CN112105383A - 用于治疗hpv相关疾病的方法 - Google Patents

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K·布拉戈维奇
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K·赫拉维蒂
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Abstract

本申请提供了包含HPV抗原和佐剂的免疫细胞；制造此类经修饰的免疫细胞的方法；以及使用此类经修饰的免疫细胞治疗HPV相关疾病、预防HPV相关疾病和/或调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法。

Description

用于治疗HPV相关疾病的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月12日提交的美国临时申请号62/641,988、2019年1月18日提交的美国临时申请号62/794,517、2019年2月28日提交的美国临时申请号62/812,225的优先权。本申请还要求2019年3月11日提交的欧洲专利申请号EP 19161964.2的权益；将其通过引用以其整体特此并入。
ASCII文本文件序列表的提交
将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：750322001640SEQLIST.TXT，记录日期：2019年3月11日，大小：14KB)。
技术领域
本公开文本总体上涉及包含抗原和佐剂的免疫细胞；制造此类经修饰的免疫细胞的方法；以及使用此类经修饰的免疫细胞治疗HPV相关疾病、预防HPV相关疾病以及调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法。
背景技术
乳头瘤病毒是病毒粒子尺寸为直径约55nm的小型无包膜DNA病毒。已完全表征了超过100种HPV基因型，并且推测存在更高的数量。HPV是子宫颈癌以及一些外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、肛门癌和直肠癌的已知病因。尽管大多数HPV感染是无症状的并且自发清除，但是在一种致癌性HPV类型的情况下的持续性感染可能发展为癌前期或癌症。其他HPV相关疾病可以包括寻常疣、足底疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头瘤、疣状囊肿、喉乳头瘤病、鳞状上皮内病变(SIL)、子宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、外阴上皮内瘤样病变(VIN)和阴道上皮内瘤样病变(VAIN)。
许多已知的人类乳头瘤病毒(HPV)类型会引起良性病变，其一个子组是致癌的。基于流行病学和系统发育关系，HPV类型分为15种“高风险类型”(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)和三种“可能的高风险类型”(HPV 26、53和66)，已知它们共同表现为低级和高级子宫颈变化和癌症以及其他肛门生殖器癌(诸如外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和肛周癌)以及头颈癌。最近，还描述了高风险型HPV16和18与乳腺癌的相关性。被归类为“低风险型”的已知有11种HPV类型(HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81)已知表现为良性低级子宫颈变化、生殖器疣和反复呼吸道乳头瘤病。皮肤HPV类型5、8和92与皮肤癌有关。在一些HPV相关癌症中，免疫系统受到抑制，并且相应地抗肿瘤应答显著受损。参见Suresh和Burtness Am J Hematol Oncol 13(6):20-27(2017)。
免疫疗法可分为两种主要干预类型：被动干预或主动干预。被动方案包括给予预激活和/或工程化细胞(例如，CAR T细胞)、疾病特异性治疗性抗体、和/或细胞因子。主动免疫疗法策略涉及体内刺激免疫系统效应子功能。当前的若干种主动方案包括用疾病相关肽、裂解物或同种异体全细胞进行疫苗接种策略；输注作为肿瘤抗原递送的媒介物的自体DC；以及输注免疫检查点调节剂。参见Papaioannou,Nikos E.等人Annals oftranslational medicine 4.14(2016)。可以采用过继免疫疗法来调节免疫应答，增强抗肿瘤活性并且实现治疗或预防HPV相关癌症的目的。
通过疾病相关抗原刺激的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助T(Th)细胞具有靶向和破坏患病细胞的潜力。本文描述的方法用于以高的通量且高效地从头产生经修饰的免疫细胞，从而诱导针对HPV抗原稳健的T细胞应答。
本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过引用以其整体并入。将专利公开WO 2017041050、WO 2016070136特此通过引用以其整体明确并入。
发明内容
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内。在一些方面，本发明提供了一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内。在一些方面，本发明提供了一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，本发明提供了一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，本发明提供了一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入细胞包含HPV抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。在一些实施方案中，所述缩窄部在通道中。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
在一些实施方案中，所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的外部进一步包含HPV抗原和/或佐剂。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的比率在约10000:1与约1:10000之间。
在一些实施方案中，所述免疫应答增强。在一些实施方案中，针对所述HPV抗原的免疫应答增强。
在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是CpG ODN1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
在一些实施方案中，所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。在一些实施方案中。
所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。在一些实施方案中，所述HPV抗原是HPV-16或HPV-18抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。在一些实施方案中，所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含HPV E6抗原和HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含抗原性表位的多肽，所述抗原性表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施方案中，所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，N末端侧接多肽包含SEQ ID NO:5-10中任何一个的氨基酸序列和/或C末端侧接多肽包含SEQ ID NO:11-17中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述药剂包含小鼠血清白蛋白(MSA)。在一些实施方案中，将所述经修饰的免疫细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施方案中，所述共刺激分子是B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。在一些实施方案中，所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞不是B细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHCII类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞对所述个体而言是同种异体的。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞对所述个体而言是自体的。在一些实施方案中，将所述个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者给予佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是IFNα或CpG ODN。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。在一些实施方案中，在给予所述佐剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，在给予所述佐剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
在一些实施方案中，将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与免疫检查点抑制剂的给予组合。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，在给予所述免疫检查点抑制剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，在给予所述免疫检查点抑制剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
在一些实施方案中，向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。在一些实施方案中，向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
在一些实施方案中，所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述方法包括多次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，所述方法包括第一次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物，然后第二次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，所述第二次给予是在所述第一次给予后约一个月。
在一些实施方案中，所述HPV相关疾病是HPV相关癌症。在一些实施方案中，所述HPV相关癌症是子宫颈癌、肛门癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。在一些实施方案中，所述HPV相关疾病是HPV相关感染性疾病。
在一些方面，本发明提供了一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸。在一些方面，本发明提供了一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些方面，本发明提供了一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
在一些方面，本发明提供了一种用于治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些方面，本发明提供了一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些方面，本发明提供了一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。在一些实施方案中，所述缩窄部在通道中。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力，
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者给予佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是IFNα或CpG ODN。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。在一些实施方案中，在给予所述佐剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，在给予所述佐剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含佐剂。在一些实施方案中，将步骤b的所述扰动的免疫细胞与所述HPV抗原和佐剂一起孵育。在一些实施方案中，所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的外部进一步包含HPV抗原和/或佐剂。
在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
在一些实施方案中，所述免疫应答增强。在一些实施方案中，针对所述HPV抗原的免疫应答增强。
在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是CpG ODN1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
在一些实施方案中，所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。在一些实施方案中，所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。在一些实施方案中，所述HPV抗原是HPV-16或HPV-18抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。在一些实施方案中，所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含HPV E6抗原和HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含抗原性表位的多肽，所述抗原性表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述药剂包含小鼠血清白蛋白(MSA)。在一些实施方案中，将所述经修饰的免疫细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施方案中，所述共刺激分子是B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。在一些实施方案中，所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞不是B细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHCII类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞对所述个体而言是同种异体的。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞对所述个体而言是自体的。在一些实施方案中，将所述个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者给予佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是IFNα或CpG ODN。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。在一些实施方案中，在给予所述佐剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，在给予所述佐剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
在一些实施方案中，将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与免疫检查点抑制剂的给予组合。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，在给予所述免疫检查点抑制剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，在给予所述免疫检查点抑制剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
在一些实施方案中，向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。在一些实施方案中，向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
在一些实施方案中，所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述方法包括多次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，所述方法包括第一次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物，然后第二次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，所述第二次给予是在所述第一次给予后约一个月。
在一些实施方案中，所述HPV相关疾病是HPV相关癌症。在一些实施方案中，所述HPV相关癌症是子宫颈癌、肛门癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。在一些实施方案中，所述HPV相关疾病是HPV相关感染性疾病。
在一些方面，本发明提供了一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含CpG ODN和与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的HPV抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含CpG ODN和HPV抗原，其中所述HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述CpG ODN通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述CpG ODN一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述CpG ODN进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。在一些实施方案中，所述缩窄部在通道中。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述HPV抗原和/或所述CpG ODN存在于细胞质液和/或胞内体中。在一些实施方案中，所述抗原和/或所述CpG ODN存在于所述细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的表面上进一步包含HPV抗原和/或CpG ODN。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的CpG ODN的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与CpG ODN的比率在约10000:1至约1:10000之间。在一些实施方案中，所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂包含CpGODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
在一些实施方案中，所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。在一些实施方案中，所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、与佐剂或与所述CpG ODN复合。在一些实施方案中，所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含抗原性表位的多肽，所述抗原性表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述CpG ODN。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原与所述CpG ODN的比率在约10000:1至约1:10000之间。
在一些方面，本发明提供了一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。在一些实施方案中，所述缩窄部在通道中。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的表面上进一步包含HPV抗原和/或佐剂。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN2006。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
在一些实施方案中，所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。在一些实施方案中，所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。在一些实施方案中，所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述药剂包含MSA。在一些实施方案中，将所述细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施方案中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。在一些实施方案中，所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞不是B细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHCI类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。
在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞对个体而言是同种异体的。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞对个体而言是自体的。在一些实施方案中，将个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、LAG3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施方案中，向个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。在一些实施方案中，向个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
在一些实施方案中，所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞不是B细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHCI类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。
在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞对个体而言是同种异体的。在一些实施方案中，所述经修饰的细胞对个体而言是自体的。在一些实施方案中，将个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3。在一些实施方案中，向个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。在一些实施方案中，向个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
在一些实施方案中，所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
在一些方面，本发明提供了一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入细胞包含HPV抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些方面，本发明提供了一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入细胞包含所述佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在一些实施方案中，所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。在一些实施方案中，所述缩窄部在通道中。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
在一些实施方案中，所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是CpG ODN1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
在一些实施方案中，所述HPV抗原是HPV-16或HPV-18抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ IDNO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
在一些方面，本发明提供了一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，其包括向所述个体给予与HPV抗原关联的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)将输入细胞与所述HPV抗原和/或佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原与所述输入细胞关联；从而产生与所述抗原相关联的所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是CpG ODN1018、CpG ODN 1826或CpG ODN2006。
附图说明
图1A示出了治疗组和时间表的代表性示意图。图1B示出了在图1A中概述的来自未治疗组(无T细胞的过继转移)的小鼠与来自治疗组B-E的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长。
图2A示出了用于评估E7抗原的代表性示意图。图2B示出了SLP序列对响应于TAPC疫苗接种而产生的产生IFN-γ的CD8+ T细胞的影响。
图3是示出了在体外人模型中E6 SLP在E6应答T细胞中诱导抗原特异性免疫应答的能力的图。
图4示出了E7 SLP在E711-20应答T细胞中诱导抗原特异性免疫应答的能力以及在体外人模型中SLP序列对SQZ T细胞APC(Tapc)激活的影响。
图5示出了在体外人模型中评估用于SQZ T细胞APC的抗原的剂量的研究结果。
图6示出了确定在体外人模型中SQZ T细胞APC的供体变异性的研究结果。
图7A是比较使用不同佐剂的免疫应答的稳健性的实验示意图。图7B示出了比较使用聚I:C和CpG ODN的免疫应答的稳健性的实验结果。
图8A是评估CpG ODN浓度对免疫应答的影响的实验示意图。图8B示出了评估CpGODN浓度对免疫应答的影响的实验结果。
图9A是评估CpG ODN的给药时间表对于免疫应答的实验示意图。图9B示出了评估CpG ODN的给药时间表对于免疫应答的实验结果。
图10A是评估细胞内和全身佐剂给予的组合对TAPC抗肿瘤功能的实验示意图。图10B示出了每个实验组的T细胞应答，并且图10C示出了每个实验组的肿瘤生长。图10D示出了相对于未治疗的动物，在用SQZ(E7+CpG)治疗的动物中再激发后的肿瘤生长。
图11A是评估组合多种HPV抗原对TAPC抗肿瘤功能的影响的实验示意图。图11B示出了每个实验组的T细胞应答，并且图11C示出了每个实验组的肿瘤生长。
图12A示出了评估CpG佐剂的给予途径对E7特异性TAPC抗肿瘤作用的重要性的实验结果。提供了给药时间表。图12B示出了每个治疗组中的个体小鼠的随时间变化的肿瘤体积。
图13示出了评价共给予的佐剂导致E7特异性T细胞肿瘤浸润的能力的实验示意图。T细胞应答在下图中示出。
图14A是确定用于负载有E7合成长肽(SLP)+CpG的TAPC的初免和加强两者的疫苗接种时间表的实验示意图。图14B示出了每个实验组的肿瘤生长。
图15示出了实验结果，其显示SQZ的TAPC可以直接呈递抗原。
图16示出了佐剂的SQZ递送在体外不显著改变T细胞细胞因子水平。
图17示出了抗原+/-佐剂的SQZ递送在体内不显著改变血清细胞因子水平。
图18示出了在树突细胞(如APC)中SQZ递送含有HPV-E7的细胞裂解物，然后将SQZ的树突细胞与CD8 T细胞应答者一起共培养导致与通过内吞作用将相同的裂解物递送到树突细胞中相比更稳健的T细胞应答。
图19A示出了评估B细胞作为APC诱导内源性应答的能力的实验的代表性示意图。图19B示出了响应于OVA负载的BAPC疫苗接种而产生的通过B9-23激发诱导的IFN-γ阳性CD8+ T细胞的水平。图19C示出了响应于E7负载的BAPC疫苗接种而产生的通过E7激发诱导的IFN-γ阳性CD8+ T细胞的水平。
图20A示出了在用于确定SQZ负载的B细胞充当APC以预防性治疗HPV相关肿瘤的能力的实验中随时间变化的肿瘤体积。图20B示出了来自HPV相关肿瘤的B细胞APC预防性治疗的随时间变化的相应生存数据。
图21A示出了在用于确定SQZ负载的B细胞充当APC以治疗性治疗HPV相关肿瘤的能力的实验中随时间变化的肿瘤体积。图21B示出了来自HPV相关肿瘤的B细胞APC治疗性治疗的随时间变化的相应生存数据。
图22A示出了在用于确定SQZ负载的B细胞充当APC以治疗性治疗HPV相关肿瘤的能力的实验中随时间变化的肿瘤体积。图22B示出了募集到肿瘤的肿瘤浸润细胞的各种表型的特征图和百分比。
图23示出了通过E7应答者产生的IFN-γ分泌，作为针对SQZ负载有HPV16 E7 SLP的BAPC的体外抗原特异性应答。
图24示出了相对于在共给予或不共给予佐剂的情况下给予用SQZ负载有HPV16 E7SLP的TAPC的肿瘤，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)募集的相对量。
图25示出了对于较短期(右侧腹肿瘤，在第0天注射)以及较长期保护(左侧腹肿瘤，在第60天注射)两者，在用于确定SQZ负载的T细胞充当APC以预防性治疗HPV相关肿瘤的能力的实验中随时间变化的肿瘤体积。
图26示出了在用于确定T细胞剂量、共给予佐剂以及给予次数(初免与初免/加强)对SQZ负载的T细胞充当APC以治疗性治疗HPV相关肿瘤的能力的影响的实验中随时间变化的肿瘤体积。在图26中，“P”指示初免，并且“B”指示加强。
图27A示出了在用于确定与电穿孔B细胞和高剂量的高剂量肽疫苗(SC SLP)相比SQZ负载的B细胞充当APC以治疗性治疗HPV相关肿瘤的能力的实验中随时间变化的肿瘤体积。图27B示出了与电穿孔B细胞和高剂量肽疫苗相比，来自HPV相关肿瘤的B细胞APC治疗性治疗的随时间变化的相应生存数据。
图28A示出了用于评估脾细胞作为APC诱导内源性应答的能力的实验的代表性示意图。图28B示出了响应于OVA负载的脾细胞APC疫苗接种而产生的通过B9-23激发诱导的IFN-γ阳性CD8+ T细胞的水平。图28C示出了响应于负载E7的脾细胞APC疫苗接种而产生的通过E7激发诱导的IFN-γ阳性CD8+ T细胞的水平。
图29A示出了在用于确定SQZ负载的脾细胞充当APC以治疗性治疗HPV相关肿瘤的能力的实验中随时间变化的肿瘤体积。图29B示出了来自HPV相关肿瘤的脾细胞APC治疗性治疗的随时间变化的相应生存数据。
图30示出了通过E7应答者产生的IFN-γ分泌，作为针对SQZ负载有HPV16 E7 SLP的PBMCAPC的体外抗原特异性应答。
具体实施方式
在一些方面，本发明提供了用于治疗和预防HPV相关疾病和/或调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂。在一些方面，本发明提供了用于治疗和预防HPV相关疾病和/或调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：首先使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；并且然后将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。本公开文本的某些方面涉及用于产生包含经修饰的免疫细胞的组合物的方法，其中使免疫细胞通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得HPV抗原和/或佐剂进入待修饰的免疫细胞中。
在一些方面，本发明提供了用于治疗和预防HPV相关疾病和/或调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原。在一些方面，本发明提供了用于治疗和预防HPV相关疾病和/或调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原，其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：首先使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入细胞；并且然后将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。本公开文本的某些方面涉及用于产生包含经修饰的免疫细胞的组合物的方法，其中使免疫细胞通过缩窄部，其中所述缩窄部使所述细胞变形，从而引起所述细胞的扰动，使得HPV抗原进入待修饰的免疫细胞中。在一些进一步的实施方案中，所述用于治疗和预防HPV相关疾病和/或调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法进一步包括向所述个体给予佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞的组合物进一步包含佐剂(例如，CpG寡核苷酸(CpG ODN)或IFNα。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步在细胞内包含佐剂，诸如CpG ODN。
通用技术
本领域技术人员通常很好理解并且通常使用常规方法来使用本文描述或引用的技术和程序，例如像描述在以下项中的广泛使用的方法：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook等人,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane编辑,1988)；Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,第6版,J.Wileyand Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods inMolecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,Academic Press,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1996)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑,J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等人,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；ntibodies:A Practical Approach(D.Catty编辑,IRLPress,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑,J.B.LippincottCompany,2011)
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。在下文阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文献发生冲突的情况下，应该以阐述的定义为准。
如本文所使用，除非另外指示，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。
应理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包含多个方面和实施方案”、“由多个方面和实施方案组成”和“基本上由多个方面和实施方案组成”。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
如本文所用，“治疗”是用于获得有益或希望的临床结果的途径。如本文所用，“治疗”涵盖针对哺乳动物(包括人)的疾病，对治疗剂的任何给予或施加。出于本发明的目的，有益或希望的临床结果包括但不限于以下中的任何一个或多个：缓和一种或多种症状、削弱疾病程度、预防或延迟疾病的传播(例如，转移，例如向肺或淋巴结转移)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、抑制疾病或疾病进展、抑制或减缓疾病或疾病进展、停滞疾病发展、和缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还涵盖减少增殖性疾病的病理后果。本发明的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。
在癌症的背景下，术语“治疗”包括以下中的任何一个或全部：抑制癌细胞的生长、抑制癌细胞的复制、减低总体肿瘤负荷以及改善与疾病相关的一种或多种症状。
如本文所用的术语“孔”是指开口，包括但不限于材料内的洞、撕裂、腔、孔口、断裂、间隙或穿孔。在一些例子中，(在指示的情况下)所述术语是指本公开文本的表面内的孔。在其他例子中，(在指示的情况下)，孔可以是指细胞膜中的孔。
如本文所用的术语“膜”是指含有孔的选择性屏障或薄片。所述术语包括充当边界或衬里的柔韧的片状结构。在一些例子中，所述术语是指含有孔的表面或过滤器。所述术语不同于术语“细胞膜”。
如本文所用的术语“过滤器”是指允许选择性通过孔的多孔制品。在一些例子中，所述术语是指含有孔的表面或膜。
如本文所用的术语“不均匀的”是指在结构或组成上是混合的或不均一的物质。在一些例子中，所述术语是指在给定表面内具有不同尺寸、形状或分布的孔。
如本文所用的术语“均匀的”是指在整个结构或组成上一致或均一的物质。在一些例子中，所述术语是指在给定表面内具有一致尺寸、形状或分布的孔。
如本文所用的术语“同源的”是指来源于相同生物体的分子。在一些例子中，所述术语是指在给定生物体内通常发现或表达的核酸或蛋白质。
术语“异源的”当其涉及核酸序列(诸如编码序列和控制序列)时表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞相关联的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或与其附接的核酸区段，所述核酸区段在自然界中未发现与另一分子相关联。例如，核酸构建体的异源区域可以包括侧接在自然界中未发现未编码序列相关联的序列的编码序列。异源编码序列的另一个例子是其中编码序列本身在自然界中找不到的构建体(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，被细胞中通常不存在的构建体转化的细胞将被认为是异源的。如本文所用，等位基因变异或自然发生的突变事件不产生异源DNA。
术语“异源的”当其涉及氨基酸序列(诸如肽序列和多肽序列)时表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞相关联的序列。因此，肽序列的“异源”区域是在另一个氨基酸分子内或与其附接的氨基酸区段，所述氨基酸区段在自然界中未发现与另一分子相关联。例如，肽构建体的异源区域可以包括侧接这样的序列的肽的氨基酸序列，所侧接的序列在自然界中未发现与所述肽的氨基酸序列相关联。异源肽序列的另一个例子是其中编码序列本身在自然界中找不到的构建体(例如，具有与天然基因编码的不同的氨基酸的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，被表达在细胞中通常不存在的氨基酸构建体的载体转化的细胞将被认为是异源的。如本文所用，等位基因变异或自然发生的突变事件不产生异源肽。
如本文所用，术语“抑制”可以指阻断、减少、消除或以其他方式拮抗特定靶标的存在或活性的行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫应答可以指导致对免疫应答的阻断、减少、消除或任何其他拮抗作用的任何行为。在其他例子中，对核酸表达的抑制可以包括但不限于核酸转录的降低、mRNA丰度的降低(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。
如本文所用，术语“阻抑”可以指降低、减少、禁止、限制、减低、或以其他方式削弱特定靶标的存在或活性的行为。阻抑可以指部分阻抑或完全阻抑。例如，阻抑免疫应答可以指导致降低、减少、禁止、限制、减低、或以其他方式削弱免疫应答的任何行为。在其他例子中，对核酸表达的阻抑可包括但不限于核酸转录的降低、mRNA丰度的降低(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。
如本文所用，术语“增强”可以指提高、加强、强化或以其他方式增加特定靶标的存在或活性的行为。例如，增强免疫应答可以指导致提高、加强、强化或以其他方式增加免疫应答的任何行为。在一个示例性例子中，增强免疫应答可以指使用抗原和/或佐剂来提高、加强、强化或以其他方式增加免疫应答。在其他例子中，增强核酸的表达可以包括但不限于核酸转录的增加、mRNA丰度的增加(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的增加、mRNA翻译的增加等。
如本文所用，术语“调节”可以指变化(changing)、改变、变化(varying)或以其他方式修饰特定靶标的存在或活性的行为。例如，调节免疫应答可以指导致变化(changing)、改变、变化(varying)或以其他方式修饰免疫应答的任何行为。在一些例子中，“调节”是指增强特定靶标的存在或活性。在一些例子中，“调节”是指阻抑特定靶标的存在或活性。在其他例子中，调节核酸的表达可以包括但不限于核酸转录的改变、mRNA丰度的改变(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的相应改变、mRNA翻译的改变等。
如本文所用，术语“诱导”可以指引发、激励、刺激、建立或以其他方式产生结果的行为。例如，诱导免疫应答可以指导致引发、激励、刺激、建立或以其他方式产生所希望的免疫应答的任何行为。在其他例子中，诱导核酸表达可以包括但不限于引发核酸转录、引发mRNA翻译等。
如本文所用，“外周血单核细胞”或“PBMC”是指具有圆形核的异质血细胞群体。在PBMC群体中可以发现的细胞的例子包括淋巴细胞，诸如T细胞、B细胞、NK细胞(包括NKT细胞和CIK细胞)；以及单核细胞，诸如巨噬细胞和树突细胞。如本文所用的“多种PBMC”是指包含至少两种类型的血细胞的细胞的PBMC的制剂。在一些实施方案中，多种PBMC包含以下中的两种或更多种：T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方案中，多种PBMC包含以下中的三种或更多种：T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方案中，多种PBMC包含以下中的四种或更多种：T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方案中，多种PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突细胞。
可以通过本领域已知的方法分离PBMC。例如，PBMC可以基于与其他血细胞相比的PBMC密度而源自个体的外周血。在一些实施方案中，PBMC使用Ficoll(例如，ficoll梯度)而源自个体的外周血。在一些实施方案中，PBMC使用
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细胞分离系统而源自个体的外周血。
在一些实施方案中，从个体分离PBMC群体。在一些实施方案中，多种PBMC是自体PBMC群体，其中所述群体源自特定个体，将其通过本文描述的任何方法进行操纵并且然后返回所述特定个体。在一些实施方案中，多种PBMC是同种异体PBMC群体，其中所述群体源自一个个体，将其通过本文描述的任何方法进行操纵并且给予第二个体。
在一些实施方案中，多种PBMC是重构的PBMC制剂。在一些实施方案中，所述多种PBMC可以通过混合典型地在PBMC群体中发现的细胞；例如通过混合T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞中的两种或更多种来产生。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的聚合物形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。因此，所述术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA；基因组DNA；cDNA；DNA-RNA杂合体；或者包括嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学修饰的或生化修饰的核苷酸碱基、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可以包含糖和磷酸基团(正如典型地可在RNA或DNA中所见的)或者经修饰或取代的糖或磷酸基团。可替代地，多核苷酸的主链可以包含合成亚基(诸如氨基磷酸酯和硫代磷酸酯)的聚合物，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)、混合的硫代磷酸酯-磷酸二酯寡聚物、或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。另外，双链多核苷酸可以从化学合成的单链多核苷酸产物，通过合成互补链并且在适当的条件下使所述链退火或者是通过使用DNA聚合酶用适当的引物从头合成互补链来获得。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指这样的蛋白质，其包括对天然序列的修饰(诸如缺失、添加和取代)(在本质上通常是保守的)，只要所述蛋白质保持所希望的活性即可。这些修饰可以是故意的(如通过定点诱变)，或者可以是偶然的(诸如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
如本文所用，术语“佐剂”是指调节和/或产生免疫应答的物质。通常，与单独的抗原相比，将佐剂与抗原结合给予以实现针对抗原的免疫应答的增强。本文描述了各种佐剂。
术语“CpG寡聚脱氧核苷酸”和“CpG ODN”在本文中是指长度为10至30个核苷酸的DNA分子，其含有被磷酸酯隔开的胞嘧啶和鸟嘌呤的二核苷酸(在本文中也称为“CpG”二核苷酸或“CpG”)。本公开文本的CpG ODN含有至少一种未甲基化的CpG二核苷酸。即，CpG二核苷酸中的胞嘧啶未被甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可以具有部分或完全的硫代磷酸酯(PS)主链。
如本文所用，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”意指不是生物学上或在其他方面不希望的材料，例如所述材料可以掺入给予患者的药物组合物中而不引起任何显著的不希望的生物学作用或以有害方式与其所处组合物的任何其他组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和制造测试的要求标准和/或包括在美国食品和药物管理局编写的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。
对于本文描述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法是本领域已知的。
微流体系统及其部件
用于提供细胞变形缩窄部的微流体通道
在一些方面，本发明提供了用于治疗和预防HPV相关疾病和/或调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：首先使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；并且然后将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，可以在微流体通道内平行和/或串联放置多个缩窄部。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。用于在本文公开的方法中使用的含有细胞变形缩窄部的示例性微流体通道描述于WO 2013059343中。用于在本文公开的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于WO2017041050中。
在一些实施方案中，微流体通道包括内腔并且被配置成使得悬浮在缓冲液中的免疫细胞可以通过，其中所述微流体通道包括缩窄部。微流体通道可由多种材料中的任何一种制成，所述材料包括硅、金属(例如，不锈钢)、塑料(例如，聚苯乙烯)、陶瓷、玻璃、结晶基底、无定形基底、或聚合物(例如，聚-甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS、环烯烃共聚物(COC)等)。微流体通道的制造可以通过本领域已知的任何方法进行，包括干法蚀刻、湿法蚀刻、光刻、注射模制、激光烧蚀或SU-8掩模。
在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部包括入口部分、中心点和出口部分。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的直径是免疫细胞的直径的函数。在一些实施方案中，微流体通道内的缩窄部的直径是免疫细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸是免疫细胞直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，缩窄部尺寸是免疫细胞的最小截面距离的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，通道包括在约2μm与约10μm之间的缩窄部宽度或在其之间的任何宽度或宽度范围。例如，缩窄部宽度可以是以下中的任何一个：约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、或约7μm。在一些实施方案中，通道包括约10μm的缩窄部长度和约4μm的缩窄部宽度。通道的截面、入口部分、中心点和出口部分也可以变化。例如，截面的形状可以是环形、椭圆形、细长狭缝、正方形、六边形或三角形。入口部分限定缩窄部角度，其中所述缩窄部角度被优化以减少通道的堵塞并且被优化以增强化合物向免疫细胞中的递送。出口部分的角度也可以变化。例如，出口部分的角度被配置成减小可导致非层流的湍流的可能性。在一些实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是线性的。在其他实施方案中，入口部分和/或出口部分的壁是弯曲的。通过通道的流速也可以调节。在一些实施方案中，通过通道的流速在约0.001mL/cm2/sec至约100L/cm2/sec之间或在其之间的任何速率或速率范围。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，缩窄部的直径是PBMC的直径(诸如多种PBMC的平均直径或多种PBMC中的子群体的平均直径)的函数。在一些实施方案中，通过细胞(例如，多种PBMC中的细胞)的最小截面距离来测量细胞的直径。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，缩窄部的直径是多种输入PBMC的平均直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：多种输入PBMC的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、或约30％至约45％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：多种输入PBMC的平均直径的约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：多种输入PBMC的平均直径的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，缩窄部的直径是在多种输入PBMC中具有最小直径的细胞子群体的平均直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：在多种输入PBMC中具有最小直径的细胞子群体的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％、或约60％至约70％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：在多种输入PBMC中具有最小直径的细胞子群体的平均直径的约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：在多种输入PBMC中具有最小直径的细胞子群体的平均直径的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。在一些实施方案中，在多种输入PBMC中具有最小直径的细胞子群体是淋巴细胞群体，其中所述淋巴细胞群体的直径是约6μm至约10μm。在一些实施方案中，淋巴细胞群体的平均直径是约7μm。在一些实施方案中，所述淋巴细胞群体是T细胞群体。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，在多种输入PBMC中具有最小直径的细胞子群体是T细胞。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，缩窄部的直径是在多种输入PBMC中具有最大直径的细胞子群体的平均直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：在多种输入PBMC中具有最大直径的细胞子群体的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约15％至约30％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约20％至约30％、约30％至约70％、或约30％至约60％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：在多种输入PBMC中具有最大直径的细胞子群体的平均直径的约5％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约99％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：在多种输入PBMC中具有最大直径的细胞子群体的平均直径的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。在一些实施方案中，在多种输入PBMC中具有最大直径的细胞子群体是单核细胞群体，其中所述单核细胞群体的直径是约15μm至约25μm。在一些实施方案中，单核细胞群体的平均直径是约20μm。在一些实施方案中，在多种输入PBMC中具有最大直径的细胞子群体是单核细胞。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，缩窄部的直径是约3μm至约15μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约3μm至约10μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约4μm至约10μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约4.2μm至约6μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约4.2μm至约4.8μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：约2μm至约14μm、约4μm至约12μm、约6μm至约9μm、约4μm至约6μm、约4μm至约5μm、约3.5μm至约7μm、约3.5μm至约6.3μm、约3.5μm至约5.6μm、约3.5μm至约4.9μm、约4.2μm至约6.3μm、约4.2μm至约5.6μm、或约4.2μm至约4.9μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：约2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：约4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm、或5.0μm。在一些实施方案中，缩窄部的直径是约4.5μm。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，使输入免疫细胞以在约0.001mL/min至约200mL/min之间的流速或其之间的任何速率或速率范围通过缩窄部。在一些实施方案中，流速在约0.001mL/min至约175mL/min、约0.001mL/min至约150mL/min、约0.001mL/min至约125mL/min、约0.001mL/min至约100mL/min、约0.001mL/min至约50mL/min、约0.001mL/min至约25mL/min、约0.001mL/min至约10mL/min、约0.001mL/min至约7.5mL/min、约0.001mL/min至约5.0mL/min、约0.001mL/min至约2.5mL/min、约0.001mL/min至约1mL/min、约0.001mL/min至约0.1mL/min或约0.001mL/min至约0.01mL/min之间。在一些实施方案中，流速在约0.001mL/min至约200mL/min、约0.01mL/min至约200mL/min、约0.1mL/min至约200mL/min、约1mL/min至约200mL/min、约10mL/min至约200mL/min、约50mL/min至约200mL/min、约75mL/min至约200mL/min、约100mL/min至约200mL/min、约150mL/min至约200mL/min、约0.5mL/min至约200mL/min、约1mL/min至约200mL/min、约2.5mL/min至约200mL/min、约5mL/min至约200mL/min、约7.5mL/min至约200mL/min、约10mL/min至约200mL/min、约25mL/min至约200mL/min、或约175mL/min至约200mL/min之间。在一些实施方案中，使输入免疫细胞以在约10mL/min至约200mL/min之间的流速通过缩窄部。在一些实施方案中，使输入免疫细胞以约100mL/min的流速通过缩窄部。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，所述缩窄部可以具有本领域已知的任何形状；例如，3维形状或2维形状。缩窄部的2维形状(诸如截面形状)可以是但不限于环状、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形。缩窄部的3维形状可以是但不限于圆柱形、圆锥形或立方形。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是矩形。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约4μm至约10μm的宽度和/或约1μm至约200μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约3μm至约6μm的宽度和/或约20μm至约120μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约4.2μm至约6μm的宽度和/或约20μm至约120μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约4.2μm至约6μm的宽度和/或约40μm至约120μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约4.2μm至约6μm的宽度和/或约20μm至约80μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，缩窄部的截面形状是包括约4.5μm的宽度和/或约80μm的深度的狭缝。在一些实施方案中，狭缝包括约5μm至约50μm的长度。在一些实施方案中，狭缝包括约10μm至约30μm的长度。在一些实施方案中，狭缝包括约2μm至约50μm的长度。在一些实施方案中，狭缝包括以下中任何一个的长度：约2μm至约5μm、约5μm至约10μm、约10μm至约15μm、约15μm至约20μm、约20μm至约25μm、约25μm至约30μm、约30μm至约35μm、约35μm至约40μm、约40μm至约45μm、或约45μm至约50μm。在一些实施方案中，狭缝包括约10μm的长度。
用于提供细胞变形缩窄部的具有孔的表面
在一些方面，本发明提供了用于治疗和预防HPV相关疾病和/或增强患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原和佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：首先使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；并且然后将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。在一些实施方案中，缩窄部是孔或被包含在孔内。在一些实施方案中，孔被包含在表面中。用于在本文公开的方法中使用的具有孔的示例性表面描述于WO 2017041050中。
如本文公开的表面可由许多材料中的任何一种制成，并且采取许多形式中的任何一种。在一些实施方案中，表面是过滤器。在一些实施方案中，表面是膜。在一些实施方案中，过滤器是切向流动过滤器。在一些实施方案中，表面是海绵或海绵状基质。在一些实施方案中，表面是基质。
在一些实施方案中，该表面是曲折路径表面。在一些实施方案中，曲折的路径表面包含醋酸纤维素。在一些实施方案中，表面包含一种材料，所述材料选自但不限于合成或天然的聚合物、聚碳酸酯、硅、玻璃、金属、合金、硝酸纤维素、银、醋酸纤维素、尼龙、聚酯、聚醚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚丙烯、PVDF、聚四氟乙烯、混合的纤维素酯、瓷和陶瓷。
本文公开的表面可以具有本领域已知的任何形状；例如3维形状。表面的2维形状可以是但不限于环形、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形或八边形。在一些实施方案中，表面的形状是圆形。在一些实施方案中，表面3维形状是圆柱形、圆锥形或立方形的。
表面可以具有各种截面宽度和厚度。在一些实施方案中，表面截面宽度在约1mm与约1m之间或在其之间的任何截面宽度或截面宽度范围。在一些实施方案中，表面具有限定的厚度。在一些实施方案中，表面厚度是均一的。在一些实施方案中，表面厚度是可变的。例如，在一些实施方案中，表面的一些部分比表面的其他部分更厚或更薄。在一些实施方案中，表面厚度变化约1％至约90％或在其间的任何百分比或百分比范围。在一些实施方案中，表面的厚度在约0.01μm至约5mm之间或在其之间的任何厚度或厚度范围。
在一些实施方案中，缩窄部是孔或被包含在孔内。孔的截面宽度与待处理的免疫细胞的类型有关。在一些实施方案中，孔径是待处理的免疫细胞或免疫细胞簇的直径的函数。在一些实施方案中，孔径使得免疫细胞在通过孔时被扰动。在一些实施方案中，孔径小于免疫细胞的直径。在一些实施方案中，孔径是免疫细胞直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，孔径是免疫细胞直径的约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或约99％。最佳孔径或孔截面宽度可以基于应用和/或免疫细胞类型而变化。在一些实施方案中，孔径是约2μm至约14μm。在一些实施方案中，孔径是约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm、或约14μm。在一些实施方案中，截面宽度是约2μm至约14μm。在一些实施方案中，孔截面是约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约8μm、约10μm、约12μm、或约14μm。
孔通道的入口和出口可以具有各种角度。可以选择孔角度以在免疫细胞通过时使孔的堵塞最小化。例如，入口或出口部分的角度可以在约0度与约90度之间。在一些实施方案中，入口或出口部分可以大于90度。在一些实施方案中，孔具有相同的入口角度和出口角度。在一些实施方案中，孔具有不同的入口角度和出口角度。在一些实施方案中，孔边缘是光滑的，例如圆形的或弯曲的。光滑的孔边缘具有连续、平坦且均匀的表面，没有凸起、脊或不平整部分。在一些实施方案中，孔边缘是尖锐的。尖锐的孔边缘具有锐利的或锐角的薄边缘。在一些实施方案中，孔通道是直的。直的孔通道不含有曲线、弯曲、角度或其他不规则性。在一些实施方案中，孔通道是弯曲的。弯曲的孔通道是弯曲的或偏离直线。在一些实施方案中，孔通道具有多条曲线，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多条曲线。通过孔的流速也可以调节。在一些实施方案中，通过孔的流速在约0.001mL/cm2/sec至约100L/cm2/sec之间或在其之间的任何速率或速率范围。
孔可以具有本领域已知的任何形状，包括2维或3维形状。孔形状(例如，截面形状)可以是但不限于环状、椭圆形、圆形、方形、星形、三角形、多边形、五边形、六边形、七边形和八边形。在一些实施方案中，孔的截面的形状是圆形。在一些实施方案中，孔的3维形状是圆柱形或圆锥形。在一些实施方案中，孔具有带凹槽的入口和出口形状。在一些实施方案中，在给定表面内的孔之间，孔形状是均匀的(即，一致的或规则的)。在一些实施方案中，在给定表面内的孔之间，孔形状是不均匀的(即，混合的或变化的)。
本文描述的表面可以具有一系列总孔数。在一些实施方案中，孔涵盖总表面积的约10％至约80％。在一些实施方案中，所述表面含有约1.0x105至约1.0x1030个总孔或其之间的任何数量或数量范围。在一些实施方案中，表面包括在约10个与约1.0x1015个之间的孔/mm2表面积。
孔可以在给定表面内以多种方式分布。在一些实施方案中，孔在给定表面内平行分布。在一个这样的实施方案中，孔在相同方向上并排分布并且在给定表面内以相同的距离分开。在一些实施方案中，孔分布是有序的或均匀的。在一个这样的实施方案中，孔以规则的系统的图案分布或在给定表面内以相同的距离分开。在一些实施方案中，孔分布是随机的或不均匀的。在一个这样的实施方案中，孔以不规则的、无序的图案分布或在给定表面内以不同的距离分开。在一些实施方案中，多个表面串联分布。多个表面的表面尺寸、形状和/或粗糙度可以是均匀的或不均匀的。多个表面可以进一步含有具有均匀或不均匀的孔径、形状和/或数量的孔，从而使得能够将一系列化合物同时递送到不同免疫细胞类型中。
在一些实施方案中，单独的孔具有均一的宽度尺寸(即沿着孔通道的长度具有恒定的宽度)。在一些实施方案中，单独的孔具有可变的宽度(即沿着孔通道的长度渐增或渐减的宽度)。在一些实施方案中，在给定表面内的孔具有相同的单独的孔深度。在一些实施方案中，在给定表面内的孔具有不同的单独的孔深度。在一些实施方案中，孔彼此紧邻。在一些实施方案中，孔彼此之间分开一段距离。在一些实施方案中，孔彼此之间分开约0.001μm至约30mm的距离或在其之间的任何距离或距离范围。
在一些实施方案中，表面涂覆有材料。所述材料可以选自本领域已知的任何材料，包括但不限于特氟隆(Teflon)、粘合剂涂层、表面活性剂、蛋白质、粘附分子、抗体、抗凝血剂、调节细胞功能的因子、核酸、脂质、碳水化合物或跨膜蛋白。在一些实施方案中，表面涂覆有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些实施方案中，材料共价附接于表面。在一些实施方案中，材料非共价附接或吸附于表面。在一些实施方案中，表面分子在免疫细胞通过孔时被释放。
在一些实施方案中，表面具有经修饰的化学特性。在一些实施方案中，表面是极性的。在一些实施方案中，表面是亲水的。在一些实施方案中，表面是非极性的。在一些实施方案中，表面是疏水的。在一些实施方案中，表面是带电荷的。在一些实施方案中，表面带正电荷和/或带负电荷。在一些实施方案中，表面可以在一些区域带正电荷并且在其他区域带负电荷。在一些实施方案中，表面具有总体正电荷或总体负电荷。在一些实施方案中，表面可以是以下中的任何一种：光滑的、电解抛光的、粗糙的或经等离子体处理。在一些实施方案中，表面包含两性离子化合物或偶极化合物。在一些实施方案中，表面是经等离子体处理的。
在一些实施方案中，表面被包含在较大的模块内。在一些实施方案中，表面被包含在注射器(诸如塑料或玻璃注射器)内。在一些实施方案中，表面被包含在塑料过滤器支架内。在一些实施方案中，表面被包含在移液管器吸头内。
细胞扰动
在一些实施方案中，本发明提供了用于通过使包含免疫细胞的细胞悬浮液通过缩窄部从而引起所述免疫细胞的扰动使得抗原和/或佐剂进入所述免疫细胞中而调节免疫应答的方法，其中所述免疫细胞中的扰动是所述免疫细胞中的缺口(例如，洞、撕裂、腔、孔口、孔、断裂、间隙或穿孔)，所述缺口允许来自所述免疫细胞外部的材料移动到所述免疫细胞中。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。变形可以由例如机械应变和/或剪切力引起。在一些实施方案中，扰动是免疫细胞膜内的扰动。在一些实施方案中，扰动是瞬时的。在一些实施方案中，免疫细胞扰动持续从约1.0x10-9秒至约2小时或在其之间的任何时间或时间范围。在一些实施方案中，免疫细胞扰动持续约1.0x10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，免疫细胞扰动持续在以下中的任何一个之间：约1.0x10-9至约1.0x10-1、约1.0x10-9至约1.0x10-2、约1.0x10-9至约1.0x10-3、约1.0x10-9至约1.0x10-4、约1.0x10-9至约1.0x10-5、约1.0x10-9至约1.0x10-6、约1.0x10-9至约1.0x10-7、或约1.0x10-9至约1.0x10-8秒。在一些实施方案中，免疫细胞扰动持续以下中的任何一个：约1.0x10-8至约1.0x10-1、约1.0x10-7至约1.0x10-1、约1.0x10-6至约1.0x10-1、约1.0x10-5至约1.0x10-1、约1.0x10-4至约1.0x10-1、约1.0x10-3至约1.0x10-1、或约1.0x10-2至约1.0x10-1秒。由本文描述的方法产生的免疫细胞扰动(例如，孔或洞)不是由于蛋白质亚基组装形成多聚体孔结构(诸如由补体或细菌溶血素产生的)的结果而形成。
当免疫细胞通过缩窄部时，所述缩窄部暂时对免疫细胞膜造成损伤，其允许通过扰动使材料被动扩散。在一些实施方案中，使免疫细胞变形仅持续大约100μs的短暂时间段，以使通过细胞信号传导机制激活凋亡途径的机会最小化，但是其他持续时间是可能的(例如，从纳秒到数小时的范围)。在一些实施方案中，使免疫细胞变形持续约1.0x10-9秒至约2小时或在其之间的任何时间或时间范围。在一些实施方案中，使免疫细胞变形持续约1.0x10-9秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约1小时。在一些实施方案中，使免疫细胞变形持续在以下中的任何一个之间：约1.0x10-9至约1.0x10-1、约1.0x10-9至约1.0x10-2、约1.0x10-9至约1.0x10-3、约1.0x10-9至约1.0x10-4、约1.0x10-9至约1.0x10-5、约1.0x10-9至约1.0x10-6、约1.0x10-9至约1.0x10-7、或约1.0x10-9至约1.0x10-8秒。在一些实施方案中，使免疫细胞变形持续在以下中的任何一个之间：约1.0x10-8至约1.0x10-1、约1.0x10-7至约1.0x10-1、约1.0x10-6至约1.0x10-1、约1.0x10-5至约1.0x10-1、约1.0x10-4至约1.0x10-1、约1.0x10-3至约1.0x10-1、或约1.0x10-2至约1.0x10-1秒。在一些实施方案中，使免疫细胞变形包括使免疫细胞变形持续一段时间，所述时间的范围是但不限于约1μs至至少约750μs，例如至少约1μs、10μs、50μs、100μs、500μs、或750μs。
在一些实施方案中，抗原和/或佐剂进入免疫细胞的过程与免疫细胞通过缩窄部和/或免疫细胞的扰动同时发生。在一些实施方案中，化合物进入免疫细胞的过程在免疫细胞通过缩窄部之后发生。在一些实施方案中，化合物进入免疫细胞的过程在免疫细胞通过缩窄部之后大约几分钟发生。在一些实施方案中，化合物进入免疫细胞的过程在免疫细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至至少约30分钟发生。例如，化合物进入免疫细胞的过程在免疫细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、或约1分钟至约30分钟发生。在一些实施方案中，化合物进入免疫细胞的过程在免疫细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约10分钟、约1.0x10-2秒至约5分钟、约1.0x10-2秒至约1分钟、约1.0x10-2秒至约50秒、约1.0x10-2秒至约30秒、约1.0x10-2秒至约10秒、约1.0x10-2秒至约1秒、或约1.0x10-2秒至约0.1秒发生。在一些实施方案中，化合物进入免疫细胞的过程在免疫细胞通过缩窄部之后约1.0x10-1秒至约10分钟、约1秒至约10分钟、约10秒至约10分钟、约50秒至约10分钟、约1分钟至约10分钟、或约5分钟至约10分钟发生。在一些实施方案中，在免疫细胞通过缩窄部之后的免疫细胞扰动在免疫细胞通过缩窄部之后约5分钟左右内被纠正。
在一些实施方案中，通过缩窄部之后的细胞活力是约5％至约100％。在一些实施方案中，通过缩窄部之后的细胞活力是至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。在一些实施方案中，在免疫细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至至少约10天测量细胞活力。例如，在免疫细胞通过缩窄部之后从约1.0x10-2秒至约1秒、约1秒至约1分钟、约1分钟至约30分钟、或约30分钟至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在免疫细胞通过缩窄部之后约1.0x10-2秒至约2小时、约1.0x10-2秒至约1小时、约1.0x10-2秒至约30分钟、约1.0x10-2秒至约1分钟、约1.0x10-2秒至约30秒、约1.0x10-2秒至约1秒、或约1.0x10-2秒至约0.1秒测量细胞活力。在一些实施方案中，在免疫细胞通过缩窄部之后约1.5小时至约2小时、约1小时至约2小时、约30分钟至约2小时、约15分钟至约2小时、约1分钟至约2小时、约30秒至约2小时、或约1秒至约2小时测量细胞活力。在一些实施方案中，在免疫细胞通过缩窄部之后约2小时至约5小时、约5小时至约12小时、约12小时至约24小时、或约24小时至约10天测量细胞活力。
递送参数
许多参数可能影响通过本文描述的方法将化合物向用于调节免疫应答的免疫细胞的递送。在一些实施方案中，在通过缩窄部之前、同时或之后使细胞悬浮液与化合物接触。免疫细胞可以通过悬浮在包含待递送的化合物的溶液中的缩窄部，但是可以在免疫细胞通过缩窄部之后将化合物添加到细胞悬浮液中。在一些实施方案中，将待递送的化合物涂覆在缩窄部上。
可影响化合物向免疫细胞中递送的参数的例子包括但不限于缩窄部的尺寸、缩窄部的入口角度、缩窄部的表面特性(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，通过缩窄部的细胞传输时间)、免疫细胞浓度、细胞悬浮液中化合物的浓度，并且免疫细胞在通过缩窄部之后恢复或孵育的时间量可以影响被递送的化合物进入免疫细胞中的过程。影响化合物向免疫细胞中递送的另外的参数可以包括免疫细胞在缩窄部中的速度、在缩窄部中的剪切速率、细胞悬浮液的粘度、垂直于流速的速度分量、以及在缩窄部中的时间。可以设计此类参数以控制化合物的递送。在一些实施方案中，免疫细胞浓度范围为从约10个到至少约1012个细胞/mL或在其之间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，递送化合物浓度的范围可以为从约10ng/mL至约1g/mL或在其之间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，递送化合物浓度的范围可以为从约1pM到至少约2M或在其之间的任何浓度或浓度范围。
可以调整本公开文本的方法中使用的温度以影响化合物递送和细胞活力。在一些实施方案中，所述方法在约-5℃与约45℃之间进行。例如，所述方法可以在室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或更高)、或降低的温度(例如，约-5℃至约4℃)、或在这些示例性温度之间的温度下进行。
可以利用各种方法来驱动免疫细胞通过缩窄部。例如，可以在入口侧通过泵(例如，压缩机)施加压力，可以在出口侧通过真空泵施加真空，可以通过管施加毛细管作用，和/或系统可以重力进给。也可以使用基于位移的流动系统(例如，注射泵、蠕动泵、手动注射器或移液器、活塞等)。在一些实施方案中，免疫细胞通过正压或负压通过缩窄部。在一些实施方案中，免疫细胞通过恒定压力或可变压力通过缩窄部。在一些实施方案中，使用注射器施加压力。在一些实施方案中，使用气瓶施加压力。在一些实施方案中，使用气瓶正压方法施加压力。在一些实施方案中，使用泵施加压力。在一些实施方案中，泵是蠕动泵或隔膜泵。在一些实施方案中，使用真空施加压力。在一些实施方案中，通过重力使免疫细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，通过离心力使免疫细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，通过毛细管压力使免疫细胞通过缩窄部。
在一些实施方案中，流体流动引导免疫细胞通过缩窄部。在一些实施方案中，在免疫细胞通过缩窄部之前，流体流动是湍流。湍流是这样的流体流动，其中在给定点的速度在大小和方向上不规律地变化。在一些实施方案中，流过缩窄部的流体是层流。层流包括在固体边界附近的流体中的非中断流，其中在每个点的流动方向保持恒定。在一些实施方案中，在免疫细胞通过缩窄部之后，流体流动是湍流。免疫细胞通过缩窄部的速度可以变化。在一些实施方案中，免疫细胞以均一的细胞速度通过缩窄部。在一些实施方案中，免疫细胞以波动的细胞速度通过缩窄部。
在其他实施方案中，使用组合治疗以通过使包含免疫细胞的细胞悬浮液通过缩窄部来调节免疫应答，其中所述缩窄部使免疫细胞变形，从而引起所述免疫细胞的扰动，使得抗原和/或佐剂进入免疫细胞，例如本文描述的方法，然后暴露于在缩窄部下游的电场中。在一些实施方案中，在通过缩窄部之后，使免疫细胞通过由至少一个电极产生的电场。在一些实施方案中，电场有助于将化合物递送至在免疫细胞内部的第二位置，诸如细胞核。例如，细胞变形缩窄部和电场的组合将编码抗体的质粒递送至免疫细胞(例如，细胞核)中，导致从头产生抗体。在一些实施方案中，一个或多个电极靠近细胞变形缩窄部以产生电场。在一些实施方案中，电场在约0.1kV/m至约100MV/m之间或在其之间的任何数量或数量范围。在一些实施方案中，使用集成电路提供电信号以驱动电极。在一些实施方案中，将免疫细胞暴露于电场中，其脉冲宽度在约1ns至约1s之间、以及时间在约100ns至约10s之间或在其间的任何时间或时间范围。
用于向免疫细胞中递送的细胞悬浮液
细胞悬浮液可以是混合的或纯化的免疫细胞群体。在一些实施方案中，细胞悬浮液是混合细胞群体，诸如全血或PBMC。在进一步的实施方案中，混合细胞群体是确定的或纯化的群体的混合物。在一些实施方案中，细胞悬浮液是纯化的细胞群体，诸如纯化的免疫细胞群体。
细胞悬浮液的组成(例如，克分子渗透浓度、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)可以影响调节用于免疫应答的化合物的递送。在一些实施方案中，悬浮液包含全血。可替代地，细胞悬浮液是细胞在生理盐水溶液或除血液之外的生理介质中的混合物。在一些实施方案中，细胞悬浮液包含水性溶液。在一些实施方案中，水性溶液包含细胞培养基、(磷酸盐缓冲盐水)PBS、盐、金属离子、糖、生长因子、动物来源产品、增量材料、表面活性剂、润滑剂、脂质、维生素、氨基酸、蛋白质、细胞周期抑制剂、和/或影响肌动蛋白聚合的药剂。在一些实施方案中，细胞培养基是X-VIVOTM10、X-VIVOTM 15、DMEM、
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IMDM、或RPMI。另外，溶液缓冲液可以包含一种或多种润滑剂(普朗尼克(pluronic)或其他表面活性剂)，其可以设计例如用于减少或消除缩窄部堵塞并且提高细胞活力。示例性表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、聚山梨醇酯、糖或糖醇(诸如甘露醇)、动物来源的血清、和白蛋白。
在用某些类型的免疫细胞的一些配置中，可以在一种或多种有助于将化合物递送到所述免疫细胞内部的溶液中孵育所述免疫细胞。在一些实施方案中，水性溶液包含影响肌动蛋白聚合的药剂。在一些实施方案中，影响肌动蛋白聚合的药剂是拉春库林A、细胞松弛素和/或秋水仙碱。例如，可以在递送之前将免疫细胞在解聚溶液诸如拉春库林A(0.lμg/mL)中孵育1小时以使肌动蛋白细胞骨架解聚。作为另外的例子，可以在递送之前将免疫细胞在10μM秋水仙碱(Sigma)中孵育2小时以使微管网络解聚。
在一些实施方案中，在用于所公开的方法中之前将细胞群体富集。例如，从体液(例如外周血)获得细胞，并且任选地将其富集或纯化以浓缩免疫细胞。可以通过本领域已知的任何方法来富集细胞，所述方法包括但不限于磁性细胞分离、荧光激活细胞分选(FACS)、或密度梯度离心。
细胞悬浮液的粘度也可以影响本文公开的方法。在一些实施方案中，细胞悬浮液的粘度的范围为从约8.9x10-4Pa·s至约4.0x10-3Pa.s或其之间的任何值或值范围。在一些实施方案中，粘度范围在以下中的任何一个之间：约8.9x10-4Pa·s至约4.0x10-3Pa·s或其之间的任何值或值范围。在一些实施方案中，粘度范围在以下中的任何一个之间：约8.9x10-4Pa·s至约4.0x10-3Pa·s、约8.9x10-4Pa·s至约3.0x10-3Pa·s、约8.9x10-4Pa·s至约2.0x10-3Pa·s、或约8.9x10-3Pa·s至约1.0x10-3Pa·s。在一些实施方案中，粘度范围在以下中的任何一个之间：约0.89cP至约4.0cP、约0.89cP至约3.0cP、约0.89cP至约2.0cP、或约0.89cP至约1.0cP。在一些实施方案中，观察到剪切稀化作用，其中细胞悬浮液的粘度在剪切应变条件下降低。可以通过本领域已知的任何方法来测量粘度，所述方法包括但不限于粘度计(诸如玻璃毛细管粘度计)或流变仪。粘度计在一种流动条件下测量粘度，而流变仪用于测量随流动条件变化的粘度。在一些实施方案中，测量剪切稀化溶液(诸如血液)的粘度。在一些实施方案中，在约-5℃与约45℃之间测量粘度。例如，在室温(例如，约20℃)、生理温度(例如，约37℃)、高于生理温度(例如，大于约37℃至45℃或更高)、降低的温度(例如，约-5℃至约4℃)、或在这些示例性温度之间的温度下测量粘度。
用于增强免疫应答的抗原和佐剂
本公开文本的某些方面涉及一种通过将根据本文描述的方法修饰的免疫细胞引入患者来治疗患者的方法。在一些实施方案中，免疫细胞用于免疫疗法。在一些方面，本公开文本涉及一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂。在一些方面，本公开文本涉及一种用于治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
在一些方面，本公开文本涉及一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂。在一些方面，本公开文本涉及一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
在一些方面，本公开文本涉及一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂。在一些方面，本公开文本涉及一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过包括细胞变形缩窄部的微流体通道，所述输入细胞包含HPV抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。在一些实施方案中，所述免疫应答增强。在一些实施方案中，针对所述HPV抗原的免疫应答增强。
本发明的一些方面提供了通过给予包含细胞内抗原的免疫细胞向患有HPV相关疾病的个体中递送抗原以增强针对所述抗原的免疫应答，其中通过本文描述的任何方法将所述抗原递送至细胞。在一些实施方案中，所述抗原是单抗原。在一些实施方案中，所述抗原是抗原混合物。抗原是刺激特定免疫应答(诸如细胞或抗体介导的免疫应答)的物质。抗原结合至由对特定抗原具有特异性的免疫细胞表达的受体(诸如T细胞受体(TCR))。抗原受体结合随后触发细胞内信号传导通路，其导向下游免疫效应子通路，诸如细胞激活、细胞因子产生、细胞迁移、细胞毒性因子分泌和抗体产生。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过缩窄部，所述输入细胞包含HPV抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在进一步的实施方案中，缩窄部的直径小于所述细胞的直径。在一些实施方案中，缩窄部的直径小于所述免疫细胞的直径。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：所述细胞的直径的约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、或约99％。在一些实施方案中，缩窄部的直径是以下中的任何一个：所述细胞的直径的约20％与约30％之间、约30％与约40％之间、约40％与约50％之间、约50％与约60％之间、约60％与约70％之间、约70％与约80％之间、约80％与约90％之间、约90％与约95％之间、或约95％与约99％之间。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。在一些实施方案中，所述缩窄部在通道中。在一些实施方案中，所述缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，所述缩窄部包含在过滤器中。在其他实施方案中，所述缩窄部是在过滤器上的孔。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原和佐剂。在一些实施方案中，所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。在进一步的实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于细胞的隔室中，所述隔室包括内质网(ER)、高尔基体、溶酶体、或外泌体中的一种或多种。在一些实施方案中，所述抗原和所述佐剂在同一隔室中。在一些实施方案中，所述抗原和所述佐剂彼此在不同的隔室中。例如，在一些实施方案中，所述抗原存在于细胞质液中，而所述佐剂存在于内体中。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的外部进一步包含HPV抗原和/或佐剂。
在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度是以下中的任何一个：小于约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度是以下中的任何一个：约0.01μM与约0.1μm之间、约0.1μM与约1μm之间、约1μM与约10μm之间、约10μM与约100μm之间、约100μM与约1mM之间、或1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度是以下中的任何一个：小于约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度是以下中的任何一个：约0.01μM与约0.1μm之间、约0.1μM与约1μm之间、约1μM与约10μm之间、约10μM与约100μm之间、约100μM与约1mM之间、或1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的摩尔比率是以下中的任何一个：在约10000:1至约1:10000之间。例如，在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的摩尔比率约为以下中的任何一个：10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000、或约1:10000。在一些实施方案中，与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的摩尔比率是以下中的任何一个：约10000:1与约1000:1之间、约1000:1与约100:1之间、约100:1与约10:1之间、约10:1与约1:1之间、约1:1与约1:10之间、约1:10与约1:100之间、约1:100与约1:1000之间、约1:1000与约1:10000之间。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.01μM与约10mM之间的所述佐剂。例如，在一些实施方案中，所述免疫细胞包含浓度为以下中的任何一个的佐剂：小于约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述免疫细胞包含浓度为大于约以下中任何一个的佐剂：10mM。在一些实施方案中，所述免疫细胞包含浓度为以下中的任何一个的佐剂：在约0.1μM与约1μm之间、在约1μM与约10μm之间、在约10μM与约100μm之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞中HPV抗原的浓度在约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞中HPV抗原的浓度是以下中的任何一个：小于约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞中HPV抗原的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞中HPV抗原的浓度是以下中的任何一个：在约0.1μM与约1μm之间、在约1μM与约10μm之间、在约10μM与约100μm之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞中HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞中HPV抗原与佐剂的摩尔比率是以下中的任何一个：在约10000:1至约1:10000之间。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞中HPV抗原与佐剂的摩尔比率约为以下中的任何一个：10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000、或约1:10000。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞中HPV抗原与佐剂的摩尔比率是以下中的任何一个：在约10000:1与约1000:1之间、在约1000:1与约100:1之间、在约100:1与约10:1之间、在约10:1与约1:1之间、在约1:1与约1:10之间、在约1:10与约1:100之间、在约1:100与约1:1000之间、在约1:1000与约1:10000之间。
在一些实施方案中，所述抗原是多肽抗原。在一些实施方案中，所述抗原是经脂质修饰的。在一些实施方案中，所述经修饰的抗原是用多糖或碳水化合物部分修饰的。在一些实施方案中，所述抗原与病毒相关。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原。示例性病毒抗原包括HPV抗原。在进一步的实施方案中，所述抗原是HPV抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原由来自以下的组的选择组成：HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、和82。HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、和82是引起癌症的高风险类型，而HPV-26、53、和66是引起癌症的“可能高风险类型”。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。HPV E6和E7基因是病毒的癌基因，并且这些基因的表达是恶性转化所需的。E6和E7蛋白靶向细胞周期的许多负调节因子，分别主要是p105Rb和p53，并且因此干扰细胞周期调节。在进一步的实施方案中，所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含HPV E6抗原和HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含免疫原性表位的多肽，所述抗原性表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原是侧接来自HPV E6多肽(E7.6)的序列的HPV E7表位。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含SEQ ID NO:18-26中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，所述抗原源自细胞裂解物，诸如疾病细胞的裂解物。在一些实施方案中，所述抗原在细胞裂解物中。在一些实施方案中，所述抗原源自肿瘤裂解物。在一些实施方案中，所述抗原源自HPV相关癌细胞的裂解物。在一些实施方案中，所述HPV相关癌症是头颈癌、子宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌或唾液腺癌。
在一些方面，本公开文本涉及一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些方面，本公开文本涉及一种用于治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
在一些方面，本公开文本涉及一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些方面，本公开文本涉及一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ IDNO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
在一些方面，本公开文本涉及一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些方面，本公开文本涉及一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。在一些实施方案中，所述免疫应答增强。在一些实施方案中，针对所述HPV抗原的免疫应答增强。
在一些实施方案中，所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。在一些实施方案中，包含在多种抗原的集合中的抗原不降低针对其他抗原的免疫应答。例如，当使用HPV E6和E7抗原的集合时，针对HPV E6和E7抗原的相应免疫应答将分别是与单独使用HPV E6或单独使用HPV E7作为抗原可比较的。
在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含免疫原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述一种或多种HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。
如本文所用，术语“佐剂”是指直接或间接调节和/或产生免疫应答的物质。通常，与单独的抗原相比，将佐剂与抗原结合给予以实现针对抗原的免疫应答的增强。因此，佐剂可以用于加强对针对抗原的免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的引发。在一些实施方案中，本发明提供了被修饰为在细胞内包含HPV抗原并且在细胞内包含佐剂的免疫细胞。在一些实施方案中，将如本文所描述扰动的免疫细胞与HPV抗原和佐剂两者一起孵育。示例性的细胞内佐剂包括但不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、干扰素基因刺激因子(STING)激动剂和视黄酸诱导基因I(RIG-I)激动剂以及聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。在具体实施方案中，所述佐剂是CpG ODN多核苷酸。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂包含来自以下的组的选择：CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODNM362、CpG ODN D-SL03。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂是CpG ODN 1826(SEQ:TCCATGACGTTCCTGACGTT)或CpG ODN 2006(也称为CpG ODN 7909)(SEQ:TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)寡核苷酸。在一些实施方案中，所述RIG-I激动剂包含聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。可以结合抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。可以结合抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含佐剂CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C的任何组合。
示例性佐剂包括但不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)、或脂多糖(LPS)。在一些实施方案中，所述佐剂是CpGODN、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。在具体实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述佐剂是CpGODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN、或C类CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂包含来自以下的组的选择：CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpGODN2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpGODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂是CpG ODN 1826(SEQ:TCCATGACGTTCCTGACGTT)或CpG ODN 2006(也称为CpG ODN 7909)(SEQ:TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)寡核苷酸。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN 7909。在一些实施方案中，所述RIG-I激动剂包含聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。可以结合抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。可以结合抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含佐剂CpG ODN、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂的任何组合。
在本文描述的任何实施方案中，除非另有指示，否则佐剂可以指(a)与扰动的输入免疫细胞一起孵育和通过的佐剂，(b)与PBMC一起孵育以调理PBMC的佐剂，(c)与经修饰的免疫细胞一起共给予个体的佐剂。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，将稳定剂与HPV抗原和/或佐剂复合。在一些实施方案中，稳定剂增加HPV抗原和/或佐剂的溶解度和/或溶液半衰期。在一些实施方案中，多种经修饰的免疫细胞具有比不包含稳定剂的相应经修饰的免疫细胞更大的活力。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在进一步的实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在进一步的实施方案中，所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施方案中，所述药剂包含MSA。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应多种经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂在冷冻-解冻循环后增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是冷冻保存剂和/或低温保存剂。在一些实施方案中，在任何冷冻-解冻循环之前，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，冷冻保存剂和低温保存剂均不会引起包含所述药剂的经修饰的免疫细胞中多于10％或20％的细胞死亡。在一些实施方案中，在高达1、2、3、4、5个冷冻-解冻循环之后，至少约70％、约80％、或约90％的经修饰的免疫细胞是有活力的。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、钠金属离子、钾金属离子、镁金属离子、氯化物、乙酸盐、葡糖酸盐、蔗糖、氢氧化钾或氢氧化钠。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、
Figure BDA0002763172940000551
海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、
Figure BDA0002763172940000552
DMSO、
Figure BDA0002763172940000553
CS2、
Figure BDA0002763172940000554
CS5、
Figure BDA0002763172940000555
CS10、
Figure BDA0002763172940000556
CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、
Figure BDA0002763172940000557
在一些实施方案中，将所述经修饰的免疫细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。在进一步的实施方案中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。在一些实施方案中，所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞不是B细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞不是B细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞、或自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。同种异体T细胞中的MHC表达可以导致响应于其给予而在个体中产生的先天性免疫应答，并且将导致此类T细胞的半衰期缩短。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。在具体实施方案中，所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHCI类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。在具体实施方案中，所述进一步修饰包括使用mRNA、质粒DNA、或cDNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞、或自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、或γδ-T细胞。
免疫细胞和其他细胞可以用作自体或同种异体细胞的来源。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞对所述个体而言是同种异体的。在其他实施方案中，所述经修饰的免疫细胞对所述个体而言是自体的。在一些实施方案中，将待治疗的个体预先调理以调节炎症。
佐剂可以用于进一步增强针对HPV抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述治疗方法进一步包括向所述受试者给予佐剂。示例性佐剂包括但不限于IFN-α、CpG ODN、STING激动剂、RIG-I激动剂和聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂是IFN-α或CpG ODN。在一些实施方案中，所述佐剂是IFN-α、CpG ODN、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。在一些实施方案中，所述佐剂包含IFN-α、CpG ODN、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C的任何组合。
在一些实施方案中，所述方法包括多次给予所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述方法包括约3至约9次给予所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述方法包括约以下中的任何一个的次数给予所述经修饰的免疫细胞：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，所述方法包括根据需要连续给予所述经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，在两次相继给予经修饰的免疫细胞之间的时间间隔在约1天与约30天之间。在一些实施方案中，在两次相继给予经修饰的免疫细胞之间的时间间隔是约21天。在一些实施方案中，在两次相继给予经修饰的免疫细胞之间的时间时间间隔是约以下中的任何一个：1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或150天。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞是多种经修饰的PBMC。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞是经调理的多种经修饰的PBMC。
在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。
在一些实施方案中，在给予所述佐剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。例如，在给予所述佐剂之前从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予所述佐剂之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予所述佐剂之前在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。
在一些实施方案中，在给予所述佐剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。例如，在给予所述佐剂之后约1小时至约1周给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予所述佐剂之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予所述佐剂之后在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。
免疫检查点是免疫系统的调节剂，并且保持检查免疫应答。可以使用免疫检查点抑制剂来促进免疫应答的增强。在一些实施方案中，将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与免疫检查点抑制剂的给予组合。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。
在一些实施方案中，在给予所述免疫检查点抑制剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。在一些实施方案中，在给予所述免疫检查点抑制剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。例如，在给予所述免疫检查点抑制剂之前从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予免疫检查点抑制剂之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予免疫检查点抑制剂之前在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。
在一些实施方案中，在给予所述免疫检查点抑制剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。例如，在给予所述免疫检查点抑制剂之后从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予免疫检查点抑制剂之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予所述免疫检查点抑制剂之后在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括多次给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物和/或多次给予检查点抑制剂。例如，在一些实施方案中，所述方法包括两次给予、三次给予、四种给予、五次给予、六次给予、七次给予、八次给予、九次给予、十次给予、十一次给予、十二次给予、十三次给予、十四次给予或十五次给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物和/或检查点抑制剂。例如，在一些实施方案中，所述方法包括少于五次给予、少于十次给予、少于十五次给予、少于二十次给予、少于二十五次给予、少于三十次给予、少于五十次给予、少于七十次-五次给予、少于一百次、或少于两百次给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物和/或检查点抑制剂。
示例性免疫检查点抑制剂靶向但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是以下中的一种或多种：与PD-1结合的抗体、与PD-L1结合的抗体、与CTLA-4结合的抗体、与LAG3结合的抗体、或与TIM-3结合的抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)、或片段抗原结合(Fab)。在进一步的实施方案中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3中的一种或多种的一种或多种化学化合物。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3或TIM-3中的一种或多种的一种或多种肽。
其他示例性免疫检查点抑制剂靶向但不限于TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是以下中的一种或多种：与TIGIT结合的抗体、与VISTA结合的抗体、与TIM1结合的抗体、与B7-H4(VTCN1)结合的抗体或与BTLA结合的抗体。在进一步的实施方案中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)、或片段抗原结合(Fab)。在进一步的实施方案中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种的一种或多种化学化合物。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合至和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种的一种或多种肽。
可以将化学疗法或放射疗法与本文描述的任何一种经修饰的免疫细胞组合使用以实现针对癌症(例如，HPV相关癌症)的累加或协同作用。在一些实施方案中，将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与化学疗法的给予组合。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。
在一些实施方案中，在给予化学疗法之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予化学疗法之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在给予所述化学疗法之前从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予所述化学疗法之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予所述化学疗法之前在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。
在一些实施方案中，在给予化学疗法之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在给予所述化学疗法之后约1小时至约1周给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予所述化学疗法之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予所述化学疗法之后在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括多次给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物和/或多次给予化学疗法。例如，在一些实施方案中，所述方法包括两次给予、三次给予、四种给予、五次给予、六次给予、七次给予、八次给予、九次给予、十次给予、十一次给予、十二次给予、十三次给予、十四次给予或十五次给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物和/或化学疗法。例如，在一些实施方案中，所述方法包括少于五次给予、少于十次给予、少于十五次给予、少于二十次给予、少于二十五次给予、少于三十次给予、少于五十次给予、少于七十次-五次给予、少于一百次、或少于两百次给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物和/或化学疗法。
示例性化学疗法可以是细胞周期依赖性的或不依赖细胞周期的。在一些实施方案中，所述化学疗法包含一种或多种化学治疗剂。在一些实施方案中，化学治疗剂可以靶向癌症的细胞分裂、DNA或代谢中的一种或多种。在一些实施方案中，化学治疗剂是基于铂的药剂，诸如但不限于顺铂、奥沙利铂或卡铂。在一些实施方案中，化学治疗剂是紫杉烷(诸如多西他赛或紫杉醇)。在一些实施方案中，化学治疗剂是5-氟尿嘧啶、阿霉素、或伊立替康。在一些实施方案中，化学治疗剂是以下的一种或多种：烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂或有丝分裂抑制剂。在一些实施方案中，化学疗法包含顺铂。在一些实施方案中，可以将一种或多种化学疗法或免疫检查点抑制剂与本文描述的任何一种经修饰的免疫细胞组合以治疗或预防HPV相关疾病。
可以将放射疗法与本文描述的任何一种经修饰的T细胞组合使用以实现针对癌症(例如，HPV相关癌症)的累加或协同作用。在一些实施方案中，将包含所述经修饰的T细胞的组合物的给予与放射疗法的给予组合。在一些实施方案中，同时给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和所述放射疗法。在一些实施方案中，依序给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和所述放射疗法。在一些实施方案中，将包含所述经修饰的T细胞的组合物的给予与放射疗法的给予组合，与化学疗法组合，和/或与免疫检查点抑制剂组合。
在一些实施方案中，在给予放射疗法之前给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予放射疗法之后给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在给予放射疗法之前从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予放射疗法之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予放射疗法之前在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。
在一些实施方案中，在给予放射疗法之后给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在给予放射疗法之后从约1小时至约1周给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，在给予放射疗法之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天、或约7天给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。在一些实施方案中，在给予放射疗法之后在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间给予包含所述经修饰的T细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括多次给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和/或多次给予放射疗法。例如，在一些实施方案中，所述方法包括两次给予、三次给予、四种给予、五次给予、六次给予、七次给予、八次给予、九次给予、十次给予、十一次给予、十二次给予、十三次给予、十四次给予或十五次给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和/或所述放射疗法。例如，在一些实施方案中，所述方法包括少于五次给予、少于十次给予、少于十五次给予、少于二十次给予、少于二十五次给予、少于三十次给予、少于五十次给予、少于七十次-五次给予、少于一百次、或少于两百次给予包含所述经修饰的T细胞的组合物和/或所述放射疗法。
当将HPV抗原在MHC上加工并且呈递给免疫细胞时，可以触发或增强针对呈递的HPV表位的免疫应答。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。在一些实施方案中，所述免疫应答增强。在进一步的实施方案中，针对所述HPV抗原的免疫应答增强。在一些实施方案中，向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。在一些实施方案中，向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
在一些实施方案中，所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述有效量的所述组合物包含约1×106、约1×107、约1×108、约1×109、约1×1010、约1×1011、或约1×1012中的任何一个的经修饰的免疫细胞。在一些实施方案中，所述有效量的所述组合物包含在约1×106至约1×107之间、在约1×107至约1×108之间、在约1×108至约1×109之间、在约1×109至约1×1010之间、在约1×1010至约1×1011之间、或在约1×1011至约1×1012之间中的任何一个的经修饰的免疫细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括多次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。例如，在一些实施方案中，所述方法包括两次给予、三次给予、四种给予、五次给予、六次给予、七次给予、八次给予、九次给予、十次给予、十一次给予、十二次给予、十三次给予、十四次给予或十五次给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，所述方法包括少于五次给予、少于十次给予、少于十五次给予、少于二十次给予、少于二十五次给予、少于三十次给予、少于五十次给予、少于七十次-五次给予、少于一百次、或少于两百次给予包含所述经修饰的免疫细胞的组合物。例如，在一些实施方案中，所述方法包括第一次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物，然后第二次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。也可以改变给予时间以实现希望的结果。在一些实施方案中，向个体第一次给予组合物在第二次给予组合物之前进行。在一些实施方案中，在引入第二次给予之前多于以下中的任何一个向个体引入第一次给予：约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约18个月、或约24个月。
在一些实施方案中，所述方法包括多次给予经修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述方法包括约2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于约10次中的任何一个的给予。在一些实施方案中，在两次相继给予经修饰的T细胞之间的时间间隔在约1天与约1个月之间。在一些实施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每两周或每月给予。在一些实施方案中，相继给予为给予高达一年或更久。
在某些方面，包含经修饰的细胞的组合物可以用于治疗、预防HPV相关疾病和/或调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答。在一些实施方案中，所述HPV相关疾病是HPV相关癌症。在一些实施方案中，所述HPV相关癌症是子宫颈疾病、肛门疾病、口咽疾病、阴道疾病、外阴疾病、阴茎疾病、皮肤疾病或头颈疾病。在一些实施方案中，所述HPV相关疾病是HPV相关感染性疾病。其他HPV相关疾病可以包括寻常疣、足底疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头瘤、疣状囊肿和喉乳头瘤病。
在一些方面，本公开文本涉及经修饰的免疫细胞用于治疗HPV相关疾病的用途，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂。在一些方面，本公开文本涉及经修饰的免疫细胞用于治疗HPV相关疾病的用途，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，使得当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在一些方面，本公开文本涉及一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其用于制造用于治疗HPV相关疾病的药剂，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂。在一些方面，本公开文本涉及一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其用于制造用于治疗HPV相关疾病的药剂，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，使得当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在一些方面，本公开文本涉及一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其用于医学治疗方法，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂。在一些方面，本公开文本涉及一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其用于医学治疗方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，使得当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在一些方面，本公开文本涉及一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其用于治疗癌症、感染性疾病或病毒相关疾病的方法，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂。在一些方面，本公开文本涉及一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其用于治疗HPV相关疾病，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，使得当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在一些方面，本公开文本涉及一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，其包括向所述个体给予与HPV抗原相关联的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞通过包括以下步骤的方法制备：a)将输入细胞与所述HPV抗原和/或佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原与所述输入细胞的细胞表面关联；从而产生与所述抗原相关联的经修饰的免疫细胞。
在一些实施方案中，本发明的经修饰的免疫细胞不诱导个体的耐受性。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞不阻抑个体的免疫应答。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞不包含致耐受性因子。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞的给予不与致耐受性因子组合。在一些实施方案中，在给予致耐受性因子之前、同时或之后给予所述经修饰的免疫细胞。
组合物
在某些方面，本发明提供了一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含细胞内HPV抗原和细胞内CpG ODN。在其他方面，本公开文本涉及一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。在进一步的实施方案中，当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。在一些实施方案中，所述组合物进一步在细胞内包含佐剂。
在一些实施方案中，所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液或胞内体中。在一些实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。在进一步的实施方案中，所述抗原和/或佐剂存在于细胞的隔室中，所述隔室包括内质网(ER)、高尔基体、溶酶体、外泌体、细胞表面或细胞膜。在一些实施方案中，所述抗原和所述佐剂在同一隔室中。在一些实施方案中，所述抗原和所述佐剂彼此在不同的隔室中。例如，在一些实施方案中，所述抗原存在于细胞质液中，而所述佐剂存在于内体中。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的外部进一步包含HPV抗原和/或佐剂。
在一些实施方案中，所述抗原是多肽抗原。在一些实施方案中，所述抗原是经修饰的抗原。例如，抗原可以与治疗剂或靶向肽融合。在一些实施方案中，所述经修饰的抗原与多肽融合。在一些实施方案中，所述抗原是经脂质修饰的。在一些实施方案中，所述抗原是用多糖或碳水化合物部分修饰的。在一些实施方案中，所述抗原与病毒相关。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原。示例性病毒抗原包括HPV抗原。在进一步的实施方案中，所述抗原是HPV抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原由来自以下的组的选择组成：HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、和82。HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、和82是引起癌症的高风险类型，而HPV-26、53、和66是引起癌症的“可能高风险类型”。在一些实施方案中，所述抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。HPV E6和E7基因是病毒的癌基因，并且这些基因的表达是恶性转化所需的。E6和E7蛋白靶向细胞周期的许多负调节因子，分别主要是p105Rb和p53，并且因此干扰细胞周期调节。在进一步的实施方案中，所述HPV抗原是HPVE6抗原或HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含HPV E6抗原和HPVE7抗原。在一些实施方案中，所述HPV抗原是包含免疫原性表位的多肽，所述抗原性表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。在一些实施方案中，所述HPV抗原是侧接来自HPV E6多肽的序列的HPV E7表位。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸。在一些实施方案中，所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
当添加到免疫原性剂中时，佐剂在暴露于混合物后非特异性地增强或加强受体宿主中对药剂的免疫应答。因此，佐剂可以用于加强对针对抗原的免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的引发。在一些实施方案中，将扰动的细胞与HPV抗原和佐剂两者一起孵育。示例性的细胞内佐剂包括但不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、视黄酸诱导基因I(RIG-I)激动剂和聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。在具体实施方案中，所述佐剂是CpG ODN多核苷酸。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂包含来自以下的组的选择：CpG ODN 1585、CpG ODN2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODND-SL03(InvivoGen)。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂是CpG ODN 1826(SEQ:TCCATGACGTTCCTGACGTT)或CpG ODN 2006(也称为CpG ODN 7909)(SE Q:TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)寡核苷酸。可以结合抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含佐剂CpGODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂和聚I:C的任何组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.01μM与约10mM之间的所述佐剂。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度为以下中的任何一个的佐剂：小于约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度大于约10mM的佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度小于以下中的任何一个的佐剂：约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度大于以下中的任何一个的佐剂：约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度为以下中的任何一个的佐剂：在约0.1μM与约1μm之间、在约1μM与约10μm之间、在约10μM与约100μm之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.01μM与约10mM之间的所述HPV抗原。例如，在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度为以下中的任何一个的佐剂：小于约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度大于约10mM的佐剂。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度小于以下中的任何一个的HPV抗原：约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度大于以下中的任何一个的佐剂：约10mM。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞包含浓度为以下中的任何一个的HPV抗原：在约0.1μM与约1μm之间、在约1μM与约10μm之间、在约10μM与约100μm之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。
在一些实施方案中，所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。例如，在一些实施方案中，所述HPV抗原与所述佐剂的比率是以下中的任何一个：约10000:1、约1000:1、约200:1、约100:1约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000、或约1:10000。在一些实施方案中，所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1与约1000:1之间、在约1000:1与约100:1之间、在约100:1与约10:1之间、在约10:1与约1:1之间、在约1:1与约1:10之间、在约1:10与约1:100之间、在约1:100与约1:1000之间、在约1:1000与约1:10000之间。
在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，将稳定剂与HPV抗原和/或佐剂复合。在一些实施方案中，稳定剂增加HPV抗原和/或佐剂的溶解度和/或溶液半衰期。在一些实施方案中，多种经修饰的免疫细胞具有比不包含稳定剂的相应经修饰的免疫细胞更大的活力。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在进一步的实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在进一步的实施方案中，所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施方案中，所述药剂包含MSA。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应多种经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂在冷冻-解冻循环后增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。在一些实施方案中，所述药剂是冷冻保存剂和/或低温保存剂。在一些实施方案中，在任何冷冻-解冻循环之前，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，冷冻保存剂或低温保存剂均不会引起包含所述药剂的经修饰的免疫细胞中不多于10％或20％的细胞死亡。在一些实施方案中，在高达1、2、3、4、5个冷冻-解冻循环之后，至少约70％、约80％、或约90％的经修饰的免疫细胞是有活力的。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。在一些实施方案中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、钠金属离子、钾金属离子、镁金属离子、氯化物、乙酸盐、葡糖酸盐、蔗糖、氢氧化钾或氢氧化钠。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、
Figure BDA0002763172940000731
海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、
Figure BDA0002763172940000732
DMSO、
Figure BDA0002763172940000733
CS2、
Figure BDA0002763172940000734
CS5、
Figure BDA0002763172940000735
CS10、
Figure BDA0002763172940000736
CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、
Figure BDA0002763172940000737
在一些实施方案中，将所述经修饰的免疫细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。在进一步的实施方案中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。在一些实施方案中，所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞不是B细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞不是B细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞、或自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+T细胞、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。同种异体T细胞中的MHC表达可以导致响应于其给予而在个体中产生的先天性免疫应答，并且将导致此类T细胞的半衰期缩短。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。在具体实施方案中，所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHCI类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。在具体实施方案中，所述进一步修饰包括使用mRNA、质粒DNA、或cDNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。在一些实施方案中，与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。在一些实施方案中，与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期增加。在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞、或自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、或γδ-T细胞。
免疫细胞和其他细胞可以用作自体或同种异体细胞的来源。在一些实施方案中，所述经修饰的免疫细胞对所述个体而言是同种异体的。在其他实施方案中，所述经修饰的免疫细胞对所述个体而言是自体的。在一些实施方案中，将待治疗的个体预调理以具有降低的炎症或经调节的免疫应答。
PBMC组合物
如本文所用，可以通过白细胞单采术从获自个体的全血中分离出PBMC。还提供了PBMC组合物，其通过将来自同一个体或不同个体的不同PBMC集合混合来重构。在其他例子中，也可以通过将不同的细胞群体混合到具有产生的特征曲线(profile)的混合细胞组合物中来重构PBMC。在一些实施方案中，用于重构PBMC的细胞群体是混合细胞群体(诸如T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞中的一种或多种的混合物)。在一些实施方案中，用于重构PBMC的细胞群体是纯化的细胞群体(诸如纯化的T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞)。在另外的例子中，用于重构PBMC组合物的不同细胞群可以从同一个体分离(例如自体的)或从不同个体分离(例如同种异体和/或异源的)。
因此，在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，所述多种输入PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述多种输入PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞。在一些实施方案中，所述多种输入PBMC包含CD3+ T细胞、CD20+B细胞、CD14+单核细胞、CD56+NK细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述多种输入PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且所述多种输入PBMC中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率基本上与全血中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率相同。在一些实施方案中，所述多种输入PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且所述多种输入PBMC中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率基本上与来自全血的白细胞单采术产物中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率相同。在一些实施方案中，所述多种输入PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且所述多种输入PBMC中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率与全血中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率相差不大于以下中任何一个：1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、或50％。在一些实施方案中，所述多种输入PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且所述多种输入PBMC中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率与全血中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率相差不大于以下中任何一个：10％。在一些实施方案中，所述多种输入PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且所述多种输入PBMC中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率与来自全血的白细胞单采术产物中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率相差不大于以下中任何一个：1％、2％、5％、10％15％、20％、25％、30％、40％、或50％。在一些实施方案中，所述多种输入PBMC包含T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且所述多种输入PBMC中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率与来自全血的白细胞单采术产物中的T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与总PBMC数量的比率相差不大于以下中任何一个：10％。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，约25％至约70％的经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施方案中，约2.5％至约14％的经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施方案中，约3.5％至约35％的经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，约4％至约25％的经修饰的PBMC是NK细胞。在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，至少约90％至约99％的输入PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。在一些实施方案中，约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约99％中的至少任何一个的输入PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。在一些实施方案中，至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％中的任何一个的输入PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。在一些实施方案中，至少约90％的输入PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。在一些实施方案中，所述输入PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，至少约90％至约99％的经修饰的PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。在一些实施方案中，约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约99％中的至少任何一个的经修饰的PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。在一些实施方案中，至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％中的任何一个的经修饰的PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。在一些实施方案中，至少约90％的经修饰的PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。在一些实施方案中，所述经修饰的PBMC由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、或75％中的任何一个的输入PBMC是T细胞。在一些实施方案中，至少约25％的输入PBMC是T细胞。在一些实施方案中，至少约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、7.5％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、或30％中的任何一个的输入PBMC是B细胞。在一些实施方案中，至少约2.5％的输入PBMC是B细胞。在一些实施方案中，至少约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、7.5％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、或30％中的任何一个的输入PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，至少约3.5％的输入PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％或40％中的任何一个的输入PBMC是单核细胞。在一些实施方案中，至少约4％的输入PBMC是单核细胞。在一些实施方案中，至少约25％的输入PBMC是T细胞；至少约2.5％的输入PBMC是B细胞；至少约3.5％的输入PBMC是NK细胞；并且至少约4％的输入PBMC是单核细胞。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％中的任何一个的经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施方案中，至少约20％的经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施方案中，至少约0.25％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、7.5％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％或30％中的任何一个的经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施方案中，至少约2％的经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施方案中，至少约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、7.5％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、或30％中的任何一个的经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，至少约3％的经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％或40％中的任何一个的经修饰的PBMC是单核细胞。在一些实施方案中，至少约3％的经修饰的PBMC是单核细胞。在一些实施方案中，至少约20％的经修饰的PBMC是T细胞；至少约2％的经修饰的PBMC是B细胞；至少约3％的经修饰的PBMC是NK细胞；并且至少约3％的经修饰的PBMC是单核细胞。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，不多于约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％中的任何一个的输入PBMC是T细胞。在一些实施方案中，不多于约70％的输入PBMC是T细胞。在一些实施方案中，不多于约5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、25％、30％、35％、40％、或50％中的任何一个的输入PBMC是B细胞。在一些实施方案中，不多于约14％的输入PBMC是B细胞。在一些实施方案中，不多于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或60％中的任何一个的输入PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，不多于约35％的输入PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，不多于约5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、25％、30％、35％、40％、或50％中的任何一个的输入PBMC是单核细胞。在一些实施方案中，不多于约4％的输入PBMC是单核细胞。在一些实施方案中，不多于约25％的输入PBMC是T细胞；不多于约2.5％的输入PBMC是B细胞；不多于约3.5％的输入PBMC是NK细胞；并且不多于约4％的输入PBMC是单核细胞。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，不多于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％中的任何一个的经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施方案中，不多于约20％的经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施方案中，不多于约0.25％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、7.5％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％或30％中的任何一个的经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施方案中，不多于约2％的经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施方案中，不多于约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、7.5％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、或30％中的任何一个的经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，不多于约3％的经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，不多于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％或40％中的任何一个的经修饰的PBMC是单核细胞。在一些实施方案中，不多于约3％的经修饰的PBMC是单核细胞。在一些实施方案中，不多于约20％的经修饰的PBMC是T细胞；不多于约2％的经修饰的PBMC是B细胞；不多于约3％的经修饰的PBMC是NK细胞；并且不多于约3％的经修饰的PBMC是单核细胞。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，约20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、或70％至75％中的任何一个的经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施方案中，约25％至约70％的经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施方案中，约1％至2.5％、2.5％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至20％或20％至25％中的任何一个的经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施方案中，约2.5％至约14％的经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施方案中，约1％至2％、2％至3.5％、3.5％至5％、5％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至20％或20％至25％中的任何一个的经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施方案中，约3.5％至约35％的经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施方案中，约2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、或35％至40％中的任何一个的经修饰的PBMC是单核细胞。在一些实施方案中，约4％至约25％的经修饰的PBMC是单核细胞。
如本文所使用的，PBMC也可以在操纵单核血细胞(诸如淋巴细胞和单核细胞)的混合细胞群体的组成之后产生。在一些情况下，在减少(诸如消耗)单核血细胞的混合细胞群体中的某些子群体(诸如B细胞)之后产生输入PBMC。可以对个体中单核血细胞的混合细胞群体中的组成进行操纵，以使所述细胞群更类似于来自同一个体中的全血的白细胞单采术产物。在其他例子中，还可以操纵单核血细胞(例如，小鼠脾细胞)的混合细胞群体中的组成，以使所述细胞群体更类似于从来自人全血的白细胞单采术产物中分离的人PBMC。
在一些实施方案中，构建介导的递送不以显著方式差异性地调节PBMC中的不同子群体(诸如B细胞、T细胞、NK细胞或单核细胞)的活力。在一些实施方案中，调理过程不以显著的方式差异性地调节PBMC中的不同子群体的活力。在一些实施方案中，进一步添加药剂(包括但不限于以下中的任何一种：生物保存剂或增强PBMC的功能和/或活力的药剂)不以显著的方式差异性地调节PBMC中的各种子群体的活力。因此，在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，所述多种经修饰的PBMC中T细胞的百分比和所述多种输入PBMC中T细胞的百分比相差按数量计不大于约10％。在一些实施方案中，所述多种经修饰的PBMC中T细胞的百分比和所述多种输入PBMC中T细胞的百分比相差按数量计不大于约5％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％中的任何一个。在一些实施方案中，所述多种经修饰的PBMC中B细胞的百分比和所述多种输入PBMC中B细胞的百分比相差按数量计不大于约10％。在一些实施方案中，所述多种经修饰的PBMC中B细胞的百分比和所述多种输入PBMC中B细胞的百分比相差按数量计不大于约5％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％中的任何一个。在一些实施方案中，所述多种经修饰的PBMC中NK细胞的百分比和所述多种输入PBMC中NK细胞的百分比相差按数量计不大于约10％。在一些实施方案中，所述多种经修饰的PBMC中NK细胞的百分比和所述多种输入PBMC中NK细胞的百分比相差按数量计不大于约5％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％中的任何一个。在一些实施方案中，所述多种经修饰的PBMC中单核细胞的百分比和所述多种输入PBMC中单核细胞的百分比相差按数量计不大于约10％。在一些实施方案中，所述多种经修饰的PBMC中单核细胞的百分比和所述多种输入PBMC中单核细胞的百分比相差按数量计不大于约5％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％中的任何一个。
PBMC的调理
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，将所述多种经修饰的PBMC调理。在进一步的实施方案中，使所述多种经修饰的PBMC成熟。在一些实施方案中，在缩窄部介导的递送之后调理所述多种PBMC。因此，在一些实施方案中，制备多种经修饰的PBMC的方法进一步包括将包含抗原和/或佐剂的多种经修饰的PBMC与第二佐剂一起孵育足够的时间，以调理包含所述抗原的所述经修饰的PBMC，从而产生经调理的包含抗原和/或佐剂的多中经修饰的PBMC。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在与所述佐剂一起孵育以调理所述经修饰的PBMC之前，从细胞悬浮液中分离出包含抗原和/或佐剂的多种经修饰的PBMC。
在一些实施方案中，与经修饰的PBMC一起孵育的抗原的浓度在约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施方案中，与经修饰的PBMC一起孵育的抗原的浓度是以下中的任何一个：小于约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，与经修饰的PBMC一起孵育的抗原的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，与经修饰的PBMC一起孵育的抗原的浓度是以下中的任何一个：在约0.01μM与约0.1μm之间、在约0.1μM与约1μm之间、在约1μM与约10μm之间、在约10μM与约100μm之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，与经修饰的PBMC一起孵育的抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与经修饰的PBMC一起孵育的抗原的浓度在约0.1μM与约10μM之间。在一些实施方案中，与经修饰的PBMC一起孵育的抗原的浓度是1μm。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，将多种经修饰的PBMC与佐剂一起孵育约1至约24小时以调理所述经修饰的PBMC。在一些实施方案中，将多种经修饰的PBMC与佐剂一起孵育约2至约10小时以调理所述经修饰的PBMC。在一些实施方案中，将多种经修饰的PBMC与佐剂一起孵育约3至约6小时以调理所述经修饰的PBMC。在一些实施方案中，将多种经修饰的PBMC与佐剂一起孵育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时、或24小时中的任何一个以调理所述经修饰的PBMC。在一些实施方案中，将多种经修饰的PBMC与佐剂一起孵育约4小时以调理所述经修饰的PBMC。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，在缩窄部介导的递送之前调理所述经修饰的PBMC。因此，在一些实施方案中，制备多种经修饰的PBMC的方法进一步包括将多种输入PBMC与佐剂一起孵育足够的时间以使调理所述输入PBMC，从而产生经调理的多种输入PBMC。在一些实施方案中，提供了包含抗原的经调理的多种经修饰的PBMC，其通过包括以下步骤的方法制备：a)将多种输入PBMC与佐剂一起孵育足够的时间以调理所述输入PBMC，从而产生经调理的多种输入PBMC；b)使包含经调理的多种输入PBMC的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入PBMC的直径的函数，从而引起所述输入PBMC的扰动足够大以使所述抗原通过以形成经调理的多种扰动的输入PBMC；以及c)将经调理的多种扰动的输入PBMC与抗原一起孵育足够的时间，以使所述抗原进入扰动的输入PBMC，从而产生包含所述抗原的经调理的多种经修饰的PBMC。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使经调理的多种输入PBMC通过细胞变形缩窄部之前，将经调理的多种输入PBMC与调理佐剂分离。
在一些实施方案中，与输入PBMC一起孵育的抗原的浓度在约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施方案中，与输入PBMC一起孵育的抗原的浓度是以下中的任何一个：小于约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，与输入PBMC一起孵育的抗原的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，与输入PBMC一起孵育的抗原的浓度是以下中的任何一个：在约0.01μM与约0.1μm之间、在约0.1μM与约1μm之间、在约1μM与约10μm之间、在约10μM与约100μm之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，与输入PBMC一起孵育的抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与输入PBMC一起孵育的抗原的浓度在约0.1μM与约10μM之间。在一些实施方案中，与输入PBMC一起孵育的抗原的浓度是1μm。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，将多种输入PBMC与佐剂一起孵育约1至约24小时以调理所述输入PBMC。在一些实施方案中，将多种输入PBMC与佐剂一起孵育约2至约10小时以调理所述输入PBMC。在一些实施方案中，将多种输入PBMC与佐剂一起孵育约3至约6小时以调理所述输入PBMC。在一些实施方案中，将多种输入PBMC与佐剂一起孵育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时、或24小时中的任何一个以调理所述输入PBMC。在一些实施方案中，将多种输入PBMC与佐剂一起孵育约4小时以调理所述输入PBMC。
在一些实施方案中，提供了包含抗原的经调理的多种PBMC，其通过以下方式制备：将包含抗原的多种PBMC与佐剂一起孵育足够的时间以调理所述PBMC，从而产生包含抗原的经调理的多种PBMC。在一些实施方案中，提供了包含抗原的经调理的多种PBMC，其通过以下方式制备：将多种PBMC与佐剂一起孵育足够的时间以调理所述PBMC，然后将抗原引入PBMC，从而产生包含抗原的经调理的多种PBMC。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，与PBMC一起孵育的抗原的浓度在约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施方案中，与PBMC一起孵育的抗原的浓度是以下中的任何一个：小于约0.01μm、约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，与PBMC一起孵育的抗原的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，与PBMC一起孵育的抗原的浓度是以下中的任何一个：在约0.01μM与约0.1μm之间、在约0.1μM与约1μm之间、在约1μM与约10μm之间、在约10μM与约100μm之间、在约100μM与约1mM之间、或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，与PBMC一起孵育的抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与PBMC一起孵育的抗原的浓度在约0.1μM与约10μM之间。在一些实施方案中，与PBMC一起孵育的抗原的浓度是1μm。
在根据本文描述的任何一种方法或组合物的一些实施方案中，其中所述免疫细胞是多种PBMC，将多种PBMC与佐剂一起孵育约1至约24小时以调理所述PBMC。在一些实施方案中，将多种PBMC与佐剂一起孵育约2至约10小时以调理所述PBMC。在一些实施方案中，将多种PBMC与佐剂一起孵育约3至约6小时以调理所述PBMC。在一些实施方案中，将多种PBMC与佐剂一起孵育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时、或24小时中的任何一个以调理所述PBMC。在一些实施方案中，将多种PBMC与佐剂一起孵育约4小时以调理所述PBMC。
在一些实施方案中，与未经调理的多种经修饰的PBMC相比，在经调理的多种经修饰的PBMC中一种或多种共刺激分子被上调。在一些实施方案中，与未经调理的多种经修饰的PBMC中的细胞子群体相比，经调理的多种经修饰的PBMC中的细胞子群体中一种或多种共刺激分子被上调。在一些实施方案中，与未经调理的多种经修饰的PBMC中的B细胞相比，经调理的多种经修饰的PBMC的B细胞中一种或多种共刺激分子被上调。在一些实施方案中，所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施方案中，所述共刺激分子是CD86。在一些实施方案中，与未经调理的多种经修饰的PBMC中的B细胞相比，经调理的多种经修饰的PBMC的B细胞中CD80和/或CD86被上调约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍、或大于10倍。在一些实施方案中，与未经调理的多种经修饰的PBMC中的B细胞相比，经调理的多种经修饰的PBMC的B细胞中CD80和/或CD86被上调以下中的任何一个：约1.2倍至约1.5倍、约1.5倍至约1.8倍、约1.8倍至约2倍、约2倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约8倍、约8倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约50倍、约50倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约500倍、或大于约500倍。在一些实施方案中，与未经调理的多种经修饰的PBMC相比，经调理的多种经修饰的PBMC中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10、或TNF-α中的一种或多种的表达增加。在一些实施方案中，与未经调理的多种经修饰的PBMC中的细胞子群体相比，经调理的多种中的细胞子群体的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10、或TNF-α中的一种或多种的表达增加。在一些实施方案中，与未经调理的多种经修饰的PBMC相比，经调理的多种经修饰的PBMC中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10、或TNF-α中的一种或多种的表达增加约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍、或大于10倍。在一些实施方案中，与未经调理的多种经修饰的PBMC相比，经调理的多种经修饰的PBMC中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10、或TNF-α中的一种或多种的表达增加以下中的任何一个：约1.2倍至约1.5倍、约1.5倍至约1.8倍、约1.8倍至约2倍、约2倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约8倍、约8倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约50倍、约50倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约500倍、或大于约500倍。
应用
在一些方面，本发明提供了用于治疗和预防HPV相关疾病和/或调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞外包含佐剂。在一些实施方案中，从患者中分离出细胞，将其根据所公开的方法进行修饰，并且引入回患者内。例如，从患者中分离出免疫细胞群体，使其通过缩窄部以实现HPV抗原和佐剂的递送，并且然后重新输注到患者内以增强针对所述HPV抗原的治疗性免疫应答。在一些实施方案中，从患有HPV相关疾病的个体中分离出细胞，将其根据所公开的方法进行修饰，并且引入回所述个体内。例如，从患有HPV相关疾病的个体中分离出免疫细胞群体，使其通过缩窄部以实现HPV抗原和佐剂的递送，并且然后重新输注到患者内以诱导或增强所述个体的针对所述HPV抗原的免疫应答。
在一些实施方案中，待递送的HPV抗原和/或佐剂是纯化的。在一些实施方案中，所述化合物是按重量(干重)计至少约60％的目的化合物。在一些实施方案中，经纯化的化合物是至少约75％、90％或99％的目的化合物。在一些实施方案中，经纯化的化合物是至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％、或100％(w/w)的目的化合物。纯度通过任何已知的方法确定，所述包括但不限于柱色谱法、薄层色谱法、HPLC分析、NMR、质谱或SDS-PAGE。经纯化的DNA或RNA被定义为不含外源核酸、碳水化合物和脂质的DNA或RNA。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗患有HPV相关疾病的个体的方法，所述方法通过向所述个体中引入细胞来进行：所述细胞是经由通过缩窄部使得HPV抗原和佐剂进入所述细胞而经修饰的。在一些实施方案中，所述细胞是自体细胞。例如，从个体(例如，患者)中分离出免疫细胞，将其根据所公开的方法进行修饰，并且引入回所述个体中。在一些实施方案中，从个体中分离出免疫细胞，将其根据所公开的方法进行修饰，并且引入回同一个体中。在一些实施方案中，所述细胞是同种异体细胞。例如，从不同的个体中分离出细胞，将其根据所公开的方法进行修饰，并且引入到第一个体(例如患者)中。在一些实施方案中，从个体中分离出细胞，将其根据所公开的方法进行修饰，并且引入到不同的个体中。
以上描述的任何方法在体外、离体或体内进行。对于体内应用，所述装置可以植入血管内腔，例如动脉或静脉内的内嵌式支架。在一些实施方案中，所述方法用作床边系统的一部分，用于离体治疗患者细胞并且立即将所述细胞重新引入所述患者内。在一些实施方案中，所述方法可以在具有最低限度训练的技术人员的典型医院实验室中实施。在一些实施方案中，可以使用患者操作的治疗系统。
系统和试剂盒
在一些方面，本发明提供了一种用于本文公开的方法的系统，其包括缩窄部、免疫细胞悬浮液、HPV抗原或佐剂中的一种或多种。所述系统可以包括针对上文公开的方法描述的任何实施方案，包括用于提供细胞变形缩窄部的微流体通道或具有孔的表面、细胞悬浮液、细胞扰动、递送参数、化合物和/或应用等。在一些实施方案中，细胞变形缩窄部的尺寸被确定为用于递送至免疫细胞。在一些实施方案中，优化递送参数，诸如操作流速、细胞和化合物浓度、细胞在缩窄部中的速度、和细胞悬浮液的组成(例如，克分子渗透浓度、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)，以使化合物阻抑免疫应答或诱导耐受性的反应最大化。
还提供了用于治疗患有HPV相关疾病的个体的试剂盒或制品。在一些实施方案中，所述试剂盒包含经修饰的免疫细胞，所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含HPV抗原并且在细胞内包含佐剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于产生经修饰的免疫细胞的缩窄部、免疫细胞悬浮液、HPV抗原或佐剂中的一种或多种，以用于治疗患有HPV相关疾病的个体。在一些实施方案中，所述试剂盒包含在合适的包装中的本文描述的组合物(例如，微流体通道或含有孔的表面、细胞悬浮液、和/或化合物)。合适的包装材料是本领域已知的，并且包括例如小瓶(诸如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。可以进一步将这些制品灭菌和/或密封。
本发明还提供了包含本文描述的方法的组分的试剂盒，并且可以进一步包含用于执行所述方法以治疗患有HPV相关疾病的个体的说明书和/或用于将HPV抗原和佐剂引入免疫细胞的说明书。本文描述的试剂盒可以进一步包含其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器、和包装插页，所述包装插页具有用于执行本文描述的任何方法的说明书；例如用于治疗患有HPV相关疾病的个体的说明书或用于修饰免疫细胞以在细胞内含有HPV抗原并且在细胞内含有佐剂的说明书。
示例性实施方案
实施方案1.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内。
实施方案2.一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内。
实施方案3.一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内。
实施方案4.一种用于治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案5.一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案6.一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入细胞包含HPV抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案7.根据实施方案4至6中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
实施方案8.根据实施方案4-7中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至99％。
实施方案9.根据实施方案4-8中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
实施方案10.根据实施方案4-9中任一项所述的方法，其中所述缩窄部在通道中。
实施方案11.根据实施方案4-10中任一项所述的方法，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。
实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。
实施方案14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的外部进一步包含HPV抗原和/或佐剂。
实施方案15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案17.根据实施方案4-16中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的比率在约10000:1与约1:10000之间。
实施方案18.根据实施方案3或6所述的方法，其中所述免疫应答增强。
实施方案19.根据实施方案18所述的方法，其中对所述HPV抗原的免疫应答增强。
实施方案20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
实施方案21.根据实施方案20所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN。
实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpGODN 1826或CpG ODN 2006。
实施方案23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。
实施方案25.根据实施方案24所述的方法，其中所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。
实施方案26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
实施方案27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。
实施方案28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原源自细胞裂解物。
实施方案29.根据实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是HPV-16或HPV-18抗原。
实施方案30.根据实施方案29所述的方法，其中所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。
实施方案31.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。
实施方案32.根据实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV E6抗原和HPV E7抗原。
实施方案33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是包含抗原性表位的多肽，所述抗原性表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。
实施方案34.根据实施方案33所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案35.根据实施方案34所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案36.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
实施方案37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
实施方案38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
实施方案39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。
实施方案40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
实施方案41.根据实施方案1-40中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。
实施方案42.根据实施方案41所述的方法，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
实施方案43.根据实施方案41所述的方法，其中所述药剂是白蛋白。
实施方案44.根据实施方案43所述的方法，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
实施方案45.根据实施方案41所述的方法，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
实施方案46.根据实施方案41所述的方法，其中所述药剂包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
实施方案47.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其中将所述经修饰的免疫细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。
实施方案48.根据实施方案47所述的方法，其中所述共刺激分子是B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。
实施方案49.根据实施方案47或48所述的方法，其中所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
实施方案50.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。
实施方案51.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞不是B细胞。
实施方案52.根据实施方案1-50中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是B细胞。
实施方案53.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
实施方案54.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是混合细胞群体。
实施方案55.根据实施方案54所述的方法，其中所述免疫细胞是多种PBMC。
实施方案56.根据实施方案53所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
实施方案57.根据实施方案53所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
实施方案58.根据实施方案56或57所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案59.根据实施方案56或57所述的方法，其中所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案60.根据实施方案56或57所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案61.根据实施方案56或57所述的方法，其中所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案62.根据实施方案53和56-59中任一项所述的方法，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。
实施方案63.根据实施方案53和56-59中任一项所述的方法，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。
实施方案64.根据实施方案53和56-63中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。
实施方案65.根据实施方案53和56-63中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。
实施方案66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞对所述个体而言是同种异体的。
实施方案67.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞对所述个体而言是自体的。
实施方案68.根据实施方案1-67中任一项所述的方法，其中将所述个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
实施方案69.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中其进一步包括向所述受试者给予佐剂。
实施方案70.根据实施方案69所述的方法，其中所述佐剂是IFNα或CpG ODN。
实施方案71.根据实施方案69或70所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。
实施方案72.根据实施方案69或70所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。
实施方案73.根据实施方案72所述的方法，其中在给予所述佐剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案74.根据实施方案72所述的方法，其中在给予所述佐剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案75.根据实施方案1-74中任一项所述的方法，其中将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与免疫检查点抑制剂的给予组合。
实施方案76.根据实施方案75所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。
实施方案77.根据实施方案75所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。
实施方案78.根据实施方案77所述的方法，其中在给予所述免疫检查点抑制剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案79.根据实施方案77所述的方法，其中在给予所述免疫检查点抑制剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案80.根据实施方案75-79中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
实施方案81.根据实施方案1-80中任一项所述的方法，其中将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与化学疗法的给予组合。
实施方案82.根据实施方案81所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。
实施方案83.根据实施方案81所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。
实施方案84.根据实施方案83所述的方法，其中在给予所述化学疗法之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案85.根据实施方案83所述的方法，其中在给予所述化学疗法之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案86.根据实施方案81至85中任一项所述的方法，其中所述化学疗法包括基于铂的药剂。
实施方案87.根据实施方案81至86中任一项所述的方法，其中所述化学疗法包括顺铂。
实施方案88.根据实施方案1-87中任一项所述的方法，其中向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。
实施方案89.根据实施方案1-87中任一项所述的方法，其中向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
实施方案90.根据实施方案1-89中任一项所述的方法，其中所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。
实施方案91.根据实施方案1-90中任一项所述的方法，其中所述方法包括多次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案92.根据实施方案91所述的方法，其中所述方法包括第一次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物，然后第二次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案93.根据实施方案92所述的方法，其中所述第二次给予是在所述第一次给予后约一个月。
实施方案94.根据实施方案1-93中任一项所述的方法，其中所述HPV相关疾病是HPV相关癌症。
实施方案95.根据实施方案94所述的方法，其中所述HPV相关癌症是子宫颈癌、肛门癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。
实施方案96.根据实施方案1-95中任一项所述的方法，其中所述HPV相关疾病是HPV相关感染性疾病。
实施方案97.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸。
实施方案98.一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案99.一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案100.一种用于治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案101.一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案102.一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案103.根据实施方案100-102中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
实施方案104.根据实施方案100-103中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至99％。
实施方案105.根据实施方案100-104中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
实施方案106.根据实施方案100-105中任一项所述的方法，其中所述缩窄部在通道中。
实施方案107.根据实施方案100-106中任一项所述的方法，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
实施方案108.根据实施方案86-107中任一项所述的方法，其中其进一步包括向所述受试者给予佐剂。
实施方案109.根据实施方案108所述的方法，其中所述佐剂是IFNα或CpG ODN。
实施方案110.根据实施方案108或109所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。
实施方案111.根据实施方案108或109所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。
实施方案112.根据实施方案111所述的方法，其中在给予所述佐剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案113.根据实施方案111所述的方法，其中在给予所述佐剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案114.根据实施方案97-113中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞进一步包含佐剂。
实施方案115.根据实施方案100-113中任一项所述的方法，其中将步骤b的所述扰动的免疫细胞与所述HPV抗原和佐剂一起孵育。
实施方案116.根据实施方案114或115所述的方法，其中所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。
实施方案117.根据实施方案114-116中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。
实施方案118.根据实施方案114-117中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的外部进一步包含HPV抗原和/或佐剂。
实施方案119.根据实施方案115-118中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案120.根据实施方案115-119中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案121.根据实施方案115-120中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
实施方案122.根据实施方案99或102所述的方法，其中所述免疫应答增强。
实施方案123.根据实施方案122所述的方法，其中对所述HPV抗原的免疫应答增强。
实施方案124.根据实施方案114-123中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpGODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
实施方案125.根据实施方案124所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN。
实施方案126.根据实施方案125所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
实施方案127.根据实施方案114-126中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
实施方案128.根据实施方案97-127中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。
实施方案129.根据实施方案128所述的方法，其中所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。
实施方案130.根据实施方案97-129中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
实施方案131.根据实施方案97-130中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。
实施方案132.根据实施方案97-131中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。
实施方案133.根据实施方案97-132中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
实施方案134.根据实施方案97-133中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
实施方案135.根据实施方案114-134中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
实施方案136.根据实施方案97-135中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。
实施方案137.根据实施方案114-136中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1与约1:10000之间。
实施方案138.根据实施方案97-137中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。
实施方案139.根据实施方案138所述的方法，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
实施方案140.根据实施方案138所述的方法，其中所述药剂是白蛋白。
实施方案141.根据实施方案140所述的方法，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
实施方案142.根据实施方案138所述的方法，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
实施方案143.根据实施方案138所述的方法，其中所述药剂包含MSA。
实施方案144.根据实施方案97-143中任一项所述的经修饰的T细胞，其中将所述细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。
实施方案145.根据实施方案144所述的经修饰的T细胞，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。
实施方案146.根据实施方案144或145所述的经修饰的T细胞，其中所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
实施方案147.根据实施方案97-146中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。
实施方案148.根据实施方案97-147中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞不是B细胞。
实施方案149.根据实施方案97-148中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是B细胞。
实施方案150.根据实施方案97-148中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
实施方案151.根据实施方案97-148中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是混合细胞群体。
实施方案152.根据实施方案151所述的方法，其中所述免疫细胞是多种PBMC。
实施方案153根据实施方案150所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
实施方案154.根据实施方案150所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
实施方案155.根据实施方案153或154所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案156根据实施方案153或154所述的方法，其中所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案157.根据实施方案153或154所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案158.根据实施方案153或154所述的方法，其中所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案159.根据实施方案150和153-156中任一项所述的方法，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。
实施方案160.根据实施方案150和153-156中任一项所述的方法，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。
实施方案161.根据实施方案150和153-160中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。
实施方案162.根据实施方案150和153-160中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+T细胞、和γδ-T细胞。
实施方案163.根据实施方案97-162中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞对所述个体而言是同种异体的。
实施方案164.根据实施方案97-162中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞对所述个体而言是自体的。
实施方案165.根据实施方案97-164中任一项所述的方法，其中将所述个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
实施方案166.根据实施方案97-165中任一项所述的方法，其中将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与免疫检查点抑制剂的给予组合。
实施方案167.根据实施方案166所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。
实施方案168.根据实施方案166所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。
实施方案169.根据实施方案168所述的方法，其中在给予所述免疫检查点抑制剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案170.根据实施方案168所述的方法，其中在给予所述免疫检查点抑制剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案171.根据实施方案152-156中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
实施方案172.根据实施方案97-171中任一项所述的方法，其中将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与化学疗法的给予组合。
实施方案173.根据实施方案172所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。
实施方案174.根据实施方案172所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。
实施方案175.根据实施方案174所述的方法，其中在给予所述化学疗法之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案176.根据实施方案174所述的方法，其中在给予所述化学疗法之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案177.根据实施方案172至176中任一项所述的方法，其中所述化学疗法包括顺铂。
实施方案178.根据实施方案97-177中任一项所述的方法，其中向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。
实施方案179.根据实施方案97-177中任一项所述的方法，其中向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
实施方案180.根据实施方案97-179中任一项所述的方法，其中所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。
实施方案181.根据实施方案97-180中任一项所述的方法，其中所述方法包括多次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案182.根据实施方案181所述的方法，其中所述方法包括第一次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物，然后第二次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
实施方案183.根据实施方案182所述的方法，其中所述第二次给予是在所述第一次给予后约一个月。
实施方案184.根据实施方案97-183中任一项所述的方法，其中所述HPV相关疾病是HPV相关癌症。
实施方案185.根据实施方案184所述的方法，其中所述HPV相关癌症是子宫颈癌、肛门癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。
实施方案186.一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含CpG ODN和与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的HPV抗原。
实施方案187.根据实施方案166所述的组合物，其中所述HPV抗原包含与SEQ IDNO:23具有至少90％相似性的所述氨基酸序列。
实施方案188.根据实施方案186或187所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方法制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述CpG ODN通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述CpG ODN一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述CpG ODN进入所述扰动的输入细胞；从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案189.根据实施方案188所述的组合物，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
实施方案190.根据实施方案188或189所述的组合物，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至约99％。
实施方案191.根据实施方案188-190中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
实施方案192.根据实施方案188-191中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部在通道中。
实施方案193.根据实施方案188-192中任一项所述的组合物，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
实施方案194.根据实施方案186-193中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
实施方案195.根据实施方案186-194中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原和/或所述CpG ODN存在于细胞质液和/或胞内体中。
实施方案196.根据实施方案186-195中任一项所述的组合物，其中所述抗原和/或所述CpG ODN存在于所述细胞的多个隔室中。
实施方案197.根据实施方案186-196中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的表面上进一步包含HPV抗原和/或CpG ODN。
实施方案198.根据实施方案188-197中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的CpG ODN的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案199.根据实施方案188-198中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案200.根据实施方案188-199中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与CpG ODN的比率在约10000:1至约1:10000之间。
实施方案201.根据实施方案186-200中任一项所述的组合物，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
实施方案202.根据实施方案186-201中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
实施方案203.根据实施方案202中任一项所述的组合物，其中所述佐剂包含CpGODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
实施方案204.根据实施方案186-203中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。
实施方案205.根据实施方案204所述的组合物，其中所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。
实施方案206.根据实施方案186-205中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
实施方案207.根据实施方案186-206中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、与佐剂或与所述CpG ODN复合。
实施方案208.根据实施方案186-207中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。
实施方案209.根据实施方案186-208中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是包含抗原性表位的多肽，所述抗原性表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。
实施方案210.根据实施方案186-209中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述CpG ODN。
实施方案212.根据实施方案186-211中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原与所述CpG ODN的比率在约10000:1至约1:10000之间。
实施方案213.一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案214.根据实施方案213所述的组合物，其中所述HPV抗原包含与SEQ IDNO:23具有至少90％相似性的所述氨基酸序列。
实施方案215.根据实施方案213或214所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方法制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案216.根据实施方案215所述的组合物，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
实施方案217.根据实施方案215-216中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至约99％。
实施方案218根据实施方案215-217中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
实施方案219.根据实施方案215-218中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部在通道中。
实施方案220.根据实施方案215-219中任一项所述的组合物，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
实施方案221.根据实施方案213-220中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
实施方案222.根据实施方案213-221中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。
实施方案223.根据实施方案213-222中任一项所述的组合物，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。
实施方案224.根据实施方案213-223中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的表面上进一步包含HPV抗原和/或佐剂。
实施方案225.根据实施方案215-224中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案226.根据实施方案215-225中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案227.根据实施方案215-226中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
实施方案228.根据实施方案213-227中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpGODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
实施方案229.根据实施方案228所述的组合物，其中所述佐剂是CpG ODN。
实施方案230.根据实施方案229所述的组合物，其中所述CpG ODN是CpG ODN1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
实施方案231.根据实施方案213-230中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
实施方案232.根据实施方案213-231中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。
实施方案233.根据实施方案232所述的组合物，其中所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。
实施方案234.根据实施方案213-233中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
实施方案235.根据实施方案213-234中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。
实施方案236.根据实施方案213-235中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。
实施方案237.根据实施方案213-236中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
实施方案238.根据实施方案213-237中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。
实施方案239.根据实施方案213-238中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
实施方案240.根据实施方案186-239中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
实施方案241.根据实施方案186-240中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
实施方案242.根据实施方案186-241中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。
实施方案243.根据实施方案242所述的组合物，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
实施方案244.根据实施方案242所述的组合物，其中所述药剂是白蛋白。
实施方案245.根据实施方案244所述的组合物，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
实施方案246.根据实施方案242所述的组合物，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
实施方案247.根据实施方案242所述的组合物，其中所述药剂包含MSA。
实施方案248.根据实施方案186-247中任一项所述的组合物，其中将所述细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。
实施方案249.根据实施方案248所述的组合物，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。
实施方案250.根据实施方案248或249所述的组合物，其中所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
实施方案251.根据实施方案186-250中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。
实施方案252.根据实施方案186-251中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞不是B细胞。
实施方案253.根据实施方案186-252中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞是T细胞。
实施方案254.根据实施方案253所述的组合物，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
实施方案255.根据实施方案253所述的组合物，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
实施方案256.根据实施方案254或255所述的组合物，其中所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案257.根据实施方案254或255所述的组合物，其中所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案258.根据实施方案254或255所述的组合物，其中所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案259.根据实施方案254或255所述的组合物，其中所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。
实施方案260.根据实施方案253-257中任一项所述的组合物，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。
实施方案261.根据实施方案253-257中任一项所述的组合物，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。
实施方案262.根据实施方案253-261中任一项所述的组合物，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。
实施方案263.根据实施方案253-261中任一项所述的组合物，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+T细胞、CD45RA+ T细胞、CD45RO+ T细胞、和γδ-T细胞。
实施方案264.根据实施方案186-263中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的细胞对个体而言是同种异体的。
实施方案265.根据实施方案186-263中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的细胞对个体而言是自体的。
实施方案266.根据实施方案186-265中任一项所述的组合物，其中将个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
实施方案267.根据实施方案186-266中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含免疫检查点抑制剂。
实施方案268.根据实施方案267所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
实施方案269.根据实施方案186-268中任一项所述的组合物，其中向个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。
实施方案270.根据实施方案186-268中任一项所述的组合物，其中向个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
实施方案271.根据实施方案186-270中任一项所述的组合物，其中所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。
实施方案272.一种包含抗原的组合物，其中所述抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案273.根据实施方案272所述的组合物，其中所述抗原包含氨基酸序列SEQID NO:23。
实施方案274.一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入细胞包含HPV抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案275.一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入细胞包含所述佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
实施方案276.根据实施方案274或275所述的方法，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
实施方案277.根据实施方案274-276中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至99％。
实施方案278.根据实施方案274-277中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
实施方案279.根据实施方案274-278中任一项所述的方法，其中所述缩窄部在通道中。
实施方案280.根据实施方案274-279中任一项所述的方法，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
实施方案281.根据实施方案274-280中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。
实施方案282.根据实施方案274-281中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。
实施方案283.根据实施方案274所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案284.根据实施方案275所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
实施方案285.根据实施方案274-285中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpGODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
实施方案286.根据实施方案285所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN。
实施方案287.根据实施方案286所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
实施方案288.根据实施方案274-287中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原源自细胞裂解物。
实施方案289.根据实施方案274-288中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是HPV-16或HPV-18抗原。
实施方案290.根据实施方案274-289中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。
实施方案291.根据实施方案290所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案292.根据实施方案289所述的方法，其中所述HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
实施方案293.根据实施方案290所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案294.根据实施方案290所述的方法，其中所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
实施方案295.一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，其包括向所述个体给予与HPV抗原关联的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞通过包括以下步骤的方法制备：
a)将输入细胞与所述HPV抗原和/或佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原与所述输入细胞关联；
从而产生与所述抗原相关联的所述经修饰的免疫细胞。
实施方案296.根据实施方案295所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
实施方案297.根据实施方案296所述的方法，其中所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
实施方案298.根据实施方案295-297中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpGODN。
实施方案299.根据实施方案298所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
实施方案300.一种包含根据实施方案186-273中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其用作药剂。
实施方案301.一种包含根据实施方案186-273中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其用于通过手术、疗法或诊断治疗人体或动物体的方法。
实施方案302.一种包含根据实施方案186-273中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其用于治疗癌症、感染性疾病或病毒相关疾病。
实施方案303.一种包含根据实施方案186-273中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述癌症是头颈癌、子宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌或唾液腺癌。
实施方案304.一种包含根据实施方案300-303中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的PBMC在给予免疫检查点抑制剂之前、同时或之后给予。
实施方案305.根据实施方案304所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、VISTA、和TIM-3。
实施方案306.根据实施方案305所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。
实施方案307.根据实施方案305所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。
实施方案308.根据实施方案300-307中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的PBMC在给予治疗剂之前、同时或之后给予。
实施方案309.根据实施方案308所述的组合物，其中所述治疗剂是化学治疗剂。
实施方案310.根据实施方案309所述的组合物，其中所述感染性疾病与HIV、HPV、EBV、MCV、HBV或HCV相关。
实施例
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内可以有若干种实施方案。本发明现在将通过引用以下非限制性实施例进行更加详细的描述。以下实施例进一步说明了本发明，但是当然不应该解释为以任何方式限制其范围。
实施例1
为了确定在治疗性设置中导致肿瘤生长抑制所需最小有效细胞剂量TAPC，在TC1肿瘤模型中测试四种不同剂量的初免/加强TAPC，并且绘制肿瘤面积随时间变化的曲线图。
在第0天，向C57BL/6J雌性小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第4天(初免)和第7天(加强)，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载200μg/mL CpG ODN 1826和预复合的40μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+40μM小鼠血清白蛋白(MSA)。向动物(10只小鼠/组)静脉注射相关剂量的E7+MSA+CpG负载的T细胞(50M细胞/mL)，并且在肿瘤植入后1周开始测量TC-1肿瘤生长，每周两次，并且与未治疗的小鼠的肿瘤生长进行比较。图1A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
图1B示出了在图1A中概述的来自未治疗组(无T细胞的过继转移)的小鼠与来自治疗组B-E的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长。所有治疗条件均导致完全肿瘤减小，表明测试的最低细胞剂量(2.5M细胞初免，1M细胞加强)仍然能够实现与较高细胞剂量相同的肿瘤减小，在第18天相对于未治疗，每种均达到统计显著性(#P<0.0001)。
实施例2
为了确定E7 SLP设计，将两种不同的E7 SLP、天然E7 SLP以及其中天然序列的所有半胱氨酸均被丝氨酸替代的物质SQZ到T APC中，同时进行CpG共给予，并且通过ICS评估每种条件的IFN-γ产生。
从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载不同剂量的(左-200μg/mL，右-25μg/mL)CpG ODN 1826和预复合的40μM E7天然或经典SLP+40μM小鼠血清白蛋白(MSA)，或在不存在SQZ的情况下用相同的条件孵育T细胞，作为阴性对照(Endo-组B和D)。向动物(5只小鼠/组)静脉内注射100μL体积(50M细胞/mL)的5M负载或孵育的T细胞。在第8天，收获脾脏，并且通过ICS定量产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％。图2A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
使用cE7的Endo对照组中产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％最高，其与使用cE7的SQZ或使用nE7的Endo无显著差异。出乎意料地，SQZ与Endo相比没有益处，但相对于所有其他情况，在SQZ nE7条件下产生IFN-γ的CD8+T细胞的％显著下降。此数据显示，SLP序列对响应于T APC疫苗接种而产生的产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％具有影响，特别是当使用SQZ将抗原负载到T细胞中时。
实施例3
为了确定在体外人模型中E6 SLP在E6应答T细胞中诱导抗原特异性免疫应答的能力，向原代人T细胞中负载E6 SLP，并且通过ELISA测量应答细胞IFN-γ分泌。
从HLA-A02+供体的PBMC中分离出人T细胞(10M细胞/mL)，并且通过SQZ在细胞内递送50μM含有HLA-A02限制性最小E629-38表位(LPQLSTELQTTIHDIILECVYSKQQLLRREVYDFAF)的E6 SLP，并且在SQZ条件与其中在不存在SQZ的情况下E6 SLP与TAPC一起孵育的对照(Endo)之间比较如通过ELISA测量的IFN-γ水平。然后将TAPC与E6特异性CD8+应答细胞以1:1的刺激物:效应子的比率共培养，并且在IL-2(100U/mL)的存在下培养。18h后，从每种条件下收集上清液，并且通过IFN-γELISA(Biolegend)评估IFN-γ的产生水平。
当与E6应答CD8+ T细胞共培养时，测试的E6 SLP(当使用SQZ在细胞内递送时)导致IFN-γ产生的增加>10倍(#P<0.0001)，如图3所示。这些发现显示了T APC引发针对多种HPV抗原(E6和E7)的抗原特异性免疫应答的能力。
实施例4
为了确定E7 SLP诱导E711-20应答T细胞中抗原特异性免疫应答的能力以及SLP序列在体外人模型中对SQZ T细胞APC(Tapc)激活的影响，向来自多个供体的原代人T细胞中负载不同的E7 SLP，并且通过ELISA测量应答细胞IFN-γ分泌。
从HLA-A02+供体的PBMC中分离出人T细胞(10M细胞/mL)，并且通过SQZ在细胞内递送50μM OL-E71-35(MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE)或E7.6(QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL)SLP，并且在SQZ条件与其中在不存在SQZ的情况下E7 SLP与Tapc一起孵育的对照(Endo)之间比较如通过ELISA测量的IFN-γ水平。然后将TAPC与E711-20特异性CD8+应答细胞以4:1的刺激物:效应子的比率共培养，并且在IL-2(100U/mL)的存在下培养。24h后，从每种条件下收集上清液，并且通过IFN-γELISA(Biolegend)评估IFN-γ的产生水平。
与Endo相比，当使用SQZ递送时，天然OL-E71-35 SLP引发最小IFN-γ应答(图4)。然而，在当与Endo对照比较时测试的所有三个供体中，包含在另一个反应性SLP的侧翼区域(E621-45-QLCTELQTXXXXXXXXXYCKQQLL)之间插入的E7最小表位(YMLDLQPETT)的E7.6相对于匹配的Endo对照诱导了更大的IFN-γ响应(*P<0.05，**P<0.01；#P<0.0001)。此发现突出了侧翼区域序列在SLP的免疫原性中的重要性，并且提供了对以下的支持：已知具有反应性的其他SLP的侧翼区域可以与正交最小表位结合使用以实现增加的免疫应答。
实施例5
为了在体外人模型中评估SQZ T细胞APC的抗原剂量，向原代人T细胞中负载不同剂量的E7 SLP，并且通过ELISA评估IFN-γ。
从HLA-A02+供体的PBMC中分离出人T细胞(10M细胞/mL)，并且通过SQZ在细胞内递送不同剂量的(50和100μM)E7 SLP(QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL)，并且在SQZ条件与其中在不存在SQZ的情况下将E7 SLP与T APC一起孵育的对照(Endo)之间比较如通过ELISA测量的IFN-γ水平。然后将T APC与E711-20特异性CD8+应答细胞以4:1的刺激物:效应子的比率共培养，并且在IL-2(100U/mL)的存在下培养。24h后，从每种条件下收集上清液，并且通过IFN-γELISA(Biolegend)评估IFN-γ的产生水平。另外，使用肽脉冲阳性对照，其中在ELISA之前将B-LCL细胞在最小E7表位(YMLDLQPETT)的存在下孵育1h。
在测试的三个供体中，相对于其中在不存在SQZ的情况下将SLP与T细胞一起孵育的可比较对照(Endo)，在所有SQZ条件下均出现一致的IFN-γ增加(图5)。供体1和3展现出在50μM E7 SLP的情况下统计学上显著的增加(8668-*P<0.05；8299-#P<0.0001)，以及在更高的100μM E7SLP下趋于显著的趋势。尽管对于任何供体，在50μM与100μM之间没有统计学上显著的差异，但是在50μM E7 SLP的情况下，存在始终相等或更高的IFN-γ应答。
实施例6
为了确定在体外人模型中SQZ T细胞APC的供体变异性以及鉴定诱导针对E7的显著免疫应答的E6和E7 SLP的最佳组合和剂量，在来自多个HLA-A02+供体的原代人T细胞中负载E6和E7 SLP并且通过ELISA评估IFN-γ。
从HLA-A02+供体的PBMC中分离出人T细胞(10M细胞/mL)，并且通过SQZ在细胞内递送25或50μM E6 SLP(QLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL)和E7.6 SLP(QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL)，并且在SQZ条件与其中在不存在SQZ的情况下将SLP与TAPC一起孵育的对照(Endo)之间比较如通过ELISA测量的IFN-γ水平。使用肽脉冲阳性对照，其中在最小E7表位(YMLDLQPETT)的存在下在TAPC产生的同时孵育B-LCL细胞。然后将TAPC和阳性对照与E711-20特异性CD8+应答细胞以4:1的刺激物:效应子的比率共培养，并且在IL-2(100U/mL)的存在下培养。24h后，从每种条件下收集上清液，并且通过IFN-γELISA(Biolegend)评估IFN-γ的产生水平。
相对于其中在不存在SQZ的情况下将SLP与T细胞一起孵育的可比较对照(Endo)，当用SQZ E6+E7 SLP治疗时，所示出的七个供体中的五个展现出一致的IFN-γ增加(供体1-3、5-6：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005)，如图6所示。在相对于Endo对照当用经SQZ的T APC治疗时没有统计学上显著的增加的两个供体中，两个供体(供体4和7)均具有这样的情况，其中在测试一个剂量的经SQZ的T APC的情况下存在可检测的增加(供体4-50μm，供体7-25μM)，趋于显著。总的来说，这些数据显示，尽管不同的供体T APC具有不同的免疫刺激活性，但我们可以看到在多个供体之间IFN-γ的产生一致增加，并且当与多种抗原/SLP组合使用时，E7特异性免疫应答仍然显著，在这种情况下是HPV特异性E6抗原。
实施例7
为了帮助确定导致最稳健免疫应答的佐剂，我们测试了作用于不同途径的两种佐剂对T APC诱导体内抗原特异性应答的能力的作用。通过四聚体和通过流式细胞术的ICS染色来定量这种作用。
从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载400μg/mL Ova+各种浓度的高分子量和低分子量聚I:C(10、30、100、300、1000μg/mL)，并且与在不存在SQZ的情况下在相同条件下孵育的T细胞(作为阴性对照(Endo-组C和E))进行比较。将SQZ有Ova+200μg/mL CpG的T细胞用作阳性对照(组F)。在第0天，向小鼠(5只/组，3只未治疗的)注射100μL体积的5M负载或孵育的T细胞(50M细胞/mL)。在第7天，收获脾脏并且使用流式细胞术通过四聚体染色对Ova特异性T细胞进行定量，同时将一些脾细胞通透化并且固定过夜。第二天(第8天)，通过ICS确定IFN-γ水平，其中PMA/离子霉素作为阳性对照。图7A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在其中CpG为佐剂的组中，四聚体或产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％最高，而其中LMW或HMW聚I:C为佐剂的所有条件相对于未治疗的情况没有增加Ova特异性或产生IFNγ的CD8+ T细胞的百分比(图7B)。由于聚I:C是TLR3激动剂并且CpG是TLR9激动剂，因此此数据支持了CpG相对于聚I:C在T APC疫苗接种的情况下作为佐剂的优越性，同时表明TLR3激活在这种设置中可能没有益处。
实施例8
为了帮助确定导致最稳健免疫应答的CpG佐剂的浓度，我们测试了多种剂量的CpG对T APC诱导体内抗原特异性应答的能力的作用。通过四聚体和通过流式细胞术的ICS染色来定量这种作用。
从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载400μg/mL Ova+各种浓度的CpG 1826(50、100、200μg/mL)，并且与在不存在SQZ的情况下在相同条件下孵育的T细胞(作为阴性对照(Endo-组B、D和F))进行比较。在第0天，向小鼠(5只/组，3只未治疗的)注射100μL体积的5M负载或孵育的T细胞(50M细胞/mL)。在第7天，收获脾脏并且使用流式细胞术通过四聚体染色对Ova特异性T细胞进行定量，同时将一些脾细胞通透化并且固定过夜。第二天(第8天)，通过ICS确定IFN-γ水平，其中PMA/离子霉素作为阳性对照。图8A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在用200μg/mL CpG的组中，四聚体或产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％最高并且对于I类肽/MHC-I，与相关的Endo对照存在显著差异(对于四聚体为*P<0.05，对于IFN-γ为#P<0.0001)，而相对于未治疗的情况或其相应的Endo对照，所有其他条件均未引发显著的应答(图8B)。仅在I类肽的情况下观察到Ova特异性T细胞的激活，支持了Ova抗原的直接呈递实现CD8+ T细胞应答。
实施例9
为了帮助评估导致稳健免疫应答的CpG佐剂给予时间表，我们测试了多种CpG给药时间表对T APC诱导体内抗原特异性应答的能力的作用。通过四聚体和通过流式细胞术的ICS染色来定量这种作用。
从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载400μg/mL Ova，并且向小鼠(5只/组，3只未治疗的)注射100μL体积的5M负载或孵育的T细胞(50M细胞/mL)。在TAPC初免(第0天)的同时或者在初免后第1天或第2天(分别为第1天或第2天)进行供体小鼠的CpG 1826(25μg/mL)全身共给予，并且与在不存在SQZ的情况下在相同条件下孵育的T细胞(作为阴性对照(组B、D和F))进行比较。将SQZ有(Ova+200μg/mL CpG)的T细胞用作阳性对照(组H)。在第7天，收获脾脏并且使用流式细胞术通过四聚体染色对Ova特异性T细胞进行定量，同时将一些脾细胞通透化并且固定过夜。第二天(第8天)，通过ICS确定IFN-γ水平，其中PMA/离子霉素作为阳性对照。图9A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在其中将Ova和CpG共递送至T APC的组中，四聚体或产生IFN-γ的CD8+ T细胞的％最高，而与初免同一天的共给予(组B)是唯一的显示出一定水平的Ova特异性激活的共给予CpG组，趋向于显著(图9B)。然而，此数据支持以下观察结果：抗原+CpG共递送可以导致Ova特异性CD8+ T细胞的最大激活，而与同时初免和共给予佐剂相比，延迟CpG的全身给予导致较低的应答。
实施例10
为了确定针对T APC抗肿瘤功能的细胞内和全身佐剂给予的组合，在预防性TC-1鼠肿瘤模型中，与我们的E7特异性T APC结合来比较CpG与IFN-α的多种给予途径。通过四聚体染色和流式细胞术测量抗原特异性T细胞应答，而通过肿瘤生长预防测量抗肿瘤作用。
在第-14天(初免)和第-7天(加强)，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载预复合的40μM E7 SLP(GQAEPDR AHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+40μM小鼠血清白蛋白(MS A)(组B和C)或E7 SLP+MSA+200μg/mL CpG ODN 1826(组D、E和F)。向C57BL/6J雌性受体小鼠(10只小鼠/组)静脉注射100μL负载的T细胞(5M细胞/动物)，而组B和E的动物也接受静脉CpG(25μg)并且组C和F接受I V IFN-α(10k IU)。在第-8天和第-3天，收集100μL鼠血，并且通过四聚体染色和流式细胞术定量E7特异性CD8+ T细胞的％。在第0天，在受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(100k细胞/小鼠)，并且在第11天开始每周两次测量TC-1肿瘤生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。图10A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在用E7+MSA或E7+MSA+CpG SQZ T细胞+/-共给予CpG或IFN-α初免后(第-8天)和加强后(第-3天)通过E7四聚体染色测量在小鼠中E7特异性T细胞的百分比(图10B)。在SQZ E7+CpG共给予和SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予组中观察到最高相对比例的E7特异性T细胞。相对于SQZ E7+共给予CpG，在SQZ(E7+CpG)+共给予CpG中E7特异性初免后CD8+ T细胞的相对数量令人惊讶地更低(*P<0.05)，而共给予IFN-α与SQZ(E7+CpG)T细胞导致比共给予CpG与SQZ(E7+CpG)T细胞显著更高的E7特异性T细胞数量(*P<0.05)。加强后(第-3天)，观察到相似的趋势，其中SQZ E7+CpG共给予和SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予组导致最高的E7特异性T细胞％。然而，最高的应答来自SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予组，其显著高于SQZ E7+IFN-α共给予和SQZ(E7+CpG)+共给予CpG，显示了当与SQZ(E7+CpG)T细胞组合使用时，IFN-α共给予导致更高的抗原特异性T细胞百分比。在图10C中概述的来自未治疗组(无T细胞的过继转移)的小鼠与来自治疗组B-F的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长。SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予组的高肿瘤生长减少和生存优势很好地与四聚体染色对应，显示了E7特异性T细胞的最高诱导导致最佳的抗肿瘤活性。有趣的是，尽管SQZ(E7+CpG)组中的E7特异性T细胞％低，但这种治疗也提供了非常高水平的抗肿瘤活性，这是唯一的将所有小鼠的生存延长超过60天的其他组(除了SQZ(E7+CpG)+IFN-α共给予之外)。虽然比先前提到的组D和F略低，但在组C和E中存在可辨别的生存延长和肿瘤生长抑制。在第78天，将来自组D的7只无肿瘤小鼠在相对的(左)侧腹用50k细胞再激发并且与年龄相匹配的未处理动物(10只小鼠)进行比较(图10D)。与接受其首次激发的未治疗小鼠相比，来自组D的小鼠在再激发后具有显著减少的肿瘤生长(***P<0.005)，提供了对以下的支持：这种抗肿瘤作用可持续超过2个月。
实施例11
为了确定组合多种HPV抗原用于T APC抗肿瘤功能的作用，在预防性TC-1鼠肿瘤模型单独的E6和E7合成长肽(SLP)以及与我们的E7特异性T APC的组合。通过四聚体染色和流式细胞术测量E7特异性T细胞应答，而通过肿瘤生长预防测量抗肿瘤作用。
在第-14天(初免)和第-8天(加强)，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且根据表XX，使用SQZ负载预复合的20μM小鼠血清白蛋白(MSA)+20μM E6(VYSKQQLLRREVYDFAFRDLSIVYRDGNPYAVSDK)和/或E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)或两者+/-200μg/mL CpG ODN 1826的组合。在不存在SQZ的情况下在与组B相同的条件下孵育的T细胞用作阴性对照(组C)。向C57BL/6J雌性受体小鼠(5-10只小鼠/组)静脉内注射100μL负载的T细胞(5M细胞/动物)。在第-3天，收集100μL鼠血，并且通过四聚体染色和流式细胞术定量E7特异性CD8+ T细胞的％。在第0天，在受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(100k细胞/小鼠)，并且在第11天开始每周两次测量TC-1肿瘤生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。图11A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在加强后(第-3天)通过E7四聚体染色测量小鼠中E7特异性T细胞的百分比，在CpG+E7 SQZ T APC(组B)的情况下观察到最大作用，如图11B所示。有趣的是，组B应答显著高于未治疗的情况以及E7和E6的组合(组F-#P<0.0001)，提供了证据表明E6 SLP的添加钝化了E7特异性应答。组B与其他治疗组显著不同，值得注意的例外是Endo对照(组C)，其中组B值得注意地更高并且趋于统计学显著性。如图11C所示，在图11A中概述的来自未治疗组(无T细胞的过继转移)的小鼠与来自治疗组B-G的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长。用SQZ有E7+CpG的T细胞以及在E7+CpG的存在下在不存在SQZ的情况下孵育的T细胞的组中出现高的肿瘤生长预防。相对于未治疗的情况(组A)和经E6+CpG SQZ的T细胞(组G)，组D-F显示出一定水平的肿瘤生长抑制，但均不如组B和C有效。
实施例12
为了确定CpG佐剂的给予途径对于E7特异性T APC抗肿瘤作用的重要性，将E7 SLP与CpG组合递送至T细胞，递送至T细胞或全身共给予于受体动物，并且通过肿瘤生长抑制测量抗肿瘤作用。
在第0天，向受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第10天(初免)和第20天(加强)，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载预复合的20μM小鼠血清白蛋白(MSA)+20μM E7(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)，并且通过SQZ共递送200μg/mL的ODN 1826(组D)或以25μg/小鼠全身共给予动物(组C)，并且与未治疗的情况(组A)和全身给予单独的CpG(组B)进行比较。将受体小鼠(8-10只小鼠/组)用100μL负载的T细胞(5M细胞/动物)治疗。从第10天开始，每周两次测量TC-1肿瘤生长。图12A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在HPV相关癌症(TC-1)的治疗性模型中，相对于未治疗的情况和单独注射CpG，SQZ有E7 SLP的T APC导致肿瘤负荷显著减小(第17天：组C-P<0.05；第20天：组C和D–P<0.0001)(图12B)。这些数据显示，在治疗性设置中，相对于未治疗的情况或单独的佐剂，CpG佐剂的全身共给予和细胞内递送两者均导致肿瘤负荷显著减小。
实施例13
为了评价共给予的佐剂导致E7特异性T细胞肿瘤浸润的能力，在治疗性TC-1鼠肿瘤模型中与我们的E7特异性T APC组合来比较CpG与IFN-α。通过四聚体染色和流式细胞术测量肿瘤浸润淋巴细胞中的抗原特异性T细胞应答。
在第0天，向受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第10天，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且使用SQZ负载预复合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+20μM小鼠血清白蛋白(MSA)。将SQZ负载的T细胞(5M细胞/动物)单独给予(组C)、与CpG ODN 1826(25μg/小鼠-组D)一起给予、或与IFN-α(10k IU/小鼠-组E)一起给予，并且静脉注射100μL总体积。还向小鼠注射全身性CpG(25μg-组A)或单独的IFN-α(10k IU-组B)。在第17天，收获肿瘤并且分离CD8+肿瘤浸润T细胞，并且通过四聚体染色评价E7特异性反应性。图13中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在初免后7天(第17天)通过E7四聚体染色测量小鼠中E7特异性CD8+ T细胞的百分比，并且CD8+细胞中E7特异性T细胞的百分比的代表性例子在图13的下图中示出。虽然单独注射佐剂不会产生可察觉量的E7特异性T细胞，但SQZ递送E7 SLP提供了40％的E7特异性T细胞增加，并且E7递送的T细胞与CpG和IFN-α的组合导致甚至更高百分比的抗原特异性T细胞(分别为70％和80％)。此数据显示，当与全身性佐剂(诸如CpG或IFN-α)组合给予负载E7SLP的T细胞时，产生更稳健的E7特异性T细胞应答。
实施例14
为了确定用于负载有E7合成长肽(SLP)+CpG的T APC的初免和加强两者的疫苗接种时间表，我们使用在不同时间点用我们的T APC疫苗以及用不同的加强数量治疗的治疗性TC-1鼠肿瘤模型。通过肿瘤生长抑制来测量抗肿瘤作用。
在第0天，在受体小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)，并且在第11天开始每周两次测量TC-1肿瘤生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。在第3天或第6天，从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离出T细胞，并且根据表XX，使用SQZ负载预复合的20μM小鼠血清白蛋白(MSA)+20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+200μg/mLCpG ODN 1826，然后向受体小鼠静脉注射100μL负载的T细胞(5M细胞/动物)。图14A中概述了治疗组和时间表的代表性示意图。
在SQZ有E7+CpG的T细胞的所有组中出现肿瘤生长抑制，并且在第20天出现相对于未治疗情况的统计显著性(第20天-所有组P<0.05；第24天-所有组P<0.0001)。此数据显示，在第6天与第3天进行初免时，用T APC疫苗的给药时间表可以表现得同样好，并且在第21天增加第二加强没有可辨别的益处。
实施例15
为了更好地理解通过已通过SQZ具有细胞内抗原递送的T细胞进行抗原呈递的机制，将Ova递送至注射到野生型小鼠或MHC-I敲除老鼠中的野生型T细胞或在不存在SQZ的情况下与其一起孵育。收获脾脏并且通过CFSE染色定量Ova特异性T细胞(OT-I)增殖的量。
在第0天，从OT-I雌性供体小鼠中分离出T细胞并且将其用2μM CFSE标记，并且将在100μL PBS中的2.5M细胞经眼眶后(RO)注射到野生型或MHC-I敲除小鼠中。同样在第0天，将400μg/mL Ova负载到从CD45.1供体小鼠(4只小鼠/组)中分离出的T细胞中或与其一起孵育，并且RO注射5M T细胞。在第3天，收获脾脏并且通过CFSE染色评价Ova特异性T细胞增殖水平。
通过CFSE标记Ova反应性OT-I CD8+ T细胞来评价Ova特异性T细胞增殖的量。为了确定负载抗原的TAPC的呈递机制，将缺乏MHC-I的小鼠用作受体小鼠。这将阻止内源性鼠APC呈递Ova抗原，这是由于正死亡的经SQZ的T细胞间接吸收抗原以及在MHC-I上交叉呈递给过继转移的OT-I细胞。已发现，当受体小鼠缺乏MHC-I时，仍然发生Ova特异性OT-I细胞增殖，提供了证据表明经SQZ的T APC直接呈递抗原(图15)。这些数据支持了SQZ介导的细胞内递送的抗原的直接呈递。
实施例16
为了评价SQZ改变细胞因子产生的倾向，向T细胞中SQZ递送CpG，并且评价在体外鼠模型中改变T细胞细胞因子水平的能力。使用多重细胞因子试剂盒剖析上清液中的细胞因子水平。
将C57BL/6J雌性受体小鼠用从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离并且SQZ有200μg/mLCpG的T细胞进行初免，并且在24h后收集上清液(N＝2)。通过Millipore Milliplex多重细胞因子试剂盒评价上清液的细胞因子水平，并且表示为相对于未治疗的T细胞的倍数变化差异。
相对于未治疗的细胞，经由SQZ负载CpG的T细胞的上清液中的细胞因子水平之间没有显著变化(图16)。此数据显示，佐剂的SQZ递送在体外不显著改变T细胞细胞因子水平。
实施例17
为了评价SQZ改变细胞因子产生的倾向，评价SQZ递送Ova或Ova+CpG的T细胞的在体外鼠模型中改变血清细胞因子水平的能力。使用多重细胞因子试剂盒剖析血清细胞因子。
将C57BL/6J雌性受体小鼠用从C57BL/6J雌性供体小鼠中分离并且SQZ有400μg/mLOva或Ova+200μg/mL CpG的T细胞进行初免，并且在初免后6h从尾静脉抽血并且在24h通过心脏穿刺抽血。通过Millipore Milliplex多重细胞因子试剂盒评价血清的细胞因子水平，并且表示为相对于未治疗的T细胞的倍数变化。
用经由SQZ负载Ova或Ova+CpG的T细胞初免的小鼠血清中的细胞因子水平之间没有显著变化(图17)。此外，在初免后6h与24h之间未观察到显著差异。这些数据显示，抗原+/-佐剂的SQZ递送在体内不显著改变血清细胞因子水平。
实施例18
为了确定原代人单核细胞来源的树突细胞(MoDC)在体外人模型中使用肿瘤细胞裂解物(TCL)作为抗原来源来诱导E7应答T细胞中的HPV E7特异性免疫应答的能力，向原代人MoDC中负载来自CaSki肿瘤细胞的裂解物，并且通过流式细胞术测量4-1BB表达百分比。
从HLA-A02+供体的PBMC中分离出人单核细胞，并且通过在4-6天内添加rhIL-4(1000U/mL)和rhGM-CSF(800U/mL)，在3天后补充含有细胞因子的媒介物来产生未成熟的MoDC。将CaSki子宫颈癌细胞系用作抗原来源，并且将来自CaSki细胞的TCL(23mg/mL)通过SQZ在细胞内递送至MoDC(1×106细胞/mL)，或者将CaSki TCL与MoDC在不存在SQZ的情况下一起孵育(Endo)。另外，采用肽脉冲对照，其中在已知的反应性E7表位(YMLDLQPETT-0.1μM-阳性Ctrl)的存在下孵育MoDC。将所有条件与LPS(60EU/mL)和rhIFN-γ(20000IU/mL)一起孵育1h以激活MoDC，然后在60EU/mL含有LPS的媒介物(无IFN-γ)中进行16-24h孵育。然后将MoDC与E7反应性T细胞(Astarte)以3:1的刺激物:应答者比率共培养16-24h。共培养后，通过流式细胞术测量在E7反应性CD8+ T细胞上的4-1BB表达％。
当使用SQZ细胞内递送时，源自已知高度表达HPV抗原E7的HPV阳性子宫颈癌细胞系的CaSki裂解物当与未治疗的情况和相应的Endo对照两者相比时导致表达4-1BB(抗原特异性激活的标记物)的E7反应性CD8+T细胞的百分比增加20％(#P<0.0001)。这些发现显示了通过SQZ产生的细胞内TCL诱导在原代人MoDC中针对HPV抗原E7的抗原特异性免疫应答的能力，为使用TCL作为复合抗原来源用于其中致癌抗原可能未知的另外适应症提供了支持。
实施例19
为了确定针对已通过SQZ负载抗原的抗原呈递细胞(APC)的内源性应答，将B细胞进行SQZ负载，并且通过细胞内细胞因子染色(ICS)测量炎性细胞因子的水平。
从C56BL/6J小鼠中分离出鼠B细胞(BAPC)，并且SQZ负载400μg/mL Ova蛋白或20μMHPV 16E7肽，然后与1μM CpG1826一起注射到供体小鼠中(5只小鼠/组)。在第7天，从未治疗的小鼠以及用SQZ负载的BAPC治疗的小鼠中收获脾细胞，将其用Ins B9-23肽再激发，并且随后对IFN-γ进行细胞内细胞因子染色(ICS)并且通过流式细胞术进行测量(图19A)。
对于模型抗原Ova(图19B)和疾病相关HPV E7(图19C)两者，结果显示，与从未治疗的小鼠中收获的脾细胞相比，来自用SQZ负载的BAPC治疗的小鼠的脾细胞当分别用Ova或HPVE7再刺激时展现出统计学上显著的IFN-γ产生增加(均为P<0.005)。总的来说，这些数据显示，可以将B细胞工程化，以在体内引发针对多种抗原的抗原特异性应答。
实施例20
为了确定SQZ负载的B细胞充当抗原呈递细胞(BAPC)用于预防性治疗肿瘤的能力，将小鼠用SQZ负载抗原的BAPC治疗，然后注射TC-1肿瘤细胞。测量肿瘤生长抑制以评价体内预防性疫苗功效。
为了测试基于预防性HPV抗原的B细胞疫苗(即，SQZ负载HPV抗原的BAPC)控制TC-1肿瘤生长的能力，将E7 SLP SQZ递送至B细胞中并且在植入肿瘤之前注射到小鼠中。具体地，在第-7天，从C56BL/6J小鼠中分离出鼠B细胞(BAPC)，并且SQZ负载HPV 16E7肽，然后与1μM CpG1826一起注射到供体小鼠中(10只小鼠/组)。在第0天，将TC-1肿瘤细胞皮下植入(在100μL中，1E6细胞/mL)每只小鼠的后侧腹。TC-1是已知表达HPV抗原E6和E7的肿瘤细胞系。随时间测量肿瘤体积，并且在第48天或当其肿瘤达到>1500mm3(以先到者为准)处死小鼠。
在接受负载E7的BAPC的小鼠中肿瘤生长被大幅抑制，并且在整个研究期间，治疗组中10只小鼠中有8只保持无肿瘤(TF)，而相比之下，对照组中为10小鼠只中有0只(图20A)。相对于对照，BAPC疫苗还导致BAPC免疫的小鼠的生存统计学上显著的提高(P<0.0001)，其中治疗组的中值生存>60天，而相比之下，对照组为32天(图20B)。总的来说，此数据显示，经由SQZ负载抗原的B细胞可以充当强效的基于APC的疫苗以用于抗原特异性预防性治疗肿瘤。
实施例21
为了确定SQZ负载的B细胞充当抗原呈递细胞(BAPC)以用于预防性治疗肿瘤的能力，向小鼠植入TC-1肿瘤细胞，然后用负载有抗原的BAPC进行治疗性免疫处理。测量肿瘤生长抑制以评价体内治疗性疫苗功效。
为了测试基于治疗性HPV抗原的B细胞疫苗(即，SQZ负载HPV抗原的BAPC)控制TC-1肿瘤生长的能力，将E7 SLP SQZ递送至B细胞中并且在植入肿瘤之后注射到小鼠中。具体地，在第0天，将TC-1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)皮下注射到C56BL/6J小鼠的右侧腹中(10只小鼠/组)。TC-1是已知表达HPV抗原E6和E7的肿瘤细胞系。在第9天，将小鼠保持不治疗或用1M细胞/小鼠的SQZ负载E7 SLP的鼠B细胞(BAPC)初免。随时间测量肿瘤体积，并且在第48天或当其肿瘤达到>1500mm3(以先到者为准)处死小鼠。
在接受负载E7的BAPC的小鼠中肿瘤生长被大幅抑制，其中在研究的持续时间内平均肿瘤体积保持<500mm3(图21A)。用负载E7的BAPC治疗的小鼠的生存也显著增加(P<0.0001)，其中治疗组的中值生存>60天，而相比之下，对照组为38天。总的来说，此数据显示，经由SQZ负载抗原的B细胞可以作充当强效的基于APC的疫苗，用于肿瘤的抗原特异性治疗性治疗。
实施例22
为了确定SQZ负载的B细胞促进肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)募集到肿瘤的能力，将荷瘤小鼠用负载的B细胞APC治疗(初免和加强)，并且除了通过流式细胞术分析肿瘤的抗原特异性T细胞的数量和相对百分比之外，还测量肿瘤生长抑制。
在第0天，将TC-1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)皮下注射到C56BL/6J小鼠的右侧腹中(20只小鼠/组)。在第14天，将小鼠用以下进行初免：(i)皮下注射150μg/小鼠的E7 SLP+50μg CpG1826(S.C.SLP)，(ii)眼眶后注射用1μg/mL E7最小表位+1μM CpG(Min.Epi.)脉冲的鼠B细胞，或(iii)眼眶后注射负载(SQZ)有E7 SLP(20μM)+1μM CpG(5M细胞/小鼠)的B细胞。随时间测量肿瘤体积，直到达到>1500mm3或到第34天，以先到者为准。在第27天，处死一子组动物(5只小鼠/组)，其中切除肿瘤，并且分离出T细胞并且将其通过流式细胞术分析。
在如所描述的治疗性治疗设置中，仅S.C.SLP和SQZ治疗导致可察觉的肿瘤生长抑制，其中仅SQZ治疗导致相对于在第19天观察到的最大体积的肿瘤消退(图22A)。对TIL募集到肿瘤以及这些T细胞的相对表型的分析显示，SQZ负载的B细胞疫苗(SQZ)导致肿瘤中浸润T细胞的百分比显著增加以及归一化至100mg肿瘤重量的细胞数量更高。除了浸润T细胞的总数量之外，还观察到与S.C.SLP和Min.EP.相比，SQZ治疗中的CD8+ T细胞以及E7特异性CD8+ T细胞两者按占CD45+细胞的百分比更显著增加，并且当归一化为肿瘤重量时也观察到这种趋势(图22B)。SQZ与每个其他治疗组之间的所有比较均是统计学上显著的(P<0.001)。总的来说，这些数据支持以下发现：SQZ负载的BAPC疫苗由于促进T细胞(特别是抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞)浸润到肿瘤中而导致肿瘤消退。
实施例23
为了确定针对已通过SQZ负载抗原的人抗原呈递细胞(APC)的体外抗原特异性应答，将B细胞进行SQZ负载，并且通过ELISA测量诱导的炎性细胞因子分泌水平。
具体地，从HLA-A2+供体中分离出人B细胞，并且将HPV 16E7SLP(50μM)与B细胞一起孵育(Endo)或通过SQZ递送至B细胞(SQZ)。然后将Endo或SQZ B细胞(60k细胞/孔)与E7应答T细胞(30k细胞/孔)以2:1的比率一起孵育，并且在IL-2(100U/mL)和CpG 2006(1μM)的存在下共培养24h。然后收获上清液，并且通过ELISA分析IFN-γ的分泌。
结果显示，SQZ负载的B细胞可以充当抗原呈递细胞(BAPC)以体外刺激HPV E7抗原特异性应答。负载有抗原的B细胞APC以比与抗原一起孵育的那些细胞显著更高的水平刺激E7特异性应答细胞以分泌IFN-γ(P<0.005)。
实施例24
为了评估佐剂对SQZ负载的疫苗诱导抗原特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的能力的重要性，向细胞负载模型抗原，与佐剂一起成熟并且注射到荷瘤小鼠中。通过流式细胞术测量募集到肿瘤的抗原特异性T细胞的相对百分比。
在第0天，向C57BL/6J雌性小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第15天(初免)，从雌性C57BL/6J供体小鼠的脾脏中获取鼠T细胞，并且通过SQZ(40psi，3.5μm缩窄部，室温)负载预复合的5μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+5μM小鼠血清白蛋白(MSA)，并且在37℃下孵育1h。在第15天经眼眶后向雌性C57BL/6J受体小鼠(10只/组)注射100μL媒介物(PBS-未治疗)或负载E7的T细胞(1M细胞/小鼠)+/-CpG 1826(25μg/小鼠)。在第25天，收获肿瘤并且通过流式细胞术测量E7特异性TIL的量。
单独的SQZ负载的T APC导致小(约15％)但统计学上不显著的E7特异性TIL数量增加，但是当与CpG共注射时，TIL数量存在更高和显著的增加(约55％，与单独的T APC相比，**P<0.01；与未治疗的情况相比，***P<0.0005)。此数据显示，与单独的T APC相比，将CpG与负载E7的T APC一起共注射导致高得多的TIL募集。
实施例25
为了评估T APC+佐剂疫苗在预防性设置中的耐久性，对于初始应答以及再激发60天后两者，比较经T APC治疗的小鼠与未治疗小鼠的表达HPV E7的TC1肿瘤模型的肿瘤生长，并且绘制肿瘤面积随时间变化的曲线图。
在第-14天，从C57BL/6J雌性供体小鼠收获脾细胞，并且通过免疫磁分离分离T细胞。接下来，经由SQZ(45psi；3.5μm缩窄部)向鼠T细胞负载预复合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+20μM小鼠血清白蛋白(MSA)，并且在37℃下孵育1小时。经眼眶后向雌性C57BL/6J受体小鼠(10只小鼠/组，除了20小鼠/组的未治疗组群I)注射100μL媒介物(PBS-未治疗)或负载E7的T细胞(1M细胞/小鼠)+CpG 1826(25μg/小鼠)[初免]。在第-7天，与第-14天完全一样，从C57BL/6J雌性供体小鼠中收获脾脏，并且分离T细胞，并且进行SQZ并且注射到受体小鼠中[加强]。在第0天，将C57BL/6J雌性小鼠在右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)(除了直到第64天才植入肿瘤细胞的10未治疗的组群2)。在高达120天内，在肿瘤植入后1周开始，每周两次测量TC-1肿瘤的生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。
在来自未治疗组的小鼠与在第0天用肿瘤细胞激发的T APC治疗组的小鼠之间比较如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长，并且虽然到第47天，未治疗组中的所有小鼠均达到人道终点，但除2只T APC小鼠外，T APC组中的所有小鼠均存在显著的肿瘤生长延迟，并且其余小鼠(8只)保持无肿瘤直到用肿瘤再激发。有趣的是，当将在第64天植入肿瘤的未治疗的小鼠与具有在其相对腹侧再植入的肿瘤的T APC治疗小鼠进行比较时，仍然存在肿瘤生长延迟，其中3只小鼠从未生长出可测量的肿瘤，即使在二次肿瘤激发后也是如此。这些数据表明，用负载E7的T APC+佐剂的治疗不仅可以导致抗原特异性肿瘤生长抑制，而且还可以导致预防肿瘤，所述预防肿瘤甚至可以持续超过>100天，即使在二次肿瘤激发的情况下。
实施例26
为了评估不同的T APC浓度以及初免-加强时间表在治疗性疫苗设置中的影响，比较T APC治疗小鼠(多种浓度和初免-加强时间表)与未治疗的小鼠的表达HPV E7的TC1肿瘤模型的肿瘤生长，并且绘制肿瘤面积随时间变化的曲线图。
在第0天，向C57BL/6J雌性小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第10天(初免)，通过免疫磁分离从雌性C57BL/6J供体小鼠的脾脏中获取鼠T细胞，并且通过SQZ(45psi，3.5μm缩窄部，室温)负载预复合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+20μM小鼠血清白蛋白(MSA)，并且在37℃下孵育1小时。然后，经眼眶后向雌性C57BL/6J受体小鼠(10只/组)注射100μL媒介物(PBS)或T APC(0.25或1M细胞/小鼠)+CpG1826(25μg/小鼠)。在第17天，初免/加强组以与第10天相同的方式接受用T APC的第二注射。在高达66天内，在肿瘤植入后1周开始，每周两次测量TC-1肿瘤的生长，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。
与未治疗的情况相比，如通过式((长度x宽度2)/2)测量肿瘤生长，并且低剂量TAPC组(0.25M细胞/小鼠)+CpG(仅初免)仅导致肿瘤生长速率略微延迟。从对在第17天用低剂量T APC+CpG(0.25M初免/加强)进行加强的包括，看出相对于仅相同浓度的初免的条件增强了肿瘤生长抑制并且相对于未治疗的情况，抑制大得多。将负载抗原的T APC的剂量增加至1M/小鼠(仅初免)导致相对于较低剂量T APC+CpG(仅初免)略微的肿瘤生长抑制。有趣的是，使用高剂量T APC+CpG(仅初免)导致免受肿瘤生长的最佳保护，其中肿瘤消退在第20-40天之间出现并且在观察的任何组中最高水平的生长抑制。总的来说，这些数据突出了增加细胞剂量、包含佐剂、或初免+加强给药时间表可以增强T APC疫苗的功效。
实施例27为了比较高剂量肽疫苗和相对于肽一起孵育或SQZ负载肽的B细胞的功效，在治疗性设置中用表达HPV E7的TC1肿瘤模型进行激发后，将小鼠用E7肽、E7孵育的B细胞(脉冲的B细胞)或负载E7的B APC治疗，并且绘制肿瘤面积和生存随时间变化的曲线图。
在第0天，向C57BL/6J雌性小鼠的右后侧腹注射TC1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)。在第13天(初免)，通过免疫磁分离从雌性C57BL/6J供体小鼠的脾脏中获取B细胞，并且与预复合的20μM E7 SLP(GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR)+20μM小鼠血清白蛋白(MSA)一起孵育(10μg/mL)或通过SQZ(60psi，4μm缩窄部，室温)负载它，并且与CpG 1826(1μM)一起孵育16小时。在第14天，经眼眶后向雌性C57BL/6J受体小鼠(10只/组)注射100μL媒介物(PBS)、E7孵育的B APC(5M细胞/小鼠)、负载E7的B APC(5M细胞/小鼠)或在左后侧腹皮下注射E7SLP(450μg/小鼠)+CpG(50μg/小鼠)。在第28天，以与第14天完全相同的方式将仅有肽的小鼠用皮下肽进行加强(加强)。在高达80天内，在肿瘤植入后1周开始，每周两次测量TC-1肿瘤生长和生存，并且与未治疗小鼠的肿瘤生长进行比较。
与未治疗的小鼠相比，用肽脉冲B APC的治疗不影响如通过式((长度x宽度2)/2)测量的肿瘤生长(图27A)。有趣的是，与未治疗的情况和肽脉冲B细胞相比，经SQZ负载的BAPC治疗的小鼠展现出明显的肿瘤生长抑制。这种作用类似于肽疫苗(SC SLP)的作用，尽管递送至小鼠的肽的量比负载的B APC高得多，并且肽疫苗组接受肽疫苗的初免和加强，而SQZ B APC组仅接受单一初免剂量。观察到肿瘤生长的趋势与总体生存相关，其中未治疗组和肽脉冲B细胞组均具有等效的中值生存(约36天-右)。相对于其他两组，高剂量肽疫苗和负载E7的B APC均具有几乎两倍的中值生存(60天[肽]与65.5天[SQZ B APC])(图27B)。这些数据显示，通过SQZ负载的B APC在HPV相关癌症的治疗性模型中可以诱导肿瘤消退，并且其与高得多剂量的经典肽疫苗一样有效或更有效。
实施例28
为了确定针对已通过SQZ负载抗原的抗原呈递细胞(APC)的内源性应答，将精制脾细胞进行SQZ负载，并且通过细胞内细胞因子染色(ICS)测量炎性细胞因子的水平。
从C56BL/6J小鼠中分离出鼠脾细胞(脾APC)并且SQZ有400μg/mL Ova蛋白(图28B)或HPV 16E7肽(20μM-图28C)，然后与1μM CpG1826一起注射到供体小鼠中(5只小鼠/组)。在第7天，收获脾细胞，用Ins B9-23进行再激发，并且通过流式细胞术针对IFN-γ和IL-2进行细胞内细胞因子染色(ICS)并且与未治疗的小鼠进行比较。
对于模型抗原Ova(图28B)和疾病相关的HPV E7(图28C)两者，发现当用Ova或E7再刺激时，脾APC治疗小鼠展现出统计学上显著的IFN-γ和IL-2两者的增加(与其相应的未治疗条件相比，对于所有APC条件，P<0.005)。总的来说，这些数据显示，可以将混合脾细胞工程化，以在体内引发针对多种抗原的抗原特异性应答。
实施例29
为了确定SQZ负载的B细胞或混合脾细胞充当抗原呈递细胞(APC)用于预防性治疗肿瘤的能力，将小鼠用负载的脾细胞APC治疗，然后注射TC-1肿瘤细胞。测量肿瘤生长抑制以评价体内疫苗功效。
在第0天，将TC-1肿瘤细胞(50k细胞/小鼠)皮下注射到C56BL/6J小鼠的右侧腹中(10只小鼠/组)。在第9天，将小鼠用1M细胞/小鼠的脾细胞进行初免(图28，脾APC)，随时间测量肿瘤体积，并且在第48天或当其肿瘤达到>1500mm3(以先到者为准)处死小鼠。
在肿瘤植入后9天通过将E7 SLP负载到B细胞或脾细胞中测试基于治疗性HPV抗原的脾细胞疫苗控制TC-1肿瘤生长(已知表达HPV抗原E6和E7的系)的能力。在脾APC治疗小鼠两者中肿瘤生长被大幅抑制，其中在研究的持续时间内平均肿瘤体积保持<500mm3(图29A)。用APC治疗的小鼠的生存也显著增加(P<0.0001)，其中脾APC治疗小鼠在研究结束之前均未达到人道终点(图29B)。总的来说，此数据显示，经由SQZ负载抗原的脾细胞可以作充当强效的基于APC的疫苗，用于抗原特异性治疗肿瘤。
实施例30
为了确定针对已通过SQZ负载抗原的人抗原呈递细胞(APC)的体外抗原特异性应答，将B细胞或PBMC进行SQZ负载，并且通过细胞内细胞因子染色(ICS)测量炎性细胞因子的水平。
从HLA-A2+供体中分离出人PBMC，并且将HPV 16E7 SLP(50μM)与PBMC一起孵育(Endo)或通过SQZ递送(SQZ)。然后将负载的PBMC(60k细胞/孔)与Astarte E7应答T细胞(30k细胞/孔)以2:1的比率共培养，并且在IL-2(100U/mL)和CpG 2006(1μM)的存在下培养24h。然后收获上清液，并且通过ELISA分析IFN-γ。
将PBMC作为APC进行测试，以在体外刺激HPV E7抗原特异性应答。负载有抗原的PBMC APC以比与抗原一起孵育的那些细胞高得多的水平刺激E7特异性应答细胞以分泌IFN-γ(P<0.005)。
总的来说，这些数据显示，人PBMC可以充当高效APC以在体外刺激疾病相关的抗原特异性应答。
序列表
Figure BDA0002763172940001361
Figure BDA0002763172940001371
Figure BDA0002763172940001381
序列表
<110> SQZ生物技术公司
<120> 用于治疗HPV相关疾病的方法
<130> 75032-20016.40
<160> 51
<170> FastSEQ Windows版4.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 人乳头瘤病毒
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<223> 人乳头瘤病毒
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<223> 人乳头瘤病毒
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<223> 人乳头瘤病毒
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<223> 人乳头瘤病毒
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<223> 人乳头瘤病毒
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<223> 人乳头瘤病毒
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Asp Phe Ala Phe
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Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala
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Phe Arg Asp Leu Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val
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Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
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Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
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Asp Ile Arg
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tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
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<212> DNA
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Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
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Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
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Glu Glu Glu
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<223> 合成构建体
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Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
20 25 30
Ile Val Thr
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser
20 25 30
Gln Lys Pro
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys
1 5 10 15
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr
1 5 10 15
Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu
1 5 10 15
Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys
20 25 30
<210> 49
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg
1 5 10 15
His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
1 5 10 15
Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
20 25 30
<210> 51
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 51
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20

Claims (310)

1.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内。
2.一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内。
3.一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内。
4.一种用于治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
5.一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
6.一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入细胞包含HPV抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至99％。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中所述缩窄部在通道中。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的方法，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的外部进一步包含HPV抗原和/或佐剂。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
17.根据权利要求4-16中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的比率在约10000:1与约1:10000之间。
18.根据权利要求3或6所述的方法，其中所述免疫应答增强。
19.根据权利要求18所述的方法，其中针对所述HPV抗原的免疫应答增强。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原源自细胞裂解物。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是HPV-16或HPV-18抗原。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV E6抗原和HPV E7抗原。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是包含抗原性表位的多肽，所述抗原性表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-26中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述药剂是白蛋白。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
45.根据权利要求41所述的方法，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
46.根据权利要求41所述的方法，其中所述药剂包含小鼠血清白蛋白(MSA)。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中将所述经修饰的免疫细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述共刺激分子是B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞不是B细胞。
52.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是B细胞。
53.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
54.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是混合细胞群体。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述免疫细胞是多种PBMC。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。
59.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHC I类和/或MHC II类表达。
60.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。
61.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。
62.根据权利要求53和56-59中任一项所述的方法，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。
63.根据权利要求53和56-59中任一项所述的方法，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。
64.根据权利要求53和56-63中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。
65.根据权利要求53和56-63中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD45RA+T细胞、CD45RO+T细胞、和γδ-T细胞。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞对所述个体而言是同种异体的。
67.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞对所述个体而言是自体的。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中将所述个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体给予佐剂。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述佐剂是IFNα或CpG ODN。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。
72.根据权利要求69或70所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。
73.根据权利要求72所述的方法，其中在给予所述佐剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
74.根据权利要求72所述的方法，其中在给予所述佐剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与免疫检查点抑制剂的给予组合。
76.根据权利要求75所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。
77.根据权利要求75所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。
78.根据权利要求77所述的方法，其中在给予所述免疫检查点抑制剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
79.根据权利要求77所述的方法，其中在给予所述免疫检查点抑制剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
80.根据权利要求75-79中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
81.根据权利要求1-80中任一项所述的方法，其中将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与化学疗法的给予组合。
82.根据权利要求81所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。
83.根据权利要求81所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。
84.根据权利要求83所述的方法，其中在给予所述化学疗法之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
85.根据权利要求83所述的方法，其中在给予所述化学疗法之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
86.根据权利要求81至85中任一项所述的方法，其中所述化学疗法包括基于铂的药剂。
87.根据权利要求81至86中任一项所述的方法，其中所述化学疗法包括顺铂。
88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。
89.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
90.根据权利要求1-89中任一项所述的方法，其中所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。
91.根据权利要求1-90中任一项所述的方法，其中所述方法包括多次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述方法包括第一次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物，然后第二次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述第二次给予是在所述第一次给予后约一个月。
94.根据权利要求1-93中任一项所述的方法，其中所述HPV相关疾病是HPV相关癌症。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述HPV相关癌症是子宫颈癌、肛门癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。
96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法，其中所述HPV相关疾病是HPV相关感染性疾病。
97.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸。
98.一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
99.一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
100.一种用于治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
101.一种用于预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
102.一种用于调节患有HPV相关疾病的个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
103.根据权利要求100-102中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
104.根据权利要求100-103中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至99％。
105.根据权利要求100-104中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
106.根据权利要求100-105中任一项所述的方法，其中所述缩窄部在通道中。
107.根据权利要求100-106中任一项所述的方法，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
108.根据权利要求86-107中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体给予佐剂。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述佐剂是IFNα或CpG ODN。
110.根据权利要求108或109所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。
111.根据权利要求108或109所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述佐剂。
112.根据权利要求111所述的方法，其中在给予所述佐剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
113.根据权利要求111所述的方法，其中在给予所述佐剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
114.根据权利要求97-113中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞进一步包含佐剂。
115.根据权利要求100-113中任一项所述的方法，其中将步骤b的所述扰动的免疫细胞与所述HPV抗原和佐剂一起孵育。
116.根据权利要求114或115所述的方法，其中所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。
117.根据权利要求114-116中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。
118.根据权利要求114-117中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的外部进一步包含HPV抗原和/或佐剂。
119.根据权利要求115-118中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
120.根据权利要求115-119中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
121.根据权利要求115-120中任一项所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
122.根据权利要求99或102所述的方法，其中所述免疫应答增强。
123.根据权利要求122所述的方法，其中针对所述HPV抗原的免疫应答增强。
124.根据权利要求114-123中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
127.根据权利要求114-126中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
128.根据权利要求97-127中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。
130.根据权利要求97-129中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
131.根据权利要求97-130中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。
132.根据权利要求97-131中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。
133.根据权利要求97-132中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
134.根据权利要求97-133中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原能够被加工成MHCII类限制性肽。
135.根据权利要求114-134中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
136.根据权利要求97-135中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。
137.根据权利要求114-136中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1与约1:10000之间。
138.根据权利要求97-137中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
140.根据权利要求138所述的方法，其中所述药剂是白蛋白。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
142.根据权利要求138所述的方法，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
143.根据权利要求138所述的方法，其中所述药剂包含MSA。
144.根据权利要求97-143中任一项所述的经修饰的T细胞，其中将所述细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。
145.根据权利要求144所述的经修饰的T细胞，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。
146.根据权利要求144或145所述的经修饰的T细胞，其中所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
147.根据权利要求97-146中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。
148.根据权利要求97-147中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞不是B细胞。
149.根据权利要求97-148中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是B细胞。
150.根据权利要求97-148中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
151.根据权利要求97-148中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是混合细胞群体。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述免疫细胞是多种PBMC。
153.根据权利要求150所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
154.根据权利要求150所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHCII类表达。
155.根据权利要求153或154所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以减少MHC I类和/或MHC II类表达。
156.根据权利要求153或154所述的方法，其中所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHC I类和/或MHC II类表达。
157.根据权利要求153或154所述的方法，其中所述T细胞包含进一步修饰以增加MHC I类和/或MHC II类表达。
158.根据权利要求153或154所述的方法，其中所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。
159.根据权利要求150和153-156中任一项所述的方法，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。
160.根据权利要求150和153-156中任一项所述的方法，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。
161.根据权利要求150和153-160中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。
162.根据权利要求150和153-160中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD45RA+T细胞、CD45RO+T细胞、和γδ-T细胞。
163.根据权利要求97-162中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞对所述个体而言是同种异体的。
164.根据权利要求97-162中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞对所述个体而言是自体的。
165.根据权利要求97-164中任一项所述的方法，其中将所述个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
166.根据权利要求97-165中任一项所述的方法，其中将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与免疫检查点抑制剂的给予组合。
167.根据权利要求166所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。
168.根据权利要求166所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。
169.根据权利要求168所述的方法，其中在给予所述免疫检查点抑制剂之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
170.根据权利要求168所述的方法，其中在给予所述免疫检查点抑制剂之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
171.根据权利要求152-156中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
172.根据权利要求97-171中任一项所述的方法，其中将包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物的给予与化学疗法的给予组合。
173.根据权利要求172所述的方法，其中同时给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。
174.根据权利要求172所述的方法，其中依序给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物和所述化学疗法。
175.根据权利要求174所述的方法，其中在给予所述化学疗法之前给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
176.根据权利要求174所述的方法，其中在给予所述化学疗法之后给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
177.根据权利要求172至176中任一项所述的方法，其中所述化学疗法包括顺铂。
178.根据权利要求97-177中任一项所述的方法，其中向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。
179.根据权利要求97-177中任一项所述的方法，其中向所述个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
180.根据权利要求97-179中任一项所述的方法，其中所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。
181.根据权利要求97-180中任一项所述的方法，其中所述方法包括多次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
182.根据权利要求181所述的方法，其中所述方法包括第一次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物，然后第二次给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物。
183.根据权利要求182所述的方法，其中所述第二次给予是在所述第一次给予后约一个月。
184.根据权利要求97-183中任一项所述的方法，其中所述HPV相关疾病是HPV相关癌症。
185.根据权利要求184所述的方法，其中所述HPV相关癌症是子宫颈癌、肛门癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。
186.一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞内包含CpG ODN和与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的HPV抗原。
187.根据权利要求166所述的组合物，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。
188.根据权利要求186或187所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原和所述CpG ODN通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原和所述CpG ODN一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原和所述CpG ODN进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
189.根据权利要求188所述的组合物，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
190.根据权利要求188或189所述的组合物，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至约99％。
191.根据权利要求188-190中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
192.根据权利要求188-191中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部在通道中。
193.根据权利要求188-192中任一项所述的组合物，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
194.根据权利要求186-193中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
195.根据权利要求186-194中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原和/或所述CpGODN存在于细胞质液和/或胞内体中。
196.根据权利要求186-195中任一项所述的组合物，其中所述抗原和/或所述CpG ODN存在于所述细胞的多个隔室中。
197.根据权利要求186-196中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的表面上进一步包含HPV抗原和/或CpG ODN。
198.根据权利要求188-197中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的CpG ODN的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
199.根据权利要求188-198中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
200.根据权利要求188-199中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与CpG ODN的比率在约10000:1至约1:10000之间。
201.根据权利要求186-200中任一项所述的组合物，其中所述CpG ODN是CpG ODN1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
202.根据权利要求186-201中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
203.根据权利要求202所述的组合物，其中所述佐剂包含CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
204.根据权利要求186-203中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。
205.根据权利要求204所述的组合物，其中所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。
206.根据权利要求186-205中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
207.根据权利要求186-206中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、与佐剂或与所述CpG ODN复合。
208.根据权利要求186-207所述的组合物，其中所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。
209.根据权利要求186-208中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是包含抗原性表位的多肽，所述抗原性表位在N末端和/或C末端侧接一个或多个异源肽序列。
210.根据权利要求186-209中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述CpG ODN。
211.根据权利要求186-210中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。
212.根据权利要求186-211中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原与所述CpG ODN的比率在约10000:1至约1:10000之间。
213.一种包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
214.根据权利要求213所述的组合物，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。
215.根据权利要求213或214所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
216.根据权利要求215所述的组合物，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
217.根据权利要求215-216中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至约99％。
218.根据权利要求215-217中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
219.根据权利要求215-218中任一项所述的组合物，其中所述缩窄部在通道中。
220.根据权利要求215-219中任一项所述的组合物，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
221.根据权利要求213-220中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
222.根据权利要求213-221中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。
223.根据权利要求213-222中任一项所述的组合物，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。
224.根据权利要求213-223中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞在所述细胞的表面上进一步包含HPV抗原和/或佐剂。
225.根据权利要求215-224中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
226.根据权利要求215-225中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
227.根据权利要求215-226中任一项所述的组合物，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原与佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
228.根据权利要求213-227中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
229.根据权利要求228所述的组合物，其中所述佐剂是CpG ODN。
230.根据权利要求229所述的组合物，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN1826或CpG ODN 2006。
231.根据权利要求213-230中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含多于一种佐剂。
232.根据权利要求213-231中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。
233.根据权利要求232所述的组合物，其中所述多种抗原的集合中的一种抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。
234.根据权利要求213-233中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列的多肽。
235.根据权利要求213-234中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原与其自身、与其他抗原、或与所述佐剂复合。
236.根据权利要求213-235所述的组合物，其中所述HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。
237.根据权利要求213-236中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。
238.根据权利要求213-237中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述HPV抗原。
239.根据权利要求213-238中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原与所述佐剂的比率在约10000:1至约1:10000之间。
240.根据权利要求186-239中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。
241.根据权利要求186-240中任一项所述的组合物，其中所述HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。
242.根据权利要求186-241中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞进一步包含一种药剂，与不包含所述药剂的相应经修饰的免疫细胞相比，所述药剂增强所述经修饰的免疫细胞的活力和/或功能。
243.根据权利要求242所述的组合物，其中所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。
244.根据权利要求242所述的组合物，其中所述药剂是白蛋白。
245.根据权利要求244所述的组合物，其中所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。
246.根据权利要求242所述的组合物，其中所述药剂是二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-谷氨酰胺、或EDTA。
247.根据权利要求242所述的组合物，其中所述药剂包含MSA。
248.根据权利要求186-247中任一项所述的组合物，其中将所述细胞进一步修饰以增加一种或多种共刺激分子的表达。
249.根据权利要求248所述的组合物，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155、或CD112。
250.根据权利要求248或249所述的组合物，其中所述细胞包含导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。
251.根据权利要求186-250中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞是T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、或造血前体细胞。
252.根据权利要求186-251中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞不是B细胞。
253.根据权利要求186-252中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞是T细胞。
254.根据权利要求253所述的组合物，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC I类表达。
255.根据权利要求253所述的组合物，其中所述T细胞包含进一步修饰以调节MHC II类表达。
256.根据权利要求254或255所述的组合物，其中所述T细胞包含进一步修饰以减少MHCI类和/或MHC II类表达。
257.根据权利要求254或255所述的组合物，其中所述进一步修饰包括使用siRNA、shRNA、CRISPR/Cas9、ZFN、TALEN、Cre重组酶或大范围核酸酶来减少MHC I类和/或MHC II类表达。
258.根据权利要求254或255所述的组合物，其中所述T细胞包含进一步修饰以增加MHCI类和/或MHC II类表达。
259.根据权利要求254或255所述的组合物，其中所述进一步修饰包括使用RNA或质粒DNA增加MHC I类和/或MHC II类表达。
260.根据权利要求253-257中任一项所述的组合物，其中与响应于在同种异体背景下给予不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答相比，响应于在同种异体背景下给予所述经进一步修饰的T细胞而在个体中产生的先天性免疫应答降低。
261.根据权利要求253-257中任一项所述的组合物，其中与不包含所述进一步修饰的相应经修饰的T细胞在被给予所述相应经修饰的T细胞的个体中的循环半衰期相比，所述经进一步修饰的T细胞在被给予所述经进一步修饰的T细胞的个体中的循环半衰期被调节。
262.根据权利要求253-261中任一项所述的组合物，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、CIK细胞和自然杀伤T细胞。
263.根据权利要求253-261中任一项所述的组合物，其中所述T细胞包括以下中的一种或多种：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD45RA+T细胞、CD45RO+T细胞、和γδ-T细胞。
264.根据权利要求186-263中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的细胞对个体而言是同种异体的。
265.根据权利要求186-263中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的细胞对个体而言是自体的。
266.根据权利要求186-265中任一项所述的组合物，其中将个体预调理以具有经调节的炎症和/或经调节的免疫应答。
267.根据权利要求186-266中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含免疫检查点抑制剂。
268.根据权利要求267所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。
269.根据权利要求186-268中任一项所述的组合物，其中向个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述HPV抗原具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和/或扩增。
270.根据权利要求186-268中任一项所述的组合物，其中向个体给予包含所述经修饰的免疫细胞的所述组合物导致对所述抗原具有特异性的辅助T(Th)细胞的激活和/或扩增。
271.根据权利要求186-270中任一项所述的组合物，其中所述有效量的所述组合物包含在约1×106个与约1×1012个之间的经修饰的免疫细胞。
272.一种包含抗原的组合物，其中所述抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。
273.根据权利要求272所述的组合物，其中所述抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
274.一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入细胞包含HPV抗原，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述佐剂进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
275.一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体给予有效量的包含经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的免疫细胞包含HPV抗原和佐剂，其中所述佐剂呈递在细胞内；
其中所述经修饰的免疫细胞通过以下方式制备：
a)使包含输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，所述输入细胞包含所述佐剂，其中所述缩窄部的直径是所述悬浮液中的输入细胞的直径的函数，从而引起所述输入细胞的扰动足够大以使所述HPV抗原通过以形成扰动的输入细胞；以及
b)将所述扰动的输入细胞与所述HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原进入所述扰动的输入细胞；
从而产生所述经修饰的免疫细胞。
276.根据权利要求274或275所述的方法，其中所述缩窄部的直径小于所述细胞的直径。
277.根据权利要求274-276中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至99％。
278.根据权利要求274-277中任一项所述的方法，其中所述缩窄部的直径是所述细胞的直径的约20％至小于约60％。
279.根据权利要求274-278中任一项所述的方法，其中所述缩窄部在通道中。
280.根据权利要求274-279中任一项所述的方法，其中当所述输入细胞通过所述缩窄部时向所述输入细胞施加变形力。
281.根据权利要求274-280中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原和/或所述佐剂存在于细胞质液和/或胞内体中。
282.根据权利要求274-281中任一项所述的方法，其中所述抗原和/或佐剂存在于所述细胞的多个隔室中。
283.根据权利要求274所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的佐剂的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
284.根据权利要求275所述的方法，其中与所述扰动的输入细胞一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。
285.根据权利要求274-285中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂或聚I:C。
286.根据权利要求285所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN。
287.根据权利要求286所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
288.根据权利要求274-287中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原源自细胞裂解物。
289.根据权利要求274-288中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是HPV-16或HPV-18抗原。
290.根据权利要求274-289中任一项所述的方法，其中所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。
291.根据权利要求290所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
292.根据权利要求289所述的方法，其中所述HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。
293.根据权利要求290所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列。
294.根据权利要求290所述的方法，其中所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
295.一种用于治疗或预防个体的HPV相关疾病的方法，其包括向所述个体给予与HPV抗原关联的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞通过包括以下步骤的方法制备：
a)将输入细胞与所述HPV抗原和/或佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述HPV抗原与所述输入细胞关联；
从而产生与所述抗原相关联的所述经修饰的免疫细胞。
296.根据权利要求295所述的方法，其中所述HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。
297.根据权利要求296所述的方法，其中所述HPV抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
298.根据权利要求295-297中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG ODN。
299.根据权利要求298所述的方法，其中所述CpG ODN是CpG ODN 1018、CpG ODN 1826或CpG ODN 2006。
300.一种包含根据权利要求186-273中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其用作药剂。
301.一种包含根据权利要求186-273中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其用于通过手术、疗法或诊断治疗人体或动物体的方法。
302.一种包含根据权利要求186-273中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其用于治疗癌症、感染性疾病或病毒相关疾病。
303.一种包含根据权利要求186-273中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述癌症是头颈癌、子宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌或唾液腺癌。
304.一种包含根据权利要求300-303中任一项所述的经修饰的免疫细胞的组合物，其中所述经修饰的PBMC在给予免疫检查点抑制剂之前、同时或之后给予。
305.根据权利要求304所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、VISTA、和TIM-3。
306.根据权利要求305所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。
307.根据权利要求305所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。
308.根据权利要求300-307中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的PBMC在给予治疗剂之前、同时或之后给予。
309.根据权利要求308所述的组合物，其中所述治疗剂是化学治疗剂。
310.根据权利要求309所述的组合物，其中所述感染性疾病与HIV、HPV、EBV、MCV、HBV或HCV相关。
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