JP2023535982A - 無核細胞を使用して変異型Ｒａｓに対する免疫応答を刺激する方法 - Google Patents
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Abstract
本出願は、変異型Ｒａｓ抗原（例えば、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原）を含む無核細胞、変異型Ｒａｓ抗原を含むかかる無核細胞を製造する方法、並びにＲａｓ変異に関連するがんを有する個体の免疫応答を刺激する、治療する、及び／又はワクチン接種するために、かかる修飾無核細胞を使用する方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法を提供する。
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関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２９日に出願された米国仮出願第６３／０５８，４３８号に対する優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年７月２９日に出願された米国仮出願第６３／０５８，４３８号に対する優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：７５０３２２００２７４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年７月２８日、サイズ：５ＫＢ）。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：７５０３２２００２７４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年７月２８日、サイズ：５ＫＢ）。
本開示は、概して、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞、かかる無核細胞由来小胞を製造する方法、及び変異型Ｒａｓタンパク質に関連するがんを治療するためにかかる無核細胞由来小胞を使用する方法に関する。
Ｒａｓは、最もよく知られているがん原遺伝子のうちの１つである。その機能獲得変異は、全てのヒトがんの約３０％で発生する。最も頻繁な変異Ｒａｓアイソフォームとして、Ｋ－Ｒａｓは過去数年間集中的に研究されてきた。がん悪性腫瘍においてその重要性が広く認識されているにもかかわらず、過去３０年間における継続的な努力は、Ｋ－Ｒａｓ変異がんに対する治療法の開発に失敗しており、これまでにそのような悪性腫瘍に対する治療法は承認されていない。したがって、Ｋ－Ｒａｓは新薬の開発に繋がらないと考えられてきた。
Ｒａｓスーパーファミリーのメンバーは、その構造、配列、及び機能に基づいて、ファミリー及びサブファミリーに分けられる。Ｋ－Ｒａｓは、Ｒａｓスーパーファミリー又はＲＡＳ様ＧＴＰａｓｅとして知られる小さなグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合タンパク質の群に属する。ヒトにおいて、３つのＲＡＳ遺伝子は、高度に相同なＲＡＳタンパク質、Ｈ－Ｒａｓ、Ｎ－Ｒａｓ、及びＫ－Ｒａｓをコードする。Ｋ－Ｒａｓは、一連のシグナル伝達分子の活性化を開始し、細胞表面から核へのシグナル伝達シグナルの伝達を可能にし、細胞分化、成長、走化性、アポトーシスなどの一連の必須な細胞プロセスに影響を与える、最前線のセンサのうちの１つである。Ｋ－Ｒａｓアイソフォームは、最も頻繁に変異されるアイソフォームであり、ＲＡＳ変異の８６％を構成する。Ｋ－Ｒａｓアイソフォーム内には、２つの既知のアイソフォームスプライスバリアント：Ｋ－Ｒａｓ４Ａ及びＫ－Ｒａｓ４Ｂが存在する。Ｋ－Ｒａｓ４Ｂスプライスバリアントは、ヒトのがんにおける変異を伴う優勢なアイソフォームであり、それは膵臓がんの約９０％、結腸がんの３０％～４０％、肺がんの１５％～２０％、主に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に存在する（Ｌｉｕ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ，２０１９，９（５）：８７１－８７９）。胆道の悪性腫瘍、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、肝臓がん、骨髄性白血病、及び乳がんにも存在する。その有病率にもかかわらず、ＲＡＳ標的療法の発見における数十年にわたる努力は、臨床的に承認された薬剤を生産することを繰り返し失敗してきた。
免疫療法は、受動的介入と能動的介入の２つの主なタイプに分けられる。受動的プロトコルには、予め活性化された及び／若しくは操作された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）、疾患特異的な治療用抗体、並びに／又はサイトカインの投与が含まれる。活性免疫療法戦略は、インビボで免疫系エフェクター機能を刺激することを目的としている。現在のいくつかの活性プロトコルには、疾患関連ペプチド、可溶化物、又は同種異系の全細胞によるワクチン接種戦略、腫瘍抗原送達用のビヒクルとしての自己樹状細胞（ＤＣ）の注入、及び免疫チェックポイントモジュレータの注入が含まれる。Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ， Ｎｉｋｏｓ Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４．１４（２０１６）を参照されたい。養子免疫療法は、免疫応答を調節し、抗腫瘍活性を増強し、Ｒａｓ変異に関連するがんを治療又は予防するという目標を達成するために利用することができる。
疾患関連抗原によって刺激されるＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、疾患細胞を標的とし、破壊する潜在性を有するが、内因性Ｔ細胞応答を誘導するための現在の方法は、課題に直面している。本明細書に記載される方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む有核細胞をハイスループット様式で効率的に生成するために使用され、これは、変異型Ｒａｓ抗原に対する強固なＴ細胞応答を誘導する際に利用することができる。
特許出願及び刊行物を含む本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。特許公開ＷＯ２０１６／０７０１３６、ＵＳ２０１８／０１４２１９８、ＷＯ２０１７／００８０６３、ＵＳ２０１８／０２０１８８９、ＷＯ２０１９／１７８００５、及びＷＯ２０１９／１７８００６、並びにＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０１９４は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
疾患関連抗原によって刺激されるＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、疾患細胞を標的とし、破壊する潜在性を有するが、内因性Ｔ細胞応答を誘導するための現在の方法は、課題に直面している。本明細書に記載される方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む有核細胞をハイスループット様式で効率的に生成するために使用され、これは、変異型Ｒａｓ抗原に対する強固なＴ細胞応答を誘導する際に利用することができる。
特許出願及び刊行物を含む本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。特許公開ＷＯ２０１６／０７０１３６、ＵＳ２０１８／０１４２１９８、ＷＯ２０１７／００８０６３、ＵＳ２０１８／０２０１８８９、ＷＯ２０１９／１７８００５、及びＷＯ２０１９／１７８００６、並びにＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０１９４は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
Ｌｉｕ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ，２０１９，９（５）：８７１－８７９
Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ， Ｎｉｋｏｓ Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４．１４（２０１６）
いくつかの態様では、本発明は、個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、個体において腫瘍成長を低減させるための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、ワクチン接種を必要とする個体にそれを実施するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。いくつかの態様では、本発明は、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含む方法であって、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原、変異型Ｈ－Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｎ－Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ａ抗原又は変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ｂ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する単一のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープ及び１つ以上の異種性ペプチド配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、他の抗原又はアジュバントと複合体化する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２抗原のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接する１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、無核細胞が、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物が、アジュバントと併せて投与される。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、により調製される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、複数のインプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、無核細胞が、赤血球又は血小板である。いくつかの実施形態では、無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞を含む組成物が、複数回投与される。いくつかの実施形態では、組成物が、静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、組成物が、別の療法の投与の前に、同時発生的に、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される、化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである。
いくつかの態様では、本発明は、無核細胞由来小胞を含む組成物であって、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である。
いくつかの態様では、本発明は、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物であって、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、により調製される、組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物であって、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、核酸が、変異型Ｒａｓ抗原を発現し、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、組成物を提供する。いくつかの態様では、本発明は、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物であって、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される。
本明細書に記載の組成物のいくつかの実施形態では、インプット無核細胞が、赤血球又は血小板である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、赤血球由来小胞又は血小板由来小胞である。いくつかの実施形態では、レチクロサイト由来小胞又はエリスロサイト由来小胞である。
本明細書に記載される組成物のいくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原、変異型Ｈ－Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｎ－Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ａ抗原又は変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ｂ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する単一のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、他の抗原又はアジュバントと複合体化する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９抗原、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２抗原のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接する１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。
本明細書に提示される組成物のいくつかの実施形態では、組成物が、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である。
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかで使用するためのキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物のいずれか１つを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットが、組成物を個体に投与して、変異型Ｒａｓに対する免疫反応を刺激する、腫瘍成長を低減させる、及び／又はがんを治療するための指示を伴う、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、又は添付文書のうちの１つ以上を更に含む。
いくつかの態様では、本発明は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生産するための方法であって、方法が、変異型Ｒａｓ抗原を細胞内で無核細胞由来小胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、無核細胞が、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ及びアジュバントを細胞内で無核細胞由来小胞に導入することが、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を細胞内で無核細胞由来小胞に導入することが、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、核酸が、変異型Ｒａｓ抗原を発現し、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞を生成する、インキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、細胞内にアジュバントを更に含み、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを細胞内で無核細胞に導入することが、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、を含む。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、複数のインプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される。
いくつかの態様では、本発明は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）を含む組成物を個体に投与することを含む、Ｒａｓ変異に関連するがんを治療若しくは予防する、及び／又はＲａｓ変異に関連するがんを有する個体において免疫応答を刺激するための方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、Ｒａｓ変異に関連するがんを治療する、及び／又はＲａｓ変異に関連するがんを有する個体において免疫応答を刺激するための方法を提供し、方法は、細胞内に送達される有効量の変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に最初に通過させることによって調製され、狭窄部の直径は、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成し、次いで、変異型Ｒａｓ抗原が摂動インプット細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原とインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する。本開示の特定の態様は、細胞内に送達される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物を生成するための方法であって、インプット無核細胞が、狭窄部を通過し、狭窄が細胞を変形させ、それにより、Ｒａｓ抗原及び／又はアジュバントが無核細胞に入るように、細胞の摂動を引き起こし、それにより、Ｒａｓ抗原及び／又はアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、方法に関する。
いくつかの態様では、本発明は、無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含む、Ｒａｓ変異に関連するがん（Ｋ－Ｒａｓ変異に関連するがんなど）を治療する若しくは予防する、及び／又はＲａｓ変異に関連するがんを有する個体における免疫応答を調節するための方法であって、無核細胞由来小胞が、細胞内に変異Ｒａｓ抗原を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、Ｒａｓ変異に関連するがんを治療する若しくは予防する、及び／又はＲａｓ変異に関連するがんを有する個体において免疫応答を調節するための方法を提供し、方法は、有効量の変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、細胞内に変異型Ｒａｓ抗原を含み、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に最初に通過させることによって調製され、狭窄部の直径は、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成し、次いで、変異型Ｒａｓ抗原が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原とインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する。本開示の特定の態様は、無核細胞由来小胞を含む組成物を生成するための方法であって、インプット無核細胞が、狭窄部を通過し、狭窄がインプット無核細胞を変形させ、それにより、Ｒａｓ抗原が摂動インプット無核細胞に入るように、インプット無核細胞の摂動を引き起こし、それにより、Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、方法に関する。いくつかの更なる実施形態では、Ｒａｓ変異に関連するがんを治療する、及び／又はＲａｓ変異に関連するがんを有する個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法は、個体にアジュバントを投与することを更に含む。
一般的な手法
一般的な手法
本明細書で説明又は参照される技術及び手順は、一般的に十分に理解されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．，１９９５）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，１９８８）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１０）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９３－８）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９６）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００２）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，２００４）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、及びＣａｎｃｅｒ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，２０１１）に記載される広範に利用されている方法論など、当業者によって従来の方法論を使用して一般的に利用される。
定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用されるが、適切な場合には、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆も同様である。以下に記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合、上記に定める定義が優先するものとする。
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用されるが、適切な場合には、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆も同様である。以下に記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合、上記に定める定義が優先するものとする。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段の指示がない限り、複数の参照を含む。
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びにその他の類似の形態、及びそれらの文法的等価物は、意味が同等であり、これらの用語のいずれか１つに続く項目又は複数の項目が、かかる項目又は複数の項目の網羅的なリストであることを意味するものではなく、又は列挙された項目又は複数の項目のみに限定されることを意味するという点で、オープンエンドであることを意図している。例えば、成分Ａ、Ｂ、及びＣを含む物品は、成分Ａ、Ｂ、及びＣから成り得るか（すなわち、それのみを含む）、又は成分Ａ、Ｂ、及びＣだけでなく、１つ以上の他の成分も含み得る。そのため、「含む」及び同様の形態、並びにその文法的等価物は、「から本質的に成る」又は「から成る」の実施形態の開示を含むことが意図され、理解される。
値の範囲が提供される場合、文脈が別段に明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在する値は、その範囲の上限及び下限、並びにその範囲内の他の記載された値又は介在する値の間の値が、記載された範囲内の特定の除外限界に従うことを条件として、本開示内に包含されることが理解される。記載された範囲が制限の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる制限のいずれか又は両方を除外する範囲も開示に含まれる。
本明細書で使用される「約」という用語は、当技術分野の当業者に容易に認識されるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値又はパラメータの「約」への言及は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（及び説明する）。例えば、「約Ｘ」を参照する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本明細書で使用される場合、「無核細胞」は、核を欠く細胞を指す。そのような細胞には、血小板、エリスロサイト及びレチクロサイトなどの赤血球（ＲＢＣ）が含まれるが、これらに限定されない。レチクロサイトは、未成熟（例えば、まだ両凹ではない）の赤血球であり、典型的には人体における赤血球の約１％を構成する。レチクロサイトも無核である。特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステム及び方法は、無核細胞（例えば、ＲＢＣ、レチクロサイト、及び／又は血小板）の濃縮（例えば、全細胞集団のうち、自然界に見られるよりも大きなパーセンテージを含む）、精製、又は単離された（例えば、それらの自然環境から、実質的に純粋又は均一な形態で）集団の治療及び／又は処理のために使用される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステム及び方法は、ＲＢＣ（例えば、エリスロサイト又はレチクロサイト）、血小板、及び他の血球を含む全血の治療並びに／又は処理に使用される。これらの細胞型の精製又は濃縮は、密度勾配システム（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気細胞選別、又は赤芽球及び赤血球系前駆体のインビトロ分化などの既知の方法を使用して達成される。
本明細書で使用される「ベシクル」という用語は、脂質二重層によって囲まれた液体を含む構造を指す。いくつかの例では、脂質二重層は、天然に存在する脂質組成物に由来する。いくつかの例では、脂質二重層は、細胞膜から供給され得る。いくつかの例では、小胞は、細胞などの様々な種類の実体に由来し得る。こうした例では、小胞は、元の実体からの分子（細胞内タンパク質又は膜成分など）を保持することができる。例えば、赤血球に由来する小胞は、赤血球及び／又は赤血球の膜成分中にあった任意の数の細胞内タンパク質を含み得る。いくつかの例では、小胞は、所望のペイロードに加えて、細胞内に任意の数の分子を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「ペイロード」は、無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）内に負荷されるなど、送達される物質を指す。「ペイロード」、「カーゴ」、「送達物質」、及び「化合物」は、本明細書では互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ペイロードは、タンパク質、低分子、核酸（例えば、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）、脂質、炭水化物、巨大分子、ビタミン、ポリマー、蛍光色素及びフルオロフォア、カーボンナノチューブ、量子ドット、ナノ粒子、並びにステロイドを指し得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、タンパク質又は低分子薬剤を指し得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つ以上の化合物を含み得る。
本明細書で使用される「細孔」という用語は、材料内の穴、裂け目、空洞、隙間、切れ目、間隙、又は穿孔を含むがこれらに限定されない開口部を指す。いくつかの例では、（示されている場合）用語は、本開示の表面内の細孔を指す。他の例では、（示されている場合）細孔は、細胞膜の細孔を指すことができる。
本明細書で使用される「膜」という用語は、細孔を含む選択的バリア又はシートを指す。用語は、境界又は内張として作用する、柔軟なシート様構造を含む。いくつかの例では、用語は、細孔を含む表面又はフィルタを指す。用語は、「細胞膜」という用語とは異なる。
本明細書で使用される「フィルタ」という用語は、細孔を選択的に通過することが可能である多孔性物品を指す。いくつかの例では、用語は、細孔を含む表面又は膜を指す。
「異種」という用語は、それがコード配列及び制御配列などの核酸配列に関連し、通常は一緒に連結されない、及び／又は特定の細胞と通常は関連しない配列を意味する。したがって、核酸構築物又はベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内又は別の核酸分子と付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然ではコード配列と関連して見出されない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞内に通常存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的では異種とみなされる。対立遺伝子変異又は自然に発生する変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ＤＮＡを生じさせない。
「異種」という用語は、それがペプチド配列及びポリペプチド配列などのアミノ酸配列に関連し、通常は一緒に連結されない、及び／又は特定の細胞と通常は関連しない配列を意味する。したがって、ペプチド配列の「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない、別のアミノ酸分子内又は別のアミノ酸分子と付着したアミノ酸のセグメントである。例えば、ペプチド構築物の異種領域は、天然ではペプチドのアミノ酸配列と関連して見出されない配列が隣接するペプチドのアミノ酸配列を含み得る。異種性ペプチド配列の別の例は、ペプチド配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、天然遺伝子とは異なるコードされたアミノ酸を有する合成配列）。同様に、細胞内に通常存在しないアミノ酸構築物を発現するベクターで形質転換された細胞は、本発明の目的では異種とみなされる。対立遺伝子変異又は自然に発生する変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ペプチドを生じさせない。
細胞又は細胞由来小胞に関する抗原又はアジュバントなどの薬剤に関連して使用される場合の「外因性」という用語は、細胞の外側の薬剤又は細胞の外側から細胞内に送達される薬剤を指す。細胞は、既に存在する薬剤を有してもよく、又は有しなくてもよく、外因性薬剤が送達された後、薬剤を産生してもよく、又は産生しなくてもよい。
本明細書で使用される「相同」という用語は、同じ生物に由来する分子を指す。いくつかの例では、用語は、所与の生物内で通常見出されるか、若しくは発現される、核酸又はタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療する」は、臨床結果を含む、有益な又は望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益又は望ましい臨床結果には、疾患に起因する１つ以上の症状を緩和する、疾患の程度を軽減する、疾患を安定化する（例えば、疾患の悪化を予防する若しくは遅延する）、疾患の蔓延（例えば、転移）を予防する若しくは遅延する、疾患の再発を予防する若しくは遅延する、疾患の進行を遅延する若しくは遅らせる、疾患の状態を回復する、疾患を（部分的又は完全に）寛解する、疾患を治療するために必要な１つ以上の他の薬物の用量を低減する、疾患の進行を遅延する、生活の質を増加する又は改善する、体重増加が増加する、及び／又は生存期間が延長する、のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。また、「治療」には、がんの病理学的結果（例えば、腫瘍体積など）の減少も包含される。本発明の方法は、治療のこれらの態様のうちのいずれか１つ以上を企図する。
本明細書で使用される場合、「予防的治療」という用語は、個体が、障害を有するか、又は障害を有するリスクがあることが知られているか、又は疑われるが、障害の症状又は最小限の症状を呈していない治療を指す。予防的治療を受ける個体は、症状の発症前に治療され得る。いくつかの実施形態では、個体は、それらが前がん病変、特に、Ｒａｓ変異を伴う前がん病変を有する場合に治療され得る。
本明細書で使用される場合、「併用療法」とは、第１の薬剤が別の薬剤と併せて投与されることを意味する。「と併せて」とは、同じ個体への本明細書に記載される免疫抱合体の投与に加えて、本明細書に記載される有核細胞の組成物の投与など、別の治療モダリティに加えて１つの治療モダリティの投与を指す。したがって、「と併せて」とは、個体への他の治療モダリティの送達前、送達中、又は送達後に、１つの治療モダリティを投与することを指す。
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、併用療法における第１の療法及び第２の療法が、約１０分、５分、又は１分以下のうちのいずれかなど、約１５分以下の時間間隔で投与されることを意味する。第１及び第２の療法が同時に投与される場合、第１及び第２の療法は、同じ組成物中（例えば、第１及び第２の療法の両方を含む組成物）又は別個の組成物中（例えば、一方の組成物中に第１の療法が含まれ、別の組成物中に第２の療法が含まれる）に含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「連続的投与」という用語は、併用療法における第１の療法及び第２の療法が、約２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、又はそれ以上のうちのいずれかを超えるなど、約１５分を超える時間間隔で投与されることを意味する。第１の療法又は第２の療法のいずれかが最初に投与され得る。第１及び第２の療法は、同じ若しくは異なるパッケージ又はキットに含まれ得る別個の組成物中に含まれる。
本明細書で使用される場合、「同時発生的投与」という用語は、併用療法における第１の療法及び第２の療法の投与が互いに重複することを意味する。
がんの文脈において、「治療する」という用語は、がん細胞を死滅させること、がん細胞の成長を阻害すること、がん細胞の複製を阻害すること、全体的な腫瘍負荷を軽減すること、及び疾患に関連する１つ以上の症状を回復することのうちのいずれか又は全てを含む。
本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、特定の標的の存在又は活性を変化させる、改変する、変更する、又はさもなければ修正する作用を指し得る。例えば、免疫応答を調節することは、免疫応答を変化させる、改変する、変更する、又はさもなければ修正することをもたらす任意の作用を指し得る。いくつかの例では、「調節」は、特定の標的の存在又は活性を増強することを指す。いくつかの例では、「調節」は、特定の標的の存在又は活性を抑制することを指す。他の例では、核酸の発現を調節することには、核酸の転写の変化、ｍＲＮＡ量の変化（例えば、ｍＲＮＡ転写の増加）、ｍＲＮＡの分解の対応する変化、ｍＲＮＡ翻訳の変化などを含み得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「阻害する」という用語は、特定の標的の存在又は活性を遮断、低減、排除、又はさもなければ拮抗する作用を指し得る。阻害は、部分的阻害又は完全阻害を指し得る。例えば、免疫応答を阻害することは、免疫応答の遮断、低減、排除、又は任意の他の拮抗作用をもたらす任意の作用を指し得る。他の例では、核酸の発現の阻害には、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害、遺伝子編集などが含まれるが、これらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現の阻害は、タンパク質をコードする核酸の転写の減少、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の減少、タンパク質の翻訳の阻害、タンパク質の安定性の減少などを含み得るが、これらに限定されない。別の実施例では、阻害は、例えば、腫瘍細胞の成長を遅延させるか、若しくは防止するなど、成長を緩徐化させるか、又は停止する作用を指し得る。
本明細書で使用される場合、「抑制する」という用語は、特定の標的の存在又は活性を低減する、減少する、妨げる、制限する、軽減する、又はさもなければ縮小する作用を指し得る。抑制は、部分的抑制又は完全な抑制を指し得る。例えば、免疫応答を抑制することは、免疫応答を減少する、低減する、妨げる、制限する、軽減する、又はさもなければ縮小することをもたらす任意の作用を指し得る。他の例では、核酸の発現の抑制には、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害などが含まれるが、これらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現の抑制は、タンパク質をコードする核酸の転写の減少、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の減少、タンパク質の翻訳の阻害、タンパク質の安定性の減少などを含み得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増強する」という用語は、特定の標的の存在又は活性を向上する、ブーストする、高める、又はさもなければ増加する作用を指し得る。例えば、免疫応答を増強することは、免疫応答を向上する、ブーストする、高める、又はさもなければ増加することをもたらす任意の作用を指し得る。例示的な一例では、免疫応答を増強することは、抗原及び／又はアジュバントを利用して、免疫応答を改善する、ブーストする、高める、又はさもなければ増加することを指し得る。他の例では、核酸の発現を増強することには、核酸の転写の増加、ｍＲＮＡ量の増加（例えば、ｍＲＮＡ転写の増加）、ｍＲＮＡの分解の低減、ｍＲＮＡ翻訳の増加などが含まれるが、これらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現を増強することは、タンパク質をコードする核酸の転写の増加、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の増加、タンパク質の翻訳の増加、タンパク質の安定性の増加などを含み得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「誘導する」という用語は、結果を開始する、促進する、刺激する、確立する、又はさもなければ産生する作用を指し得る。例えば、免疫応答を誘導することは、所望の免疫応答を開始する、促進する、刺激する、確立する、又はさもなければ産生することをもたらす任意の作用を指し得る。他の例では、核酸の発現を誘導することには、核酸の転写の開始、ｍＲＮＡの翻訳の開始などが含まれるが、これらに限定されない。他の例では、タンパク質の発現を誘導することは、タンパク質をコードする核酸の転写の増加、タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の増加、タンパク質の翻訳の増加、タンパク質の安定性の増加などを含み得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、プリン及びピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、若しくは複数鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はポリマーが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖及びリン酸基（典型的にはＲＮＡ又はＤＮＡに見出される）、又は修飾若しくは置換された糖若しくはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシンなどの反復単位（すなわち、ペプチド核酸）を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミデート及びホルフォルチオエートなどの合成サブユニットのポリマーを含むことができ、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ－ＮＨ２）又は混合ホスホロチオエート－ホスホロジエステルオリゴマー又は混合ホスホルアミデート－ホスホジエステルオリゴマーであり得る。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニーリングするか、又は適切なプライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖をデノボ合成するかのいずれかにより化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から取得することができる。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小の長さに限定されない。アミノ酸残基のかかるポリマーは、天然又は非天然のアミノ酸残基を含み得、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及び多量体を含むが、これらに限定されない。完全長タンパク質及びその断片の両方が定義によって包含される。用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含まれる。更に、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然の配列に対して、欠失、付加、及び置換（一般的に天然では保存的）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的変異誘導を介してのように意図的であってもよく、又は例えば、タンパク質を産生する宿主の変異又はＰＣＲ増幅によるエラーを介してなど、偶発的であってもよい。
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫反応を調節及び／又は生成する物質を指す。概して、アジュバントは抗原と併せて投与され、抗原単独と比較して抗原に対する免疫反応の増強をもたらす。様々なアジュバントが本明細書に記載される。
本明細書における「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド」及び「ＣｐＧ ＯＤＮ」という用語は、リン酸によって分離されたシトシン及びグアニンのジヌクレオチド（本明細書では「ＣｐＧ」ジヌクレオチド、又は「ＣｐＧ」とも称される）を含む、１０～３０ヌクレオチドの長さのＤＮＡ分子を指す。本開示のＣｐＧ ＯＤＮは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。すなわち、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンはメチル化されない（すなわち、５－メチルシトシンではない）。ＣｐＧ ＯＤＮは、部分的又は完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有し得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」又は「薬理学的に適合する」とは、生物学的又はさもなければ望ましくないものではない物質を意味し、例えば、物質は、重大な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又はそれが含まれる組成物の他の成分のうちのいずれかと有害な様式で相互作用することなく、患者に投与される薬学的組成物に組み込まれ得る。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、毒性及び製造試験の必要な基準を満たしており、及び／又は米国食品医薬品局によって準備された不活性成分ガイドに含まれることが好ましい。
本明細書に記載される構造的及び機能的特徴のいずれについても、これらの特徴を決定する方法は当技術分野で公知である。
本明細書で使用される場合、「マイクロ流体システム」は、少量（例えば、ｍ￥Ｌ、ｎＬ、ｐＬ、ｆＬ）の流体が処理されて、少量の液体の別個の処理を達成するシステムを指す。本明細書に記載される特定の実施には、多重化、自動化、及びハイスループットスクリーニングが含まれる。流体（例えば、緩衝液、溶液、ペイロード含有溶液、又は細胞懸濁液）は、移動、混合、分離、又は別の方法で処理することができる。本明細書に記載される特定の実施形態では、マイクロ流体系を使用して、緩衝液中に懸濁された細胞に機械的狭窄を適用し、細胞内に摂動を誘発し（例えば、穴）、それによってペイロード又は化合物が細胞のサイトゾルに入ることを可能にする。
本明細書で使用される場合、「狭窄部」は、入口部分、中心点、及び出口部分によって画定されるマイクロ流体チャネルの一部分を指し得、中心点は、幅、長さ、及び深さによって画定される。他の実施例では、狭窄部は、細孔を指してもよく、又は細孔の一部分であってもよい。細孔は、表面（例えば、フィルタ及び／又は膜）上に含まれ得る。
本明細書で使用される「Ｒａｓ」という用語は、Ｒａｓスーパーファミリー又はＴａｓ様ＧＴＰアーゼとして知られる小さなグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合タンパク質の群の任意のメンバーを指し、特に明記しない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などを含む全ての相同体が含まれる。用語は、「完全長」のプロセシングされていないＲａｓだけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のＲａｓも包括する。用語はまた、Ｒａｓの野生型発生アイソフォームバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。ヒトにおいて、３つのＲａｓ遺伝子は、高度に相同なＲａｓタンパク質、Ｈ－Ｒａｓ、Ｎ－Ｒａｓ、及びＫ－Ｒａｓをコードする。Ｋ－ＲＡＳには、２つの形態：Ｋ－ＲａｓＡ及びＫ－ＲａｓＢが含まれる。ヒトＫ－Ｒａｓのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受入番号 Ｐ０１１１６（バージョン２４１）に示されている。詳細には、ヒトＫ－Ｒａｓアイソフォームａ（Ｋ－Ｒａｓ４Ａとして知られる）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受入番号 Ｐ０１１１６－１（バージョン２４１）及びＮＣＢＩ（ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿２０３５２４．１に示されている。ヒトＫ－Ｒａｓアイソフォームｂ（Ｋ－Ｒａｓ４Ｂとして知られる）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受入番号 Ｐ０１１１６－２（バージョン２４１）及びＮＣＢＩ（ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４９７６．２に示されている。ヒトＫ－ＲａｓのＮ末端ドメインは、アミノ酸１位から８６位まで延在する。
本明細書に記載される構造的及び機能的特徴のいずれについても、これらの特徴を決定する方法は当技術分野で公知である。
Ｒａｓ変異に関連する疾患の治療方法
いくつかの態様では、個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内（すなわち、小胞内）で無核細胞由来小胞に送達される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。
いくつかの態様では、個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内（すなわち、小胞内）で無核細胞由来小胞に送達される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。
いくつかの態様では、個体において腫瘍成長を低減させるための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。
いくつかの態様では、ワクチン接種を必要とする個体にそれを実施するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。
いくつかの態様では、個体においてがんを治療するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含む。
いくつかの態様では、個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、ｃ）有効量の変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を個体に投与することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、個体において腫瘍成長を低減させるための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、ｃ）有効量の変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を個体に投与することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、ワクチン接種を必要とする個体にそれを実施するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、ｃ）有効量の変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を個体に投与することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、個体においてがんを治療するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、ｃ）有効量の変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を個体に投与することと、を含む、方法を提供する。
本明細書に記載の方法、使用、又は組成物のいずれかによるいくつかの実施形態では、方法は、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原とインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成することと、ｃ）有効量の変異Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を個体に投与することと、を含む。
本明細書に記載の方法、使用、又は組成物のいずれかによるいくつかの実施形態では、方法は、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、核酸が、変異型Ｒａｓ抗原を発現し、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、を含む。
本明細書に記載の方法、使用、又は組成物のいずれかによるいくつかの実施形態では、方法は、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、を含む。
いくつかの実施形態では、個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための組成物が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍成長を低減させるための組成物が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。いくつかの実施形態では、個体においてがんを治療するための組成物が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである。
いくつかの実施形態では、個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための組成物が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍成長を低減させるための組成物が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。いくつかの実施形態では、個体においてがんを治療するための組成物が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓに対する免疫応答を刺激するための薬物の製造における有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物の使用が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、個体において腫瘍成長を低減させるための薬物の製造における有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物の使用が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。いくつかの実施形態では、個体においてがんを治療するための薬物の製造における有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物の使用が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓに対する免疫応答を刺激するための薬物の製造における有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物の使用が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、個体において腫瘍成長を低減させるための薬物の製造における有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物の使用が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。いくつかの実施形態では、個体においてがんを治療するための薬物の製造における有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物の使用が提供され、組成物は、有効量の本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物のうちのいずれか１つを含む。
本明細書に記載される方法、使用、又は組成物によるいくつかの実施形態では、個体は、がんを有する。いくつかの実施形態では、がんは、膵臓がん、結腸がん、肺がん（非小細胞肺がんを含むが、これらに限定されない）、胆道がん、膀胱がん、肝臓がん、骨髄性白血病、及び乳がんである。いくつかの実施形態では、がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである。いくつかの実施形態では、がんは、固形がんである。いくつかの実施形態では、がんは、液体がんである。いくつかの実施形態では、がんは、血液がんである。いくつかの実施形態では、がんは、Ｒａｓ変異に関連するがんである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、Ｒａｓ変異に関連するがんに見出されるがん抗原である。いくつかの実施形態では、がんは、局在性がんである。いくつかの実施形態では、がんは、転移性がんである。
いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、又は約６０％～約７０％のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ～約４μｍ、約１μｍ～約４μｍ、約１．２μｍ～約３μｍ、約１．４μｍ～約２．６μｍ、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．２μｍ、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、２．２μｍ、２．４μｍ、２．６μｍ、２．８μｍ、３．０μｍ、３．２μｍ、３．４μｍ、３．６μｍ、３．８μｍ、４．０μｍ、４．２μｍ、４．４μｍ、４．６μｍ、４．８μｍ、５．０μｍ、５．２μｍ、５．４μｍ、５．６μｍ、５．８μｍ、６．０μｍ以下のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される。
いくつかの実施形態では、無核細胞が、ＲＢＣ又は血小板である。いくつかの実施形態では、無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、ＲＢＣ由来小胞又は血小板由来小胞である。いくつかの実施形態では、エリスロサイト由来小胞又はレチクロサイト由来小胞である。
いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、アジュバントを含み、条件付けするのに使用されるアジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）である。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープ及び１つ以上の異種性ペプチド配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、他の抗原又はアジュバントと複合体化する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接する１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接しない１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２抗原のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の類似性のうちのいずれか１つを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。
いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の複数回の投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の約３回～約９回の投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５回の投与のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、方法は、必要に応じて変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の連続した投与を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の２回の逐次投与の間の時間間隔は、約１日～約３０日の間である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の２回の逐次投与の間の時間間隔は、約２１日である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の２回の逐次投与の間の時間間隔は、約１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又は１５０日のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の最初の２回の逐次投与の間の時間間隔は、１日又は２日である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の最初の２回の逐次投与の間の時間間隔は、１日又は２日であり、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の２回を超える（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回、又はそれ以上の投与であるが、これらに限定されない）投与を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、静脈内、腫瘍内、及び／又は皮下に投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、静脈内に投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ポリＩ：Ｃである。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及びアジュバントが、同時に投与される。いくつかの実施形態では、変異Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及びアジュバントが、連続して投与される。いくつかの実施形態では、アジュバント及び／又は変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、静脈内、腫瘍内、及び／又は皮下に投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含むアジュバント及び／又は無核細胞由来小胞は、静脈内に投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、アジュバントを投与する前に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、アジュバントの投与前の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、アジュバントの投与前の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、アジュバントの投与前の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、アジュバントの投与後に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、アジュバントの投与後の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、アジュバントの投与後の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、アジュバントの投与後の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
いくつかの実施形態では、個体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、又はＨＬＡ－Ｃ＊１６の発現について陽性である。
本明細書に記載される方法、使用、又は組成物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、治療剤の投与の前に、同時発生的に、又は後に投与される。いくつかの実施形態では、治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法、又は放射線療法のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、治療剤は、１つ以上のサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、治療剤は、１つ以上の抗体を含む。いくつかの実施形態では、治療剤は、免疫腫瘍学で使用される１つ以上の二重特異性ポリペプチド（例えば、免疫抱合体）を含む。
免疫チェックポイントは、免疫系の調節因子であり、免疫応答を抑制する。免疫チェックポイント阻害剤を使用して、免疫応答の増強を促進することができる。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び免疫チェックポイント阻害剤は、同時に投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び免疫チェックポイント阻害剤は、連続して投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤及び／又は変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、静脈内、腫瘍内、及び／又は皮下に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤及び／又は変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、静脈内に投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前の約７日間、約１０日間、約１４日間、約１８日間、約２１日間、約２４日間、約２８日間、約３０日間、約３５日間、約４０日間、約４５日間、又は約５０日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前の約７日間～約１０日間、約１０日間～約１４日間、約１４日間～約１８日間、約１８日間～約２１日間、約２１日間～約２４日間、約２４日間～約２８日間、約２８日間～約３０日間、約３０日間～約３５日間、約３５日間～約４０日間、約４０日間～約４５日間、又は約４５日間～約５０日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後の約７日間、約１０日間、約１４日間、約１８日間、約２１日間、約２４日間、約２８日間、約３０日間、約３５日間、約４０日間、約４５日間、又は約５０日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後の約７日間～約１０日間、約１０日間～約１４日間、約１４日間～約１８日間、約１８日間～約２１日間、約２１日間～約２４日間、約２４日間～約２８日間、約２８日間～約３０日間、約３０日間～約３５日間、約３５日間～約４０日間、約４０日間～約４５日間、又は約４５日間～約５０日間で投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物の複数回の投与及び／又は免疫チェックポイント阻害剤の複数回の投与を含む。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び／又は免疫チェックポイント阻害剤の２回の投与、３回の投与、４回の投与、５回の投与、６回の投与、７回の投与、８回の投与、９回の投与、１０回の投与、１１回の投与、１２回の投与、１３回の投与、１４回の投与、又は１５回の投与を含む。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び／又は免疫チェックポイント阻害剤の５回未満の投与、１０回未満の投与、１５回未満の投与、２０回未満の投与、２５回未満の投与、３０回未満の投与、５０回未満の投与、７５回未満の投与、１００回未満の投与、又は２００回未満の投与を含む。
例示的な免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、又はＢＴＬＡを標的とするが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、又はＢＴＬＡのうちの１つ以上を標的とする。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１と結合する抗体、ＰＤ－Ｌ１と結合する抗体、ＣＴＬＡ－４と結合する抗体、ＬＡＧ３と結合する抗体、又はＴＩＭ－３と結合する抗体、ＴＩＧＩＴと結合する抗体、ＶＩＳＴＡと結合する抗体、ＴＩＭ－１と結合する抗体、Ｂ７－Ｈ４と結合する抗体、又はＢＴＬＡと結合する抗体のうちの１つ以上である。更なる実施形態では、抗体は、完全長抗体又は任意のバリアント、例えば、抗体断片、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、又は断片抗原結合（Ｆａｂ）であり得るが、これらに限定されない。更なる実施形態では、抗体は、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性であり得る。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、又はＢＴＬＡのうちの１つ以上と結合する及び／又は阻害する１つ以上の化学的な化合物である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、又はＢＴＬＡのうちの１つ以上と結合する及び／又は阻害する１つ以上のペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１を標的とする。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１を標的とする。
サイトカインは、がん、例えば、変異型Ｒａｓ関連がんに対する相加効果又は相乗効果を達成するために、本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物のうちのいずれか１つと組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、１つ以上のサイトカインの投与と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及びサイトカインが、同時に投与される。いくつかの実施形態では、変異Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及びサイトカインが、連続して投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施す前に投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与後に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与前の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与前の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与前の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与前の約７日間、約１０日間、約１４日間、約１８日間、約２１日間、約２４日間、約２８日間、約３０日間、約３５日間、約４０日間、約４５日間、又は約５０日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与前の約７日間～約１０日間、約１０日間～約１４日間、約１４日間～約１８日間、約１８日間～約２１日間、約２１日間～約２４日間、約２４日間～約２８日間、約２８日間～約３０日間、約３０日間～約３５日間、約３５日間～約４０日間、約４０日間～約４５日間、又は約４５日間～約５０日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与後に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与後の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与後の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、サイトカインの投与後の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
例示的なサイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、及び腫瘍壊死因子、又はそれらの機能的誘導体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、サイトカインは、細胞性免疫応答を増強する。いくつかの実施形態では、サイトカインは、抗体応答を増強する。いくつかの実施形態では、サイトカインは、Ｉ型サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、２型サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－ａ、又はＩＬ－２１のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５を含む。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む有核細胞を含む組成物は、サイトカイン部分を含む二重特異性ポリペプチドを投与する前に投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む有核細胞を含む組成物は、サイトカイン部分及び免疫チェックポイント阻害剤部分を含む二重特異性ポリペプチドを投与する前に投与される。いくつかの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、ＣＤ３標的部分及び腫瘍抗原標的部分を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、２つの免疫チェックポイントを標的とする部分を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、間質に見出されるか、又はがん関連線維芽細胞で発現される抗原を標的とする部分を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、間質に見出されるか、又はがん関連線維芽細胞で発現される抗原を標的とする部分及びサイトカイン部分を含む。
化学療法は、がん、例えば、Ｒａｓ関連がんに対する相加効果又は相乗効果を達成するために、本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物のうちのいずれか１つと組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施すのと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び化学療法が、同時に施される。いくつかの実施形態では、変異Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び化学療法が、連続して施される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施す前に投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施した後に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施す前の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施す前の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施す前の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施した後に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施した後の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施した後の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施した後の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施した後の約７日間、約１０日間、約１４日間、約１８日間、約２１日間、約２４日間、約２８日間、約３０日間、約３５日間、約４０日間、約４５日間、又は約５０日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、化学療法を施した後の約７日間～約１０日間、約１０日間～約１４日間、約１４日間～約１８日間、約１８日間～約２１日間、約２１日間～約２４日間、約２４日間～約２８日間、約２８日間～約３０日間、約３０日間～約３５日間、約３５日間～約４０日間、約４０日間～約４５日間、又は約４５日間～約５０日間で投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物の複数回の投与及び／又は化学療法を複数回施すことを含む。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び／又は化学療法を２回施すこと、３回施すこと、４回施すこと、５回施すこと、６回施すこと、７回施すこと、８回施すこと、９回施すこと、１０回施すこと、１１回施すこと、１２回施すこと、１３回施すこと、１４回施すこと、又は１５回施すことを含む。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び／又は化学療法を５回未満施すこと、１０回未満施すこと、１５回未満施すこと、２０回未満施すこと、２５回未満施すこと、３０回未満施すこと、５０回未満施すこと、７５回未満施すこと、１００回未満施すこと、又は２００回未満施すことを含む。
例示的な化学療法は、細胞周期依存性又は細胞周期非依存性であり得る。いくつかの実施形態では、化学療法は、１つ以上の化学療法剤を含む。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、がんにおける細胞分裂、ＤＮＡ、又は代謝のうちの１つ以上を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、シスプラチン、オキサリプラチン、又はカルボプラチンなどであるがこれらに限定されない、プラチナ系薬剤である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、タキサン（ドセタキセル又はパクリタキセルなど）である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、又はイリノテカンである。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、又は有糸分裂阻害剤のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、化学療法は、シスプラチンを含む。
放射線療法は、がん、例えば、Ｒａｓ関連がんに対する相加効果又は相乗効果を達成するために、本明細書に記載される変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物のうちのいずれか１つと組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施すのと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び放射線療法が、同時に施される。いくつかの実施形態では、変異Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び放射線療法が、連続して施される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施すのと組み合わせて、化学療法と組み合わせて、及び／又は免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて施される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施す前に投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施した後に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施す前の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施す前の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施す前の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施した後に投与される。例えば、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施した後の約１時間～約１週間で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施した後の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、又は約７日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施した後の約１時間～約２時間、約２時間～約３時間、約３時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～約１０時間、約１０時間～約１２時間、約１２時間～約１４時間、約１４時間～約１６時間、約１６時間～約１８時間、約１８時間～約２０時間、約２０時間～約２４時間、約２４時間～約３０時間、約３０時間～約３６時間、約３６時間～約４２時間、約４２時間～約４８時間、約４８時間～約６０時間、約６０時間～約３日間、約３日間～約４日間、約４日間～約５日間、約５日間～約６日間、約６日間～約７日間で投与される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施した後の約７日間、約１０日間、約１４日間、約１８日間、約２１日間、約２４日間、約２８日間、約３０日間、約３５日間、約４０日間、約４５日間、又は約５０日間で投与される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物は、放射線療法を施した後の約７日間～約１０日間、約１０日間～約１４日間、約１４日間～約１８日間、約１８日間～約２１日間、約２１日間～約２４日間、約２４日間～約２８日間、約２８日間～約３０日間、約３０日間～約３５日間、約３５日間～約４０日間、約４０日間～約４５日間、又は約４５日間～約５０日間で投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物の複数回の投与及び／又は放射線療法を複数回施すことを含む。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び／又は放射線療法を２回施すこと、３回施すこと、４回施すこと、５回施すこと、６回施すこと、７回施すこと、８回施すこと、９回施すこと、１０回施すこと、１１回施すこと、１２回施すこと、１３回施すこと、１４回施すこと、又は１５回施すことを含む。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物及び／又は放射線療法を５回未満施すこと、１０回未満施すこと、１５回未満施すこと、２０回未満施すこと、２５回未満施すこと、３０回未満施すこと、５０回未満施すこと、７５回未満施すこと、１００回未満施すこと、又は２００回未満施すことを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれか１つに従って、個体において免疫応答を刺激する方法で使用するための変異型Ｒａｓ抗原を含む複数の無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）が提供される。
Ｒａｓ抗原
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓタンパク質に対する個体における免疫応答を刺激するための方法が提供され、方法は、ａ）有効量の無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞は、細胞内に狭窄送達される変異型Ｒａｓ抗原を含む。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓタンパク質に対する個体における免疫応答を刺激するための方法が提供され、方法は、ａ）有効量の無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞は、細胞内に狭窄送達される変異型Ｒａｓ抗原を含む。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、対応する野生型Ｒａｓタンパク質と比較して１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原（例えば、変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ａ又は変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ｂ）、変異型Ｈ－Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｎ－Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、疾患関連抗原（例えば、がん関連抗原）である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、疾患細胞（例えば、細胞）から単離されたペプチド又はｍＲＮＡに由来する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、非自己抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、疾患細胞の可溶化物などの可溶化物に由来する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、腫瘍可溶化物に由来する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原はがんと関連している。いくつかの実施形態では、がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、膵臓がん抗原、結腸がん抗原、小腸がん抗原、胆道がん抗原、子宮内膜がん抗原、肺がん抗原、皮膚がん抗原、卵巣がん抗原、胃がん抗原、食道がん抗原、子宮頸がん抗原、又は尿路がん抗原である。いくつかの実施形態では、がんは、固形がんである。いくつかの実施形態では、がんは、液体がんである。いくつかの実施形態では、がんは、血液がんである。いくつかの実施形態では、がんは、ウイルス関連がんである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、Ｒａｓ関連がんに見出されるがん抗原である。いくつかの実施形態では、がんは、局在性がんである。いくつかの実施形態では、がんは、転移性がんである。
本明細書に記載の方法によるいくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、１つ以上のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、１つ以上の核酸によってコードされ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプラスミドなどであるがこれらに限定されない、１つ以上の核酸の形態で無核細胞に入る。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、１つ以上のｍＲＮＡによってコードされ、１つ以上のｍＲＮＡの形態で無核細胞に入る。
Ｋ－Ｒａｓは、ＲＡＳスーパーファミリー又はＲＡＳ様ＧＴＰａｓｅとして知られる小さなグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合タンパク質の群に属する。ＲＡＳスーパーファミリーのメンバーは、その構造、配列、及び機能に基づいて、ファミリー及びサブファミリーに分けられる。ヒトにおいて、３つのＲＡＳ遺伝子は、高度に相同なＲＡＳタンパク質、Ｈ－Ｒａｓ、Ｎ－Ｒａｓ、及びＫ－Ｒａｓをコードする。Ｒａｓは、ヒトがんにおいて最も頻繁に変異されるがん遺伝子の１つであり、Ｋ－Ｒａｓは、最も頻繁に変異されるアイソフォームであり、ＲＡＳ変異の８６％を構成する。Ｋ－Ｒａｓ－４Ｂスプライスバリアントは、ヒトのがんにおける変異を伴う優勢なアイソフォームであり、それは膵臓がんの約９０％、結腸がんの３０％～４０％、肺がんの１５％～２０％、主に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に存在する。胆道の悪性腫瘍、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、肝臓がん、骨髄性白血病、及び乳がんにも存在する。Ｋ－Ｒａｓ遺伝子で最も頻繁に見られる変異は、主にコドン１２、１３、又は６１にある。Ｋ－Ｒａｓ変異は、コドン６３、１１７、１１９、及び１４６でも発生するが、頻度は少ない。詳細には、グリシン１２（Ｇ１２）の変異は、ＧＡＰ結合及びＧＡＰ刺激ＧＴＰ加水分解を妨害することによって、ＲＡＳ活性化を引き起こす。残基１３での変異は、立体的にアルギニンと衝突し、ＧＡＰ結合及び加水分解を減少させる。残基１２、１３、及び６１での変異は、ＲＡＦのＲＡＳ結合ドメイン（ＲＢＤ）に対する親和性も減少させることが報告されたが、程度は異なる。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原、変異型Ｈ－Ｒａｓ抗原、及び／又は変異型Ｎ－Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原は、変異型Ｋ－Ｒａｓ－４Ａ抗原、及び／又はＫ－Ｒａｓ－４Ｂ抗原である。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである。いくつかの実施形態では、複数の抗原のプール内の抗原は、複数の抗原のプール内の他の抗原に向けられた免疫応答を減少させない。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、抗原性変異型Ｒａｓエピトープ及び１つ以上の異種性ペプチド配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、それ自体と、他の抗原と、又はアジュバントと複合体化する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、ＨＬＡ－Ａ２特異的エピトープから成る。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、ＨＬＡ－Ａ１１特異的エピトープから成る。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、ＨＬＡ－Ｂ７特異的エピトープから成る。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、ＨＬＡ－Ｃ８特異的エピトープから成る。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、そのＮ末端に変異を含む変異型Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異のうちの１つ以上を含む変異型Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、完全長変異型Ｒａｓタンパク質のＮ末端ドメインの一部又は全部を含む。本明細書で使用される場合、グリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変異したＮ末端ドメインの１２番目の残基を有する変異型Ｒａｓタンパク質（例えば、変異型Ｋ－Ｒａｓ）は、Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄと称される。本明細書で使用される場合、グリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変異したＮ末端ドメインの１２番目の残基を有する変異型Ｋ－Ｒａｓタンパク質は、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄと称される。本明細書で使用される場合、グリシン（Ｇ）からバリン（Ｖ）に変異したＮ末端ドメインの１２番目の残基を有する変異Ｒａｓタンパク質（例えば、変異型Ｋ－Ｒａｓ）は、Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖと称される。本明細書で使用される場合、グリシン（Ｇ）からバリン（Ｖ）に変異したＮ末端ドメインの１２番目の残基を有する変異型Ｋ－Ｒａｓタンパク質は、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖと称される。本明細書で使用される場合、グリシン（Ｇ）からシステイン（Ｃ）に変異したＮ末端ドメインの１２番目の残基を有する変異型Ｒａｓタンパク質（例えば、変異型Ｋ－Ｒａｓ）は、Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃと称される。本明細書で使用される場合、グリシン（Ｇ）からシステイン（Ｃ）に変異したＮ末端ドメインの１２番目の残基を有する変異型Ｋ－Ｒａｓタンパク質は、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃと称される。本明細書で使用される場合、グリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変異したＮ末端ドメインの１３番目の残基を有する変異型Ｒａｓタンパク質（例えば、変異型Ｋ－Ｒａｓ）は、Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄと称される。本明細書で使用される場合、グリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変異したＮ末端ドメインの１３番目の残基を有する変異型Ｋ－Ｒａｓタンパク質は、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄと称される。
いくつかの実施形態では、変異Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄタンパク質のＮ末端ドメインの残基Ｘ～残基Ｙを含む抗原又は抗原性エピトープの配列は、Ｇ１２ＤＸ－Ｙ又はＲａｓ－Ｇ１２ＤＸ－Ｙと称される。非限定的な例として、変異Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄタンパク質のＮ末端ドメインの残基１～残基１６を含む抗原又は抗原エピトープの配列は、Ｇ１２Ｄ１－１６又はＫ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ１－１６と称される。いくつかの実施形態では、変異Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖタンパク質のＮ末端ドメインの残基Ｘ～残基Ｙを含む抗原又は抗原性エピトープの配列は、Ｇ１２ＶＸ－Ｙ又はＲａｓ－Ｇ１２ＶＸ－Ｙと称される。非限定的な例として、変異Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖタンパク質のＮ末端ドメインの残基２～残基２２を含む抗原又は抗原性エピトープの配列は、Ｇ１２Ｖ２－２２又はＫ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ２－２２と称される。同じ原則が、本明細書に記載されるＧ１２ＣＸ－Ｙ若しくはＲａｓ－Ｇ１２ＤＸ－Ｙ、又は野生型ＲａｓＸ－Ｙの開示のいずれかに適用される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、Ｇ１２Ｄ変異を含むＫ－Ｒａｓ由来のペプチド（Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ）、Ｇ１２Ｖ変異を含むＫ－Ｒａｓ由来のペプチド（Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ）、Ｇ１２Ｃ変異を含むＫ－Ｒａｓ由来のペプチド（Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ）、又はＧ１３Ｄ変異を含むＫ－Ｒａｓ由来のペプチド（Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ）のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ由来のＨＬＡ－Ａ２拘束性ペプチド、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ由来のＨＬＡ－Ａ２拘束性ペプチド、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ由来のＨＬＡ－Ａ２拘束性ペプチド、及び／又はＫ－Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ由来のＨＬＡ－Ａ２拘束性ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ペプチドは、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、対応する変異型Ｋ－Ｒａｓタンパク質のＮ末端ドメイン由来のアミノ酸配列を含む（例えば、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ、又はＫ－Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ）。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、又はＧ１２Ｄ２－２９、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２抗原のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメインは、Ｋ－Ｒａｓ、Ｎ－Ｒａｓ、及びＨ－Ｒａｓの３つのＲａｓアイソフォームにおいて同一である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原であり、変異型Ｋ－Ｒａｓ 抗原は、対応する変異型Ｋ－Ｒａｓタンパク質のＮ末端ドメイン由来のアミノ酸配列を含み（例えば、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ、又はＫ－Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ）、これは、対応する変異型Ｈ－Ｒａｓタンパク質（例えば、Ｈ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ又はＨ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ）、又は変異型Ｎ－Ｒａｓタンパク質（例えば、Ｎ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ、又はＫ－Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ）のＮ末端ドメイン由来のアミノ酸配列と同じである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の類似性のうちのいずれか１つを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１と少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号７のアミノ酸配列から成る。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号８のアミノ酸配列から成る。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、複数の変異型Ｒａｓエピトープである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む複数の変異型Ｒａｓエピトープである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は複、数のＲａｓエピトープを含み、変異型Ｒａｓ抗原は、約９～約２００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む複数の抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、約９～約２００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列のうちの２、３、４、５、６、７、又は８個を含む複数の抗原である。いくつかの実施形態では、複数の抗原は、非共有結合したペプチドのプール内に含まれる。いくつかの実施形態では、複数の抗原は、非共有結合したペプチドのプール内に含まれ、各ペプチドは、１つ以下の抗原を含む。
本明細書に記載される方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）は、複数の免疫原性エピトープを含む複数のＲａｓ抗原を含む。更なる実施形態では、複数の免疫原性エピトープを含む複数の抗原を含む無核細胞由来小胞を個体に投与した後、複数の免疫原性エピトープのいずれも、他の免疫原性エピトープのいずれかに対する個体における免疫応答を減少させない。いくつかの実施形態では、Ｒａｓ抗原はポリペプチドであり、免疫原性エピトープは免疫原性ペプチドエピトープである。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドエピトープは、Ｎ末端隣接ポリペプチド及び／又はＣ末端隣接ポリペプチドと融合する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、免疫原性ペプチドエピトープ及び１つ以上の異種性ペプチド配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、Ｎ末端及び／又はＣ末端で異種性ペプチド配列に隣接する免疫原性ペプチドエピトープを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、隣接異種性ペプチド配列は、疾患関連免疫原性ペプチドに由来する。いくつかの実施形態では、隣接異種性ペプチド配列は、天然に存在しない配列である。いくつかの実施形態では、隣接異種性ペプチド配列は、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、ＭＨＣクラスＩ拘束ペプチド及び／又はＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドにプロセシングされることが可能である。
変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成するための方法が提供され、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達され、Ｒａｓ抗原は、配列番号１～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成する方法が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成するための方法が提供され、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達され、Ｒａｓ抗原は、配列番号１～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成するための方法が提供され、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原とインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞の組成物を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞の組成物を生成するための方法であって、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、無核細胞が、ＲＢＣ又は血小板である。いくつかの実施形態では、無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、ＲＢＣ由来小胞又は血小板由来小胞である。いくつかの実施形態では、エリスロサイト由来小胞又はレチクロサイト由来小胞である。
いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、又は約６０％～約７０％のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ～約４μｍ、約１μｍ～約４μｍ、約１．２μｍ～約３μｍ、約１．４μｍ～約２．６μｍ、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．２μｍ、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、２．２μｍ、２．４μｍ、２．６μｍ、２．８μｍ、３．０μｍ、３．２μｍ、３．４μｍ、３．６μｍ、３．８μｍ、４．０μｍ、４．２μｍ、４．４μｍ、４．６μｍ、４．８μｍ、５．０μｍ、５．２μｍ、５．４μｍ、５．６μｍ、５．８μｍ、６．０μｍ以下のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープ及び１つ以上の異種性ペプチド配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、他の抗原又はアジュバントと共に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異のうちのいずれか１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接する１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の類似性のうちのいずれか１つを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０の類似性のうちのいずれか１つを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。
いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）である。
変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達され、Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１２Ｃ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ－Ｇ１３Ｄ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞由来小胞に送達され、Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原とインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成することと、により調製される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、変異型Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞は、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、によって調製される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、変異型Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物が提供され、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、ａ）ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、によって調製される。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、変異型Ｒａｓ抗原である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、無核細胞が、ＲＢＣ又は血小板である。いくつかの実施形態では、無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞が、ＲＢＣ由来小胞又は血小板由来小胞である。いくつかの実施形態では、エリスロサイト由来小胞又はレチクロサイト由来小胞である。
いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、又は約６０％～約７０％のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ～約４μｍ、約１μｍ～約４μｍ、約１．２μｍ～約３μｍ、約１．４μｍ～約２．６μｍ、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３．０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．２μｍ、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、２．２μｍ、２．４μｍ、２．６μｍ、２．８μｍ、３．０μｍ、３．２μｍ、３．４μｍ、３．６μｍ、３．８μｍ、４．０μｍ、４．２μｍ、４．４μｍ、４．６μｍ、４．８μｍ、５．０μｍ、５．２μｍ、５．４μｍ、５．６μｍ、５．８μｍ、６．０μｍ以下のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープ及び１つ以上の異種性ペプチド配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、他の抗原又はアジュバントと複合体化する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異のうちのいずれか１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接する１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の類似性のうちのいずれか１つを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である。
いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）である。
変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の更なる修飾
本明細書に記載される方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、無核物由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）の組成物は、薬剤を含まない対応する無核細胞由来小胞の組成物と比較して、無核細胞由来小胞の生存率及び／又は機能を増強する薬剤を更に含む。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞の組成物は、薬剤を含まない対応する無核細胞由来小胞の組成物と比較して、凍結融解サイクル時に無核細胞由来小胞の生存率及び／又は機能を増強する薬剤を更に含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、凍結保存剤及び／又は低温保存剤である。いくつかの実施形態では、凍結保存剤も低温保存剤も、任意の凍結融解サイクルの前に薬剤を含まない無核細胞由来小胞の対応する組成物と比較して、薬剤を含む無核細胞由来小胞の組成物において１０％～２０％以下の細胞死を引き起こす。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞の少なくとも約７０％、約８０％、又は約９０％が、最大１、２、３、４、５回の凍結融解サイクル後に生存可能である。いくつかの実施形態では、薬剤は、エンドサイトーシスを増強する化合物、安定化剤、又は補因子である。いくつかの実施形態では、薬剤は、アルブミンである。いくつかの実施形態では、アルブミンは、マウス、ウシ、又はヒトアルブミンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ヒトアルブミンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、二価金属カチオン、グルコース、ＡＴＰ、カリウム、グリセロール、トレハロース、Ｄ－スクロース、ＰＥＧ１５００、Ｌ－アルギニン、Ｌ－グルタミン、又はＥＤＴＡのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、又はＣａ２＋のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピルビン酸ナトリウム、アデニン、トレハロース、デキストロース、マンノース、スクロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＤＭＳＯ、ＨＥＰＥＳ、グリセロール、グルタチオン、イノシン、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、ナトリウム金属イオン、カリウム金属イオン、マグネシウム金属イオン、塩化物、アセテート、グルコネート、スクロース、水酸化カリウム、又は水酸化ナトリウムのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピルビン酸ナトリウム、アデニン、Ｒｅｊｕｖｅｓｏｌ（登録商標）、トレハロース、デキストロース、マンノース、スクロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ（登録商標）、ＤＭＳＯ、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１５、ＨＥＰＥＳ、グリセロール、グルタチオン、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）のうちの１つ以上である。
本明細書に記載される方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、無核物由来小胞（例えば、ＲＢＣ由来小胞）の組成物は、薬剤を含まない対応する無核細胞由来小胞の組成物と比較して、無核細胞由来小胞の生存率及び／又は機能を増強する薬剤を更に含む。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞の組成物は、薬剤を含まない対応する無核細胞由来小胞の組成物と比較して、凍結融解サイクル時に無核細胞由来小胞の生存率及び／又は機能を増強する薬剤を更に含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、凍結保存剤及び／又は低温保存剤である。いくつかの実施形態では、凍結保存剤も低温保存剤も、任意の凍結融解サイクルの前に薬剤を含まない無核細胞由来小胞の対応する組成物と比較して、薬剤を含む無核細胞由来小胞の組成物において１０％～２０％以下の細胞死を引き起こす。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞の少なくとも約７０％、約８０％、又は約９０％が、最大１、２、３、４、５回の凍結融解サイクル後に生存可能である。いくつかの実施形態では、薬剤は、エンドサイトーシスを増強する化合物、安定化剤、又は補因子である。いくつかの実施形態では、薬剤は、アルブミンである。いくつかの実施形態では、アルブミンは、マウス、ウシ、又はヒトアルブミンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ヒトアルブミンである。いくつかの実施形態では、薬剤は、二価金属カチオン、グルコース、ＡＴＰ、カリウム、グリセロール、トレハロース、Ｄ－スクロース、ＰＥＧ１５００、Ｌ－アルギニン、Ｌ－グルタミン、又はＥＤＴＡのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、又はＣａ２＋のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピルビン酸ナトリウム、アデニン、トレハロース、デキストロース、マンノース、スクロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＤＭＳＯ、ＨＥＰＥＳ、グリセロール、グルタチオン、イノシン、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、ナトリウム金属イオン、カリウム金属イオン、マグネシウム金属イオン、塩化物、アセテート、グルコネート、スクロース、水酸化カリウム、又は水酸化ナトリウムのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ピルビン酸ナトリウム、アデニン、Ｒｅｊｕｖｅｓｏｌ（登録商標）、トレハロース、デキストロース、マンノース、スクロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ（登録商標）、ＤＭＳＯ、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１５、ＨＥＰＥＳ、グリセロール、グルタチオン、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）のうちの１つ以上である。
本明細書に記載される方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、プロセスは、更なるインキュベーションステップなしで調製された対応する無核細胞と比較して、無核細胞の生存率及び／又は機能を増強する薬剤と無核細胞の組成物をインキュベートするステップを更に含む。
アジュバント
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫応答を直接的若しくは間接的にのいずれかで調節及び／又は生成する物質を指すことができる。本発明のいくつかの実施形態では、アジュバントは、ＲＢＣ若しくはＲＢＣ由来小胞の集団などの無核細胞又は無核由来小胞の集団に細胞内で送達され（すなわち、狭窄処理の前、間、及び／又は後であるが個体への投与前に、細胞又は小胞をアジュバントとインキュベーション）、アジュバントを含む無核細胞由来小胞を形成する。いくつかの事例では、アジュバントは、変異型Ｒａｓ抗原単独と比較して、変異型Ｒａｓ抗原に対する免疫応答を増強するために変異型Ｒａｓ抗原と併せて投与される。したがって、アジュバントを使用して、変異型Ｒａｓ抗原に対する免疫細胞応答（例えば、Ｔ細胞応答）の誘発をブーストすることができる。例示的なアジュバントには、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）アゴニスト、並びにＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及び／又はＴＬＲ９のアゴニストが含まれるが、これらに限定されない。例示的なアジュバントには、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、又はリポ多糖（ＬＰＳ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＯＤＮ、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ： Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。特定の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮである。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＡ ＣｐＧ ＯＤＮ、クラスＢ ＣｐＧ ＯＤＮ、又はクラスＣ ＣｐＧ ＯＤＮである。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮアジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮ １０１８、ＣｐＧ ＯＤＮ １５８５、ＣｐＧ ＯＤＮ ２２１６、ＣｐＧ ＯＤＮ ２３３６、ＣｐＧ ＯＤＮ １６６８、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６、ＣＰＧ ＯＤＮ ２００６、ＣｐＧ ＯＤＮ ２００７、ＣｐＧ ＯＤＮ ＢＷ００６、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｄ－ＳＬ０１、ＣｐＧ ＯＤＮ ２３９５、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｍ３６２、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｄ－ＳＬ０３の群からの選択を含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮアジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１６））、又はＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（ＣｐＧ ７９０９としても知られる）（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号１７））オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９である。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアゴニストは、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）を含む。複数のアジュバントは、変異型Ｒａｓ抗原と組み合わせて使用して、免疫応答の誘発を増強することもできる。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、１つを超えるアジュバントを更に含む。複数のアジュバントは、変異型Ｒａｓ抗原と組み合わせて使用して、免疫応答の誘発を増強することもできる。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、１つを超えるアジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、アジュバントＣｐＧ ＯＤＮ、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストの任意の組み合わせを更に含む。
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫応答を直接的若しくは間接的にのいずれかで調節及び／又は生成する物質を指すことができる。本発明のいくつかの実施形態では、アジュバントは、ＲＢＣ若しくはＲＢＣ由来小胞の集団などの無核細胞又は無核由来小胞の集団に細胞内で送達され（すなわち、狭窄処理の前、間、及び／又は後であるが個体への投与前に、細胞又は小胞をアジュバントとインキュベーション）、アジュバントを含む無核細胞由来小胞を形成する。いくつかの事例では、アジュバントは、変異型Ｒａｓ抗原単独と比較して、変異型Ｒａｓ抗原に対する免疫応答を増強するために変異型Ｒａｓ抗原と併せて投与される。したがって、アジュバントを使用して、変異型Ｒａｓ抗原に対する免疫細胞応答（例えば、Ｔ細胞応答）の誘発をブーストすることができる。例示的なアジュバントには、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）アゴニスト、並びにＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及び／又はＴＬＲ９のアゴニストが含まれるが、これらに限定されない。例示的なアジュバントには、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、又はリポ多糖（ＬＰＳ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＯＤＮ、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ： Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである。特定の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮである。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＡ ＣｐＧ ＯＤＮ、クラスＢ ＣｐＧ ＯＤＮ、又はクラスＣ ＣｐＧ ＯＤＮである。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮアジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮ １０１８、ＣｐＧ ＯＤＮ １５８５、ＣｐＧ ＯＤＮ ２２１６、ＣｐＧ ＯＤＮ ２３３６、ＣｐＧ ＯＤＮ １６６８、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６、ＣＰＧ ＯＤＮ ２００６、ＣｐＧ ＯＤＮ ２００７、ＣｐＧ ＯＤＮ ＢＷ００６、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｄ－ＳＬ０１、ＣｐＧ ＯＤＮ ２３９５、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｍ３６２、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｄ－ＳＬ０３の群からの選択を含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮアジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１６））、又はＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（ＣｐＧ ７９０９としても知られる）（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号１７））オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９である。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアゴニストは、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）を含む。複数のアジュバントは、変異型Ｒａｓ抗原と組み合わせて使用して、免疫応答の誘発を増強することもできる。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、１つを超えるアジュバントを更に含む。複数のアジュバントは、変異型Ｒａｓ抗原と組み合わせて使用して、免疫応答の誘発を増強することもできる。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、１つを超えるアジュバントを更に含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞は、アジュバントＣｐＧ ＯＤＮ、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストの任意の組み合わせを更に含む。
変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物の生成に使用される狭窄
いくつかの実施形態では、本発明は、免疫応答を刺激するための変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、無核細胞が、ＲＢＣ又は血小板である。いくつかの実施形態では、無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞に送達される。ペイロードを無核細胞に導入する方法は、当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、本発明は、免疫応答を刺激するための変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、無核細胞が、ＲＢＣ又は血小板である。いくつかの実施形態では、無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞内で無核細胞に送達される。ペイロードを無核細胞に導入する方法は、当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、細胞の膜に一過性の細孔が導入され、それにより変異型Ｒａｓ抗原が細胞に入ることができるように、細胞を狭窄部に通過させることによって無核細胞に導入される。細胞への化合物の狭窄に基づく送達の例は、ＷＯ２０１３／０５９３４３、ＷＯ２０１５／０２３９８２、ＷＯ２０１６／０７０１３６、ＷＯ２０１７／０４１０５０、ＷＯ２０１７／００８０６３、ＷＯ２０１７／１９２７８５、ＷＯ２０１７／１９２７８６、ＷＯ２０１９／１７８００５、ＷＯ２０１９／１７８００６、ＷＯ２０２０／０７２８３３、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１５０９８、及びＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０１９４により提供される。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原は、無核細胞（例えば、ＲＢＣ）を含む細胞懸濁液を狭窄部に通過させることによって、無核細胞に送達され、本発明の無核細胞由来小胞を生成し、狭窄部は細胞を変形させ、それにより、変異型Ｒａｓ抗原が細胞に入るように細胞の摂動を引き起こす。いくつかの実施形態では、狭窄部は、マイクロ流体チャネル内に含まれる。いくつかの実施形態では、複数の狭窄部は、マイクロ流体チャネル内で並列及び／又は直列に配置され得る。
いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄部は、入口部分、中心点、及び出口部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄部の長さ、深さ、及び幅は、変化し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネル内の狭窄部の幅は、無核細胞の直径の関数である。無核細胞の直径を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ハイコンテントイメージング、細胞カウンタ、又はフローサイトメトリーである。
無核細胞由来小胞への変異型Ｒａｓ抗原の狭窄に基づく送達のいくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．５μｍ～約１０μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１μｍ～約４μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１μｍ～約３μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１．５μｍ～約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１．２μｍ～約２．８μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．５μｍ～約５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２μｍ～約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約１．５μｍ～約２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．５μｍ～約３．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３．２μｍ～約３．８μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３．８μｍ～約４．３μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約０．２５μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．２μｍ、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、２．２μｍ、２．４μｍ、２．６μｍ、２．８μｍ、３．０μｍ、３．２μｍ、３．４μｍ、３．６μｍ、３．８μｍ、４．０μｍ、４．２μｍ、４．４μｍ、４．６μｍ、４．８μｍ、５．０μｍ、５．２μｍ、５．４μｍ、５．６μｍ、５．８μｍ、６．０μｍ以下のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、狭窄部の幅は、約３μｍである。
無核細胞由来小胞への化合物の送達に影響を与え得るパラメータの例には、狭窄部の寸法、狭窄部の入射角、狭窄部の表面特性（例えば、粗さ、化学修飾、親水性、疎水性など）、操作の流れの速度（例えば、狭窄部を通過する細胞の通過時間）、細胞濃度、細胞懸濁液中の化合物の濃度、細胞懸濁液中の緩衝液、及び送達された化合物の無核細胞由来小胞への通過に影響を与え得る狭窄部を通過した後に無核細胞由来小胞が回復又はインキュベートする時間の量が含まれるが、これらに限定されない。無核細胞由来小胞への化合物の送達に影響を与える追加のパラメータは、狭窄部内の無核細胞の速度、狭窄部内のせん断速度、細胞懸濁液の粘度、流速に垂直な速度成分、及び狭窄部内の時間を含めることができる。加えて、直列及び／又は並列のチャネルを含む複数のチップは、無核細胞由来小胞への送達に影響を与え得る。複数のチップを並列にすることは、スループットを増強するために有用であり得る。こうしたパラメータは、化合物の送達を制御するように設計され得る。いくつかの実施形態では、細胞濃度は、約１０～少なくとも約１０１２細胞／ｍＬの範囲、又はそれらの間の任意の濃度若しくは濃度範囲である。いくつかの実施形態では、送達化合物の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１ｇ／ｍＬの範囲、又はそれらの間の任意の濃度若しくは濃度範囲であり得る。いくつかの実施形態では、送達化合物の濃度は、約１ｐＭ～少なくとも約２Ｍの範囲、又はそれらの間の任意の濃度若しくは濃度範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞とインキュベートされる変異型Ｒａｓ抗原の濃度は、約０．０１μＭ～約１０ｍＭである。例えば、いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞とインキュベートされる変異型Ｒａｓ抗原の濃度は、約０．０１μＭ未満、約０．１μＭ、約１μＭ、約１０μＭ、約１００μＭ、約１ｍＭ、又は約１０ｍＭのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞とインキュベートされる変異型Ｒａｓ抗原の濃度は、約１０ｍＭを超える。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞とインキュベートされる変異型Ｒａｓ抗原の濃度は、約０．０１μＭ～約０．１μＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約１００μＭ～約１ｍＭ、又は約１ｍＭ～約１０ｍＭのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞とインキュベートされる変異型Ｒａｓ抗原の濃度は、約０．１μＭ～約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞とインキュベートされる変異型Ｒａｓ抗原の濃度は、約０．１μＭ～約１０μＭである。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞とインキュベートされる変異型Ｒａｓ抗原の濃度は、１μＭである。
いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞は、約１ｎＭ～約１ｍＭの濃度で、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞は、約０．１ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．０１ｕＭ、約０．１ｕＭ、約１ｕＭ、約１０ｕＭ、約１００ｕＭ、約１ｍＭ、又は約１０ｍＭのうちのいずれかの濃度で、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞は、約１０ｍＭを超える濃度で、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞は、約０．１ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約１００μＭ～約１ｍＭ、又は１ｍＭ～約１０ｍＭの間のうちのいずれかの濃度で、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞は、約１０ｎＭ～約１００ｎＭの濃度で、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞は、約１ｎＭ～約１０ｎＭの濃度で、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、無核細胞又は無核細胞由来小胞は、約５０ｎＭの濃度で、変異型Ｒａｓ抗原を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡである。
無核細胞由来小胞の特徴及び抗原提示細胞による内在化
本明細書に記載される方法、使用、又は組成物のいずれか１つによる実施形態では、方法は、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、ペイロード（変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントなど）を含む無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して異なる特徴を示す。いくつかの実施形態では、ペイロード（変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントなど）を含む無核細胞由来小胞は、他の送達方法（溶血性負荷又はエレクトロポレーションなど）によって導入されたペイロードを含む無核細胞と比較して異なる特徴を示す。いくつかの実施形態では、ペイロード（変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントなど）を含む無核細胞由来小胞は、ペイロードを含む無核細胞由来小胞である。いくつかの実施形態では、抗原（変異型Ｒａｓ抗原など）を含む無核細胞由来小胞は、抗原担体（ＡＣ）と称される。いくつかの実施形態では、抗原（変異型Ｒａｓ抗原など）及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞は、活性化抗原担体（ＡＡＣ）と称される。無核細胞由来小胞は、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１５０９８に開示されており、その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される方法、使用、又は組成物のいずれか１つによる実施形態では、方法は、ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、ペイロード（変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントなど）を含む無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して異なる特徴を示す。いくつかの実施形態では、ペイロード（変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントなど）を含む無核細胞由来小胞は、他の送達方法（溶血性負荷又はエレクトロポレーションなど）によって導入されたペイロードを含む無核細胞と比較して異なる特徴を示す。いくつかの実施形態では、ペイロード（変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントなど）を含む無核細胞由来小胞は、ペイロードを含む無核細胞由来小胞である。いくつかの実施形態では、抗原（変異型Ｒａｓ抗原など）を含む無核細胞由来小胞は、抗原担体（ＡＣ）と称される。いくつかの実施形態では、抗原（変異型Ｒａｓ抗原など）及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞は、活性化抗原担体（ＡＡＣ）と称される。無核細胞由来小胞は、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１５０９８に開示されており、その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、哺乳動物への投与後の無核細胞由来小胞の半減期は、哺乳動物への投与後のインプット無核細胞の半減期と比較して減少する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞のヘモグロビン含有量は、インプット無核細胞のヘモグロビン含有量と比較して減少する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞のＡＴＰ産生は、インプット無核細胞のＡＴＰ産生と比較して減少する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来の小胞は、球状形態を呈する。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、エリスロサイトであり、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して減少した両凹形状を有する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、赤血球ゴーストである。いくつかの実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、その表面上に約１．５倍を超えるホスファチジルセリンを有する。いくつかの実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来小胞の集団プロファイルは、インプット無核細胞と比較して、表面上でより高い平均ホスファチジルセリンレベルを呈する。いくつかの実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来小胞の集団プロファイルの少なくとも５０％は、インプット無核細胞と比較して、表面上でより高いホスファチジルセリンレベルを呈する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、組織又は細胞において優先的な取り込みを示す。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、食細胞及び／又は抗原提示細胞において優先的な取り込みを示す。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、組織又は細胞における取り込みを増強するように修飾される。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、修飾されていない無核細胞由来小胞と比較して、食細胞及び／又は抗原提示細胞における取り込みを増強するように修飾される。いくつかの実施形態では、食細胞及び／又は抗原提示細胞は、樹状細胞又はマクロファージのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、組織又は細胞は、肝臓又は脾臓のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、その表面上にＣＤ４７を含む。
無核細胞由来小胞を生成するための上記の方法のいくつかの実施形態では、狭窄部は、マイクロ流体チャネル内に含まれる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネルは、複数の狭窄部を含む。いくつかの実施形態では、複数の狭窄部は、直列及び／又は並列に配置される。いくつかの実施形態では、狭窄部は、複数のマイクロピラーの間、アレイに構成された複数のマイクロピラーの間、又は１つ以上の移動可能なプレートの間である。いくつかの実施形態では、狭窄部は、細孔であるか、又は細孔内に含まれる。いくつかの実施形態では、細孔は、表面内に含まれる。いくつかの実施形態では、表面は、フィルタである。いくつかの実施形態では、表面は、膜である。いくつかの実施形態では、狭窄部サイズは、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数である。いくつかの実施形態では、狭窄部サイズは、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、又は約７０％である。いくつかの実施形態では、狭窄部は、約０．２５μｍ～約４μｍの幅を有する。いくつかの実施形態では、狭窄部は、約４μｍ、３．５μｍ、約３μｍ、約２．５μｍ、約２μｍ、約１．５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、又は約０．２５μｍの幅を有する。いくつかの実施形態では、狭窄部は、約２．２μｍの幅を有する。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、約１０ｐｓｉ～約９０ｐｓｉの範囲の圧力下で狭窄部を通過する。いくつかの実施形態では、該細胞懸濁液は、狭窄部を通過する前に、同時発生的に、又は後に抗原と接触する。
いくつかの実施形態では、ペイロード（例えば、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバント）を含む無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞から調製され、無核細胞由来小胞は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：（ａ）哺乳動物における循環半減期が、インプット無核細胞と比較して低減する、（ｂ）インプット無核細胞と比較して低減したヘモグロビンレベル、（ｃ）球状形態、（ｄ）インプット無核細胞と比較して増加した表面ホスファチジルセリンレベル、又は（ｅ）インプット無核細胞と比較して減少したＡＴＰ産生。
いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球又は血小板である。いくつかの実施形態では、赤血球は、エリスロサイト又はレチクロサイトである。
いくつかの実施形態では、哺乳動物における無核細胞由来小胞の循環半減期は、インプット無核細胞と比較して減少する。いくつかの実施形態では、哺乳動物における循環半減期は、インプット無核細胞と比較して、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％を超えて減少する。
いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、ヒト細胞であり、無核細胞由来小胞の循環半減期は、約１分、約２分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約１時間、約６時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約１０日、約２５日、約５０日、約７５日、約１００日、約１２０日未満である。
いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来小胞中のヘモグロビンレベルは、インプット無核細胞と比較して減少する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプット無核細胞と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％、又は約１００％減少する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞におけるヘモグロビンレベルは、インプット無核細胞におけるヘモグロビンのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、又は約５０％である。
いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球であり、無核細胞由来小胞は、形態的に球状である。いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、エリスロサイトであり、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して減少した両凹形状を有する。
いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、赤血球又はエリスロサイトであり、無核細胞由来小胞は、赤血球ゴースト（ＲＢＣゴースト）である。
いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、その表面上にＣＤ４７を含む。
いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、増加した表面ホスファチジルセリンレベルを有する。いくつかの実施形態では、プロセスによって調製された無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、その表面上に約１．５倍を超えるホスファチジルセリンを有する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、その表面上に約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９９％、約１００％、又は約１００％を超えるホスファチジルセリンを有する。
いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、減少したＡＴＰ産生を有する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞によって産生されるＡＴＰのレベルの約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、又は約５０％未満でＡＴＰを産生する。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、ＡＴＰを産生しない。
いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、組織又は細胞において増強した取り込みを示す。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞の取り込みと比較して、肝臓若しくは脾臓における、又は食細胞若しくは抗原提示細胞による優先的な取り込みを示す。
いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞と比較して、組織又は細胞における取り込みを増強するように更に修飾される。いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、インプット無核細胞の取り込みと比較して、肝臓若しくは脾臓における、又は食細胞若しくは抗原提示細胞による取り込みを増強するように更に修飾される。
いくつかの実施形態では、無核細胞由来小胞は、肝臓若しくは脾臓における、又は食細胞及び／若しくは抗原提示細胞による増強した取り込みを示し、無核細胞由来小胞の内在化は、食細胞又は抗原提示細胞の成熟マーカーの増加した発現をもたらす。いくつかの実施形態では、食細胞及び／又は抗原提示細胞は、単球由来樹状細胞（ＭＯＤＣ）である。いくつかの実施形態では、成熟マーカーは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＭＨＣ－ＩＩのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＭＨＣ－ＩＩのうちの１つ以上の発現は、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞と接触していない食細胞及び／又は抗原提示細胞と比較して、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞と接触した食細胞及び／又は抗原提示細胞において、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍以上のうちのいずれか１つで増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＭＨＣ－ＩＩのうちの１つ以上の発現は、インプット無核細胞と接触した食細胞及び／又は抗原提示細胞と比較して、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞と接触した食細胞及び／又は抗原提示細胞において、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍以上のうちのいずれか１つで増加する。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞は、肝臓若しくは脾臓における、又は食細胞及び／若しくは抗原提示細胞による増加した取り込みを示し、無核細胞由来小胞の内在化は、無核細胞由来小胞内に含まれる変異型Ｒａｓ抗原の増加した提示をもたらす。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原の提示は、他の送達方法（溶血性負荷などであるが、これに限定されない）によって導入された同じ変異型Ｒａｓ抗原を含む対応する無核細胞と接触した食細胞及び／又は抗原提示細胞と比較して、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞と接触した食細胞及び／又は抗原提示細胞において、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍以上のうちのいずれか１つで増加する。
いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞は、肝臓若しくは脾臓における、又は食細胞及び／若しくは抗原提示細胞による増加した取り込みを示し、無核細胞由来小胞の内在化は、食細胞及び／又は抗原提示細胞が抗原特異的免疫応答を誘導する増加した能力をもたらす。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞と接触した食細胞及び／又は抗原提示細胞によって媒介される抗原特異的免疫応答は、インプット無核細胞と接触した食細胞及び／又は抗原提示細胞と比較して、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍以上のうちのいずれか１つで増加する。いくつかの実施形態では、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞と接触した食細胞及び／又は抗原提示細胞によって媒介される抗原特異的免疫応答は、他の送達方法（溶血性負荷などであるが、これに限定されない）によって導入された同じ変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞と接触した食細胞及び／又は抗原提示細胞と比較して、少なくとも約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍以上のうちのいずれか１つで増加する。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答である。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。
本明細書に記載される方法、組成物、又は使用のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、食細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、又はＨＬＡ－Ｃ＊１６のハプロタイプを有するヒト細胞である。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、又はＨＬＡ－Ｃ＊０８のハプロタイプを有するヒト細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される食細胞及び／又は抗原提示細胞によって提示される変異型Ｒａｓ抗原は、ＨＬＡ－Ａ２特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される食細胞及び／又は抗原提示細胞によって提示される変異型Ｒａｓ抗原は、ＨＬＡ－Ａ１１特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される食細胞及び／又は抗原提示細胞によって提示される変異型Ｒａｓ抗原は、ＨＬＡ－Ｂ７特異的エピトープから構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される食細胞及び／又は抗原提示細胞によって提示される変異型Ｒａｓ抗原は、ＨＬＡ－Ｃ８特異的エピトープから構成される。
いくつかの実施形態では、インプット無核細胞は、無核細胞由来小胞の調製中に、（ａ）熱処理、（ｂ）化学処理、及び／又は（ｃ）低張条件若しくは高張条件に供されなかった。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度は、インプット無核細胞からの無核細胞由来小胞の調製中に維持された。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約６００ｍＯｓｍに維持された。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓｍ～約４００ｍＯｓｍに維持された。
システム及びキット
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に開示される方法で使用するための、狭窄部、無核細胞懸濁液、変異型Ｒａｓ抗原、又はアジュバントのうちの１つ以上を含むシステムを提供する。システムは、細胞変形狭窄部、細胞懸濁液、細胞摂動、送達パラメータ、化合物、及び／若しくはアプリケーションなどを提供するためのマイクロ流体チャネル又は細孔を有する表面を含む、上記で開示された方法について記載された任意の実施形態を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞変形狭窄部は、無核細胞への送達のためにサイズ設定される。いくつかの実施形態では、操作流速、細胞及び化合物濃度、狭窄部内の細胞の速度、並びに細胞懸濁液の組成（例えば、浸透圧、塩濃度、血清含有量、細胞濃度、ｐＨなど）などの送達パラメータは、免疫応答を抑制する、又は寛容を誘導するための化合物の応答が最大になるように最適化される。
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に開示される方法で使用するための、狭窄部、無核細胞懸濁液、変異型Ｒａｓ抗原、又はアジュバントのうちの１つ以上を含むシステムを提供する。システムは、細胞変形狭窄部、細胞懸濁液、細胞摂動、送達パラメータ、化合物、及び／若しくはアプリケーションなどを提供するためのマイクロ流体チャネル又は細孔を有する表面を含む、上記で開示された方法について記載された任意の実施形態を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞変形狭窄部は、無核細胞への送達のためにサイズ設定される。いくつかの実施形態では、操作流速、細胞及び化合物濃度、狭窄部内の細胞の速度、並びに細胞懸濁液の組成（例えば、浸透圧、塩濃度、血清含有量、細胞濃度、ｐＨなど）などの送達パラメータは、免疫応答を抑制する、又は寛容を誘導するための化合物の応答が最大になるように最適化される。
また、Ｒａｓ変異に関連するがんを有する個体の治療において使用するためのキット又は物品も提供される。いくつかの実施形態では、キットは、細胞内に変異抗原を含み、細胞内にアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む。いくつかの実施形態では、キットは、がんなどのＲａｓ変異に関連するがんを有する個体の治療において使用するための無核細胞由来小胞を生成する際に使用するための、狭窄部、無核細胞懸濁液、変異型Ｒａｓ抗原、又はアジュバントのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは、好適なパッケージング内に、本明細書に記載される組成物（例えば、細孔を含むマイクロ流体チャネル若しくは表面、細胞懸濁液、及び／又は化合物）を含む。好適なパッケージング材料は当技術分野で公知であり、例えば、バイアル（密閉バイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、瓶、柔軟なパッケージング（例えば、密閉マイラ又はビニールバッグ）などを含む。これらの製造品は更に、滅菌及び／又は密封され得る。
本発明はまた、本明細書に記載される方法の構成要素を含むキットを提供し、Ｒａｓ変異に関連するがんを有する個体を治療する該方法を実施するための指示、並びに／又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを無核細胞に導入するための指示を更に含み得る。本明細書に記載されるキットは、本明細書に記載されるいずれかの方法を実施するための指示、例えば、Ｒａｓ変異に関連するがんを有する個体を治療するための指示、又は細胞内に変異型Ｒａｓ抗原及び細胞内にアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成するための指示を伴う、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、及び添付文書を含む他の材料を更に含み得る。
例示的な実施形態
実施形態１．個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法。
実施形態１．個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法。
実施形態２．個体において腫瘍成長を低減させるための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法。
実施形態３．ワクチン接種を必要とする個体にそれを実施するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法。
実施形態４．個体が、がんを有する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５．個体においてがんを治療するための方法であって、方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、方法。
実施形態６．がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである、実施形態４又は５に記載の方法。
実施形態７．変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原、変異型Ｈ－Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｎ－Ｒａｓ抗原である、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８．変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ａ抗原又は変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ｂ抗原である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９．変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する単一のポリペプチドである、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０．変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１．変異型Ｒａｓ抗原が、１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープ及び１つ以上の異種性ペプチド配列を含むポリペプチドである、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２．変異型Ｒａｓ抗原が、他の抗原又はアジュバントと複合体化する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３．変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４．変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５．変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６．変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２抗原のうちの１つ以上である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７．変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８．変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９．変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接する１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０．変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１．変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２．無核細胞が、アジュバントを更に含む、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３．組成物が、アジュバントと併せて投与される、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４．アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、実施形態２２又は２３に記載の方法。
実施形態２５．アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、実施形態２２～２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６．変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、により調製される、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、により調製される、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２７．変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２８．変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９．狭窄部の幅が、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０．狭窄部の幅が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである、実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１．複数のインプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される、実施形態２６～３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２．無核細胞が、赤血球又は血小板である、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３．無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４．無核細胞由来小胞を含む組成物が、複数回投与される、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３５．組成物が、静脈内に投与される、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６．個体が、ヒトである、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７．組成物が、別の療法の投与の前に、同時発生的に、又は後に投与される、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３８．別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される、化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである、実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９．無核細胞由来小胞を含む組成物であって、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で無核細胞由来小胞に送達される、組成物。
実施形態４０．組成物が、アジュバントを更に含む、実施形態３９に記載の組成物。
実施形態４１．アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、実施形態４０に記載の組成物。
実施形態４２．前記アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、実施形態４０又は４１に記載の組成物。
実施形態４３．変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物であって、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、により調製される、組成物。
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、により調製される、組成物。
実施形態４４．変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物であって、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、核酸が、変異型Ｒａｓ抗原を発現し、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、組成物。
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、核酸が、変異型Ｒａｓ抗原を発現し、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、組成物。
実施形態４５．変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物であって、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、組成物。
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、組成物。
実施形態４６．狭窄部の幅が、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態４３～４４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４７．狭窄部の幅が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである、実施形態４３～４６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４８．インプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される、実施形態４３～４７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４９．インプット無核細胞が、赤血球又は血小板である、実施形態４３～４８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５０．インプット無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである、実施形態４３～４８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５１．無核細胞由来小胞が、赤血球由来小胞又は血小板由来小胞である、実施形態３８～４８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５２．無核細胞由来小胞が、レチクロサイト由来小胞又はエリスロサイト由来小胞である、実施形態３８～４８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５３．変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原、変異型Ｈ－Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｎ－Ｒａｓ抗原である、実施形態３８～５２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５４．変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ａ抗原又は変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ｂ抗原である、実施形態３８～５３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５５．変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する単一のポリペプチドである、実施形態３８～５４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５６．変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである、実施形態３８～５５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５７．変異型Ｒａｓ抗原が、他の抗原又はアジュバントと複合体化する、実施形態３８～５６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５８．変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異を含む、実施形態３８～５７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５９．変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３８～５８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６０．変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のアミノ酸配列を含む、実施形態３８～５９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６１．変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９抗原、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２抗原のうちの１つ以上である、実施形態５１～６０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６２．変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３８～６１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６３．変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のアミノ酸配列を含む、実施形態３８～６２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６４．変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接する１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである、実施形態３８～６３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６５．変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である、実施形態３８～６４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６６．変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である、実施形態３８～６５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６７．組成物が、アジュバントを更に含む、実施形態３８～６６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６８．アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、実施形態６７に記載の組成物。
実施形態６９．アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、実施形態６７又は６８に記載の組成物。
実施形態７０．個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫反応を刺激するための組成物であって、組成物が、有効量の実施形態３９～６９のいずれか１つに記載の組成物を含む、組成物。
実施形態７１．個体において腫瘍成長を低減させるための組成物であって、組成物が、有効量の実施形態３９～６９のいずれか１つに記載の組成物を含む、組成物。
実施形態７２．個体が、がんを有する、実施形態７０又は７１に記載の組成物。
実施形態７３．個体においてがんを治療するための組成物であって、組成物が、有効量の実施形態３９～６９のいずれか１つに記載の組成物を含む、組成物。
実施形態７４．がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである、実施形態７２又は７３に記載の組成物。
実施形態７５．組成物が、アジュバントを更に含む、実施形態７１～７４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７６．組成物が、アジュバントと併せて投与される、実施形態７１～７４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７７．アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、実施形態７６に記載の組成物。
実施形態７８．アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、実施形態７６又は７７に記載の組成物。
実施形態７９．無核細胞を含む組成物が、複数回投与される、実施形態７０～７８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８０．組成物が、静脈内に投与される、実施形態７０～７９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８１．個体が、ヒトである、実施形態７０～８０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８２．組成物が、別の療法の投与の前に、同時発生的に、又は後に投与される、実施形態７０～８１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８３．別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される、化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである、実施形態８２に記載の組成物。
実施形態８４．変異型Ｒａｓに対する免疫応答を刺激するための薬物の製造における有効量の無核細胞を含む組成物の使用であって、組成物が、有効量の実施形態３９～６９のいずれか１つに記載の組成物を含む、使用。
実施形態８５．個体において腫瘍成長を低減させるための薬物の製造における有効量の無核細胞を含む組成物の使用であって、組成物が、有効量の実施形態３９～６９のいずれか１つに記載の組成物を含む、使用。
実施形態８６．個体が、がんを有する、実施形態８４又は８５に記載の使用。
実施形態８７．個体においてがんを治療するための薬物の製造における有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物の使用であって、組成物が、有効量の実施形態３８～６１のいずれか１つに記載の組成物を含む、使用。
実施形態８８．がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである、実施形態８６又は８７に記載の使用。
実施形態８９．組成物が、アジュバントを更に含む、実施形態８４～８８のいずれか１つに記載の使用。
実施形態９０．組成物が、アジュバントと併せて投与するために製剤化される、実施形態８４～８９のいずれか１つに記載の使用。
実施形態９１．アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、実施形態９０に記載の使用。
実施形態９２．アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、実施形態８４～８９のいずれか１つに記載の使用。
実施形態９３．無核細胞由来小胞を含む組成物が、複数回投与される、実施形態８４～９２のいずれか１つに記載の使用。
実施形態９４．組成物が、静脈内に投与される、実施形態８４～９３のいずれか１つに記載の使用。
実施形態９５．個体が、ヒトである、実施形態８４～９４のいずれか１つに記載の使用。
実施形態９６．組成物が、別の療法の投与の前に、同時発生的に、又は後に投与される、実施形態８４～９５のいずれか１つに記載の使用。
実施形態９７．前記別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される、化学療法、又は放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである、実施形態９６に記載の使用。
実施形態９８．実施形態１～３８のいずれか１つに記載の方法で使用するための、キット。
実施形態９９．実施形態３９～６９のいずれか１つに記載の組成物を含む、キット。
実施形態１００．キットが、組成物を個体に投与して、変異型Ｒａｓに対する免疫反応を刺激する、腫瘍成長を低減させる、及び／又はがんを治療するための指示を伴う、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、又は添付文書のうちの１つ以上を更に含む、実施形態９８又は９９に記載のキット。
実施形態１０１．変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生産するための方法であって、方法が、変異型Ｒａｓ抗原を細胞内で無核細胞由来小胞に導入することを含む、方法。
実施形態１０２．無核細胞が、アジュバントを更に含む、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０３．アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１０２に記載の方法。
実施形態１０４．アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、実施形態１０２又は１０３に記載の方法。
実施形態１０５．変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ及びアジュバントを細胞内で無核細胞由来小胞に導入することが、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、を含む、実施形態１０４に記載の方法。
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、を含む、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０６．変異型Ｒａｓ抗原を細胞内で無核細胞由来小胞に導入することが、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、核酸が、変異型Ｒａｓ抗原を発現し、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞を生成する、インキュベートすることと、を含む、実施形態１０４に記載の方法。
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸とインキュベートすることであって、核酸が、変異型Ｒａｓ抗原を発現し、それにより、変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞を生成する、インキュベートすることと、を含む、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０７．無核細胞由来小胞が、細胞内にアジュバントを更に含み、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを細胞内で無核細胞に導入することが、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、を含む、実施形態１０４に記載の方法。
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、狭窄部の直径が、懸濁液中のインプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさのインプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、摂動インプット無核細胞を、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントとインキュベートすることであって、変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が発現され、それにより、変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、を含む、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０８．狭窄部の幅が、インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態１０５～１０７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０９．狭窄部の幅が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである、実施形態１０５～１０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１０．複数のインプット無核細胞を含む細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される、実施形態１０５～１０９のいずれか１つに記載の方法。
当業者は、いくつかの実施形態が本発明の範囲内及び精神内で可能であることを認識するであろう。ここで、本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より詳細に記述されるであろう。以下の実施例は、本発明を更に説明するものであるが、当然のことながら、その範囲をいかなる方法でも制限していると解釈されるべきではない。
実施例１
変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原を圧搾負荷した無核細胞小胞が、ヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって内在化され得るかを決定するために、健康なヒトドナーからの赤血球を、１つ以上変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原の存在下で圧搾処理し、得られた抗原を負荷した無核小胞を、樹状細胞による取り込みについてインビトロで試験した。
変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原を圧搾負荷した無核細胞小胞が、ヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって内在化され得るかを決定するために、健康なヒトドナーからの赤血球を、１つ以上変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原の存在下で圧搾処理し、得られた抗原を負荷した無核小胞を、樹状細胞による取り込みについてインビトロで試験した。
方法
単球由来樹状細胞（ＭＯＤＣ）を、ＣＤ１４＋単球からの５日間のＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４分化を通してＨＬＡドナーから生成した。これらのＭＯＤＣは、ヒトＡＰＣのインビトロモデルとして使用することができる（本出願全体を通した本実施例及び他の実施例において）。ＨＬＡドナーは、サブグループＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０８を含む任意のサブグループからであり得る。
単球由来樹状細胞（ＭＯＤＣ）を、ＣＤ１４＋単球からの５日間のＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４分化を通してＨＬＡドナーから生成した。これらのＭＯＤＣは、ヒトＡＰＣのインビトロモデルとして使用することができる（本出願全体を通した本実施例及び他の実施例において）。ＨＬＡドナーは、サブグループＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０８を含む任意のサブグループからであり得る。
ＰＫＨ２６標識ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ（Ｋ－Ｒａ 抗原及びアジュバントを含む活性化抗原担体）を、健康なヒトドナーから赤血球（ＲＢＣ）を採取し、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む２つの合成ロングペプチド（ＳＬＰ）でＲＢＣを圧搾処理する前に、親油性蛍光膜色素であるＰＫＨ２６で標識し、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原及びアジュバント（ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ）を含むＰＫＨ２６標識無核細胞小胞を形成することによって生成した。２つのＳＬＰは、１つ以上のＧ１２Ｄ ＳＬＰ、１つ以上のＧ１２Ｖ ＳＬＰ、又は少なくとも１つのＧ１２Ｄ ＳＬＰ及び少なくとも１つのＧ１２Ｖ ＳＬＰから選択される２つ以上のＳＬＰの組み合わせであり得る。アジュバントは、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）を含む、当該技術分野で公知のアジュバントであり得る。次いで、ヒトドナーＭＯＤＣを、ＰＫＨ２６標識ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓと３７℃又は４℃で一晩共培養し、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ内在化についてアッセイするのために、ＭＯＤＣ試料をフローサイトメトリーを介してアッセイし、ＭＯＤＣに関連するＰＫＨ２６ 蛍光をＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
結果
ＰＫＨ２６蛍光（生物学的複製又は三重の平均の平均±標準偏差）は、ＰＫＨ２６標識ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓと３７℃及び４℃で共培養したＭＯＤＣから検出され、ヒトＡＰＣによる圧搾－ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓのインビトロでの取り込みを示す。
ＰＫＨ２６蛍光（生物学的複製又は三重の平均の平均±標準偏差）は、ＰＫＨ２６標識ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓと３７℃及び４℃で共培養したＭＯＤＣから検出され、ヒトＡＰＣによる圧搾－ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓのインビトロでの取り込みを示す。
実施例２
ＲＢＣから生成されたＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓの内在化に続いて、抗原提示細胞によって抗原特異的応答が誘導されるかを決定するために、ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ及びＭＯＤＣとのインビトロでの共培養後の抗原特異的応答性Ｔ細胞の活性化を、ＩＦＮ－γ発現又は分泌アッセイによって測定した。
ＲＢＣから生成されたＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓの内在化に続いて、抗原提示細胞によって抗原特異的応答が誘導されるかを決定するために、ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ及びＭＯＤＣとのインビトロでの共培養後の抗原特異的応答性Ｔ細胞の活性化を、ＩＦＮ－γ発現又は分泌アッセイによって測定した。
方法
ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ機能の読み取りは、ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ、ＭＯＤＣ、及び抗原特異的ＣＤ８＋応答性Ｔ細胞のインビトロでの共培養物を含む、馴化培地中のＩＦＮ－γ分泌を測定することによって決定することができる。２人の健康なヒトドナーからの赤血球（ＲＢＣ）を、２つの合成ロングペプチド（ＳＬＰ）（Ｇ１２Ｄからの１つ以上、Ｇ１２Ｖからの１つ以上、又はＧ１２Ｄ及びＧ１２Ｖペプチドの組み合わせのいずれか）及びアジュバントポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）の混合物で圧搾処理し、ＡＡＣ－ＫＲＡＳを生成した。Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ ＳＬＰは、ＨＬＡ拘束性エピトープを含み、その提示により、それぞれのＫ－Ｒａｓ変異を含む細胞に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導することができる。ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓの異なるバッチを個別にＨＬＡ＋ＭＯＤＣ及びＨＬＡ＋拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養し、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌のレベルを、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、又はフローサイトメトリー系アッセイにより測定することができる。
ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ機能の読み取りは、ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ、ＭＯＤＣ、及び抗原特異的ＣＤ８＋応答性Ｔ細胞のインビトロでの共培養物を含む、馴化培地中のＩＦＮ－γ分泌を測定することによって決定することができる。２人の健康なヒトドナーからの赤血球（ＲＢＣ）を、２つの合成ロングペプチド（ＳＬＰ）（Ｇ１２Ｄからの１つ以上、Ｇ１２Ｖからの１つ以上、又はＧ１２Ｄ及びＧ１２Ｖペプチドの組み合わせのいずれか）及びアジュバントポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）の混合物で圧搾処理し、ＡＡＣ－ＫＲＡＳを生成した。Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ ＳＬＰは、ＨＬＡ拘束性エピトープを含み、その提示により、それぞれのＫ－Ｒａｓ変異を含む細胞に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導することができる。ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓの異なるバッチを個別にＨＬＡ＋ＭＯＤＣ及びＨＬＡ＋拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養し、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌のレベルを、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、又はフローサイトメトリー系アッセイにより測定することができる。
ＭＯＤＣは、ＨＬＡハプロタイプ型の健康なドナーから単離されたＣＤ１４＋単球を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及びインターロイキン４で５日間刺激することによって生成した。培地（ＡＡＣを含まない）中のＫ－Ｒａｓ変異特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養したＭＯＤＣを、陰性対照として使用した。ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ依存性活性を周囲の培地の活性と区別するために、ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓ流動相を含む溶液を、ＭＯＤＣ及びＫ－Ｒａｓ変異特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。遊離Ｋ－Ｒａｓ変異ＳＬＰの存在下でインキュベートし、Ｋ－Ｒａｓ変異特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養したＭＯＤＣは、陽性対照としての役割を果たす。リポ多糖類（ＬＰＳ）は、ＡＡＣ－Ｋ－ＲａｓのインビトロでのＭＯＤＣ処理を強化するために使用し、対照の目的のために全ての共培養群に適用した。分泌されたＩＦＮ－γの量を、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡを使用して決定した。
結果
ドナーＲＢＣから生成されたＡＡＣ－Ｋ－ＲａｓとＭＯＤＣ及び応答体の共培養によって誘導された応答性ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌の変化は、変異Ｋ－Ｒａｓ最小エピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞から機能的な抗原特異的応答が誘発される、ＭＯＤＣによるＨＬＡ拘束性変異Ｋ－Ｒａｓエピトープの提示をもたらす、ヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓのインビトロでの取り込みを実証するために、野生型Ｋ－Ｒａｓ対照、流動相対照、及び未処理対照との共培養からのものと比較した。
ドナーＲＢＣから生成されたＡＡＣ－Ｋ－ＲａｓとＭＯＤＣ及び応答体の共培養によって誘導された応答性ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌の変化は、変異Ｋ－Ｒａｓ最小エピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞から機能的な抗原特異的応答が誘発される、ＭＯＤＣによるＨＬＡ拘束性変異Ｋ－Ｒａｓエピトープの提示をもたらす、ヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓのインビトロでの取り込みを実証するために、野生型Ｋ－Ｒａｓ対照、流動相対照、及び未処理対照との共培養からのものと比較した。
実施例３
ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓとのインキュベーションが、抗原提示細胞のインビトロでの成熟を媒介できるかを決定するために、ＡＡＣ－Ｋ－ＲａｓをＭＯＤＣと共培養し、ＭＯＤＣの成熟マーカーの変化をフローサイトメトリーを使用して評価した。
ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓとのインキュベーションが、抗原提示細胞のインビトロでの成熟を媒介できるかを決定するために、ＡＡＣ－Ｋ－ＲａｓをＭＯＤＣと共培養し、ＭＯＤＣの成熟マーカーの変化をフローサイトメトリーを使用して評価した。
方法
単球由来樹状細胞（ＭＯＤＣ）を、ＣＤ１４＋単球の５日間のＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４分化を通してＨＬＡドナーから生成した。これらのＭＯＤＣを、ヒトＡＰＣのインビトロモデルとして使用した。ＨＬＡドナーは、サブグループＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０８を含む任意のサブグループからである。
単球由来樹状細胞（ＭＯＤＣ）を、ＣＤ１４＋単球の５日間のＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４分化を通してＨＬＡドナーから生成した。これらのＭＯＤＣを、ヒトＡＰＣのインビトロモデルとして使用した。ＨＬＡドナーは、サブグループＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０８を含む任意のサブグループからである。
ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓを、３人の健康なヒトドナーからＲＢＣを採取し、２つの合成ロングペプチド（ＳＬＰ）（１つ以上のＧ１２Ｄ ＳＬＰ、１つ以上のＧ１２Ｖ ＳＬＰ、又は２つ以上のＧ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ ＳＬＰの組み合わせのいずれか）及びアジュバントポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリ Ｉ：Ｃ）の混合物で圧搾処理し、アジュバント及びＳＬＰのそれぞれの混合物を含むＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓを生成することによって生成した。Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ ＳＬＰは、ＨＬＡ拘束性エピトープを含み、その提示により、それぞれのＫ－Ｒａｓ変異を含む細胞に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導することができる。ＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓの３つのバッチを、個別にＨＬＡ＋ＭＯＤＣと共培養し、成熟マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＭＨＣ－ＩＩ）の上方制御を、共培養の約４６時間後にフローサイトメトリーにより評価した。データは、培地及び空の対照と比較した。
結果
ＡＡＣ－Ｋ－ＲａｓをヒトＭＯＤＣ抗原提示細胞（ＡＰＣ）とインキュベーションした後、ＭＯＤＣ上の成熟マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＭＨＣ－ＩＩ）のレベルの変化を測定し、それらのうちの１つ以上の上方制御が、それぞれのＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓが、ＭＯＤＣのインビトロでの成熟を媒介できることを示すことができる。
ＡＡＣ－Ｋ－ＲａｓをヒトＭＯＤＣ抗原提示細胞（ＡＰＣ）とインキュベーションした後、ＭＯＤＣ上の成熟マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＭＨＣ－ＩＩ）のレベルの変化を測定し、それらのうちの１つ以上の上方制御が、それぞれのＡＡＣ－Ｋ－Ｒａｓが、ＭＯＤＣのインビトロでの成熟を媒介できることを示すことができる。
実施例４
変異Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原で圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞を活性化できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｄ抗原で圧搾処理し、Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はフローサイトメトリー系アッセイによって測定され得る。
変異Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ抗原で圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞を活性化できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｄ抗原で圧搾処理し、Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はフローサイトメトリー系アッセイによって測定され得る。
方法
ヒトドナーＲＢＣを単離した。細胞を、ＲＰＭＩ中の１００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｄ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照を用いて、６０ｐｓｉで２×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度でマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。
ヒトドナーＲＢＣを単離した。細胞を、ＲＰＭＩ中の１００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｄ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照を用いて、６０ｐｓｉで２×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度でマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。
次いで、Ｇ１２Ｄ抗原及びアジュバント（ＡＡＣ）を含む圧搾処理したＲＢＣを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート上でＡＰＣ及びＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ応答性Ｔ細胞とインキュベートした。Ｇ１２Ｄ抗原を含むＡＡＣの任意の内在化の後、Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ応答性Ｔ細胞に対するＨＬＡ拘束性Ｇ１２Ｄエピトープを提示するＡＰＣの効果は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定することができる。陽性対照として、最小エピトープを含むＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄペプチドを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート中の未処理のＭＯＤＣ及び応答性細胞に直接追加した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、製造元の指示に従って展開／定量した。
結果
Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＡＡＣ、及びＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、その上方制御は、Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＡＡＣがＡＰＣ によって内在化され、その後抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化を媒介することを示す。
Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＡＡＣ、及びＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、その上方制御は、Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＡＡＣがＡＰＣ によって内在化され、その後抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化を媒介することを示す。
実施例５
変異Ｋ－Ｒａｓ抗原で圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞を活性化できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｄ抗原で圧搾処理し、Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はフローサイトメトリー系アッセイによって測定され得る。
変異Ｋ－Ｒａｓ抗原で圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞を活性化できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｄ抗原で圧搾処理し、Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はフローサイトメトリー系アッセイによって測定され得る。
方法
ヒトドナーＲＢＣを単離し、ＲＰＭＩ中の１００μＭの合成ロングペプチド（野生型Ｋ－Ｒａｓ又はＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照を用いて、６０ ｐｓｉでマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。次いで、アジュバント及びＷＴ Ｋ－Ｒａｓ又はＧ１２Ｄ抗原（ＡＡＣ）のいずれかを含む圧搾処理したＲＢＣを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート上でＡＰＣ及びＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ応答性Ｔ細胞とインキュベートした。ＷＴ Ｋ－Ｒａｓ又はＧ１２Ｄ抗原を含むＡＡＣの任意の内在化の後、Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ応答性Ｔ細胞に対するＨＬＡ拘束性ＷＴ Ｋ－Ｒａｓ又はＧ１２Ｄエピトープを提示するＡＰＣの効果は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定することができる。対照として、最小エピトープのＷＴ又はＧ１２Ｄバージョンのいずれかを含むペプチドを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート中の未処理のＭＯＤＣ及び応答性細胞に直接追加した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、製造元の指示に従って展開／定量した。
ヒトドナーＲＢＣを単離し、ＲＰＭＩ中の１００μＭの合成ロングペプチド（野生型Ｋ－Ｒａｓ又はＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照を用いて、６０ ｐｓｉでマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。次いで、アジュバント及びＷＴ Ｋ－Ｒａｓ又はＧ１２Ｄ抗原（ＡＡＣ）のいずれかを含む圧搾処理したＲＢＣを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート上でＡＰＣ及びＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ応答性Ｔ細胞とインキュベートした。ＷＴ Ｋ－Ｒａｓ又はＧ１２Ｄ抗原を含むＡＡＣの任意の内在化の後、Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ応答性Ｔ細胞に対するＨＬＡ拘束性ＷＴ Ｋ－Ｒａｓ又はＧ１２Ｄエピトープを提示するＡＰＣの効果は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定することができる。対照として、最小エピトープのＷＴ又はＧ１２Ｄバージョンのいずれかを含むペプチドを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート中の未処理のＭＯＤＣ及び応答性細胞に直接追加した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、製造元の指示に従って展開／定量した。
結果
Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＡＡＣ、及びＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、その上方制御は、Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＡＡＣがＡＰＣによって内在化され、その後抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化を媒介することを示す。更に、Ｇ１２Ｄを圧搾負荷したＡＡＣによって媒介されたＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量の上方制御は、野生型Ｋ－Ｒａｓ抗原を圧搾負荷したＡＡＣによる同等の効果の欠如とは対照的に、抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化が変異特異的であることを更に示すことができる。
Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＡＡＣ、及びＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、その上方制御は、Ｇ１２Ｄ抗原を圧搾負荷したＡＡＣがＡＰＣによって内在化され、その後抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化を媒介することを示す。更に、Ｇ１２Ｄを圧搾負荷したＡＡＣによって媒介されたＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量の上方制御は、野生型Ｋ－Ｒａｓ抗原を圧搾負荷したＡＡＣによる同等の効果の欠如とは対照的に、抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化が変異特異的であることを更に示すことができる。
実施例６
変異Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原で圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞を活性化できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｖ抗原で圧搾処理し、Ｇ１２Ｖ抗原を圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｖ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はフローサイトメトリー系アッセイによって測定され得る。
変異Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｖ抗原で圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞を活性化できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｖ抗原で圧搾処理し、Ｇ１２Ｖ抗原を圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｖ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はフローサイトメトリー系アッセイによって測定され得る。
方法
ヒトドナーＲＢＣを単離した。細胞を、ＲＰＭＩ中の１００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照を用いて、６０ｐｓｉで２×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度でマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。
ヒトドナーＲＢＣを単離した。細胞を、ＲＰＭＩ中の１００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照を用いて、６０ｐｓｉで２×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度でマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。
次いで、Ｇ１２Ｖ抗原及びアジュバント（ＡＡＣ）を含む圧搾処理したＲＢＣを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート上でＡＰＣ及びＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ応答性Ｔ細胞とインキュベートした。Ｇ１２Ｖ抗原を含むＡＡＣの任意の内在化の後、Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ応答性Ｔ細胞に対するＨＬＡ拘束性Ｇ１２Ｖエピトープを提示するＡＰＣの効果は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定することができる。陽性対照として、最小エピトープを含むＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖペプチドを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート中の未処理のＭＯＤＣ及び応答性細胞に直接追加した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、製造元の指示に従って展開／定量した。
結果
Ｇ１２Ｖ抗原を圧搾負荷したＡＡＣ、続いてＧ１２Ｖ特異的応答性細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、その上方制御は、Ｇ１２Ｖ抗原を圧搾負荷したＡＡＣがＡＰＣ によって内在化され、その後抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化を媒介することを示す。
Ｇ１２Ｖ抗原を圧搾負荷したＡＡＣ、続いてＧ１２Ｖ特異的応答性細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、その上方制御は、Ｇ１２Ｖ抗原を圧搾負荷したＡＡＣがＡＰＣ によって内在化され、その後抗原特異的Ｔ細胞応答の活性化を媒介することを示す。
実施例７
Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせで圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞の活性化を媒介できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせで圧搾処理し、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせを圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はフローサイトメトリー系アッセイによって測定され得る。
Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせで圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞の活性化を媒介できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせで圧搾処理し、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせを圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はフローサイトメトリー系アッセイによって測定され得る。
方法
ヒトドナーＲＢＣを単離し、ＲＰＭＩ中の単一のＧ１２Ｄ合成ロングペプチド（ＳＬＰ）、１つのＧ１２Ｄ ＳＬＰ及び１つのＧ１２Ｖ ＳＬＰの組み合わせ、又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照のいずれかを用いて、６０ ｐｓｉでマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。
ヒトドナーＲＢＣを単離し、ＲＰＭＩ中の単一のＧ１２Ｄ合成ロングペプチド（ＳＬＰ）、１つのＧ１２Ｄ ＳＬＰ及び１つのＧ１２Ｖ ＳＬＰの組み合わせ、又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照のいずれかを用いて、６０ ｐｓｉでマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。
次いで、それぞれの抗原を含む圧搾処理したＲＢＣ（ＡＡＣ）を、ＥＬＩＳＰＯＴプレート上でＡＰＣ及びＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ応答性Ｔ細胞とインキュベートした。Ｇ１２Ｄ抗原を含むＡＡＣの任意の内在化の後、Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ応答性Ｔ細胞に対するＨＬＡ拘束性Ｇ１２Ｄエピトープを提示するＡＰＣの効果は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定することができる。陽性対照として、最小エピトープを含むＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄペプチドを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート中の未処理のＭＯＤＣ及び応答性細胞に直接追加した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、製造元の指示に従って展開／定量した。
結果
ＡＡＣ（Ｇ１２Ｄ抗原又はＧ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせのいずれかを圧搾負荷した）、及びＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、いずれかのＡＡＣ試料と接触したＡＰＣによって誘導された同等の上方制御は、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２変異ＳＬＰの組み合わせで圧搾処理したＲＢＣが、Ｇ１２Ｄのみ圧搾処理したＲＢＣと同程度に、インビトロでＧ１２Ｄ応答性Ｔ細胞を活性化できること、及びＧ１２Ｄ ＳＬＰを含むＡＡＣにＧ１２Ｖ ＳＬＰペイロードを追加しても、Ｇ１２Ｄ ＳＬＰを含む ＡＡＣによって媒介されるＧ１２Ｄ特異的Ｔ細胞の応答に大きな変化が生じないことを示す。
ＡＡＣ（Ｇ１２Ｄ抗原又はＧ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせのいずれかを圧搾負荷した）、及びＧ１２Ｄ特異的応答性Ｔ細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、いずれかのＡＡＣ試料と接触したＡＰＣによって誘導された同等の上方制御は、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２変異ＳＬＰの組み合わせで圧搾処理したＲＢＣが、Ｇ１２Ｄのみ圧搾処理したＲＢＣと同程度に、インビトロでＧ１２Ｄ応答性Ｔ細胞を活性化できること、及びＧ１２Ｄ ＳＬＰを含むＡＡＣにＧ１２Ｖ ＳＬＰペイロードを追加しても、Ｇ１２Ｄ ＳＬＰを含む ＡＡＣによって媒介されるＧ１２Ｄ特異的Ｔ細胞の応答に大きな変化が生じないことを示す。
実施例８
Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせで圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞の活性化を媒介できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせで圧搾処理し、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせを圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｖ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定され得る。
Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせで圧搾処理したヒトＲＢＣが、インビトロで抗原特異的応答性Ｔ細胞の活性化を媒介できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせで圧搾処理し、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせを圧搾負荷したＲＢＣと接触させたＡＰＣと共培養した後のＧ１２Ｖ特異的応答性Ｔ細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γの発現及び／又は分泌）が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定され得る。
方法
ヒトドナーＲＢＣを単離し、ＲＰＭＩ中の単一のＧ１２Ｖ合成ロングペプチド（ＳＬＰ）、１つのＧ１２Ｄ ＳＬＰ及び１つのＧ１２Ｖ ＳＬＰの組み合わせ、又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照のいずれかを用いて、６０ ｐｓｉでマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。
ヒトドナーＲＢＣを単離し、ＲＰＭＩ中の単一のＧ１２Ｖ合成ロングペプチド（ＳＬＰ）、１つのＧ１２Ｄ ＳＬＰ及び１つのＧ１２Ｖ ＳＬＰの組み合わせ、又はビヒクル（ＤＭＳＯ）対照のいずれかを用いて、６０ ｐｓｉでマイクロ流体チップを介して、室温で圧搾処理した。圧搾処理後、ＲＢＣを遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｒ１０培地で１回、次いでＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）で２回洗浄した後、ＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。
次いで、それぞれの抗原を含む圧搾処理したＲＢＣ（ＡＡＣ）を、ＥＬＩＳＰＯＴプレート上でＡＰＣ及びＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ応答性Ｔ細胞とインキュベートした。Ｇ１２Ｖ抗原を含むＡＡＣの任意の内在化の後、Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ応答性Ｔ細胞に対するＨＬＡ拘束性Ｇ１２Ｖエピトープを提示するＡＰＣの効果は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定することができる。陽性対照として、最小エピトープを含むＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖペプチドを、ＥＬＩＳＰＯＴプレート中の未処理のＭＯＤＣ及び応答性細胞に直接追加した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、製造元の指示に従って展開／定量した。
結果
ＡＡＣ（Ｇ１２Ｖ抗原又はＧ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせのいずれかを圧搾負荷した）、及びＧ１２Ｖ特異的応答性Ｔ細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、いずれかのＡＡＣ試料と接触したＡＰＣによって誘導された同等の上方制御は、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２変異ＳＬＰの組み合わせで圧搾処理したＲＢＣが、Ｇ１２Ｖのみ圧搾処理したＲＢＣと同程度に、インビトロでＧ１２Ｖ応答性Ｔ細胞を活性化できること、及びＧ１２Ｄ ＳＬＰを含むＡＡＣにＧ１２Ｖ ＳＬＰペイロードを追加しても、Ｇ１２Ｖ ＳＬＰを含むＡＡＣによって媒介されるＧ１２Ｖ特異的Ｔ細胞の応答に大きな変化が生じないことを示す。
ＡＡＣ（Ｇ１２Ｖ抗原又はＧ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ抗原の組み合わせのいずれかを圧搾負荷した）、及びＧ１２Ｖ特異的応答性Ｔ細胞とＡＰＣをインキュベーションした後、ＩＦＮ－γを発現するＴ細胞の量を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、いずれかのＡＡＣ試料と接触したＡＰＣによって誘導された同等の上方制御は、Ｋ－Ｒａｓ－Ｇ１２変異ＳＬＰの組み合わせで圧搾処理したＲＢＣが、Ｇ１２Ｖのみ圧搾処理したＲＢＣと同程度に、インビトロでＧ１２Ｖ応答性Ｔ細胞を活性化できること、及びＧ１２Ｄ ＳＬＰを含むＡＡＣにＧ１２Ｖ ＳＬＰペイロードを追加しても、Ｇ１２Ｖ ＳＬＰを含むＡＡＣによって媒介されるＧ１２Ｖ特異的Ｔ細胞の応答に大きな変化が生じないことを示す。
実施例９
ヒトＲＢＣにＫ－Ｒａｓ合成長ペプチドを圧搾負荷できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、ＦＡＭで標識したＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰで圧搾処理した。次いで、圧搾負荷したＲＢＣ（ＡＡＣ）を、ＦＡＭ蛍光についてフローサイトメトリーを使用して分析した。
ヒトＲＢＣにＫ－Ｒａｓ合成長ペプチドを圧搾負荷できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、ＦＡＭで標識したＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰで圧搾処理した。次いで、圧搾負荷したＲＢＣ（ＡＡＣ）を、ＦＡＭ蛍光についてフローサイトメトリーを使用して分析した。
方法
ヒトＲＢＣを単離し、室温（ＲＴ）、３７℃、又は氷で少なくとも１５分間、ＲＰＭＩ中で合成ロングペプチドとインキュベートした。次いで、ＲＢＣを、１００μＭのＦＡＭ標識Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ１－１６の存在下、６０ｐｓｉで、幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍのマイクロ流体狭窄部を通して、２×１０９細胞／ｍＬの密度で圧搾処理した。細胞を、ＤＭＳＯを補充したＲＰＭＩに再懸濁して、最終濃度５％にした。圧搾処理した後、ＲＢＣを、同じ温度（ＲＴ、３７℃、氷のそれぞれ）で２０分間保持し、ＰＢＳで５回洗浄し、ＡＡＣを濃縮し（遠心分離して、形成されるペレットの上部の明るい色の層を収集することにより）、次いで、ＰＢＳで再懸濁した。得られたＡＡＣもアネキシンＶで染色した（データは示さず）。次いで、ＦＡＭ標識ＳＬＰを含むＡＡＣを、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＦＡＭ＋事象を記録した。
ヒトＲＢＣを単離し、室温（ＲＴ）、３７℃、又は氷で少なくとも１５分間、ＲＰＭＩ中で合成ロングペプチドとインキュベートした。次いで、ＲＢＣを、１００μＭのＦＡＭ標識Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖ１－１６の存在下、６０ｐｓｉで、幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍのマイクロ流体狭窄部を通して、２×１０９細胞／ｍＬの密度で圧搾処理した。細胞を、ＤＭＳＯを補充したＲＰＭＩに再懸濁して、最終濃度５％にした。圧搾処理した後、ＲＢＣを、同じ温度（ＲＴ、３７℃、氷のそれぞれ）で２０分間保持し、ＰＢＳで５回洗浄し、ＡＡＣを濃縮し（遠心分離して、形成されるペレットの上部の明るい色の層を収集することにより）、次いで、ＰＢＳで再懸濁した。得られたＡＡＣもアネキシンＶで染色した（データは示さず）。次いで、ＦＡＭ標識ＳＬＰを含むＡＡＣを、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＦＡＭ＋事象を記録した。
結果
図１に示すように、ＦＡＭ標識蛍光の増加は、ヒトＡＡＣにＧ１２Ｖ１－１６ ＳＬＰを負荷できることを示す。加えて、圧搾媒介負荷は、ＲＴ（２５℃）、３７℃、氷上（４℃）を含む、試験した全ての圧搾／保持温度にわたって有効であった。
図１に示すように、ＦＡＭ標識蛍光の増加は、ヒトＡＡＣにＧ１２Ｖ１－１６ ＳＬＰを負荷できることを示す。加えて、圧搾媒介負荷は、ＲＴ（２５℃）、３７℃、氷上（４℃）を含む、試験した全ての圧搾／保持温度にわたって有効であった。
実施例１０
ヒトＲＢＣにＫ－Ｒａｓ合成長ペプチドを圧搾負荷できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、ＦＡＭ標識Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ１－１６ 、又はＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ２－１９ ＳＬＰの存在下で圧搾処理した。次いで、ＡＡＣを、ＦＡＭ＋事象に対してフローサイトメトリーを使用して分析した。
ヒトＲＢＣにＫ－Ｒａｓ合成長ペプチドを圧搾負荷できるかを決定するために、ヒトＲＢＣを、ＦＡＭ標識Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ１－１６ 、又はＫ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ２－１９ ＳＬＰの存在下で圧搾処理した。次いで、ＡＡＣを、ＦＡＭ＋事象に対してフローサイトメトリーを使用して分析した。
方法
ヒトＲＢＣを単離し、１００μＭのＦＡＭ標識Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ１－１６、又はＫ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ２－１９の存在下、６０ｐｓｉで、幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍのマイクロ流体狭窄部を通して、２×１０９細胞／ｍＬの密度で圧搾処理した。細胞を、ＤＭＳＯを補充したＲＰＭＩに再懸濁して、最終濃度５％にした。圧搾処理した後、試料を、室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄し、ＡＡＣを濃縮し（遠心分離して、形成されるペレットの上部の明るい色の層を収集することにより）、次いで、ＰＢＳで再懸濁した。次いで、ＦＡＭ標識ＳＬＰを含むＡＡＣを、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＦＡＭ＋事象を記録した。
ヒトＲＢＣを単離し、１００μＭのＦＡＭ標識Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｄ１－１６、又はＫ－Ｒａｓ－Ｇ１２Ｄ２－１９の存在下、６０ｐｓｉで、幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍのマイクロ流体狭窄部を通して、２×１０９細胞／ｍＬの密度で圧搾処理した。細胞を、ＤＭＳＯを補充したＲＰＭＩに再懸濁して、最終濃度５％にした。圧搾処理した後、試料を、室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄し、ＡＡＣを濃縮し（遠心分離して、形成されるペレットの上部の明るい色の層を収集することにより）、次いで、ＰＢＳで再懸濁した。次いで、ＦＡＭ標識ＳＬＰを含むＡＡＣを、フローサイトメトリーを使用して分析し、ＦＡＭ＋事象を記録した。
結果
図２に示すように、ＦＡＭ標識蛍光の増加は、ヒトＡＡＣがＧ１２Ｄ１－１６、又はＧ１２Ｄ２－１９ ＳＬＰの両方で効率的に負荷され、ＡＡＣの少なくとも４０％に送達されることを示す。
図２に示すように、ＦＡＭ標識蛍光の増加は、ヒトＡＡＣがＧ１２Ｄ１－１６、又はＧ１２Ｄ２－１９ ＳＬＰの両方で効率的に負荷され、ＡＡＣの少なくとも４０％に送達されることを示す。
実施例１１
インビボでの抗原特異的応答性Ｔ細胞の誘発におけるブーストワクチン接種としての抗原担体（ＡＣ）及びアジュバントの共投与の有効性を決定するために、マウスＲＢＣを、Ｇ１２Ｖ抗原で圧搾処理し、様々なブーストスケジュールでＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスにポリＩ：Ｃを共投与した。Ｇ１２Ｖ抗原による刺激後の免疫化マウスから採取した特異的応答性細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌）を、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。
インビボでの抗原特異的応答性Ｔ細胞の誘発におけるブーストワクチン接種としての抗原担体（ＡＣ）及びアジュバントの共投与の有効性を決定するために、マウスＲＢＣを、Ｇ１２Ｖ抗原で圧搾処理し、様々なブーストスケジュールでＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスにポリＩ：Ｃを共投与した。Ｇ１２Ｖ抗原による刺激後の免疫化マウスから採取した特異的応答性細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌）を、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。
方法
マウスドナーＲＢＣを単離した。ＲＢＣを、ＲＰＭＩ中の２００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ）の存在下、５０ｐｓｉで、１×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度で、マイクロ流体チップ（幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍ）を通して、室温で圧搾処理した。未処理のＲＢＣも対照として使用した（接触なし）。圧搾処理した後、処理したＲＢＣを、室温で４０分間静置し、次いで、遠心分離（８０００ｘｇ）して、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ又はＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）のいずれかに再懸濁した。Ｇ１２Ｖ１－１６ ＳＬＰ（抗原担体ＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む圧搾処理したＲＢＣは、ＡＣ内のゴースト集団に対して濃縮（例えば、物理的な分離を通して）した（濃縮）。対照ＲＢＣ（接触なし）及びＡＣ集団（事前濃縮ＡＣ、濃縮ＡＣ）を、細胞表面ホスファチジルセリンについて分析した（アネキシンＶ染色）。
マウスドナーＲＢＣを単離した。ＲＢＣを、ＲＰＭＩ中の２００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ）の存在下、５０ｐｓｉで、１×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度で、マイクロ流体チップ（幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍ）を通して、室温で圧搾処理した。未処理のＲＢＣも対照として使用した（接触なし）。圧搾処理した後、処理したＲＢＣを、室温で４０分間静置し、次いで、遠心分離（８０００ｘｇ）して、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ又はＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）のいずれかに再懸濁した。Ｇ１２Ｖ１－１６ ＳＬＰ（抗原担体ＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む圧搾処理したＲＢＣは、ＡＣ内のゴースト集団に対して濃縮（例えば、物理的な分離を通して）した（濃縮）。対照ＲＢＣ（接触なし）及びＡＣ集団（事前濃縮ＡＣ、濃縮ＡＣ）を、細胞表面ホスファチジルセリンについて分析した（アネキシンＶ染色）。
Ｋ－Ｒａｓショートペプチド（Ｇ１２Ｖ７－１６）／ＨＢＶコアペプチド／ＩＦＡを含むエマルジョン（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ２０１６ Ｍａｒ；４（３）：２０４－１４を参照されたい）を、プライムワクチン接種として投与し（ＫＲａｓ／ＨＢＶ／ＩＦＡ；ＩＦＡプライム）、その後、追加のＫＲａｓ／ＨＢＶ／ＩＦＡエマルジョン（ＩＦＡブースト）、又はＡＣＧ１２Ｖ１－１６（２億５０００万個のＡＣ）＋１ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃ（ＡＣ／ポリＩ：Ｃブースト）を、図３Ａ及び図３Ｂに示される投薬群及びスケジュールに従って、ＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスにブーストワクチン接種として後眼窩（ＲＯ）に投与した。ＰＢＳ投与を対照として使用した。
記載した投薬スケジュールの最後に（テイクダウン）、脾臓及び／又は流入領域リンパ節を、治療又は対照マウスから採取し、脾細胞又はリンパ節由来細胞を、図３Ｃに示すように、１μＭのＧ１２Ｖ７－１６Ｋ－Ｒａｓペプチド又は関連性のない対照ペプチド（ＭＡＲＴ１）のスパイクで処理し、直ちにＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供されるか（テイクダウン）、又は６日間のインビトロ増殖後にＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供された。
結果
図３Ｄに示すように、圧搾処理した後のゴースト集団は、ＲＢＣを１４日目の投与についてＡＣを生成するために圧搾処理した後は６４～７３％、ＲＢＣを１６日目の投与についてＡＣを生成するために圧搾処理した後は６１～７６％の範囲であり、赤血球を圧搾処理した後に、ゴースト集団の一貫した生成を示している。また、図３Ｅに示すように、圧搾処理から生成されたＡＣの収率は、１４日目の投与（１８％）及び１６日目の投与（２９％）について生成されたＡＣにおいて同等であった。加えて、圧搾処理したＲＢＣの高い割合は、アネキシンＶ染色によってアッセイしたように、細胞表面ホスファチジルセリンを示した（濃縮ＡＣの９３％、又は濃縮ＡＣのゴースト集団内の９６％；それぞれ、図３Ｆの左パネル及び右パネル）。
図３Ｄに示すように、圧搾処理した後のゴースト集団は、ＲＢＣを１４日目の投与についてＡＣを生成するために圧搾処理した後は６４～７３％、ＲＢＣを１６日目の投与についてＡＣを生成するために圧搾処理した後は６１～７６％の範囲であり、赤血球を圧搾処理した後に、ゴースト集団の一貫した生成を示している。また、図３Ｅに示すように、圧搾処理から生成されたＡＣの収率は、１４日目の投与（１８％）及び１６日目の投与（２９％）について生成されたＡＣにおいて同等であった。加えて、圧搾処理したＲＢＣの高い割合は、アネキシンＶ染色によってアッセイしたように、細胞表面ホスファチジルセリンを示した（濃縮ＡＣの９３％、又は濃縮ＡＣのゴースト集団内の９６％；それぞれ、図３Ｆの左パネル及び右パネル）。
図３Ｇに示すように、ブーストワクチン接種（ＩＦＡブースト）としてのＫＲａｓ／ＨＢＶ／ＩＦＡの使用は、投薬スケジュールの最後（テイクダウン）にＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって試験したように、抗原特異的Ｔ細胞応答をわずかに増加させるだけであった。図３Ｈに示すように、Ｋ－Ｒａｓ Ｇ１２Ｖペプチドスパイク後の６日間のインビトロ増殖で、ブーストワクチン接種としてのＡＣＧ１２Ｖ１－１６／ポリＩ：Ｃの使用は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって試験したように、抗原特異的Ｔ細胞応答の同等又はわずかな増加をもたらした。
実施例１２
インビボでの抗原特異的応答性Ｔ細胞の誘発における抗原担体（ＡＣ）及びアジュバントの共投与の有効性を決定し、投薬スケジュールを最適化するために、マウスＲＢＣを、Ｇ１２Ｖ抗原で圧搾処理し、様々な投薬スケジュールでＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスにポリＩ：Ｃを共投与した。Ｇ１２Ｖ抗原による刺激後の免疫化マウスから採取した特異的応答性細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌）を、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。
インビボでの抗原特異的応答性Ｔ細胞の誘発における抗原担体（ＡＣ）及びアジュバントの共投与の有効性を決定し、投薬スケジュールを最適化するために、マウスＲＢＣを、Ｇ１２Ｖ抗原で圧搾処理し、様々な投薬スケジュールでＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスにポリＩ：Ｃを共投与した。Ｇ１２Ｖ抗原による刺激後の免疫化マウスから採取した特異的応答性細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌）を、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。
方法
マウスドナーＲＢＣを単離した。ＲＢＣを、ＲＰＭＩ中の２００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ）の存在下、５０ｐｓｉ又は７０ｐｓｉで、１×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度で、マイクロ流体チップ（幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍ）を通して、室温で圧搾処理した。未処理のＲＢＣも対照として使用した（接触なし）。圧搾処理した後、処理したＲＢＣを、室温で４０分間静置し、次いで、遠心分離（８０００ｘｇ）して、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ又はＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。Ｇ１２Ｖ１－１６ ＳＬＰ（ＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む圧搾処理したＲＢＣは、ＡＣ内のゴースト集団に対して濃縮（例えば、物理的な分離を通して）した（濃縮）。対照ＲＢＣ（接触なし）及びＡＣ集団（事前濃縮ＡＣ、濃縮ＡＣ）を、細胞表面ホスファチジルセリンについて分析した（アネキシンＶ染色）。
マウスドナーＲＢＣを単離した。ＲＢＣを、ＲＰＭＩ中の２００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ）の存在下、５０ｐｓｉ又は７０ｐｓｉで、１×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度で、マイクロ流体チップ（幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍ）を通して、室温で圧搾処理した。未処理のＲＢＣも対照として使用した（接触なし）。圧搾処理した後、処理したＲＢＣを、室温で４０分間静置し、次いで、遠心分離（８０００ｘｇ）して、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ又はＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。Ｇ１２Ｖ１－１６ ＳＬＰ（ＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む圧搾処理したＲＢＣは、ＡＣ内のゴースト集団に対して濃縮（例えば、物理的な分離を通して）した（濃縮）。対照ＲＢＣ（接触なし）及びＡＣ集団（事前濃縮ＡＣ、濃縮ＡＣ）を、細胞表面ホスファチジルセリンについて分析した（アネキシンＶ染色）。
続いて、ＡＣＧ１２Ｖ１－１６（２億５０００万個のＡＣ）＋１ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃ、又はＰＢＳ（対照）を、図４Ａに示す投薬スケジュールに従って、ＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスに後眼窩（ＲＯ）に投与した。
群Ａ：－２日目、０日目、７日目、１４日目のＰＢＳ（対照）。
群Ｂ：２５０ＭのＡＣＧ１２Ｖ１－１６＋ポリＩ：Ｃを５日目及び１４日目に投与（Ｐ／－／Ｂ）
群Ｃ：２５０ＭのＡＣＧ１２Ｖ１－１６＋ポリＩ：Ｃを－２日目、０日目、７日目、及び１４日目に投与（Ｐ／Ｂ／Ｂ／Ｂ）
群D：２５０ＭのＡＣＧ１２Ｖ１－１６を－２日目、０日目、及び１４日目に投与（Ｐ／Ｂ／－／Ｂ）
記載した投薬スケジュールの最後に（テイクダウン）、脾臓及び／又は流入領域リンパ節を、治療又は対照マウスから採取し、脾細胞又はリンパ節由来細胞を、図３Ｃに示すように、１μＭのＧ１２Ｖ７－１６Ｋ－Ｒａｓペプチド又は関連性のない対照ペプチド（ＭＡＲＴ１）でのスパイクにより処理し、直ちにＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供されるか（テイクダウン）、又は６日間のインビトロ増殖後にＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供された。
結果
図４Ｂに示すように、圧搾処理した後のゴースト集団は、ＲＢＣを－２日目、０日目、及び７日目の投与についてＡＣを生成するために圧搾処理（５０ｐｓｉで圧搾処理）した後は１７～６８％、ＲＢＣを１４日目の投与についてＡＣを生成するために圧搾処理（７０ｐｓｉで圧搾処理）した後は８６～９４％の範囲であった。また、図４Ｃに示すように、圧搾処理から生成されたＡＣの回収率は、－２日目、０日目、５日目、及び７日目の投与で生成されたＡＣにおいては同等であったが（５％～２６％、５０ｐｓｉで圧搾処理）、回収率は、１６目の投与で生成されたＡＣの方が高かった（３３％、７０ｐｓｉで圧搾処理）。
図４Ｂに示すように、圧搾処理した後のゴースト集団は、ＲＢＣを－２日目、０日目、及び７日目の投与についてＡＣを生成するために圧搾処理（５０ｐｓｉで圧搾処理）した後は１７～６８％、ＲＢＣを１４日目の投与についてＡＣを生成するために圧搾処理（７０ｐｓｉで圧搾処理）した後は８６～９４％の範囲であった。また、図４Ｃに示すように、圧搾処理から生成されたＡＣの回収率は、－２日目、０日目、５日目、及び７日目の投与で生成されたＡＣにおいては同等であったが（５％～２６％、５０ｐｓｉで圧搾処理）、回収率は、１６目の投与で生成されたＡＣの方が高かった（３３％、７０ｐｓｉで圧搾処理）。
図４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ、及び４Ｇに示すように、ＡＣＧ１２Ｖ１－１６／ポリＩ：Ｃの投与は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって試験したように、抗原特異的Ｔ細胞応答の増加をもたらした。特に、Ｐ／Ｂ／Ｂ／Ｂスケジュールに従って投与したＡＣＧ１２Ｖ１－１６／ポリＩ：Ｃは、テイクダウン時（平均約３００ＳＦＵ／１ｅ６細胞、図４Ｄ）及びインビトロ増殖後（平均約５１０００ＳＦＵ／１ｅ６細胞、図４Ｆ）の両方でＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって試験したように、抗原特異的Ｔ細胞応答を強く誘発した。対照的に、Ｐ／－－／Ｂスケジュール及びＰ／Ｂ／－－／Ｂスケジュールに従って投与したＡＣＧ１２Ｖ１－１６／ポリＩ：Ｃは、テイクダウン時及びインビトロ増殖後に中程度に活性化された応答をもたらした（約１９０００～２２０００ＳＦＵ／１ｅ６細胞）。
実施例１３
インビボでの抗原特異的応答性Ｔ細胞の誘発において、抗原及びアジュバントを含む抗原担体（ＡＡＣ）の、抗原担体（ＡＣ）とアジュバントとの共投与に対する活性化の有効性を決定するために、マウスＲＢＣを、ポリＩ：Ｃを含むか又は含まないＧ１２Ｖ抗原で圧搾処理し（ポリＩ：Ｃの共注入を含むか又は含まない）、様々な投与スケジュールでＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスに投与した。Ｇ１２Ｖ抗原による刺激後の免疫化マウスから採取した特異的応答性細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌）を、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。
インビボでの抗原特異的応答性Ｔ細胞の誘発において、抗原及びアジュバントを含む抗原担体（ＡＡＣ）の、抗原担体（ＡＣ）とアジュバントとの共投与に対する活性化の有効性を決定するために、マウスＲＢＣを、ポリＩ：Ｃを含むか又は含まないＧ１２Ｖ抗原で圧搾処理し（ポリＩ：Ｃの共注入を含むか又は含まない）、様々な投与スケジュールでＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスに投与した。Ｇ１２Ｖ抗原による刺激後の免疫化マウスから採取した特異的応答性細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌）を、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。
方法
マウスドナーＲＢＣを単離した。ＲＢＣを、（１）２００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ１－１６ ＳＬＰ）、又は（２）２００μＭのＧ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ及び１ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃの存在下、７０ｐｓｉで、２×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度で、マイクロ流体チップ（幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍ）を通して、室温で圧搾処理した。未処理のＲＢＣも対照として使用した（接触なし）。圧搾処理した後、処理したＲＢＣを、室温で４０分間静置し、次いで、遠心分離（８０００ｘｇ）して、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ又はＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）のいずれかに再懸濁した。Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ（ＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む、又はＧ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ及びポリＩ：Ｃ（ＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む圧搾処理したＲＢＣを、ＡＣ又はＡＡＣ内のゴースト集団について（例えば、物理的な分離を通して）濃縮した（濃縮）。対照ＲＢＣ（接触なし）及びＡＣ又はＡＡＣ集団（事前濃縮ＡＣ又はＡＡＣ、濃縮ＡＡＣ又はＡＡＣ）を、細胞表面ホスファチジルセリンについて分析した（アネキシンＶ染色）。
マウスドナーＲＢＣを単離した。ＲＢＣを、（１）２００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ１－１６ ＳＬＰ）、又は（２）２００μＭのＧ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ及び１ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃの存在下、７０ｐｓｉで、２×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度で、マイクロ流体チップ（幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍ）を通して、室温で圧搾処理した。未処理のＲＢＣも対照として使用した（接触なし）。圧搾処理した後、処理したＲＢＣを、室温で４０分間静置し、次いで、遠心分離（８０００ｘｇ）して、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ又はＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）のいずれかに再懸濁した。Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ（ＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む、又はＧ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ及びポリＩ：Ｃ（ＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む圧搾処理したＲＢＣを、ＡＣ又はＡＡＣ内のゴースト集団について（例えば、物理的な分離を通して）濃縮した（濃縮）。対照ＲＢＣ（接触なし）及びＡＣ又はＡＡＣ集団（事前濃縮ＡＣ又はＡＡＣ、濃縮ＡＡＣ又はＡＡＣ）を、細胞表面ホスファチジルセリンについて分析した（アネキシンＶ染色）。
続いて、ＡＣＧ１２Ｖ１－１６（２億５０００万個のＡＣ）及び１ｍｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃの共投与、又はＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６（２億５０００万個のＡＡＣ）、又はＰＢＳ（対照）の投与を、図５Ａに示す投薬スケジュールに従って、ＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスに後眼窩（ＲＯ）に投与した。
群Ａ：－２日目、０日目、７日目、１４日目のＰＢＳ（対照）。
群Ｂ：２５０ＭのＡＣＧ１２Ｖ１－１６＋ポリＩ：Ｃを１２日目及び１４日目に投与（Ｐ／－／Ｂ）
群Ｃ：２５０ＭのＡＣＧ１２Ｖ１－１６＋ポリＩ：Ｃを５日目、７日目、及び１４日目に投与（Ｐ／Ｂ／Ｂ）
群D：２５０ＭのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６（Ｇ１２Ｖ１－１６及びポリＩ：Ｃを共圧搾することによって生成）を５日目、７日目、及び１４日目に投与（Ｐ／Ｂ／Ｂ共圧搾ｐＩＣ）
群Ｅ：２５０ＭのＡＣＧ１２Ｖ１－１６＋ポリＩ：Ｃを－２日目、０日目、７日目、及び１４日目に投与（Ｐ／Ｂ／Ｂ）
群Ｆ：２５０ＭのＡＣＧ１２Ｖ１－１６＋ポリＩ：Ｃを１４日目に投与（Ｐ）
記載した投薬スケジュールの最後に（テイクダウン）、脾臓及び／又は流入領域リンパ節を、治療又は対照マウスから採取し、脾細胞又はリンパ節由来細胞を、前に図３Ｃに示すように、１μＭのＧ１２Ｖ７－１６Ｋ－Ｒａｓペプチド又は関連性のない対照ペプチド（ＭＡＲＴ１）のスパイクで処理し、直ちにＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供されるか（テイクダウン）、又は６日間のインビトロ増殖後にＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供された。
結果
図５Ｂに示すように、圧搾処理した後のゴースト集団は、ＲＢＣを－２日目、０日目、５日目、７日目、１２日目、及び１４日目の投与についてＡＣ又はＡＡＣを生成するために圧搾処理した後は６８～９４％の範囲であり、赤血球を圧搾処理した後に、高い割合のゴースト集団の一貫した生成を示している。また、図５Ｃに示すように、圧搾処理からの回収率は、－２日目、０日目、５日目、７日目、１２日目の投与について生成されたＡＣ及びＡＡＣにおいて同等であり（約２０％～４０％、５０ｐｓｉで圧搾）、１４日目の投与について生成されたＡＣ及びＡＡＣでは更に上昇した（約６０％、７０ｐｓｉで圧搾）。
図５Ｂに示すように、圧搾処理した後のゴースト集団は、ＲＢＣを－２日目、０日目、５日目、７日目、１２日目、及び１４日目の投与についてＡＣ又はＡＡＣを生成するために圧搾処理した後は６８～９４％の範囲であり、赤血球を圧搾処理した後に、高い割合のゴースト集団の一貫した生成を示している。また、図５Ｃに示すように、圧搾処理からの回収率は、－２日目、０日目、５日目、７日目、１２日目の投与について生成されたＡＣ及びＡＡＣにおいて同等であり（約２０％～４０％、５０ｐｓｉで圧搾）、１４日目の投与について生成されたＡＣ及びＡＡＣでは更に上昇した（約６０％、７０ｐｓｉで圧搾）。
図５Ｄ及び５Ｅに示すように、Ｐ／Ｂ／Ｂ群（２５０ＭのＡＣＧ１２Ｖ１－１６＋ポリＩ：Ｃを５日目、７日目、及び１４日目に共投与）は、テイクダウン時及び増殖後のそれぞれでＰ／Ｂ／Ｂ共圧搾ｐＩＣ（２５０ＭのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６を５日目、７日目、１４日目に投与）よりも約２倍及び約３．５倍高い数を伴って、テイクダウン時及びインビトロ増殖後の両方で全ての群の中で最も高いＥＬＩＳＰＯＴのスポット数を示した。プライムのみの群Ｐ（２５０ＭのＡＣＧ１２Ｖ１－１６＋ポリＩ：Ｃを１４日目に共投与）では、ＥＬＩＳＰＯＴのスポット数によりアッセイした場合に、インビトロでの増殖後にプライムのみの群からのみ有意な応答が観察された。
実施例１４
インビボでの抗原特異的応答性Ｔ細胞の誘発における抗原及びアジュバントの両方を含む抗原担体（ＡＡＣ）の活性化の有効性を決定し、投薬スケジュールを最適化するために、マウスＲＢＣを、Ｇ１２Ｖ抗原及びポリＩ：Ｃで圧搾処理し、様々な投与スケジュールでＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスに投与した。Ｇ１２Ｖ抗原による刺激後の免疫化マウスから採取した特異的応答性細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌）を、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。
インビボでの抗原特異的応答性Ｔ細胞の誘発における抗原及びアジュバントの両方を含む抗原担体（ＡＡＣ）の活性化の有効性を決定し、投薬スケジュールを最適化するために、マウスＲＢＣを、Ｇ１２Ｖ抗原及びポリＩ：Ｃで圧搾処理し、様々な投与スケジュールでＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスに投与した。Ｇ１２Ｖ抗原による刺激後の免疫化マウスから採取した特異的応答性細胞の活性（例えば、ＩＦＮ－γ発現及び／又は分泌）を、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。
方法
マウスドナーＲＢＣを単離した。ＲＢＣを、ＲＰＭＩ中の２００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ）及びダルトンポリＩ：Ｃの存在下、７０ｐｓｉで、２×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度で、マイクロ流体チップ（幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍ）を通して、室温で圧搾処理した。未処理のＲＢＣも対照として使用した（接触なし）。圧搾処理した後、処理したＲＢＣを、室温で１時間静置し、次いで、遠心分離（８０００ｘｇ）して、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ又はＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ及びポリＩ：Ｃ（ＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む圧搾処理したＲＢＣは、ＡＡＣ内のゴースト集団に対して濃縮（例えば、物理的な分離によって）した（濃縮）。対照ＲＢＣ（接触なし）及びＡＡＣ集団（事前濃縮ＡＡＣ、濃縮ＡＡＣ）を、細胞表面ホスファチジルセリンについて分析した（アネキシンＶ染色）。
マウスドナーＲＢＣを単離した。ＲＢＣを、ＲＰＭＩ中の２００μＭの合成ロングペプチド（Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ）及びダルトンポリＩ：Ｃの存在下、７０ｐｓｉで、２×１０９ＲＢＣ／ｍＬの密度で、マイクロ流体チップ（幅２．２μｍ、長さ１０μｍ、深さ７０μｍ）を通して、室温で圧搾処理した。未処理のＲＢＣも対照として使用した（接触なし）。圧搾処理した後、処理したＲＢＣを、室温で１時間静置し、次いで、遠心分離（８０００ｘｇ）して、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ又はＣＴＬ培地（１％グルタミンを補充）に再懸濁した。Ｇ１２Ｖ１－１６ＳＬＰ及びポリＩ：Ｃ（ＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６）を含む圧搾処理したＲＢＣは、ＡＡＣ内のゴースト集団に対して濃縮（例えば、物理的な分離によって）した（濃縮）。対照ＲＢＣ（接触なし）及びＡＡＣ集団（事前濃縮ＡＡＣ、濃縮ＡＡＣ）を、細胞表面ホスファチジルセリンについて分析した（アネキシンＶ染色）。
続いて、ＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６（２億５０００万、５億、又は１０億個のＡＡＣ）、又はＰＢＳ（対照）を、図６Ａに示す投薬スケジュールに従って、ＨＬＡ－Ａ＊１１トランスジェニックマウスに後眼窩（ＲＯ）に投与した。
群Ａ：－２日目、０日目、５日目、７日目のＰＢＳ（対照）。
群Ｂ：２５０ＭのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６を－２日目、０日目、７日目に投与（２５０ＭのＰ／Ｂ／Ｂ）
群Ｃ：２５０ＭのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６を０日目、及び７日目に投与（２５０ＭのＰ／Ｂ ０、７日目）
群D：２５０ＭのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６を５日目、及び７日目に投与（２５０ＭのＰ／Ｂ ５、７日目）
群Ｅ：２５０ＭのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６を７日目に投与（２５０ＭのＰ ７日目）
群Ｆ：５００ＭのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６を７日目に投与（５００ＭのＰ ７日目）
群Ｆ：１ＢのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６を７日目に投与（１ＢのＰ ７日目）
記載した投薬スケジュールの最後に（テイクダウン）、脾臓及び／又は流入領域リンパ節を、治療又は対照マウスから採取し、脾細胞又はリンパ節由来細胞を、１μＭのＧ１２Ｖ７－１６Ｋ－Ｒａｓペプチド又は関連性のない対照ペプチド（ＭＡＲＴ１）のスパイクで処理し、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供された（テイクダウン）。
結果
図６Ｂは、ＲＢＣを、－２日目、０日目、５日目、及び７日目に７０ｐｓｉで圧搾処理した後、高い比率のゴースト集団の一貫した生成を示した。また、図６Ｃに示すように、圧搾処理から生成されたＡＡＣの回収率は、－２日目、０日目、５日目、７日目、１２日目の投与について生成されたＡＡＣにおいて同等であった（約２０％～４０％の範囲）。
図６Ｂは、ＲＢＣを、－２日目、０日目、５日目、及び７日目に７０ｐｓｉで圧搾処理した後、高い比率のゴースト集団の一貫した生成を示した。また、図６Ｃに示すように、圧搾処理から生成されたＡＡＣの回収率は、－２日目、０日目、５日目、７日目、１２日目の投与について生成されたＡＡＣにおいて同等であった（約２０％～４０％の範囲）。
図６Ｃに示すように、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって試験したように、ブーストスケジュール（Ｐ／Ｂ／Ｂ又はＰ／Ｂ、２５０ＭのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６の２回又は３回の免疫化を受けた）でマウスに投与した場合、テイクダウン時に内因性抗原特異的応答が観察された。図６Ｄに示すように、２５０ＭのＡＡＣＧ１２Ｖ１－１６（２５０ＭのＰ ７日目）によるプライムワクチン接種単独ではテイクダウン時の応答は観察されなかったが、高用量のプライムワクチン接種単独（５００ＭのＰ ７日目及び１ＢのＰ ７日目）では、対照と比較して小さな応答の誘発を示した。
Claims (110)
- 個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法であって、前記方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、前記変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で前記無核細胞由来小胞に送達される、方法。
- 個体において腫瘍成長を低減させるための方法であって、前記方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、前記無核細胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、前記変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で前記無核細胞由来小胞に送達される、方法。
- ワクチン接種を必要とする個体にそれを実施するための方法であって、前記方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、前記無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、前記変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で前記無核細胞由来小胞に送達される、方法。
- 前記個体が、がんを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 個体においてがんを治療するための方法であって、前記方法が、有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物を個体に投与することを含み、前記無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、前記変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で前記無核細胞由来小胞に送達される、方法。
- 前記がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである、請求項４又は５に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原、変異型Ｈ－Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｎ－Ｒａｓ抗原である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ａ抗原又は変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ｂ抗原である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する単一のポリペプチドである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープ及び１つ以上の異種性ペプチド配列を含むポリペプチドである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、他の抗原又はアジュバントと複合体化する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２抗原のうちの１つ以上である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接する１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無核細胞が、アジュバントを更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、アジュバントと併せて投与される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、請求項２２又は２３に記載の方法。
- 前記アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む前記無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントが前記摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、前記摂動インプット無核細胞を、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントとインキュベートし、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、により調製される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記変異型Ｒａｓ抗原を含む前記無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸が前記摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、前記摂動インプット無核細胞を、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸とインキュベートすることであって、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸が発現され、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む前記無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及びアジュバントが通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸及び前記アジュバントが前記摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、前記摂動インプット無核細胞を、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸及び前記アジュバントとインキュベートすることであって、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸が発現され、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。 - 前記狭窄部の幅が、前記インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の前記幅が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のインプット無核細胞を含む前記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、前記複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無核細胞が、赤血球又は血小板である、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無核細胞由来小胞を含む前記組成物が、複数回投与される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、静脈内に投与される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体が、ヒトである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、別の療法の投与の前に、同時発生的に、又は後に投与される、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される、化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
- 無核細胞由来小胞を含む組成物であって、前記無核細胞由来小胞が、変異型Ｒａｓ抗原を含み、前記変異型Ｒａｓ抗原が、細胞内で前記無核細胞由来小胞に送達される、組成物。
- 前記組成物が、アジュバントを更に含む、請求項３９に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、請求項４０に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、請求項４０又は４１に記載の組成物。
- 変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物であって、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントが通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記変異型Ｒａｓ抗原、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントが前記摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、前記摂動インプット無核細胞を、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントとインキュベートし、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、により調製される、組成物。 - 変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を含む組成物であって、前記変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸が前記摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、前記摂動インプット無核細胞を、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸とインキュベートすることであって、前記核酸が、前記変異型Ｒａｓ抗原を発現し、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、組成物。 - 変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞を含む組成物であって、前記変異型Ｒａｓ抗原及びアジュバントを含む無核細胞由来小胞が、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及び前記アジュバントが通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸及び前記アジュバントが前記摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、前記摂動インプット無核細胞を、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸及び前記アジュバントとインキュベートすることであって、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸が発現され、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、により調製される、組成物。 - 前記狭窄部の幅が、前記インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、請求項４３～４４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記狭窄部の前記幅が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記インプット無核細胞を含む前記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、前記複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される、請求項４３～４７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記インプット無核細胞が、赤血球又は血小板である、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記インプット無核細胞が、エリスロサイト又はレチクロサイトである、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記無核細胞由来小胞が、赤血球由来小胞又は血小板由来小胞である、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記無核細胞由来小胞が、レチクロサイト由来小胞又はエリスロサイト由来小胞である、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ抗原、変異型Ｈ－Ｒａｓ抗原、又は変異型Ｎ－Ｒａｓ抗原である、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ａ抗原又は変異型Ｋ－Ｒａｓ４Ｂ抗原である、請求項３８～５３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する単一のポリペプチドである、請求項３８～５４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、同じ及び／又は異なる変異型Ｒａｓ抗原に対する応答を誘発する複数のポリペプチドのプールである、請求項３８～５５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、他の抗原又はアジュバントと複合体化する、請求項３８～５６のいずれか一項に記載の組成物。
- 変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異、Ｇ１２Ｃ変異、又はＧ１３Ｄ変異を含む、請求項３８～５７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８～５８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号９～１５のアミノ酸配列を含む、請求項３８～５９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、Ｇ１２Ｄ１－１６、Ｇ１２Ｄ２－１９、Ｇ１２Ｄ２－２２、Ｇ１２Ｄ２－２９抗原、Ｇ１２Ｖ１－１６、Ｇ１２Ｖ２－１９、Ｇ１２Ｖ３－１７、又はＧ１２Ｖ３－４２抗原のうちの１つ以上である、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８～６１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、配列番号１～８のアミノ酸配列を含む、請求項３８～６２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、Ｎ末端及び／又はＣ末端で１つ以上の異種性ペプチド配列に隣接する１つ以上の抗原性変異型Ｒａｓエピトープを含むポリペプチドである、請求項３８～６３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である、請求項３８～６４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原が、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドにプロセシングされることが可能である、請求項３８～６５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、アジュバントを更に含む、請求項３８～６６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、請求項６７に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、請求項６７又は６８に記載の組成物。
- 個体において変異型Ｒａｓタンパク質に対する免疫反応を刺激するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項３９～６９のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
- 個体において腫瘍成長を低減させるための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項３９～６９のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
- 前記個体が、がんを有する、請求項７０又は７１に記載の組成物。
- 個体においてがんを治療するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項３９～６９のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
- 前記がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである、請求項７２又は７３に記載の組成物。
- 前記組成物が、アジュバントを更に含む、請求項７１～７４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、アジュバントと併せて投与される、請求項７１～７４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、請求項７６に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、請求項７６又は７７に記載の組成物。
- 前記無核細胞を含む組成物が、複数回投与される、請求項７０～７８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、静脈内に投与される、請求項７０～７９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記個体が、ヒトである、請求項７０～８０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、別の療法の投与の前に、同時発生的に、又は後に投与される、請求項７０～８１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される、化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである、請求項８２に記載の組成物。
- 変異型Ｒａｓに対する免疫応答を刺激するための薬物の製造における有効量の無核細胞を含む組成物の使用であって、前記組成物が、有効量の請求項３９～６９のいずれか一項に記載の組成物を含む、使用。
- 個体において腫瘍成長を低減させるための薬物の製造における有効量の無核細胞を含む組成物の使用であって、前記組成物が、有効量の請求項３９～６９のいずれか一項に記載の組成物を含む、使用。
- 前記個体が、がんを有する、請求項８４又は８５に記載の使用。
- 個体においてがんを治療するための薬物の製造における有効量の無核細胞由来小胞を含む組成物の使用であって、前記組成物が、有効量の請求項３８～６１のいずれか一項に記載の組成物を含む、使用。
- 前記がんが、膵臓がん、結腸がん、小腸がん、胆道がん、子宮内膜がん、肺がん、皮膚がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、又は尿路がんである、請求項８６又は８７に記載の使用。
- 前記組成物が、アジュバントを更に含む、請求項８４～８８のいずれか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、アジュバントと併せて投与するために製剤化される、請求項８４～８９のいずれか一項に記載の使用。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、請求項９０に記載の使用。
- 前記アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、請求項８４～８９のいずれか一項に記載の使用。
- 無核細胞由来小胞を含む前記組成物が、複数回投与される、請求項８４～９２のいずれか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、静脈内に投与される、請求項８４～９３のいずれか一項に記載の使用。
- 前記個体が、ヒトである、請求項８４～９４のいずれか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、別の療法の投与の前に、同時発生的に、又は後に投与される、請求項８４～９５のいずれか一項に記載の使用。
- 前記別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される、化学療法、又は放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである、請求項９６に記載の使用。
- 請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法で使用するための、キット。
- 請求項３９～６９のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
- 前記キットが、前記組成物を前記個体に投与して、変異型Ｒａｓに対する免疫反応を刺激する、腫瘍成長を低減させる、及び／又はがんを治療するための指示を伴う、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、又は添付文書のうちの１つ以上を更に含む、請求項９８又は９９に記載のキット。
- 変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞由来小胞の組成物を生産するための方法であって、前記方法が、前記変異型Ｒａｓ抗原を細胞内で前記無核細胞由来小胞に導入することを含む、方法。
- 前記無核細胞が、アジュバントを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストである、請求項１０２に記載の方法。
- 前記アジュバントが、ポリイノシン－ポリシチジル酸である、請求項１０２又は１０３に記載の方法。
- 前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ及び前記アジュバントを細胞内で無核細胞由来小胞に導入することが、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントが通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントが前記摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、前記摂動インプット無核細胞を、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントとインキュベートし、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原、又は前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成することと、を含む、請求項１０４に記載の方法。 - 前記変異型Ｒａｓ抗原を細胞内で前記無核細胞由来小胞に導入することが、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸が通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸が前記摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、前記摂動インプット無核細胞を、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸とインキュベートすることであって、前記核酸が、前記変異型Ｒａｓ抗原を発現し、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原を含む無核細胞を生成する、インキュベートすることと、を含む、請求項１０４に記載の方法。 - 前記無核細胞由来小胞が、細胞内にアジュバントを更に含み、前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントを細胞内で前記無核細胞に導入することが、
ａ）インプット無核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させることであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット無核細胞の直径の関数であり、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする核酸及び前記アジュバントが通過するのに十分な大きさの前記インプット無核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット無核細胞を形成する、通過させることと、
ｂ）前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸及び前記アジュバントが前記摂動インプット無核細胞に入ることを可能にするのに十分な時間の間、前記摂動インプット無核細胞を、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸及び前記アジュバントとインキュベートすることであって、前記変異型Ｒａｓ抗原をコードする前記核酸が発現され、それにより、前記変異型Ｒａｓ抗原及び前記アジュバントを含む無核細胞由来小胞を生成する、インキュベートすることと、を含む、請求項１０４に記載の方法。 - 前記狭窄部の幅が、前記インプット無核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、請求項１０５～１０７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の前記幅が、約１．６μｍ～約２．４μｍ、又は約１．８μｍ～約２．２μｍである、請求項１０５～１０８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のインプット無核細胞を含む前記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、前記複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される、請求項１０５～１０９のいずれか一項に記載の方法。
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