CN110709094A

CN110709094A - Kras肽疫苗组合物及其使用方法

Info

Publication number: CN110709094A
Application number: CN201880023091.7A
Authority: CN
Inventors: 潘静; 尤明; R·鲁贝特
Original assignee: Medical College of Wisconsin Research Foundation Inc
Current assignee: Medical College of Wisconsin; Medical College of Wisconsin Research Foundation Inc
Priority date: 2017-02-03
Filing date: 2018-02-05
Publication date: 2020-01-17
Also published as: US11771749B2; EP3576764A4; WO2018145020A1; EP3576764A1; US20210213120A1

Abstract

本公开提供了引发抗肿瘤免疫应答和治疗癌症的方法和组合物，其包含至少一种KRAS肽。

Description

KRAS肽疫苗组合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年2月3日提交的美国临时申请第62/454,270号的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。

关于联邦资助研究的声明

无

发明背景

本发明的领域是用于治疗和预防癌症的疫苗。更具体地，本发明涉及KRAS肽。

肺癌具有低于5年的存活率，其仍然是全球范围导致癌症死亡的主要原因，并且全球范围内病例增加[1]。需要新的方法以改善对于这些患者的临床结果。许多遗传和表观遗传异常被鉴定为促进肿瘤发展的重要驱动[2、3]。这促进了对已成为癌症疫苗开发相关靶标的潜在癌症抗原的鉴定和表征。在NSCLC(非小细胞肺癌)的致癌基因中，最常观察到的是Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)的突变。在高加索人吸烟人群中，它们可能代表高达30％的肺癌[4]，比并且它们中的80％的密码子12发生特异性改变[5]。尚未研发出特定的靶向疗法，部分是由于缺少RAS表面可药物化的袋和腔体[6]，除了最近发现的特异性靶向突变KRAS^G12C的新化合物[7]，替代疗法或预防措施的研发极具吸引力。

作为治疗癌症患者或预防高危个体(例如，之前或当前的吸烟者)中肿瘤发展的手段，针对肿瘤相关抗原的肽疫苗接种是当前的热门研究领域。肽疫苗可以引发记忆T细胞，这些记忆T细胞保留在淋巴结中直到暴露于靶抗原。刺激后，无论位置如何，T细胞迁移至表达抗原的病灶的位点，并且将增殖并破坏这些病灶。许多研究人员已经试图抑制突变KRAS，常采用相对短的MHC I类限制性肽，取得微小到中等程度的成功[9、10]。然而，我们采取了一种完全不同的方法，采用较长的肽，预测其对MHC II类具有结合亲和力。使用该方法，我们和我们的合作者先前已经研发了这样的多重肽(multipeptide)多价疫苗，其引发强烈的Th1免疫应答并有效阻遏neu-驱动的乳腺肿瘤[11]或突变体EGFR1-驱动的肺癌[12]。这些研究显示，不论潜在的耐受性，人们可以生成针对各种靶标肽有效的MHC II类介导的免疫应答。后一研究还强调，人们可以在不直接用突变肽本身进行免疫的情况下诱导针对过表达的突变蛋白的有效免疫力。

因此，存在对于在许多癌症中引发有效抗肿瘤免疫应答的组合物和方法的需求。

发明概述

本公开提供了用于治疗癌症，包括肺癌、胰腺癌和结肠癌的疫苗组合物和方法，如本文说明书和权利要求所述。

本发明证明了靶向KRAS分子多个表位的新配制的多重肽(15-17个氨基酸长的肽)疫苗在KRAS驱动的肺肿瘤小鼠模型中的免疫原性和抗肿瘤功效。多重肽KRAS疫苗在初步预防KRAS诱导的肺癌中具有免疫原性并有效，这表明该方法可以单独地或与其他方式联合用于预防其他KRAS驱动的癌症。

本发明提供了KRAS MHC II类肽，其能够引发对象中的抗肿瘤免疫应答。在一些方面中，MHC II类肽的组合引发对象中强烈且抗肿瘤的免疫应答。在一些方面中，本发明提供了至少一种KRAS MHC II类肽联合至少一种KRAS MHC I类肽的组合以提供抗肿瘤应答。MHCI类或II类肽能够靶向多个表位，这导致强烈且抗肿瘤免疫应答。

通过以下描述可以清楚地了解本发明的上述和其他方面和优势。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示了本发明的优选实施方式。这类实施方式不必然代表本发明的全部范围，而是作为参考，由此对权利要求进行说明并在本文中解释本发明的范围。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。本专利或专利申请公开与彩色附图的副本将根据要求，在支付所需的费用之后由政府机关提供。

图1A-1C：通过原初小鼠中的ELISPOT体内筛选肽候选物。(A)鉴定多个MHC II类等位基因中与最高结合亲和力相关的肽的免疫原性热图。颜色代表针对各氨基酸的三种算法的最高评分的百分位数，从深红色到浅蓝色按等评分排名的顺序排列。颜色层如下所示：深红色≥75％最高评分；红色＝50～75％最高评分；桔色＝40～50％最高评分；黄色＝30～40％最高评分；绿色＝20～30％最高评分；蓝色≤20％最高评分。(B)代表性的ELISPOT结果显示对来自用无抗原(第一行)、阴性对照抗原(HIV肽，第二行)、靶标肽(第三行)或阳性对照肽ConA(第四行)刺激的小鼠脾细胞的特异性KRAS肽的T细胞应答。(C)定量的ELISPOT结果。用各种单个KRAS肽(表2中所列序列)对小鼠疫苗接种。然后，收集脾细胞并用无抗原对照、各单个KRAS肽或阴性对照肽(HIV肽)或阳性对照ConA脉冲。孵育72小时后，进行ELISPOT试验，扫描平板，并统计分析斑点数量。空心柱，来自经特定KRAS肽脉冲的KRAS肽疫苗接种动物的ELISPOT读数；蓝色柱，来自仅注射佐剂并经特定KRAS肽脉冲的动物的ELISPOT读数；黑色柱，来自3只最显著KRAS肽疫苗接种动物的ELISPOT读数。数据显示为各组三个重复孔的平均值±SE，n＝5。

图2A-2H：KRAS疫苗在预防性设定中抑制条件型CCSP-KRAS小鼠中KRASG12D驱动的小鼠。(A)实验设计的示意图，其概述了疫苗给予的时间、致癌转基因的诱导、成像时间点和实验终点。(B)来自注射佐剂对照或KRAS多重肽疫苗的小鼠的代表性MRI图像。表面肿瘤的定量。来自各组的具有表面肿瘤的典型肺叶(C)、表面肿瘤数量(D)和肿瘤体积定量(E)。(F)代表性肺叶(H&E切片)以显示各组肺部内的肿瘤，显示肿瘤计数。内部肿瘤数量(G)和肿瘤体积定量(H)。数据以平均值±SE显示，n＝8(佐剂)，n＝9(KRAS-疫苗)，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。

图3：通过IFN-γELISPOT测试表位扩展。用KRAS组合疫苗(p5-21，p5-21G12D，p17-31和p78-92)对小鼠进行疫苗接种。然后收集脾细胞并用KRAS组合肽(combo peptides)、各种单一KRAS肽、未经疫苗接种的KRAS肽p75-89、组合IGFR肽或Tert肽脉冲。孵育72小时后，进行ELISPOT试验，扫描平板，并统计分析斑点数量。

图4A-4F：疫苗接种的免疫学作用。(A)KRAS疫苗促进淋巴结中的CD4+/CD8细胞。来自纵隔肺引流淋巴结(A，上图)和脾(A，下图)的CD4/CD8细胞的代表性流式细胞术结果。(B,C)CD8+细胞表示为实验终点分离自佐剂处理和疫苗接种动物的肺肿瘤引流淋巴结或脾的总活细胞百分比(B和C中的右侧两列)；CD4+细胞表示为实验终点时分离自佐剂处理和疫苗接种动物的肺肿瘤引流淋巴结或脾的总活细胞百分比(B和C中的左侧两列)。(D)Treg未通过KRAS肽疫苗增加。FoxP3+细胞的代表性流式细胞术数据表示为实验终点时分离自佐剂处理和疫苗接种动物的肺和脾的总活CD4+库的百分比。(E)KRAS不增加经处理的动物中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的数量。(E)KRAS增加经处理的动物中CD4+肿瘤浸润淋巴细胞的数量。

图5：KRAS疫苗诱导Th1/Th17细胞因子应答。通过凯杰公司(QIAGEN)ELISArrayKit进行细胞因子分析。最后一次加强性疫苗接种后，收集来自KRAS疫苗接种的或仅用佐剂的小鼠的脾细胞，并用KRAS疫苗共培养72小时；收集上清液并用凯杰公司的ELISArrayKit按照生产商的说明分析。数据显示为平均值±SE，n＝8(佐剂)，n＝9(KRAS-疫苗)，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。

图6：具有常规14个MHC II类等位基因的人Kras的免疫原性热图。

图7：K-ras疫苗与UAB30在K-rasLA1模型中起协同作用。Kras疫苗接种在8～10周龄时给予K-rasLA1小鼠，在此时许多胸膜病变已经在肺中形成。用单独的UAB30或者UAB30和K-ras疫苗的组合处理小鼠。确定多肿瘤性(multiplicity)和肿瘤负荷。

图8：UAB30增加肿瘤中肿瘤浸润的CD8+细胞并减少Treg。用对照、Kras疫苗、单独的UAB30或者Kras疫苗和UAB30的组合处理K-rasLA1小鼠，并在处理后4～5周时评估小鼠肿瘤和脾脏中的％CD4+或CD8+T细胞。

图9：K-ras疫苗在MNU诱导的小鼠肺腺瘤模型中抑制肿瘤数量和肿瘤负荷。MNU诱导后，用佐剂或Kras疫苗处理MNU模型小鼠4周，并在处理开始后第19周对肿瘤的数量和肿瘤负荷进行分析。

图10：K-ras疫苗与阿伐麦布(Avasamibe)协同作用以抑制K-ras驱动的肺癌同基因移植肿瘤模型中的肺肿瘤进展。

K-ras驱动的肺癌同基因移植模型中，用K-ras多重肽(multi-peptide)疫苗与阿伐麦布(avasimibe)的组合处理小鼠。肿瘤细胞接种后，评估随时间变化的肿瘤体积。

图11：K-ras疫苗与免疫检查点抑制剂抗-Vista协同作用以抑制K-ras驱动的胰腺癌同基因移植肿瘤模型中的胰腺癌进展。在胰腺癌肿瘤模型中，用与K-RAS疫苗组合的抗-VISTA处理小鼠。给药后分析随时间变化的肿瘤体积。

图12：选择针对PD-L1或PD-1的最具免疫原性的肽。

使用IFN-γELISPOT试验在原初小鼠中测试PD-1和PD-L1的免疫原性。(P<0.0001，数据未显示)

图13：PD-1/PD-L1肽疫苗有效抑制K-ras驱动的肺癌同基因移植肿瘤模型中的肿瘤生长。在小鼠肺癌肿瘤模型中，用PD-1抗体，PD-L1抗体，PD-1和PD-L1抗体的组合，或包含PD-1肽(表3：mPD1-21、mPD1-94、mPD1-193和mPD1-216)、PD-L1肽(表3：mPDL1-13、mPDL1-76和mPDL1228)或PD-1和PD-L1肽(表3：mPD1-21、mPD1-94、mPD1-193、mPD1-216和mPDL1-13、mPDL1-76、mPDL1228)的疫苗处理小鼠。监测随时间变化的肿瘤体积。

发明详述

在进一步详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的具体实施方式。还应当理解本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式而不是限制性的目的。本发明的范围仅受权利要求的限制。如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数实施方式，除非文中另有明确说明。

对本领域技术人员显而易见的是，除了已描述的那些外，在不背离所述发明理念的前提下可以进行更多的改良。在解释本公开时，所有术语应以与上下文一致的最广义的方式解释。术语“包含”的变体应该被解释为以非排他的方式引用元件，组件或步骤，因此引用的元件，组件或步骤可以与不明确引用的其他元件，组件或步骤组合。被称为“包含”某些元件的实施方式也被认为是“基本上由(这些元件)组成”和“由(这些元件)组成”。在值的范围是给定时，本公开明确考虑了未明确列举的那些范围的上限和下限的其他组合。例如，叙述1至10或2至9的值也考虑1至9或2至10之间的值。认定为“至”两个值之间的范围包括端点值。例如，叙述1至10的值包括值1和10。

本发明提供了可以用于引发对象中抗肿瘤应答的肽，编码这些肽的核酸序列，和包含这些肽的组合物(并且在一些情况中，两种或更多种肽的特定组合)。此外，还提供了治疗、预防或减少癌症进展的方法。合适地，所述肽特异性地引发MHC II类介导的T细胞应答，其导致治疗、减少或消除对象中的肿瘤。

癌症的术语“治疗”或“处理”包括但不限于，减少、抑制或预防癌细胞的生长或传播，减少、抑制或预防原发性肿瘤的转移，和/或减少、抑制或预防癌症或其转移的一种或多种症状。

术语“肿瘤细胞生长”或“肿瘤细胞增殖”在本文中可以互换使用表示肿瘤细胞数量的增长。

术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换使用。术语癌症和肿瘤指或描述哺乳动物中的生理病症，其中细胞群的特征在于源于哺乳动物器官不受调控或不正常的细胞生长。术语癌症指原发性癌症和其继发性(转移性)病变。

可以通过本文所述的方法治疗或预防的合适癌症包括但不限于，KRAS相关癌症，包括，例如，与突变的KRAS基因相关的癌症，具有异常或上调KRAS表达的癌症，等等。具体地，可以通过本文所述方法治疗的合适癌症包括但不限于，肺癌，非小肺癌(NSCLC)，胰腺癌和结肠癌。

可能具有突变的或失调的KRAS基因的其他癌症也可以通过本文所述的方法治疗或预防。这些癌症可以包括但不限于，例如，泌尿生殖系统、妇科、肺、胃肠道、头颈癌，恶性胶质母细胞瘤，恶性间皮瘤，非转移性或转移性乳腺癌，恶性黑色素瘤，梅克尔细胞癌或骨和软组织肉瘤，血液肿瘤，多发性骨髓瘤，急性髓性白血病，慢性粒细胞白血病，骨髓增生异常综合征和急性淋巴细胞白血病，乳腺癌，转移性结直肠癌，激素敏感或激素难治性前列腺癌，结直肠癌，卵巢癌，肝细胞癌，肾细胞癌，胰腺癌，胃癌，食道癌，肝细胞癌，胆管细胞癌，头颈部鳞状细胞癌，软组织肉瘤和小细胞肺癌。在优选的实施方式中，癌症是胰腺癌、肺癌或结肠癌。具体地，在一些实施方式中，癌症是具有突变的或失调的KRAS基因的胰腺癌、肺癌或结肠癌。

在一实施方式中，本发明提供了分离的MHC II类相关抗原肽，其包含来自KRAS的氨基酸序列，所述来自KRAS的氨基酸序列的长度小于26个氨基酸并且能够结合抗原呈递细胞上的MHC II类分子并通过抗原呈递细胞上的MHC II类分子呈递。MHC II类相关抗原肽包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列组成、由下述氨基酸序列组成或是下述氨基酸序列，所述氨基酸序列选自如表1所述的SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12或与氨基酸序列SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列相同性的氨基酸序列。优选地，抗原多肽的长度小于26个氨基酸，更优选11-25个氨基酸的长度。在一些是实施方式中，多肽的长度约14-18个氨基酸，或者约15-17个氨基酸的长度。

本发明的多肽优选由抗原呈递细胞上的MHC II类分子呈递。

在一些实施方式中，本公开提供了疫苗组合物，其包含(1)至少一种KRAS肽，其中该肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID No.4、5、6、7、8、9、10、11或12或与SEQ ID No.4、5、6、7、8、9、10、11或12具有至少70％序列相同性的氨基酸序列，或(2)载体，其包含编码SEQID No.4-12中任一项的多肽序列或与SEQ ID No.4-12中任一项的氨基酸具有至少70％序列相同性的氨基酸序列的核酸序列；和佐剂，其中该疫苗组合物引发对象中的抗肿瘤免疫应答。

在其他实施方式中，本公开提供了包含至少两种KRAS MHC II类肽的疫苗组合物，其中所述至少两种KRAS肽选自：存在于表1中的SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少70％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少85％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少95％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少98％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少99％序列相同性的氨基酸序列，或与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有100％序列相同性的氨基酸序列。

在其他实施方式中，本公开提供了包含至少三种KRAS MHC II类肽的疫苗组合物，其中所述至少三种KRAS的肽选自：存在于表1中的SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项所述的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少70％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少85％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少95％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少98％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少99％序列相同性的氨基酸序列，或与SEQ IDNo.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有100％序列相同性的氨基酸序列。

在其他实施方式中，本公开提供了包含至少四种KRAS MHC II类肽的疫苗组合物，其中所述至少四种KRAS的肽选自存在于表1中的SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项所述的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少70％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少85％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少95％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有至少98％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一项具有至少99％序列相同性的氨基酸序列，或与SEQ IDNo.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项具有100％序列相同性的氨基酸序列。

在一实施方式中，疫苗组合物包含至少四种肽，其中至少四种KRAS的肽包含SEQID NO:1(p5-21Wt：KLVVVGAGGVGKSALTI)，SEQ ID NO:4(p17：SALTIQLIQNHFVDE)，SEQ IDNO:6(P78：FLCVFAINNTKSFED)和SEQ ID NO:8(P156:FYTLVREIRKHKEKM)的氨基酸序列，与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8具有至少70％序列相同性的氨基酸序列；与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8具有至少80％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8具有至少95％序列相同性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQID NO:8具有至少99％序列相同性的氨基酸序列。

在另一实施方式中，疫苗组合物包含至少四种肽，其中至少四种KRAS的肽包含SEQID NO:1(p5-21Wt：KLVVVGAGGVGKSALTI)，SEQ ID NO:2(P5-21G12D：KLVVVGADGVGKSALTI)，SEQ ID NO:4(p17：SALTIQLIQNHFVDE)，和SEQ ID NO:6(P78：FLCVFAINNTKSFED)的氨基酸序列，与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6具有至少70％序列相同性的氨基酸序列；与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6具有至少80％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6具有至少95％序列相同性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8具有至少99％序列相同性的氨基酸序列。

在另一实施方式中，疫苗组合物包含多种肽，例如，至少1种肽，至少2种肽，至少3种肽，至少4种肽，并且可以包含来自SEQ ID No.1-12的肽(包括与SEQ ID No.1-12中任一项具有至少90％相同性的氨基酸序列)的任何组合，。例如，特定组合物可以包含含有SEQID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的肽。应当理解的是，疫苗组合物可以包含选自表1的两种或多种肽的组合，包括任何组合的SEQ ID No.1-12，或包括编码所述多肽或包含存在于表1中的核酸序列(例如，SEQ ID No.13-24)的载体。例如，合适的组合物可以包含SEQ IDNO:1、5、7和9的肽(或包含编码这些载体的核酸的载体)；或者SEQ ID NO 2、5、7和9，或者SEQ ID NO 3、5、7和9，或者SEQ ID No 1、4、6和8，或者SEQ ID No.2、4、6、8，或者SEQ IDNo.3、4、6和8，或者SEQ ID No.3、5、7和9等等，并且并不限于本文所述的示例。

表1

疫苗组合物适当地包含至少一种佐剂。术语“佐剂”指这样的化合物，当给予个体或体外测试时，增加对向给予抗原的测试系统或个体中抗原的免疫应答。

本发明的组合物和方法中利用的佐剂包括但不限于本领域已知的佐剂。合适的佐剂包括但不限于，含有CpG的核苷酸序列，含有CpG的寡核苷酸，ODN1826，铝盐佐剂，它们为本领域所熟知并且述于，例如，Harlow,E.和D.Lane(1988；《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))和Nicklas,W.(1992；铝盐(Aluminum salts).Research inImmunology 143:489-493)，蒙塔尼(Montanide)ISA佐剂，补体组件C3d、MF59、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白的三聚体，皂苷QS21，单磷酰基脂质A(MPL)，SBAS2，含有未甲基化的CpG的寡核苷酸，免疫刺激细胞因子，羽茎糖苷(quill glycoside)，包含细菌分裂素的混合物，包含细菌毒素的混合物，包含2种上述佐剂的混合物，包含3种上述佐剂的混合物或其其他组合。

具体地，适合用于人给药的佐剂包括但不限于，例如，GM-CSF，环二核苷酸(CDN)，铝，单磷酰基脂质A(MPL)，和STING配体(cGAMP)。

该疫苗组合物可进一步包含药学上可接受的运载体。药学上可接受的运载剂基于选定的给药途径和标准药学实践选择。根据药学制剂领域中的标准实践，组合物可以配制成剂型。参见Alphonso Gennaro,编著,《雷明顿药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences),第18版，(1990)宾西马尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.)。合适的剂型可以包括，例如，溶液，胃肠外溶液或悬浮液。

本领域技术人员可以容易地确定剂量，给药方式以及合适的药学上可接受的运载体、稀释剂和赋形剂。

所述发明的肽的治疗有效量与药学上可接受的运载体组合以提供疫苗组合物。组合物可以本领域认可的任何模式给予，包括口腔，粘膜和胃肠外，优选肌肉内和静脉内给药。本发明的另一方面是提供了这样的疫苗组合物，当其在哺乳动物中，优选在人类中胃肠外给予，优选皮内、肌肉内或皮下给予时，引发强烈的免疫学抗肿瘤应答。在一些方面中，当将疫苗组合物粘膜给予或通过其他途径诸如口服途径或气雾剂途径给予时，疫苗组合物是有效的。

可以确定合适的剂量，例如，通过来自动物研究的推断或者在临床试验中考虑患者的体重、吸收率、半衰期、病情严重程度等因素。剂量和治疗过程可能因人而异。在一些实施方式中，为了预防癌症的发展或进展，可能需要定期给药以加强对免疫细胞的免疫应答。本领域技术人员可以确定合适的加强剂(booster)。例如，可以每个月、每隔一月、每4个约、每6个月、一年一次、每两年一次和介于两者之间的任何时间范围给予疫苗。此外，待以疫苗递送的其他疗法的时间和剂量可以不同并且取决于其他疗法。

对于肠胃外给药，肽和载体可以与合适的运载剂或稀释剂混合，如水，油(例如，植物油)，乙醇、盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水或盐水)，右旋糖(葡萄糖)水溶液和相关的糖溶液、甘油或二醇，如丙二醇或聚乙二醇。可以添加稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。合适的抗氧化剂包括亚硫酸盐，抗坏血酸，柠檬酸及其盐，以及EDTA钠。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。用于肠胃外给药的组合物可以采用水性或非水性溶液，分散体、悬浮液或乳液形式。

组合物优选是单位剂型。以这种形式将所述制剂分成含有适量活性组分的单位剂量。所述单位剂型可以是套装制剂，套装包含分散的定量制剂，如小瓶或安瓿瓶中的分装好的片剂、胶囊剂和粉末剂。另外，所述单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭，或是适量的这些剂型的套装形式。

在一些方面中，组合物可以包含分离和纯化质粒或载体，其包含编码KRAS肽的核酸序列。在一些实施方式中，载体包含选自SEQ ID NO:13-24的核酸序列，所述核酸序列与转录调控元件操作性地连接。在一些实施方式中，载体或质粒可以编码一种或多种本文所述的肽。制造编码一种或多种质粒的载体或质粒的合适方法为本领域所知。合适的组合物可以包含本文所述的一种或多种质粒或载体

在一实施方式中，本公开提供了这样的载体，所述载体包含分离和纯化的核酸序列，所述分离和纯化的核酸序列包含编码选自下组的至少一种肽的至少一种核酸序列：SEQID No.1-12和与SEQ ID No.1-12具有至少70％序列相同性的氨基酸序列，其中所述至少一种核酸序列与转录调控元件操作性地连接。

在一些实施方式中，载体还包含异源性核酸序列。述及“异源性核酸序列”意指非人核酸序列，例如，细菌、病毒或并不自然存在于人类中并能够表达编码的肽的其他非人核酸序列。例如，本领域已知并包含非人核酸序列的表达载体或质粒，包括例如含有CMV启动子的表达质粒。

在一些实施方式中，载体包含选自SEQ ID NO:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及其组合的核酸序列以及异源性核酸序列。

在一些方面中，提供了在有此需要的对象中引发抗肿瘤免疫应答的方法。该方法包括：向该对象给予有效量的本文所提供的疫苗组合物，其中该疫苗组合物引发抗肿瘤免疫应答。在一些实施方式中，抗肿瘤免疫应答是MHC II类介导的T细胞应答。抗肿瘤免疫应答的增强减少对象中肿瘤细胞的数量或对象中肿瘤的大小。在一些方面中，抗肿瘤应答导致肿瘤细胞生长的预防并引起肿瘤细胞凋亡。在一些方面中，MHC II类介导的T细胞应答是CD4+T细胞应答。

在其他方面中，提供了治疗癌症的方法或降低、抑制或预防癌细胞生长的方法。该方法包括提供有效量的本文所提供的疫苗组合物，例如，包含至少一种KRAS肽的疫苗组合物，适宜地至少两种KRAS肽，其中该有效量能够治疗癌症或抑制、降低或预防患者中癌细胞生长、增殖、入侵或转移。

在一些方面中，疫苗组合物可以用于选择性地增加患者体内肿瘤细胞的细胞死亡，引起肿瘤尺寸的减小，肿瘤生长的抑制和/或转移的减少或抑制。

在一些方面中，治疗癌症的方法包括在以标准疗法治疗之前、同时或之后给予疫苗组合物。合适的标准疗法包括但不限于，手术，放疗(RT)和化疗(CT)等。

在一些方面中，疫苗组合物以有效量给予，所述有效量增加放疗或化疗在治疗患者癌症中的功效。本领域技术人员已知合适的化疗方式。

本文所公开的方法可以包括常规治疗方案，可以对其进行改变以包括本文所述的步骤。本文所公开的方法可以包括监测患者以确定治疗的功效并响应监测进一步改进治疗。

在其他方面中，提供了预防、降低或减缓处于发展KRAS相关癌症风险中的患者中癌症进展或发展的方法。该方法可以包括确定患者是否处于发展KRAS相关癌症的风险之中；和用有效量的本文所提供的疫苗组合物治疗患者。

本领域已知确定患者是否处于发展KRAS相关癌症较高风险的方法，例如，通过确定患者样品中的KRAS突变。已经证明KRAS突变可以存在于非小细胞肺癌(NSCLC)患者的循环游离DNA(circulating free DNA)(cfDNA)中。本领域已知检测该循环游离DNA的方法，如Garzon等"非小细胞肺癌(NSCLC)患者循环游离DNA(cfDNA)中的KRAS突变(KRAS mutationsin the circulating free DNA(cfDNA)of non-small cell lung cancer(NSCLC)patients)"Transl Lung Cancer Res 2016；5(5):511-516中所述，其通过引用其全部纳入。合适的方法包括但不限于，实时PNA PCR和其他标准技术。

检测样品的KRAS突变合适地是生物样品，例如，来自活检的组织样品或流体样品，例如，血液样品。

在一些实施方式中，该方法还包括给予至少一种检查点抑制剂。

相应地，在一实施方式中，本发明提供了在有此需要的对象中治疗癌症或起始、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括向对象给予与试剂组合的疫苗组合物，所述试剂是检查点抑制剂。在一个方面中，检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。在另一方面中，检查点抑制剂是单克隆抗体，人源化抗体，全人抗体，融合蛋白或其组合。在其他方面中，检查点抑制剂抑制检查点蛋白，其可以是CTLA-4、PDLl、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在其他方面中，检查点抑制剂与检查点蛋白的配体相互作用，所述检查点蛋白可以是CTLA-4、PDLl、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。

在一些实施方式中，检查点抑制剂是抗-PDL1抗体，抗-TIM3抗体和抗-VISTA抗体，抗-CTLA-4抗体或其组合。

在另一实施方式中，检查点抑制剂是包含PD-1或PD-L1的肽的PD-1/PD-L1肽疫苗。在另一实施方式中，PD-1/PD-L1肽疫苗包含表3或4的至少一种肽，或与SEQ ID NO.33-54中任一项具有至少70％序列相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO.33-54中任一项具有至少85％序列相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO.33-54中任一项具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO.33-54中任一项具有至少95％序列相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO.33-54中任一项具有至少98％序列相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO.33-54中任一项具有至少99％序列相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO.33-54中任一项具有100％序列相同性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，至少一种K-ras肽、或者至少两种K-ras肽、或者至少三种K-ras肽、或者至少四种K-ras肽与存在于表3或4中的至少一种PD-1/PD-L1肽、或者至少两种PD-1/PD-L1肽、或者至少三种PD-1/PD-L1肽、或者至少四种PD-1/PD-L1肽，或与存在于表3或4中的任一种具有至少70％序列相同性、或与存在于表3或4中的任一种具有至少80％序列相同性、或与存在于表3或4中的任一种具有至少90％序列相同性的任何氨基酸组合。

在一些实施方式中，将K-ras肽和PD-1/PD-L1肽组合成单个疫苗制剂。在一些实施方式中，至少一种K-ras肽、或者至少两种K-ras肽、或者至少三种K-ras肽、或者至少四种K-ras肽与至少一种PD-1/PD-L1肽、或者至少两种PD-1/PD-L1肽、或者至少三种PD-1/PD-L1肽、或者至少四种PD-1/PD-L1肽组合。

在一些实施方式中，疫苗组合物和检查点抑制剂同时给予。在其他实施方式中，在治疗之间的数分钟、数小时或数天依次给予疫苗组合物和检查点抑制剂。本领域技术人员可以确定合适的给药方案。

在另一方面中，本发明提供了在有此需要的对象中治疗或预防癌症或起始、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括给予与RXR激动剂组合的疫苗组合物。合适的RXR激动剂为本领域所知并且包括但不限于，例如，蓓萨罗丁(bexarotene)、UAB30和低剂量视黄酸(例如，25-300μg/小鼠/天)。例如，用于人对象的低剂量视黄酸包括约45-100mg/m2/天。例如，用于人对象的合适剂量的蓓萨罗丁可以是约75mg/天至约200mg/天，合适地为约150mg/天。用于人对象的合适剂量的UAB30包括例如约75mg至约300mg/天，合适地为约200mg至约300mg/天。

在另一方面中，本发明提供了在有此需要的对象中治疗癌症或起始、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括给予与有效量的非类固醇抗炎药(NSAID)组合的疫苗组合物，以治疗或预防癌症或增强或延长对象中的抗肿瘤应答。已经证明使用NSAID，例如cox抑制剂，将协同增强疫苗的抗肿瘤作用。参见Selene等"通过逃避免疫的环氧酶依赖性肿瘤生长(Cyclooxygenase-Dependent Tumor Growth through Evasion of Immunity)"2015,Cell162,1257-1270，通过引用其全文纳入。

在另一方面中，本发明提供了在有此需要的对象中治疗或预防癌症或起始、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括给予与阿伐麦布(avasimibe)(CI-1011)组合的疫苗组合物，所述阿伐麦布是酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶(ACAT)的抑制剂。合适剂量的阿伐麦布为本领域已知并且包括但不限于，例如，50mg/天至约1000mg/天，或者约50mg/天至500mg/天，例如，50mg/天、125mg/天、250mg/天或500mg/天。

除非上下文另有明确说明，否则本公开关于前一种方法所述公开内容的方面可以适用于后一种方法，反之亦然。

术语“对象”和“患者”在本文可以互换使用，并且指需要治疗的哺乳动物或动物。合适的对象包括，哺乳动物，包括例如，人、狗、猫、马、牛、大鼠、小鼠、猴。在优选的实施方式中，对象是人。

术语“有效量”或“治疗有效量”指足以产生有益或所需生物和/或临床结果的量。

还包括了用于进行本文所述方法的合适的试剂盒。试剂盒可以包括本文所述的疫苗组合物以及用于给予疫苗组合物的说明书。

从本发明下述优选实施方式的描述以及附权利要求中能够很容易地了解本发明的其他特征和优点。除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。

实施例

实施例1证明了肽对本文所述KRAS的用途。具体地，该实施例证明了多重肽KRAS疫苗在初步预防KRAS诱导的肺癌中具有免疫原性并有效。

肺癌仍然是全球范围癌症死亡的主要原因。在高达30％的肺癌病例中检测到KRAS中的突变。尚未研发出特异性地靶向突变KRAS的有效疗法。通过针对指定肿瘤相关抗原进行疫苗接种来加强宿主免疫应答作为治疗建立的肿瘤或预防高危个体中肿瘤发展的方法是一个重点研究的领域。本研究评估了靶向KRAS分子多个表位的新配制的多重肽疫苗在KRAS驱动的肺肿瘤小鼠模型中的免疫原性和抗肿瘤功效。配制的疫苗包含排在前列的四种肽，这些肽引发最强的免疫应答，并且显示人和小鼠之间的100％的序列同源性。多重肽KRAS疫苗在诱导型CCSP-TetO-KRAS^G12D小鼠模型中测试，其中在激活突变KRAS蛋白之前给予疫苗。KRAS肽疫苗展现出显著的功效，当与仅有佐剂的情况相比较时，降低肿瘤数量和肿瘤负担>80％。收集自疫苗接种动物的脾细胞显示出对免疫肽(immunizing peptide)强烈的免疫应答。此外，通过疫苗接种的肽体外刺激这些脾细胞导致指示Th1和Th17应答的细胞因子分泌，但是Th2相关细胞因子分泌最少。多重肽KRAS疫苗在初步预防KRAS诱导的肺癌中具有免疫原性并有效，这表明该方法潜在地可以单独地或与其他方式用于预防其他KRAS驱动的癌症。

材料和方法

小鼠

在FVB背景上表达具有G12D突变的鼠KRAS的诱导型TetOKRAS小鼠获自NCI鼠模型财团(NCI Mouse Models Consortium)，然后与在A/J背景上表达Tet-on克拉拉细胞分泌性蛋白(CCSP)的小鼠杂交，以允许转基因的组织特异性诱导型表达。对于本文所报道的所有实验，仅使用具有KRAS^G12D和CCSP的F1代。将所有小鼠置于威斯康辛州密尔沃基市威斯康星医学院(Medical College of Wisconsin,Milwaukee,WI)的生物医学资源中心。所有操作经机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。

用于预测MHC II类结合肽的分选系统

我们和其他人已经证明了在多种算法中得分较高的肽最有可能产生强免疫应答。因此，我们使用如之前所述的多重评分系统[13]。简言之，为了鉴定在多个等位基因中具有最佳结合亲和力和混杂性(promiscuity)的KRAS特异性MHC II类肽，我们使用下述算法进行预测：SYFPEITHI(德国海德堡的细胞生物学研究所(Institute for Cell Biology,Heidelberg,Germany))、IEDB和Rankpep(马萨诸塞州波士顿哈佛(Harvard,Boston,MA))。

以如下所述选择该研究中所述的11个肽。对于来自3种算法的多个可用的MHC II类等位基因，初始时，仅基于预测的结合亲和力的排名次序选择20种肽序列。序列的长度为大约15个氨基酸。为各种选定的肽的每个氨基酸指定分数，其中1是在多种算法中的预测性结合亲和力排名最高的肽序列中所含的氨基酸。对每个氨基酸进行评分考虑了在算法中和算法间出现的多个肽重叠。将来自所有3种算法的多个MHC II类等位基因针对各氨基酸的评分(S)相加。然后，对其中预测各氨基酸将具有高结合亲和力的MHC II类等位基因的数量(N)进行计数。各氨基酸的最终得分通过S乘以N来计算。为了方便鉴定KRAS蛋白的最有潜力的免疫原性区段，基于其最终评分百分比为各氨基酸指定颜色(从深红到浅蓝)，其中深红为最高≥75％，而浅蓝为最低<10％(图1A)。因此，深红色对应这样的序列，其中多个肽在算法中以及算法间评分高。浅蓝代表这样的序列，其是所有预测的高结合肽中潜在免疫原性最小的。KRAS肽由Genemed合成有限公司(Genemed Synthesis Inc)(加利福尼亚州南旧金山)合成，通过高通量液相色谱纯化，并通过质谱表征，用于所有实验。

疫苗制备和免疫

用50μg的各肽疫苗接种小鼠。添加磷酸盐缓冲盐水(PBS)以获得50μL/小鼠的总体积。添加等量的佐剂(完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)以获得100μL/小鼠的总体积小鼠在7周龄时于肩部经皮下注射，并且给予加强型疫苗接种，对于前三个加强型疫苗接种，以每两周给予，而对于后三个加强接种，以每4周给予，如图2A所示。第四个疫苗接种后一周，用Dox饮食(625mg/kg饮食)启动转基因Kras，并在整个研究中给予Dox饮食。

ELISPOT试验

通过70μm细胞过滤器(BD公司)过滤来自整个脾脏的细胞悬浮液，并使用ACK裂解缓冲液进行血红细胞裂解。将1.5～3.0x 10⁴个细胞铺板到MAIPS4510多重筛选(Multiscreen)96孔板的单个孔中，所述单个孔之前用抗干扰素γ检测抗体涂覆并包含具有肽、阳性对照(伴刀豆球蛋白A)或阴性对照(HIV肽，或无抗原)的培养基。72小时后，洗涤平板并添加二抗(BD公司)，并在平板上于4摄氏度孵育过夜。然后用PBS洗涤孔，并添加HRP链霉亲和素。1小时孵育后，使用AEC基质对平板进行5-25分钟的显色。然后，在冷自来水下温和洗涤平板。当干燥时，使用自动化读板器系统(CTL科技公司)对平板成像并对斑点数量定量。

核磁共振成像

使用具有定制的鸟笼状正交线圈(Doty科学公司(Doty Scientific)，南卡罗来纳州哥伦比亚市)的9.4T MRI(Bruker公司，马萨诸塞州比尔里卡)对小鼠进行成像。整个成像过程中，小鼠用异氟醚麻醉。以2.5％异氟醚处理小鼠，并维持在1.0-1.5％。成像期间连续监测小鼠心律、体温和呼吸率。使用心电图的呼吸和心脏门控均用于确保在呼吸周期的潜伏期和心动周期期间的一致点处一致地获得图像。使用多切片、多回波采集(MSME)对肿瘤成像。使用下述参数获得图像；TE＝8.07ms，TR≥400ms(可变)，基质＝128X 128，1评价，20个轴向切片。

使用H&E染色的肺肿瘤计数

来自CCSP-KRASG12D小鼠的小鼠肺样品经膨胀并福尔马林固定并进行石蜡包埋处理(Sakura Tissue Tek VIP5)。石蜡包埋后，将样品以4μm(Microm HMS355S)切片到聚-l-赖氨酸涂覆的切片上并于45℃过夜风干，然后进行免疫组织化学或H&E染色。

使用NanoZoomer切片扫描仪(滨松公司(Hamamatsu))扫描H&E染色的切片。随后，使用NanoZoomer软件，并特别地突出和测量肿瘤区域。每只小鼠选择3个切片用于分析，对应肺的腹侧、中线和背侧。

流式细胞术

将间充质淋巴结、小鼠肺或脾切碎并加工成单细胞悬浮液。使用针对表面标志物CD4、CD8、CD44、CD62L和CD25(电子生物公司(eBioscience))表达的流式细胞术以及针对FoxP3(电子生物公司)的胞内染色评估单细胞。将染色的细胞固定在1％多聚甲醛中，并按照生产商的说明进行透化以评估胞内靶标(FoxP3)的表达。使用LSR-II流式细胞仪(BD公司)进行流式细胞术。使用Flowjo软件(树星公司(Tree Star))分析数据。

细胞因子分析

小鼠Th1/Th2/Th17细胞因子Multi-AnalyteELISArray^TM试剂盒(凯杰公司(Qiagen)用于细胞因子分析；其分析涉及T辅助细胞生物学的一组12个细胞因子。通过该阵列表示的细胞因子是IL2、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、IL17A、IL23、IFNγ、TNFα和TGFβ1。用不同的肽刺激来自不同组小鼠的脾细胞，然后收集上清液并基于生产商的说明分析。

评估肿瘤浸润T细胞

将细胞冷冻于Tissue-Tek OCT中并储存在-80C。然后对冷冻的肿瘤进行切片(8mm)，固定在75％/25％丙酮/甲醇中5分钟，然后使用PBS洗涤。使用常规山羊血清(PBS中10％)于室温孵育切片1小时，洗涤，并用大鼠抗-小鼠CD8(AbDSerotec)以1:100稀释度在10％山羊血清/PBS中4C过夜孵育。洗涤后，添加Alexa Fluor 488山羊抗-大鼠二抗(英杰公司(Invitrogen)至切片(1:1000)室温下1小时。附加洗涤并覆盖盖玻片后，添加具有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)封装介质的Prolong Gold抗褪色剂(英杰公司)。在三个随机高倍显微镜视野中对各切片的阳性细胞和DAPI染色的细胞核进行计数，并以平均值表示。在该视野中的阳性细胞数表示为CD8⁺细胞数/mm²肿瘤区域。数据以3只小鼠/组的平均值和SEM显示。

统计学分析

所有体外实验都至少重复三次。体内研究各种使用5-9只小鼠。使用双尾斯氏t检测评估对照和各处理组之间的差异。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001被认为具有统计学显著性。

结果

通过多个MHC II类肽结合算法联合的多重评分系统鉴定引发T细胞应答KRAS肽

使用结合了多个MHC II类肽结合算法的多重评分系统鉴定了免疫原性“热点(hotspot)”；选定了11个肽(表2)；在首次接受试验的小鼠中使用如之前所提供的IFN-γELISPOT试验评估其免疫原性。还将涵盖密码子12中突变的KRAS 17-聚体肽(p5-21)以及其G12D突变体(p5-21G12D)选作加强肽(robust peptide)以刺激免疫应答[14]。图1A显示了整个KRAS蛋白序列和通过仅针对MHC II类表位的多重评分系统鉴定的免疫原性“热点”。11个新设计的肽中的6个(45％)具有免疫原性，并且p5-21、p17-31、p78-92和p156-170引发最强的IFN-γ应答(图1C)。有趣的是，与p78-92仅有3个氨基酸不同的p75-89，在首次接受试验的动物中产生较弱的应答。相似地，p154-168产生比p156-170弱得多的应答，尽管肽之间有很大程度的重叠，而包含在p5-21内并且仅在C-末端缺失2个氨基酸的p5-19产生的应答小于p5-21的50％。两个17-聚体肽(p5-21和p5-21G12D突变体)也显示出强免疫原性，其IFN-γ分泌细胞的均值为约100斑点各孔(SPW)，相较于阴性对照HIV肽的10SPW(图1B和1C)。如所预期，仅用佐剂免疫的小鼠没有发展出对单一肽或多重肽刺激的任何抗原特异性IFN-γ应答，并且平均IFN-γ应答与HIV肽类似(P<0.0001，图1B、1C)。为了包括针对野生型和突变KRAS两者的肽，还基于人和小鼠KRAS之间的高度同源性，选择肽p5-21(SEQ ID NO:2)、p5-21G12D(SEQ ID NO:1)、p17-31(SEQ ID NO:4)和p78-92(SEQ ID NO:6)以在预防性功效研究中配制多重肽KRAS疫苗。

KRAS特异性多重肽疫苗在初级预防设定中防止非肿瘤形成

我们在多西环素诱导的KRAS^G12D小鼠模型中进行实验。如图2A所示，当小鼠为7周龄时，给予第一初免疫疫苗接种，以CFA作为佐剂给予，然后以两周的间隔给予3个加强型疫苗接种，采用IFA。IFA的最后一次疫苗接种后一周，在饮食中起始多四环素以诱导KRAS^G12D表达。其他加强型疫苗接种以四周的间隔在研究的剩余期间内给予。在实验终点之前即刻，首先使用来自至少三只代表性动物的MRI成像原位评价肿瘤生长。如图2B所示，MRI成像显示了未经疫苗接种和疫苗接种的小鼠之间肺实质内显著的定性差异。图2C显示了代表性的未经疫苗接种和疫苗接种的小鼠肺部。来自未经疫苗接种的小鼠的肺被肺腺瘤完全覆盖，而来自KRAS特异性肽疫苗接种的小鼠的肺显示出几乎没有严重的肿瘤。KRAS疫苗显著地减少表面肿瘤，从未经疫苗接种的小鼠中各鼠肺约150个肿瘤降至疫苗接种的小鼠中约21个肿瘤(图2D)，并使肿瘤提及减小接近90％(图2E，19.1mm³至2.4mm³)。并对经由H&E染色的内部肿瘤计数进行进一步的分析。来自疫苗接种的相对于佐剂治疗的动物的肺的代表性组织学检查揭示了肺实质内的变化(图2F)。类似于表面肿瘤计数，接种疫苗动物显示出各切片平均约5个肿瘤以及0.4mm³的平均体积，与之相对的是未接受疫苗的动物中各切片平均约21个肿瘤(p＝0.0013)和1.6mm³的平均体积，等同于多肿瘤性和肿瘤体积的75％减少(图2G、2H)。值得注意的是，9只疫苗接种动物中的2只完全没有肺部肿瘤(图2G)。这些结果表明KRAS特异性肽疫苗在预防设定中可以抑制KRAS驱动的肺致癌作用。

KRAS疫苗接种诱导T细胞特异性免疫应答和可能的抗原内表位扩展

为了检验孵育KRAS疫苗保护性作用的特异性免疫，在研究结束时对分离自单独的佐剂和疫苗接种的CCSP-KRAS^G12D小鼠的脾细胞进行IFN-γELISPOT试验。来自ELISPOT试验的结果表明疫苗接种动物对KRAS肽具有强烈的抗原特异性、IFN-γ相关免疫应答。如图3所示，来自疫苗接种小鼠的脾细胞显示出对疫苗制剂中所使用的4种KRAS肽的混合物具有最高水平的IFN-γ应答，虽然它们也对构成该疫苗的个别肽有应答。平均IFN-γ分泌细胞应答在汇集的KRAS肽组中为216，而对个别肽p5-21、p5-21G12D、p17-31和p78-92分别为36、40、116和52。有趣的是，我们观察到来自疫苗接种动物的脾细胞对非疫苗KRAS肽p75-89具有强应答，而非疫苗KRAS肽p75-89与疫苗接种中使用的一种肽p78-92具有12个氨基酸重叠(p75-89，图3)。这表明当前的KRAS疫苗可能诱导了分子内表位扩展(spreading)。观察到的免疫应答似乎对疫苗KRAS肽具有高度特异性，如单独接受佐剂的动物中缺少应答所证实；将这些动物暴露于在生长的肿瘤中过表达的突变的KRAS蛋白，但是其对于所测试的任何肽都不显示免疫源性反应性，包括具有突变区域(p5-21G12D)的肽。没有证据显示一般的免疫过度刺激，因为没有动物对无关未原初抗原有响应，这进一步支持了在疫苗接种组中检测到的免疫应答对KRAS疫苗具有高度特异性的观点。

KRAS疫苗接种增加肺引流淋巴结中的CD4+/CD8+细胞，以及CD4+肿瘤浸润淋巴细胞。

细胞表面标志物详细的流式细胞术分析进一步揭示淋巴结(图4A)和脾脏(图4B)中存在CD4+和CD8+淋巴群的不同特征。来自疫苗接种动物的肺引流淋巴结内CD4+和CD8+细胞的整体百分比的趋势向上(p分别为0.16和0.056)，而表达CD4和FoxP3转录因子的Treg的百分比似乎维持不受影响(图4C)。我们进一步评估了发展出肺癌的各组中代表性小鼠的CD4+和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量(图4D、4E、4F)。KRAS疫苗相对于佐剂对照显著增加肿瘤内CD4+T细胞的数量，但是在CD8+肿瘤浸润淋巴细胞中没有区别。

对于辅助肽疫苗接种的T细胞应答的Th1/Th2细胞因子概况

在用疫苗接种的四-肽库(four-peptide pool)体外刺激后三天测量脾细胞分泌的细胞因子。响应KRAS肽库的Th1和Th2细胞因子产生如图5所示。响应KRAS肽库时丰度最高的个别细胞因子是IFN-γ、IL-2和IL-17A，分别由脾细胞中的基线增加约7倍、5倍和15倍。相较于佐剂对照，疫苗接种动物中脾细胞的Th2细胞因子产生无显著地增加。这些数据表明Th1和Th17的免疫应答，而不是Th2的免疫应答，通过当前的KRAS特异性肽疫苗而被主要引发。

讨论

之前的临床前和临床研究中，已经鉴定了KRAS突变特异性CD4和/或CD8导向的肽表位。例如，覆盖G12V突变的9-聚体肽(4-12)显示激活小鼠中的CD4+和CD8+T细胞应答[15、16]。17-聚体肽(5-21)据报道诱导对一名患者中的巢式表位(nested epitope)具有特异性的CD4+和CD8+细胞毒性T淋巴细胞免疫应答[14]。用突变RAS特异性肽或载有突变的RAS肽的抗原呈递细胞(APC)进行疫苗接种都产生突变RAS特异性T细胞免疫应答[9、17、18]。17-聚体KRAS肽脉冲的APC疫苗诱导对患有多种类型癌症(包括肺癌)的26至42％的患者中给定的KRAS突变具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞和细胞因子应答[19、20]。在II期临床试验中，13-聚体突变RAS肽疫苗接种在胰腺癌患者中显示阳性免疫应答，以及潜在但非统计学显著更好的无疾病存活和总存活率[10]。许多这些之前的研究评价了基于短肽的KRAS疫苗，绝大多数在患有晚期癌症的患者中。因此，虽然可以从多种KRAS肽的安全性概况和免疫原性活性中了解很多，但它们的抗肿瘤功效尚无法确定地建立。

因为组成型活性KRAS表达可以在发展中的肿瘤中诱导免疫抑制环境，这可能妨碍对于KRAS疫苗的预防性功效的评估，于是我们在诱导型CCSP-KRAS鼠模型中KRAS激活之前开始疫苗接种，其中在癌症发展之前给予疫苗接种并且因此，理论上，不存在肿瘤相关的免疫抑制。不同于大多数采用针对KRAS的短MHCI限制性肽疫苗的研究，这些研究主要关注CD8细胞毒性T淋巴细胞，我们使用了不同的方案。我们采用了多个且较长的(15-20个氨基酸)肽，我们预测其将具有针对多个MHC II类等位基因最佳的结合亲和力。据报道，突变KRAS将以外来抗原形式的MHC I类和II类表位存在；我们由与鼠系统中MHC II结合的热点设计了源自KRAS的肽。我们当前的KRAS疫苗中使用的4种肽中的2种源自密码子12中突变位点的外侧，而剩下的2个17-聚体肽源自在位置12含有的野生型或突变的肽残基的区域，意图优化对疫苗的敏感性。

我们从当前的研究中获得了多个重要的发现。首先，疫苗在预防肿瘤发展方面显著地有效，导致该高侵袭性模型中肿瘤体积降低大约80％。第二，使用计算机预测且在小鼠中测试，我们显示了我们可以得到针对这些15-20长度肽的相对强的免疫应答。观察到的对KRAS疫苗的免疫应答似乎并不仅仅针对突变肽，而是使用的整个野生型肽。第三，因为人和小鼠KRAS蛋白之间存在显著水平的同源性，我们能够鉴定热点区域内在人和小鼠之间具有100％序列相同性的15-17个氨基酸肽，这使得这些肽可被直接用于临床研究成为可能。第四，在我们研究中采用的KRAS肽主要引发Th1和Th17 T细胞应答，并不引发强烈的Th2应答。这表明针对KRAS驱动的恶性肿瘤的保护性免疫力可能主要构成Th1和Th17免疫应答。第五，疫苗接种动物的引流淋巴结在CD4+T细胞群方面而非调节T细胞群方面有显著增加。这可能有助于加强对KRAS肽的免疫应答。

肽疫苗相对于其他策略的一个诟病之处是缺乏抗原多样性。诱导表位扩展对于肽疫苗策略的成功至关重要[21]。在我们的研究中，我们使用IFN-γELISPOT试验检验了抗原内和抗原间表位扩展的存在。我们的初步数据表明了有限的抗原内表位的扩展，如对疫苗接种小鼠中非免疫原KRAS肽的强INF-γ分泌T细胞应答所证明。有可能是我们的疫苗接种策略可能引起了对KRAS蛋白其他区域的免疫应答，这表明需要进一步的研究，以确定当前的多重肽KRAS疫苗接种是否有效于刺激天然处理(processing)并证明KRAS抗原的在体内的呈递。

总之，我们已经证明了我们的基于KRAS肽的不但靶向突变KRAS^G12D，而且靶向其它野生型区域的疫苗诱导了强烈的Th1和Th17免疫应答，这与KRAS驱动的肺部肿瘤发生的超过80％的抑制相关。我们的临床前数据值得进一步研究，以评估疫苗接种对早期病变或复发情况的功效。鉴于KRAS是许多癌症类型中最高频突变的基因，从这些研究中获得的结果将具有显著的临床相关性。

补充材料和方法

小鼠

在FVB背景上具有G12D突变的鼠KRAS的诱导型TetOKRAS小鼠获自NCI鼠模型财团(NCI Mouse Models Consortium)，然后与在A/J背景上表达Tet-on克拉拉细胞分泌性蛋白(CCSP)的小鼠杂交，以允许转基因的组织特异性诱导型表达。对于本文所报道的所有实验，仅使用具有KRAS^G12D和CCSP的F1代。将所有小鼠置于威斯康辛州密尔沃基市威斯康星医学院(Medical College of Wisconsin,Milwaukee,WI)的生物医学资源中心。所有操作经机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。

用于预测MHC II类结合肽的分选系统

我们和其他人已经证明了在多种算法中得分较高的肽最有可能产生强免疫应答。因此，我们使用如之前所述的多重评分系统[18]。简言之，为了鉴定在多个等位基因中具有最佳结合亲和力和混杂性(promiscuity)的KRAS特异性MHC II类肽，我们使用下述算法进行预测：SYFPEITHI(德国海德堡的细胞生物学研究所(Institute for Cell Biology,Heidelberg,Germany))、IEDB和Rankpep(马萨诸塞州波士顿哈佛(Harvard,Boston,MA))。

以如下所述选择该研究中所述的11个肽。对于来自3种算法的多个可用的MHC II类等位基因，初始时，仅基于预测的结合亲和力的排名次序选择20种肽序列。序列的长度为大约15个氨基酸。为各种选定的肽的每个氨基酸指定分数，其中1是在多种算法中的预测性结合亲和力排名最高的肽序列中所含的氨基酸。对每个氨基酸进行评分考虑了在算法间和算法中出现的多个肽重叠。将来自所有3种算法的多个MHC II类等位基因针对各氨基酸的评分(S)相加。然后，对其中预测各氨基酸将具有高结合亲和力的MHC II类等位基因的数量(N)进行计数。各氨基酸的最终得分通过S乘以N来计算。为了方便鉴定KRAS蛋白最有潜力的免疫原性区段，基于其最终评分百分比为各氨基酸指定颜色(从深红到浅蓝)，其中深红为最高≥75％，而浅蓝为最低<10％(图1A)。因此，深红色对应这样的序列，其中多个肽在算法中以及多个算法间评分高。浅蓝代表这样的序列，其是所有预测的高结合肽中潜在免疫原性最小的。KRAS肽由Genemed合成有限公司(Genemed Synthesis Inc)(加利福尼亚州南旧金山)合成，通过高通量液相色谱纯化，并通过质谱表征，用于所有实验。

疫苗制备和免疫

用50μg的各肽疫苗接种小鼠。添加磷酸盐缓冲盐水(PBS)以获得50μL/小鼠的总体积。添加等量的佐剂(完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)以获得100μL/小鼠的总体积小鼠在7周龄时于肩部经皮下注射，并且给予加强型疫苗接种，对于前三个加强型疫苗接种，以每两周给予，而对于后三个加强型接种，以每4周给予，如图2A所示。第四个疫苗接种后一周，用Dox饮食(625mg/kg饮食)启动转基因Kras，并在整个研究中给予Dox饮食。

ELISPOT试验

核磁共振成像

使用H&E染色的肺肿瘤计数

流式细胞术

细胞因子分析

评估肿瘤浸润T细胞

将细胞冷冻于Tissue-Tek OCT中并储存在-80C。然后对冷冻的肿瘤进行切片(8mm)，固定在75％/25％丙酮/甲醛中5分钟，然后使用PBS洗涤。使用常规山羊血清(PBS中10％)于室温孵育切片1小时，洗涤，并用大鼠抗-小鼠CD8(AbDSerotec)以1:100稀释度在10％山羊血清/PBS中4C过夜孵育。洗涤后，添加Alexa Fluor 488山羊抗-大鼠二抗(英杰公司(Invitrogen)至切片(1:1000)室温下1小时。附加洗涤并覆盖盖玻片后，添加具有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)封装介质的Prolong Gold抗褪色剂(英杰公司)。在三个随机高倍显微镜视野中对各切片的阳性细胞和DAPI染色的细胞核进行计数，并以平均值表示。在该视野中的阳性细胞数表示为CD8⁺细胞数/mm²肿瘤区域。数据以3只小鼠/组的平均值和SEM显示。

表2：源自Ki-Ras蛋白的肽的同源性和序列

实施例2：K-ras疫苗的进一步表征

K-ras是人肿瘤(包括胰腺(70～90％发生率)、结肠(约50％)和肺(25～50％)的腺瘤)中最频繁突变的成员。种系K-RAS突变最近被证明与多种发育性紊乱相关，包括努南综合征(NS)、心脏-面部-皮肤综合征(CFCS)和科斯特洛综合征(CS)。具体地，氨基酸位置K5、V14、Q22、P34、I36、T58、G60、V152、D153和F156处的K-RAS突变非常广泛并且包括NS、CFC。尚未研发出靶向K-Rra的特定靶向疗法，部分是由于缺少RAS表面可药物化的袋和腔体；替代疗法或预防措施的研发极具吸引力。

在上述实施例中，发明人已显示新研发的K-ras多重肽疫苗对于条件型K-ras驱动的肺癌模型中的肺癌发展的初级免疫预防而言非常有效，其中疫苗接种是在致癌性K-ras表达开始之前给予的。为了进一步将K-ras疫苗应用于二级或四级预防(其在临床上更具相关性)，如在高风险群体中，个体已经暴露于环境致癌物或已经携带K-ras突变或扩增。发明人在致癌物诱导的K-ras驱动的模型中和其中K-ras突变起始于疫苗接种之前的遗传模型中测试K-ras疫苗。用于该实施例的Kras-疫苗包含存在于表1中的四种(4)肽，具体是SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6，因此在本文中称其为“K-ras多重肽疫苗”或“K-ras疫苗”。因为多重肽疫苗接种主要加强T细胞免疫性以发挥作用，我们进一步研究了可以与K-ras疫苗协同作用的方法，如与促进T细胞浸润的试剂组合，或与免疫检查点抑制剂组合，以阻断免疫抑制环境。

K-ras疫苗有效并在K-rasLA1模型中显示联合UAB30(视黄酸X受体(RXR)激动剂蓓萨罗丁的模拟物)的抑制肿瘤发生的协同作用。

K-rasLA1小鼠发展出癌前肺病变，其由于K-ras中的体细胞突变向多病灶肺腺癌进展，所述体细胞突变在这些小鼠出生时由DNA重组发生。该模型中K-ras活化的自发性质近似地概括了人癌症中所见的自发性致癌基因活化，因此代表了更具临床相关性的K-ras驱动的肺肿瘤模型。在该模型中，在小鼠为8～10周龄时给予疫苗接种，此时许多胸膜病变已经在肺中形成，然而单独的K-ras疫苗接种显著抑制K-rasLA1小鼠中的肺多肿瘤性以及负荷，将肿瘤数量从各小鼠约12个降低至约7个，并将肿瘤负荷从约55mm3降至约30mm3(图7)。UAB30是低毒性RXR激动剂，其显著地增加浸润的CD8+细胞并减少肿瘤中Treg(图8)，并且当于K-ras疫苗接种联合时，诱导更好的抗肿瘤功效(图7)。

K-ras疫苗抑制致癌物质MNU诱导的肺肿瘤发生

N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)是一种烷基化试剂，并且通过将其甲基基团转移至核酸中的核碱基来发挥其毒性，而这可导致AT:GC转化突变，具体地，其诱导大量K-ras突变，因此，是高度可靠的致癌物质、突变原和致畸物，已经报道其诱导处于多种实验动物的多种器官中的癌症。已经报道了各种食物样品，如烟熏/干鱼、鱼露、海鲜和民族特色发酵/腌菜中亚硝化后MNU的形成，发布为模拟人癌症发展的相关致癌物质诱导模型。

在该模型中，在NMU诱导后4周给予K-ras疫苗接种，如图9所示，仅疫苗接种将肿瘤数量从约25降低至约12，并将肿瘤负荷从约18mm3降低至约9mm3，这表明其可以在起始后设定(post-initiation setting)中防止肿瘤发生，可能对已经暴露于K-ras突变的高风险群体有益。

K-ras疫苗与阿伐麦布(avasamibe)在K-ras驱动的肺癌同基因移植肿瘤模型中的协同作用。

胆固醇，尤其是胆固醇酯的异常积累，是质膜的关键组分，最近发现其涉及促进癌细胞生长和转移。阿伐麦布是一种介导胆固醇酯化的关键酶ACAT1的特异性抑制剂，最近已被证明通过靶向肿瘤特异性CD8+细胞毒性T细胞来促进抗肿瘤免疫应答。阿伐麦布抑制胆固醇酯化；上调质膜胆固醇水平，增强TCR聚集，并促进CD8+T细胞中免疫突触的形成，这对于促进T细胞介导的抗肿瘤免疫是必需的。

因此，我们在K-ras驱动的肺癌同基因移植模型中测试了K-ras多重肽疫苗与阿伐麦布的组合。结果显示阿伐麦布和K-ras疫苗接种有效地抑制肿瘤生长，并且以联合治疗实现了叠加作用。

K-ras疫苗与抗-Vista在K-ras驱动的胰腺癌同基因移植肿瘤模型中的协同作用。

免疫检查点蛋白CTLA-4，PD-1和VISTA抑制抗肿瘤免疫应答，特别是阻止针对癌症的T细胞活性，因此预测免疫检查点抑制剂与疫苗相组合将提供协同抗肿瘤功效，当前，多项临床试验正在对与抗-PD1或抗-CTLA-4组合的多重肽疫苗进行测试。此处我们检验了阻断VISTA与K-RAS疫苗组合在同基因移植肿瘤模型中预防K-ras驱动的胰腺癌进展的功效。我们的结果显示抗-VISTA和K-ras疫苗接种均有效地抑制肿瘤生长，并且以联合治疗实现了叠加作用(图11)。

K-ras疫苗还与下文详述的PD-1和PD-L1肽疫苗进行测试。简言之，测试针对PD-L1的肽p13、p76和p228以及p21、p94、p193和p228与KRAS疫苗(KRAS疫苗包含表1中的4种肽SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6)的组合。预期结果将显示与抗-VISTA相似的结果，具体地，该组合显示抑制肿瘤生长的能力。

实施例3：研发针对免疫检查点PD-1和PD-L1的新型肽疫苗

癌细胞自然受到免疫系统细胞的攻击，但可以诱导耐受状态，从而免于免疫攻击，免疫检查点蛋白如PD1，VISTA是介导这种免疫逃逸的重要因素。激活的T细胞上的PD-1和癌细胞上的PD-L1的相互作用导致对毒性T细胞的抑制。研究人员最近鉴定了针对肿瘤微环境和具有转移性黑色素瘤的患者和健康供体的外周血中的自发性T细胞反应性，PD-L1反应性CD8 T细胞具有细胞毒性并且可以体外杀伤癌细胞和免疫调节细胞，从而响应性PD-L1肽疫苗因此正在研发中。因此，通过使用结合多重MHC II类肽结合算法的多重评分系统，我们鉴定了免疫原性“热点”并从这些免疫原性“热”区针对PD-L1选择了7个肽且针对PD-1选择了11个肽(参见表3)。然后我们使用IFN-γELISPOT试验在首次接受试验的小鼠中测试了它们的免疫原性。这7个设计的肽中的3个具有免疫原性，其中针对PD-L1的p13、p76和p228引发最强的IFN-γ应答(图12上分图)，而针对PD-1的p21、p94、p193和p228引发最强的IFN-γ应答(图12下分图)。如所预期，仅用佐剂免疫的小鼠没有发展出对单一肽或多重肽刺激的任何抗原特异性IFN-γ应答，并且平均IFN-γ应答与HIV肽类似(P<0.0001，数据未示出)。

表3.针对PD-1和PD-L1设计的同源性和序列

表4.显示了用于人类应用所设计的潜在的免疫原性肽序列

表4.针对人PD-1和人PD-L1设计的潜在的免疫原性肽序列

PD-1/PD-L1肽疫苗在同基因移植肿瘤模型中展现出优异的抗肿瘤活性

进一步测试这些新开发的PD-1/PD-L1肽在K-ras驱动的肿瘤模型中的抗肿瘤功效，我们发现相较于抗体，多重肽疫苗显示出相同或甚至更好的抗癌功效，这表明它在临床上可能是有益的(图13)。

实施例4：以新型癌症疫苗(KRAS/PD-1/PD-L1)在胰腺、肺或结肠癌患者中的I期研究

该实施例在胰腺、肺或结肠癌中评估了本文所述的KRAS疫苗联合PD-1/PDL1疫苗的组合。收集有关参与者自身KRAS突变状态的特定特征的信息。已知胰腺、肺和结肠癌具有对个体患者肿瘤具有特异性的KRAS突变，并且产生的突变KRAS蛋白是新抗原。突变KRAS蛋白可以用作疫苗以诱导强免疫应答，这可以有助于参与者的身体抵抗在未来可以导致复发或转移的残留肿瘤细胞(最小残留疾病情况)。研究的目的是当疫苗以多个不同的时间点给予时研究疫苗的安全性，并检验疫苗诱导的免疫应答。该研究计划招募28名参与者。

实验：KRAS/PD-1/PD-L1疫苗(肽+聚-ICLC)

聚-ICLC：4x 0.5mg(总剂量2mg)，在第1、4、8、15、22、78和162天给予

肽：各肽为4x 300mcg，在第1、4、8、15、22、78和162天给予

生物品：聚-ICLC

生物品：KRAS、PD-1和PD-L1肽

将会对参与者进行监测并测试下述一级指标：(a)经历临床和实验室不良事件(AE)的参与者数量[时间范围：距离第一次研究药物给药7周]，和(b)进行KRAS突变状评估的参与者数量[时间范围：12周]。

将会对参与者进行监测并测试下述二级指标：(a)疫苗给药后具有特异性细胞免疫应答的参与者数量[时间范围：16周]，和(b)疫苗给药后手术后2年没有进展的存活参与者数量[时间范围：2年]。

选择年龄为18岁或以上并在筛选检查中符合以下标准的参与者有资格参加该研究：

具有可切除和边界可切除癌症且(a)完成所有计划的治愈性意向治疗，(b)没有复发或转移性疾病的临床和影像学证据，(c)没有肽疫苗治疗禁忌症并且(d)同意参加试验的患者将有资格参加该研究。

必须通过完整的体格检查和影像学检查记录该手术前基线评估。影像学研究必需包括全身PET-CT。

具有生育潜力的妇女在进入试验之前和开始研究药物之前7天内必须进行阴性妊娠试验，因为疫苗对发育中的人类胎儿的影响未知。

女性和男性患者必需同意使用有效的避孕措施。

排除标准：

之前用包括但不限于下述免疫调节试剂治疗：PD-1/PD-L1阻抑，CTLA-4阻抑，IL-2，CD40刺激，CD137刺激

先前研究性癌症指向的癌症疫苗疗法，骨髓或干细胞移植，靶向治疗，其他研究性抗癌疗法，免疫抑制剂，长期使用全身性皮质类固醇或预防传染病的疫苗疗法

由疗法预防传染病或任何其他非肿瘤疾病的任何疫苗引起的严重过敏反应的病史

已知自身免疫性疾病或免疫抑制状况，除了白癜风，1型糖尿病，残留自身免疫性甲状腺功能减退症，牛皮癣或HIV，乙型肝炎或丙型肝炎慢性感染

活动性感染，症状性充血性心力衰竭，不稳定型心绞痛，心律失常

妊娠期或哺乳期妇女被排除在本研究之外，因为疫苗和聚-ICLC是风险未知的物质。

我们预计疫苗将提供改善的癌症治疗，并提高存活率和延长癌症复发时间或减少癌症复发。

本公开中引用的每篇出版物，专利和专利公开均通过引用全文并入本文。本发明不受限于前述实施例，但涵盖落在权利要求范围内的全部修改形式和变化形式。

序列表

<110> 威斯康星州医药大学股份有限公司（MEDICAL COLLEGE OF WISCONSIN）

潘静（Pan, Jing）

尤明（You, Ming）

R•鲁贝特（Lubet, Ronald）

<120> KRAS肽疫苗组合物及其使用方法

<130> 650053.00526

<150> US 62/454270

<151> 2017-02-03

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr

1 5 10 15

Ile

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr

1 5 10 15

Ile

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr

1 5 10 15

Ile

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

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1 5 10 15

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成的

<400> 5

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1 5 10 15

Tyr Asp

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成的

<400> 6

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1 5 10 15

<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

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1 5 10 15

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<210> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成的

<400> 8

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1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成的

<400> 9

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1 5 10 15

Ser

<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成的

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<213> 人工序列

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<223> 合成的

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1 5 10 15

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20

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<212> PRT

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Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp

20 25

<210> 13

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<212> DNA

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<223> 合成的

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aagctggtgg tggtgggcgc cgacggcgtg ggcaagagcg ccctgaccat c 51

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<212> DNA

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<223> 合成的

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<212> DNA

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gagtacgac 69

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<212> DNA

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gtgggcgccg gcggcgtggg caagagcgcc ctgaccatcc agctgctgca gaaccacttc 60

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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Ala Gly Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln

1 5 10 15

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 27

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp

1 5 10 15

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp

1 5 10 15

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

Gly Glu Gly Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser

1 5 10 15

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 30

Ala Gln Glu Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr

1 5 10 15

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 31

Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr Ser Ala Lys Thr Arg

1 5 10 15

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 32

Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu

1 5 10 15

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 33

Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

1 5 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 34

Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp

1 5 10 15

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 35

Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

1 5 10 15

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 36

Leu Ala Val Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala

1 5 10 15

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 37

Gly Ser Lys Asp Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro

1 5 10 15

<210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 38

Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala Tyr Glu

1 5 10 15

<210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 39

Cys His Leu Leu Arg Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu

1 5 10 15

<210> 40

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 40

Pro Gln His Ser Asn Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp

1 5 10 15

<210> 41

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 41

Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His Trp Val Leu

1 5 10 15

<210> 42

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 42

Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

1 5 10 15

<210> 43

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 43

Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr

1 5 10 15

Asp Lys Leu

<210> 44

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 44

Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

1 5 10 15

<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 45

Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

1 5 10 15

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 46

Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala

1 5 10 15

<210> 47

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 47

Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg

1 5 10 15

Arg Thr Gly

<210> 48

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 48

Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro

1 5 10 15

<210> 49

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 49

Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

1 5 10 15

<210> 50

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 50

Trp His Leu Leu Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu

1 5 10 15

<210> 51

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 51

Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp

1 5 10 15

<210> 52

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 52

Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile

1 5 10 15

<210> 53

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 53

Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val Ile

1 5 10 15

<210> 54

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 54

Leu Thr Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val

1 5 10 15

Claims

1.一种疫苗组合物，其包含(1)(i)至少一种KRAS肽，其中所述肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID No.4、5、6、7、8、9、10、11、12或与SEQ ID No.4-12具有至少70％序列相同性的氨基酸序列，或(ii)载体，其包含编码SEQ ID No.4-12中任一项所述肽序列或与SEQ IDNo.4-12中任一项所述氨基酸具有至少70％序列相同性的氨基酸序列的核酸序列；和(2)佐剂，其中所述疫苗组合物引发对象中的抗肿瘤免疫应答。

2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含至少两种KRAS MHC II类肽，其中所述至少两种KRAS肽选自存在于表1中的SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及其组合或与SEQ ID NO.1-12中任一项具有至少70％序列相同性的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含至少三种KRAS肽，其中所述至少四种KRAS肽选自存在于表1中的SEQ ID No.1-12或与SEQ ID NO.1-12具有至少70％序列相同性的氨基酸序列及其组合。

4.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含至少四种KRAS肽，其中所述至少四种KRAS肽选自存在于表1中的SEQ ID No.1-12或与SEQ ID NO.1-12具有至少70％序列相同性的氨基酸序列。

5.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述至少一种肽包含与SEQ IDNO:1-12具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

6.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含至少四种肽，其中所述至少四种肽包含SEQ ID NO:1(p5-21Wt：KLVVVGAGGVGKSALTI)、4(p17：SALTIQLIQNHFVDE)、6(P78：FLCVFAINNTKSFED)和8(P156：FYTLVREIRKHKEKM)的氨基酸序列或与SEQ ID NO.1、4、6和8具有至少70％序列相同性的氨基酸序列。

7.如权利要求1-5中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含至少四种肽，其中所述至少四种肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO.1、2、4和6具有至少70％序列相同性的氨基酸序列。

8.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂选自GM-CSF，环二核苷酸(CDN)，铝，单磷酰基脂质A(MPL)，和STING配体(cGAMP)。

9.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包含药学上可接受的运载体。

10.一种载体，所述载体包含分离的核酸序列，所述分离的核酸序列包含编码选自下组的至少一种肽的至少一种核酸序列：SEQ ID No.1-12或与SEQ ID No.1-12具有至少70％序列相同性的氨基酸序列，其中所述至少一种核酸序列与转录调控元件操作性地连接。

11.如权利要求9所述的载体，其中，所述载体还包含异源性序列；和异源性核酸序列。

12.一种在有此需要的对象中引发抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括：

向所述对象给予有效量的权利要求1-8中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物引发抗肿瘤免疫应答。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述抗肿瘤免疫应答是MHC II类介导的T细胞应答。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中，所述抗肿瘤免疫应答减少所述对象中肿瘤细胞的数量或所述对象中肿瘤的大小。

15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：

向所述对象给予至少一种检查点抑制剂。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述检查点抑制剂与所述疫苗组合物同时给予。

17.如权利要求15或16所述的方法，其中，所述检查点抑制剂选自抗-PDL1抗体、抗-VISTA抗体、TIM3抗体、CTLA-4抗体、PD-1肽、PDL-1肽及其组合。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是至少一种PD-1肽、至少一种PD-L1肽或其组合。

19.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括向所述对象给予至少一种NSAIDS。

20.如权利要求12-19中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括给予RXR激动剂，其中所述RXR激动剂选自蓓萨罗丁、UAB30和低剂量视黄酸。

21.如权利要求中12-14任一项所述的方法，其中，所述方法还包括给予有效量的Kras-疫苗联合阿伐麦布以引发抗肿瘤应答。

22.如权利要求12-21中任一项所述的方法，其中，所述对象是患有包含KRAS突变的癌症的人。

23.如权利要求12-22中任一项所述的方法，其中，所述对象是患有肺癌、胰腺癌或结肠癌的人。

24.如权利要求12-23中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括用放疗或化疗治疗所述对象。

25.一种预防、降低或减缓处于发展KRAS相关癌症的风险中的患者中癌症进展或发展的方法，所述方法包括：

确定患者是否处于发展KRAS相关癌症的风险中；和

以权利要求1-8中任一项所述的疫苗组合物治疗所述患者。

26.如权利要求25所述的方法，其中，所述确定患者是否处于发展KRAS相关癌症的风险中的步骤包括：

检测来自所述对象的样品中的KRAS突变。

27.如权利要求26所述的方法，其中，所述样品是血液样品，组织样品或体液样品。

28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中，所述治疗步骤包括给予有效量的权利要求1-8中任一项所述的疫苗组合物。

29.如权利要求25所述的方法，其中，所述治疗步骤还包括给予有效量的所述疫苗联合阿伐麦布以治疗所述癌症。

30.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中，所述治疗步骤还包括给予检查点抑制剂，所述检查点抑制剂选自抗-PDL1抗体、抗-VISTA抗体、TIM3抗体、CTLA-4抗体、PD-1肽、PDL-1肽及其组合，其中所述疫苗的组合。

31.如权利要求30所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是至少一种PD-1肽、至少一种PD-L1肽或其组合。

32.如权利要求31所述的方法，其中，所述至少一种PD-1肽、至少一种PD-1肽或其组合选自SEQ ID NO:33-54及其组合。

33.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括给予至少一种RXR激动剂，其中所述RXR激动剂选自蓓萨罗丁、UAB30和低剂量视黄酸。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述RXR激动剂是UAB30。