10μm长，70μm深)以1×109个RBC/mL的密度在50psi下挤压加工RBC。未经加工的RBC也被用作对照(无接触)。挤压加工之后，将经过加工的RBC在室温下静置40分钟，然后离心(以8000x g)并在PBS中洗涤，然后重新悬浮于PBS或CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中。富集(例如，通过物理分离)包括G12V1-16 SLP(抗原载体ACG12V1-16)的经挤压加工的RBC的AC内的影泡群体(富集的)。分析对照RBC(无接触)和AC群体(预富集的AC，富集的AC)的细胞表面磷脂酰丝氨酸(膜联蛋白V染色)。
含有K-Ras短肽(G12V7-16)/HBV核心肽/IFA的乳剂(参见Wang等人，《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res.)》2016年3月；4(3):204-14)以初免疫苗接种(KRas/HBV/IFA；IFA初免)形式施用；而随后根据图3A和图3B所示的给药组和方案，将另外的KRas/HBV/IFA乳剂(IFA加强)或ACG12V1-16(2.5亿个AC)+1mg/mL Poly I:C(AC/Poly I:C加强)作为加强疫苗接种经眼眶后(RO)施用于HLA-A*11转基因小鼠。PBS施用用作对照。
在所描述的给药方案结束(杀死)时，从经处理或对照小鼠中采集脾和/或引流淋巴结，其中脾细胞或淋巴结源性细胞用1μM G12V7-16 K-Ras肽或非相关对照肽(MART1)处理，并立即进行IFN-γELISPOT测定(杀死)或在体外扩增6天之后进行IFN-γELISPOT测定，如图3C所示。
结果
如图3D所示，挤压加工后的影泡群体在RBC被挤压加工以产生用于第14天施用的AC之后的范围为64-73％，并且在RBC被挤压加工以产生用于第16天施用的AC之后为的范围为61-76％，示出了在RBC被挤压加工之后影泡群体的一致产生。此外，如图3E所示，由挤压加工产生的AC的产率与第14天施用(18％)和第16天施用(29％)产生的AC相当。另外，如通过膜联蛋白V染色测定的，高比例的挤压加工的RBC展示出细胞表面磷脂酰丝氨酸(富集的AC中93％；或富集的AC的影泡群体中的96％；分别为图3F左图和右图)。
如图3G所示，使用KRas/HBV/IFA作为加强疫苗接种(IFA加强)仅导致抗原特异性T细胞应答的适度增加，如在给药方案结束(杀死)时通过IFN-γELISPOT测定所测定的。如图3H所示，在K-Ras G12V肽掺入之后进行6天体外扩增，使用ACG12V1-16/polyI:C作为加强疫苗接种导致相当的或适度增加的抗原特异性T细胞应答，如通过IFN-γELISPOT测定所测定的。
实例12
为了确定共同施用抗原载体(AC)和佐剂作为在体内引发抗原特异性应答T细胞的功效和优化给药方案，用G12V抗原挤压加工鼠RBC，并以各种给药方案与poly I:C共同施用于HLA-A*11转基因小鼠。通过ELISPOT测量用G12V抗原刺激之后从经免疫的小鼠采集的特异性应答细胞的活性(例如，IFN-γ表达和/或分泌)。
方法
分离鼠供体RBC。在RPMI中，在存在200μM合成长肽(G12V1-16 SLP)的情况下，在室温下通过微流体芯片(2.2μm宽，10μm长，70μm深)以1×109个RBC/mL的密度在50psi或70psi下挤压加工RBC。未经加工的RBC也被用作对照(无接触)。挤压加工之后，将经过加工的RBC在室温下静置40分钟，然后离心(以8000x g)并在PBS中洗涤，然后重新悬浮于PBS或CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中。富集(例如，通过物理分离)包括G12V1-16 SLP(ACG12V1-16)的经挤压加工的RBC的AC内的影泡群体(富集的)。分析对照RBC(无接触)和AC群体(预富集的AC，富集的AC)的细胞表面磷脂酰丝氨酸(膜联蛋白V染色)。
随后，根据图4A所示的给药方案，将ACG12V1-16(2.5亿个AC)+1mg/mL Poly I:C或PBS(对照)经眶后(RO)施用于HLA-A*11转基因小鼠：
组A：第-2天、第0天、第7天和第14天的PBS(对照)。
组B：在第5天和第14天施用250M ACG12V1-16+poly I:C(P/-/B)
组C：在第-2天、第0天、第7天和第14天施用250M ACG12V1-16+poly I:C(P/B/B/B)
组D：在第-2天、第0天和第14天施用250M ACG12V1-16(P/B/-/B)
在所描述的给药方案结束(杀死)时，从经处理或对照小鼠中采集脾和/或引流淋巴结，其中脾细胞或淋巴结源性细胞通过用1μM G12V7-16 K-Ras肽或非相关对照肽(MART1)掺入进行处理，并立即进行IFN-γELISPOT测定(杀死)或在体外扩增6天之后进行IFN-γELISPOT测定，如图3C所示。
结果
如图4B所示，在RBC被挤压加工以产生用于第-2天、第0天和第7天施用的AC(在50psi下挤压加工)之后，挤压加工后的影泡群体的范围为17％-68％，并且在RBC被挤压加工以产生用于第14天施用的AC(在70psi下挤压加工)之后，影泡群体的范围为约86％-94％。此外，如图4C所示，由挤压加工产生的AC的回收产率与针对第-2天、第0天、第5天和第7天施用所产生的AC相当(5％-26％，在50psi下挤压加工)，而针对第16天施用所产生的AC的回收产率更高(33％，在70psi下挤压加工)。
如图4D、4E、4F和4G所示，施用ACG12V1-16/poly I:C导致抗原特异性T细胞应答增加，如通过IFN-γELISPOT测定所测定的。具体地，根据P/B/B/B方案施用的ACG12V1-16/poly I:C导致强烈引发抗原特异性T细胞应答，如通过IFN-γELISPOT测定在杀死时(平均约300个SFU/1e6个细胞，图4D)和体外扩增之后(平均约51000个SFU/1e6个细胞，图4F)所测定的。相比之下，根据P/--/B方案和P/B/--/B方案施用的ACG12V1-16/poly I:C在杀死时和体外扩增之后产生中度激活应答(约19000-22000个SFU/1e6个细胞)。
实例13
为了确定包括抗原和佐剂的活化抗原载体(AAC)相对于抗原载体(AC)与佐剂的共同施用在体内引发抗原特异性应答T细胞的功效，将鼠RBC用G12V抗原(含或不含poly I:C)挤压加工，并以不同的给药方案施用于HLA-A*11转基因小鼠(在与poly I:C共同注射的情况下或不与其共同注射的情况下)。通过ELISPOT测量用G12V抗原刺激之后从经免疫的小鼠采集的特异性应答细胞的活性(例如，IFN-γ表达和/或分泌)。
方法
分离鼠供体RBC。在RPMI中，在存在(1)200μM合成长肽(G12V1-16SLP)或(2)200μMG12V1-16 SLP和1mg/mL Poly I:C的情况下，在室温下通过微流体芯片(2.2μm宽，10μm长，70μm深)以2×109个RBC/mL的密度在70psi下挤压加工RBC。未经加工的RBC也被用作对照(无接触)。挤压加工之后，将经过加工的RBC在室温下静置40分钟，然后离心(以8000x g)并在PBS中洗涤，然后重新悬浮于PBS或CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中。包括G12V1-16 SLP(ACG12V1-16)或包括G12V1-16 SLP和poly I:C(AACG12V1-16)的挤压加工的RBC被富集(例如，通过物理分离)，用于AC或AAC(富集的)内的影泡群体。分析对照RBC(无接触)和AC或AAC群体(预富集的AC或AAC，富集的AC或AAC)的细胞表面磷脂酰丝氨酸(膜联蛋白V染色)。
随后，根据图5A所示的给药方案，将共同施用ACG12V1-16(2.5亿个AC)和1mg/mL PolyI:C；或施用AACG12V1-16(2.5亿个AAC)或PBS(对照)经眶后(RO)施用于HLA-A*11转基因小鼠：
组A：第-2天、第0天、第7天和第14天的PBS(对照)。
组B：在第12天和第14天施用250M ACG12V1-16+poly I:C(P/-/B)
组C：在第5天、第7天和第14天施用250M ACG12V1-16+poly I:C(P/B/B)
组D：在第5天、第7天和第14天施用250M AACG12V1-16(通过G12V1-16和poly I:C的共同挤压产生)(P/B/B共同挤压pIC)
组E：在第-2天、第0天、第7天和第14天施用250M ACG12V1-16+poly I:C(P/B/B)
组F：在第14天施用250M ACG12V1-16+poly I:C(P)
在所描述的给药方案结束(杀死)时，从经处理或对照小鼠中采集脾和/或引流淋巴结，其中脾细胞或淋巴结源性细胞用1μM G12V7-16 K-Ras肽或非相关对照蛋白(MART1)处理，并立即进行IFN-γELISPOT测定(杀死)或在体外扩增6天之后进行IFN-γELISPOT测定，如先前图3C所示。
结果
如图5B所示，挤压加工后的影泡群体在RBC被挤压加工以产生用于第-2天、第0天、第5天、第7天、第12天和第14天施用的AC或AAC之后的范围为68％-94％，显示出在RBC被挤压加工后一致产生高比例的影泡群体。此外，如图5C所示，针对第-2天、第0天、第5天、第7天、第12天施用(约20％-40％，在50psi下挤压)所产生的AC和AAC，挤压加工的回收率相当，针对第14天施用(约60％，在70psi下挤压)所产生的AC和AAC，回收率进一步提高。
如图5D和5E所示，P/B/B组(在第5天、第7天和第14天共同施用的250M ACG12V1-16+poly I:C)在杀死时和体外扩增之后均显示出所有组中最高的ELISPOT斑点计数，分别比P/B/B共挤压pIC(在第5天、第7天和第14天施用的250M AACG12V1-16)在杀死时和扩增后高约2倍和约3.5倍。对于仅初免组P(在第14天共同施用的250M ACG12V1-16+poly I:C)，通过ELISPOT斑点计数测定，仅在体外扩增之后仅从仅初免组观察到显著应答。
实例14
为了确定包括抗原和佐剂两者的活化抗原载体(AAC)在体内引发抗原特异性应答T细胞的功效，并且优化给药方案，将鼠RBC用G12V抗原和poly I:C挤压加工，并以不同的给药方案施用于HLA-A*11转基因小鼠。通过ELISPOT测量用G12V抗原刺激之后从经免疫的小鼠采集的特异性应答细胞的活性(例如，IFN-γ表达和/或分泌)。
方法
分离鼠供体RBC。在RPMI中，在存在200μM合成长肽(G12V1-16 SLP)和Dalton PolyI:C的情况下，在室温下通过微流体芯片(2.2μm宽，10μm长，70μm深)以2×109个RBC/mL的密度在70psi下挤压加工RBC。未经加工的RBC也被用作对照(无接触)。挤压加工之后，将经过加工的RBC在室温下静置1小时，然后离心(以8000x g)并在PBS中洗涤，然后重新悬浮于PBS或CTL培养基(补充有1％谷氨酰胺)中。富集(例如，通过物理分离)包括G12V1-16 SLP和polyI:C(AACG12V1-16)的经挤压加工的RBC的AAC内的影泡群体(富集的)。分析对照RBC(无接触)和AAC群体(预富集的AAC，富集的AAC)的细胞表面磷脂酰丝氨酸(膜联蛋白V染色)。
随后，根据图6A所示的给药方案，将AACG12V1-16(2.5亿个、5亿个或10亿个AAC)或PBS(对照)经眶后(RO)施用于HLA-A*11转基因小鼠：
组A：第-2天、第0天、第5天和第7天的PBS(对照)。
组B：在第-2天、第0天和第7天施用250M AACG12V1-16(250M P/B/B)
组C：在第0天和第7天施用250M AACG12V1-16(250M P/B第0天、第7天)
组D：在第5天和第7天施用250M AACG12V1-16(250M P/B第5天、第7天)
组E：在第7天施用250M AACG12V1-16(250M P第7天)
组F：在第7天施用500M AACG12V1-16(500M P第7天)
组F：在第7天施用1B AACG12V1-16(1B P第7天)
在所描述的给药方案结束(杀死)时，从经处理或对照小鼠中采集脾和/或引流淋巴结，其中脾细胞或淋巴结源性细胞用1μM G12V7-16 K-Ras肽或非相关对照蛋白(MART1)处理，并进行IFN-γELISPOT测定(杀死)。
结果
图6B示出了在第-2天、第0天、第5天和第7天，在70psi下挤压加工RBC之后，一致产生高比例的影泡群体。此外，如图6C所示，由挤压加工产生的AAC的回收率与针对第-2天、第0天、第5天、第7天、第12天施用所产生的AAC相当(约20％-40％)。
如图6C所示，如通过IFN-γELISPOT测定所测定的，当小鼠以加强方案(P/B/B或P/B，已经接受了2或3次250M AACG12V1-16的免疫接种)施用时，在杀死时观察到内源性抗原特异性应答。如图6D所示，虽然单独用250M AACG12V1-16(250M P第7天)进行初免疫苗接种时，在杀死时没有观察到应答，但与对照相比，单独进行较高剂量的初免疫苗接种(500M P第7天和1B P第7天)显示出小应答的引发。
序列表
序列表
<110> SQZ生物技术公司
<120> 使用无核细胞刺激对突变体RAS的免疫应答的方法
<130> 75032-20027.40
<140> 尚未指定
<141> 与此同时
<150> US 63/058,438
<151> 2020-07-29
<160> 17
<170> Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln
20
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val
20 25
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Leu
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser
1 5 10 15
<210> 8
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala
1 5 10 15
Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro
20 25 30
Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys
35 40
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu
1 5 10
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
Claims (110)
1.一种用于刺激对个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
2.一种用于减少个体的肿瘤生长的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
3.一种用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述个体患有癌症。
5.一种用于治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括无核细胞源性囊泡的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原、突变的H-Ras抗原或突变的N-Ras抗原。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras4A抗原或突变的K-Ras4B抗原。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是单个多肽，所述单个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位和一个或多个异源肽序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原与其它抗原或佐剂复合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括与SEQ IDNO:9-15中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括SEQ IDNO:9-15的氨基酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29、G12V1-16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42抗原中的一种或多种。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括与SEQ IDNO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原包括SEQ IDNO:1-8的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述无核细胞进一步包括佐剂。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述组合物与佐剂联合施用。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。
28.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中包括所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和佐剂的无核细胞源性囊泡。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述收缩的宽度为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的方法，其中包括多个输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述无核细胞是红细胞或血小板。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述无核细胞是红细胞或网织红细胞。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中包括所述无核细胞源性囊泡的所述组合物被施用多次。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述组合物被静脉内施用。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述另一种疗法是化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或用于免疫肿瘤疗法的双特异性多肽。
39.一种组合物，其包括无核细胞源性囊泡，其中所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原；其中所述突变的Ras抗原被细胞内递送至所述无核细胞源性囊泡。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
42.根据权利要求40或41所述的组合物，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
43.一种组合物，其包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原或突变的Ras抗原和佐剂，其中包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
44.一种组合物，其包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原，其中包括所述突变的Ras抗原的所述无核细胞源性囊泡通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞，其中所述核酸表达所述突变的Ras抗原；由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡。
45.一种组合物，其包括无核细胞源性囊泡，所述无核细胞源性囊泡包括突变的Ras抗原和佐剂，其中包括所述突变的Ras抗原和佐剂的所述无核细胞通过以下制备：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
46.根据权利要求43至44中任一项所述的组合物，其中所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的组合物，其中所述收缩的宽度为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的组合物，其中包括所述输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的组合物，其中所述输入无核细胞是红细胞或血小板。
50.根据权利要求43至48中任一项所述的组合物，其中所述输入无核细胞是红细胞或网织红细胞。
51.根据权利要求38至48中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡是红细胞源性囊泡或血小板源性囊泡。
52.根据权利要求38至48中任一项所述的组合物，其中所述无核细胞源性囊泡是网织红细胞源性囊泡或红细胞源性囊泡。
53.根据权利要求38至52中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras抗原、突变的H-Ras抗原或突变的N-Ras抗原。
54.根据权利要求38至53中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是突变的K-Ras4A抗原或突变的K-Ras4B抗原。
55.根据权利要求38至54中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是单个多肽，所述单个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。
56.根据权利要求38至55中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同突变的Ras抗原的应答。
57.根据权利要求38至56中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原与其它抗原或佐剂复合。
58.根据权利要求38至57中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括G12D突变、G12V突变、G12C突变或G13D突变。
59.根据权利要求38至58中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括与SEQID NO:9-15中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
60.根据权利要求38至59中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括SEQ IDNO:9-15的氨基酸序列。
61.根据权利要求51至60中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是G12D1-16、G12D2-19、G12D2-22、G12D2-29抗原、G12V1-16、G12V2-19、G12V3-17或G12V3-42抗原中的一种或多种。
62.根据权利要求38至61中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括与SEQID NO:1-8中的任一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
63.根据权利要求38至62中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原包括SEQ IDNO:1-8的氨基酸序列。
64.根据权利要求38至63中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原是多肽，所述多肽包括一个或多个抗原性突变的Ras表位，所述抗原性突变的Ras表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。
65.根据权利要求38至64中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
66.根据权利要求38至65中任一项所述的组合物，其中所述突变的Ras抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
67.根据权利要求38至66中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
69.根据权利要求67或68所述的组合物，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
70.一种用于刺激对个体的突变的Ras蛋白的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求39至69中任一项所述的组合物。
71.一种用于减少个体的肿瘤生长的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求39至69中任一项所述的组合物。
72.根据权利要求70或71所述的组合物，其中所述个体患有癌症。
73.一种用于治疗个体的癌症的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求39至69中任一项所述的组合物。
74.根据权利要求72或73所述的组合物，其中所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。
75.根据权利要求71至74中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
76.根据权利要求71至74中任一项所述的组合物，其中所述组合物与佐剂联合施用。
77.根据权利要求76所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
78.根据权利要求76或77所述的组合物，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
79.根据权利要求70至78中任一项所述的组合物，其中包括无核细胞的所述组合物被多次施用。
80.根据权利要求70至79中任一项所述的组合物，其中所述组合物被静脉内施用。
81.根据权利要求70至80中任一项所述的组合物，其中所述个体是人。
82.根据权利要求70至81中任一项所述的组合物，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中另一种疗法是化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或用于免疫肿瘤疗法的双特异性多肽。
84.一种包括有效量的无核细胞的组合物在制备用于刺激对突变的Ras的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求39至69中任一项所述的组合物。
85.一种包括有效量的无核细胞的组合物在制备用于减少个体的肿瘤生长的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求39至69中任一项所述的组合物。
86.根据权利要求84或85所述的用途，其中所述个体患有癌症。
87.一种包括有效量的无核细胞源性囊泡的组合物在制备用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求38至61中任一项所述的组合物。
88.根据权利要求86或87所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌、结肠癌、小肠癌、胆道癌、子宫内膜癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、宫颈癌或泌尿道癌。
89.根据权利要求84至88中任一项所述的用途，其中所述组合物进一步包括佐剂。
90.根据权利要求84至89中任一项所述的用途，其中所述组合物被调配用于与佐剂联合施用。
91.根据权利要求90所述的用途，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
92.根据权利要求84至89中任一项所述的用途，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
93.根据权利要求84至92中任一项所述的用途，其中包括无核细胞源性囊泡的所述组合物被施用多次。
94.根据权利要求84至93中任一项所述的用途，其中所述组合物被静脉内施用。
95.根据权利要求84至94中任一项所述的用途，其中所述个体是人。
96.根据权利要求84至95中任一项所述的用途，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
97.根据权利要求96所述的用途，其中另一种疗法是化学疗法、或放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或用于免疫肿瘤疗法的双特异性多肽。
98.一种试剂盒，其用于根据权利要求1至38中任一项所述的方法。
99.一种试剂盒，其包括根据权利要求39至69中任一项所述的组合物。
100.根据权利要求98或99所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器或具有用于向个体施用所述组合物以刺激对突变的Ras的免疫应答、减少肿瘤生长和/或治疗癌症的说明的包装插页中一种或多种。
101.一种用于产生包括突变的Ras抗原的无核细胞源性囊泡的组合物的方法；所述方法包括将所述突变的Ras抗原细胞内引入到所述无核细胞源性囊泡。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述无核细胞进一步包括佐剂。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。
104.根据权利要求102或103所述的方法，其中所述佐剂是聚肌-聚胞苷酸。
105.根据权利要求104所述的方法，其中将所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂细胞内引入到无核细胞源性囊泡包括：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；由此产生包括所述突变的Ras抗原或所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
106.根据权利要求104所述的方法，其中将所述突变的Ras抗原细胞内引入到所述无核细胞源性囊泡包括：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸进入所述扰动的输入无核细胞，其中所述核酸表达所述突变的Ras抗原；由此产生包括所述突变的Ras抗原的无核细胞。
107.根据权利要求104所述的方法，其中所述无核细胞源性囊泡进一步细胞内包括佐剂，其中将所述突变的Ras抗原和所述佐剂细胞内引入到所述无核细胞包括：
a)使包括输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩，其中所述收缩的直径是所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径的函数，由此使得所述输入无核细胞的扰动足够大以使编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及
b)将所述扰动的输入无核细胞与所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂一起温育足够长的时间，以允许所述编码所述突变的Ras抗原的核酸以及所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；其中所述编码所述突变的Ras抗原的核酸被表达，由此产生包括所述突变的Ras抗原和所述佐剂的无核细胞源性囊泡。
108.根据权利要求105至107中任一项所述的方法，其中所述收缩的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。
109.根据权利要求105至108中任一项所述的方法，其中所述收缩的宽度为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。
110.根据权利要求105至109中任一项所述的方法，其中包括多个输入无核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩，其中所述多个收缩串联和/或并联布置。
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