KR102308798B1 - 다양한 암의 면역요법 치료에서의 사용을 위한 펩티드, 펩티드의 조합 및 골격 - Google Patents

다양한 암의 면역요법 치료에서의 사용을 위한 펩티드, 펩티드의 조합 및 골격 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역요법 방법에서의 사용을 위한 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단독, 또는, 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할가능한 기타 종양-연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 촉진하거나 세포를 생체외 촉진하여 환자로 이전하기 위한 종양-연관 T 세포 에피톱에 관한 것이다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드, 또는 펩티드 자체는 항체, 용해성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적일 수도 있다.

Description

다양한 암의 면역요법 치료에서의 사용을 위한 펩티드, 펩티드의 조합 및 골격{NOVEL PEPTIDES, COMBINATION OF PEPTIDES AND SCAFFOLDS FOR USE IN IMMUNOTHERAPEUTIC TREATMENT OF VARIOUS CANCERS}
본 발명은 면역요법에 사용되는 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 종양-연관 T 세포 에피톱을 단독으로, 또는, 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할가능한 기타 종양-연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 촉진하거나 T 세포를 생체외 자극하여 환자에게 이전하는 것과 관련된다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드, 또는 펩티드 자체는 항체, 용해성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적일 수도 있다.
본 발명은 항종양 면역 반응을 이끌어내는데 필요한 백신 조성물 또는 약학적/면역학적 활성 화합물 및 세포의 개발에 필요한 표적으로서 사용할 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 분자로부터 유래하는 몇몇 신규 펩티드 서열들 및 이들의 변이체들에 관한 것이다.
세계보건기구(WHO)에 따르면, 암은 2012년에 세계적인 4대 비전염성 치명적 질병에 속한다. 같은 해에 직장암, 유방암 및 호흡관암들은 고소득 국가들에서 10대 사망 원인에 올랐다(http://www.who.int/mediacentre/factsheets /fs310/en/).
역학
2012년에는, 1410만 건의 신규 암 사례, 암으로 고생하는 3260만의 환자(진단 후 5년 이내) 및 820만 건의 암에 의한 사망이 세계적으로 추정되었다(Ferlay et al., 2013; Bray et al., 2013).
뇌암, 백혈병 및 폐암의 군에서, 본 출원은 특히 아교모세포종(GB), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 비소세포 및 소세포 폐암(NSCLC 및 SCLC)에 초점을 둔다.
폐암은 세계적으로 가장 흔한 유형의 암이며, 여러 국가에서 암에 의한 사망의 주요 원인이다.
유방암은 면역원성 암 단위이며, 원발성 종양에서 다른 유형들의 침균 면역세포들은 뚜렷한 예후 및 예후의 유의성을 표출한다. 유방암 환자를 대상으로 다수의 조기 면역요법 시험이 실행된 바 있다. 대부분의 완료된 백신접종 연구는 HER2 및 MUC-1과 같은 탄수화물 항원을 표적으로 했으며 꽤 실망스러운 결과를 드러냈다. 유방암에서 이필리무맙 및 다른 T 세포-활성화 항체에 의한 면역 체크포인트 억제의 영향에 관한 임상 데이터가 나오고 있다(Emens, 2012).
만성 림프구성 백혈병
CLL은 현재 치유가 가능하지 않지만, 다수의 환자들은 질병의 느린 진행이나 증상의 악화만을 보인다. 환자는 치료의 조기 시작으로부터 이익을 얻지 못하므로, 초기 접근방식은 "감시 및 대기"이다(Richards et al., 1999). 증상성 질병 또는 급속히 진행하는 질병을 가진 환자의 경우, 몇몇 치료 옵션을 사용할 수 있다. 여기에는 화학요법, 표적요법, 단클론성 항체와 같은 면역 기반 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) 및 활성 면역요법 및 줄기 세포 이식이 포함된다.
단클론 항체는 혈액 악성 종양에서 널리 사용된다. 이는 면역세포 표면 분자의 양호한 특성화 및 혈액이나 골수에서 종양 세포의 접근성에 근거하는 적합한 항원의 지식에 기인한다. CLL 요법에서 사용되는 일반적인 단클론 항체는 CD20 또는 CD52를 표적으로 한다. 원래 NHL의 치료를 위해 FDA가 승인한 최초의 단클론 항-CD20 항체인 리툭시맙은 현재 CLL 요법에 널리 사용된다. 리툭시맙/플루다라빈/사이클로포스파미드를 사용한 병용 치료는 플루다라빈/사이클로포스파미드 병용에 비해 더 높은 CR 비율 및 개선된 전체 생존 기간(OS)으로 이어지며 선호되는 치료 옵션이 되었다(Hallek et al., 2008). 오파투모맙은 CD20을 표적으로 하며 불응성 CLL 환자의 요법에 사용된다(Wierda et al., 2011). 오비누투주맙은 클로람부실과 병용하여 일차 치료에 사용되는 또 다른 단클론 항-CD20 항체이다(Goede et al., 2014).
알렘투주맙은 화학요법 내성의 질병 환자 또는 del 17p 또는 p53 돌연변이로 불량한 예후 인자를 가진 환자의 치료에 사용되는 항-CD52 항체이다(Parikh et al., 2011).
새로운 단클론 항체는 CD37(오틀레르투주맙, BI 836826, IMGN529 및 (177)Lu-테툴로맙) 또는 CD40(다세투주맙 및 루카투무맙)을 표적으로 하며 전임상 환경에서 시험된다(Robak and Robak, 2014).
몇몇 완료되거나 진행 중인 임상 시험은 CD19 특이성을 가진 공학적 자가 키메라 항원 수용체(CAR) 변형 T 세포에 기반한다(Maus et al., 2014). 지금까지 소수의 환자들만 검출가능하거나 지속적인 CAR을 보였다. Porter 등 및 Kalos 등에 의한 CAR T세포 시험에서 1회의 부분 반응(PR) 및 2회의 완전 반응(CR)이 검출된 바 있다(Kalos et al., 2011; Porter et al., 2011).
활성 면역요법에는 다음의 전략이 포함된다: 유전자 요법, 전체 변형 종양 세포 백신, DC 기반 백신 및 종양 관련 항원(TAA) 유래 펩티드 백신.
유전자 치료에서의 접근방식은 유전적으로 변형된 자가 종양 세포를 이용한다. 이러한 B-CLL 세포는 IL-2, IL-12, TNF-알파, GM-CSF, CD80, CD40L, LFA-3 및 ICAM-1과 같은 면역공동자극 유전자로 형질감염시켜 항원-제시 및 T 세포 활성화를 개선시킨다(Carballido et al., 2012). 종양 세포에서 특이적 T 세포 반응 및 감소는 쉽게 관찰되는 반면, 면역 반응은 단지 일과성이다.
여러 연구에서는 자가 DC를 항원-제시 세포로 사용하여 항종양 반응을 끌어냈다. DC는 종양-연관 펩티드, 전종양 세포 용해물 및 종양 유래 RNA 또는 DNA와 함께 생체외에서 로딩되었다. 또 다른 전략에서는 DC와의 융합 및 DC-B-CLL-세포 잡종의 생성을 위해 전체 종양 세포를 사용한다. 형질감염된 DC는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 개시했다(Muller et al., 2004). 융합 잡종 및 종양 세포 용해물이나 세포자멸체로 로딩된 DC는 종양-특이적 CD8+ T 세포 반응을 증가시켰다. 임상적 반응을 보인 환자에서는 IL-12 혈청 수준이 증가되었고 Treg 숫자가 감소되었다(Palma et al., 2008).
다른 접근방식은 변형된 종양 세포를 사용하여 CLL-특이적 면역 반응을 개시하거나 증가시킨다. 이 전략의 한 예는 트리오마 세포의 생성이다: B-CLL 세포가 항-APC 특이성을 가진 하이브리도마 세포를 발현하는 항-Fc 수용체와 융합된다. 트리오마 세포는 시험관내에서 CLL-특이적 T 세포 반응을 유도했다(Kronenberger et al., 2008).
또 다른 전략은 보강제로서 칼메트-게렝(Calmette-Guerin) 간균으로 조사된 자가 CLL 세포를 백신으로 사용한다. 여러 환자에서 백혈구 수준 감소 또는 안정성 질병이 나타났다(Hus et al., 2008).
분리된 CLL 세포 외에도, CLL 환자의 전혈을 혈액 처리 장치에서 제조 후 백신으로 사용했다. 이 백신은 여러 환자에서 CLL-특이적 T 세포 반응을 이끌어 냈으며 부분적 임상 반응이나 안정성 질병으로 이어졌다(Spaner et al., 2005).
몇몇 TAA는 CLL에서 과발현되며 예방접종에 적절하다. 여기에는 피브로모듈린(Mayr et al., 2005), RHAMM/CD168(Giannopoulos et al., 2006), MDM2(Mayr et al., 2006), hTERT(Counter et al., 1995), 종양태아성 항원-미숙 라미닌수용체 단백질(OFAiLRP)(Siegel et al., 2003), 아디포필린(Schmidt et al., 2004), 서바이빈(Granziero et al., 2001), KW1에서 KW14(Krackhardt et al., 2002) 및 종양 유래 IgVHCDR3 영역(Harig et al., 2001; Carballido et al., 2012)이 포함된다. 제I상 임상 시험은 RHAMM-유래 R3 펩티드를 백신으로 사용하여 수행했다. 6명 환자 가운데 5명에게 검출가능한 R3 특이적 CD8+ T 세포 반응이 나타났다(Giannopoulos et al., 2010).
대장암
대장암(CRC)의 병기에 따라, 결장 및 직장 암에 사용가능한 다른 표준 요법이 있다. 표준 처치에는 수술, 방사능 요법, 화학요법 및 CRC 표적 요법이 포함된다(Berman et al., 2015a; Berman et al., 2015b).
화학요법적 약물 외에도, 표피 성장 인자 수용체(EGFR, 세툭시맙, 파니투무맙) 또는 혈관 내의 성장인자-A(VEGF-A, 베바시주맙)를 표적화하는 여러 단클론 항체를 높은 병기의 질병 환자에게 투여한다. 2차 및 그 이후의 치료를 위해서는 VEGF 억제제인 아플리베르셉트, 티로신 키나제 억제제인 레고라페닙 및 티미딜레이트-합성효소 억제제인 TAS-102 및 dUTPase 억제제인 TAS-114를 사용할 수 있다(Stintzing, 2014; Wilson et al., 2014).
가장 최근의 임상 시험에서는 CRC에 대한 치료 옵션으로서 활성 면역요법을 분석한다. 그러한 전략에는 종양 관련 항원(TAA), 전종양 세포, 수지상 세포(DC) 백신 및 바이러스 벡터로부터의 펩티드를 사용한 예방접종이 포함된다(Koido et al., 2013).
지금까지 펩티드 백신은 암배아 항원(CEA), 뮤신 1, EGFR, T 세포 3에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원(SART3), 베타-사람 융모성 성선자극호르몬(베타-hCG), 윌름즈 종양 항원 1(WT1), 서바이빈-2B, MAGE3, p53, 링 핑거 단백질 43 및 미토콘드리아 외막 34 트랜스로케이스(TOMM34), 또는 변이 KRAS에 대한 것이었다. 몇몇 제I상 및 제II상 임상 시험에서 환자들은 항원-특이적 CTL 반응 또는 항체 생성을 보여주었다. 면역학적 반응과 대조적으로, 다수의 환자들은 임상적 수준에서 펩티드 백신에 의한 혜택을 얻지 못했다(Koido et al., 2013; Miyagi et al., 2001; Moulton et al., 2002; Okuno et al., 2011).
수지상 세포 백신은 TAA-유래 펩티드, 종양 세포 용해질, 세포자멸사 종양 세포 또는 종양 RNA 또는 DC-종양 세포 융합 생성물로써 맥동시킨 DC들로 구성된다. 제I/II상 시험에서 많은 환자들이 구체적인 면역학적 반응을 보인 반면, 소수만이 임상적 혜택을 얻었다(Koido et al., 2013).
전체 종양 세포 백신은 GM-CSF를 분비하도록 방사선 조사 또는 바이러스 감염된 방사선 조사된 세포에 의해 변형된 자가 종양 세포로 구성된다. 대부분의 환자는 여러 제II/III상 임상 시험에서 어떠한 임상적 혜택도 보이지 않았다(Koido et al., 2013).
CEA 및 B7.1, ICAM-1 및 LFA-3을 인코딩하는 우두 바이러스 또는 복제결손의 조류 폭스바이러스가 제I상 임상 시험에서 바이러스성 벡터 백신의 부형제로 사용되었다. 다른 연구에서는 CEA 및 B7.1을 인코딩하는 비복제 카나리폭스 바이러스가 사용되었다. CEA-특이적 T 세포 반응의 유도 외에, 환자의 40%가 객관적인 임상적 반응을 보였다(Horig et al., 2000; Kaufman et al., 2008).
식도암
식도암의 일차 치료 전략은 종양 병기와 위치, 조직학적 유형 및 환자의 의학적 상태에 따른다. 소수의 편평세포 암종 환자 하위군을 제외하고는 수술만으로는 충분하지 못하다(Stahl et al., 2013).
매우 제한된 수의 조기 임상 시험만이 수행되었으므로 식도암에서의 면역요법적 접근 방법에 관한 데이터는 매우 드물다. 세 가지 다른 암-고환 항원들(TTK 단백질 키나제, 림프구 항원 6 콤플렉스 로커스 K 및 인슐린-유사 성장 요인(IGF)-II mRNA 결합 단백질 3)로부터 유래된 세 가지 펩티드로 구성된 백신을 제I상 시험에서 식도암이 진행된 환자에게 투여한 결과 중간 정도의 결과가 나타났다. 자가 급성 세포의 시험관내 투여 이후 활성화된 T 세포의 종양내 주사는 제I/II상 임상연구에서 11명의 환자 가운데 4명으로부터 완전 또는 부분 반응을 초래했다(Toomey et al., 2013).
위암
위암(GC)은 세포 라이닝의 점막층에서 시작하여 성장함에 따라 외층을 통해 퍼진다. 위암에는 수술이 일차 치료이며 유일한 치유 치료이다. 진행 GC를 위한 현재의 치료 요법 효능은 불량하며 이는 낮은 5년 생존율을 초래한다. 면역요법은 GC 환자의 생존을 개선시키는 대체 접근 방법일 수 있다. 종양 관련 림프구 및 시토카인 유도 살해 세포, HER2/neu를 표적하는 펩티드 기반 백신, MAGE-3 또는 혈관의 내피 성장 인자 수용체 1 및 2, 및 HER2/neu를 표적화하는 수지상 세포 기반 백신의 양자 전이는 GC 임상 시험에서 촉망되는 결과를 보여주었다. 면역 체크포인트 억제 및 인공 T 세포는 추가의 치료 옵션을 나타낼 수 있으며, 이는 전임상 및 임상 연구에서 현재 평가되고 있다(Matsueda and Graham, 2014).
아교모세포종
아교모세포종(WHO IV 등급)의 치료 옵션은 매우 제한된다. 독일 신경학협회가 공개한 지침에 따라 젊은 환자에서의 표준 요법에는 종양의 절제나 생검, 국소 방사선 요법 및 테모졸로마이드 또는 CCNU/로무스틴의 화학요법 또는 CCNU 및 빈크리스틴(PCV)과 프로카르바진의 병용이 포함된다. 미국, 캐나다 및 스위스의 경우, 베바시주맙(항-VEGF-항체)에 의한 치료가 재발 요법에도 승인되어 있다(Leitlinien fuer Diagnostik und Therapie in der Neurologie, 2014).
GB의 치료를 위해 여러 면역요법 접근방식을 조사하고 있으며, 면역 관문 억제, 백신접종 및 유전자조작된 T 세포의 양자 전이가 포함된다.
억제 T 세포 수용체 또는 그 리간드에 대한 항체는 흑색종 및 방광암 등 여러 암 유형에서 T 세포 매개 항종양 면역 반응을 효율적으로 강화시키는 것으로 나타났다. 따라서, 이필리무맙 및 니볼루맙과 같은 T 세포 활성화 항체의 효과는 임상 GB 시험에서 평가되지만, 예비 자료는 자가면역 관련 유해 사례를 나타낸다.
GB 환자를 위한 여러 백신접종의 접근방식이 현재 조사 중이며, 펩티드 기반 백신, 열충격 단백질 백신, 자가 종양 세포 백신, 수지상 세포 기반 백신 및 바이러스 단백질 기반 백신이 포함된다. 이러한 접근방식에서는 상피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII) 또는 열출력 단백질 자가 종양 세포 용해질 또는 거대세포 바이러스 성분으로 맥동화된 수지상 세포로부터 유래한 펩티드를 GB 환자에 적용하여 항종양 면역 반응을 유도한다. 이러한 연구들의 몇몇은 양호한 안정성 및 내약성 프로파일은 물론 촉망되는 효능 데이터를 드러낸다.
유전자 변형 T 세포의 양자 전이는 GB의 치료를 위한 추가적 면역치료 접근방식이다. 현재 여러 임상 시험을 통해 HER2, IL-13 수용체 알파 2 및 EGFRvIII에 대한 T 세포가 포함된 키메라 항원 수용체의 안정성 및 효능이 평가 중이다(Ampie et al., 2015).
간암
질병 관리는 진단 시 종양 병기 및 간의 전반적 상태에 의존한다. 수술이 치료 옵션이 아니라면, 다른 기타 요법의 사용이 가능하다.
최근에 제한된 수의 HC를 위한 면역요법 시험이 실행된 바 있다. 시토카인은 면역 세포의 하위 조합의 활성화 및/또는 종양 면역원성의 증가에 사용되고 있다(Reinisch et al., 2002; Sangro et al., 2004). 다른 시험에서는 종양-침윤 림프구 또는 활성화 말초 혈액 림프구의 주입에 초점을 맞추었다(Shi et al., 2004; Takayama et al., 1991; Takayama et al., 2000b).
지금까지, 적은 수의 치료 예방 접종 시험이 실행되었다. Butterfield 등은 백신으로 알파-태아단백(AFP)에서 유래된 펩티드 또는 AFP 펩티드가 로딩된 DC를 사용한 생체외 시험 두 가지를 수행했다(Butterfield et al., 2003; Butterfield et al., 2006). 두 가지 다른 연구에서는, 자가 수지 세포(DC)를 자가 종양 용해물 (Lee et al., 2005) 또는 간모세포종 세포주 HepG2의 용해물(Palmer et al., 2009)로써 생체외 펄스를 가했다. 지금까지 예방접종 시험에서는 제한된 임상적 결과의 개선만을 보여주었다.
흑색종
흑색종에서 표준 요법은 주위의 조직이 건강한 상태에서 완전한 외과적 절제이다. 절제가 완전하지 않거나 전혀 가능하지 않으면, 환자는 일차 방사선 요법을 받으며, 이것은 진행성 병기(IIB/C 및 IIIA-C기)에서 인터페론-알파 투여와 병용이 가능하다.
항종양 면역 반응의 강화는 진행성 흑색종의 치료를 위한 유망한 전략으로 보인다. 미국의 경우, 면역 관문 억제제인 이필리무맙 및 BRAF 키나제 억제제인 베무라페닙 및 다브라페닙 및 MEK 억제제인 트라메티닙이 진행성 흑색종의 치료에 이미 승인되어 있다. 두 접근방식 모두 환자의 항종양 면역성을 증가시키는데, 이필리무맙은 T 세포 억제의 감소에 의해 직접적으로 증가시키고, 키나제 억제제는 멜라닌세포 분화 항원의 강화에 의해 간접적으로 증가시킨다. 추가의 관문 억제제들(니볼무맙 및 람브롤리주맙)은 현재 임상 시험에서 조사 중이며 초기 결과는 고무적이다. 그 밖에, 항종양 면역 반응을 표적하는 여러 병용 요법이 임상 연구를 통해 시험되고 있으며, 이필리무맙 + 니볼루맙, 이필리무맙 + gp100-유래 펩티드 백신, 이필리무맙 + 다카르바진, 이필리무맙 + IL-2, 이필리무맙과 + 다카르바진, 이필리무맙 + GM-CSF가 포함된다(Srivastava and McDermott, 2014).
몇몇 다른 백신접종 접근방식이 진행성 흑색종 환자를 대상으로 이미 평가된 바 있다. 지금까지 제3상 시험은 비교적 실망스러운 결과를 보였으며 백신접종 전략은 분명히 개선되어야 할 필요가 있다. 따라서, OncoVEX GM-CSF 시험이나 DERMA 시험과 같은 새로운 임상 시험은 내약성의 감소없이 임상적 효능의 개선을 목표로 한다(http://www.cancerresearchuk.org).
T 세포의 양자 전이는 진행 단계 흑색종의 치료에 대한 커다란 전망을 보여준다. 시험관내 확장 자가 종양 침윤 림프구는 물론 암-고환 항원 NY-ESO-1에 대한 고친화도 T 세포 수용체를 은닉하는 T 세포는 흑색종 환자에게 이전시 상당히 유익하며 독성이 낮은 효과가 있었다. 불행하게도 멜라닌 세포 특이적 항원 MART1 및 gp100에 대해 고친화도 T 세포 수용체를 가진 T 세포 및 암 고환 항원 MAGEA3은 임상 시험에서 상당한 독성 효과를 유도했다. 이와 같이 T 세포 양자 전이는 높은 치료 잠재성이 있지만, 이러한 치료의 모험성과 내성은 더욱 증가시킬 필요가 있다(Phan and Rosenberg, 2013; Hinrichs and Restifo, 2013).
비소세포 폐암
치료 옵션은 암의 유형(소세포 또는 비소세포) 및 단계에 따라 결정되고 수술, 방사선 요법, 화학요법, 및 베바시주맙 또는 엘로티닙 및 제피티닙과 같은 표적 생물학적 요법 등을 포함한다.
NSCLC를 위한 치료 옵션의 확대를 위해 여러 면역치료 접근방식들을 연구했으며 아직 조사 중에 있다. NSCLC 환자에서 L-BLP25 또는 MAGEA3에 의한 백신접종은 백신 매개에 의한 생존율 이점을 보여주는데 실패했지만, 동종이행 세포주에서 유래한 백신은 임상 연구에서 촉망되는 결과를 보여주었다. 그 밖에 갱글리오사이드, 표피 성장 인자 수용체 및 몇몇 다른 항원을 표적으로 하는 추가의 백신접종 시험이 현재 진행 중이다. 환자의 항종양 T 세포 반응을 강화시키는 대체 전략은 차단 억제 T 세포 수용체 또는 특정 항체와 이의 리간드로 구성된다. NSCLC에서의 이필리루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, MPDL3280A 및 MEDI-4736 등에서 몇몇 항체의 치료 가능성이 현재 임상 시험에서 평가 중이다(Reinmuth et al., 2015).
난소암
조기는 물론 진행기의 난소 암종에서는 외과적 절제가 일차 요법이다(S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 2013). 수술 후 화학요법을 필요로 하지 않는 매우 낮은 등급의 난소암(IA기, 1등급)을 제외하고는, 외과적 제거 이후 백금 유사체를 사용한 전신 화학요법을 실시한다.
특히 CD8-양성 T 세포와 같은 전염증성 종양 침윤 림프구의 존재는 양호한 예후와 상관관계가 있으며 종양 관련 항원에 특이적인 T 세포는 암 조직으로부터 분리될 수 있으므로, 면역요법은 난소암 환자의 치료를 개선시키는 유망한 전략인 것처럼 보인다.
따라서, 난소암에서 여러 면역요법의 조사를 위해 상당한 과학적 노력이 이루어지고 있다. 상당한 수의 전임상 및 임상 연구가 이미 수행되었으며 추가 연구가 현재 진행 중이다. 시토카인 요법, 백신접종, 단클로성 항체 치료, 양자 세포 전이 및 면역조절에 대해 사용가능한 임상적 데이터가 있다.
인터루킨-2, 인터페론-알파, 인터페론-감마 또는 과립구 대식세포 집락 자극 인자를 사용한 시토카인 요법은 환자 자신의 항종양 면역 반응의 증강을 목표로 하며, 이러한 치료는 소규모 연구 코호트에서 이미 유망한 결과를 나타냈다.
몇몇 종양 관련 단백질(Her2/neu, NY-ESO-1, p53, 윌름 종양-1)로부터 유래한 단일 또는 복수 펩티드 또는 자가 종양 세포로부터 유래한 전체 종양 항원을 사용한 제I상 및 제II상 백신접종 연구에서 양호한 안전성과 내성 프로파일이 밝혀졌으나 그 임상적 효과는 낮음 내지 중간으로 그쳤다.
종양 관련 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론 항체는 종양 세포의 면역 세포 매개 사멸을 강화시키는 것으로 사료된다. 항-CA-125 항체 또는 에고보맙 및 아바고보맙 및 항-EpCAM 항체인 카투막소맙은 제II상 및 제III상 연구에서 유망한 결과를 성취했다. 이와 대조적으로 항-MUC1 항체인 HMFG1은 제III상 연구에서 생존 기간을 분명히 강화시키지 못했다.
대체 접근방식에서는 종양 세포상의 성장 인자 및 생존 수용체를 표적화하여 차단시키는 단클론 항체를 사용한다. 트라스투주맙(항-HER2/neu 항체) 및 MOv18 및 MORAb-003(항엽산 수용체 알파 항체)의 투여 시 난소암 환자에게 제한된 임상적 혜택만이 나타난 반면, 진행성 난소암에서 표준 화학요법에 베바시주맙(항-VEGF 항체)을 추가하면 유리한 것으로 나타났다.
임상 시험에서 면역 세포의 양자 전이에서는 이질성 결과를 얻었다. 시험관내 확장 자가 종양 침윤 T 세포의 양자 전이는 파일럿 시험에서 유망한 접근방식으로 나타났다. 이와 반대로 염산 수용체 알파에 특이적인 키메라 항원 수용체를 은닉하는 T 세포의 이전은 제I상 시험에서 유의한 임상적 반응을 유도하지 못했다. 시험관내에서 종양 세포 용해질 또는 종양 관련 단백질로 맥동화된 수지상 세포는 이전시 항종양 T 세포를 강화시키는 것으로 나타났지만, T 세포 활성화의 정도는 임상적 효과와 상관관계를 나타내지 않았다. 자연 살해 세포의 이전은 제II상 임상 연구에서 유의한 독성을 유발했다.
내인성 항종양 면역성은 물론 면역요법은 면역억제 종양 미세환경에 의해 방해를 받는다. 이러한 장애가 되는 면역조절 약물(예: 사이클로포스타마이드)을 극복하기 위해, 항-CD25 항체 및 페길화 리포좀 독소루비신을 면역요법과 병용하여 시험한다. 현재 가장 신뢰할 수 있는 데이터는 항-CTLA4 항체인 이필리무맙에 대해 사용가능하며, 이는 T 세포 활성을 강화시킨다. 이필리무맙은 난소암 환자에서 상당한 항종양 효과를 미치는 것으로 나타났다(Mantia-Smaldone et al., 2012).
췌장암
췌장암 환자에 대한 치료 옵션은 매우 제한되어 있다. 효과적인 치료에 대한 하나의 주요 문제는 진단 시 전형적으로 진행된 종양 단계이다. 그 밖에, 췌장암은 화학요법에 대한 내성이 꽤 높으며, 이는 치밀하고 저혈관성 결합조직형성 종양 기질에 의한 것일 수 있다.
독일 암협회, 독일 암방지협회 및 독일 의학협회가 공개한 지침에 따르면, 유일하고 가능한 근치적 치료 옵션은 종양 절제이다.
백신접종 전략은 췌장암의 치료에 대한 더욱 혁신적이고 유망한 대안으로서 조사되고 있다. KRAS 변이를 표적하는 펩티드 기반 백신, 반응성 텔로머라제, 가스트린, 서바이빈, CEA 및 MUC1은 임상 시험에서 이미 평가된 바 있으며, 부분적으로 유망한 결과를 나타냈다. 더욱이 췌장암 환자에서 수지상 세포 기반 백신, 동종이형 GM-CSF-분비 백신 및 알젠판투셀-L에 대한 임상 시험은 또 면역요법의 유익한 효과를 드러냈다. 여러 백신 임상 시험 계획서의 효율성을 조사하는 추가 임상 시험이 현재 진행 중이다(Salman et al., 2013).
전립선암
전립선암의 치료 전략은 주로 암 병기에 의존한다. 수지상 세포 기반의 백신 시플루셀-T는 FDA가 승인한 최초의 항암 백신이다. CRPC 환자의 생존에 대한 긍정적인 효과로 인해, 이 면역요법의 개발에 많은 노력이 계속되고 있다. 백신접종 전략에 대하여, 펩티드 백신 전립선-특이적 항원(PSA)-TRICOM, 개인화된 펩신 백신 PPV, DNA 백신 pTVG-HP 및 GM-CSF GVAX를 발현하는 전세포 백신은 여러 임상 시험에서 유망한 결과를 나타냈다. 더욱이 시풀루셀-T 이외의 수지상 세포 기반 백신, 즉, BPX-101 및 DCVAC/Pa는 전립선암 환자로부터 임상적 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 이필리무맙과 니볼루맙과 같은 면역 체크포인트 억제제는 임상 연구를 통해 단일요법은 물론 안드로젠 박탈 요법, 국소 방사선 요법, PSA-TRICOM 및 GVAX 등의 다른 치료와의 병용으로서 평가 중에 있다. 면역조절 물질인 타스퀴니모드는 제II상 시험에서 진행을 상당히 지연시키고 무진행 생존율을 증가시켰으며 현재 제III상 시험에서 추가로 조사 중에 있다. 또 다른 면역조절제인 레날리도마이드는 조기 임상 연구에서는 유망한 효과를 유도했지만 제III상 시험에서는 생존율을 개선시키지 못했다. 이러한 실망스러운 결과에도 불구하고 레날리도마이드에 대한 추가 시험이 지속되고 있다(Quinn et al., 2015).
신장 세포 암종
초기 치료는 가장 흔하게는 영향받은 신장의 일부 또는 전부 제거하는 방법이며 근치 치료의 중심이 되는 치료법이다(Rini et al., 2008). RCC의 알려진 면역원성은 진행성 RCC에서 면역요법과 암 백신의 사용을 지지하는 기반을 제시한 바 있다. 림프구 PD-1 발현 및 RCC 진행 단계, 등급 및 예후 사이의 흥미로운 상관관계는 물론 RCC 종양 세포에 의한 선택적 PD-L1 발현 및 이의 악화된 임상적 결과와의 관련 가능성 모두 RCC의 치료를 위해 새로운 항 PD-1/PD-L1 제제의 단일 사용 또는 항혈관형성 약물이나 다른 면역요법 접근방식과의 병용 요법 개발로 이끌었다(Massari et al., 2015). TRIST라고 부르는 진행 RCC의 제III상 암 백신 시험에서는, 치유 요법의 일선 표준에 추가된 TroVax(종양 관련 항원인, 5T4 및 마마 바이러스 벡터)가 국소적으로 진행된 또는 mRCC 환자의 생존율을 연장시키는지 평가한다. 이 연구에 남아있는 399명(54%)의 환자군에서 중간 생존율에 도달하지 않았으나, 그 데이터의 분석은 TroVax가 면역학적으로 활성이 있으며 또한 5T4-특이적 항체 반응의 강도와 생존율 개선 사이의 상관관계가 존재함을 보여주는 이전의 임상적 결과를 확인한다. 또한 RCC에서 과발현된 에피톱을 사용하는 펩티드 백신을 찾는 몇몇 연구가 있다.
종양 백신의 다양한 접근방식에 대한 조사가 이루어진 바 있다. 종양 백신의 다양한 접근방식에 대한 조사가 이루어진 바 있다. RCC 환자를 대상으로 종양 세포 용해질, 수지상 세포와 종양 세포의 융합 또는 전체 종양 RNA를 포함하는 전체 종양 접근방식을 사용하는 연구가 수행되었으며, 이러한 시험의 일부에서 종양 병변의 완화가 보고되었다(Avigan et al., 2004; Holtl et al., 2002; Marten et al., 2002; Su et al., 2003; Wittig et al., 2001).
소세포 폐암
SCLC의 치료 및 예후는 진단된 암의 병기에 강력하게 의존한다. 면역요법은 암 요법의 과도하게 조사된 분야를 제시한다. SCLC의 치료에서 다양한 접근방식이 연구되고 있다. 그러한 접근방식의 하나는 자연적 인간 면역 억제제인 CTLA-4의 차단을 표적으로 한다. CTLA-4의 억제는 면역계를 북돋아서 암을 퇴치하는 것을 의도한다. 최근에 SCLC의 치료에서 촉망되는 면역 체크 포인트 억제제의 개발이 시작된 바 있다. 또 다른 접근방식은 항암 백신에 근거하며 이는 현재 임상 연구에서 SCLC의 치료에 사용가능하다(American Cancer Society, 2015; National Cancer Institute, 2015).
급성 골수성 백혈병
AML의 한 치료 옵션은 항체-약물 접합체(항 CD33 + 칼레치아미신, SGN-CD33a, 항-CD33 + 악티니움-225), 양특이성 항체(CD33 + CD3(AMG 330) 또는 CD33 + CD16의 인지) 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 사용하여 CD33을 표적으로 한다(Estey, 2014).
비호지킨 림프종
NHL의 치료는 조직학적 유형과 병기에 의존한다(National Cancer Institute, 2015). 림프종 환자에서는 자발적 종양 퇴행을 관찰할 수 있다. 따라서, 활성 면역요법은 요법 옵션이다(Palomba, 2012).
중요한 백신접종 옵션에는 Id 백신이 포함된다. B 림프구는 세포 클론마다 독특한(= 이디오타입, Id) 중쇄 및 경쇄의 가변 부위에 특이적 아미노산 서열이 있는 면역글로불린을 발현한다. 이디오타입은 종양 관련 항원의 기능을 한다.
수동적 면역화에는 재조합 뮤린 항-Id 단클론 항체 단독 또는 IFN알파, IL2 또는 클로람부실과의 병용 주입이 포함된다.
능동적 백신접종에는 보조제(KLH)와 접합된 재조합 단백질(Id)의 주사가 포함되며 면역 보조제로서 GM-CSF와 함께 투여한다. 종양-특이적 Id는 하이브리도마 배양에 의해 생산되거나 박테리아, 곤충 또는 포유류 세포 배양에 의한 재조합 DNA 기술(플라스미드)로써 생산된다.
3건의 제III상 임상 시험이 수행되었다(Biovest, Genitope, Favrille). 2건의 임상 시험에서 환자들은 리툭시맙을 투여받았다. 3건의 임상 시험 모두에서 GM-CSF가 투여되었다. Biovest에서는 히브리도마 생성에 의한 단백질을, Genitope과 Favrille에서는 재조합 단백질을 사용했다. 3건의 임상 시험 모두에서 Id가 KLH에 결합되었다. Biovest만 유의한 결과를 나타냈다.
Id 이외의 백신에는 암-고환 항원인 MAGE, NY-ESO1 및 PASD-1, B-세포 항원인 CD20 또는 세포성 백신이 포함된다. 가장 최근의 언급 내용은 세포자멸성 종양 세포 펄스화된 DC, 종양 세포 용해물, DC-종양 세포 융합 또는 종양 유래 RNA 펄스화된 DC로 구성된다.
원위치 백신접종(In situ vaccination)에는 GM-CSF 존재하에 T 세포의 채집/확장/재주입으로 성장시킨 방사선 조사된 종양 세포 또는 화학요법과 병용한 종양 내 CpG 백신접종이 관여된다.
면역학적 억제를 변형시키는 항체를 사용한 백신은 항-CD40, 항-OX40, GM-항-41BB, GM-항-CD27, GM-항-GITR(항종양 반응을 직접 강화시키는 작용제 항체) 또는 항-PD1, 항-CTLA-4(면역 반응을 방해할 관문을 억제하는 차단 항체)로 구성된다. 예는 이필리무맙(항-CTLA-4)과 CT-011(항-PD1)이다(Palomba, 2012).
자궁암
자궁내막 암종의 치료는 병기 의존적이다. 자궁내막 암종의 대부분은 진단 시 대개 자궁체부로 국한되는 양호 내지 중간 정도의 분화된 자궁내막 선암종을 포함하며 자궁절제술에 의해 치유가 가능하다(World Cancer Report, 2014).
자궁경부암의 요법 또한 그 병기에 의존한다. 조기 병기에는 절제가 표준 요법이며 방사선(화학)요법과 병용할 수 있다. 후기 병기(III기 및 그 이후), 림프절 침윤이 있는 사례, 종양의 절제가 불가능한 사례의 경우에는 일차 방사선(화학)요법이 선택된다.
현재 시험 중인 면역치료 접근방식도 일부 있다. 제I/II상 임상 시험에서 자궁암을 앓는 환자들에게 윌름 종양 유전자 1(WT1) mRNA로써 전기천공된 자가 수지상 세포(DC)를 접종하였다. 보조제에 대한 국소적 알레르기 반응 1건 외에도, 부작용이 관찰되지 않았으며, 6명 가운데 3명의 환자가 면역 반응을 보였다(Coosemans et al., 2013).
위에서 기술한 바와 같이, HPV 감염은 궁극적으로 자궁경부암으로 이어질 수 있는 병변을 자극한다. 따라서, 고등급 병변과 암에서 구성적으로 발현되며 악성 표현형의 발병과 유지에 요구되는 HPV 바이러스성 종양단백질 E6 및 E7은 면역요법 접근방식을 위한 유망한 표적으로 간주된다(Hung et al., 2008; Vici et al., 2014). 한 연구에서 전이성 자궁경부암 환자에서 양자 T 세포 요법(ACT)을 수행했다. 환자들은 E6 및 E7 반응성 종양 침윤 T 세포(TIL)를 주입받았으며, 9명의 환자 중 2명에서 완전 관해가 나타났고, 1명에서 부분 반응이 나타났다(Stevanovic et al., 2015). 더욱이 E7을 표적하는 세포내 항체는 생쥐에서 종양 성장을 차단하는 것으로 보고되었다(Accardi et al., 2014). 또한, 펩티드, DNA 및 DC 기반 백신으로 HPV E6 및 E7을 표적하는 임상 시험이 진행 중이다(Vici et al., 2014).
담낭 선암종 및 담관암종
담관암종은 진단이 어렵기 때문에 대부분 진행성 병기에서 확인된다. 담관암종은 치료가 어렵고 대개 치명적이다.
담낭암은 세계적으로 가장 흔하며 공격적인 담관의 악성 암이다.
방광암
방광암의 표준 치료에는 수술, 방사선 요법, 화학요법 및 면역요법이 포함된다(National Cancer Institute, 2015).
방광암은 병기 0 및 I에서는 전형적으로 경요도적 절제술로 치료한 후 잠재적으로 방광내 화학요법을 실시하며 임의적으로 BCG(칼메트-게렝 간균)을 사용하는 방광내 면역요법 치료와 병용한다.
공격적 비근 침윤성 방광암(NMIBC)의 치료에 있어서 효과적인 면역치료 접근방식이 확립되어 있다. 따라서, 박테리아의 약화 형태인 소결핵균(Bacillus Calmette-Guerin = BCG)이 방광내 해결안으로 적용된다. BCG 치료의 주요 효과는 암 재발로부터의 상당한 장기적(최대 10년) 보호 및 감소된 진행률이다. 원칙적으로 BCG에 의한 치료는 세포 면역 반응을 자극하는 국소적 염증성 반응을 유도한다. BCG에 대한 면역 반응은 다음의 주요 단계들에 근거한다: BCG에 의한 요로상피 및 방광암 세포의 감염과 그에 따른 항원-제시 분자의 증가된 발현, 시토카인 방출을 통해 매개되는 면역 반응의 유도, 다양한 면역 세포들(세포 독성 T 림프구, 호중구, 자연 살해 세포 및 대식세포)의 관여를 통한 항종양 활성도의 유도(Fuge et al., 2015; Gandhi et al., 2013).
BCG 치료는 일반적으로 환자의 내약성이 좋지만 특히 면역 손상이 있는 환자의 경우 치명적일 수 있다. BCG 불응성은 약 30 내지 40%의 환자에서 관찰된다(Fuge et al., 2015; Steinberg et al., 2016a). BCG 요법에 실패한 환자의 치료는 도전의 대상이다. BCG 치료에 실패한 환자는 근육 침습성 질환의 발병 위험이 높다. 비반응자의 경우 근치 방광절제술이 선호되는 치료 옵션이다(Steinberg et al., 2016b; von Rundstedt and Lerner, 2015). 방광 보존을 원하는 환자의 경우, BCG 실패 NMIBC에 대해 FDA가 승인한 이차 요법은 발루비신을 사용한 화학요법 치료이다. 다수의 기타 이차 요법이 사용가능하거나 현재 조사가 진행 중이며, 여기에는 BCG-인터페론 또는 BCG-관문 억제제의 치료와 같은 면역요법 접근방식, 전-BCG 경피 백신접종, 마이코박테륨 플레이(Mycobacterium phlei) 세포벽-핵산(MCNA) 복합체에 의한 치료, 단일 또는 미토마이신 C, 젬시타빈, 도세탁셀, 냅-파클리탁셀, 에피루비신, 미토마이신/젬시타빈, 젬시타빈/도세탁셀과 같은 다양한 제제와의 병용 화학요법 및 열화학, 방사선화학, 기전 또는 광역학 요법과 같은 장치 보조 화학요법이 포함된다(Fuge et al., 2015; Steinberg et al., 2016b; von Rundstedt and Lerner, 2015). 임상 시험에서 사용가능한 요법에 대한 추가 평가가 여전히 요구된다.
진행성 방광암의 대체 치료 옵션이 지속적인 임상 시험에서 현재 조사 중이다. 현재의 임상 시험은 분자적 표적의 요법 및 면역요법의 개발에 초점을 맞추었다. 방광암 치료의 표적 요법에서는 암생성 관련 경로 억제제(즉, mTOR, 혈관 내피, 섬유모세포 또는 외피 성장 인자 수용체, 항혈관형성 또는 세포 주기 억제제)의 영향을 조사한다. 분자적 표적 요법의 개발은 방광암의 높은 유전적 다양성 때문에 여전히 어려운 상태로 남아 있다. 현재의 면역요법의 주요 초점은 항-PD1 단클론 항체 및 양자 T 세포 전이과 같은 관문 차단제의 개발이다(Knollman et al., 2015b; Grivas et al., 2015; Jones et al., 2016; Rouanne et al., 2016).
두경부 편평세포 암종
두경부 편평세포 암종(HNSCC)은 역학, 병인 및 치료에 차이가 있는 이질 종양이다(Economopoulou et al., 2016).
HNSCC는 면역억제 질환이며, 면역적격 세포의 조절곤란과 시토카인 분비의 부전이 그 특징이다(Economopoulou et al., 2016). 면역요법 전략은 HPV 음성과 HPV 양성 종양 사이에 차이가 있다.
HPV 양성 종양에서, 바이러스성 종양단백질 E6 및 E7은 종양 세포에 의해 연속적으로 발현되고 HPV 양성 암 세포의 형질전환 상태의 유지에 필수적이므로 양호한 표적을 나타낸다. 여러 백신접종 요법이 HPV 양성 HNSCC에서 현재 조사 중이며, DNA 백신, 펩티드 백신 및 수지상 세포(DC)가 관여하는 백신이 포함된다. 추가로 HPV 양성 종양 환자를 대상으로 진행 중인 제II상 임상 시험에서 림프구고갈 및 이후의 TIL의 자가 주입의 유효성을 조사한다(Economopoulou et al., 2016).
HPV 음성 종양에서, 여러 면역요법 전략이 현재 사용되고 있으며 조사 중이다. 재발성/전이성 HNSCC의 표준 일차 치료로서 화학요법과 병용하는 키메라 IgG1 항-EGFR 단클론 항체인 세툭시맙이 FDA에 의해 승인되었다. 파니투무맙, 니모투주맙 및 잘루투무맙 등 다른 항-EGFR 단클론 항체가 HNSCC에서 평가된다. 여러 면역 관문 억제제가 HNSCC에서의 사용에 대해 임상 시험을 통해 조사되고 있다. 여기에는 다음 항체가 포함된다: 이필리무맙(항-CTLA-4), 트레멜리무맙(항-CTLA-4), 펨브롤리주맙(항-PD-1), 니볼루맙(항-PD-1), 두르발루맙(항-PD-1), 항-KIR, 우렐루맙(항-CD137), 및 항-LAG-3.
HNSCC 환자에 대한 2건의 임상 시험에서 p53 펩티드 또는 세포자멸 종양 세포가 로딩된 DC의 사용을 평가했다. 그 면역학적 반응이 만족스러웠으며 부작용은 허용가능했다.
여러 연구는 양자 T 세포 요법(ACT)을 사용하여 수행했다. T 세포는 조사된 자가 종양 세포 또는 EBV에 대해 유도되었다. 질병 통제 및 전체 생존 기간의 결과는 유망했다(Economopoulou et al., 2016).
암 치료와 연관된 중증의 부작용과 비용을 비교하면, 일반적인 암 및 특히 간세포 암종(HCC), 대장암(CRC), 아교모세포종(GB), 위암(GC), 식도암, 비소세포 폐암(NSCLC), 췌장암(PC), 신장 세포 암종(RCC), 전립선 비대증(BPH), 전립선암(PCA), 난소암(OC), 흑색종, 유방암, 만성 림프성 백혈병(CLL), 메르켈 세포 암종(MCC), 소세포 폐암(SCLC), 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 담낭암 및 담관 암종(GBC, CCC), 방광암(UBC), 자궁암(UEC), 두경부 편평세포 암종(HNSCC)의 치료에서 사용가능한 요인들을 파악할 필요가 있다. 또한 일반적인 암 및 상기 언급된 암의 유형에 대한 바이오마커를 나타내는 요인들 특히 암의 보다 나은 진찰과 예후의 평가 및 치료 성공의 예측을 초래하는 요인들을 파악할 필요도 있다.
암의 면역요법이란 부작용은 최소화하면서 암 세포에 특이적으로 표적화하는 옵션을 나타낸다. 암 면역요법에서는 종양-연관 항원을 이용한다. 종양 관련 항원(TAA)의 현재 분류는 다음과 같은 주요 그룹을 포함한다:
a) 암-고환 항원: 이미 확인되어 T 세포에 의해 인식된 첫 번째 TAA는 이 종류에 속하며, 이는 그 멤버들의 발현이 조직학적으로 인간 종양과 다르며, 정상 조직 중, 고환의 정모 세포/정원 세포에만 있으며, 때로는 태반에 있기 때문에 최초에 암-고환(CT) 항원이라고 불렸다. 고환 세포가 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 세포에 있는 T 세포에 의해 인식될 수 없으며 면역학적으로 종양-특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 구성원 및 NY-ESO-1이 있다.
b) 분화 항원: 이러한 TAA는 종양과 종양이 발생한 정상 세포 사이에 공유된다. 대부분의 알려진 분화 항원은 흑색종과 정상 멜라닌 세포에서 발견된다. 이러한 많은 멜라닌 세포 계통-관련 단백질은 멜라닌의 생합성과 관련되어 있으며, 이에 따라 종양-특이적은 아니지만 암 면역치료에 널리 사용된다. 예로는, 흑색종을 위한 티로시나아제 및 Melan-A/MART-1 또는 전립선암을 위한 PSA가 있고 이에 국한되지 않는다.
c) 과발현된 TAA: 일반적으로 낮은 발현 수준이 있는 많은 정상 조직뿐만 아니라 조직학적으로 다른 유형의 종양에서 유전자 인코딩에서 널리 발현된 TAA가 발견된다. 정상 조직에 의해 처리되고 잠재적으로 제시되는 많은 에피톱이 T 세포 인식의 임계치 수준보다 낮을 수 있고, T 세포의 종양 세포에서의 과발현은 이전에 확립된 내성을 중단시켜 항암 반응을 개시할 수 있다. 이 클래스 TAA의 유력한 예로는 Her-2/neu, 서바이빈, 텔로머라제 또는 WT1가 있다
d) 종양-특이적 항원: 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 변이로써 발생한다(β-카테닌, CDK4 등). 이러한 분자 변경의 일부는 종양 변이 및/또는 진행과 관련되어 있다. 종양-특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자가 면역 반응 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 TAA는 발견되어 일반적으로 많은 개별 종양에서 대개 공유되지 않은 해당 종양에만 적절하다. 종양-특이적(연관된) 아형을 갖는 단백질의 경우 펩티드가 종양(관련) 엑손으로부터 비롯된다면 펩티드의 종양-특이성(또는 연관성) 또한 발생할 수 있다.
e) 비정상 번역 후 변형에서 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 특이적이 아니고 과발현되지도 않는 단백질에서 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활동적인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양-특이적일 수도 있고 아닐 수도 있는 분해 과정 동안 단백질 스플라이싱과 같은 이벤트 또는 MUC1의 경우 종양의 새로운 에피톱으로 이끄는 변화된 당화 패턴에서 발생한다.
f) 종양 바이러스 단백질: 이러한 TAA는 종양발생 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 그들이 이질적이기 때문에(인간 태생이 아닌), T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이런 단백질의 예로는 인간 유두종 타입 16 바이러스 단백질, 및 경부 암종에서 발현하는 E6와 E7이 있다.
T 세포 기반의 면역요법은 종양-연관 또는 종양-특이적 단백질로부터 유래된 펩티드 에피톱을 표적으로 하며, 이는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 의해 제시된다. 종양-특이적 세포 독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 에피톱은, 발현되고, 같은 원조의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 대개 상향조절된 세포인 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.
MHC-분자에는 두 클래스가 있으며, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II이다. MHC 클래스 I 알파 중쇄와 베타-2-저분자글로불린, 알파와 베타 쇄의 MHC 클래스 II 분자로 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하며, 이는 펩티드와의 비공유결합에 사용된다.
MHC 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포에서 찾을 수 있다. 이는 대부분 내인 단백질, 결손 리보솜 생성물(DRIP)과 큰 펩티드의 단백질분해성 절단으로 인해 생성된 펩티드를 제시한다. 하지만 엔도솜 구획이나 외생 출처로부터 유래된 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 문헌에서는 교차-제시라고 칭한다(Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC 클래스-II 분자는 대부분 전문적인 항원-제시 세포(APC)에서 찾아 볼 수 있으며, 이들은 주로 APC에 의해 섭취된 외인 또는 막횡단 단백질의 펩티드를 제시하며(예: 세포내이입 동안), 이는 후에 처리된다.
펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합체는 적당한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8-양성 T 세포에 의해서 인식이 되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체는 적당한 TCR을 갖는 CD4-양성 조력 T 세포에 의해 인식이 된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 이로써 1:1:1의 화학양론적 반응량으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.
CD4-양성 보조 T 세포는 CD8-양성 세포 독성 T 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는데 중요한 역할을 한다. 종양-연관 항원(TAA)에서 유도된 CD4-양성 T 세포 에피톱의 동정은 항-종양 면역 반응을 일으키기 위한 의약품의 개발에 아주 중요하다(Gnjatic et al., 2003). 종양 부위에서, 보조 T 세포는, 세포독성 T 세포(CTL) 친화적 시토카인 주위 환경을 지원하고(Mortara et al., 2006) 효과기 세포, 예를 들어 CTL, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포, 과립구를 유치한다(Hwang et al., 2007).
염증이 없는 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문적 항원-제시 세포(APC), 예를 들어, 단핵 세포, 단핵 세포-유도된 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 암 환자에서, 종양의 세포는 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 것으로 밝혀졌다(Dengjel J, et al.).
본 발명의 신장 펩티드는 HLA 클래스 II 활성 에피톱으로 작용할 수 있다.
MHC 클래스 II에 의해 활성화된 조력 T 세포는 항-종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8-양성 킬러 T 세포의 TH1 유형 지원 효과기 기능의 조력 T 세포 반응을 일으키는 조력 T 세포 에피톱은, 세포 표면에 종양-연관 펩티드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포 독성 기능을 포함한다. 이런 식으로 종양-연관 조력 T 세포 펩티드 에피톱은, 따로 또는 다른 종양-연관 펩티드와 함께, 항-종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 활성 약학 원료로 사용될 수 있다.
예를 들어, 생쥐 같은 포유류 동물 모델에서는 심지어 CD8-양성 T 림프구의 부재 하에서도, CD4-양성 T 세포가 인터페론-감마(IFNγ)의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통한 종양의 억제 징후에 충분하다는 것이 보여졌다(Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). CD4 T 세포가 직접적 항종양 작용기라는 증거가 있다(Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
이전에는 HLA 클래스 II 분자의 구성적 발현이 일반적으로 면역 세포로 제한되기 때문에, 클래스 II 펩티드를 원발성 종양에서 직접 격리하는 것은 가능하지 않다고 간주되었다. 그러나, Dengjel 등은 MHC 클래스 II 에피톱을 종양에서 직접적으로 식별하는데 성공했다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 함께 상승작용에 의해 항종양 효과에 기여함으로써, CD8+ T 세포(리간드: MHC 클래스 I 분자 + 펩티드 에피톱) 또는 CD4-양성 조력 T 세포(리간드: MHC 클래스 II 분자 + 펩티드 에피톱)에 의해 인식되는 종양-연관 항원의 식별 및 특성화가 종양 백신의 개발에 중요하다.
MHC 클래스 I 펩티드 세포 면역 반응을 촉발(유도)하려면 MHC-분자에도 결합해야 한다. 이 프로세스는 MHC-분자의 대립형질 및 그 펩티드의 아미노산 서열의 특정한 다형성에 의존한다. MHC-클래스-I-결합 펩티드는 대개 길이가 8 내지 12개의 아미노산 잔기이며 대개 그 서열 내에 MHC-분자와 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 2개의 보존 잔기("고정")를 포함하고 있다. 이렇게 함으로써 각 MHC 대립형질은 어떤 펩티드가 결합 홈에 특이적으로 결합할 수 있는가를 결정하는 "결합 모티프"를 갖는다.
MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하며 또한 추후 특정한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있어야 한다.
종양-특이적 또는 종양-연관 항원으로서 T 림프구에 의해 단백질이 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하며 비교적 소량일지라도 건강한 정상 조직에 의해서는 발현되어서는 안 된다. 바람직한 구현에서, 펩티드는 건강한 정상 조직과 비교하여 종양 세포에 의해 과다제시되어야 한다. 더욱이 각각의 항원이 하나의 유형의 종양에서 뿐만 아니라 높은 농도로 나타나는 것이 바람직하다(즉 세포마다 펩티드의 각각의 사본 번호). 종양-특이적 및 종양-연관 항원은 흔히 기능 때문에(예: 세포 주기 관리 또는 아폽토시스의 억제) 정상 세포를 종양 세포로 전환하는 것과 직접 관련된 단백질에서 유도된다. 또한, 변환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적은 상향조절될 수 있으며, 이에 따라 간접적으로 종양과 연관될 수 있다. 이러한 간접적 종양-연관 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다(Singh-Jasuja et al., 2004). 에피톱이 항원의 아미노산 서열에 나타나는 것이 중요하며, 종양-연관 항원에서 유도된 그러한 펩티드("면역성 펩티드")는 시험관내 또는 생체내 T 세포반응을 유도해야 한다.
기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 모든 펩티드는 T 세포 에피톱으로서 기능할 수 있다. 시험관내 또는 생체내 T 세포 반응을 유도하는 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성의 부재이다.
따라서, TAA는 종양 백신으로 제한되지 않지만 이를 포함하는 T 세포 기반 요법의 개발에 있어서 시작점이 된다. TAA의 식별과 특성화의 방법은 대개 환자 또는 건강한 대상에서 격리될 수 있는 CTL의 사용에 기반되거나, 다른 전송 프로파일 또는 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로파일이나 차등 펩티드 발현 패턴의 생성에 기반한다. 그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 치료에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정밀한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성이 없거나 최소화되어야 하므로 이러한 항원의 에피톱의 개개의 소집단만이 그런 응용에 적합하기 때문이다. 따라서 본 발명의 매우 바람직한 구현에서, 기능성 및/또는 증식성 T 세포가 발견될 수 있는 MHC 분자와 관련이 있게 나타나는 과발현된 또는 선택적으로 발현된 펩티드만 선택하는 것이 중요하다. 이러한 기능성 T 세포는 특정 항원에 의해 자극되었을 때 클론에 의해 확대되고 효과기 기능("효과기 T 세포")을 실행할 수 있는 T 세포로 정의된다.
본 발명에 따른 특정 TCR(예: 용해성 TCR) 및 항체 또는 다른 결합 분자(골격)에 의해 펩티드-MHC를 표적화하는 경우, 기저 펩티드의 면역원성은 이차적인 것이다. 이러한 경우, 제시가 결정요인이다.
본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388 또는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로, 상기 변이체는 MHC에 결합하며/거나 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하며, 상기 펩티드는 기저의 전장 폴리펩티드가 아니다.
펩티드가 암 요법 표적으로 기능하는데 가장 중요한 기준은 정상 조직에 비해 원발성 종양 조직에 대한 과다제시인 반면, 상응하는 유전자의 RNA 발현 프로파일 또한 적절한 펩티드의 선택에 도움을 줄 수 있다. 특히, 일부 펩티드는 그 화학적 물성으로 인해 세포에 대한 낮은 복제수로 인하여 질량 분광법에 의한 검출이 어려우며, 펩티드 제시의 검출에 집중하는 스크리닝 접근방식은 이러한 표적의 파악에 실패할 수 있다. 하지만 이러한 표적은 정상 조직에서 유전자 발현의 분석으로 시작하며 이차적으로 종양에서의 펩티드 제시 및 유전자 발현을 평가하는 대체 접근방식으로 검출할 수 있다. 이 접근방식은 추가적인 유전자 발현 데이터(종양 샘플 포함)와 합쳐진 mRNA 데이터베이스(Lonsdale, 2013)를 사용하여 본 발명에서 실현되었다. 유전자의 mRNA가 정상 조직, 특히 필수 기관계에 거의 부재한다면, 심지어 효능이 강한 전략(양특이성 친화도-최적화 항체 또는 T 세포 수용체와 같은)에 의해 상응하는 펩티드를 표적화하는 것이 더 안전할 수 있다. 그러한 펩티드는 작은 비율의 종양 조직에서만 동정되더라도 흥미로운 표적을 나타낸다. 일상적 질량 분광 분석은 펩티드 수준에 대한 표적 범위를 평가하기에 충분히 민감하지 않다. 이와 달리 종양 mRNA 발현은 범위 평가에 사용할 수 있다. 펩티드 자체의 검출을 위해서는, 일상적 스크리닝보다 민감도가 더 높은 표적 질량 분석의 접근방식이 필요할 수 있으며 이는 펩티드 제시 수준에 대한 범위의 더 나은 추정이 가능하다.
본 발명은 또한 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388 또는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 본 발명의 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 이의 변이체가 갖는 전체 길이는 8 내지 100개, 바람직하게는 8 내지 30개, 가장 바람직하게는 8 내지 14개의 아미노산이다.
다음 표에는 본 발명에 따른 펩티드와 각각의 서열식별번호 및 이 펩티드의 유망한 근원(기저) 유전자가 제시된다. 표 1A 및 표 2A의 모든 펩티드는 HLA-A*02에 결합한다. 표 1C 및 표 2B의 펩티드는 HLA-A*24에 결합한다. 표 1B의 펩티드는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합한다. 표 3의 펩티드는 HLA-A*24 결합이고 본 발명에 따른 펩티드와의 병용에서 유용할 수 있는 추가적인 펩티드이다.
[표 1A]
본 발명에 따른 펩티드, HLA-A*02 결합
Figure 112018079258903-pat00001
Figure 112018079258903-pat00002
Figure 112018079258903-pat00003
Figure 112018079258903-pat00004
[표 1B]
본 발명에 따른 펩티드, HLA 클래스 II 결합
Figure 112018079258903-pat00005
[표 1C]
본 발명에 따른 펩티드, HLA-A*24 결합
Figure 112018079258903-pat00006
Figure 112018079258903-pat00007
Figure 112018079258903-pat00008
Figure 112018079258903-pat00009
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Figure 112018079258903-pat00011
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[표 2A]
본 발명에 따른 추가 펩티드, HLA-A*02 결합
Figure 112018079258903-pat00013
[표 2B]
본 발명에 따른 추가 펩티드, HLA-A*24 결합
Figure 112018079258903-pat00014
Figure 112018079258903-pat00015
[표 3]
본 발명에 따른 암 요법(예: 개인화된 암 요법)에 유용한 펩티드
Figure 112018079258903-pat00016
본 발명은 또한, 예를 들어 아교모세포종(GB), 유방암(BRCA), 대장암(CRC), 신세포 암종(RCC), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 간세포 암종(HCC), 비소세포 및 소세포 폐암(NSCLC, SCLC), 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 난소암(OC), 췌장암(PC), 전립선암(PCA), 위-식도 연결부 암(OSCAR)을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종(GBC, CCC), 흑색종(MEL), 위암(GC), 고환암(TC), 방광암(UBC), 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 및 자궁암(UEC)과 같은 증식성 질병 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 펩티드와 일반적으로 관련이 있다.
특히 바람직한 것은 서열식별번호 1 내지 388로 구성된 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 단일 또는 조합의 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 295(표 1A, 1B, 1C 참조)로 구성된 군으로부터 선택된 단일 또는 조합의 펩티드, 및 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종 또는 자궁암의 면역요법에서의 이들의 용도이다.
특히 바람직하게는, 서열식별번호 70, 80, 323 및 325로 구성된 군으로부터 선택된 단일 또는 조합의 본 발명에 따른 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, 서열식별번호 70, 80, 323 및 325로 구성된 군으로부터 선택된 단일 또는 조합의 펩티드, 및 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종 또는 자궁암의 면역요법에서의 이들의 용도이다.
특히 바람직하게는, 서열식별번호 391 및 403으로 구성된 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 단일 또는 조합의 펩티드이다. 더욱 바람직하게는, 서열식별번호 391 및 403으로 구성된 군으로부터 선택된 단일 또는 조합의 펩티드, 및 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종 또는 자궁암의 면역요법에서의 이들의 용도이다.
실시예 1에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 많은 펩티드는 다른 종양 유형에서도 발견되며, 이에 따라 다양한 적응증의 면역요법에도 사용될 수 있다. 실시예 2에 제시된 바와 같이 다양한 암에서 기저 폴리펩티드의 과발현은 다양한 기타 종양학적 적응증에서 이러한 펩티드의 유용성을 암시한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종 또는 자궁암의 군으로부터 선택된 증식성 질병에 있어서, 바람직하게는 병용 치료를 위한 본 발명에 따른 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 길이 변이체와 같은 긴 형태의 MHC 클래스-II의 분자와 결합하는 능력을 가진 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드는 (각각) 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드는 변형되며/거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부이며, 특히 HLA-DR 항원-결합 항원-연관된 불변쇄(Ii)에 융합되거나, 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 그 서열 안으로) 융합된다.
본 발명의 또 다른 구현은 비자연적으로 발생하는 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 48에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되며 약학적으로 허용가능한 염으로 합성적으로 생성되었다(예컨대, 합성되었다). 펩티드를 합성적으로 생성하는 방법들은 당업계에서 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 생체내 상태에서의 펩티드와 실질적으로 다르며, 이는 생체내에서 생성된 펩티드는 염이 아니기 때문이다. 펩티드의 비자연적 염 형태는 특히, 예를 들어 본원에 공개된 펩티드 백신과 같이 펩티드를 포함하는 약학 조성물의 맥락에서 상기 펩티드의 용해도를 매개한다. 치료할 시험대상자에게 펩티드를 효율적으로 제공하기 위해서는 충분하며 적어도 실질적인 펩티드의 용해도가 요구된다. 바람직하게, 상기 염은 펩티드의 약학적으로 허용가능한 염이다. 본 발명에 따른 이러한 염에는 음이온으로 PO4 3-, SO4 2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3 -, ClO4 -, I-, SCN-, 및 양이온으로 NH4 +, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ 및 Ba2+를 포함하는 호프마이스터 계열의 염과 같은 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염이 포함된다. 특히 염은 (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2 Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4), Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2, 및 Ba(SCN)2로부터 선택된다. 특히 바람직하게는, 예를 들어 염화물 또는 아세테이트(트라이플루오로아세테이트) 염과 같은 NH 아세테이트, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl 및 CaCl2이다.
일반적으로, 펩티드 및 변이체(아미노산 잔기 간에 펩티드 결합을 적어도 포함하는 것들)는 Lucas 등(Lukas et al., 1981) 및 여기에 인용된 참조문헌에서 공개된 Fmoc-폴리아미드 방식의 고체상 펩티드 합성에 의해 합성될 수 있다. 임시적인 N-아미노 기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 기에 의해 제공된다. 이 고도로 염기에 불안정한 보호기의 반복적 분할은 N,N-다이메틸포름아미드에서 20% 피페리딘을 사용하여 이루어진다. 측쇄의 기능성은 그 부틸 에테르(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카보닐 유도체(리신 및 히스티딘의 경우), 트리틸 유도체(시스테인의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트라이메틸벤젠술포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 각각 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단 잔기인 경우, 4,4'-다이메톡시벤즈하이드릴기를 사용하여 측쇄의 아미노 기능성을 보호한다. 고체상 지지는 다이메틸아크릴아미드(백본 단량체), 비스아크릴로일에틸렌 다이아민(가교제) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(기능화제)의 세 단량체로부터 구성된 폴리다이메틸-아크릴아미드 중합체에 기반한다. 사용되는 펩티드-수지 절단가능한 결합제는 산에 불안정한 4-하이드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 각각의 사전형성된 대칭성 무수물 유도체로 첨가되되, 아스파라긴과 글루타민은 예외로 이 경우에는 역 N,N-다이사이클로헥실-카보다이이미드/1-하이드록시벤조트리아졸 매개 짝지음 절차를 사용하여 첨가된다. 모든 짝지음 및 탈보호 반응은 닌히드린, 트라이니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 검사 절차를 사용하여 감시한다. 합성 완료 시, 50% 스캐빈저 혼합물을 포함하는 95% 트라이플루오로아세트산으로 처리하면 측쇄 보호기가 동시에 제거되면서 펩티드가 수지 지지체로부터 절단된다. 일반적으로 사용되는 스캐빈저에는 에탄다이티올, 페놀, 아니솔 및 물이 포함되며, 정확한 선택은 합성되는 펩티드를 구성하는 아미노산에 따라 달라진다. 또한 펩티드의 합성에서 고체상 및 용액상의 조합 방식도 가능하다(예는 문헌[Bruckdorfer et al., 2004] 및 여기에 인용된 참조문헌 참고).
트라이플루오로아세트산은 진공하 증발에 의해 제거되며 그 이후 다이에틸 에테르에 의한 분쇄로 조(crude) 펩티드를 얻는다. 모든 존재하는 스캐빈저는 단순 추출 절차에 의해 제거되며, 수용액상을 동결 건조하여 스캐빈저가 없는 펩티드를 얻는다. 펩티드 합성 시약들은 일반적으로, 예를 들어 Calbiochem-Novabiochem(Nottingham, UK)로부터 입수 가능하다.
정제는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및, 예를 들어 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 (대개) 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 기법의 하나 또는 그 조합에 의해 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있거나 발현하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 질병의 치료와 의학, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 대해 특이적인 항체 또는 본 발명에 따른 상기 펩티드와 MHC와의 복합체 및 이들을 만드는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 T 세포 수용체(TCR), 특히 용해성 TCR(sTCR) 및 상동성 또는 동종이형 T 세포로 조작된 복제된 TCR 및 이러한 수용체를 만드는 방법은 물론 상기 TCR을 함유하거나 상기 TCR과 교차반응하는 NK 세포 또는 기타 세포들에 관한 것이다.
항체 및 TCR은 즉시 가용한 본 발명에 따른 펩티드의 면역치료적 사용의 추가 구현이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원-제시 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 단리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원-제시 세포 또는 인공 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원-제시 세포는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388, 바람직하게는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 295 또는 변이체 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있거나 발현하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제공된 활성화된 T 세포에 관한 것으로, 상기 T 세포는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 또한 표적 세포가 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따라 생산된 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 설명한 일체의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 활성화된 T 림프구, T 세포 수용체 또는 항체, 또는 본 발명에 따른 다른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC-결합 분자의 약제로서 또는 약제의 제조에서의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 약제는 암에 대해 활성이다.
바람직하게는, 상기 약제는 세포 요법, 백신 또는 용해성 TCR 또는 항체에 근거한 단백질이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로, 상기 암 세포는 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종 또는 자궁암이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 기반한 바이오마커(여기서 "표적"이라고 함)에 관한 것으로, 이는 바람직하게는 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종 또는 자궁암의 진단에서 사용될 수 있다. 마커는 펩티드 자체의 과다제시 또는 상응하는 유전자의 과발현일 수 있다. 또한, 마커는 치료, 바람직하게는 면역요법, 가장 바람직하게는 바이오마커에 의해 파악된 동일한 표적을 대상으로 하는 면역요법의 성공 확률을 예측하는데 사용할 수도 있다. 예를 들어, 항체 또는 용해성 TCR은 MHC와의 복합체에서 관심 있는 펩티드의 존재를 검출하기 위해 종양의 부분 염색에 사용할 수 있다.
임의적으로, 그 항체는 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 효과기 기능을 갖는다.
본 발명은 또 암 치료의 맥락에서 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.
추가의 암 질환에 대한 치료 및 진단 용도 모두 본 발명에 따른 펩티드의 기저 발현 생성물(폴리펩티드)에 대한 다음의 설명에 개시된다.
A4GNT는 췌장암의 세포에서는 빈번히 발현되지만 말초혈 세포에서는 그렇지 않으며 말초혈의 단핵 세포 분획에 발현되는 A4GNT mRNA의 정량적 분석은 췌장암의 검출에 기여할 것이다(Ishizone et al., 2006). 암 세포가 위 점막으로 제한되었 때, 조기 위암 환자의 80%에서 A4GNT mRNA가 검출되었으며, A4GNT mRNA의 발현 수준은 종양 진행과 연관되어 증가했다(Shimizu et al., 2003).
원발성 난관 암종에서 ABCC2의 상향조절된 발현은 불량한 예후와 연관이 있다(Halon et al., 2013).
인간 암에서 ADAM10은 상향조절되며 그 수준은 종양 진행 및 불량한 결과의 매개변수와 일반적으로 상관관계가 있다. 전임상 모델에서, ADAM10에 대한 선택적 억제제는 종양 성장 감소에 있어 기존 요법들과 상승작용을 보였다(Duffy et al., 2009).
AHCYL2는 결장 암종에서 및 폐 암종의 하위조합에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Lleonart et al., 2006). AHCYL2의 mRNA 발현은 p53 기능 및 ras-MAPK 경로, 메틸화 및 전사적 세포 프로그램의 제어와 연관있을 가능성이 있는 것으로 기술되었고, 이에 따라 AHCYL2는 인간 결장 및 폐 종양에서 조절 억제 유전자일 수 있다(Lleonart et al., 2006).
AKR1C1은 자궁경부, 난소 및 폐의 암 세포에서 시스플라틴 내성에 대한 역할을 하며, 이에는 미토콘드리아 막 탈분극, ROS 생성 및 JNK 경로의 활성화가 포함된다(Chen et al., 2015). AKR1C1의 유의하게 더 높은 종양내 수준이 신보강 화학요법의 비반응자에 비해 반응자에서 발견되었다(Hlavac et al., 2014).
전립선암에서 AKR1C3의 발현이 글리슨(Gleason) 점수의 상승과 양적 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이는 AKR1C3이 전립선암의 진행에 대한 유망한 바이오마커 역할을 할 수 있음을 나타낸다(Tian et al., 2014). AKR1C3은 4-안드로스텐-3,17-다이온에서 테스토스테론 및 에스트론에서 17β-에스트라다이올로의 환원을 촉매하는 것으로 나타났으며, 이는 각각 호르몬 의존 전립선암 및 유방암의 증식을 촉진시킨다(Byrns et al., 2011). AKR1C3은 유방암, 전립선암 및 피부 편평세포 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Byrns et al., 2011; Mantel et al., 2014). AKR1C3은 국소 진행성 직장암 환자의 화학-방사선요법 치료 시 반응자 환자를 비반응자 환자로부터 구별할 수 있는 유전자 시그니처 내의 표적인 것으로 나타났다(Agostini et al., 2015). AKR1C3은 종양 억제인자 PTEN의 소실을 통한 항-세포자멸사 PTEN/Akt 경로의 활성화에 의해 인간 유방암에서 독소루비신 내성과 연관있는 것으로 나타났다(Zhong et al., 2015). AKR1C3은 석탄 배출에 노출된 중국 지방의 사람들에서 높은 폐암의 위험과 연관있는 것으로 나타났다(Li et al., 2015a). AKR1C3은 융모막암종에서 메토트렉세이트 내성 발생과도 연관이 있는 이 질병의 잠재적 치료 표지자로서 기술되었다(Zhao et al., 2014a).
ALDH1L1의 발현은 HCC 및 신경아교종에서 하향조절되는 것으로 나타났다. 이러한 암에서 ALDH1L1의 하향조절은 더 불량한 예후 및 더 공격적인 표현형과 연관이 있었다(Chen et al., 2012; Rodriguez et al., 2008).
ALOX15는 전립선암(PCa), 폐암, 유방암, 흑색종 및 결장 선암종에서 정상 조직에 비해 높은 수준으로 존재한다(Kelavkar et al., 2002). ALOX15 효소 활성도는 PCa 개시 및 진행에 기여한다(Kelavkar et al., 2007).
전립선암, 거세 저항성 전립선암, 유방암, 다형성 아교모세포종, 결장암 및 위암과 같은 다양한 암의 발생에 있어서 AR이 연루되었다(Wang et al., 2009d; Yu et al., 2015b; Mehta et al., 2015; Wang et al., 2015a; Sukocheva et al., 2015). 전립선암 증식의 증식 외에도, AR을 통한 안드로겐 신호전달은 사이클린 의존 키나제 억제제인 p21(WAF1/CIP1)의 발현 유도를 걸쳐 세포자멸사를 초래한다(Yeh et al., 2000).
ARMC5의 돌연변이는 거대결절성 코르티솔 생산 신생물, 양측성 거대결절성 증식, 원발성 거대결절성 부신피질 증식 및 수막종을 야기시킨다(Espiard and Bertherat, 2015; Kirschner and Stratakis, 2016; Elbelt et al., 2015).
약물유전체학 연구에서 ATAD5와 항암제 사이의 상관관계를 밝힌다(Abaan et al., 2013). ATAD5는 악성 말초 신경초 종양에서 유의하게 상향조절된다(Pasmant et al., 2011). B형 간염 바이러스 단백질 X는 HBV 관련 간세포 암종에서 ATAD5의 발현을 유의하게 강화시킨다(Ghosh et al., 2016). ATAD5의 소실은 생쥐에서 배체에 치사적이며, 생쥐와 인간 모두에서 종양 억제인자로서 작용하고, 또한 인간 판코니(Fanconi) 빈혈 경로의 성분과 상호작용한다. 더욱이, 이것은 종양 성장의 위험이 높은 유전적 질병인 신경섬유종증과 연관있는 일부 표현형에 책임이 있을 수 있다(Gazy et al., 2015; Jenne et al., 2001). ATAD5 유전자 자리의 변이체는 상피 난소암 위험과 연관이 있다(Kuchenbaecker et al., 2015). ATAD5는 비소세포 폐암의 적어도 하나의 포유류 표현형과 관련이 있다(Li et al., 2014).
ATP10B의 발현은 고도의 침윤성 신경아교종 세포에서 탈조절되며 침윤성 거동과 연관이 있다(Tatenhorst et al., 2004).
ATP8B4는 다발성 골수종 환자 및 기타 객체에서 예후 표지자와 치료 표적일수 있다(미국 특허 2007-0237770 A1)(Ni et al., 2012).
ATR은 ATR 세린/트레오닌 키나제를 인코딩하며, 이것은 PI3/PI4 키나제 계열에 속한다. 구강 편평세포 암종의 세포주에서 ATR 유전자의 복제수 증가, 증폭 또는 전위가 관찰되었다(Parikh et al., 2014). 자궁내막암에서의 ATR 돌연변이 절단이 무질병 생존 기간 및 전체 생존 기간의 감소와 연관이 있음이 입증되었다(Zighelboim et al., 2009).
B3GNT5는 급성 골수성 백혈병과 생쥐 배아 암종에서 과발현되며, 그 발현은 아교모세포종에서 촉진인자 메틸화와 역의 상관관계가 있다(Ogasawara et al., 2011; Etcheverry et al., 2010; Wang et al., 2012). miRNA-203을 통한 B3GNT5의 하향조절은 하인두 편평세포 암종의 악성에 기여할 수 있다(Wang et al., 2015g). B3GNT5는 유방암 환자의 생존과 연관이 있다(Potapenko et al., 2015).
Bub1 발현은 림프종, 유방암, 위암 및 전립선암의 하위조합에서 증가된다. Bub1 과발현은 불량한 임상적 예후와 상관관계가 있다(Ricke and van Deursen, 2011). Bub1 돌연변이는 염색체 불안정성을 나타내는 대장 암종에서 발견될 수 있다(Williams et al., 2007).
C4A 다낭성 난소 증후군과 자궁내막암의 바이오마커로서 기술되었으며 실험 데이터에 의하면 C4가 암 성장을 매개할 수 있음이 시사된다(Galazis et al., 2013; Rutkowski et al., 2010).
급성 골수단핵구 백혈병 세포주 JIH3에서 염색체 결손에는 C7orf10이 포함된다(Pan et al., 2012).
C8은 인간 간암 세포주 HepG2에 의해 구성적으로 발현되며 시토카인 IL-6, IFN-감마 및 IL-1 베타와의 자극 후에 발현이 강력히 강화된다(Scheurer et al., 1997).
암 고환 항원-특이적 프라이머는 다형성 아교모세포종에서 CASC5를 검출할 수 있으며, 이 암은 예후가 매우 불량하고 가장 악성이며 공격적인 종양의 하나이다. CASC5는 N-말단(Bub1 및 BubR1의 경우) 및 C-말단(Zwint-1 및 hMis14/hNsl1의 경우)에서 특이적 결합 모티프를 갖는다. 이 연결의 파괴는 종양 형성으로 이어질 수 있다(Kiyomitsu et al., 2011; Jiang et al., 2014c). CASC5는 종양 억제인자 pRb와 상호작용한다(Bogdanov and Takimoto, 2008). CASC5는 체세포, 종양 및 건강한 인간 고환의 증식에 있어 고도로 발현된다(Bogdanov and Takimoto, 2008; Sasao et al., 2004). CASC5는 세포 성장 억제 및 성숙화 강화와 연계되며, 이에 따라 그 파괴는 백혈병 유발의 주요 인자일 수 있다(Hayette et al., 2000; Bogdanov and Takimoto, 2008; Chinwalla et al., 2003; Kuefer et al., 2003; Yang et al., 2014a).
CCR4는 신세포 암종, 두경부 편평세포 암종, 위암, 유방암, 결장암 및 호지킨 림프종과 같은 다양한 종양에서 예후 표지자로 기술되었다(Ishida et al., 2006; Olkhanud et al., 2009; Yang et al., 2011; Tsujikawa et al., 2013; Al-haidari et al., 2013; Liu et al., 2014a). 연구 결과에 의하면 CCR4 양성 종양의 위암 환자들은 CCR4 음성 종양의 환자에 비해 예후가 유의하게 더 불량한 것으로 드러났다(Lee et al., 2009a).
CCR8 발현은 요로상피 및 신장 암종 환자의 말초혈에 있는 단핵구성 및 과립구 골수 세포 하위조합에서 증가된다. CCR8의 상향조절된 발현은 인간 방광 및 신장 암 조직 내에서도 검출되며, 일차적으로 종양 관련 대식세포로 제한된다. CCL1/CCR8 축은 암 관련 염증의 구성요소이며 면역 침입에 기여할 수 있다(Eruslanov et al., 2013).
CD101에서 단일 뉴클레오티드 다형태는 췌장암 위험과 연관있는 것으로 나타났으나, 전립선암 환자 대조군 및 코호트 모집단에서 이 결과를 복제할 수 없었으므로 췌장암에서 CD101의 가능한 역할에 관한 향후 연구가 요구된다(Reid-Lombardo et al., 2011). CD101은 베이지안(Bayesian) 모델 평균법을 사용하여 급성기(blast crisis) 만성 골수성 백혈병과 만성기를 구별하는 6-유전자 시그니처의 하나로 식별되었다(Oehler et al., 2009).
CD84는 느린 진행성 및 안정성 만성 림프구성 백혈병에 비해 진행성 만성 백혈구성 백혈병에서 차등적으로 풍부한 CD 항원으로 기술되었다(Huang et al., 2014). CD84 발현은 만성 림프구성 백혈병의 조기 병기에서부터 유의하게 상승되는 것으로 나타났다(Binsky-Ehrenreich et al., 2014).
CENPE 발현은 신경아교종 등급과 유의하게 상관관계가 있으며 신경아교종 환자의 생존 기간 예측에 대한 다른 매개 변수들을 보완할 수 있다(Bie et al., 2011). CENPE는 화학요법 민감 종양에 비해 화학요법 내성의 상피 난소암 종양에서 상향조절된다(Ju et al., 2009). CENPE는 침윤성 및 공격-침윤성 프로락틴 뇌하수체 종양에서 상향조절된다(Wierinckx et al., 2007).
CLDN14는 위암에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Gao et al., 2013). CLDN14 발현은 위암에서 림프관 전이와 연관있는 것으로 나타났다(Gao et al., 2013). CLDN14는 생쥐에서 종양 혈관의 완결성과 혈관 신생에서 역할을 하는 것으로 기술되었다(Baker et al., 2013).
CLDN3은 다수의 인간 종양에서 고도로 차등적으로 발현되며, CLDN3이 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 장독소의 높은 친화도 수용체이므로 생물학적으로 공격적인 인간 암 세포를 특이적으로 식별하고 표적하는 효율적인 분자 도구를 제공할 수 있다(Black et al., 2015). CLDN3은 난소암, 유방암, 췌장암 및 전립선암 등의 여러 신생물에서 빈번히 과발현된다(Morin, 2005). CLDN3은 전립선암에서 고도로 발현되므로 전립선암 바이오마커로서 식별되었다(Amaro et al., 2014). CLDN3의 발현 감소는 완전 절제된 편평세포 폐 암종에서 불량한 예후 및 EMT와 연관이 있다(Che et al., 2015). CLDN3은 Wnt-EMT 신호전달을 통해 암 공격성을 억제하며 간세포 암종의 잠재적인 예후 바이오마커이다(Jiang et al., 2014b).
CLDN4는 다수의 인간 종양에서 고도로 차등적으로 발현되며, CLDN4가 클로스트리듐 퍼프린젠스 장독소의 높은 친화도 수용체이므로 생물학적으로 공격적인 인간 암 세포를 특이적으로 식별하고 표적하는 효율적인 분자 도구를 제공할 수 있다(Black et al., 2015). CLDN4는 난소암, 유방암, 췌장암 및 전립선암 등의 여러 신생물에서 빈번히 과발현된다(Morin, 2005). CLDN4의 세포의 도메인에 대한 항체는 방광암에서 전구-화학요법(pro-chemotherapeutic) 효과를 제공한다(Kuwada et al., 2015). CLDN4의 높은 발현은 더 분화된 창자형 위 암종과 연관있었으며 불량하게 분화된 미만성 유형에서 소실되었다. CLDN4의 낮은 발현은 림프관 신생과 관련이 있었다(Shareef et al., 2015).
CLDN6 발현은 비소세포 폐암에서 림프절 전이와 TNM 병기와 연관이 있는 것으로 나타났다(Wang et al., 2015f). 더욱이, CLDN6의 낮은 발현은 비소세포 폐암 환자에서 유의하게 더 낮은 생존률과 연관있는 것으로 나타났다(Wang et al., 2015f). 따라서, 비소세포 폐암 환자에서 낮은 CLDN6 발현은 악화된 예후를 나타내는 독립적 예후 바이오마커이다(Wang et al., 2015f). CLDN6은 자궁경부 암종과 위암에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Zhang et al., 2015; Lin et al., 2013). CLDN6은 BRCA1 관련 유방암과 난소 유두상 장액성 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Wang et al., 2013b; Heerma van Voss et al., 2014). CLDN6은 유방암의 종양 억제인자로서 기술되었다(Zhang et al., 2015). 자궁경부 암종 세포주인 HeLa 및 C33A에서 CLDN6 발현의 증가는 세포 증식, 시험관내 집락 형성 및 생체내 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났는데 이는 CLDN6이 자궁경부 암종 세포에서 종양 억제인자로 기능할 수 있음을 시사한다(Zhang et al., 2015). CLDN6은 난소암의 침윤 및 전이에서 긍정적 역할을 할 수 있다(Wang et al., 2013b). CLDN6은 생식 세포 종양에서 일관적으로 발현되는 것으로 나타났으며, 이에 따라 원시 생식 세포 종양의 새로운 진단 표지자이다(Ushiku et al., 2012). CLDN6 발현은 중추 신경계의 비전형의 기형/간상 종양에 대해 평가된 조합내 대부분의 종양에서 양성인 것으로 나타났으며, 강력한 CLDN6 양성은 이 질병의 결과에 대한 잠재적인 독립적 예후 인자였다(Dufour et al., 2012).
CLDN9는 전이성 루이스(Lewis) 폐 암종 세포주인 p-3LL에서 및 이러한 세포에서 유래한 종양에서 또한 뇌하수체 호산성세포종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Sharma et al., 2016; Hong et al., 2014). 전이성 루이스 폐 암종의 p-3LL 세포에서 CLDN9 발현의 녹-다운은 유의하게 감소된 운동성, 시험관내 침윤성 및 생체내 전이를 초래하는 것으로 나타난 반면, 이러한 세포에서 일과성 과발현은 그 운동성을 강화시키는 것으로 나타났다(Sharma et al., 2016). 따라서, CLDN9는 폐암 전이의 촉진에 있어서 필수적 역할을 할 수 있다(Sharma et al., 2016). CLDN9는 자궁경부암 조직에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Zhu et al., 2015a). CLDN9 발현은 자궁경부 암종의 림프관 전이와 상관관계가 있는 것으로 관찰되었다(Zhu et al., 2015a). CLDN9는 뇌하수체 호산성세포종에서 가장 유의하게 변형되고 상향조절된 유전자이며 비침윤성 호산성세포종에 비해 침윤성 세포주에서 발현 수준이 더 높은 것으로 기술되었다(Hong et al., 2014). 따라서, CLDN9는 침윤성 뇌하수체 호산성세포종에 대한 중요한 바이오마커일 수 있다(Hong et al., 2014). 위 선암종 세포주 AGS에서 CLDN9의 과발현은 침윤 가능성, 세포 이동 및 증식률을 강화시키는 것으로 나타났으며, 이에 따라 위 선암종 세포주의 종양 형성 성질을 강화하기에 충분하다(Zavala-Zendejas et al., 2011). 강력한 CLDN9 발현은 장형에 비해 미만성 유형의 위 선암종에서 더 높은 사망률과 연관있는 것으로 나타났으며 그 검출은 "장형" 및 "미만성 유형" 위 선암종에서 유용한 예후 표지자로서 기술되었다(Rendon-Huerta et al., 2010).
CLEC5A mRNA 발현은 건강한 공여자의 대식세포 및 과립구에 비해 원발성 급성 골수성 백혈병 환자에서 유의하게 더 낮은 것으로 나타났다(Batliner et al., 2011). CLEC5A는 단핵구/대식세포 및 과립구에서 종양 억제인자 PU.1의 새로운 전사적 표적으로서 기술되었다(Batliner et al., 2011).
DCP2는 메토트렉세이트 내성 인간 결장암 세포에서 2배 이상 차등적으로 발현되는 miR-224 표적으로 식별되었다(Mencia et al., 2011).
DCSTAMP 발현은 유두상 갑상선암에서 증가된다(Lee et al., 2009b; Kim et al., 2010b). DCSTAMP의 하향조절은 MCF-7 세포의 집락 형성의 감소를 초래하는데 이는 증식 및 세포 주기 진행의 감소 및 세포자멸사의 증가 때문일 것이다(Zeng et al., 2015). DCSTAMP는 말초 대식세포에서 과발현되며, 수지상 세포와 골수종 혈장 세포는 DCSTAMP에 대해 높은 감수성을 보이며 파골세포로 교차분화할 수 있다. 암 줄기 세포 표현형 및 높은 전이 능력을 발현하는 악성 혈장 세포는 ERK1/2 인산화 및 골 흡수 활성도의 개시를 초래하는 베타3 전사 경로를 활성화시키는 파골세포 표지자를 발현한다(Silvestris et al., 2011). 에스쿨레틴 및 파테놀라이드는 c-Fos 및 활성화된 T 세포 c1 신호전달 경로의 핵 인자를 억제하여, 파골세포 분화에 대한 표지자 유전자인 DCSTAMP의 억제를 초래한다(Ihn et al., 2015; Baek et al., 2015; Cicek et al., 2011; Courtial et al., 2012; Kim et al., 2014a).
DENND1B에서 SNP는 췌장암 위험과 유의하게 연관이 있었다(Cotterchio et al., 2015).
DNAH17은 DNEL2로도 알려져 있으며 흑색종 환자에서 식별된 종양-항원에 대해 상동성인 것으로 기술되었다(Ehlken et al., 2004). DNAH17은 산발성 유방 및 난소 종양형성 및 보통염색체 우성 질환인 유전적 신경통 근위축증 및 각화과다증에서 식도암과 연관된 작은 염색체 간격에 매핑된 여러 후보 유전자 가운데 하나로 기술되었다(Kalikin et al., 1999).
DNAH2는 10% 초과의 환자에서 돌연변이되는 하나의 유전자이다(Mason et al., 2015). DNAH2와 같은 미세관 연관 단백질을 코딩하는 유전자는 CpG 섬 메틸화 표현형 양성 투명 신세포 암종에서 10% 이상의 유전적 이상의 발생률을 나타냈다(Arai et al., 2015).
DNMT3B 억제에 의한 메틸화 침묵 종양 억제인자 유전자의 재발현이 암에 대한 효과적인 전략으로 출현했다(Singh et al., 2013).
FAM83B mRNA 발현은 정상 폐 또는 선암종보다 편평세포 암종에서 유의하게 더 높았으며, 이에 따라서 FAM83B는 진단 및 예후에 대한 새로운 바이오마커이다(Okabe et al., 2015). FAM83B는 CRAF/MAPK 신호전달의 활성화 및 외피세포 형질전환의 주도에 관여하는 종양유전자로 식별되었다. 상승된 발현은 종양 등급 상승과 전체 생존 기간 감소와 연관이 있다(Cipriano et al., 2014). 상승된 FAM83B 발현은 PI3K/AKT 신호전달 경로를 활성화시키며 PI3K, AKT 및 mTOR 억제제에 대한 감소된 민감도를 부여한다(Cipriano et al., 2013).
유전적 돌연변이에 기인한 FANCD2의 하향조절 또는 기능장애는 유방암, 급성 림프구성 백혈병, 고환 정상피종을 포함한 여러 암 유형에서 보고되었으며 암의 발생과 관련이 있다. 이와는 달리 FANCD2의 재발현 및 상향조절 또한 신경아교종 및 대장암에서 종양 진행 및 전이와 관련있는 것으로 나타났다(Patil et al., 2014; Shen et al., 2015a; Shen et al., 2015b; Ozawa et al., 2010; Rudland et al., 2010; Zhang et al., 2010a; Smetsers et al., 2012). PI3K/mTOR/Akt 경로는 DNA 손상 반응으로 ATM/Chk2 관문을 유도하는 FANCD2를 촉진하며, 단일 유비퀴틴화된 FANCD2는 종양 억제인자 TAp63의 전사를 활성화시킨다(Shen et al., 2013; Park et al., 2013).
FOXJ1 발현은 투명 신세포 암종 환자에서 상향조절되고 종양 병기, 조직학적 등급 및 크기와 연관이 있으며 또한 예후와 상관관계가 있다(Zhu et al., 2015b). 감소된 FOXJ1 발현은 임상 병기, 림프절 전이 및 원위 전이와 유의하게 상관관계가 있으며, 더 낮은 FOXJ1 발현은 위 암종에서 더 짧은 생존 기간을 독립적으로 예측했다(Wang et al., 2015c). FOXJ1의 과발현은 간세포 암종에서 종양 세포 증식 및 세포 주기 전이를 촉진시킬 수 있으며 조직학적 등급 및 불량한 예후와 연관이 있다(Chen et al., 2013).
높은 GINS2 전사체 수준은 유방암 환자에서 유암 줄기 세포를 통해 불량한 예후를 예측하며 높은 조직학적 등급 및 내분비 요법 내성과 상관관계가 있다(Zheng et al., 2014). GINS2는 폐 선암종에서 높은 수준으로 존재하며 TNM 병기와 연관있는 것으로 보고되었다(Liu et al., 2013b). GINS2는 유방암, 흑색종 및 간 암종과 같은 다수의 악성 고형 종양에서 풍부하게 및 비정상적으로 발현된다. 더욱이 GINS2의 과발현은 백혈병 세포주의 증식을 촉진할 수 있다(Zhang et al., 2013a).
GPR98 발현은 정상 조직에 비해 원발성 신경내분비 종양에서 증가된다(Sherman et al., 2013). GPR98은 다형성 아교모세포종의 생존 기간과 연관있는 유전자 중 하나이다(Sadeque et al., 2012). GPR98은 세포자멸사의 유도를 초래하므로 급성 림프모구성 백혈병의 치료에 사용되는 글루코코르티코이드에 의해 조절되는 전사체를 표시한다(Rainer et al., 2012).
GTPBP10은 아교모세포종에서 복제수 변이, 유전자 표현 및 환자 결과와 고도의 상관관계가 있다(Kong et al., 2016).
GTSE1 발현은 세포자멸사 신호전달을 억압하며 위암 세포에서 시스플라틴 내성을 부여한다(Subhash et al., 2015). GTSE1은 자궁 평활근육종(ULMS)에서 과발현되며 세포 주기 조절에 참여했다.
H2BFS는 저위험 급성 림프모구성 백혈병 하위군과 연관있는 유의한 클러스터로서 일관성 있게 발현되었다(Qiu et al., 2003).
HIST1H2BJ는 뇌 종양에서 하향조절되는 것으로 나타났으며 진단이나 예후 가치가 있는 분자 표지자의 개발에 잠재적으로 유용한 것으로 기술되었다(Luna et al., 2015).
HISTH4A의 아세틸화는 태아의 신장암(윌름 종양)을 비활성화하는 잠재적 표적일 수 있다(Yan-Fang et al., 2015).
HIST1H4C는 치료 관련 골수성 백혈병의 발병에 대한 위험 구별 인자로서 작용할 수 있다(Bogni et al., 2006).
HIST1H4F는 전립선암에서 과메틸화되는 것으로 관찰되었으며, 이는 전립선암 환자의 노화와도 상관관계가 있을 수도 있다(Kitchen et al., 2016).
HIST1H4K의 높은 메틸화 비율은 고등급의 비근육 침윤성 방광암 및 전립선암에서 관찰되었으며, 이에 따라 잠재적인 바이오마커임을 나타낸다(Payne et al., 2009; Kachakova et al., 2013).
HIST1H4L은 ERG+ 전립선 암종에서 유의하게 상향조절되는 것으로 나타났다(Camoes et al., 2012). HIST1H4L은 히스톤 H4 계열의 구성원인 복제 의존 히스톤 클러스터 1인 H4l을 코딩한다(RefSeq, 2002).
HIST2H4B는 현재 항암 종양살상제로서 임상 시험 중인 레오바이러스 아형에 감염된 세포에서 주요 세포 병원체 경로의 새로운 단백질로 식별되었다(Berard et al., 2015).
HIST4H4는 변이체 d9-E-카드헤린을 발현하는 세포를 특이적으로 표적하는, 알파방출제 및 단클론 항체 d9MAb로 구성된 면역 접합체를 사용한 위암 치료 후 연속적 하향조절을 보이는 유전자 중 하나였다(Seidl et al., 2010). 히스톤 H4 계열의 다른 구성원의 과메틸화는 I기 비소세포 폐암에서 더 짧은 무재발 생존 기간과 유의하게 연관이 있었다(Sandoval et al., 2013).
HIVEP1은 림프종 세포주에서 인간 T-림프친화 바이러스 1형에 의해 방해받는 세포 유전자로서 식별되었다(Cao et al., 2015). HIVEP1은 만성 림프구성 백혈병에서 불리한 11q 결손 및 불리한 비네(Binet) B 및 C 단계와 연관이 있었다(Aalto et al., 2001).
HNRNPH2는 췌장암, 간암 및 위암 등의 여러 암 유형에서 상향조절된다(Honore et al., 2004; Zeng et al., 2007). HNRNPH2는 hTERT의 베타 결손 전사체의 스플라이싱에 관여하며, 이것은 암 세포에서 고도로 발현되고 경쟁하여 그에 따라 내인성 텔로머라제 활성을 억제한다(Listerman et al., 2013).
HOXD11은 세포주 및 환자 종양 샘플에서 현저하게 높은 수준을 보이는 두경부 편평세포 암종에서 탈조절된다. HOXD11의 녹-다운은 침윤을 감소시켰다(Sharpe et al., 2014). HOXD11은 구강 편평세포 암종에서 유의하게 상향조절된다(Rodini et al., 2012). HOXD11은 인간 유방암에서 이상 메틸화된다(Miyamoto et al., 2005). HOXD11 유전자는 t(2;11) (q31;p15)가 있는 급성 골수성 백혈병에서 NUP98 유전자에 융합된다(Taketani et al., 2002).
ICOS는 T 세포상에서 예정 세포사-1(PD-1)의 리간드로서 작용하고 암 세포의 면역 회피를 유도하며 또한 암 세포에 대한 항세포자멸사 영향을 매개하는 수용체로서 작용한다(Yang et al., 2015c). 쥐 종양 모델은 종양 성장 동안 ICOS가 관여하는 복수의 면역 관문 표적화에 대한 유의한 지원을 제공했다(Leung and Suh, 2014). ICOS+ 세포 침윤은 유해한 환자 예후와 상관관계가 있어, ICOS가 암 면역요법에 대한 새로운 표적으로 식별된다(Faget et al., 2013). ICOS는 시험관내 및 생체내 모두에서 담관암종에 대한 시토카인 유도 살해 세포의 세포 독성 효과를 강화시킬 수 있다(He et al., 2011).
IFNG의 종양내 발현은 인간 흑색종에서 MHC 클래스 II 분자의 발현 및 더 공격적인 표현형과 연관있는 것으로 나타났다(Brocker et al., 1988). 자가분비 IFNG 신호전달은 IFNG 유전자의 형질감염 유선 선암종 세포의 실험적인 전이 능력을 강화시키는 것으로 나타났으며, NK 세포에 대한 내성 증가에 기인하였다(Lollini et al., 1993).
삼중 음성 유방암은 불량한 예후의 표지자와 연관있는 IGFBP3의 높은 종양 발현을 갖는다(Marzec et al., 2015). IGFBP3에 특이적으로 결합하는 새로운 세포 살해 수용체가 식별되었으며 유방암 치료에 사용될 수 있다(Mohanraj and Oh, 2011). IGFBP3은 시험관내에서 생존 촉진(pro-survival) 및 성장 촉진 성질을 나타낸다(Johnson and Firth, 2014). IGFBP3은 요로상피 세포 암종의 재발에 대한 독립적 표지자이다(Phe et al., 2009).
IGFBPL1은 인슐린 성장 인자의 조절인자이며 유방암 세포주에서 이상 과메틸화에 의해 하향조절된다. IGFBPL1에서 메틸화는 더 불량한 전체 생존 기간 및 무질병 생존 기간과 명백한 연관이 있었다(Smith et al., 2007).
IGFLR1은 대장암에서 돌연변이된다(Donnard et al., 2014). IGFLR1은 종양 괴사 인자 수용체 계열과 구조적 유사성을 갖는다(Lobito et al., 2011).
IL4I1 단백질 발현은 종양에서 매우 빈번하다. IL4I1은 여러 종양 객체의 종양-연관 대식세포에서, 림프종의 종양 세포에서 및 드문 경우에 주로 고형 암 중피종에서 검출되었다(Carbonnelle-Puscian et al., 2009). 인간 Th17 세포에서 IL4I1 상향조절은 IL-2 촉진인자의 활성화에 관여하는 분자 경로의 차단에 의해 및 높은 수준의 Tob1 유지에 의해 T 세포 수용체(TCR) 매개 확장을 제한하며, 이것은 세포 주기로의 진입을 손상시킨다(Santarlasci et al., 2014).
IQGAP3은 폐암에서 과발현되며 종양 세포 성장, 이동 및 침입과 연관이 있다. 더욱이, 이것은 간세포 암종에서 염색체 증폭에 의해 상향조절되고, IQGAP3의 발현은 생존율이 불량한 p53-변이 대장암 환자에서 증가한다(Katkoori et al., 2012; Yang et al., 2014b; Skawran et al., 2008). IQGAP3은 EGFR/Ras/ERK 신호전달 연쇄반응을 조절하고 Rac/Cdc42와 상호작용한다(Yang et al., 2014b; Kunimoto et al., 2009).
정상적인 배양 멜라닌 세포 및 비전이성 흑색종 세포주에 비해 고도로 침습성 및 전이성의 흑색종 세포주에서 상승된 수준의 ITGA2가 발견되었다(van Muijen et al., 1995). 유착 분자 ITGA2는 흑색종 세포에서 IFN-감마, TNF-알파 및 IL-1-베타에 의해 상향조절되었다(Garbe and Krasagakis, 1993). ITGA2를 발현하지 않는 인간 횡문근육종으로의 ITGA2 형질감염은 다양한 장기에서 전이 빈도를 강화시켰다(Matsuura et al., 1995).
KCNU1은 유방암에서 복잡한 염색체 재정렬에 빈번히 관여하는 영역의 염색체 8p 상에 위치한다(Gelsi-Boyer et al., 2005). KCNU1은 소아 암 샘플의 간모세포종에서 상위 25개의 과발현된 세포의 막 단백질 중 하나이다(Orentas et al., 2012).
KIAA0226L은 자궁경부암에서 종양 억제인자 유전자로서 사료되며 과메틸화된다. KIAA0226L의 재활성화는 세포 성장, 생존력 및 집락 형성 감소를 초래한다(Huisman et al., 2015; Eijsink et al., 2012; Huisman et al., 2013). KIAA0226L의 메틸화 패턴은 전구 병변과 정상 자궁경부암을 구별하는데 사용될 수 있다(Milutin et al., 2015). KIAA0226L의 메틸화 패턴은 자궁경부암의 특이적 바이오마커로서 사용할 수 없다(Sohrabi et al., 2014). KIAA0226L의 재활성화는 그 촉진인자 영역을 부분적으로 탈메틸화하며 또한 억압적 히스톤 메틸화를 감소시킨다(Huisman et al., 2013).
KIAA1244 과발현은 유방암 세포의 호르몬 관련 성장에서 에스트로겐/ER알파 신호전달 경로의 활성화를 야기시키는 중요한 기전 중 하나이다(Kim et al., 2009). KIAA1244와 PHB2 사이의 상호작용 억제는 내강형 유방암의 치료를 위한 새로운 치료 전략일 수 있다(Yoshimaru et al., 2013).
KIAA1524는 단백질 인산분해효소 2A(CIP2A)의 암성 억제인자를 코딩한다. CIP2A의 중대한 역할은 NSCLC, HCC, HNSCC, 방광암, 췌장암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 난소암, 대장암 등에 대해서 나타났다(Ventela et al., 2015; Ma et al., 2014; Guo et al., 2015b; Rincon et al., 2015; Guo et al., 2015c; Wu et al., 2015; Peng et al., 2015; Lei et al., 2014; Liu et al., 2014c; Farrell et al., 2014; Fang et al., 2012; He et al., 2012; Bockelman et al., 2012).
KIF18A는 간세포암에서 과발현되는 것으로 나타났으며 이는 유의하게 더 짧은 무질병 생존 기간 및 전체 생존 기간과 상관관계가 있었다. 따라서, KIF18A는 간세포암 진단의 바이오마커 및 외과적 절제 후의 무질병 생존 기간 및 전체 생존 기간의 독립적 예측인자일 수 있다(Liao et al., 2014). KIF18A 발현은 윤활막 육종의 특이적 아형에서 상향조절된다(Przybyl et al., 2014). 에스트로겐은 유방암에서 KIF18A 발현을 강력히 유도하며, 이것은 증식의 증가 및 세포자멸사의 감소와 연관이 있다(Zou et al., 2014).
KIF20A의 과발현은 췌관 선암종, 흑색종, 방광암, 비소세포 폐암 및 담관세포 암종에서 검출되었다(Imai et al., 2011; Yamashita et al., 2012; Stangel et al., 2015). 최근에, KIF20A 유래 펩티드로 백신접종을 받은 췌관 선암종 환자들이 대조군에 비해 더 양호한 예후를 보였다고 보고되었다(Asahara et al., 2013). 또한, KIF20A의 침묵은 췌장암 세포주의 증식, 기동성 및 침윤의 억제를 초래했다(Stangel et al., 2015).
유방암에서 KIF26B의 높은 발현은 불량한 예후와 연관이 있다(Wang et al., 2013c). KIF26B 상향조절은 CRC 종양 조직 및 짝지어진 주위의 정상 점막을 분석한 결과 종양 크기와 유의하게 상관관계가 있었다. KIF26B는 대장 발암에서 중요한 역할을 하며 CRC에 대한 새로운 예후 지표 및 잠재적 치료 표적으로서 기능한다(Wang et al., 2015d).
KIF2C는 종양 세포의 방향적 이동 및 침습에 관여하는 것으로 나타났다(Ritter et al., 2015). KIF2C의 과발현은 위암 및 대장암에서 림프관 침습 및 림프절 전이와 연관있는 것으로 나타났다(Ritter et al., 2015). KIF2C는 구강 설암에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Wang et al., 2014a). KIF2C의 높은 발현은 구강 설의 편평세포 암종에서 림프절 전이와 종양 병기와 연관있는 것으로 나타났다(Wang et al., 2014a). KIF2C의 침묵은 인간 구강 편평세포 암종 세포주인 Tca8113의 억제된 증폭 및 이동을 초래하는 것으로 나타났다(Wang et al., 2014a). KIF2C의 돌연변이는 대장암과 연관있는 것으로 기술되었다(Kumar et al., 2013).
KIFC1은 형성된 중심체(정상 또는 과잉 중심체)의 수와는 비의존적으로, 적절한 방추 조립체, 안정된 극 초점화 및 암 세포의 생존에 필수적인 것으로 나타났다. KIFC1 발현은 유방암, 특히 에스트로겐 수용체 음성, 프로게스테론 수용체 음성 및 3중 음성 유방암 및 8가지 인간 유방암 세포주에서 상향조절되는 것으로 나타났다. 에스트로겐 수용체 양성 유방암 세포에서, KIFC1은 그 발현이 에스트로겐에 의해 강력히 유도되는 19가지 키네신 중 하나였다. 유방암에서, KIFC1의 과발현 및 그 핵 축적은 조직학적 등급과 상관관계가 있으며 불량한 무진행 생존 기간 및 전체 생존 기간을 예측하는 것으로 나타났다. 유방암 세포주에서 KIFC1의 과발현은 도세탁셀에 대한 내성을 매개하는 것으로 나타났다. KIFC1 침묵은 유방암 세포의 생존력에 부정적으로 영향을 미쳤다(Zou et al., 2014; Pannu et al., 2015; De et al., 2009; Li et al., 2015b). KIFC1은 난소암에서 과발현되는 것으로 나타났으며 이는 종양의 공격성, 진행성 종양 등급 및 병기와 관련이 있었다. KIFC1은 원발성 NSCLC 종양에서 그 발현 증가로 인해 뇌 전이의 발생 위험의 증가를 표시하는 세 유전자 중 하나로 확인되었다(Grinberg-Rashi et al., 2009).
KL은 자궁경부암에서 상피에서 중간엽으로의 전이를 억제하며, 인슐린/IGF1, p53/p21 및 Wnt 신호전달의 억제에 의해 여러 유형의 인간 암에서 종양 억제인자로서 기능하는 종양 억제인자로 기술되었다(Xie et al., 2013; Qureshi et al., 2015). KL은 유방암, 폐암, 간세포 암종 등 다수의 암에서 이상 발현되는 유전자로서 기술되었다(Zhou and Wang, 2015). KL은 췌장암, 간세포 암종 및 기타 종양에서 하향조절되는 것으로 기술되었다(Zhou and Wang, 2015). KL은 하향조절이 암 세포의 증식 촉진과 세포자멸사 감소을 초래하는 것으로 기술된 암에 대한 새로운 바이오마커로서 기술되었다. 이러한 맥락에서 Wnt/β-카테닌 신호전달은 여러 관련있는 신호전달 경로 중 하나이다(Zhou and Wang, 2015). KL 유전자 다형태는 대장암의 위험 증가와 연관있는 것으로 나타났다(Liu et al., 2015).
KLHDC7B는 자궁경부 편평세포 암종과 연관이 있으며, 자궁경부 편평세포 암종에 대한 잠재적 바이오마커이다(Guo et al., 2015a).
KLHL 유전자는 여러 멘델 질환(Mendelian disease)에 대한 책임이 있으며 암과 연관되었다(Dhanoa et al., 2013).
KRT31의 국소성 발현은 손발톱 기질 각질세포가 출처인 침습성 종양세포 암종에서 관찰되었다(Wang et al., 2015e). 모기질세포종은 모낭 기질 세포의 분화를 모방하는 종양이며, KRT35 및 KRT31 케라틴의 순차적 과발현과 더불어 피질 분화를 나타낸다(Battistella et al., 2014).
KRT35는 모기질세포종에서 가장 빈번하게 및 가장 강력하게 발현되는 모발 케라틴 중 하나였다. 모기질세포종은 모낭 기질 세포의 분화를 모방하는 종양이며, KRT35 및 KRT31 케라틴의 순차적 과발현과 더불어 피질 분화를 나타낸다(Battistella et al., 2014).
LCTL의 녹-다운은 hTERT가 인간 결장 상피 세포를 무한증식하도록 허용했다(Kim et al., 2011).
연구자들은 RNA 간섭 또는 우성 음성 돌연변이체에 의한 LRBA 발현의 억제가 암 세포의 성장 억제를 초래했음을 관찰했다. 이러한 발견 사항은 LRBA의 탈조절된 발현이 암 세포의 성장 성질의 변형에 기여함을 시사한다(Wang et al., 2004).
LRRC8E는 골육종 및 신경모세포종 조직에서 정상 샘플에 비해 과발현된다(Orentas et al., 2012).
LTA 다형태는 암 위험의 증가에 기여했다(Huang et al., 2013a). LTA와 같은 골 흡수 인자는 특정한 고형 및 혈액 암에 의해 생성되며 종양 유도 고칼슘혈증에도 연루되었다(Goni and Tolis, 1993). LTA와 LT베타R 신호전달 축과 암 사이에 연계가 존재한다(Drutskaya et al., 2010). B 세포 유래 림프독소는 거세 저항성 전립선암을 촉진시킨다(Ammirante et al., 2010).
MACC1은 위암, 대장암, 폐암 및 유방암 등 다수의 암 객체에서 과발현되며, 환자의 암 진행, 전이 및 불량한 생존 기간과 연관이 있다(Huang et al., 2013b; Ma et al., 2013a; Stein, 2013; Wang et al., 2015b; Wang et al., 2015h; Ilm et al., 2015). MACC1은 베타-카테닌의 표적 및 PI3K/AKT 신호전달 경로를 통한 암 형성을 촉진시키며, 이는 c-Met 및 베타-카테닌 및 c-Myc, 사이클린 D1, 카스파제9, BAD 및 MMP9 등 이들의 하류 표적 유전자의 증가를 초래한다(Zhen et al., 2014; Yao et al., 2015).
MAGEA10은 선천성 각화부전증과 같은 일부 유전 질환에 연루되는 MAGE 계열 구성원인 A10을 코딩한다(RefSeq, 2002). 모두 세포독성 T 림프구 반응의 표적으로 알려진 MAGEA10 및 2개의 다른 암 고환 항원에 대한 백신에 의해, 유방암의 3분의 2 이상이 해당되게 된다(Taylor et al., 2007). MAGEA10은 간세포 암종 환자의 종양 조직 가운데 36.7%에서 발현되었지만; 암 주위 조직에서는 발현되지 않았다(Chen et al., 2003). MAGEA10은 79개의 폐암 조직의 14%에서 발현되었다(Kim et al., 2012).
MAGEB6은 고환을 제외한 정상 조직에서는 발현되지 않는, 새로운 MAGE 유전자로 식별되었으며 조직학적 출처가 다른 종양들에서 발현되었다(Lucas et al., 2000). MAGEB6은 두경부 편평세포 암종에서 빈번히 발현되는 것으로 나타났으며 mRNA 양성은 불량한 결과에 대해 인식되는 임상적 특징과 유의한 연관성을 제시했다(Zamuner et al., 2015).
MCC는 베타-카테닌과 상호작용하며 대장암 세포에서 MCC의 재발현은 Wnt 신호전달을 특이적으로 억제시킨다(Fukuyama et al., 2008). MCC 유전자는 대장암에서 이형접합성(LOH)의 소실이 빈번한 영역에서는 염색체 5상의 선종성 폴립증 결장 유전자와 밀접한 연관이 있다(Kohonen-Corish et al., 2007). MCC 유전자의 LOH는 위암, 폐암, 식도암 및 유방암에서 조기 및 진행 병기 모두에서 찾아볼 수 있다(Wang et al., 1999a; Medeiros et al., 1994).
MET는 역분화 지방육종에서 상향조절된 것으로 나타났으며, 멜라닌세포성 종양, 간세포 암종, 비소세포 폐암, 유전성 유두상 신장암 및 위 선암종과 연관이 있다(Petrini, 2015; Finocchiaro et al., 2015; Steinway et al., 2015; Bill et al., 2015; Yeh et al., 2015).
구강 편평세포 암종에서의 MMP10 발현은 강력했으며 사마귀모양 암종에서는 중간 정도였다(Kadeh et al., 2015). MMP10은 기질 유래 인자인 1/C-X-C 케모카인 수용체 4축과의 신규 누화에서의 간암 발생에 기여한다(Garcia-Irigoyen et al., 2015). 헬리코박터 파일로리균 감염은 MMP10의 발현 증가를 통해 위암의 침습 및 전이를 촉진시킨다(Jiang et al., 2014a). MMP10은 자궁경부 종양에서 혈관형성 및 세포자멸사 경로의 조절을 통해 종양 진행을 촉진시킨다(Zhang et al., 2014).
수술전 MMP-13의 상승된 수준은 식도 편평세포 암종 환자에서 종양 진행 및 불량한 생존 기관과 연관있는 것으로 나타났다(Jiao et al., 2014). PAI-1은 miR-143의 표적 유전자로서 인간 골육종 세포에서 MMP-13 발현 및 분비의 강화를 통해 침습 및 폐 전이를 조절하며, 이는 이 분자가 골육종 환자에서 폐 전이의 방지를 위한 가능한 치료 표적일 수 있음을 시사한다(Hirahata et al., 2016). MMP13은 구강 편평세포 암종(OSCC)의 전악성 상태로 분류된 구강 편평태선(OLP)에서 이미 상향조절된다(Agha-Hosseini and Mirzaii-Dizgah, 2015). MMP-13은 골모 유사 세포의 재생에서 잠재적으로 고유한 생리학적 역할을 수행한다(Ozeki et al., 2016).
MUC5AC는 대장암, 위암, 폐암 및 췌장암 등을 포함하여 다양한 암 유형에서 탈조절된다. 대장 및 위 종양에서 결손 또는 낮은 발현은 보다 더 공격적인 거동과 불량한 예후와 관련이 있다. 폐암에서의 과발현은 재발과 전이의 가능성 증가를 초래한다(Yonezawa et al., 1999; Kocer et al., 2002; Kim et al., 2014b; Yu et al., 1996).
MUC5B는 대장암, 폐암, 유방암 등을 포함한 여러 암 객체에서 과발현되며 종양 진행과 관련이 있다(Sonora et al., 2006; Valque et al., 2012; Walsh et al., 2013; Nagashio et al., 2015). MUC5B는 메틸화의 영향 하에서 억압될 수 있으며, ATF-1, c-Myc, NF카파B, Sp1, CREB, TTF-11 및 GCR에 의해 상향조절될 수 있다(Perrais et al., 2001; Van, I et al., 2000).
MUC6의 유전 변이체는 위암 발생의 위험을 변형시키는 것으로 보고되었다(Resende et al., 2011). 타액선 종양에서 MUC6의 발현 패턴은 조직병리학적 종양 유형과 매우 긴밀하게 상관관계가 있는 것으로 나타나며, 진단 정확성의 개선을 위한 사용가능성을 나타낸다(Mahomed, 2011). 연구 결과에 의하면 유방암 조직에서는 비암성 유방 조직과 비교할 때 MUC6의 차등적 발현이 확인되었다(Mukhopadhyay et al., 2011).
중국에서의 한 연구에 의하면 비소세포 폐암에서 MXRA5가 두 번째로 가장 빈번하게 변이되는 유전자로 확인되었다(Xiong et al., 2012). 결장암에서, MXRA5는 과발현되는 것으로 나타났으며 조기 진단 및 그물막 전이에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다(Zou et al., 2002; Wang et al., 2013a).
MYB는 여러 돌연변이를 거쳐 종양유전자 형질전환 단백질로의 전환이 가능하다(Zhou and Ness, 2011). MYB는 종양유전자로 알려져 있으며 사이클로옥시게나제-2, Bcl-2, BclX(L) 및 c-Myc와 같은 주요 표적 유전자의 발현 조절에 의한 세포자멸사, 세포 주기 제어, 세포 성장/혈관 형성 및 세포 유착과 연관이 있다(Ramsay et al., 2003; Stenman et al., 2010). 종양유전자 융합 단백질 MYB-NFIB 및 MYB 과발현은 타액선 및 유방의 선양 낭포암, 소아 미만성 신경아교종, 급성 골수성 백혈병 및 췌장암에서 발견된다(Wallrapp et al., 1999; Pattabiraman and Gonda, 2013; Nobusawa et al., 2014; Chae et al., 2015; Marchio et al., 2010). Wnt 신호전달 동안 MYB 및 베타-카테닌 사이의 상승작용에 의해, MYB는 결장 종양 형성과 연관이 있다(Burgess et al., 2011). MYB는 에스트로겐 신호전달의 직접적 표적이므로 ER 양성 유방 종양에 대해 항-MYB 요법이 고려된다(Gonda et al., 2008).
N4BP2는 비인두 암종의 발병에서 잠재적 역할을 한다. 산발성 비인두 암종의 위험과 상관관계가 있는 2개의 다른 일배체형 블록(haplotype block)에 통계적으로 의의있는 차이가 있다. 더욱이, N4BP2는 상응하는 정상 조직에 대해 이러한 종양 조직에서 과발현된다(Zheng et al., 2007).
12,518건의 전립선암 사례에 대한 다병기 환자군(case-only) 게놈 전체 연관 연구에서, NAALADL2는 질병 공격성의 병리학적 측정치인 글리슨 점수와 연관있는 유전자 자리로서 식별되었다(Berndt et al., 2015). NAALADL2는 전립선암 및 결장암에서 과발현되며 불량한 생존 기간과 연관있는 이동 촉진(pro-migratory) 및 전이 촉진(pro-metastatic) 표현형을 촉진시킨다(Whitaker et al., 2014).
NCAPG는 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병 및 혈액의 백혈병 세포나 골수종 세포의 환자에서 하향조절된다(Cohen et al., 2014). NCAPG는 대장암에서 다제 내성 유전자일 수 있다(Li et al., 2012a). NCAPG는 인간 세포 암종의 혐색소성 아형에서는 고도로 상향조절되지만 일반 인간 신장 세포 암종에서는 그렇지 않다(Kim et al., 2010a). NCAPG의 상향조절은 흑색종 진행과 연관이 있다(Ryu et al., 2007). NCAPG는 포도막 흑색종과 연관이 있다(Van Ginkel et al., 1998). NCAPG는 여러 종양 세포에서 다양한 발현을 나타낸다(Jager et al., 2000).
NRK는 배아 생성 후기에서 액틴 중합의 유도에 관여할 수 있는 JNK 활성화에 요구되는 단백질 키나제인 Nik 관련 키나제를 코딩한다(RefSeq, 2002). NRK는 c-Jun N-말단 키나제 신호전달 경로를 활성화하며, 코필린 인산화를 통한 골격근 세포에서 액틴 세포 골격 조직의 조절에 관여할 수 있다(Nakano et al., 2003).
NUP210은 대장암의 위험과 연관된 다형태를 보유하는 후보 유전자로서 나타났다(Landi et al., 2012). NUP210은 자궁경부암에서 상향조절되는 것으로 나타났으며 종양형성의 조기 단계에서 역할을 하는 것으로 시사되었다(Rajkumar et al., 2011).
ORC1은 전립선암 및 백혈병의 경우 종양 유래 세포주에서 과발현되는 것으로 나타났으며 바이오마커로 예측된다(Struyf et al., 2003; Zimmerman et al., 2013; Young et al., 2014). HBO1과 같은 히스톤 아세틸전이효소와 상호작용을 통해, ORC1은 유방암에서 종양유전자 기능을 가한다(Wang et al., 2010).
OSCP1의 2개 SNP에서 이종접합 돌연변이의 비운반체는 비바이러스성 간 암종에 대한 감수성의 바이오마커일 수 있다(Toda et al., 2014).
OVOL2는 전이의 감소를 초래하는 중간엽-상피 이행을 유도한다(Roca et al., 2013). OVOL2는 c-Myc 및 Notch1을 억제한다(Wells et al., 2009). OVOL2는 대장암에서 과메틸화되어 Wnt 신호전달 억제에 대한 무능력을 초래한다(Ye et al., 2016). OVOL2의 과발현은 세포 이동 및 침습을 감소시키고 상피-중간엽 이행의 표지자를 감소시키며 전이를 억제시켰다(Ye et al., 2016). OVOL2는 대장암에서 하향조절되며 종양 병기와 역으로 상관관계가 있다(Ye et al., 2016). OVOL2는 Wnt 신호전달 경로에 의해 조절된다(Ye et al., 2016).
OXTR은 원발성 소장 및 췌장 신경내분비 종양, 폐의 소세포 암종, 난소 암종 및 췌장암, 매개하는 세포 이동 및 전이에서 유의하게 과발현된다(Morita et al., 2004; Zhong et al., 2010; Carr et al., 2012; Carr et al., 2013; Pequeux et al., 2002). 그러나, OXTR1은 상피, 신경 또는 골 출처의 종양 세포의 증식에 대한 억제 효과도 소유하며 이는 막의 수용체 국소화에 의존하는 것으로 사료된다(Cassoni et al., 2004).
PAPPA는 NSCLC 및 간세포 암종과 같은 다양한 암 유형에서 발생하는 전이 관련 유전자를 나타내며, 성장(VEGF 및 IGF-I) 및 전사 인자(NF-카파B p50, NF-카파B p65, HIF-1알파)와 양적으로 상관관계가 있다(Salim et al., 2013; Iunusova et al., 2013; Engelmann et al., 2015). PAPPA는 유방암과 난소암 세포에서 IGF-1 신호전달 경로의 조절을 통해 유사분열을 조절하며 이는 원발성 부위에서 주로 발견된다(Boldt and Conover, 2011; Loddo et al., 2014; Becker et al., 2015; Iunusova et al., 2014).
PGAP1은 선암종 세포주 AsPC-1에서 하향조절된다(Yang et al., 2016).
PGR은 유방암의 개시 및 진행과 고도의 연관이 있으며, MAPK 및 PI3K/AKT 경로 및 성장 인자 수용체(GFR)의 발현을 활성화시킨다(Jaiswal et al., 2014; Piasecka et al., 2015). PGR(HER 및 에스트로겐 수용체 이외에)은 3가지 다른 유방암 아형의 구별을 돕는 분류 인자로서 작용한다(Safarpour and Tavassoli, 2015).
PLA2G7은 유방암, 난소암, 흑색종 및 전립선암 세포에서 지질 대사에 강력한 영향을 미치며, 그 효소의 차단은 암 발병성 저하를 초래한다(Vainio et al., 2011a; Massoner et al., 2013; Kohnz et al., 2015). PLA2G7은 전립선암과 고도의 연관이 있으므로 이러한 암 유형에 대한 잠재적 바이오마커를 나타낸다(Vainio et al., 2011b).
PPP3R1은 간세포 암종에서 상향조절되어 최대 10개의 다른 신호전달 경로에 영향을 준다(Zekri et al., 2008).
PRKDC는 자궁내막증-연관 난소암 및 유방암에서 빈번히 변이되는 유전자이다(Er et al., 2016; Wheler et al., 2015). PRKDC는 대장 암종에서 정상 조직에 비해 암성 조직에서 상향조절된다. PRKDC 발현이 높은 환자는 전체 생존 기간이 더 불량하다(Sun et al., 2016).
PSMA7T의 상향조절된 발현이 전이성 폐암, 거세 재발성 전립선암(CRPC) 및 원발성 대장암에서 발견되었으며, 이는 간 전이의 위험을 증가시킨다(Hu et al., 2008; Hu et al., 2009; Romanuik et al., 2010; Cai et al., 2010). 또한, PSMA7T의 양은 안드로겐/AR-매개 전립선 종양 성장에서 안드로겐 수용체(AR)의 전이활성과 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Ogiso et al., 2002).
PSMC1은 세포 성장에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났으며, 이에 따라 전립선암, 다발성 골수종 및 아교모세포종 세포에서 잠재적 항암 표적을 나타냈다(Dahlman et al., 2012; Kim et al., 2008).
RAD18은 DNA 손상 우회, 복제 후 복구는 상동성 재조합에서 잘 알려진 기능으로 인해 종양형성에 연루된다(Ting et al., 2010). RAD18 Arg302Gln 다형태는 대장암 및 비소세포 폐암의 위험과 연관이 있다(Kanzaki et al., 2008; Kanzaki et al., 2007). RAD18은 인간 신경아교종 세포에서 이온화 방사선에 대한 내성을 매개하며 RAD18의 녹-다운은 상동성 재조합 매개 복구를 방해하여, 이중가닥 절단의 누적 증가를 초래한다(Xie et al., 2014). 흑색종 조직 마이크로어레이를 사용하는 경우, 핵 RAD18 발현이 형성이상 모반에 비해 원발성 및 전이성 흑색종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Wong et al., 2012).
RAD51AP1은 방사선 노출된 유두상 갑상선과 연관있는 것으로 나타났다(Handkiewicz-Junak et al., 2016). RAD51AP1의 증폭은 난소암에서 세포 불멸 및 더 짧은 생존 기간과 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Sankaranarayanan et al., 2015). RAD51AP1은 종양 세포 및 조직에서 일상적으로 과발현되는 것으로 기술되었으며, RAD51AP1 기능의 방해는 표적 종양의 요법에서 유망한 접근방식임을 시사했다(Parplys et al., 2014). RAD51AP1 전사는 종양 억제인자 MEN1에 의해 직접 촉진되는 것으로 나타났다(Fang et al., 2013). RAD51AP1은 간내 담관암종, 인간 두경부의 유두종바이러스 양성 편평세포 및 산발성 유방 종양에 비해 BRCA1-결손 종양에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Martinez et al., 2007; Martin et al., 2007; Obama et al., 2008). RAD51AP1의 억제는 간내 담관암종에서 성장 억압을 초래하는 것으로 나타났으며, 간내 담관암종의 발병 및/또는 진행에 관여함을 시사한다(Obama et al., 2008).
RBM14의 녹-다운은 생체내 조사 후 다형태 아교모세포종의 재성장을 차단하는 것으로 나타났다(Yuan et al., 2014). RBM14는 신세포 암종에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Kang et al., 2008). RBM14는 인간 신장 세포에서 G(1)-S 전개를 억제하며 원암유전자 c-myc의 하향조절에 의해 부분적으로 부착 비의존성 성장 및 이종이식 종양 형성을 억압하는, 간세포 암종에서의 잠재적 종양 억제인자로서 기술되었다(Kang et al., 2008). RBM14는 PEA3 및 MCF7 인간 암 세포의 이동 강화 작용에 관여하는 것으로 나타났다(Verreman et al., 2011). RBM14 유전자는 비소세포 폐 암종, 편평세포 피부 암종 및 림프종 등 원발성 인간 암의 하위조합에서 증폭되는 것으로 나타났다(Sui et al., 2007).
RBM4는 다양한 암 세포의 증식 및 이동을 억제하는 전구 전령 RNA의 규제 스플라이싱 기전에 관여한다(Lin et al., 2014; Wang et al., 2014c). BBM4 활성도의 조절 곤란은 자궁경부암, 유방암, 폐암, 결장암, 난소암 및 직장암에서 나타났다(Liang et al., 2015; Markus et al., 2016).
간암 환자의 혈청 RCOR3 수준은 중등도의 만성 B형 간염 및 경증의 만성 B형 간염 환자에서의 수치보다 유의하게 더 낮았다(Xue et al., 2011).
위암에서 RFWD2의 하향조절은 불량한 예후와 상관관계가 있다(Sawada et al., 2013). RFWD2는 p27과 직접 상호작용하며, 이 상호작용의 탈조절은 종양 형성에 관여한다(Choi et al., 2015b; Choi et al., 2015a; Marine, 2012). RFWD2의 상향조절은 방광암, 위암 및 삼중음성 유방암에서 불량한 예후와 상관관계가 있다(Ouyang et al., 2015; Li et al., 2016; Li et al., 2012c).
RIF1은 인간 유방 종양에서 고도로 발현되며 DNA 복구에 요구되는 항세포자멸 인자를 코딩하고 암 치료의 잠재적 표적이다(Wang et al., 2009a). 게놈 무결성의 유지에서 RIF1의 역할은 염색질 구조, 복제 시기 및 S 내기(intra-S phase) 관문의 조절이 포함되도록 확장되었다(Kumar and Cheok, 2014).
내장 다중심 영아 근섬유종증의 진단을 받은 환자에서 RLTPR 유전자의 신규 동형집합 변이체가 식별되었다(Linhares et al., 2014).
RNF24는 식도 선암종에서 상향조절되는 것으로 나타났으며 바레트 식도에서 식도 선암종으로의 진행에서 중대한 역할을 한다(Wang et al., 2014b). RNF24는 구강 편평세포 암종에서 특정한 위험 요인에 따라 차등적으로 발현되는 것으로 나타났다(Cheong et al., 2009).
RPGRIP1L은 유사분열 관문 단백질 Mad2를 통해 부분적으로 고정-독립 성장을 억제하며, 인간 간세포 암종에서 후보 종양 억제제 유전자이다(Lin et al., 2009).
성숙한 생쥐의 간에서 Rtl1의 과발현은 고도로 침투성인 종양 형성을 초래했으며 RTL1의 과발현은 분석한 인간 간세포 암종 샘플의 30%에서 검출되었다(Riordan et al., 2013). 각인된 유전자 RTL1의 전사적 활성도를 32개 윌름 종양의 패널에서 평가했으며 정상 신장 조직에 비해 엄청난 과발현이 검출되었다(Hubertus et al., 2011).
SAPCD2(p42.3 또는 C9orf140이라고도 함)는 정상 위 점막에서는 발현되지 않고 위암에서 초기에 발현되는 것으로 발견된 단백질을 코딩한다(Xu et al., 2007). SAPCD2는 대장암, 위암, 간세포암 및 뇌암 등 여러 암 객체에서 과발현되며 SAPCD2의 높은 수준은 종양 진행과 연관이 있다(Sun et al., 2013; Weng et al., 2014; Wan et al., 2014). 위암의 단백질 규제망에서 SAPCD2 유전자의 최적 경로는 Ras 단백질, Raf-1 단백질, MEK, MAPK 키나제, MAPK, 튜불린, 방추 단백질, 중심체 단백질 및 종양이다(Zhang et al., 2012a; Weng et al., 2014).
두경부 편평세포 암종의 환자에서 SEMA3A의 더 낮은 발현은 더 짧은 전체 생존 기간과 상관관계가 있는 것으로 나타났으며 독립적 예후의 중요성이 있었다(Wang et al., 2016). 두경부 편평세포 암종의 세포주에서 SEMA3A의 과발현은 부분적으로 NF-kB 및 SNAI2의 억제에 기인하여 이동, 침습 및 상피에서 중간엽으로의 전이를 억제하는 것으로 나타났다(Wang et al., 2016). 따라서, SEMA3A는 두경부 편평세포 암종에서 종양 억제인자로서 역할하며 이 질병의 새로운 표적일 수 있다(Wang et al., 2016). SEMA3A 발현은 간세포 암종에서 전이와 유의하게 역의 연관이 있는 것으로 나타났다(Yan-Chun et al., 2015). SEMA3A는 전립선암, 유방암, 신경아교종, 상피 난소암종 및 위암 등 다수의 암 유형에서 하향조절되는 것으로 기술되었다(Jiang et al., 2015a; Tang et al., 2014). 낮은 SEMA3A 발현은 위암에서 불량한 분화, 혈관 침습, 침습의 깊이, 림프절 전이, 원격 전위, 진행성 TNM 병기 및 불량한 예후와 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Tang et al., 2014). SEMA3A는 위 발암에서 후보 종양 억제인자 및 잠재적 예후 바이오마커로서 기술되었다(Tang et al., 2014).
SERPINB10 유전자의 과오 변이는 전립선암의 위험 증가를 유도하는 종양형성 특징을 소유하는 것으로 나타났다(Shioji et al., 2005). 그 밖에 SERPINB10 발현은 전이성 유선 종양에서 유의하게 상향조절된다(Klopfleisch et al., 2010).
SLC16A14의 발현 수준은 상피 난소암에서 무진행 생존 기간과 유의하게 연관이 있으며 새로운 추정적 표지자를 제시한다(Elsnerova et al., 2016).
SLC18A1은 유리한 신경모세포종에 비해 불리한 그것에서 더 낮은 발현을 나타냈다(Wilzen et al., 2009).
SLC25A43은 유방암 세포주에서 잠정적 미토콘드리아 관문을 통해 세포 주기 진행 및 증식의 조절인자로서 식별되었다(Gabrielson et al., 2016). SLC25A43은 유방암 세포주에서 약물 노출 이후 약물 효능 및 세포 주기 조절에 영향을 미친다(Gabrielson and Tina, 2013).
SLC28A3은 췌관 선암종에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Mohelnikova-Duchonova et al., 2013). SLC28A3은 파클리탁셀과 젬시타빈 화학요법으로 치료한 전이성 유방암에서의 임상 결과, 젬시타빈으로 치료한 비소세포 폐암에서의 전체 생존 기간, 및 젬시타빈 기반 화학방사선 요법으로 치료한 췌장 선암종에서의 전체 생존 기간과 각각 관련이 있다(Li et al., 2012b; Lee et al., 2014b; Marechal et al., 2009). SLC28A3은 만성 림프구성 백혈병에서 플루다라빈 내성 및 T 세포 림프종에서 약물 내성과 각각 관련이 있다(Karim et al., 2011; Fernandez-Calotti et al., 2012).
SLC2A13은 구강 편평세포 암종 샘플의 일차 배양액의 구형성 세포에서 일관적으로 증가했으며, 동일초점 현미경에 의해 드러난 바에 의하면 SLC2A13 발현 세포가 종양 조직의 제한된 영역에 클러스터로서 포매되었으며 이는 SLC2A13이 암 줄기 세포의 잠재적 표지자가 될 수 있음을 시사한다(Lee et al., 2011). SLC2A13은 비소세포 폐암의 촉진 및 진행과 연관있는 유전자로서 식별되었다(Bankovic et al., 2010).
SLC35A1의 억제는 암 세포 시알산화를 절감시키고 암 세포의 전이 가능성을 감소시키는 것으로 나타났다(Maggioni et al., 2014).
SLC7A11은 W1 난소암 세포주의 약물 내성 변이체에서 하향조절되는 것으로 나타났으며, 이에 따라 암 세포의 약물 내성에서 역할을 할 수 있다(Januchowski et al., 2013). SLC7A11은 종양 미세환경을 조절하여 암의 성장 이점으로 이어지는 것으로 기술되었다(Savaskan and Eyupoglu, 2010). SLC7A11은 신경아교종에서 신경 퇴행성 과정에 관여하는 것으로 기술되었다(Savaskan et al., 2015). SLC7A11은 페롭토시스(ferroptosis)의 맥락에서 p53에 의해 억압되는 것으로 나타났으며, p53-SLC7A11 축은 p53(3KR) 돌연변이체에서 보전되는 것으로 기술되었으며, 고전적 종양 억제 기전의 부재 시 종양 형성을 억제하는 능력에 기여한다(Jiang et al., 2015b). SLC7A11은 공격성 유방암 세포에서 그 기능이 증가하는 시스템 Xc-의 기능적 아단위로 기술되었다(Linher-Melville et al., 2015). 시스플라틴 내성 방광암에서 SLC7A11에 대한 고도의 막 염색은 더 불량한 임상적 결과와 관련 있는 것으로 나타났으며, SLC7A11 억제는 이 질병의 치료를 위한 유망한 치료 접근방식으로 기술되었다(Drayton et al., 2014). SLC7A11은 벤젠과 그 대사물에 노출되었던 인간 전골수구성 백혈병 세포주 HL-60에서 차등적으로 발현되는 것으로 나타났으며, 이에 따라 SLC7A11과 백혈병 유발의 잠재적 관련성을 강조한다(Sarma et al., 2011). SLC7A11의 교란은 림프종, 신경아교종, 전립선암, 유방암 등을 포함하여 다양한 암종의 성장 억제를 초래하는 것으로 기술되었다(Chen et al., 2009). SLC7A11의 억제는 식도암 세포주 KYSE150에서 시험관내 세포 침습 및 누드 생쥐에서 그 실험적 전이를 억제하는 것으로 나타났으며, 이에 따라 종양 전이에서 SLC7A11의 역할을 확립한다(Chen et al., 2009).
SLCO5A1은 혈장 막에 위치하며 약물의 세포내 운반에 영향을 줌으로써 소세포 폐 암종의 화학내성에 기여할 수 있다(Olszewski-Hamilton et al., 2011). SLCO5A1은 전이성 소세포 폐암에서 가장 두드러진 유기성 음이온 수송 폴리펩티드이며, SLCO5A1의 mRNA 수준은 간 종양 및 유방암에서 고도로 증가된다(Kindla et al., 2011; Wlcek et al., 2011; Brenner et al., 2015). 구인두 편평세포 암종에서 유전자 융합은 SLCO5A1의 하향조절과 연관이 있다(Guo et al., 2016).
SP5는 대장암 세포주에서 베타 카테닌의 고갈 이후에 하향조절되었으며 Wnt 신호전달 경로에서 새로운 직접 하류 표적이다(Takahashi et al., 2005). SP5의 과발현은 드문 인간 췌장 종양에서 베타-카테닌 경로의 활성화를 나타냈다(Cavard et al., 2009). 탈조절된 Wnt 신호전달을 표시하는 인간 대장 암종 세포에서, 모넨신은 β-카테닌의 세포내 수준을 절감하여 SP5와 같은 Wnt 신호전달 표적 유전자의 발현의 증가 및 세포 증식률의 감소를 초래했다(Tumova et al., 2014).
STIL은 15개의 코르티솔 분비 부신피질 선종에서 복제수 변형 및 이형접합성의 복제수 중립 소실을 갖는 유전자에 속한다(Ronchi et al., 2012). 이 유전자와 주위의 유전자 자리를 융합시키는 염색체 결손은 T 세포 백혈병에서 흔히 발생하며 변칙 V-(D)-J 재조합 사건을 통해 발생하는 것으로 사료된다(Karrman et al., 2009; Alonso et al., 2012).
TBC1D7의 발현 상승은 대부분의 폐암에서 발견되었으며 면역조직화학적 염색은 TBC1D7 발현과 NSCLC 환자의 불량한 예후와의 연관을 시사했다(Sato et al., 2010). TBC7의 과발현은 TSC1의 유비퀴틴화를 강화시켰으며 mTOR 신호전달 경로에 위치한 S6 키나제에 의한 S6 단백질의 인산화를 증가시켰다(Nakashima et al., 2007).
TDG는 전사 인자 TCF4와의 상호작용을 통해 상호조절하는 방식으로 Wnt 신호전달 경로에 영향을 미치며 대장암의 잠재적 바이오마커인 것으로 사료된다(Xu et al., 2014). 반면에, TDG의 감소된 발현은 강력한 종양유전자의 특징을 통해 염기 절단 수리(BER) 경로 손상을 유도한다(van de Klundert et al., 2012). 단백질의 하향조절은 조기 유방암, 식도 편평세포 암종(ESCC) 및 위암에서 관찰되었다(Li et al., 2013; Du et al., 2015; Yang et al., 2015a).
가장 빈번하게 변이되는 네 유전자 중 하나는 원발성 CNS 림프종에서 단백질 변경 돌연변이를 보이는 TENM4였다(Vater et al., 2015). MDA-MB-175 세포주는 TENM4와 ErbB 계열의 수용체의 융합을 유도하는 염색체 전좌를 함유한다. 키메라 유전자는 신경모세포종에서 또한 발견되었다(Wang et al., 1999b; Boeva et al., 2013).
TET2는 그 기능의 부전이 혈액 악성 종양을 유도하는 조혈 줄기 세포 항상성에 대한 중대한 조절인자이다(Nakajima and Kunimoto, 2014). TET2 돌연변이는 급성 골수성 백혈병 환자의 예후에 부정적 영향이 있으며 위험이 적용된 치료 전략의 정당화에 도움이 될 수 있다(Liu et al., 2014b). TET2의 핵 국소화는 전이와 연관하여 대장암 조직의 유의한 부분에서 소실되었다(Huang et al., 2016).
TKTL1은 식도 편평세포 암종, 구강 편평세포 암종, 폐암, 대장암 및 비소세포 폐암과 같은 복수의 종양 유형의 발생 및 진행과 연관이 있다(Kayser et al., 2011; Bentz et al., 2013; Grimm et al., 2014).
TMEM67은 중심소체의 정단막으로의 이동 및 일차 섬모의 형성에서 기능한다. 이 유전자의 결합은 멕켈(Meckel) 증후군 3형(MKS3) 및 주베르 증후군 6형(JBTS6)의 원인이다(RefSeq, 2002). TMEM67은 섬모 형성에 관여하며 손상된 섬모는 안조직 결손, 설 종양 및 수모세포종을 초래할 수 있다(Yang et al., 2015b; Parisi, 2009).
TONSL은 종양유전자 단백질 MMS22L을 안정화하여 폐 및 식도의 발암에 관여한다(Nguyen et al., 2012). TONSL과 BRCA1 사이에 추가의 상호작용이 나타났으며, 이는 유방 및 난소 종양 억제인자로서 작용한다(Hill et al., 2014).
TP63 전위는 역형성 림프종 키나제 양성 역형성 거대 세포 림프종의 하위조합에서의 사례로 기술되었으며 이는 이 질병의 공격적 과정과 관련이 있다(Hapgood and Savage, 2015). TP63은 상피 분화, 세포 주기 정지 및 세포자멸사에 관여하는 것으로 인해 암에서 복합적 역할을 하는 것으로 기술되었다(Lin et al., 2015). TP63 아이소형인 TAp63은 혈액학적 악성 종양에서 과발현되는 것으로 기술된 반면 TP63 과오 돌연변이는 편평 암에서 및 TP63 전위는 림프종 및 일부 폐 선암종에서 각각 보고되었다(Orzol et al., 2015). TP63 아이소형인 DeltaNp63의 과발현을 초래하는 이상 스플라이싱은 피부 편평세포 암종과 같은 인간 암에서 빈번히 발견되는 것으로 기술되었으며, 이러한 암에서 종양 개시 및 진행을 유리하게 할 가능성이 크다(Missero and Antonini, 2014; Inoue and Fry, 2014).
TRIM59는 세포 주기 관련 단백질의 상향조절에 의해 비소세포 폐암의 증식 및 이동을 촉진시킨다(Zhan et al., 2015). 추정적 유비퀴닌 연결효소 TRIM59는 비종양 조직에 비해 위 종양에서 상향조절되며 TRIM59의 수준의 종양 진행 및 환자의 생존 기간과 상관관계가 있다. TRIM59는 P53과 상호작용하여 유비퀴틴화 및 분해를 촉진하고, TRIM59는 이 기전을 통해 위 발암을 촉진할 수 있다(Zhou et al., 2014).
TRPC4는 폐암, 난소암, 두경부암, 신장암 및 비소세포 폐암에서 상향조절되는 것으로 발견되었다(Zhang et al., 2010b; Zeng et al., 2013a; Jiang et al., 2013; Park et al., 2016).
ULBP3은 다수의 종양 세포에서 용해성 및 막 결합 아이소형을 발현한다. 소아 급성 림프모구성 백혈병 모세포는 성인의 모세포에 비해 유의하게 더 높은 수준의 ULBP3을 발현한다(Torelli et al., 2014). 다른 백혈병 세포주에 비해 백혈병 세포주 K562에서 훨씬 더 높은 ULBP3의 발현 수준이 발견되었다. 더욱이, 이는 백혈병 세포주와 원발성 악성 백혈병 세포 모두에서 찾을 수 있다(Ma et al., 2013b). ULBP3 유전자 자리는 대장암 세포주에서 메틸화된다(Bormann et al., 2011). mRNA 수준 및 ULBP3의 표면 발현 수준의 증가가 인간 폐암 세포주 SW-900에서 검출되었다(Park et al., 2011). ULBP3은 백혈병 세포에서 표면 발현이 더 높다(Ogbomo et al., 2008). ULBP3 수준은 여러 종양 세포주에서 NK 세포 세포독성과 상관관계가 있지만, ULBP3은 바이오마커로서 적합하지 않은 것으로 보인다(Wang et al., 2008; Linkov et al., 2009). ULBP3은 인간 비인두 암종 세포주 CNE2에서 발현되지 않는다(Mei et al., 2007). ULBP3은 난소암에서 발현되며 환자의 생존 기간과 역으로 상관관계가 있다(Carlsten et al., 2007; McGilvray et al., 2010). B 세포는 비호지킨 림프종에서 ULBP3을 발현하거나 말초 혈액, 골수 또는 림프절에서 찾을 수 있다(Catellani et al., 2007). ULBP3은 유방암, 아교모세포종 세포주 U251, 인간 뇌 종양 및 두경부 편평세포 암종에서 발현된다(Eisele et al., 2006; Butler et al., 2009; Bryant et al., 2011; de Kruijf et al., 2012). 종양 세포는 용해성의 표면 ULBP3을 발현하여 NK 세포 활성도를 조절한다(Mou et al., 2014). ULBP3은 특정 상피 종양에서 과발현된다. 더욱이, 암 환자의 혈청에서 ULBP3 수준은 건강한 공여자에 비해 상승된다(Mou et al., 2014).
VPS13B 대립유전자는 소세포 폐암에서 돌연변이된다(Iwakawa et al., 2015). 위암 및 대장암에서 VPS13B의 돌연변이가 관찰되었다(An et al., 2012).
VPS13C의 틀이동 돌연변이는 미세위성 불안정성이 있는 위암 및 대장암에서 발견되었다(An et al., 2012).
WDR62 발현은 위암 조직 및 세포주에서 유의하게 증가되었으며 불량한 분화 및 예후와 연관이 있었다. 더욱이, WDR62 발현은 다약제 내성 세포에서 상승되었다(Zeng et al., 2013b). WDR62 과발현은 난소암에서 중심체 증식과 관련이 있으며 새로운 유용한 분화 바이오마커 및 잠재적 요법 표적일 수 있다(Zhang et al., 2013b).
엑소솜 결합 WDR92는 암피레굴린 mRNA의 분해에 의해 유방암 세포 침습을 억제시킨다(Saeki et al., 2013). WDR92는 종양 괴사 인자-알파 및 사이클로헥시미드에 의해 유도되는 세포자멸사를 강화시킨다(Ni et al., 2009).
WNT5A에 대한 유전자는 분비된 신호전달 단백질을 인코딩하는 구조적으로 관련된 유전자들로 구성되는 WNT 유전자 계열에 속한다. 이 단백질들은 종양생성 및 배아생성 동안 세포의 운명 및 형태화의 조절 등 여러 발달 과정에 연루된 바 있다. WNT5A 유전자는 정준 및 비정준 WNT 경로 모두를 통해 신호를 전달하는 WNT 계열의 구성원을 인코딩한다. 이 단백질은 7개의 막횡단 수용체 프리즐드(frizzled)-5 및 티로신 키나제 고아 수용체 2에 대한 리간드이다. 이 단백질은 배아 생성 동안 발육 경로의 조절에서 필수적 역할을 한다. 이 단백질은 종양생성에서도 역할을 할 수 있다(RefSeq, 2002). WNT5A는 CRC에서 과발현되며 원발성 종양과 전이된 부위 사이의 일치율은 76%였다(Lee et al., 2014a). WNT5A는 인간 위 암종 세포, 비인간 암종 및 췌장암에서 상향조절되며, 상피-간엽 이행 및 전이의 핵심 조절인자이다(Kanzawa et al., 2013; Zhu et al., 2014; Bo et al., 2013).
XRN1은 성상세포 및 성상세포종 세포에서 다수의 조절 mRNA 경로에 관여할 가능성이 있다(Moser et al., 2007). XRN1의 녹-다운은 전립선암 세포에서 안드로겐 수용체 발현을 억제했으며 전립선 선암종의 miR-204/XRN1 축에서 중요한 역할을 한다(Ding et al., 2015).
전체 게놈 연관성 연구에서 XXYLT1의 유전자 다형태가 식별되었다. 이러한 다형태가 비소세포 폐암 발병의 감수성 유전자 자리라고 제안되었다(Zhang et al., 2012b).
ZBTB20은 비소세포 폐암에서 FoxO1의 억압을 통해 세포 증식을 촉진한다(Zhao et al., 2014b). ZBTB20 발현은 간세포 암종에서 증가하며 불량한 예후와 연관이 있다(Wang et al., 2011c). ZBTB20 유전자의 다형태는 위암과 연관이 있다(Song et al., 2013).
ZFHX4는 세포 분화를 조절하는 것으로 사료되며 그 억제는 무신경 아교종 생존 기간에 연계된다(Chudnovsky et al., 2014). 송과체 부위의 유두상 종양은 ZFHX4의 높은 발현 수준을 나타낸다(Fevre-Montange et al., 2006). ZFHX4는 기저 세포 암종의 감수성 유전자 자리인 것으로 발견되었다(Stacey et al., 2015).
ZMYM1은 에스트로겐 신호전달 및 유방암 증식에서 작용하는 ZNF131의 주요 상호작용 인자이다(Oh and Chung, 2012; Kim et al., 2016).
발명의 상세한 설명
면역 반응 자극은 숙주 면역계가 외부 물질로 인식하는 항원의 존재에 의존한다. 종양-연관 항원의 발견은 숙주의 면역계를 종양 성장에 개입하는데 사용할 가능성을 제기했다. 면역계의 체액성 및 세포성 지류를 이용하는 다양한 기전이 현재 암 면역 치료에서 탐색되고 있다.
세포 면역 반응의 특정 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. T 세포의 종양 침투 세포 군락 또는 말초 혈액에서의 분리는 이러한 T 세포가 암에 대해 자연 면역 방어로써의 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 시토졸에 자리잡은 단백질 또는 불완전 리보솜 생성물(DRIPS)에서 파생된 보통 8 내지 10개의 아미노산 잔기로 구성된 주조직적합 복합체(MHC)를 가진 펩티드의 클래스 I 분자를 인식하는 CD8 양성 T 세포는 특히, 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC-분자도 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다.
본원에 사용된 모든 용어는 달리 표기되지 않는 한 다음으로 정의된다.
"T-세포 반응"이란 특이적 증식과 시험관내 또는 생체내에서 유도되는 효과기 기능의 활성화를 의미하여야 한다. MHC 클래스 I 제한 세포 독성 T 세포의 경우, 효과기 기능이 펩티드 펄스, 펩티드 전조 펄스 또는 자연적 펩티드 제시 표적 세포들의 용해, 시토카인의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 인터페론 감마, TNF 알파, 또는 IL-2, 효과기 분자의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 그랜자임 또는 퍼로린 또는 탈과립일 수 있다.
"펩티드"란 용어는 여기서 이웃 아미노산의 알파 아미노와 카보닐 기 사이에 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 사용한다. 펩티드는 아미노산 9개의 길이가 바람직하지만 아미노산 8개까지 짧을 수도 있고 10, 11, 12, 13 또는 14개의 아미노산까지 길 수도 있으며, MHC 클래스 II 펩티드의 경우(본 발명의 펩티드의 연장된 변이) 그 길이가 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산일 수 있다.
더욱이 "펩티드"라는 용어는 알파 아미노 기와 이웃 아미노산의 카보닐 기 사이의 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 아미노산 잔기의 서열에 의한 염을 포함한다. 바람직하게는 이 염은, 예를 들어 염화물 또는 아세트산염(삼분화 아세트산염)과 같은 약학적으로 허용되는 펩티드의 염이다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 펩티드가 생체내에서 염이 아니므로 생체내 상태의 펩티드와는 실질적으로 다르다는 점을 유의해야 한다.
"펩티드"라는 용어는 "올리고펩티드"도 포함한다. 본원에서 "올리고펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노 기와 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 아미노산 잔기를 지정하는데 사용된다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 올바른 에피톱이 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 일반적으로 30개 아미노산 보다 길이가 짧고, 15개 아미노산 보다 길다.
"폴리펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노 기와 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는데 사용된다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고펩티드와 다르게, 폴리펩티드는 약 30개 아미노산 잔기 이상의 분자를 가지고 있는 것을 언급한다.
이런 분자의 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드 코딩은 면역 반응을 유도할 수 있으면 "면역성"(따라서 본 발명에서의 "면역원")이다. 본 발명의 경우, 면역성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로 특정하게 정의된다. 따라서, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다. 다른 양태에서, 면역원은 펩티드, 펩티드와 MHC의 복합체, 올리고펩티드 및/또는 특정 항체나 항체에 대한 TCR을 높이는데 사용되는 단백질일 수 있다.
클래스 I T 세포 "에피톱"은 적당한 친화력을 가진 MHC/펩티드 혼합물에 결합하는 T 세포 수용체에 일치하는 T 세포에 의해 인식되는 삼항 혼합물(MHC 클래스 I 알파 쇄, 베타-2-미세글로블린 및 펩티드)을 생성하는 클래스 I 또는 II MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 일반적으로 길이가 8 내지 14개 아미노산이며, 대개 일반적으로 길이가 9개 아미노산이다.
인간에는 MHC 클래스 I 분자를 인코딩하는 3개의 유전자 부위가 있다(인간의 MHC 분자도 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다(HLA)): HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, 및 HLA-A*07은 유전자 부위에서 발현할 수 있는 다른 MHC 클래스 I 대립형질의 예이다.
표 4는 HLA-A*02, HLA-A*24 및 가장 빈번한 HLA-DR 혈청형의 발현 빈도이다. 빈도는 Mori 등(Mori et al., 1997)으로부터 조정된 미국 인구 내에서의 일배체형 빈도 Gf로부터 유추되며, 하디-와인버그 공식 F=1-(1-Gf)2를 사용한다. A*02 또는 A*24와 일부 HLA-DR 대립형질의 조합은 강화되거나 연관 불평형으로 인해 단일 빈도보다 덜 빈번할 수 있다. 자세한 내용은 Chanock 등을 참조한다(Chanock et al., 2004).
[표 4]
Figure 112018079258903-pat00017
Figure 112018079258903-pat00018
본 발명의 펩티드는 바람직하게는 본원에 설명한 바와 같이 본 발명의 백신에 포함되는 경우 바람직하게는 명시된 바와 같이 A*02, A*24 또는 클래스 II 대립유전자에 결합한다. 백신은 범-결합 MHC 클래스 II 펩티드를 포함할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 A*02 양성인 환자의 암을 치료하는데 사용할 수 있는 반면, MHC 클래스 II 동종형에 대한 선택은 이 펩티드의 범-결합 성격으로 인해 필요하지 않다.
본 발명의 A*02 펩티드가 다른 대립형질, 예를 들어 A*24와 결합하는 펩티드와 조합되는 경우, 모든 환자 모집단에서 MHC 클래스 I 대립형질 하나만을 취급하는 것에 비해 더 높은 비율의 치료가 가능하다. 대부분의 모집단에서 하나의 대립형질만으로는 환자의 50% 미만을 해결할 수 있는 반면, HLA-A*24 및 HLA-A*02로 구성된 백신은 일체의 관련있는 모집단에서 적어도 환자의 60% 치료가 가능하다. 구체적으로 환자의 다음 백분율은 다양한 지역에서 하나 이상의 이러한 대립형질에 대해 양성이 된다: 미국 61%, 서부 유럽 62%, 중국 75%, 한국 77%, 일본 86%(www.allelefrequencies.net의 자료로부터 계산됨).
한 바람직한 구현에서 용어 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드의 이성중합체를 언급한다.
특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩은 자연적으로 발생하거나 합성 구축될 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 인코딩하는 DNA 절편은 cDNA 조각들과 짧은 올리고뉴클레오티드 링커, 또는 일련의 올리고뉴클레오티드에서 미생물이나 바이러스 오페론에서 유도된 조절 요소를 구성하는 재조합 전사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공하기 위해서 조립된다.
본원에 사용된 용어 "펩티드를 코딩(또는 인코딩)하는 뉴클레오티드"는 예를 들어, 수지상 세포 또는 TCR 제조에 유용한 다른 세포계에 의해 서열이 발현되는 생물학적 체계와 호환가능한 인공(사람이 만든) 시작 및 정지 코돈을 포함하는 펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩을 지칭한다.
본원에 사용된 핵산 서열에 대한 언급에는 한 가닥 및 두 가닥 핵산 모두가 포함된다. 따라서, 예를 들어 DNA의 경우 특정 서열이란 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 이러한 서열의 단일 가닥 DNA, 보완이 있는 이러한 서열의 중복(이중 가닥 DNA) 및 이러한 서열의 보완을 언급한다.
용어 "코딩 영역"은 자연적인 게놈 환경에서 유전자의 발현 생성물에 대해 자연스럽게 또는 정상적으로 코딩하는 유전자의 부분을 언급한다(즉, 유전자 본래의 발현 생성물에 대한 생체내 영역 코딩).
코딩 영역은 비변이("정상적")이거나 변이 또는 개조된 유전자에서 찾을 수 있거나, 심지어는 DNA 서열, 또는 DNA 합성 기술을 보유한 제조업자에게 잘 알려진 방법을 사용해서 실험실에서 전적으로 합성된 유전자에서 찾을 수 있다.
용어 "발현 생성물"은 유전자의 자연 번역 생성물인 폴리펩티드 또는 단백질, 및 유전적 코딩 퇴화 및 이에 따른 동일 아미노산 코딩으로 인해 초래된 어떤 핵산 서열 코딩 생성물을 의미한다.
코딩 서열을 말할 때, 용어 "단편"은 발현 제품이 완전한 코딩 영역의 발현 생성물과 같은 생물학적 기능이나 활동을 유지하는 완전한 코딩 영역보다 적은 부분의 DNA를 언급한다.
용어 "DNA 분절"은 최소한 한번 이상의 상당히 순수한 형태로 분리된 DNA에서 유도된 단편의 형태, 또는 큰 DNA 구조의 구성 요소로서 DNA 중합체를 언급한다. 이때, 순수한 형태는 내인성 오염 물질이 없고 분절 및 표준 생화학 방법, 예를 들어, 복제 벡터에 따른 그 구성 요소 뉴클레오티드 서열의 식별, 조작 및 복구를 가능하게 하는 양 또는 농도를 언급한다. 이러한 분절은 일반적으로 진핵 생물 유전자에 존재하는 내부 비번역 서열, 또는 인트론에 의해 방해되지 않는 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공된다. 비번역 DNA 서열은 동일 서열이 코딩 영역의 조작이나 발현을 방해하지 않는 오픈 리딩 프레임의 하단에 나타날 수 있다.
용어 "프라이머"는 하나의 표준 DNA와 짝을 이룰 수 있는 짧은 핵산 서열을 의미하며 DNA 폴리머라제가 데옥시리보뉴클레오티드 쇄 합성을 시작하는 자유 3'-OH 말단을 제공한다.
용어 "프로모터"는 모사를 시작하기 위한 RNA 폴리머라제의 결합에 관여하는 DNA 영역을 뜻한다.
용어 "단리"는 그 물질이 원래의 환경(예를 들어, 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)에서 제거되는 것을 뜻한다. 예를 들어, 자연 발생하는 살아있는 동물에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 부분 또는 전체에서 분리되는 같은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 제거된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 운송체 및/또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 부분이거나 폴리펩티드는 구성의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 구성이 자연 환경의 일부가 아닐 때 여전히 분리될 수 있다.
본 발명에서 밝혀지는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 또는 면역성의 폴리펩티드는 "순수한" 형태일 수도 있다. 용어 "정제"는 절대적인 순도를 필요로 하지 않는다. 오히려, 그것은 상대적인 정의를 의도하며, 관련된 당업자들이 이해하는 용어로써 상당히 정제된 제조 또는 부분적으로 정제된 제조를 포함할 수 있다. 예를 들어, cDNA 라이브러리에서 분리된 각각의 클론은 전기 영동 동일성으로 통상적으로 정제된다. 시작 물질 또는 자연 물질의 최소한 하나 이상의 순서, 바람직하게 2 내지 3개 순서, 더 바람직하게는 4 내지 5개 순서의 크기로 정제가 명시적으로 심사숙고된다. 또한 바람직하게는 중량 단위로 99.999%, 또는 최소한 99.99% 또는 99.9%; 심지어 바람직하게 99%보다 큰 순도를 가진 청구범위에 기재된 폴리펩티드는 명시적으로 심사숙고된다.
본 발명에서 밝혀진 핵산과 폴리펩티드 발현 생성물은, 이러한 핵산 및/또는 이러한 폴리펩티드를 가진 발현 벡터뿐만 아니라, "강화된 형태"일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "강화"는 물질의 농도가 최소한 그것의 자연적 농도(예를 들어)의 최소한 2, 5, 10, 100, 또는 1000배 정도이고, 유리하게는 0.01 중량%, 바람직하게는 최소한 약 0.1 중량% 정도임을 의미한다. 중량 단위로 약 0.5%, 1%, 5%, 10%, 및 20% 강화된 제조도 심사숙고된다. 서열, 구성, 벡터, 클론, 및 본 발명의 다른 물질들은 유리하게 강화된 또는 격리된 형태가 될 수 있다. 용어 "활성 단편"은, 예를 들어 토끼 또는 쥐 및 인간을 포함한 포유류 같은 동물에게 따로 또는 임의적으로 적당한 보조제와 함께 또는 매개체로서 투여했을 때 면역 반응(즉, 면역성 활동이 있는)을 생성하고 인간과 같은 수용 동물 내에서 T 세포 반응을 자극하는 형태로 면역 반응을 나타내는 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 단편을 의미한다. 그렇지 않으면, "활성 단편"은 또한 시험관내 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용될 수도 있다.
본원에 사용된 "부분", "분절" 및 "단편"이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 서열이 더 큰 서열의 하위 집합을 형성하는 경우 아미노산 잔기와 같은 잔기의 지속적인 서열을 언급한다. 예를 들어, 만약에 폴리펩티드가 트립신이나 키모트립신 같은 일반적인 엔도펩티다아제 치료를 받는다면, 그런 치료로 인해 생기는 올리고펩티드는 폴리펩티드의 시작 부분, 분절 또는 단편을 나타낼 것이다. 폴리뉴클레오티드와 관련해서 사용될 때, 이러한 용어들은 일반적인 엔도뉴클레아제 중 어떤 것과 함께 상기 폴리뉴클레오티드의 치료에 의해 생성된 생성물을 언급한다.
본 발명에 따라, 서열을 언급할 때 용어 "백분율 동일성" 또는 "백분율 동일한"은 설명되거나 명시된 서열("기준 서열")에 비교될 서열의 정렬 후("비교 서열") 서열이 명시된 또는 설명된 서열에 비교되는 것을 언급한다. 백분율 동일성은 하기 공식에 따라서 결정된다:
백분율 동일성 = 100 [1 -(C/R)]
이때, C는 기준 서열과 비교 서열의 정렬의 길이에 비해 기준 서열과 비교 서열의 차이의 개수이되,
(i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산이 없는 기준 서열에 각 염기 또는 아미노산,
(ii) 기준 서열의 각 차이, 및
(iii) 비교 서열의 정렬된 염기 또는 아미노산과 다른 기준 서열의 각 정렬된 염기 또는 아미노산이 차이를 구성하며,
(iv) 정렬은 정렬된 서열의 위치 1에서 시작해야 한다.
또한, R은 비교 서열과의 정렬의 길이에 대한 기준 서열 염기 또는 아미노산의 수이고 기준 서열에 생긴 공백도 염기 또는 아미노산 개수로 계산된다.
만약에 위에서와 같이 계산된 비교 서열과 기준 서열 사이의 백분율 동일성이 특정 최소 백분율과 같거나 더 크면 위에서 계산된 백분율 동일성이 특정 백분율 동일성보다 작은 경우에 정렬이 있더라도 비교 서열은 기준 서열에 대해 특정한 최소 백분율 동일성이 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 서열식별번호 1 내지 388로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 팹티드, 또는 서열식별번호 1 내지 388에 대해 88% 상동성인 그 변이체, 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I의 분자에 결합하는 능력 또는 신장된 버전의 상기 펩티드가 클래스 II에 결합하는 능력을 갖는다.
본 발명에서, "상동"이라는 용어는 2개의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 일치 정도(위의 백분율 동일성 참조)를 일컫는다. 전술한 "상동"은 비교될 2개의 서열을 최적 상태에서 나란히 정렬하고 비교하여 결정된다. 이러한 서열 상동 관계는, 예를 들어 ClustalW 알고리즘을 이용하여 정렬을 만들어 계산할 수 있다. 일반적으로 사용이 가능한 서열 분석 소프트웨어, 더 구체적으로 벡터 NTI, GENETYX 또는 다른 도구들은 공용 데이터베이스에서 제공된다.
이 분야의 당업자는 특정 펩티드의 변이체에 의해서 유도된 T 세포가 그 펩티드 자체와 교차 반응할 수 있을지를 평가할 수 있을 것이다(Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).
주어진 아미노산 서열의 "변이체"에 의해, 발명자들은 예를 들어, 1 또는 2개의 아미노산 잔기의 측쇄가 변경되어 그 펩티드가 여전히 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388의 아미노산 서열로 구성된 펩티드와 실질적으로 같은 방법으로 HLA 분자와 결합할 수 있음을 의미한다(예를 들어, 그들을 자연적으로 발생하는 다른 아미노산 잔기 또는 다른 측쇄로 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388로 구성된 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 단일 또는 조합의 펩티드이다. 예를 들어, 펩티드 변형에 의해 HLA-A*02 또는 DR과 같은 적합한 MHC 분자의 결합 홈과 상호 작용하여 결합하는 능력이 향상되지 않으면 적어도 유지하고 마찬가지로 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력이 향상되지 않으면 적어도 유지할 수 있다.
이 T 세포는 그 결과로 본 발명의 한 양태에서 정의된 바 있는 동족의 펩티드의 자연 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응하고 이러한 세포를 죽일 수 있다. 과학 문헌 및 데이터베이스(Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997)에서 얻을 수 있듯이, HLA 결합 펩티드의 특정한 위치는 전형적으로 HLA 수용기의 결합 모티프에 일치하는 핵심 고정 잔기이며, 이는 결합 홈을 이루고 있는 폴리펩티드의 극성, 전기 물리성, 소수성 및 공간적 특성에 의해 정의된다. 따라서, 이 분야의 당업자는 알려진 고정 잔기를 유지함으로써 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 정해진 아미노산 서열을 변형할 수 있고 이러한 변이체들이 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있는지를 결정할 수 있어야 한다. 이 본 발명의 변이체는 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 유지하고, 이는 그 결과로 본 발명의 양태에서 동족의 펩티드라고 정의된 자연 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응을 하고 이 세포를 죽일 수 있다.
본원에서 밝혀진 본래 (변형되지 않은) 펩티드는 달리 언급되지 않는 이상 아마도 선택적인 다른 부위에서 펩티드 쇄의 부위의 하나 이상의 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있다. 바람직하게, 이러한 치환은 아미노산 쇄의 말단에 위치한다. 그런 치환은, 예를 들어, 소수성의 아미노산이 다른 소수성의 아미노산으로 치환되는 것처럼, 보수적일 수 있다. 심지어 더 보수적인 것은 류신이 이소류신으로 치환되는 것 같이, 같거나 비슷한 크기와 화학적 특성을 가진 아미노산으로 치환되는 것이다. 자연적으로 발생하는 동종 단백질의 종족에서의 서열 변화의 연구에서, 특정 아미노산의 치환은 다른 것들보다 더 자주 용인되고 있으며, 이들은 본래의 아미노산과 치환 사이에서 크기, 전하, 극성, 및 소수성이 비슷한 상관관계를 보이며, 이것은 "보존적 치환"을 정의하는데 기본이 된다.
본원에서 보존적 치환은 아래의 다섯 개 그룹 중 하나의 교환으로 정의된다: 그룹 1- 작은 지방성, 무극성 또는 약간 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 그룹 2- 극성, 음성 하전된 잔기와 그 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 그룹 3- 극성, 양성 하전된 잔기(His, Arg, Lys); 그룹 4- 큰, 지방성, 무극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 그룹 5- 큰, 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).
덜 보존적 치환은 알라닌을 이소류신 잔기로 치환하는 것처럼, 비슷한 성질이지만 크기가 어느 정도 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 아주 비보수적인 치환은 산성 아미노산을 극성, 또는 심지어 염기성 아미노산으로 치환하는 것을 포함할 수도 있다. 그러나, 이러한 "급진적" 치환은 화학적 작용이 완전히 예측 불가능하고, 급진적 치환은 단순한 화학 원리에서 예측 가능하지 않은 뜻밖의 발생이 있을 수 있기 때문에 효과가 없다고 기각할 수는 없다.
물론, 이런 치환은 일반적인 L-아미노산 외 다른 구조를 포함할 수 있다. 따라서, D-아미노산을 본 발명의 항원 펩티드에서 흔히 발견되는 L-아미노산으로 교체할 수 있고 여기에서 공개를 통해 계속 포함시킬 수 있다. 또한, 비표준 아미노산(즉, 흔히 자연적으로 발생하는 단백질성 아미노산이 아닌) 역시 본 발명에 따라 면역성과 면역성 폴리펩티드를 생산하기 위해서 치환될 수 있다.
아래에서 정의된 것과 상당히 동일하거나 더 큰 항원 활성이 있는 펩티드의 하나 이상의 위치에서 치환이 발견되면, 이러한 치환의 조합은 조합된 치환이 펩티드의 항원성에 추가적 효과 또는 시너지 효과의 결과를 내는지 결정하기 위해 시험된다. 최대, 펩티드에서 네 곳 이상의 위치에서 동시에 치환될 수 없을 것이다.
본 문서에서 명시한 바와 같이, 아미노산 서열로 필수적으로 구성된 펩티드는, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 클래스-II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 부정적으로 영향받음 없이 1 또는 2개의 비앵커 아미노산(앵커 모티프에 대해서는 아래 참조)이 교환되도록 할 수 있다. 또 다른 구현에서는, 본 문서에서 명시된 바와 같이 아미노산 서열로 필수적으로 구성된 펩티드에 있어서, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 클래스-II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 부정적으로 영향받음 없이 1 또는 2개의 아미노산이 그에 대한 보존적 교환 파트너(다음을 참조)와 교환될 수 있다.
T 세포 수용체와 상호작용하는데 상당히 기여를 하지 않는 아미노산 잔기들은 이와 결합됨으로써 T 세포의 반응성에 상당한 영향을 주지 않고 관련된 MHC와의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산과의 교체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 외에도, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 한 부분 또는 주어진 변이체를 포함하는(발명자들이 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다고 일컫는) 어떠한 펩티드가 될 수도 있다.
[표 5]
서열식별번호 2, 4 및 6에 따른 HLA-A*02-펩티드의 바람직한 변이체 및 모티프
Figure 112018079258903-pat00019
Figure 112018079258903-pat00020
[표 6]
서열식별번호 98, 114 및 158에 따른 HLA-A*24-펩티드의 바람직한 변이체 및 모티프
Figure 112018079258903-pat00021
더 긴 펩티드도 적합할 수 있다. 대개 길이가 8 내지 11개의 아미노산이지만, MHC 클래스 I 에피톱이 더 긴 펩티드로부터 처리되는 펩티드 또는 실제 에피톱을 포함하는 단백질에 의해 생성될 가능성이 있다. 실제 에피톱이 양측에 있는 장기는 처리 동안 실제 에피톱을 노출하는데 필요한 단백질 분해에 의한 분할에 상당한 영향을 주지 못하는 잔기이다.
본 발명의 펩티드는 아미노산을 최대 4개까지 연장할 수 있는데 즉, 1, 2, 3 및 4개의 아미노산이 4:0과 0:4 사이에서 일체의 조합으로 양쪽 어디로든 추가될 수 있다. 본 발명에 따른 신장의 조합은 표 7에서 찾을 수 있다.
[표 7]
본 발명의 펩티드들의 신장에 대한 조합
Figure 112018079258903-pat00022
연장/신장을 위한 아미노산은 해당 단백질의 원래 서열의 펩티드나 기타 모든 아미노산일 수 있다. 연장은 펩티드의 안정성이나 용해성 강화를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 에피톱은 자연적으로 발생하는 종양-연관 또는 종양-특이적 에피톱과 동일하거나 실질상 동일한 항원적 활동력을 가지고 있는 한, 참조 펩티드와 비교 시 4개 이하의 다른 잔기를 가지고 있는 에피톱을 포함할 수 있다.
대체의 구현에서, 펩티드는 한쪽 또는 양쪽으로 4개 이상의 아미노산, 바람직하게는 총 30개의 아미노산 길이만큼 연장된다. 이는 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 초래할 수 있다. MHC 클래스 II에 대한 결합은 당업계에서 알려진 방법으로 시험할 수 있다.
따라서, 본 발명은 MHC 클래스 I 에피톱의 펩티드와 변이체를 제공하며, 이때 펩티드 또는 변이체는 전체 길이가 8 내지 100개이며, 바람직하게는 8 내지 30개이며, 가장 바람직하게는 8 내지 14개이며, 이는 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개의 아미노산이다. 신장된 클래스 II 결합 펩티드의 경우 그 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 아미노산일 수도 있다.
물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 변이체는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖게 된다. 펩티드 또는 변이체의 MHC 복합체에 대한 결합은 당업계의 방법에 의해 시험할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 특이적 펩티드의 T 세포가 치환 펩티드에 대해 시험될 때, 치환 펩티드가 배경에 상대적으로 세포 용해의 최대 증가의 절반을 달성할 때의 펩티드 농도는 약 1 mM 이하, 바람직하게 약 1 μM 이하, 더 바람직하게 약 1 nM 이하, 여전히 더 바람직하게 약 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 약 10 pM 이하이다. 치환 펩티드가 하나 이상, 최소 2개, 보다 바람직하게 3개의 개별 T 세포에 의해 인식되는 것 또한 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 구현에서, 펩티드는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 따를 아미노산 서열로 구성되거나 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 따른 아미노산 서열로 본질적으로 구성된다.
"본질적으로 구성된"이란. 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 따른 서열 또는 변이체 외에도. 본 발명에 따른 펩티드가, MHC 분자 에피톱에 대한 에피톱으로 기능하는 펩티드의 한 부분을 반드시 형성하지 않는 아미노산의 추가적인 N- 및/또는 C-말단 위치 신장을 함유하는 것을 의미해야 한다.
그럼에도 불구하고, 이러한 신장은 본 발명에 따른 펩티드의 세포 내로의 효율적인 도입에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현에서, 펩티드는 예를 들어 NCBI, GenBank 수탁번호 X00497에서 유도된 것처럼 HLA-DR 항원 결합 불변쇄(p33, 다음의 "Ii")의 80개 N-말단 아미노산을 포함하고 있는 융합 단백질의 일부이다. 다른 융합에서는, 본 발명의 펩티드는 항체에 의해 특이적으로 표적화될 수 있도록 본원에 설명된 상기 항체나 그 기능적 일부, 특히 항체의 서열에 대해 또는, 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체에 대해 또는 그 안으로 융합될 수 있다.
추가적으로, 펩티드 또는 변이체는 안정성 및/또는 MHC 분자와의 결합성을 높여 더 강한 면역 반응을 일으킬 수 있도록 변형될 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 반대 펩티드 결합 또는 비-펩티드 결합을 도입하는 것이 있다.
반대 펩티드 결합에서는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 연결로 결합되어 있지 않으나 펩티드 결합이 반대로 되어있다. 이러한 역-인버스 펩티드 모방형 물질은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 생성될 수 있으며, 이 방법의 예는 이 문헌의 참조문헌으로 포함된 Meziere 등(1997)(Meziere et al., 1997)에 설명되어 있다. 이 방법은 백본의 변경을 포함하지만, 측쇄의 방향을 바꾸지 않는 유사펩티드를 만드는 것을 포함한다. Meziere 등(Meziere et al., 1997)은 MHC 결합과 T 조력 세포 반응에서 이 유사 펩티드가 유용하다는 것을 보여준다. CO-NH 대신에 NH-CO 결합을 포함하고 있는 레트로 역위 펩티드는 단백질 가수 분해에 대한 저항력이 훨씬 높다.
비-펩티드 결합의 예는 -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-이다. 미국 특허 4,897,445는 기본 과정을 거쳐 합성된 폴리펩티드와 아미노 알데히드와 아미노산을 NaCNBH3 존재 하에 반응시켜 생성된 비-펩티드 결합을 포함한 폴리펩티드 쇄의 비-펩티드 결합(-CH2-NH)을 위한 고체상 합성의 방법을 제공한다.
위에서 묘사된 서열로 구성된 펩티드는 안정성, 생물가용성, 및/또는 펩티드의 결합을 증가시키기 위해 추가적인 화학 기를 아미노 및 또는 카복시 말단에 결합할 수도 있다. 예를 들어, 카보벤족실, 단실, 또는 t-부틸옥시카보닐 기 등 소수성 기가 펩티드의 아미노 말단에 추가될 수 있다. 마찬가지로, 아세틸 기 또는 9-플루오레닐메톡시-카보닐 기가 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수도 있다. 또한, 소수성 기, t-부틸옥시카보닐, 또는 아미도 기 또한 펩티드의 카르복시 말단에 추가될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 입체적 배치를 변화시키기 위해 생성될 수도 있다. 예를 들어, 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 D-이성질체가 보통의 L-이성질체 대신에 사용될 수도 있다. 더 나아가서, 본 발명의 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 비자연적으로 발생하는 아미노산 잔기와 치환될 수도 있다. 이와 같은 변화는 안정성, 생물가용성, 및/또는 본 발명의 펩티드의 결합을 증가시킬 수 있다.
유사하게, 본 발명의 펩티드 또는 변이체는 특정한 아미노산을 펩티드 생성 전 또는 후에 반응시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 이 문헌의 참조문헌에 포함되어 있는 문헌[R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004(Lundblad, 2004)]에 잘 묘사되어 있다. 아미노산의 화학 변형은 아실화, 아미딘화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화 반응, 아미노산의 2,4,6-트라이니트로벤젠 설폰화(TNBS)에 의한 트라이니트로벤질화, 카르복실 기의 아미드 변형 및 퍼포민산에 의한 설피드릴 변형, 시스틴의 시스테릭산으로의 산화, 머큐리얼 유도체 생성, 다른 티올 화합물과 다이설피드 생성, 말레이미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드 아세트아미드에 의한 카르복시메틸화, 및 알칼리성 pH에서 시안산 염에 의한 카르바모일화를 포함하지만 이에 국한되지 않은 변형을 언급한다. 이에 관해서, 더 광대한 단백질의 화학 변형에 대한 방법론에 대해서는 당업자는 (Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan 등 (John Wiley & Sons NY 1995-2000))(Coligan et al., 1995)의 15장을 참조하길 바란다.
간단히 말하면, 예를 들어 단백질의 아르기닌 잔기는 흔히 페닐글리옥산, 2,3-부탄다이온 및 1,2-사이클로헥산다이온과 같은 이웃자리 다이카르보닐 화합물과의 반응에 근거하여 부가물을 형성한다. 다른 예는 메틸글로옥살과 아르기닌 잔기와의 반응이다. 시스테인은 리신과 히스티딘과 같은 다른 친핵성 부위의 동시 변형 없이 변형시킬 수 있다. 그 결과 다수의 시약들이 시스테인 변형에 사용 가능하다. Sigma-Aldrich(http://www.sigma-aldrich.com)와 같은 회사들의 웹사이트에서는 특정 시약에 관한 정보를 제공하고 있다.
단백질에서 이황화 결합의 선택적 환원 또한 흔하게 나타난다. 단백질에서 이황화 결합은 생물약제의 열 처리 동안 형성되어 산화될 수 있다. 우드워드의 시약 K는 특정 글루탐산 잔기의 변형에 사용될 수 있다. N-(3-다이메틸아미노)프로필l)-N'-에틸카르보다이이미드를 사용하여 리신 잔기와 글루탐산 잔기 사이의 분자 내 가교를 형성할 수 있다. 예를 들어, 다이메틸피로카보네이트는 단백질에서 히스티딘 잔기의 변형을 위한 시약이다. 히스티딘은 4-하이드록시-2-노네날을 사용하여 변형시킬 수 있다. 리신 잔기와 다른 α-아미노 기의 작용은, 예를 들어, 펩티드의 표면 결합 또는 단백질/펩티드들의 가교에 유용하다. 리신은 폴리(에틸렌)글리콜의 부착 부위이며 단백질의 당화에서 중요 변형 부위이다. 단백질에서 메티오닌 잔기는, 예를 들어 요오도아세트아미드, 브로모에틸아민 및 클로르아민 T를 사용하여 변형시킬 수 있다.
테트라니트로메탄 및 N-아세틸이미다졸은 티로신 잔기의 변형에 사용할 수 있다. 다이티로신의 형성을 통한 가교 형성은 과산화 수소/구리 이온으로써 성취할 수 있다.
트립토판의 변형에 대한 최근의 연구에서는 N-브로모숙신이미드, 브롬화 2-하이드록시-5-니트로벤질 또는 3-브로모-3-메틸-2-(2-니트로페닐메르캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)이 사용된 바 있다.
PEG를 이용한 치료 단백질과 펩티드의 성공적인 변환은 하이드로겔 준비시 사용되는 단백질을 글루타르알데히드, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트 및 포름알데히드와 교차 결합하는 동시 순환 반감기를 증가시키는 것과 흔히 관련되어 있다. 면역 치료를 위한 알레르겐의 화학적 변형은 종종 칼륨 시안산염의 카바밀화와 관련이 있다.
펩티드 또는 변이체, 이때 펩티드는 변환되었거나 비-펩티드 결합을 포함하는 것이 본 발명 구현에서 바람직하다. 일반적으로 펩티드와 변이체(적어도 펩티드 링크를 아미노산 잔기 사이에 포함하는 것들)는 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드에 의해 합성될 수 있으며, 이는 Lukas 등(Lukas et al., 1981) 및 여기에 인용된 참조문헌에 공개되어 있다. 일시적인 N-말단 기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)에 의해 제공된다. 이렇게 염기 불안정한 보호기의 반복적인 절단은 N,N-다이메틸포름아미드의 20% 피페리딘를 이용하여 구성된다. 측쇄 기능은 부틸 에테르(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카보닐 변이체(리신과 히스티딘의 경우), 트라이틸 변이체(아르기닌의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트라이메틸벤젠술포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단의 잔기인 경우, 4,4'-다이메톡시벤즈하이드릴이 사용되어 측쇄 아미도 기능을 보호한다. 고체형 보조는 다이메틸아크릴아미드(백본-모노머), 비스아크릴로일에틸렌 다이아민(가교 결합) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(기능 작용제)의 3개의 모노머로 만들어진 폴리다이메틸-아크릴아미드 중합체에 기반을 둔다. 펩티드 대 레진 절단 가능 연결 작용제로 사용되는 것은 산-불안정 4-하이드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 역 N,N-다이사이클로헥실-카보다이이미드/1-하이드록시벤조트라이아졸에 의한 커플링 과정에 의해 추가되는 아스파라진과 글루타민을 제외하고 미리 생성된 대칭의 무수물 유도체로서 추가된다. 모든 커플링과 탈보호 반응은 닌히드린, 트라이니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 실험 과정에 의해 모니터링된다. 합성 완료 시에, 펩티드는 레진 기반에서 50% 스캐빈저 믹스를 포함한 95% 트라이플루오로아세트산에 의한 측쇄 보호기 제거와 동시에 절단된다. 일반적으로 사용되는 스캐빈저로는 에탄다이티올, 페놀, 아니솔 및 물을 포함하고, 정확한 선택은 합성되는 펩티드에 포함되어 있는 아미노산에 따라 결정된다. 펩티드의 합성에 있어서 고체상과 액체상 방법의 결합 또한 가능하다(예를 들어, 문헌[Bruckdorfer et al., 2004] 및 이 문헌에 인용된 참고문헌 참조).
트라이플루오로아세트산은 진공 상태에서 증발된 후 다이에틸에테르에 의한 분쇄에 의해 제거되어 조 펩티드를 생성한다. 존재하는 일체의 스캐빈저는 수용액 상태에서 냉동건조에 의한 간단한 추출 과정에 의해 제거되어 스캐빈저가 없는 조 펩티드를 생성한다. 펩티드 합성의 시약은 일반적으로, 예를 들어 칼바이오켐-노바바이오켐(노팅힐)(Calbiochem-Novabiochem(Nottingham))으로부터 입수할 수 있다.
정제는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및 (보통) 예를 들어 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 등의 단일 방법 또는 이의 결합 방법에 의해 수행할 수 있다.
펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 전기 영동법, 특히 모세관 전기 영동법, 고체상 추출법(CSPE), 고성능 역단계 액체 크로마토그래피, 산성 가수분해 후 아미노산 분석 및 고속 원자 폭격 질량 분석법 및 MALDI와 ESI-QTOF 질량 분석법 등에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 펩티드의 동정을 위해, 약 3000개의 정상(건강한) 조직 샘플로부터 얻은 RNA 발현 데이터의 데이터베이스(Lonsdale, 2013)를 선별하여 생명유지 기관계에서 거의 발현이 부재하며 다른 중요 기관계에서는 발현이 낮은 유전자를 찾았다. 이어서, 이러한 유전자의 단백질 생성물로부터 유래된 암 관련 펩티드들을 여기서 설명된 XPRESIDENT™ 플랫폼을 사용한 질량분석법에 의해 동정했다.
과다제시된 펩티드를 선택하기 위해, 중간 샘플 제시는 물론 복제 변이를 보여주는 제시 프로파일이 계산된다. 이 프로파일은 관심 대상의 종양 개체 샘플을 정상 조직 샘플의 베이스라인에 병치된다. 그런 다음, 이 프로파일 각각에 대해 선형 혼합효과 모형의 p-값을 계산하고(Pinheiro et al., 2015) 오류 발견율(Benjamini and Hochberg, 1995)에 대한 복수의 검사를 조절함으로써 과다제시 점수에 통합될 수 있다(실시예 1 참고).
질량 분석에 의한 HLA 리간드의 동정 및 상대적 정량화를 위해, 충격동결된 조직 샘플에서 얻은 HLA를 정제하고 HLA-연관 펩티드를 확인했다. 확인된 펩티드는 분리하여 그 서열을 온라인 나노-전기분무-이온화(nanoESI) 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 실험에 의해 식별했다. 암 샘플(370명 기증자로부터의 N = 377 A*02-양성 샘플, N = 204 A*02-양성 샘플)로부터 기록된 자연적 종양-연관 펩티드(TUMAP)의 단편화 패턴을 동일한 서열을 가진 상응하는 합성 참조 펩티드의 단편화 패턴과 비교하여, 얻어진 펩티드 서열을 확인했다. 이 펩티드는 원발성 종양의 HLA 분자의 리간드로서 직접 식별되기 때문에, 그 결과는 574명 암 환자로부터 수득된 원발성 암 조직에 대해 식별된 펩티드의 자연적 처리와 제시에 대한 직접적 증거를 제공한다.
발견 파이프라인 XPRESIDENT® v2.1(예를 들어, 전체가 여기에 포함되는 US 2013-0096016을 참고)은 몇 가지 다른 비암성 조직 및 기관에 비해 암 조직에 대한 HLA-제한 펩티드 수준의 직접적인 상대적 정량화를 기준으로 관련된 과다제시된 펩티드 백신 후보의 식별과 선택을 허용한다. 이는 서열 식별, 스펙트럼 집락화, 전화 이온 계수화, 정체 시간 정렬, 상태 디컨볼루션 및 정상화에 필요한 알고리즘을 조합시킨 독점 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리하여 획득한 LC-MS 데이터를 사용한 비표지 차등 정량화의 개발에 의해 성취되었다.
펩티드와 샘플 각각에 대한 오류 측정치 등 제시 수준이 확립되었다. 종양 조직에 배타적으로 제시된 펩티드 및 종양에서 과다제시된 펩티드 대비 비암성 조직 및 기관이 식별된 바 있다.
조직 샘플에서 얻은 HLA-펩티드 복합체를 정제했으며, HLA-관련 펩티드를 분리하여 LC-MS에 의해 분석했다(실시예 참조). 본 출원서에 포함된 모든 TUMAP들은 원발성 암 샘플에 대한 이러한 접근방식으로 식별되었으며, 원발성 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암 또는 자궁암에서 이들의 제시가 확인된다.
복수의 암 및 정상 조직에 대해 식별된 TUMAP를 비표지 LC-MS 데이터에 대한 이온-계수화를 사용하여 정량화했다. 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플에 과다한 존재와 상관관계가 있음을 가정한다. 다양한 LC-MS 실험에서 펩티드의 모든 정량적 신호들을 LS-MS 실험을 중심 경향에 근거하여 정상화하고 샘플 당 평균화하여 제시 프로파일이라 부르는 막대 도표에 통합시켰다. 이 제시 프로파일은 단백질 데이터베이스 검색, 스펙트럼 군락화, 충전 상태 디컨벌루션(방전) 및 시간 성격 및 정체 정상화와 같은 다른 분석 방법들을 통합시킨다.
더욱이, 발견 파이프라인 XPRESIDENT® v2.1을 사용하면 암 또는 다른 감염된 조직에서 MHC-, 바람직하게는 HLA-제약된 펩티드 수준의 직접 절대 정량화가 가능하다. 간단히 말하면 총 세포 수는 분석된 조직 샘플의 총 DNA 함량으로부터 계산되었다. 조직 샘플에서 TUMAP의 펩티드 총량은 자연 TUMAP에 대한 비율 및 소위 내부 표준으로 부르는 TUMAP의 동위원소 버전의 알려진 양으로서 나노 LC MS/MS에 의해 측정했다. TUMAP 분리의 효율은 TUMAP 분리 절차에서 가능한 가장 이른 시점에 모든 선택된 펩티드:MHC 복합체를 조직 용해물에 스파이킹하고, 펩티드 단리 절차의 완료 후 나노 LC-MS/MS에 의한 검출을 이용하여 결정했다. 총 세포수와 펩티드의 총량은 조직 샘플당 3회 측정으로부터 계산했다. 펩티드 특이적 분리 효율은 10회의 스파이킹 실험을 진행하고 매회마다 3회 측정을 통해 평균을 내어 계산했다(실시예 6 및 표 14 참조).
이러한 RNA 발현 및 질량 분석 데이터의 분석 조합을 통해 본 발명의 417개 펩티드가 밝혀졌다.
본 발명은 암/종양 치료, 바람직하게는 본 발명의 펩티드를 과다제시하거나 배타적으로 제시하는 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종 및 자궁암의 치료에 유용한 펩티드를 제공한다. 이러한 펩티드는 질량분석법에 의해 원발성 인간 암 샘플 상의 HLA 분자에 의해 자연적으로 제시되는 것으로 나타났다.
펩티드가 유래하는 근원 유전자/단백질("전장 단백질" 또는 "기저 단백질"로도 지정됨)의 다수는 근원 유전자에 대한 고도의 종양-연관을 표출하는 정상 조직과 비교해서 암에서 고도로 과발현되는 것으로 나타났다. 본 발명과 관련하여 "정상 조직"은 근원 유전자와의 높은 정도의 종양 연관성을 발휘하는 종양과 같은 장기로부터 유래하는 건강한 세포 또는 조직 또는 기타 정상 조직 세포를 의미한다(실시예 2 참조). 게다가, 펩티드 자체는 종양 조직에서 강력히 과다제시된다. 본 발명과 관련하여 "종양 조직"은 정상 조직상의 것이 아니라 암을 앓는 환자의 샘플을 의미한다(예를 들어, 실시예 1 참조).
HLA-결합된 펩티드는 면역계 특히 T 림프구에 의해서 인식된다. T 세포는 인식된 HLA/펩티드 복합체를 제시하는 세포, 예를 들어 유래된 펩티드를 제시하는 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종 또는 자궁암 세포를 파괴할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 T 세포 반응을 자극할 수 있으며/거나 과다제시되는 것으로 나타났으므로, 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR, 예를 들어 용해성 TCR의 생산에 사용될 수 있다(실시예 3 참조). 더욱이, 해당되는 MHC와 복합된 펩티드는 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR, 특히 sTCR의 생산에도 사용될 수 있다. 해당 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으며 해당 문헌에서도 찾을 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 환자의 종양 세포를 파괴할 수 있는 면역 반응을 생성하는데 유용하다. 환자의 면역 반응은 설명된 펩티드의 직접적인 투여 또는 면역성을 강화할 수 있는 제제(즉, 보조제)와 섞인 적당한 전조 물질(예를 들어, 연장된 펩티드, 단백질, 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산)을 환자에게 투여하는 것으로 유도될 수 있다. 이런 치료 백신에서 생긴 면역 반응은 본 발명의 표적 펩티드가 비교가능한 복사수로 정상 조직에서는 나타나지 않고, 환자의 정상 세포에 대한 기피되는 자기 면역 반응의 위험을 배제하기 때문에 종양 세포에 아주 특이적일 수 있다.
본 설명은 또한 알파 쇄 및 베타 쇄("알파/베타 TCR")를 구성하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 또한, MHC 분자에 의해 제시될 경우 TCR 및 항체에 결합할 수 있는 펩티드가 제공된다. 본 설명은 또한 본 설명의 TCR 및 펩티드의 발현을 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
"T 세포 수용체"(약자로 TCR)란 용어는 알파 폴리펩티드 쇄(알파 쇄) 및 베타 폴리펩티드 쇄(베타 쇄)로 구성된 이종이합체 분자를 칭하며 이종이합체 수용체는 HLA 분자에 의해 제시되는 펩티드 항원에 결합할 수 있다. 이 용어는 또한 소위 감마/델타 TCR도 포함한다.
한 구현에서 이 설명은 여기서 설명한 TCR 생산 방법을 제공하며 이 방법은 TCR의 발현 촉진에 적합한 조건 하에서 TCR을 발현시킬 수 있는 숙주 세포의 배양으로 구성된다.
다른 양상에서 본 발명은 본 설명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 상기 항원이 적절한 항원-제시 세포 또는 인공 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자에 로딩되거나 항원/클래스 I 또는 II MHC 복합체 단량체를 사합체화함으로써 상기 항원이 클래스 I 또는 II MHC 사합체에 로딩된다.
알파/베타 TCR의 알파 및 베타 쇄, 및 감마/델타 TCR의 감마 및 베타 쇄는 일반적으로 각각 2개의 "도메인", 즉, 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로 간주된다. 가변 도메인은 가변 영역(V) 및 결합 영역(J)의 연속으로 구성된다. 가변 도메인은 선도 구역(L)도 포함할 수 있다. 베타 및 델타 쇄도 다양성 구역(D)을 포함할 수 있다. 알파 및 베타 불변 도메인은 알파 및 베타 쇄를 세포막에 고정시키는 C-말단 막횡단(TM) 도메인도 포함할 수 있다.
감마/델타 TCR에 대하여, 본원에 사용된 "TCR 감마 가변 도메인"이란 용어는 선도 영역(L) 없는 TCR 감마 V(TRGV) 구역의 연속을 지칭하며, TCR 감마 불변 도메인이란 용어는 세포의 TRGC 구역이나 C-말단 절두된 TRGC 서열을 지칭한다. 마찬가지로 "TCR 델타 가변 도메인"이란 용어는 선도 영역(L)이 없는 TCR 델타 V(TRDV) 영역 및 TCR 델타 D/J(TRDD/TRDJ) 영역의 연속을 지칭하며 "TCR 델타 불변 도메인"이란 용어는 세포의 TRDC 영역 또는 C-말단 절단 TRDC 서열을 지칭한다.
본 설명의 TCR은 바람직하게는 결합 친화성(KD)이 약 100 μM 이하, 약 50 μM 이하, 약 25 μM 이하, 또는 약 10 μM 이하로서 펩티드-HLA 분자 복합체에 결합한다. 더욱 바람직하게는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 25 nM 이하의 결합 친화성을 갖는 고친화성 TCR이다. 본 발명의 TCR에 대한 바람직한 결합 친화성 범위의 비제한적 실례에는 약 1 nM 내지 약 10 nM; 약 10 nM 내지 약 20 nM; 약 20 nM 내지 약 30 nM; 약 30 nM 내지 약 40 nM; 약 40 nM 내지 약 50 nM; 약 50 nM 내지 약 60 nM; 약 60 nM 내지 약 70 nM; 약 70 nM 내지 약 80 nM; 약 80 nM 내지 약 90 nM; 및 약 90 nM 내지 약 100 nM이 포함된다.
본 설명의 TCR과 관련하여 본원에 사용된, "특이적 결합" 및 이의 문법적 변형들은 펩티드-HLA 분자 복합체의 결합 친화성(KD)이 100 μM 이하인 TCR을 의미한다.
본 발명의 알파/베타 이종이합체는 그 불변 도메인 사이에 개입된 이황화 결합이 있을 수 있다. 이 유형의 바람직한 TCR에는 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열이 있는 것들을 포함하지만, TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57은 시스테인 잔기에 의해 교체되고, 상기 시스테인은 TRAC 불변 도메인 서열과 TCR의 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열 사이에 이황화 결합을 형성한다.
위에서 언급된 도입된 쇄간 결합의 유무와 무관하게, 본 설명의 알파/베타 이종이량체 TCR은 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 가질 수 있으며, TCR의 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 기본 이황화 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 설명의 TCR은 방사선핵종, 형광단 및 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 본 설명의 TCR은 방사성핵종과 같은 치료적으로 활성인 제제, 화학요법 제제 또는 독소에 결합할 수 있다.
한 구현에서, 알파 쇄에서 하나 이상의 돌연변이를 갖고/거나 베타 쇄에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 본 발명의 TCR이 돌연변이되지 않은 TCR에 비해 변형된 글리코실화를 갖는다.
한 구현에서, TCR 알파 쇄 및/또는 TCR 베타 쇄에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 TCR의 펩티드-HLA 분자 복합체에 대한 결합 친화성 및/또는 결합 반감기가 돌연변이되지 않은 TCR 알파 쇄 및/또는 돌연변이되지 않은 TCR 베타 쇄을 포함하는 TCR의 그것보다 적어도 2배이다. 종양-특이적 TCR의 친화성-강화 및 이의 이용은 최적의 TCR 친화성에 대한 윈도우의 존재에 의존한다. 그러한 윈도우의 존재는 HLA-A2-제약된 병원체의 KD 값이 HLA-A2-제약된 종양 관련 자가-항원에 비해 일반적으로 약 10배라는 관찰에 근거한다. 종양 항원이 면역원성의 잠재성을 갖더라도, 종양이 개인 자신의 세포로부터 발생하기 때문에, 돌연변이된 단백질이나 변형된 번역 처리를 갖는 단백질만이 면역계에 의해 이물질로 보여지는 것으로 현재 알려져 있다. 상향조절되거나 과발현된 항원(소위 자가-항원)이 종양에 대해 기능적 면역 반응을 반드시 유도하지는 않을 것이다. 이러한 항원에 대해 반응성이 높은 TCR을 발현하는 T 세포는 자가-항원에 대해 낮은 친화성의 TCR을 가진 T 세포만 남는다는 의미로 알려진 중추 내성의 과정에서 흉선 내에서 부정적으로 선택되었을 것이다. 따라서, 본 발명의 TCR 또는 변이체의 본 발명에 따른 펩티드에 대한 친화성은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 강화시킬 수 있다.
본 설명은 또한 본 발명에 따른 TCR의 식별 및 분리 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 HLA-A*02-음성의 건강한 공여자로부터 PBMC를 A2/펩티드 단량체로써 배양하는 단계, PBMC를 사합체-파이코에리스린(PE)으로써 배양하는 단계, 및 형광 유세포 분리(FACS)-캘리버 분석에 의한 고결합성 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
본 설명은 또한 본 설명에 따른 TCR의 식별 및 단리에 관한 것으로, 상기 방법은 T 세포가 마우스 TCR 결핍을 보상하는 방대한 TCR 수집물을 발현하는 전체 인간 TCRαβ 유전자 자리들(1.1 및 0.7 Mb)로써 유전자이식 마우스의 획득, 관심 대상의 펩티드에 의한 마우스의 백신접종, 유전자이식 마우스로부터 얻어진 PBMC의 사합체-홍조(PE)에 의한 배양, 및 형광 유세포 분리(FACS)-캘리버 분석에 의한 고결합성 T 세포의 단리를 포함한다.
한 양태에 있어서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 취득하기 위해, 본 발명의 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 쇄를 인코딩하는 핵산을 감마 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 발현 벡터로 클로닝한다. 이 재조합 바이러스를 생성한 다음 항원 특이성 및 기능적 결합성과 같은 기능성에 대해 검사한다. 다음 최종 생성물의 일정 부분을 사용하여 표적 T 세포 군락(일반적으로 환자 PBMC로부터 정제됨)을 형질도입하며, 이는 확장된 다음 환자에게 주입한다. 다른 양태에 있어서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 취득하기 위해, TCR RNA는 당업계에서 알려진 기법으로, 예를 들어 시험관내 전사 시스템에서 합성한다. 다음, 시험관내에서 합성된 TCR RNA를 건강한 공여자로부터 얻은 원발성 CD8+ T 세포에 전기천공에 의해 도입함으로써 종양-특이적 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 쇄를 재발현시킨다.
발현의 증가를 위해, 본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 강력한 프로모터에 작동가능하게 연관시킬 수 있으며, 이는 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR), 거대세포 바이러스(CMV), 마우스 줄기세포 바이러스(MSCV) U3, 포스포글리세르산 인산화효소(PGK), β-액틴, 유비퀴틴 및 원숭이 바이러스 40(SV40)/CD43 복합 프로모터, 연장 인자(EF)-1a 및 비장 병소 형성 바이러스(SFFV) 프로모터 등이다. 바람직한 구현에서, 이 프로모터는 발현 중인 핵산에 대해 이종이다. 강력한 프로모터 외에도, 본 설명의 TCR 발현 카세트에는 이식 유전자 발현을 강화시킬 수 있는 추가의 요소들이 포함될 수 있으며, 이는 렌티바이러스성 구성의 핵 전위를 촉진하는 중앙 폴리퓨린 트랙(cPPT)(Follenzi et al., 2000), 및 RNA 안정성의 증가를 통해 이식 유전자 발현의 수준을 증가시키는 wPRE(우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소)(Zufferey et al., 1999) 등을 포함한다.
본 발명의 TCR의 알파 및 베타 쇄는 별개의 벡터에 위치한 핵산에 의해 인코딩할 수 있거나 동일한 벡터에 의한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩할 수 있다.
고수준의 TCR 표면 발현의 성취는 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄가 고수준으로 전사되는 것을 요구한다. 이를 위해서는, 본 설명의 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄가 단일 벡터에서 비시스트로닉 구성으로 클로닝될 수 있으며, 이는 이러한 장애물을 극복할 수 있는 것으로 나타난 바 있다. TCR-알파 및 TCR-베타 쇄 사이에 있는 바이러스성 내부 리보좀 엔트리 부위(IRES)를 사용하는 경우 두 쇄의 발현 조정을 초래하는데, 이는 번역 동안 2개의 단백질로 분해되는 단일 전사물로부터 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄가 생성됨으로써 동일한 몰 비율의 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄가 생성되도록 보장하기 때문이다(Schmitt et al. 2009).
본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 코돈의 최적화를 통해 숙주 세포의 발현을 증가시킬 수 있다. 유전 부호의 중복성으로 인해 일부 아미노산은 하나보다 많은 코돈에 의해 인코딩이 가능하지만, 특정 코돈은 다른 것보다 덜 "최적"인데 이는 tRNA는 물론 다른 인자의 짝짓기에 대한 상대적 가용도 때문이다(Gustafsson et al., 2004). 각 핵산이 포유류 유전자 발현을 위해 최적의 코돈에 의해 인코딩되도록 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 서열의 변형은 물론 mRNA 불안정성 모티프 또는 잠적 스플라이스 부위의 제거는 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 발현을 유의하게 강화시키는 것으로 나타났다(Scholten et al., 2006).
더욱이 도입된 TCR 쇄에 따라 내인성 TCR 쇄 사이의 틀린 짝짓기는 자가 면역에 대해 상당한 위험을 제기하는 특이성의 획득을 초래할 수 있다. 예를 들어, 혼합 TCR 이합체의 형성은 제대로 짝짓기된 TCR 복합체의 형성에 가용한 CD3 분자의 수를 감소시킬 수 있으며, 이에 따라, 도입된 TCR을 발현하는 세포의 기능적 결합성을 유의하게 감소시킬 수 있다(Kuball et al., 2007).
잘못된 짝짓기를 감소시키려면, 본 설명의 도입된 TCR 쇄의 C-말단 도메인을 변형하여 쇄간 친화성을 촉진시킬 수 있는 반면, 내인 TCR과 도입된 쇄의 짝짓기 능력을 감소시킬 수 있다. 이러한 전략에는 인간 TCR-알파 및 TCR-베타 C-말단 도메인의 상응하는 마우스 도메인에 의한 교체(마우스 C-말단 도메인); 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄 모두에 두 번째 시스테인 잔기를 도입하여 C-말단 도메인에서 두 번째 쇄간 이황 결합의 생성(시스테인 변형); TCR-알파 및 TCR-베타 쇄 C-말단 도메인에서 상호작용하는 잔기들의 교환("놉-인-홀(knob-in-hole)"); 및 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄의 가변 도메인의 CD3ζ에 대한 직접 융합(CD3ζ 융합)이 포함될 수 있다(Schmitt et al. 2009).
한 구현에서는, 숙주 세포를 본 설명의 TCR을 발현하도록 공학적으로 조작한다. 바람직한 구현에서는, 이 숙주 세포가 인간 T 세포 또는 T 전구세포이다. 일부 구현에서는 T 세포 또는 T 전구 세포를 암 환자로부터 얻는다. 다른 구현에서는 T 세포 또는 T 전구 세포를 건강한 공여자로부터 얻는다. 본 설명의 숙주 세포는 치료하려는 환자에 대해 동종이거나 자가일 수 있다. 한 구현에서, 이 숙주는 감마/델타 T 세포 변형을 통해 알파/베타 TCR을 발현한다.
"약학 조성물"이란 의학적 환경에서 인간에게 투여하는데 적합한 조성물이다. 바람직하게는, 약학 조성물은 무균이며 GMP 지침에 따라 생산된다.
약학 조성물은 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 된 펩티드를 포함한다(상기 내용도 참조). 본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 염"은 펩티드가 산 또는 제제의 염기 염을 만들며 변형되는 공개된 펩티드의 유도체를 언급한다. 예를 들어, 산성 염은 적당한 산과의 반응을 가진 자유 염기(일반적으로 중성 NH2 기가 있는 약물의 중성 형태)로부터 제조된다. 산성 염을 준비할 때 적당한 산은, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산과 같은 같은 무기산뿐만 아니라 초산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 수산, 말산, 말론산, 호박산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 계피산, 맨델릭산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산과 같은 유기산을 포함한다. 반대로, 펩티드에서 나타날 수 있는 산성 잔기의 염기 염의 제조는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘, 트라이메틸아민과 같은 약학적으로 허용가능한 염기를 사용한다.
특별히 바람직한 약학 조성물의 구현은 초산(아세트산염), 삼불화 초산 또는 염산(염화물)의 염으로서 펩티드를 포함한다.
바람직하게는, 이 본 발명의 약제는 백신과 같은 면역요법제이다. 이는 환자의 영향을 받은 기관에 직접적으로 투여될 수 있거나 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.로서 전체적으로 투여되거나 환자에게서 또는 나중에 환자에게 투여될 인간 세포주에 생체외로 적용될 수도 있거나 나중에 환자에게 다시 투여될 선택된 면역 세포의 부분 집단에 시험관내로 사용될 수도 있다. 만약 핵산이 시험관내에서 세포에 투여되면, 인터루킨-2와 같은 면역 유도 시토카인과 함께 발현되는 것이 유용할 수도 있다. 펩티드는 상당히 순도가 높을 수도 있고, 또는 면역 유도 보조제(아래 참조)와 결합되어 있거나 면역-유도 시토카인과 함께 합성체로 사용되거나, 리포좀과 같은 적당한 전달 체계와 함께 투여될 수도 있다. 펩티드는 또한 키홀 임펫 헤모시아닌(KLH) 또는 만난과 같은 적절한 담체와 접합시킬 수도 있다(WO 95/18145 및 문헌[Longenecker et al., 1993] 참고). 펩티드는 표지를 붙일 수도 있으며 융합 단백질일 수 있고 하이브리드 분자일 수도 있다. 본 발명에서 그 서열이 제공된 펩티드는 CD4 또는 CD8 T 세포를 자극할 것으로 기대된다. 하지만 CD8 세포의 자극은 CD4 보조 T 세포에 의해 제공되는 도움이 존재할 때 더 효율적이다. 따라서, CD8 T 세포를 자극하는 MHC 클래스 I 에피톱의 경우, 융합 파트너 또는 하이브리드 분자의 섹션은 CD4-양성 T 세포를 자극하는 에피톱을 적절하게 제공한다. CD4-와 CD8-자극 에피톱은 이 분야에서 잘 알려졌고 본 발명에서 식별된 것들을 포함한다.
한 양태에서, 이 백신은 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388을 명시하는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드 및 하나 이상의 추가적인 펩티드, 바람직하게는 2개 내지 50개이고, 더 바람직하게는 2 내지 25개이며, 보다 더 바람직하게는 2개 내지 20개이고, 가장 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 펩티드를 포함한다. 펩티드는 하나 이상의 특정한 TAA에서 유도되었고 이는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)에 대한 정보를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이의 결합일 수 있으며, 한 가닥 및/또는 이중 쇄로 되어 있을 수 있고, 또는 본래의 형태일 수도 있거나, 예를 들어 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드의 안정화된 형태로 되어 있을 수도 있으며, 펩티드를 코딩하는 한 인트론을 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 단지 자연적으로 일어나는 아미노산 잔기로 구성된, 및 자연적으로 일어나는 펩티드 결합에 의해 결합된 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해서 인코딩될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터에 대한 설명을 제공한다.
특히 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드를, 벡터, 예를 들어 보완 응집성 말단을 이용하여 연결하는 여러 가지 방법이 개발되었다. 예를 들어, 보완 동종중합체 트랙트가 DNA 조각에 추가되어 이를 벡터 DNA에 삽입할 수 있다. 벡터와 DNA 조각은 이후 보완 동종중합체 꼬리와 함께 수소 결합을 이용하여 재조합 DNA 분자를 생성할 수 있다.
하나 이상의 제한 부위를 포함하는 합성된 연결부위는 DNA 분절과 벡터를 결합하는 다른 방법을 제시한다. 여러 가지의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 연결부위는 상업적으로 International Biotechnologies Inc(New Haven, CN, USA)를 비롯한 곳에서 구입이 가능하다.
본 발명에서 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 변형하는 바람직한 방법은 다음의 Saiki RK 등에 의하여 공개된 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한다(Saiki et al., 1988). 이 방법은, 예를 들어 적당한 제한 부위를 만들어 적당한 벡터로 DNA를 도입하는데 사용하거나 당업계에서 알려져 있는 DNA를 다른 유용한 용도를 위해 변형하는데 사용될 수도 있다. 만약 바이러스 벡터가 사용된다면, 수두 벡터 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다.
DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 그 후 적당한 숙주에서 발현되며 이는 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 가지고 있는 폴리펩티드를 생성한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 DNA는 알려진 기술과 여기에서 배울 수 있는 것을 고려하여 적절히 수정하여 적절한 숙주 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생성하도록 형질전환시키는 데 사용된다. 이러한 기법은, 예를 들어 다음에 공개되어 있다: 미국 특허 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 및 4,810,648.
본 발명의 화합물을 만드는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 많은 종류의 다른 DNA 서열과 결합되어, 적절한 숙주로의 도입을 유도할 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, DNA를 숙주로 도입하는 방법 및 에피솜 유지 또는 통합이 필요한지에 따라 결정될 것이다.
보통, DNA는 발현을 위한 올바른 방향 및 올바른 리딩 프레임에 맞추어 플라스미드와 같은 발현 벡터로 삽입된다. 필요할 경우, DNA는 바람직한 숙주에 의해 인식되는 적당한 전사 조절 제어 뉴클레오티드 서열(하지만, 이 제어는 대부분의 경우 발현 벡터 내에 이미 존재한다)에 연결될 수도 있다. 벡터는 그 후 숙주로 기본적인 기술을 통해 도입된다. 보통, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지 않는다. 따라서, 형질전환된 세포를 선택하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선택 기술은 형질전환된 세포에서 선택이 가능한 특성(예: 항생제 내성)을 코딩하는 DNA 서열을 필요한 제어 요소와 함께 발현 벡터에 통합시키는 것이다.
다른 방법으로는, 이러한 선택이 가능한 특성이 다른 벡터에 있을 수도 있으며, 이는 바람직한 숙주 세포를 동시-형질전환하는데 사용된다.
발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 문서에서 기술된 내용을 고려하여 당업자가 이미 알고 있는 적절한 상태에서 충분한 시간 동안 배양되어 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하며, 이는 후에 회복된다.
박테리아(예를 들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 사상균류(예를 들어, 아스퍼길러스 스피시즈(Aspergillus spec.)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포 등의 많은 발현 체계가 알려져 있다. 바람직하게는, 그 체계는 ATCC Cell Biology Collection에서 구할 수 있는 CHO 세포 등의 포유류 세포로 구성될 수 있다.
구조성 발현을 위한 전형적인 포유류 세포 벡터 플라스미드는 CMV 또는 SV40 촉진제와 적당한 폴리 A 꼬리 및 네오마이신과 같은 저항성 마커를 포함한다. 하나의 예는, Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)에서 구할 수 있는 pSVL이다. 유도가능 포유류 발현 벡터의 예는 pMSG이며 이 또한 Pharmacia에서 구할 수 있다. 유용한 효소 플라스미드 벡터는 pRS403-406과 pRS413-416이며 이는 대부분 Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA 92037, USA)에서 구할 수 있다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효소 통합 플라스미드(YIps)이며 이는 효소 선택 마커 HIS3, TRP1, LEU2와 URA3을 통합한다. 플라스미드 pRS413-416은 효소 동원체 플라스미드(Ycps)이다. (예를 들어, Sigma-Aldrich로부터 입수한) CMV 프로모터 기반 벡터는 일시적인 또는 안정된 발현, 세포질 발현 또는 분비, 및 FLAG, 3xFLAG, c-myc 또는 MAT 등의 다양한 조합으로 N-말단 또는 C-말단 표지 등을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 단백질의 검출, 정제와 분석을 가능하게 한다. 이중 표지 융합은 검출 시 유연성을 제공한다.
강한 인간 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터 조절 영역은 구성 단백질 발현 수준을 높게는 COS 세포에서 1 mg/L까지 작동한다. 좀 더 효능이 약한 세포주에서는, 단백질 수준이 전형적으로 약 0.1 mg/L 정도이다. SV40 복제 원점의 존재는 SV40 복제를 가능하게 하는 COS 세포에서 높은 수준의 DNA 복제를 야기한다. CMV 벡터는, 예를 들어 박테리아 세포에서의 복제를 위한 pMB1 원점, 박테리아에서 암피실린 저항 선택을 위한 b-락타마제 유전자, hGH poly A, 및 f1 원점을 포함할 수 있다. 프리프로트립신 리더(PPT) 서열을 포함하는 벡터는 FLAG 융합 단백질을 ANTI-FLAG 항원, 레진, 및 플레이트를 사용하여 정제하기 위한 배양 배지로 분비하도록 방향을 정할 수가 있다. 다른 벡터와 발현 체계는 여러 가지의 숙주 세포 사용에 대해 널리 알려져 있다.
다른 구현에서는 본 발명의 2개 이상의 펩티드나 펩티드 변이체가 인코딩됨으로써 연속적인 순서로 발현된다("염주 모양" 구조와 유사). 그렇게 함으로써 펩티드나 펩티드 변이체는, 예를 들어 LLLLLL과 같은 링커 아미노산의 퍼짐에 의해 함께 연결 또는 융합될 수 있으며 또한 그 사이에 추가의 펩티드 없이 연결될 수 있다. 이러한 구성들은 암 요법에서도 사용할 수 있으며 MHC I 및 MHC II 모두가 연관되는 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구성에 의해 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 박테리아 세포가 몇몇의 상황에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있으며, 보통 Bethesda Research Laboratories Inc.(Bethesda, MD, USA)에서 구할 수 있는 에스케리치아 콜라이 균주 DH5, 및 American Type Culture Collection(ATCC)(Rockville, MD, USA)(No ATCC 31343)에서 RR1이 입수가능하다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효소, 곤충, 포유류 세포를 포함하고, 생쥐, 쥐, 원숭이 또는 인간 섬유아세포와 대장 세포주 등의 척추 동물이 바람직하다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501을 포함하며, 이는 대부분 Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA 92037, USA)에서 구입이 가능하다. 바람직한 포유류 숙주 세포는 ATCC에서 구입이 가능한 CCL61로 알려져 있는 중국 햄스터 난소 세포, CRL 1658로 알려져 있는 스위스 생쥐 배아 세포 NIH/3T3, CRL 1650 세포로 알려져 있는 원숭이 신장-유도 COS-1 세포와 293 세포로 알려져 있는 인간 배아 신장 세포를 들 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf9 세포이며 이는 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 세포로 감염될 수 있다. 발현을 위한 적당한 숙주 세포의 선택에 대한 개관은 예를 들어 문헌[Paulina Balbas and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1- 58829-262-9] 및 당해 분야의 숙련자에게 알려진 다른 문헌에서 찾을 수 있다.
적당한 세포 숙주를 본 발명의 DNA 구성으로 형질전환하는 것은 보통 사용되는 벡터의 유형이 따라 결정되는 잘 알려진 방법으로 완성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 대해서는, 예를 들어 Cohen 등(Cohen et al., 1972) 및 문헌[Green and Sambrook, 2012]을 참조한다. 효모 세포의 형질전환은 Sherman 등에 설명되어 있다(Sherman et al., 1986). Beggs의 방법(Beggs, 1978) 또한 유용하다. 척추 동물 세포와 관련하여 이러한 세포를 감염시키는 시약, 예를 들어 칼슘 인산염과 DEAE-덱스트란 또는 리포좀 제제는 Stratagene Cloning Systems 또는 Life Technologies Inc.(Gaithersburg, MD 20877, USA)에서 입수할 수 있다. 전기 천공법 역시 형질전환 및/또는 세포를 감염시키는데 유용하며 이는 효소 세포, 박테리아 세포, 곤충세포 및 척추동물 세포 형질전환에 잘 알려져 있다.
성공적으로 형질전환이 된 세포, 즉 본 발명의 DNA 구조를 가지고 있는 세포는 잘 알려진 PCR과 같은 기술로 식별된다. 다른 방법으로는, 상청액에 존재하는 단백질은 항생제를 사용함으로써 검출될 수 있다.
본 발명의 특정한 숙주 세포, 예를 들어 박테리아, 효소 및 곤충 세포와 같은 세포는 본 발명의 펩티드의 준비에 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 하지만, 다른 숙주 세포 또한 특정한 치료 방법에 유용할 수도 있다. 예를 들어, 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포는 적당한 MHC 분자에 로딩이 되도록 하는 본 발명의 펩티드를 발현하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 구현에서, 숙주 세포는 항원-제시 세포이며, 특히 수지상 세포 또는 항원-제시 세포이다. 전립선산 인산효소(PAP)를 함유하는 재조합 융합 단백질로 로딩된 APC는 무증상 또는 최소한의 증상 전이성 HRPC(Sipuleucel-T)의 치료에 대해 미국 식품안전청(FDA)에서 2010년 4월 29일에 승인된 바 있다(Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
본 발명의 다른 양태는 펩티드 또는 그 변이체를 생산하는 방법, 숙주 세포를 배양하고 펩티드를 숙주 세포 또는 배지에서 단리하는 것을 포함한 생산 방법을 제공한다.
다른 구현에서는 본 발명의 펩티드, 핵산 또는 벡터 발현이 의학에서 사용된다. 예를 들어, 펩티드 또는 그의 변이체는 정맥내(i.v.) 투여, 피부하(s.c.) 투여, 피부내(i.d.) 투여, 복강내(i.p.) 투여, 근육내(i.m.) 투여를 포함한다. 펩티드 투여의 바람직한 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m., 및 i.v. 투여를 포함한다. DNA 투여의 바람직한 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v. 투여를 포함한다. 펩티드 또는 DNA의 50 μg 및 1.5 mg, 바람직하게는 125 μg 내지 500 μg의 용량이 각각의 펩티드 또는 DNA에 따라서 투여될 수 있다. 이러한 범위의 용량이 이전의 임상실험에서 성공적으로 사용된 바 있다(Walter et al., 2012).
능동적 백신접종에 사용된 폴리뉴클레오티드는 상당히 순도가 높거나 적당한 벡터 또는 전달 체계에 포함되어 있을 수 있다. 핵산은 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 핵산을 설계하고 도입하는 방법은 이 업계에 잘 알려져 있다. 개요는, 예를 들어 Teufel 등(Teufel et al., 2005)이 제공하고 있다. 폴리뉴클레오티드 백신은 만들기가 쉽지만, 이들 벡터의 면역 반응을 유도하는 동작 모드는 완전히 이해가 되지 않았다. 적당한 벡터와 전달 체계는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 하나 이상의 바이러스를 포함하는 혼성체 등의 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 비-바이러스 전달 체계는 양이온 지질과 양이온 중합체를 포함하고 있으며 DNA 전달 분야에서 잘 알려져 있다. "유전자-총(gene-gun)"을 통한 것과 같은 물리적 전달 또한 사용될 수 있다. 펩티드 또는 핵산에 의해 인코딩된 펩티드는 융합 단백질이 될 수도 있고, 예로서는 위에서 언급한 각각의 반대 CDR을 위한 T 세포를 유도하는 에피톱을 들 수 있다.
본 발명의 약제는 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 면역 반응을 비특이적으로 향상시키거나 강력하게 하는 물질을 언급한다(예: 항원에 대한 CD80-양성 T 세포 및 조력 T(TH) 세포에 의해서 중재된 면역 반응). 따라서, 본 발명에서 보조제는 유용한 약제 구성이라고 할 수 있다. 적당한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라젤린에서 유도된 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(ALDARA®), 레스퀴미드, ImuFact IMP321, IL-2, IL-13, IL-21과 같은 인터루킨, 인터페론 알파 또는 베타, 또는 이들의 페길화된 유도체, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, 주브이뮨(JuvImmune), LipoVac, MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 유중수형과 수중유형 에멀전, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® 벡터 시스템, PLG와 덱스트란 극미립자, 탈락토페린, SRL172, 비로솜(Virosome) 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타글루칸, Pam3Cys, 사포닌에서 유도된 아퀼라스 QS21 스틸물론, 마이코박테리아 추출물과 합성 세균의 세포 벽 모방제, 및 다른 리비의 데톡스(Ribi's Detox), 쿠일(Quil), 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 독점 보조제 등이 있다. 프로인트 보조제(Freund's adjuvant) 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 바람직하다. 몇몇 면역적 보조제(예: MF59)는 수지상 세포에 특이적이고, 그 제조 방법은 이전에 묘사된 바 있다(Allison and Krummel, 1995). 또한, 시토카인도 사용될 수 있다. 몇몇 시토카인은 수지상 세포의 림포이드 조직으로의 이동에 영향을 주는 것에 직접적으로 연관된 바 있으며(예: TNF-α), 이는 수지상 세포의 더 효율적인 T 림프구에 대한 항원-제시 세포로의 성장을 가속시키고(예: GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(미국 특허 5,849,589, 본원에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 면역보조제의 역할을 한다(예: IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-알파, IFN-베타)(Gabrilovich et al 1996).
CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드는 백신 세팅에서 보조제의 효율성을 높이는 것으로 나타났다. 이 이론에 국한하지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR), 특히 TLR9를 통해 선천(비적응) 면역 반응을 활성화시킨다. CpG에 의해 유도된 TLR9의 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 살아 있거나 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가 세포 백신 및 예방적 및 치료적 백신의 다당류 접합체를 포함한 넓은 종류의 항원에 대한 항원-특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게 이는 수지상 세포의 성숙 및 차별화를 향상시키고 이는 TH1 세포의 활성화를 향상시키며 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 생성을 CD4 T 세포의 도움이 없을 때에도 향상시킨다. TLR9 자극에 의해 일어난 TH1 바이러스는 보통 TH2 바이러스를 촉진시키는 명반 또는 비완성된 프로인트 보조제(IFA)와 같은 백신 보조제가 존재할 때도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 다른 보조제와 함께 제조되거나 함께 투여될 시 또는 특히 항원이 상대적으로 약할 때 강한 반응을 얻어내기 위해 필요한 미세입자, 나노입자, 지질 에멀전 또는 비슷한 제약으로 되어 있을 경우 더 큰 보조제 활동을 보인다. 그들은 또한 면역 반응을 가속화시키고, 몇몇의 연구에서 보여진 바 있듯이 CpG가 없을 때 백신 전체 용량이 일으키는 항체 반응 수준으로 항원의 용량을 약 2배 정도 줄일 수 있도록 한다(Krieg, 2006). 미국 특허 6,406,705 B1은 CpG 올리고뉴클레오티드, 비핵산 보조제 및 항원 특이 면역 반응을 일으키는 항원의 결합 사용에 대해 묘사한다. CpG TLR9 길항제는 Mologen(Berlin, Germany)에 의해 만들어진 dSLIM(double Stem Loop Immunomodulator)이며 이는 본 발명의 제약 조성의 바람직한 성분이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9 등의 다른 TLR 결합 분자 또한 사용이 가능하다.
다른 유용한 보조제의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 화학적으로 변형된 CpGs(예: CpR, Idera), Poly(I:C)와 같은 dsRNA 유사체 및 그 유도체, 예컨대 앰프리젠(AmpliGen), 힐토놀(Hiltonol), poly-(ICLC), poly(IC-R), poly(I:C12U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA 및 사이클로포스아미드, 수니티닙, 베바시주맙(Bevacizumab), 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라페닙, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 항-CTLA4와 같은 면역활성적인 작은 분자 및 항체 및 면역계의 주요 구조를 표적화하는 다른 항체(예: 항-CD-40, 항-TGF베타, 항-TNF알파 수용체) 및 SC58175가 있으며 이는 치료적으로 또는 보조제의 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 보조제와 첨가제의 양과 농도는 과도한 실험 없이 숙련된 기술자에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.
바람직한 보조제들은 이미퀴모드, 레시퀴모드, GM-CSF, 사이클로포스파마이드, 수리티닙, 베바시주맙, 인터페론-알파, CpG, 올리고뉴클레오티드 및 유도체 폴리-(I:C) 및 유도체, RNA, 실데나필, 및 PLG 또는 비로솜 미립자 제제이다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니-자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 인테페론 알파와 같은 콜로니 자극 인자로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 및 레시퀴모드로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 또는 레시퀴모드이다. 훨씬 더 바람직한 보조제는 Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC(Hiltonol®) 및 anti-CD40 mAB 또는 이들의 조합들이다.
이 조성물은 피하, 피부내, 근육내 비경구 투약 또는 경구 투약에 사용된다. 이를 위해, 펩티드 및 임의적으로 다른 분자들을 약학적으로 허용되는, 바람직하게는 수용성 담체에 용해하거나 현탁한다. 추가로, 이 조성물은 완충제, 결합제, 발파제, 희석제, 향미료, 윤활제 등과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 또한 펩티드는 시토카인 같은 면역 자극 물질과 같이 투여될 수도 있다. 이러한 성분에 사용될 수 있는 방대한 부형제 목록은, 예를 들어 다음에서 확인할 수 있다: A. Kibbe, 약학적 부형제 핸드북(Kibbe, 2000). 이러한 조성물은 선종성 또는 암성 질병의 예방, 방지 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 예시적 제제는 예를 들어 EP2113253에서 찾을 수 있다.
본 발명에 따른 백신에 의해 일어나는 면역 반응이 다른 세포 단계 및 다른 개발 단계에서 암을 공격한다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 더욱이, 암과 연관된 다른 신호전달 경로가 공격을 받는다. 이것은 단 하나 또는 몇몇 표적만을 다루며 종양으로 하여금 공격에 쉽게 적응하도록 유발할 수 있는(종양 탈출) 백신에 비해 이점으로 작용한다. 더욱이, 모든 개별 종양들이 같은 항원의 패턴을 발현하는 것은 아니다. 따라서, 몇몇 종양-연관 펩티드들의 조합은 모든 개별 종양이 적어도 표적의 일부를 갖도록 한다. 이 조성물은 각 종양이 몇 개의 항원을 발현할 것으로 기대되며 종양 성장 및 유지에 필요한 몇 개의 독립적 경로를 다루도록 설계되었다. 따라서, 백신은 보다 큰 환자 모집단을 위해 "기성품"으로 쉽게 사용이 가능하다. 이는 백신으로 치료할 환자의 사전 선택을 HLA 유형결정으로 제약될 수 있고, 항원 발현을 위해 어떠한 추가의 바이오마커 평가를 요구하지 않음을 의미하지만, 효능에 중요한 몇몇 표적들이 유도된 면역 반응에 의해 동시적으로 공격되도록 계속 보장한다(Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
본원에 사용된 "골격(scaffold)"이란 용어는 (예: 항원성) 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 언급한다. 한 구현에서, 골격은 그것이 부착되는 객체(예: (제2) 항원 결합 모이어티)를 표적 부위, 예를 들어 특이한 유형의 종양 세포 또는 항원성 결정인자를 갖는 종양 간질(예: 당장의 용도에 따른 펩티드와 MHC의 복합체)로 향하도록 지시할 수 있다. 또 다른 구현에서, 골격은 그 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 골격은 항체 및 그 단편, 항체 중쇄 변수 영역 및 항체 연쇄 변수 영역을 포함하는 항체의 도메인에 결합하는 항원, 하나 이상의 앙키린 반복 모티프 및 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함하는 결합 단백질, 압타머, (용해성) TCR 및 동종 또는 자가 T 세포와 같은 (변형된) 세포를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 어떤 분자가 표적에 결합하는 골격인지 평가하기 위해, 결합 검정을 수행할 수 있다.
"특이적" 결합이란 그 골격이 다른 자연적으로 발생하는 펩티드-MHC-복합체보다 관심 대상의 펩티드-MHC-복합체에 더 잘 결합하며, 그 정도는 특정 표적이 포함된 세포를 줄일 수 있는 활성 분자로 무장한 골격이 특정 표적이 없는 다른 세포는 죽일 수 없으며 다른 펩티드-MHC 복합체를 제시하는 것을 의미한다. 교차-반응성 펩티드-MHC의 펩티드가 자연적으로 발생하지 않는다면, 즉 인간 HLA-펩티돔으로부터 유래되지 않는다면, 다른 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 관련이 없다. 표적 세포 살해의 평가 검사는 당업계에 잘 알려져 있다. 이 검사는 변경되지 않는 펩티드-MHC 제시를 가진 표적 세포(일차 세포 또는 세포주) 또는 자연적으로 발생되는 펩티드-MHC 수준이 도달되는 정도로 펩티드가 포함된 세포를 사용하여 수행해야 한다.
각 골격은 표지가 제공하는 신호의 존재나 부재를 판단함으로써 결합된 골격이 검출가능하도록 제공하는 표지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 골격은 형광 염료나 일체의 다른 해당되는 세포 마커 분자를 사용하여 표지가 가능하다. 그러한 마커 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 형광 표지(예를 들어, 형광 염료에 의해 제공되는)는 형광이나 레이저 스캐닝 현미경 또는 유세포 분석에 의해 결합된 압타머의 가시화를 제공할 수 있다.
각 골격은 IL-21, 항CD3, 항CD28과 같은 두 번째 활성 분자와 접합될 수 있다.
폴리펩티드 골격에 대한 추가 정보는, 예를 들어 WO 2014/071978A1의 배경기술 부분과 거기에 인용된 참조문헌을 참조한다.
본 발명은 또한 압타머에 관한 것이다. 압타머(예를 들어, WO 2014/191359 및 여기에 인용된 문헌을 참조)는 정의된 삼차원적 구조로 접힐 수 있으며 특정 표적 구조를 인지할 수 있는 짧은 단일 가닥 핵산 분자이다. 이것은 표적 요법의 개발에 필요한 적합한 대안인 것으로 보여진 바 있다. 압타머는 높은 친화성 및 특이성으로써 다양한 복합체 표적에 임의적으로 결합하는 것으로 나타난 바 있다.
세포 표면에 위치한 분자를 인지하는 압타머가 지난 십 년 동안 동정된 바 있으며 진단 및 치료 접근방식을 개발하기 위한 수단을 제공한다. 압타머가 독성 및 면역원성을 거의 소유하지 않는 것으로 나타난 바가 있으므로, 생존의학적 용도를 위한 유력한 후보이다. 정말로 압타머, 예를 들어 전립선 특이적 막-항원을 인지하는 압타머는 표적 대상의 요법을 위해 성공적으로 사용되어 왔으며 또한 생체 모델에서의 이종이식에 기능적인 것으로 나타난 바 있다. 더욱이 특이적 종양 세포주를 인지하는 압타머가 동정된 바 있다.
DNA 압타머는 다양한 암 세포 및 특히 고형 종양으로부터 유래하는 것들을 위한 광범위 인지 성질을 밝히기 위해 선택가능한 반면에, 비종양형성 및 원발성의 건강한 세포는 인지되지 않는다. 동정된 압타머가 특이적 종양 아형을 인지할 뿐만 아니라 일련의 종양과 상호작용한다면, 이로 인해 압타머는 소위 광범위 진단 및 치료에 적용될 수 있다.
더욱이, 유세포 분석을 사용한 세포 결합 거동의 조사에 의하면 압타머는 나노몰 범위에서 매우 양호하고 뚜렷한 친화성을 드러내는 것으로 나타났다.
압타머는 진단 및 치료 목적으로 유용하다. 더욱이 일부 압타머는 종양 세포에 의해 섭취되어 종양 세포 안으로의 siRNA와 같은 항암제의 표적화된 전달을 위한 분자 부형제로서 기능할 수 있음을 보여줄 수 있다.
압타머는 세포와 조직과 같은 복합체 표적 및 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388 중 어느 하나에 따른 서열을 포함하는(바람직하게는 이들로 구성된) 본 발명에 따른 펩티드와 MHC 분자와의 복합체에 대하여, 세포-SELEX(지수적 증식에 의한 리간드의 체계적 진화) 기법을 사용하여 선택될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 MHC/펩티드 복합체에 대한 특정 항체를 생성하고 개발하는데 사용될 수 있다. 이들은 병변 조직에 치료, 독성 물질 표적화 또는 방사능 물질로 사용될 수 있다. 이런 항체의 또 다른 사용은 PET 같은 이미지 목적을 위해 병변 조직의 방사성 핵종을 표적화할 수도 있다. 이 사용은 작은 전이를 검출하거나 병변 조직의 크기와 정확한 위치를 결정하는데 도움이 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합하는 재조합 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 상기 HLA 제한 항원과 복합체를 형성하는 용해성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로써 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 단리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 하나 이상의 파지의 단리를 포함하며, 상기 하나 이상의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 특이적으로 결합하는 상기 항체를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것으로 이 항체는 바람직하게는 다클론 항체, 단클론 항체, 양특이성 항체 및/또는 키메라 항체이다.
그러한 항체 및 단일 쇄 클래스 I 주조직적합 복합체의 생산을 위한 해당 방법들은 물론 이러한 항체의 생산을 위한 다른 도구들은 WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 및 문헌[Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003]에 공개되어 있으며, 이들은 본 발명의 목적을 위해 그 전문이 참조문헌에 명백히 포함되어 있다.
바람직하게는 항체는 20 nM 미만, 복합체에 대해서 바람직하게는 10 nM 미만의 결합 친화성으로써 복합체와 결합하는데, 이는 또한 본 발명의 맥락에서 "특이적"으로 간주된다.
본 발명은 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388로 구성된 군으로부터의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 또는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 대해 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 동일한) 그 변이체 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체에 관한 것으로, 상기 펩티드는 기저 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명은 또한 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388로 구성된 군으로부터의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 또는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 대해 적어도 90% 상동성인(바람직하게는 동일한) 그 변이체에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 변이체는 전체 길이가 8 내지 100개, 바람직하게는 8 내지 30개, 가장 바람직하게는 8 내지 14개의 아미노산이다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖는 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드는 서열식별번호 1 내지 388에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드는 (화학적으로) 변형되거나/며 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 펩티드는 융합 단백질의 일부이며, 특히 HLA-DR 항원 연관 불변쇄(Ii)에 융합되거나, 펩티드는, 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 안으로) 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명이 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것으로, 펩티드는 완전한 (전부) 인간 단백질이 아니다.
본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있거나 발현하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의학, 특히 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암(GC), 고환암(TC), 방광암(UBC), 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암(UEC)과 같은 암의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항원-제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 단리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원-제시 세포가 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388을 포함하는 상기 펩티드 또는 상기 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있는 펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 활성화된 T 세포에 관한 것으로, 상기 T 세포는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 또한 표적 세포가 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 설명한 일체의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포 독성 T 림프구의 약제로서 또는 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로, 상기 약제는 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로, 상기 약제는 백신이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로, 상기 약제는 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로, 상기 암 세포는 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암과 같은 고형이나 혈액 종양 세포이다.
본 발명은 또한 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암의 진단 및/또는 예후에 사용가능한(본원에서 "표적"이라 지칭되는) 본 발명에 따른 펩티드에 근거한 특별 표지자 단백질 및 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 치료를 위한 이러한 새로운 표적의 용도에 관한 것이다.
"항체"란 용어는 본원에서 넓은 범위로 사용되며, 다클론 및 단클론 항체를 포함한다. 손상되지 않은 또는 "전체" 면역글로불린 분자 외에도, "항체"란 용어에는 이러한 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 인간화 버전의 단편(예: CDR, Fv, Fab 및 Fc 단편) 또는 중합체 또한 포함되는데, 본 발명에 따른 일체의 바람직한 성질(예: 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암 표지자 (폴리)펩티드의 특이적인 결합, 암 표지자 유전자를 상승된 수준으로 발현하는 암 세포로의 독소 전달 및/또는 암 표지자 폴리펩티드의 활성도 억제)을 나타내야 한다.
가능한 한, 본 발명의 항체는 상용 공급원에서 구입해야 한다. 본 발명의 항체는 잘 알려진 방법을 통해서 만들어질 수도 있다. 당업자는 전장의 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암의 표지자 폴리펩티드 또는 이의 단편이 본 발명의 항체 생성에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 항체를 생성하는데 사용될 폴리펩티드는 자연적인 원천에서 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있거나, 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어질 수도 있다.
예를 들어, 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388에 따른 본 발명에 따른 펩티드 또는 그 변이체 또는 단편을 인코딩하는 cDNA는 원핵 세포(예, 박테리아) 또는 진핵 세포(예, 효모, 곤충 또는 포유류 세포)에서 발현될 수 있으며, 재조합 단백질은 그 후 정제되고 본 발명에 따른 항체 생성에 사용되는 상기 암에 대한 마커 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체 제조에 사용될 수 있다.
당업자는 2개 이상의 다른 단클론 또는 다클론 항체의 조합의 생성이 의도하는 용도(예: ELISA, 면역조직화학, 생체내 이미징, 면역 독소 요법)에 요구되는 특이성 및 친화성을 갖는 항체의 획득가능성을 최대화시킴을 인식할 것이다. 이 항체들은 그 항체들이 사용되는 목적에 의거하여 알려진 방법에 의해 목적하는 활성에 대해 시험된다(예: ELISA, 면역조직화학, 면역요법 등; 항체의 생성과 시험에 관한 추가 지침은, 예컨대 문헌[Greenfield, 2014]을 참고한다). 예를 들어, 항체는 ELISA 검정, 웨스턴 블롯, 포르말린 고정 암 면역조직화학 염색 또는 동결 조직 절개에서 시험할 수 있다. 치료 또는 생체내 진단을 위한 항체는 초기의 시험관내 특성화 이후, 알려진 임상 시험 방법에 따라 시험한다.
"단클론 항체"라는 용어는 본원에서 실질적으로 균질한 항체 집단에서 획득된 것을 언급한다. 즉, 이 집단이 포함하는 각각의 항체는 자연적으로 일어날 수 있는 소수의 변이체를 제외하고는 동일하다. 본원에서 단클론 항체는 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분이 특정한 종 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체의 서열과 상응하거나 일치하고, 쇄의 나머지 부분은 다른 종 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체 및 이러한 항체의 단편의 서열과 상응하거나 일치하고, 희망하는 상반되는 활동성을 보여주는 "키메라" 항체를 포함한다(미국 특허 4,816,567, 전문이 여기에 포함됨).
본 발명의 단클론 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 생쥐 또는 다른 적당한 숙주 동물이 보통 면역성을 주는 작용제에 의해 면역되어, 면역성을 주는 작용제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 이를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있는 림프구를 유도한다. 다른 방법으로는, 림프구는 시험관내에서 면역될 수도 있다.
단클론 항체는 미국 특허 4,816,567에 설명된 것과 같은 재조합 DNA 방법들에 의해서도 만들어질 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 인코딩하는 DNA는 손쉽게 격리되고 전통적인 방법을 사용하여 염기 서열 분석이 가능하다(예, 마우스 유래 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특정하게 결합할 수 있는 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써).
시험관내 방법 또한 1가(monovalent) 항체를 제조하는 데에 적당하다. 이 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 항체를 절편화시켜 항체의 단편을 특히 여기서는 Fab 단편을 생산할 수 있다. 예를 들어, 파파인을 사용하여 절편화가 이루어질 수 있다. 파파인 절편화의 예는 WO 94/29348 및 미국 특허 4,342,566에 설명되어 있다. 항체의 파파인 절편화는 보통 각각 하나의 항원 결합 위치 및 남은 Fe 단편을 포함한 Fab 단편의 동일한 2개의 항원 결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편 및 pFc' 단편을 생산한다.
항체 단편(다른 서열과 붙어 있든 그렇지 않든 간에)은 또한 단편의 활동력이 변경되지 않은 항체 또는 항체 단편에 비교할 시, 현저하게 바뀌거나 손상이 되지 않는 한, 삽입, 삭제, 치환, 또는 특정한 위치 또는 특정한 아미노산 잔기의 다른 선택된 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 이황화물 결합의 능력이 있는 아미노산의 제거/추가, 생물적 생명의 증가, 분비 특징의 변화 등의 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우에도, 항체 단편은 결합성, 결합 도메인에서의 결합 조정 등의 생물작용 성질을 소유하고 있어야 한다. 항체의 기능적인 또는 활동적인 범위는 단백질의 특정한 지역의 돌연변이 생성, 발현 및 이 발현된 폴리펩티드의 실험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법은 이 분야의 기술자가 손쉽게 알 수 있는 기술이며 이는 항체 단편을 인코딩하는 핵산의 위치-특정 돌연변이 생성을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 인간화된 형태의 비-인간(예, 쥐과 동물) 항체는 최소의 비-인간 면역글로불린 항체에서 유도된 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린 항체, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항체의 항원 결합의 결과)이다. 인간화된 항체는 상보성 결정 영역(complementary determining region(CDR))의 잔기가 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여 항체)의 CDR의 잔기로 바뀐 요구되는 특이성, 친화력 및 수용력을 가진 인간 면역글로불린(수용 항체)이다. 몇몇의 예에서는, 인간 면역글로불린의 Fv 구조(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 인간화된 항체는 수용 항체 또는 수입된 CDR 또는 구조 서열의 어디에서도 찾을 수 없는 서열을 포함하기도 한다. 보통, 인간 항체는 변이성 도메인을 적어도 하나 또는 거의 대부분 2개를 포함하며, 모든 또는 실질상 모든 CDR 범위는 비-인간 면역글로불린에 상응하고 모든 또는 실질상 모든 구조 범위는 인간 면역글로불린 일치 서열이다. 인간화된 항체는 이상적으로 적어도 보통 인간 면역 글로불린의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 한 부분 또한 포함할 것이다.
이 분야에서 비인간 항체를 인간화하는 방법은 잘 알려져 있다. 보통, 인간화된 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-인간 근원에서 이에 도입된다. 이 비-인간 아미노산 잔류들은 종종 "수입" 잔기이라고 일컬어지며, 이는 대개 "수입" 변수 도메인에서 취한다. 인간화는 본질적으로 설치류의 CDR 또는 상응하는 인간 항체 서열의 CDR 서열을 인간의 것으로 교체하는 것으로 실행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체이며(US 4,816,567), 온전한 인간 변수 도메인보다 훨씬 적게 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 대체된다. 실제적으로, 인간화된 항체는 보통 몇몇의 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇의 구조 잔기가 이 설치류의 유사한 영역의 잔기와 치환된 인간 항체이다.
면역되었을 때, 내생의 면역글로불린 생성이 없는 중에 전체 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자 변형 동물(예, 생쥐)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포계열 돌연변이 생쥐의 항체 중쇄 결합 영역 유전자의 동형 삭제는 내생 항체 생산의 완전한 억제 결과를 가져온다. 이러한 생식세포계열 돌연변이 생쥐로의 인간 생식세포계열 면역글로불린 유전자 정렬의 이입은 항원이 존재할 때 인간 항체 생산의 결과를 낳을 것이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생산될 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에 의해서 피험자에게 투여된다. 보통, 적당한 약학적으로 허용가능한 염이 제형을 등장 상태로 만들기 위해 제형에 사용된다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는, 링거 용액(Ringer's solution) 및 포도당 용액이 있다. 이 용액의 pH 값은 바람직하게는 약 5 내지 약 8이며, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 더 많은 담체는 항체를 포함하는 세포간질이 막, 리포좀 또는 미세입자와 같은 형태로 되어 있는 고체 소수성 중합체 반투성의 세포간질과 같은 지속적인 방출 준비를 포함한다. 예를 들어, 투여 방법 및 투여되는 항체의 농도에 따라 어떤 담체가 더 바람직한지는 이 분야의 당업자에게는 명백할 것이다.
항체는 피험자, 환자 또는 세포에 주사(예, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내), 또는 효과적인 형태로 혈류로의 전달을 보장하는 주입과 같은 다른 방법으로 투여될 수 있다. 항체는 국소 및 전신 치료 효과를 얻기 위해 종양내 또는 종양 주위 경로 투여될 수도 있다. 국소 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
항체 투여의 효율적인 용량과 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 이 분야의 기술에 속한다. 이 분야의 당업자는 투여되는 항체의 용량이, 예를 들어 이 항체를 받는 대상, 투여 방법, 사용되는 특정한 항체의 종류 및 투여되는 다른 약들에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 단독으로 사용하는 항체의 전형적 일일 용량의 범위는 위에서 언급된 요인에 따라 체중 기준으로 하루에 약 1 ㎍/kg 내지 최대 100 mg/kg일 수 있다. 항체 투여 이후, 바람직하게는 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암의 치료 이후, 그 치료 항체의 효능은 당업자에게 잘 알려진 다양한 방식으로 평가할 수 있다. 예를 들어, 크기, 수, 및/또는 치료를 받고 있는 대상의 암의 분포 등이 표준 종양 영상 기술을 이용하여 모니터링될 수 있다. 항체의 투여가 없을 경우 일어날 수 있는 종양의 성장을 정지시켜, 종양을 오그라들게 하거나, 새로운 종양의 성장을 예방하는 치료의 목적으로 투여된 항체는 효과있는 폐암의 치료라고 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 특이적 펩티드-MHC 복합체를 인식하는 용해성 T 세포 수용체(sTCR)의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 용해성 T 세포 수용체는 특이적 T 세포 클론으로부터 생성가능하며, 그 친화력은 상보결정 부위를 표적으로 하는 돌연변이유발성에 의해 증가될 수 있다. T 세포 수용체 선택을 위하여, 파지 디스플레이를 사용할 수 있다(US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). 파지 디스플레이 동안 T 세포 수용체의 안정화를 위하여, 및 약물로서의 실용적인 용도의 경우, 알파 및 베타 쇄는, 예를 들어 비정상적 이황화 결합, 기타 공유 결합(단일-쇄 T 세포 수용체) 또는 이합체화 도메인에 의해 연결될 수 있다(Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T 세포 수용체는 표적 세포에 대한 특정 기능의 실행을 목적으로 독소, 약물, 시토카인(예를 들어, US 2013/0115191 참고), 및 항-CD3 도메인과 같은 효과기 세포를 모집하는 도메인 등과 연결될 수 있다. 더욱이, 이것은 양자 전이에 사용되는 T 세포에서 발견될 수 있다. 추가 정보는 WO 2004/033685A1 및 WO 2004/074322A1에서 찾을 수 있다. sTCR의 조합은 WO 2012/056407A1에 설명되어 있다. 이 생산에 관한 추가 방법들은 WO 2013/057586A1에 공개되어 있다.
그 밖에, 본 발명의 펩티드 및/또는 TCR 또는 항체 또는 다른 결합하는 분자는 병리학자에 의한 생검 샘플에 근거하는 암의 진단을 확인하는데 사용가능하다.
항체 또는 TCR은 생체내의 진단 분석에 사용될 수도 있다. 보통, 항체는 방사성핵종으로 표지되고(예컨대, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P 또는 35S), 면역 섬광 조형술을 사용하여 그 종양이 국소화될 수 있다. 하나의 구현에서는, 항체 또는 그 단편은 상기 언급된 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된 단백질에 대한 2개 이상의 표적의 세포외 도메인에 결합을 하고 친화성 값(Kd)은 1x10 μM 보다 낮다.
진단의 용도로 사용되는 항체는 여러 가지의 영상 방법으로 검출될 수 있는 적당한 프로브로 표지될 수 있다. 프로브의 검출 방법은 형광, 광학, 공초점 및 전자 현미경, 자기 공명 단층 촬영 영상 및 분광기 형광 투시법, 전산화 단층 촬영과 양전자 방사 단층 촬영기를 포함하지만 이에 국한되지 않는 방법을 들 수 있다. 적당한 프로브는 플루오레세인, 로다민, 에오신, 및 다른 형광체, 방사성 동위 원소, 금, 가돌리늄 및 다른 란탄계열 원소, 상자성체의 이온, 플루오르-18 및 다른 양전자 방출 방사성 핵종 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 것을 들 수 있다. 또한, 프로브는 2개 이상의 기능을 가지고 있을 수 있으며, 본원에 나열된 하나 이상의 방법으로 검출될 수 있다. 이러한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 본원에 나열된 프로브로 표지될 수 있다. 이렇게 항체와 프로브를 연결하는 것으로는 이 분야에서 잘 알려진 것들 중에 프로브의 공유원자 연결, 프로브의 항체로의 편입, 및 프로브의 결합을 위한 킬레이트 화합물의 공유원자 연결 등을 들 수 있다. 면역조직 화학을 위해서, 질병 조직 샘플은 신선하거나 냉동되었거나 파라핀에 포매되어 포르말린과 같은 방부제로 고정되어 있을 수 있다. 고정되었거나 포매되어 있는 샘플을 포함하고 있는 조직 절편은 표지된 1차 항체와 2차 항체와 접촉되며, 이때 그 항체는 동일 반응계 단백질 발현의 검출을 위해 사용된다.
본 발명의 다른 양태는 활성화된 T 세포와 항원 적재된 적당한 항원-제시 세포의 표면에서 T 세포를 항원이 본 발명의 펩티드라고 할 때 항원 특정 방식으로서 활성화시키는데 충분한 시간 동안에 발현되는 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자의 접촉을 포함하는 시험관내 방법으로 생성하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 충분한 양의 항원이 항원-제시 세포와 함께 사용된다.
바람직하게는, 포유류 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있거나, 감소된 수준 또는 기능을 가지고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있는 적당한 세포로는 T2, RMA-S 및 초파리 세포를 들 수 있다. TAP란 항원 처리에 관련된 트랜스포터를 일컷는다.
인간 펩티드 적재 결핍 세포주 T2는 American Type Culture Collection(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA)의 카탈로그 번호 CRL 1992로 구입이 가능하고, 초파리 세포주 Schneider 2는 ATCC의 카탈로그 번호 CRL 19863으로 구입이 가능하며, 생쥐 RMA-S 세포주는 Ljunggren 등에서 묘사가 된 바 있다(Ljunggren and Karre, 1985).
바람직하게는, 숙주 세포는 감염 전에 실질적으로 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다. 자극기 세포는 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA 3과 같은 T 세포를 위한 공동-자극 신호의 제공에 중요한 분자를 발현하는 것 또한 바람직하다. 다수의 MHC 클래스 II 분자의 핵산 서열 및 동시자극 분자의 서열은 GenBank와 EMBL 데이터베이스에서 공개적으로 제공된다.
MHC 클래스 I 에피톱이 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD8-양성 CTL이다.
항원-제시 세포가 이러한 에피톱을 발현하도록 감염되는 경우, 바람직하게는 그 세포는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
T 세포를 시험관내에서 생성하는 몇몇의 다른 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가 종양-침윤 림프구를 CTL 생성에 사용할 수 있다. Plebanski 등(Plebanski et al., 1995)은 T 세포의 제조에 자기 말초 혈액(PLB) 림프구를 사용했다. 수지상 세포를 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스화시키거나, 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 자가 조직 T 세포의 생산이 가능하다. 또한, B 세포는 자가 조직 T 세포의 생산에서 사용할 수 있다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스화된 또는 재조합된 바이러스에 의해 감염된 대식 세포가 자가 조직 T 세포의 제조 시 사용될 수 있다. S. Walter 등(Walter et al., 2003)은 인공 항원-제시 세포(aAPC)를 사용하는 시험관내 T 세포의 프라이밍을 묘사하며, 이는 역시 선택된 펩티드에 대해 T 세포를 생성하는 적절한 방법일 수 있다. 본 발명에서, aAPC는 미리 생성된 MHC:펩티드 복합체를 폴리스티렌 입자(마이크로 비드)의 표면과 커플링시키고 바이오틴-스트렙트아비딘 생화학을 이용함으로써 생성되었다. 이 체계는 aAPC의 정확한 MHC 밀도를 제어할 수 있도록 허용하며, 이는 항원-특이적 T 세포 반응을 혈액 샘플에서 높은 효율성으로 고- 또는 저-결합력을 임의적으로 유도해낼 수 있게 한다. MHC:펩티드 합성체를 제외하고, aAPC는 그들의 표면에 커플된 항-CD28 항원과 같은 동시-자극 활동을 가지고 다른 단백질을 운반해야 한다. 더욱이 이러한 aAPC-기반 체계는 종종, 예를 들어, 인터루킨-12와 같은 시토카인 등 적당한 용해 요소의 첨가를 요구한다.
동종이계 세포는 T 세포의 제조에 역시 사용될 수 있으며 방법은 WO 97/26328에 더 자세하게 묘사되어 있으며, 여기에 참조문헌으로 포함되어 있다. 예를 들어, 초파리 세포와 T2 세포에 추가적으로, CHO 세포, 배큘로바이러스-감염 곤충 세포, 박테리아, 효모, 백시니아-감염된 표적 세포 등과 같은 다른 세포들도 항원을 제시하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 식물 바이러스가 사용될 수도 있으며(예를 들어, Porta 등(Porta et al., 1994)), 이는 외부 펩티드의 제시를 위한 카우피 모자이크바이러스의 높은 수확 체계로서 개발에 대해 묘사한다.
이 실험의 펩티드에 대해 활성화된 T 세포는 치료에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 더 나아간 양태는 앞서 말한 발명의 방법으로 획득할 수 있는 활성화된 T 세포에 대한 내용을 제공한다.
위에서 말한 방법으로 생성된 활성화된 T 세포는 서열식별번호 1 내지 서열식별번호 388의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
바람직하게는, T 세포는 그의 TCR을 HLA/펩티드-합성체(예, 결합)와 상호작용함으로써 이런 세포를 인식한다. 이 T 세포는 효율적인 활성화된 T 세포의 수가 투여되었을 시, 본 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포를 괴사시키는데 유용하다. 환자에게 투여된 T 세포는 위에서 묘사된 바와 같이 환자에게 유도되고 활성화된다(즉, 이는 자가 조직 T 세포이다). 다른 방법으로는, T 세포는 환자에게 유도되지 않고, 다른 개인에서 유도된다. 물론, 이 개인이 건강한 개인인 것이 바람직하다. 본 발명자들이 말하는 "건강한 개인"이라고 함은 개인이 전체적으로 좋은 건강을 가지고 있으며, 바람직하게는 충분한 면역 체계를 가지고 있으며, 더 바람직하게는, 손쉽게 실험되고 검출될 수 있는 어떤 질병도 겪고 있지 않다는 것이다.
생체내에서, 본 발명에 따른 CD4-양성 T 세포는 종양 세포(이들은 가끔 MHC 클래스 II를 발현하기도 한다)이거나 종양(종양 세포)을 감싸고 있는 간질성 세포(이는 가끔 MHC 클래스 II를 또한 발현하기도 한다(Dengjel et al., 2006))일 수 있다.
본 발명의 T 세포는 활성적인 치료 구성의 성분으로 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포를 괴사시키고 환자에게 위에 정의된 바와 같이 효율적인 T 세포의 수를 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 "비정상적으로 발현되는"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 조직에서의 발현 수준에 비교했을 때 과발현되거나 유전자가 종양이 유도된 조직에서는 침묵적이지만(silent) 종양에서는 발현되는 것도 의미한다. 본 발명자들은 "과발현"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 조직에서 존재하는 수준의 적어도 1.2배 이상으로 존재하는 것을 말하고, 바람직하게는 적어도 2배, 더 바람직하게는 적어도 5배 또는 10배로 존재하는 것을 의미한다.
T 세포는, 예를 들어 위에서 묘사된 바와 같은 방법으로 얻어질 수 있다.
흔히 T 세포의 양자 전이라고 불리는 것에 대한 프로토콜은 이 업계에서 잘 알려져 있다. 리뷰는 다음에서 찾을 수 있다: Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006.
본 발명의 다른 양태에는 그 핵산이 클로닝되어 숙주 세포, 바람직하게는 T 세포로 도입되는 T 세포 수용체를 생성하기 위해 MHC와 복합체가 되는 펩티드의 사용이 포함된다. 이러한 조작된 T 세포는 따라서, 암 치료를 위해 환자로 이전할 수 있다.
본 발명의 모든 분자, 즉, 펩티드, 핵산, 항체, 발현 벡터, 세포, 활성화된 T 세포, T 세포 수용체 또는 이를 인코딩하는 핵산은 면역 반응을 피할 수 있는 성질을 가진 세포에 의해 특징지어지는 질병의 치료에 유용하다. 따라서 본 발명에 포함되어 있는 어떤 분자든지 약제로 사용되거나 약제를 만드는데 사용될 수 있다. 이 분자는 단독으로 사용될 수도 있고, 어떤 알려진 분자와 함께 결합하여 사용될 수도 있다.
본 발명은 다음을 포함한 키트(kit)를 포함한다:
(a) 위에 묘사된 바와 같은 약학 조성물을 용액 또는 동결건조된 형태로 포함하고 있는 용기;
(b) 임의적으로 희석제 또는 동결건조된 제형을 위한 재구성 용액을 포함하는 제2 용기; 및
(c) 임의적으로 (i) 용액의 사용 또는 (ii) 동결건조된 배합의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서.
이 키트는 하나 이상의 (iii) 완충제, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘, 및 (vii) 주사기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 그 용기는, 바람직하게 병, 바이알, 주사기 또는 시험관이며; 다용도 용기일 수 있다. 약학 조성물은 바람직하게는 동결건조된다.
본 발명에 사용되는 키트는 바람직하게는 동결건조되어 있는 약제를 적당한 용기와 이들의 재구성 및/또는 사용에 관한 설명서를 함께 포함한다. 적당한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알(예: 듀얼 챔버 바이알), 주사기(듀얼 챔버 주사기 등) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재질로서 형성할 수 있다. 바람직하게는 키트 및/또는 용기는 재구성 및/또는 사용에 대한 사용법을 표시하는 지시 내용을 그 용기 상에 또는 그와 연관하여 포함한다. 예를 들어, 라벨 상에서 동결건조된 제형을 상기 펩티드 농도로 재구성해야 한다고 지시할 수 있다. 라벨은 또한 약제가 피하투여가 가능한지 아니면 유용한지를 보여줄 수도 있다.
제형을 포함한 용기는 재구성된 약제의 반복된 투여를 가능하게 하는 다용도 바이알일 수 있다(예: 2 내지 6회의 투여). 키트는 또한 적당한 희석제(예: 중탄산 용액)를 포함하는 제2 용기를 포함할 수도 있다.
희석제와 동결건조된 약제를 섞었을 때, 재구성된 배합의 최종 펩티드 농도가 바람직하게는 적어도 0.15 mg/mL/펩티드(=75 μg)이며 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(=1500 μg)를 넘지 않아야 한다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입 및 사용 설명서 등의 사용자의 입장에서 필요한 것을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트는 본 발명에 따른 약학 조성물을 포함하는 하나의 용기를 다른 제품과 함께 또는 단독으로 포함하거나(예: 다른 화합물들 또는 이 다른 화합물들의 약학 조성물) 각각의 조성물을 각자 다른 용기에 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 다음과 같은 제2 화합물 또는 그들의 약학 조성물과 함께 투여될 수 있는 약학 조성물을 포함한다: 보조제(예: GM-CSF), 화학요법제, 자연 생성물, 호르몬 또는 길항제, 항혈관신생 제제 또는 억제제, 괴사유도제 또는 킬레이터. 키트의 조성물은 미리 혼합되어 있을 수도 있거나, 각각의 조성물이 각각 따로 용기에 담겨 있을 수도 있다. 키트의 조성물은 하나 이상의 액체 용액에 제공될 수도 있고, 바람직하게는 수용액, 더욱 바람직하게는 무균 수용액에 제공된다. 키트의 조성물은 적당한 용해제를 첨가함으로써 액체로 바뀔 수 있는 고체로 제공될 수도 있고, 바람직하게는 이는 다른 용기에 담겨 제공된다.
치료 키트의 용기는 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 고체나 액체를 담을 수 있는 다른 어떤 용기일 수 있다. 보통, 하나 이상의 구성물이 있을 경우, 키트는 제2 물약병 또는 다른 용기를 포함하고, 이는 각각의 복용을 가능하게 한다. 키트는 약학적으로 허용가능한 액체를 포함하고 있는 용기를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 본 발명 키트의 성분인 본 발명의 제제를 투여할 수 있는 기구를 포함한다(예: 하나 이상의 바늘, 주사기, 안약 투입제, 피펫 등).
본 제형은 구강(경구), 비강, 안약 형태, 피하, 피내, 근육내, 혈관내 또는 경피 등 어떠한 투여 형태로든 펩티드 투여에 적당한 약제이다. 바람직하게는, 그 투여는 s.c.이며, 가장 바람직하게 i.d. 투여는 주입 펌프에 의할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암 또는 자궁암으로부터 분리되었으므로, 본 발명의 약제는 바람직하게는 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암의 치료에 사용된다.
본 발명은 또한 사전선별된 TUMAP의 창고에서 선택된 하나 이상의 펩티드로 구성된 약학 조성물의 제조를 포함하는 개별 환자를 위한 개인화된 약학 조성물의 생산 방법에 관한 것으로, 그 약학 조성물에 사용되는 상기 하나 이상의 펩티드는 개별 환자의 적합성을 위해 선택된다. 한 구현에서, 이 약학 조성물은 백신이다. 이 방법은 TCR 분리와 같은 하류 용도를 위한 T 세포 클론의 생산 또는 용해성 항체 및 다른 치료 옵션에도 적응할 수 있다.
"개인화된 약학"이란, 활성적으로 개인화된 암 백신 및 자가 환자 조직을 사용하는 적응적 세포 요법을 포함하는 한 명의 개별 환자의 치료를 위해서만 사용되는 그러한 개별 환자를 위해 구체적으로 맞춤화된 요법을 의미해야 한다.
본원에 사용된 용어 "창고"란 특정한 종양 유형에서 면역 원성 및/또는 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드의 군 또는 조합을 지칭해야 한다. 용어 "창고"는 백신에 포함된 특정 펩티드가 사전 제조되어 물리적 시설에 보관되었음을 함축하는 의도가 아니다(하지만 그러한 가능성은 고려된다). 생산된 각 개인화된 백신을 위해 창고(예를 들어, 데이터베이스의 형태)는 다양한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 대립유전자를 가진 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암 환자의 종양 조직에서 고도로 과발현된 종양-연관 펩티드로 구성된다. 이는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 펩티드 또는 신장된 MHC 클래스 I 펩티드를 포함할 수 있다. 창고는 몇몇 종양 조직들로부터 수집된 종양-연관 펩티드 외에도, HLA-A*02 및 HLA-A*24 마커 펩티드를 포함할 수 있다. 이 펩티드들은 TUMAP에 의해 유도된 T 세포 면역성의 크기에 대한 정량적인 비교를 허용하므로 백신의 항종양 반응을 이끌어내는 용량에 관한 중요한 결론을 도출할 수 있다. 둘째로, 어떤 환자에서 "자가" 항원으로 유래한 TUMAP에 대한 인체의 백신-유도 T 세포 반응이 관찰되지 않는 경우, 이것은 "비-자가" 항원으로부터 유래한 중요한 양성 대조군 펩티드로서 기능한다. 그리고, 셋째로, 이것은 환자의 면역능력 상태에 대한 결론의 도출을 가능케 한다.
창고의 TUMAP는 유전자 발현 분석, 질량 분석 및 T 세포 면역학(XPresident ®)이 조합된 통합 기능적 유전체 접근방식을 사용하여 동정된다. 이 접근방식은 정상 조직에서 발현되지 않거나 최소한으로만 발현되는 것이 아닌 고비율의 종양에서 실제로 존재하는 TUMAP만을 추가 분석을 위해 선택한다는 것을 보증한다. 초기의 펩티드 선택을 위해, 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 및 자궁암 환자의 샘플과 건강한 공여자의 혈액을 단계별 접근방식으로 분석했다:
1. 악성 종양 물질로부터의 HLA 리간드는 질량 분석법으로 식별되었다.
2. 전장 유전체 전령 리보핵산(mRNA)의 발현 분석을 사용하여 정상 기관 및 조직과 비교하여 악성 조직에서 과발현되는 유전자를 동정하였다.
3. 동정된 HLA 리간드들을 유전자 발현 데이터와 비교했다. 단계 2에서 검출된 종양 조직 상에 과다제시되거나 임의적으로 제시된 바람직하게는 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자들에 의해 인코딩된 펩티드들은 멀티-펩티드 백신의 적절한 TUMAP 후보로서 간주되었다.
4. TUMAP로서 동정된 펩티드의 관련성을 지지하는 추가 증거를 파악하기 위해 문헌 연구를 수행했다.
5. mRNA 수준에서의 과발현의 타당성은 단계 3에서 종양 조직으로부터 선택된 TUMAP의 재검출 및 건강한 조직에 대한 검출의 결여(낮은 빈도)에 의해 확인되었다.
6. 선택된 펩티드에 의한 생체내 T 세포 반응의 유도가 가능한지 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여자 및 암 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관내 면역원성 검사를 수행했다.
한 측면에서는, 펩티드들이 창고에 포함되기 전에 면역원성에 대해 사전선별된다. 제한이 아니라 한 예로서, 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원-제시 세포를 가진 건강한 공여자의 CD8+ T 세포를 반복적으로 자극하는 시험관내 T 세포 초회감작을 포함하는 방법을 사용하여 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을 결정한다.
이 방법은 희귀한 암과 드문 발현 프로파일을 갖는 환자에 대해 선호된다. 현재 개발되고 있는 고정된 성분을 갖는 멀티-펩티드 칵테일과 대비할 때, 창고는 종양에서 항원의 실제 발현과 백신과의 훨씬 더 높은 정합을 허용한다. 선택된 하나의 또는 몇몇 "재고(off-the-shelf)" 펩티드들의 조합을 다중표적 접근방식으로 각 환자에 대해 사용한다. 이론상으로, 예를 들어 50개 라이브러리로부터 선택된 5개의 다른 항원 펩티드 선택에 근거한 접근방법은 이미 약 1700만 가지의 가능한 약품(DP) 성분을 초래할 것이다.
한 양태에서, 이 펩티드는 여기서 또는 다음에 설명된 본 발명에 따른 방법에 근거하여 백신의 포함 여부가 선택된다.
HLA 표현형, 전사체학 및 펩티도믹스 데이터는 환자의 종양 물질과 혈액 샘플로부터 수집하여 "창고"와 환자 고유의(즉, 돌연변이된) TUMAP를 포함하는 각 환자에 대해 가장 적절한 펩티드를 동정한다. 환자 종양에서 선택적으로 발현되거나 과발현되는 펩티드를 선택하게 되며, 이는 가능한 경우 환자의 개별 PBMC로써 시험했을 때 강한 시험관내 면역원성을 나타낸다.
바람직하게는 백신에 포함된 펩티드는, (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드들(TUMAP)의 동정; (b) (a)에서 동정된 펩티드를 위에 설명된 펩티드들의 창고(데이터베이스)와 비교; 및 (c) 그 환자에서 동정된 종양-연관 펩티드와 상관관계가 있는 창고(데이터베이스)로부터 하나 이상의 펩티드 선택을 포함하는 방법에 의해 동정된다. 예를 들어, 종양 샘플에 의해 제시된 TUMAP는 다음에 의해 동정된다: (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 및 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계 결정. 바람직하게는 종양 샘플로부터 단리된 MHC 분자의 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드의 서열결정에 의해 MHC 리간드의 서열을 파악한다. 바람직하게는 종양 샘플과 정상 조직은 같은 환자로부터 얻는다.
창고(데이터베이스) 모델을 사용하는 펩티드의 선택 외에 또는 그 대안으로서, TUMAP를 새 환자에서 동정한 다음 백신에 포함시킬 수 있다. 한 예로서, 후보 TUMAP 환자에서, (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 및 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계의 결정에 의해 동정할 수 있다. 다른 예로서, 개별 환자의 조직에 상응하는 정상 샘플에 대해 종양 샘플에서 고유한 돌연변이를 포함하는 단백질을 동정할 수 있으며, 돌연변이를 특이적으로 표적하는 TUMAP를 동정할 수 있다. 예를 들어, 종양 및 상응하는 정상 조직의 유전체에 대한 염기서열은 전체 유전체의 염기서열 결정에 의해 결정할 수 있다. 유전자의 단백질-코딩 영역에서 비동의 돌연변이의 발견을 위해, 유전체 DNA 및 RNA를 종양 조직으로부터 추출하고, 정상의 돌연변이되지 않은 유전체의 종자계 DNA는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 추출한다. 이러한 응용 NGS 접근방법은 단백질 코딩 영역의 염기서열 재결정으로 제약된다(신유전체 염기서열 재결정). 이 목적을 위해, 업체가 공급하는 표적 강화 키트를 사용한 다음, 예를 들어 HiSeq2000(Illumina)에 의해 염기서열 결정에 의해 인간 샘플의 엑손 DNA를 포착한다. 그 밖에, 유전자 발현의 직접 정량화 및 돌연변이된 유전자가 환자의 종양에서 발현된다는 검증을 위해 종양 mRNA에 대한 염기 서열을 결정한다. 그에 따른 수백만의 서열 판독값은 소프트웨어 알고리즘을 통해 처리된다. 그 출력 목록에는 돌연변이와 유전자 발현이 포함된다. 종양-특이적 체세포 돌연변이는 PBMC-유래 생식세포의 변종과 비교하여 결정한 다음 우선순위화된다. 다음에는 새로 동정된 펩티드를 위에 설명한 창고의 면역원성에 대해 시험할 수 있으며, 적절한 면역원성을 소유하는 후보 TUMAP를 선택하여 백신에 포함시킨다.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드(TUMAP)를 위에 설명한 방법으로 동정하는 단계; (b) 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성과 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고를 이용하여 (a)에서 동정된 펩티드와 비교하는 단계; (c) 환자에서 동정된 종양-연관 펩티드와 상관관계가 있는 하나 이상의 펩티드를 창고에서 선택하는 단계; 및 (d) 임의적으로 (a)에서 새로 동정된 하나 이상의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인하는 단계.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드들(TUMAP)을 위에 설명한 방법으로 동정하는 단계; 및 (b) (a)에서 새로 동정된 하나 이상의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인하는 단계.
개인화된 펩티드 기반 백신을 위한 펩티드들이 선택되면, 백신이 생산된다. 백신은 20 내지 40% DMSO, 바람직하게는 약 33% DMSO와 같은 약 30 내지 35% DMSO에 용해된 개별 펩티드들로 구성된 액체 배합이다.
제품에 포함되는 펩티드는 각각 DMSO에 용해한다. 단일 펩티드 용액의 농도는 제품에 포함시킬 펩티드의 수에 따라 선택해야 한다. 단일 펩티드-DMSO 용액들을 동등한 비율로 혼합하여 제품에 포함시킬 모든 펩티드가 포함된 용액을 만드는데 그 농도는 펩티드 당 약 2.5 mg/mL이다. 그런 다음, 주사제용으로 33% DMSO에서 펩티드 당 0.826 mg/mL의 농도를 얻기 위해 혼합된 용액을 1:3의 비율로 물로 희석한다. 희석시킨 용액을 0.22 μm 멸균 필터를 통해 여과시킨다. 최종 벌크 용액을 얻는다.
최종 벌크 용액을 바이알에 채워 사용 시까지 -20℃에서 보관한다. 1개의 바이알에는 각 펩티드를 0.578 mg씩 포함하는 700 μL의 용액이 들어있다. 여기서 500 μL(펩티드 당 약 400 μg)를 피내 주사로 투여하게 된다.
암 치료에 유용함에 덧붙여, 본 발명의 펩티드는 진단제로도 유용하다. 펩티드가 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암 샘플로부터 생성되었고, 또한 이러한 펩티드가 정상 조직에 존재하지 않거나 보다 낮은 수준으로 존재하는 것으로 판단되었으므로, 이 펩티드들은 암의 존재 진단에 사용이 가능하다.
청구되는 펩티드의 혈액 샘플내 조직 생체 검사에서의 존재는 암의 진단 시 병리학자를 도울 수 있다. 항체, 질량 분석법 또는 당업계에 알려진 기타 방법의 수단에 의한 특정 펩티드의 검출은 조직 샘플이 악성이나 염증이 있거나 일반적으로 질병 상태에 있음을 병리학자에게 알려줄 수 있거나, 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 담낭암 및 담관암종, 흑색종, 위암, 고환암, 방광암, 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 또는 자궁암의 바이오마커로서 사용할 수 있다. 펩티드 군의 존재는 질병 상태 조직의 분류 또는 하위 분류를 가능하게 할 수 있다.
병변 조직 샘플의 펩티드의 탐지는 특히 만약 T 림프구가 작용 기전에 참여하는 것으로 알려져 있거나 기대할 때, 면역계를 포함한 치료의 이익에 대한 결정을 내릴 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 악성 세포가 면역 감시를 탈출하는 과정에서 잘 설명되는 기전이다. 펩티드의 존재는 이 기전이 분석된 세포에서 악용되지 않는 것을 보여준다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 또는 MHC 분자에 합성된 펩티드에 대한 T 세포 반응 또는 항체 반응과 같은 펩티드에 대한 림프구 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 이런 림프구 반응은 추가 치료 단계에서 결정을 내릴 때 전조 마커로 사용될 수 있다. 이런 반응은 또한 림프구 반응을 여러 방법으로, 예를 들어, 단백질 백신, 핵산, 자가 조직 물질, 림프구의 양자 면역 전송을 유도하는 것을 목표로 하는 면역치료의 접근방식에서 대리 마커로 사용될 수 있다. 유전자 치료 설정에서, 펩티드에 대한 림프구 반응은 부작용의 평가에서 고려할 수 있다. 림프구 반응의 모니터링은 이식 요법의 후속 시험을 위한 중요한 도구가 될 수도 있다(예를 들어, 이식편대숙주 및 숙주대이식편병의 검출).
이제 본 발명은 그 바람직한 구현을 설명하는 하기 실시예 및 동반되는 도면을 참조하여 묘사될 것이나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 여기에 인용된 모든 참조문헌들은 그 전문이 포함된다.
도 1은 정상 조직(흰색 막대) 및 다른 암들(검은색 막대)에서 다양한 펩티드의 과다제시를 보여준다. 도 1a) 유전자 부호: IGFBPL1, 펩티드: LLPLLPPLSPSLG(서열식별번호 33) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 세포주(1개 췌장), 1개 정상 조직(1개 갑상선), 22개 암조직(5개 뇌암, 1개 유방암, 1개 결장암, 1개 식도암, 1개 담낭암, 1개 간암, 10개 폐암, 1개 췌장암, 1개 위암; 도 1b) 유전자 부호: HIVEP1, 펩티드: NYIPVKNGKQF(서열식별번호 103) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 11개 암조직(1개 뇌암, 1개 간암, 8개 폐암, 1개 전립선암); 도 1c) 유전자 부호: GET4, 펩티드: EYLDRIGQLFF(서열식별번호 131) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 2개 정상 조직(1개 신장, 1개 폐), 41개 암 조직(2개 뇌암, 1개 신장암, 3개 간암, 29개 폐암, 2개 전립선암, 4개 위암); 도 1d) 유전자 부호: N4BP2, 펩티드: FYINGQYQF(서열식별번호 176) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 세포주(1개 전립선), 3개 정상 조직(1개 신장, 1개 뇌하수체, 1개 피부), 67개 암 조직(4개 뇌암, 2개 간암, 42개 폐암, 12개 전립선암, 7개 위암). 도 1e 내지 도 1z는 정상 조직에 비해 여러 암 조직에서 다양한 펩티드의 과다제시를 보여준다. 분석에는 440개 이상의 정상 조직 샘플과 526개의 암 샘플의 데이터가 포함되었다. 도면에 나와 있는 것은 펩티드가 존재하는 것으로 발견된 샘플만이다. 도 1e) 유전자 부호: AKR1C1, AKR1C3, 펩티드: HLYNNEEQV(서열식별번호 16) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 세포주(췌장), 15개 암 조직(담관암 1개, 1개 식도암, 6개 간암, 5개 폐암, 2개 방광암); 도 1f) 유전자 부호: RPS26P39, RPS26P11, RPS26, RPS26P28, RPS26P20, RPS26P15, RPS26P50, RPS26P2, RPS26P25, RPS26P58, 펩티드: YVLPKLYVKL(서열식별번호 35) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 정상 조직(1개 백혈구 샘플), 8개 암 조직(1개 두경부암, 3개 백혈구성 백혈병 암, 1개 골수세포암, 1개 담낭암, 1개 결장암, 1개 림프절암); 도 1g) 유전자 부호: CLDN4, CLDN3, CLDN14, CLDN6, CLDN9, 펩티드: SLLALPQDLQA(서열식별번호 40) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 21개 암 조직(1개 담관암, 1개 유방암, 3개 결장암, 1개 직장암, 6개 폐암, 2개 난소암, 1개 전립선암, 3개 방광암, 3개 자궁암); 도 1h) 유전자 부호: KLHDC7B, 펩티드: VLSPFILTL(서열식별번호 42) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 18개 암 조직(1개 백혈구성 백혈병 암, 1개 골수종 세포암, 1개 유방암, 1개 신장암, 6개 폐암, 3개 림프절암, 2개 난소암, 2개 방광암, 1개 자궁암); 도 1i) 유전자 부호: ATR, 펩티드: SLLSHVIVA(서열식별번호 53) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 3개 세포주(1개 혈액 세포, 2개 췌장), 21개 암 조직(1개 두경부암, 1개 담관암, 2개 백혈구성 백혈병 암, 1개 유방암, 2개 식도암, 1개 담낭암, 1개 신장암, 1개 간암, 2개 폐암, 4개 림프절암, 1개 난소암, 3개 피부암, 1개 방광암), 도 1j) 유전자 부호: PGAP1, 펩티드: FITDFYTTV(서열식별번호 66) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 세포주(피부), 1개 정상 조직(1개 결장), 13개 암 조직(1개 두경부암, 6개 뇌암, 1개 결장암, 1개 간암, 2개 피부암, 2개 방광암); 도 1k) 유전자 부호: ZNF679, SAPCD2, 펩티드: RLLPKVQEV(서열식별번호 325) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 4개 세포주(2개 혈액 세포, 1개 신장, 1개 대장), 22개 암 조직(1개 골수 세포암, 1개 유방암, 1개 식도암, 4개 결장암, 1개 직장암, 10개 폐암, 2개 난소암, 1개 위암, 1개 방광암); 도 1l) 유전자 부호: ZDHHC24, 펩티드: VLGPGPPPL(서열식별번호 339) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 2개 세포주(1개 신장, 1개 췌장), 19개 암 조직(4개 백혈구성 백혈병 암, 1개 골수 세포암, 1개 골수암, 2개 뇌암, 1개 간암, 2개 폐암, 6개 림프절암, 1개 피부암, 1개 자궁암); 도 1m) 유전자 부호: ORC1, 펩티드: VYVQILQKL(서열식별번호 111) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 정상 조직(1개 간), 32개 암 조직(2개 간암, 24개 폐암, 6개 위암); 도 1n) 유전자 부호: RIF1, 펩티드: IYSFHTLSF(서열식별번호 113) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 28개 암조직(1개 전립선암, 1개 뇌암, 25개 폐암, 2개 위암 ); 도 1o) 유전자 부호: ANKRD5, 펩티드: RYLNKSFVL(서열식별번호 115) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 1개 정상 조직(1개 위), 25개 암 조직(1개 뇌암, 2개 간암, 17개 폐암, 2개 전립선암, 3개 위암); 도 1p) 유전자 부호: IGFLR1, 펩티드: RYGLPAAWSTF(서열식별번호 121) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 20개 암 조직(2개 간암, 17개 폐암, 1개 위암); 도 1q) 유전자 부호: CCR8, 펩티드: VYALKVRTI(서열식별번호 145) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 25개 암 조직(25개 폐암); 도 1r) 유전자 부호: CLEC5A, 펩티드: SYGTVSQIF(서열식별번호 148) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 5개 정상 조직(1개 간, 3개 폐, 1개 뇌하수체), 100개 암 조직(10개 뇌암, 4개 간암, 74개 폐암, 1개 전립선암, 11개 위암); 도 1s) 유전자 부호: FOXJ1, 펩티드: IYKWITDNF(서열식별번호 155) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 4개 정상 조직(4개 신장), 53개 암 조직(10개 뇌암, 1개 간암, 26개 폐암, 1개 전립선암, 15개 위암); 도 1t) 유전자 부호: IFNG, 펩티드: KYTSYILAF(서열식별번호 162) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 3개 세포주(3개 전립선), 4개 정상 조직(1개 간, 1개 폐, 1개 췌장, 1개 위), 95개 암 조직(1개 신장암, 5개 간암, 71개 폐암, 2개 전립선암, 16개 위암); 도 1u) 유전자 부호: KLHL11, 펩티드: EYFTPLLSGQF(서열식별번호 165) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 10개 암 조직(10개 폐암); 도 1v) 유전자 부호: TMEM189, 펩티드: LYSPVPFTL(서열식별번호 175) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 42개 암 조직(4개 뇌암, 1개 간암, 30개 폐암, 7개 위암); 도 1w) 유전자 부호: BUB1, 펩티드: EYNSDLHQFF(서열식별번호 345) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 13개 암 조직(3개 뇌암, 10개 폐암); 도 1x) 유전자 부호: CASC5, 펩티드: IYVIPQPHF(서열식별번호 346) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 21개 암 조직(3개 뇌암, 1개 신장암, 1개 간암, 14개 폐암, 2개 위암); 도 1y) 유전자 부호: KIF18A, 펩티드: VYNEQIRDLL(서열식별번호 354) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 13개 암 조직(1개 뇌암, 11개 폐암, 1개 위암); 도 1z) 유전자 부호: PSMA8, PSMA7, 펩티드: VFSPDGHLF(서열식별번호 360) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 33개 암 조직(4개 간암, 27개 폐암, 1개 전립선암, 1개 위암).
도 2는 정상 조직(흰색 막대) 및 여러 암 샘플(검은색 막대)의 패널에서 여러 암에서 고도로 과발현되거나 배타적으로 발현된 본 발명의 근원 유전자들의 예시적 발현 프로파일을 보여준다. 도 2a) 유전자 부호: MXRA5 - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 61개 정상 조직 샘플(6개 동맥, 1개 뇌, 1개 심장, 2개 간, 2개 폐, 2개 정맥, 1개 지방 조직, 1개 부신, 5개 골수, 1개 연골, 1개 결장, 1개 식도, 2개 담낭, 1개 신장, 6개 림프절, 1개 췌장, 1개 뇌하수체, 1개 직장, 1개 골격근, 1개 피부, 1개 소장, 1개 비장, 1개 위, 1개 흉선, 1개 갑상선, 5개 기관, 1개 방광, 1개 유방, 5개 난소, 3개 태반, 1개 전립선, 1개 고환, 1개 자궁) 및 70개 암 샘플(10개 유방암, 11개 폐암, 12개 난소암, 11개 식도암, 26개 췌장암); 도 2b) 유전자 부호: KIF26B - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 61개 정상 조직 샘플(6개 동맥, 1개 뇌, 1개 심장, 2개 간, 2개 폐, 2개 정맥, 1개 지방 조직, 1개 부신, 5개 골수, 1개 연골, 1개 결장, 1개 식도, 2개 담낭, 1개 신장, 6개 림프절, 1개 췌장, 1개 뇌하수체, 1개 직장, 1개 골격근, 1개 피부, 1개 소장, 1개 비장, 1개 위, 1개 흉선, 1개 갑상선, 5개 기관, 1개 방광, 1개 유방, 5개 난소, 3개 태반, 1개 전립선, 1개 고환, 1개 자궁) 및 58개 암 샘플(10개 유방암, 11개 폐암, 11개 식도암, 26개 췌장암); 도 2c) 유전자 부호: IL4I1 - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 61개 정상 조직 샘플(6개 동맥, 1개 뇌, 1개 심장, 2개 간, 2개 폐, 2개 정맥, 1개 지방 조직, 1개 부신, 5개 골수, 1개 연골, 1개 결장, 1개 식도, 2개 담낭, 1개 신장, 6개 림프절, 1개 췌장, 1개 뇌하수체, 1개 직장, 1개 골격근, 1개 피부, 1개 소장, 1개 비장, 1개 위, 1개 흉선, 1개 갑상선, 5개 기관, 1개 방광, 1개 유방, 5개 난소, 3개 태반, 1개 전립선, 1개 고환, 1개 자궁) 및 34개 암 샘플(11개 폐암, 12개 난소암, 11개 식도암); 도 2d) 유전자 부호: TP63 - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 61개 정상 조직 샘플(6개 동맥, 1개 뇌, 1개 심장, 2개 간, 2개 폐, 2개 정맥, 1개 지방 조직, 1개 부신, 5개 골수, 1개 연골, 1개 결장, 1개 식도, 2개 담낭, 1개 신장, 6개 림프절, 1개 췌장, 1개 뇌하수체, 1개 직장, 1개 골격근, 1개 피부, 1개 소장, 1개 비장, 1개 위, 1개 흉선, 1개 갑상선, 5개 기관, 1개 방광, 1개 유방, 5개 난소, 3개 태반, 1개 전립선, 1개 고환, 1개 자궁) 및 11개 식도암 샘플.
도 3은 예시적 면역원성 데이터: 펩티드-특이적 다합체 염색 이후 유세포 측정 결과를 보여준다.
도 4는 건강한 HLA-A*02+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 각각 다음 서열식별번호와의 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*2로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다: 서열식별번호 2 펩티드(A, 왼쪽 패널), 서열식별번호 9 펩티드(B, 왼쪽 패널), 서열식별번호 331 펩티드(C, 왼쪽 패널). 세 주기의 자극 후, A*02/서열식별번호 2(A), A*02/서열식별번호 9(B) 또는 A*02/서열식별번호 331(C)로 염색된 2D 다합체를 사용하여 펩티드 반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널들(A, B 및 C)은 관련이 없는 A*02/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사례 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 중 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
도 5는 건강한 HLA-A*24+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 각각 다음 서열식별번호와의 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*24로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다: 서열식별번호 99 펩티드(A, 왼쪽 패널), 서열식별번호 119 펩티드(B, 왼쪽 패널), 서열식별번호 142 펩티드(C, 왼쪽 패널) 및 서열식별번호 174 펩티드(D, 왼쪽 패널). 세 주기의 자극 후, A*24/서열식별번호 99(A), A*24/서열식별번호 119(B), A*24/서열식별번호 142(C) 또는 A*24/서열식별번호 174(D)로 염색된 2D 다합체를 사용하여 펩티드 반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널들(A, B, C 및 D)은 관련이 없는 A*24/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존가능한 단일 유리 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사례 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 중 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
실시예
실시예 1
세포 표면에 제시한 종양 연관 펩티드의 동정 및 정량화
조직 샘플
환자의 종양 조직은 환자의 고지에 의한 동의서가 수술 전 또는 부검 전에 제출되는 조건 하에 취득되었다. 조직은 절제 직후 충격 동결되었으며 TUMAP의 분리까지 -70℃ 이하에서 보관되었다.
펩티드는 다음 2가지 조건이 맞으면 선택했다: (1) 그 기저 전사체 및/또는 엑손이 매우 낮은 수준으로 발현된다. 즉, 킬로베이스 및 백만 리드 당 중간값 리드(RPKM)가 다음 기관에 대해 2 미만이어야 하며, 75% 사분위가 5 미만이어야 했다: 뇌, 혈관, 심장, 간, 폐, 혈액. 그 밖에, 중간 값 RPKM이 다음 기관에 대해 10 미만이어야 했다: 방광, 타액선, 위, 부신, 결장, 소장, 비장, 골수, 췌장, 근육, 지방 조직, 피부, 식도, 신장, 갑상선, 뇌하수체, 신경. (2) 펩티드는 종양-연관되었다. 즉, 특이적으로 발견되거나 종양 상에 발견되거나 정상 조직의 베이스라인에 비해 과발현된다(실시예 1 참조).
HLA-A*02 TUMAP 선택에 대한 샘플 수는 다음과 같았다: 췌장암은 N=16이고, 신장암은 N=20이고, 대장암은 N=28이고, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암은 N=15이고, 전립선암은 N=35이고, 간세포 암종은 N=16이고, 비소세포 폐암은 N=88이고, 위암은 N=29이고, 유방암은 N=9이고, 흑색종은 N=3이고, 난소암은 N=20이고, 만성 림프구성 백혈병은 N=13(12명 공여자)이고, 방광암은 N=5이고, 고환암은 N=1이고, 비소세포 폐암은 N=18(13명 공여자)이고, 담낭암 및 담관암종은 N=3이고, 급성 골수성 백혈병은 N=5(4명 공여자)이고, 아교모세포종은 N=40이고 자궁암은 N=5이다.
HLA-A*24 TUMAP 선택에 대한 샘플 수는 다음과 같았다: 위암은 N=44이고, 전립선암은 N=37이고, 비소세포 폐암은 N=88이고, 간세포 암종은 N=15이고, 신장암은 N=2이고, 대장암은 N=1이고 아교모세포종은 N=17이다.
조직 샘플에서 HLA 펩티드의 단리
작은 변형을 갖는 공개된 프로토콜에 따라, 충격 동결된 조직 샘플의 HLA 펩티드 풀은 고형 조직의 면역 침전에 의해 HLA-A*02-특이 항체 BB7.2 또는 HLA-A, -B, -C-특이적 항체 W6/32, HLA 클래스 II-특이적 항체 L243, CNBr-활성화 세파로오스, 산성 처리와 한외 여과를 이용해 획득되었다(Falk, et al 1991; Seeger, et al. T 1999).
질량 분광분석법의 분석
얻어진 HLA 펩티드 풀은 그들의 소수성에 의해 역상 크로마토그래피를 이용하여 분리되었고(nanoAcquity UPLC system, Waters) 용출된 펩티드는 ESI 공급원을 갖춘 LTQ-velos 및 융합 하이브리드 질량분광분석기(ThermoElectron)에 의해 분석되었다. 펩티드 풀은 분당 400 nL의 유량을 적용하여 1.7 μm C18 역상 물질(Waters)로 충전된 용융-실리카 마이크로모세관 컬럼(75 μm i.d. x 250 mm)에 바로 로딩된다. 이어서, 펩티드는 2-단계 180분-10% 내지 33%의 2개 용매 구배를 이용하여 분리되고, 여기서 유량은 분당 300 nL이다. 구배는 용매 A(물의 0.1% 포름산)와 용매 B(아세토니트릴의 0.1% 포름산)로 이루어진다. 구배는 용매 A(물의 0.1% 포름산)와 용매 B(아세토니트릴의 0.1% 포름산)로 이루어진다. 금이 입혀진 유리 모세관(PicoTip, New Objective)이 미세-ESI 공급원으로의 도입에 사용되었다. LTQ-Orbitrap 분광분석기가 TOP5 전략을 이용한 데이터-의존 모드에서 작동되었다. 간략하게, 스캔 사이클은 오비트랩(orbitrap)의 높은 질량 정확도(R = 30,000)의 전스캔으로 시작되고, 이후 5개의 가장 많은 이전에 선택한 이온의 동적 배제에 의한 전조 이온에 대한 오비트랩(R = 7,500)의 MS/MS 스캔이 이어졌다. 탠덤 질량 스펙트럼은 SEQUEST와 추가적인 수동 컨트롤에 의해 해석된다. 동정된 펩티드 서열은 생성된 자연 펩티드 단편화 패턴과 합성을 서열-일치 참고 펩티드와의 비교를 통해 보증되었다.
비표지 상대적 LC-MS 정량화는 이온 계측, 즉, LC-MS 특징의 추출 및 분석에 의해 수행했다(Mueller et al., 2007). 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플 내의 풍부함과 상관관계가 있음을 가정한다. 추출된 특징은 전하 상태 디컨블루션 및 정체 시간 정렬에 의해 더욱 처리되었다(Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). 마지막으로 모든 LC-MS 특징은 서열 확인 결과와 상호 참조하여 다른 샘플과 조직의 정량 데이터를 펩티드 제시 프로파일에 합쳤다. 이 정량 데이터를 중심 경향성에 따라 2단 형태로 정상화함으로써 기술적인 생물학적 복제 내에서의 변동을 고려했다. 따라서, 동정된 펩티드는 하나씩 정량 데이터와 연관시키며 샘플과 조직 사이의 상대적 정량화를 허용할 수 있다. 그 밖에 펩티드 후보로부터 얻어진 모든 정량 데이터를 수동으로 검사하여 데이터 일관성을 보증하고 자동화 분석의 정확성을 확인했다. 펩티드마다 평균 샘플 제시는 물론 복사 변이를 보여주는 제시 프로파일을 계산했다. 이 프로파일은 상이한 암 샘플을 정상 조직 샘플의 기준선에 병치한다. 예시적인 과다제시된 펩티드의 제시 프로파일이 도 1에 제시된다.
표 8(A 및 B) 및 표 9(A 및 B)는 선택된 펩티드에 대한 다양한 암 객체 상의 제시와 그에 따라서 표시된 암의 진단 및/또는 치료에 대해 언급된 펩티드의 특별한 관련성을 보여준다(예: 방광암, 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, 간세포 암종, 비소세포 폐암 및 췌장암은 펩티드 서열식별번호 1, 신장암, 위-식도 암 등 식도암, 아교모세포종은 펩티드 서열식별번호 2 등).
표 8A는 객체들에서 선택된 본 발명의 HLA-A*02-결합 종양-연관 펩티드의 제시 개요를 나타낸다. GB = 아교모세포종, BRCA = 유방암, CRC = 대장암, RCC = 신세포 암종, CLL = 만성 림프구성 백혈병, HCC = 간세포 암종, NSCLC = 비소세포 폐암, SCLC = 소세포 폐암, NHL = 비호지킨 림프종(8개 샘플), AML = 급성 골수성 백혈병, OC = 난소암, PC = 췌장암, clPC = 췌장암 세포주, PCA = 전립선암 및 양성 전립선 비대증, OSCAR = 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, GBC_CCC = 담낭 선암종 및 담관암종, MEL = 흑색종, GC = 위암, TC = 고환암, UBC = 방광암, UEC = 자궁암.
[표 8A]
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표 8B는 선택된 펩티드에 대한 다양한 암 객체 상의 제시와 그에 따라서 표시된 암의 진단 및/또는 치료에 대해 언급된 펩티드의 특별한 관련성을 보여준다.
표 8B는 객체에 걸쳐 선택된 HLA-A*02 펩티드의 제시 개요를 나타낸다. GB = 아교모세포종, BRCA = 유방암, CRC = 대장암, RCC = 신세포 암종, CLL = 만성 림프구성 백혈병, HCC = 간세포 암종, NSCLC = 비소세포 폐암, SCLC = 소세포 폐암, NHL = 비호지킨 림프종, AML = 급성 골수성 백혈병, OC = 난소암, PC = 췌장암, BPH = 전립선암 및 양성 전립선 비대증, OSCAR = 위-식도 연결부의 암을 포함한 식도암, GBC_CCC = 담낭 선암종 및 담관암종, MEL = 흑색종, GC = 위암, TC = 고환암, UBC = 방광암, UTC = 자궁암, HNSCC = 두경부 편평세포 암종.
[표 8B]
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표 9A는 객체에 걸쳐 선택된 본 발명의 HLA-A*24 결합 종양-연관 펩티드의 제시 개요를 나타낸다. GB = 아교모세포종, HCC = 간세포 암종, NSCLC = 비소세포 폐암, PCA = 전립선암, GC = 위암, CRC = 대장암, RCC = 신세포 암종.
[표 9A]
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표 9B는 선택된 펩티드에 대한 다양한 암 객체 상의 제시와 그에 따라서 표시된 암의 진단 및/또는 치료에 대해 언급된 펩티드의 특별한 관련성을 보여준다.
표 9B는 객체에 걸쳐 선택된 HLA-A*24 펩티드의 제시 개요를 나타낸다. GB = 아교모세포종, CRC = 대장암, RCC = 신세포 암종, HCC = 간세포 암종, NSCLC = 비소세포 폐암, PCA = 전립선암 및 양성 갑상선 비대증, GC = 위암.
[표 9B]
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실시예 2
본 발명의 펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현 프로파일
정상 세포와 비교한 종양 세포 상의 펩티드의 과다제시 또는 특이적 제시는 면역요법에서의 그 유용성에 충분하며 일부 펩티드는 정상 조직에서도 발생하는 그 근원 단백질에도 불구하고 종양-특이적이다. 여전히 mRNA 발현 프로파일의 결정은 면역요법을 위한 펩티드 표적의 선택에서 추가적 안정성 수준을 추가한다. 특별히 친화도 성숙 TCR과 같은 안전성 위험이 높은 치료 옵션의 경우, 이상적인 표적 펩티드는 그 종양에 고유하고 정상 조직에서는 발견되지 않는 단백질로부터 유래할 것이고 종양-대-정상 비율이 높은 유전자 발현은 치료 윈도우(therapeutic window)를 나타낸다. 더욱이, 펩티드 제시에 대해 아직 분석되지 않은 종양 객체에서 근원 유전자의 과발현은 특정 펩티드가 해당 객체에서 중요할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 HLA 클래스 I 결합 펩티드의 경우, 모든 근원 유전자의 정상 조직 발현은 약 3,000개의 정상 조직 샘플을 포함하는 RNASeq 데이터의 데이터베이스에 근거하여 최소인 것으로 나타났다(Lonsdale, 2013). 그 밖에 종양의 정상 조직에서 얻는 유전자 발현 데이터를 분석하여 다양한 종양 객체의 표적 범위를 평가했다.
RNA 공급원 및 준비
외과적으로 제거된 조직 샘플은 위에서 지적한 바와 같이 각 환자로부터 서면 동의서를 받은 후 제공되었다(실시예 1 참조). 종양 조직 샘플은 수술 직후 스냅-냉동되었고 절구와 유봉을 이용하여 액체 질소 환경 아래에서 균질화되었다. 총 RNA는 TRIzol(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 이용하여 샘플로부터 제조되었고 이는 RNeasy(QIAGEN, Hilden, Germany)에 의해 청소되었다; 이 2개의 모든 방법은 제조업체의 설명서에 따라 실행되었다.
RNASeq 실험을 위한 건강한 인체 조직의 총 RNA는 다음으로부터 얻었다. Asterand(Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK); Bio-Options Inc.(Brea, CA, USA); ProteoGenex Inc.(Culver City, CA, USA); Geneticist Inc.(Glendale, CA, USA); Istituto Nazionale Tumori "Pascale"(Naples, Italy); University Hospital of Heidelberg(Heidelberg, Germany); BioCat GmbH(Heidelberg, Germany), BioServe(Beltsville, MD, USA), Capital BioScience Inc.(Rockville, MD, USA).
RNASeq 실험을 위한 종양 조직의 모든 RNA는 다음을 통해 제공되었다: Asterand(Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK), Bio-Options Inc.(Brea, CA, USA), BioServe(Beltsville, MD, USA), Geneticist Inc.(Glendale, CA, USA), ProteoGenex Inc.(Culver City, CA, USA), Tissue Solutions Ltd(Glasgow, UK), University Hospital Bonn(Bonn, Germany), University Hospital Heidelberg(Heidelberg, Germany), University Hospital Tubingen(Tubingen, Germany).
모든 샘플의 품질 및 양은 RNA 6000 Pico LabChip Kit(Agilent)를 사용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, Waldbronn, Germany) 상에서 분석했다.
RNAseq 실험
종양 및 정상 조직 RNA 샘플의 유전자 발현 분석은 CeGaT(독일 튀빙겐)의 차세대 시퀀싱(RNAseq)에 의해 수행했다. 요약하면, RNA 단편화, cDNA 변환 및 시퀀싱 어댑터의 추가를 포함하는 제공자의 프로토콜(Illumina Inc., 미국 캘리포니아 샌디에고)에 따라 Illumina HiSeq v4 시약 키트를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 준비했다. 복수의 샘플로부터 유래한 라이브러리들을 동일 몰 비율로 혼합한 다음 제조사의 지침에 따라 Illumina HiSeq 2500 시퀀서에서 시퀀싱을 수행하여 50 bp 단일 말단 리드를 생성했다. 처리된 리드를 STAR 소프트웨어를 사용하여 인간 게놈(GRCh38)에 대해 매핑한다. 발현 데이터는 앙상블 시퀀스 데이터베이스(Ensembl77)의 주석에 근거하여, 전사물 수준에서 RPKM(Reads Per Kilobase per Million 매핑 리드, Cufflinks 소프트웨어로 생성)으로서 엑손 수준(총 리드, Bedtools 소프트웨어로 생성)에서 제공된다. 엑손 리드들 엑손 길이 및 정렬 크기로서 정규화하여 RPKM 값을 얻는다.
도 2는 여러 암에서 고도로 과발현되거나 배타적으로 발현된 본 발명의 근원 유전자에 대한 예시적 발현 프로파일을 보여준다. 추가의 예시적 표적에 대한 발현 점수는 자체의 RNASeq 분석에 근거했으며 표 10(A 및 B)에 제시된다. 기타 객체의 발현 데이터 및 추가의 예시적 펩티드가 표 11에 요약되어 있으며, 이는 다음의 데이터에 근거한다: TCGA Research Network: http://cancergenome.nih.gov/.
표 10A는 선택된 펩티드에서 근원 유전자의 발현에 대한 다양한 종양체 내의 표적 범위이다. 과발현이란 해당 유전자에 대해 가장 높은 발현을 보여 관련있는 정상 조직과 비교하여 종양 조직의 발현이 1.5배를 초과하는 것으로 정의했다. 19% 미만 과발현 = I, 20 내지 49% = II, 50 내지 69% = III, 70% 초과 = IV. 펩티드가 몇몇 근원 유전자로부터 유래할 수 있다면, 최소 범위를 가진 유전자로 결정되었다. 베이스라인에는 다음의 관련있는 정상 조직들이 포함되었다: 지방 조직, 부신, 동맥, 골수, 뇌, 연골, 결장, 식도, 담낭, 심장, 신장, 간, 폐, 림프절, 췌장, 뇌하수체, 직장, 골격 근육, 피부, 소장, 비장, 위, 흉선, 갑상선, 기관, 방광 및 정맥. 동일한 조직 유형의 여러 샘플에 대한 발현 데이터가 있는 경우, 모든 해당 샘플의 산술 평균을 계산에 사용했다.
[표 10A]
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표 10B는 선택된 펩티드의 근원 유전자에 대한 표적 범위를 나타낸다. 과발현은 해당 유전자의 가장 높은 발현을 보인 관련 정상 조직에 비해 종양에서 발현이 1.5배를 초과하는 것으로 정의했다. 19% 미만 과발현 = I, 20 내지 49% = II, 50 내지 69% = III, 70% 초과 = IV. 펩티드가 여러 근원 유전자로부터 유래할 수 있는 경우에는, 범위가 최소인 유전자로 결정했다. 베이스라인에는 다음의 관련 있는 정상 조직이 포함되었다: 지방 조직, 부신, 동맥, 골수, 뇌, 연골, 결장, 식도, 담낭, 심장, 신장, 간, 폐, 림프절, 췌장, 뇌하수체, 직장, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 흉선, 갑상선, 기관, 방광, 정맥. 동일한 조직 유형에 대해 여러 샘플의 발현 데이터가 있는 경우, 모든 해당 샘플의 산술 평균을 그 계산에 사용했다. NHL = 비호지킨 림프종, PCA = 전립선암 및 양성 전립선 비대증, GC = 위암, GBC_CCC = 담낭 선암종 및 담관암종, MEL = 흑색종, UBC = 방광암, UTC = 자궁암, HNSCC = 두경부 소세포 암종.
[표 10B]
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표 11은 선택된 펩티드의 근원 유전자의 발현에 대해 다양한 종양 객체 내의 표적 범위를 나타낸다. 종양 샘플에서 그 유전자의 발현 수준이 다음의 정상 기관들(종양의 주위)에서 얻은 샘플로부터 측정된 발현 수준의 가장 높은 75% 백분위보다 2배를 초과하는 경우 그 유전자가 과발현된 것으로 간주했다: 직장(n=10), 식도(n=11), 방광(n=19), 신장(n=129), 위(n=35), 결장(n=41), 두경부(n=43), 간(n=50), 폐(n=51), 갑상선(n=59), 폐(n=59).
표 11에서, 과발현의 범주는 다음과 같이 표시된다: "A"(종양의 50% 이상이 컷오프 초과), "B"(종양의 20% 이상 내지 50% 미만이 컷오프 초과), 및 "C"(종양의 5% 이상 내지 20% 미만이 컷오프 초과).
표 11에서, ACC=부신피질 암종(N=79), BLCA=방광 요로상피 암종(N=408), LGG=저등급 신경교종(N=534), CESC=자궁경부 편평세포 암종 및 자궁목 선암종(N=307), STAD=위 선암종(N=415), CHOL=담관암종(N=36), MESO=중피종(N=87), KICH=혐색소 신세포암(N=66), PRAD=전립선 선암종(N=498), DLBC=림프구 종양 미만성 거대 B세포 림프종(N=48), PCPG=크롬친화세포종 및 부신결절종(N=184), KIRP=신장 유두상 세포 암종(N=291), SKCM=피부 흑색종(N=473), SARC=육종(N=263), THCA=갑상선 암종(N=513), THYM=흉선종(N=120), UCS=자궁 암육종(N=57), UCEC=자궁체 자궁내막 암종(N=546), UVM=포도막 흑색종(N=80), TGCT=고환 생식 세포 종양(N=156), HNSC=두경부 편평세포 암종(N=521).
[표 11]
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실시예 3
MHC 클래스 I 제시 펩티드에 관한 시험관내 면역원성
본 발명의 TUMAP의 면역원성에 대한 정보를 얻기 위해, 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원-제시 세포(aAPC)를 갖는 CD8+ T 세포의 반복된 자극을 근거로 시험관내 초회감작 검사를 사용하여 조사를 수행했다. 이 방법으로 본 발명자들은 HLA-A*02:01 제한된 본 발명의 TUMAP의 면역원성을 보여줄 수 있었으며, 이것은 이 펩티드들이 인간에 존재하는 CD8+ 전구 T 세포에 대한 T 세포 에피톱이라는 것을 보여주었다(표 9).
CD8+ T 세포의 시험관내 초회감작
펩티드-MHC 복합체(pMHC) 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원-제시 세포에 의한 시험관내 자극을 수행하기 위해, 독일 소재 University clinics Mannheim에서 동의서를 받은 건강한 공여자로부터의 CD8 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany)를 사용한 양성 선택을 통해 신선한 HLA-A*02 백혈구 성분 채집 산물로부터 CD8+ T 세포를 먼저 분리했다.
PBMC 및 단리된 CD8+ 림프구는 10% 열 비활성화된 인간 AB 혈청(PAN-Biotech, Aidenbach, Germany), 100 U/mL 페니실린/100 μg/mL 스트렙토마이신(Cambrex, Cologne, Germany), 1 mM 피루브산 나트륨(CC Pro, Oberdorla, Germany), 20 μg/mL 젠타마이신(Cambrex)으로 보충된 RPMI-Glutamax(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)로 구성된 T 세포 배지(TCM)에서 사용할 때까지 배양했다. 이 단계에서 2.5 ng/mL IL-7(PromoCell, Heidelberg, Germany) 및 10 U/mL IL-2(Novartis Pharma, Nㆌrnberg, Germany) 또한 TCM에 추가했다.
pMHC/항-CD28 코팅된 비드의 생성, T 세포 자극 및 판독은 고도로 정의된 시험관내 체계에서 수행했으며, 자극 조건 당 4가지 다른 pMHC 분자 및 판독 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자를 각각 사용했다.
정제된 공동-자극 쥐 IgG2a 항인체 CD28 Ab 9.3(Jung et al., 1987)은 제조사가 권장하는 술폰-N-하이드록시숙신이미도비오틴을 사용하여 화학적으로 비오틴닐화했다(Perbio, Bonn, Germany). 사용된 비드는 스트렙티비딘으로 코팅된 직경 5.6 μm의 폴리스티렌 입자였다(Bangs Laboratories, Illinois, USA).
양성 및 음성 대조군 자극에 사용된 pMHC는 각각 A*0201/MLA-001(변형된 Melan-A/MART-1에서 얻은 펩티드 ELAGIGILTV(서열식별번호 418) 및 A*0201/DDX5-001(DDX5에서 얻은 YLLPAIVHI, 서열식별번호 419)였다.
800,000 비드/200 μL는 4 x 12.5 ng 비오틴-pMHC 존재 하에 96-웰 플레이트에서 코팅하고 세척한 다음 600 ng 비오틴 항CD28을 첨가하여 200 μL의 부피로 만들었다. 1x106 CD8+ T 세포와 2x105의 세척하고 코팅한 비드를 5 ng/mL IL-12 (PromoCell)로 보충한 200 μL TCM에서 37℃에서 3일 동안 배양함으로써 96-웰 플레이트에서의 자극을 개시했다. 배지의 반은 80 U/mL IL-2로 추가된 새로운 TCM에 의해 교환되고 배양은 37℃에서 4 일간 계속되었다. 이 자극 주기는 총 세 번 수행되었다. 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자를 사용하는 pMHC 멀티머의 판독을 위해, 이미 설명된 바와 같이(Andersen et al., 2012) 2차원 조합대수적 코팅 접근방식을 사용했으며, 5가지 다른 형광색소와의 결합을 허용하는 약간의 변형이 있었다. 마지막으로 멀티머 분석은 살아있는/죽은 세포를 근적외선(near IR) 염료(Invitrogen, Karlsruhe, Germany), CD8-FITC 항체 클론 SK1(BD, Heidelberg, Germany) 및 형광 pMHC 멀티머로써 세포를 염색하여 수행했다. 분석에는 적절한 레이저 및 필터가 장착된 BD LSRII SORP 세포측정기를 사용했다. 펩티드 특이적 세포는 총 CD8+ T 세포의 백분율로 계산되었다. 멀티머 분석의 평가는 FCS Express 소프트웨어(De Novo Software)를 사용하여 수행되었다. 특정 멀티머+ CD8+ 림프구의 시험관내 프라이밍은 음성 대조군 자극과 비교함으로써 검출했다. 주어진 항원의 면역성은 건강한 기증자의 최소한 하나의 시험관내 자극된 평가가능한 웰에 시험관내 자극 후 CD8+ T 세포주가 포함되는 것으로 확인될 때 나타났다(예를 들어, 이 웰은 CD8+ T 세포 중 최소한 1%의 특정 테트라머+를 가졌으며 특정 테트라머+ 세포의 백분율은 최소한 음성 대조군 자극의 매체보다 10배여야 한다).
상이한 암 펩티드에 관한 시험관내 면역원성
실험된 HLA 클래스 I 펩티드에서, 시험관내 면역원성은 펩티드-특이적 T 세포주의 형성에 의해 입증될 수 있었다. 본 발명의 2개의 펩티드에 대한 TUMAP-특이적 다합체 염색 이후 예시적 유세포 측정 결과 및 상응하는 음성 대조군이 도 3에 제시된다. 본 발명의 5개의 펩티드에 대한 결과는 표 12A에 요약되어 있다. 도 4 및 5에는 본 발명의 7개 펩티드에 대한 TUMAP-특이적 다합체 염색 후 얻은 예시적 유세포 측정 결과 및 상응하는 음성 대조군이 제시된다. 본 발명의 74개 펩티드에 대한 결과가 표 12B에 요약되어있다.
표 12A는 본 발명의 HLA 클래스 I 펩티드의 시험관내 면역원성에 관한 것으로서, 본 출원자가 본 발명의 펩티드에 대해 실행한 시험관내 면역원성 실험의 예시적 결과를 나타낸다. 20% 미만 = +; 20% 내지 49% = ++; 50% 내지 69%= +++; 70% 이상 = ++++.
[표 12A]
Figure 112018079258903-pat00064
표 12B는 본 발명의 HLA 클래스 I 펩티드의 시험관내 면역원성에 관한 것으로서, 본 발명의 출원자가 실행한 펩티드에 대한 시험관내 면역원성 실험의 예시적 결과를 나타낸다. 20% 미만 = +; 20% 내지 49% = ++; 50% 내지 69%= +++; 70% 이상 = ++++.
[표 12B]
Figure 112018079258903-pat00065
Figure 112018079258903-pat00066
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실시예 4
펩티드의 합성
모든 펩티드는 Fmoc-전략을 사용하여 표준 및 잘 확립된 고체상 펩티드 합성으로써 합성되었다. 각 개별 펩티드의 정체와 순도는 질량 분석법과 분석 RP-HPLC에 의해 결정되었다. 펩티드는 백색 내지 황백색 동결건조 배양물(삼불화아세트산 염) 및 50% 초과의 순도로서 얻어졌다. 모든 TUMAP는 바람직하게는 삼불화아세트산 염 또는 아세트산 염으로 투여되지만, 다른 염의 형태 또한 가능하다.
실시예 5
MHC 결합 검정
본 발명에 따른 T 세포 기반 요법의 후보 펩티드를 그 MHC 결합 능력(친화성)에 대해 추가로 시험했다. 개별 펩티드-MHC 복합체는 UV-리간드 교환에 의해 만들었으며, UV에 민감한 펩티드가 UV 조사 후 분할된 다음 분석된 관심 대상의 펩티드로 교환되었다. 펩티드 수용성 MHC 분자를 효과적으로 결합하고 안정화시킬 수 있는 펩티드 후보만이 MHC 복합체의 해리를 막는다. 이 교환작용의 수율을 결정하기 위해, 안정화된 MHC 복합체의 경쇄(β2m) 검출에 근거하여 ELISA를 수행했다. 이 검정은 Rodenko 등에서 일반적으로 설명된 대로 수행했다(Rodenko et al., 2006).
96-웰 MAXISorp 플레이트(NUNC)를 PBS에서 2 μg/mL 스트렙타비딘으로 밤새 코팅하고 4회 세척한 다음 블로킹 완충제를 함유하는 2% BSA에서 37℃ 및 30분 동안 블로킹을 진행했다. 되접기된 HLA-A*02:01/MLA-001 단량체가 표준의 역할을 했으며, 그 범위는 15 내지 500 ng/mL였다. UV-교환 반응을 위한 펩티드-MHC 단량체는 블로킹 완충제으로 100배 희석되었다. 샘플은 37℃에서 1시간 배양 후 4회 세척하고 2 μg/mL HRP 접합된 항-β2m으로 37℃에서 1시간 배양한 다음 NH2SO4로 정지시킨 TMB 용액으로 검출했다. 흡광은 450 nm에서 측정했다. 높은 교환 수율(바람직하게는 50% 초과, 가장 바람직하게는 75% 초과)을 보이는 후보 펩티드가 일반적으로 항체 또는 그 단편 및/또는 T 세포 수용체 또는 그 단편의 생성 및 생성을 위해 선호되는데, 이는 MHC 분자에 대한 충분한 결합성을 보이며 MHC 복합체의 해리를 막기 때문이다.
표 13은 MHC 클래스 I 결합 점수를 타나낸다. HLA 클래스 I 제한 펩티드의 HLA-A*02에 대한 결합 범위는 펩티드 교환 수율에 의해 정해졌다: 20% 미만 = +; 20% 내지 49% = ++; 50% 내지 75%= +++; 75% 이상 = ++++.
[표 13]
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표 14는 MHC 클래스 I 결합 점수를 나타낸다. HLA 클래스 I 제한 펩티드의 HLA-A*24에 대한 결합 범위는 펩티드 교환 수율에 의해 정해졌다: 20% 미만 = +; 20% 내지 49% = ++; 50% 내지 75%= +++; 75% 이상 = ++++.
[표 14]
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실시예 6
세포 표면에 제시된 종양-연관 펩티드의 절대 정량화
항체 및/또는 TCR과 같은 결합제의 생성은 시간이 많이 걸리는 과정이며, 일부의 선택된 표적에 대해서만 수행할 수 있다. 종양-연관 및 종양-특이적 펩티드의 경우, 선택 기준은 제시의 배타성 및 세포 표면 상에 제시된 펩티드의 밀도를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 실시예 1에 설명되는 펩티드의 단리 및 상대적 정량화 외에도, 본 발명자는 설명된 바와 같이 세포 당 절대 펩티드 복제 수를 분석했다. 고형 종양 샘플에서 세포당 TUMAP 복제수의 정량화는 분리된 TUMAP의 절대 정량화, TUMAP 분리의 효율 및 분석된 조직 샘플의 세포 수를 요구한다.
nanoLC-MS/MS에 의한 펩티드 정량
질량 분석법에 의한 펩티드의 정확한 정량화를 위해, 내부 표준법을 사용하여 각 펩티드의 검정 곡선을 생성했다. 내부 표준이란 각 펩티드의 2중-동위원소-표지 변이체이며, 즉 동위원소-표지 아미노산 2개를 TUMAP 합성에 포함시켰다. 이는 질량에서만 종양-연관 펩티드와 다를 뿐 다른 물리화학적 성질은 차이를 보이지 않는다(Anderson et al., 2012). 각 MS 샘플에 대해 내부 표준을 스파이킹하며, 모든 MS 신호는 내부 표준의 MS 신호에 대해 정규화하여 MS 실험 간 가능한 기술적 편차를 없앴다.
검정 곡선은 적어도 3가지 다른 매트릭스에서 작성했다. 즉, HLA 펩티드는 일상적 MS 샘플과 유사한 자연 샘플로부터 용출되며 각 제제는 이중 MS 실행을 통해 측정했다. 평가에서는, MS 신호를 내부 표준의 신호에 대해 정규화하고 검정 곡선은 로지스틱 회귀에 의해 계산했다.
조직 샘플에서 얻는 종양-연관 펩티드의 정량화에서는, 각 샘플을 내부 표준으로 스파이킹하고; MS 신호는 내부 표준에 대해 정규화한 다음 펩티드 검정 곡선을 사용하여 정량화했다.
펩티드/MHC 단리의 효율
모든 단백질 정제 공정과 마찬가지로, 조직 샘플로부터의 단백질 단리는 관심 대상의 단백질에 대한 일정 손실과 연관된다. TUMAP 단리의 효율 결정을 위해, 절대 정량을 위해 선택된 모든 TUMAP에 대한 펩티드/MHC 복합체를 생성했다. 자연 펩티드/MHC 복합체로부터 스파이킹된 것을 구별할 수 있기 위해, TUMAP의 단일-동위원소-표지 버전을 사용했다. 즉, 하나의 동위원소-표지 아미노산을 TUMAP 합성에 포함시켰다. 이 복합체들을 신선하게 준비된 조직 용해물에 즉, TUMAP 단리 절차에서 가능한 가장 이른 시점에 스파이킹한 다음 추후 친화성 정제에서 자연 펩티드/MHC 복합체와 같이 포획했다. 따라서, 단일-표지 TUMAP의 회수 측정은 개별 자연 TUMAP의 단리 효율에 대한 결론을 허용한다.
단리의 효율은 적은 수의 샘플에서 분석했으며 이러한 조직 샘플들 사이에 유사했다. 이와 반대로 개별 펩티드 간의 단리 효율은 차이가 있다. 이것은 단리 효율은 그것이 제한된 수의 조직 샘플만을 통해 결정되는 것이라도 다른 조직의 제제로 외삽할 수 있음을 시사한다. 하지만 각 TUMAP는 개별적으로 분석하는 것이 필요한데 이는 단리 효율을 한 펩티드에서 다른 것으로 외삽할 수 없기 때문이다.
고체 동결 조직에서의 세포 수 결정
본 발명자는 절대 펩티드 정량화를 거친 조직 샘플의 세포 수 결정을 위해, DNA 함량 분석을 적용했다. 이 방법은 광범위한 다른 출처의 샘플들, 가장 중요하게는 동결 샘플에 적용된다(Alcoser et al., 2011; Forsey and Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). 펩티드 분리 프로토콜 동안, 조직 샘플을 동질의 용해물로 처리하며 이로부터 소량의 용해물 일정 부분을 취한다. 이 일정 부분을 세 부분으로 나누며, 이로부터 DNA가 분리된다(QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany). 각 DNA 분리물로부터 총 DNA 함량을 형광-기반 DNA 정량화 검정(Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Germany)을 사용하여 정량화하는데 이때 최소 2회 반복 측정한다.
세포수의 계산을 위해, 1개의 건강한 혈액 샘플의 일정 부분들로부터 얻어진 DNA 표준 곡선(정의된 세포 수 범위 포함)을 생성한다. 이 표준 곡선을 사용하여, 각 DNA 단리물로부터 얻은 총 DNA 함량에서 총 세포 수를 계산한다. 펩티드 분리에 사용된 조직 샘플의 평균 총 세포수를 외삽하며, 이때 용해 분별액의 알려진 용적과 총 용해물 용적을 고려한다.
세포 당 펩티드 복제수
본 발명자는 상기 언급된 실험에서 얻는 데이터를 통해, 샘플의 펩티드 총량을 해당 샘플의 총 세포수로 나눈 다음 다시 단리 효율에 따른 나누기를 하여 세포당 TUMAP 복제수를 계산했다. 선택된 펩티드의 복제수는 표 15에 제시된다.
표 15는 절대 복제수이다. 이 표는 종양 샘플에 대한 절대 펩티드 정량화 결과를 나열하고 있다. 각 펩티드에 대한 세포당 복제수 중간값이 표시되어 있다: 100 미만 = +; 100 이상 = ++; 1,000 이상 = +++; 10,000 이상 = ++++. 평가가능한 고품질 MS 데이터를 사용할 수 있는 샘플 수가 표시되어 있다.
[표 15]
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참조문헌 목록
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SEQUENCE LISTING <110> Immatics Biotechnologies GmbH <120> Novel peptides, combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapeutic treatment of various cancers <130> I32855WO <140> PCT/EP2016/070146 <141> 2016-08-26 <150> GB 1515321.6 <151> 2015-08-28 <150> US 62/211,276 <151> 2015-08-28 <160> 419 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Leu Trp Gly Lys Val Phe Tyr Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Leu Tyr Gly Lys Leu Leu Lys Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Leu Leu Gly Lys Gln Val Thr Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Leu Ala Glu Ile Val Phe Lys Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Leu Phe Gly Gln Glu Val Tyr Cys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Leu Asp Pro Ala Gln Arg Asp Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ala Ala Ala Lys Val Pro Glu Val 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Lys Leu Gly Pro Phe Leu Leu Asn Ala 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Phe Leu Gly Asp Tyr Val Glu Asn Leu 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Lys Thr Leu Asp Val Phe Asn Ile Ile Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Val Leu Lys Val Phe Leu Glu Asn Val 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Leu Asp His Leu Ser Phe Ile Asn Lys Ile 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Leu Gly Asp Tyr Val His Ala Cys 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 His Leu Tyr Asn Asn Glu Glu Gln Val 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Thr Leu Leu Pro Thr Val Leu Thr Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ala Leu Asp Gly His Leu Tyr Ala Ile 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Leu Tyr His Arg Val Leu Leu Tyr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Leu Ser Asp Leu Thr Leu Gln Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Gln Thr Val Val Val Ile Lys Ala 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Phe Leu Trp Asn Gly Glu Asp Ser Ala Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ile Gln Ala Asp Asp Phe Arg Thr Leu 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Lys Val Asp Gly Val Val Ile Gln Leu 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Lys Val Phe Gly Asp Leu Asp Gln Val 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 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308 Thr Phe Asp Gly His Gly Val Phe Phe 1 5 <210> 309 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 309 Lys Tyr Tyr Arg Gln Thr Leu Leu Phe 1 5 <210> 310 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 310 Ile Tyr Ala Pro Thr Leu Leu Val Phe 1 5 <210> 311 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 311 Glu Tyr Leu Gln Asn Leu Asn His Ile 1 5 <210> 312 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 312 Ser Tyr Thr Ser Val Leu Ser Arg Leu 1 5 <210> 313 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 313 Lys Tyr Thr His Phe Ile Gln Ser Phe 1 5 <210> 314 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Arg Tyr Phe Lys Gly Asp Tyr Ser Ile 1 5 <210> 315 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 315 Phe Tyr Ile Pro His Val Pro Val Ser Phe 1 5 10 <210> 316 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 316 Val Tyr Phe Glu Gly Ser Asp Phe Lys Phe 1 5 10 <210> 317 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 317 Val Phe Asp Thr Ser Ile Ala Gln Leu Phe 1 5 10 <210> 318 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 318 Thr Tyr Ser Asn Ser Ala Phe Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 319 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 319 Lys Tyr Ser Asp Val Lys Asn Leu Ile 1 5 <210> 320 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 320 Lys Phe Ile Leu Ala Leu Lys Val Leu Phe 1 5 10 <210> 321 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 321 Ser Leu Trp Phe Lys Pro Glu Glu Leu 1 5 <210> 322 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 322 Ala Leu Val Ser Gly Gly Val Ala Gln Ala 1 5 10 <210> 323 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 323 Ile Leu Ser Val Val Asn Ser Gln Leu 1 5 <210> 324 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 324 Ala Ile Phe Asp Phe Cys Pro Ser Val 1 5 <210> 325 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 325 Arg Leu Leu Pro Lys Val Gln Glu Val 1 5 <210> 326 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 326 Ser Leu Leu Pro Leu Val Trp Lys Ile 1 5 <210> 327 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 327 Ser Ile Gly Asp Ile Phe Leu Lys Tyr 1 5 <210> 328 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 328 Ser Val Asp Ser Ala Pro Ala Ala Val 1 5 <210> 329 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 329 Phe Ala Trp Glu Pro Ser Phe Arg Asp Gln Val 1 5 10 <210> 330 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 330 Phe Leu Trp Pro Lys Glu Val Glu Leu 1 5 <210> 331 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 331 Ala Ile Trp Lys Glu Leu Ile Ser Leu 1 5 <210> 332 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 332 Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ala Lys 1 5 <210> 333 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 333 Gly Thr Phe Leu Glu Gly Val Ala Lys 1 5 <210> 334 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 334 Gly Arg Ala Asp Ala Leu Arg Val Leu 1 5 <210> 335 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 335 Val Leu Leu Ala Ala Gly Pro Ser Ala Ala 1 5 10 <210> 336 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 336 Gly Leu Met Asp Gly Ser Pro His Phe Leu 1 5 10 <210> 337 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 337 Lys Val Leu Gly Lys Ile Glu Lys Val 1 5 <210> 338 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 338 Leu Leu Tyr Asp Gly Lys Leu Ser Ser Ala 1 5 10 <210> 339 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 339 Val Leu Gly Pro Gly Pro Pro Pro Leu 1 5 <210> 340 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 340 Ser Val Ala Lys Thr Ile Leu Lys Arg 1 5 <210> 341 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 341 Ser Tyr Leu Thr Gln His Gln Arg Ile 1 5 <210> 342 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 342 Asn Tyr Ala Phe Leu His Arg Thr Leu 1 5 <210> 343 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 343 Asn Tyr Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile 1 5 <210> 344 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 344 Glu Tyr Asn Ser Asp Leu His Gln Phe 1 5 <210> 345 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 345 Glu Tyr Asn Ser Asp Leu His Gln Phe Phe 1 5 10 <210> 346 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 346 Ile Tyr Val Ile Pro Gln Pro His Phe 1 5 <210> 347 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 347 Val Tyr Ala Glu Val Asn Ser Leu 1 5 <210> 348 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 348 Ile Tyr Leu Glu His Thr Glu Ser Ile 1 5 <210> 349 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 349 Gln Tyr Ser Ile Ile Ser Asn Val Phe 1 5 <210> 350 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 350 Lys Tyr Gly Asn Phe Ile Asp Lys Leu 1 5 <210> 351 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 351 Ile Phe His Glu Val Pro Leu Lys Phe 1 5 <210> 352 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 352 Gln Tyr Gly Gly Asp Leu Thr Asn Thr Phe 1 5 10 <210> 353 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 353 Thr Tyr Gly Lys Ile Asp Leu Gly Phe 1 5 <210> 354 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 354 Val Tyr Asn Glu Gln Ile Arg Asp Leu Leu 1 5 10 <210> 355 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 355 Ile Tyr Val Thr Gly Gly His Leu Phe 1 5 <210> 356 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 356 Asn Tyr Met Pro Gly Gln Leu Thr Ile 1 5 <210> 357 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 357 Gln Phe Ile Thr Ser Thr Asn Thr Phe 1 5 <210> 358 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 358 Tyr Tyr Ser Glu Val Pro Val Lys Leu 1 5 <210> 359 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 359 Asn Tyr Gly Val Leu His Val Thr Phe 1 5 <210> 360 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 360 Val Phe Ser Pro Asp Gly His Leu Phe 1 5 <210> 361 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 361 Thr Tyr Ala Asp Ile Gly Gly Leu Asp Asn Gln Ile 1 5 10 <210> 362 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 362 Val Tyr Asn Tyr Ala Glu Gln Thr Leu 1 5 <210> 363 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 363 Ser Tyr Ala Glu Leu Gly Thr Thr Ile 1 5 <210> 364 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 364 Lys Tyr Leu Asn Glu Asn Gln Leu Ser Gln Leu 1 5 10 <210> 365 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 365 Val Phe Ile Asp His Pro Val His Leu 1 5 <210> 366 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 366 Gln Tyr Leu Glu Leu Ala His Ser Leu 1 5 <210> 367 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 367 Leu Tyr Gln Asp His Met Gln Tyr Ile 1 5 <210> 368 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 368 Lys Tyr Gln Asn Val Lys His Asn Leu 1 5 <210> 369 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 369 Val Tyr Thr His Glu Val Val Thr Leu 1 5 <210> 370 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 370 Arg Phe Ile Gly Ile Pro Asn Gln Phe 1 5 <210> 371 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 371 Ala Tyr Ser His Leu Arg Tyr Val Phe 1 5 <210> 372 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 372 Val Tyr Val Ile Glu Pro His Ser Met Glu Phe 1 5 10 <210> 373 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 373 Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu Phe 1 5 <210> 374 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 374 Val Phe Leu Pro Arg Val Thr Glu Leu 1 5 <210> 375 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 375 Lys Tyr Thr Asp Tyr Ile Leu Lys Ile 1 5 <210> 376 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 376 Val Tyr Thr Pro Val Ala Ser Arg Gln Ser Leu 1 5 10 <210> 377 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 377 Gln Tyr Thr Pro His Ser His Gln Phe 1 5 <210> 378 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 378 Val Tyr Ile Ala Glu Leu Glu Lys Ile 1 5 <210> 379 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 379 Val Phe Ile Ala Gln Gly Tyr Thr Leu 1 5 <210> 380 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 380 Val Tyr Thr Gly Ile Asp His His Trp 1 5 <210> 381 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 381 Lys Tyr Pro Ala Ser Ser Ser Val Phe 1 5 <210> 382 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 382 Ala Tyr Leu Pro Pro Leu Gln Gln Val Phe 1 5 10 <210> 383 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 383 Arg Tyr Lys Pro Gly Glu Pro Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 384 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 384 Arg Tyr Phe Asp Val Gly Leu His Asn Phe 1 5 10 <210> 385 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 385 Gln Tyr Ile Glu Glu Leu Gln Lys Phe 1 5 <210> 386 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 386 Thr Phe Ser Asp Val Glu Ala His Phe 1 5 <210> 387 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 387 Lys Tyr Thr Glu Lys Leu Glu Glu Ile 1 5 <210> 388 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 388 Ile Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Ala Phe 1 5 <210> 389 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 389 Glu Tyr Leu Pro Glu Phe Leu His Thr Phe 1 5 10 <210> 390 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 390 Arg Tyr Leu Trp Ala Thr Val Thr Ile 1 5 <210> 391 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 391 Leu Tyr Gln Ile Leu Gln Gly Ile Val Phe 1 5 10 <210> 392 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 392 Arg Tyr Leu Asp Ser Leu Lys Ala Ile Val Phe 1 5 10 <210> 393 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 393 Lys Tyr Ile Glu Ala Ile Gln Trp Ile 1 5 <210> 394 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 394 Phe Tyr Gln Pro Lys Ile Gln Gln Phe 1 5 <210> 395 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 395 Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Asn Ile Trp 1 5 <210> 396 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 396 Tyr Tyr His Phe Ile Phe Thr Thr Leu 1 5 <210> 397 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 397 Ile Tyr Asn Gly Lys Leu Phe Asp Leu 1 5 <210> 398 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 398 Ile Tyr Asn Gly Lys Leu Phe Asp Leu Leu 1 5 10 <210> 399 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 399 Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe 1 5 <210> 400 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 400 Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu 1 5 <210> 401 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 401 Val Phe Met Lys Asp Gly Phe Phe Tyr Phe 1 5 10 <210> 402 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 402 Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 403 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 403 Thr Tyr Lys Tyr Val Asp Ile Asn Thr Phe 1 5 10 <210> 404 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 404 Arg Tyr Leu Glu Lys Phe Tyr Gly Leu 1 5 <210> 405 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 405 Asn Tyr Pro Lys Ser Ile His Ser Phe 1 5 <210> 406 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 406 Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Phe 1 5 <210> 407 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 407 Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe 1 5 <210> 408 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 408 Gln Tyr Ala Ser Arg Phe Val Gln Leu 1 5 <210> 409 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 409 Tyr Phe Ile Ser His Val Leu Ala Phe 1 5 <210> 410 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 410 Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe 1 5 <210> 411 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 411 Val Tyr Ile Gly His Thr Ser Thr Ile 1 5 <210> 412 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 412 Ser Tyr Asn Pro Leu Trp Leu Arg Ile 1 5 <210> 413 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 413 Asn Tyr Leu Leu Tyr Val Ser Asn Phe 1 5 <210> 414 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 414 Met Tyr Pro Tyr Ile Tyr His Val Leu 1 5 <210> 415 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 415 Ser Tyr Gln Lys Val Ile Glu Leu Phe 1 5 <210> 416 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 416 Ala Tyr Ser Asp Gly His Phe Leu Phe 1 5 <210> 417 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 417 Val Tyr Lys Val Val Gly Asn Leu Leu 1 5 <210> 418 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 418 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 419 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 419 Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile 1 5

Claims (38)

  1. 서열식별번호 323의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서,
    클래스 I 또는 II MHC 분자에 결합하는 능력을 보유하고, 상기 MHC와 결합할 때, CD4 및/또는 CD8 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    펩티드가 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함하는, 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    펩티드가 융합 단백질의 일부인, 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제4항에 있어서,
    펩티드가 HLA-DR 항원-연관된 불변쇄(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질의 일부인, 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산.
  7. 제6항에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터.
  8. 제1항에 따른 펩티드를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약에 사용하기 위한 따른 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  10. 제1항에 따른 펩티드를 제시하거나 제6항에 따른 핵산을 발현하거나 제7항에 따른 발현 벡터를 발현하는, 제8항에 따른 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 펩티드를 상기 재조합 숙주 세포 또는 이의 배양 배지로부터 단리하는 단계
    를 포함하는, 제1항에 따른 펩티드의 생산 방법.
  11. T 세포를 항원-제시 세포 또는 항원-제시 세포를 모방하는 인공 구축물의 표면에 발현된 항원-로딩된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자와 시험관내에서 상기 T 세포를 항원-특이적 방식으로 활성화하기 위한 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 항원이 제1항에 따른 펩티드인, 활성화된 T 림프구를 생산하는 시험관내 방법.
  12. 서열식별번호 323의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제11항에 따른 방법에 의해 생산되는 활성화된 T 림프구.
  13. 제1항에 따른 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체.
  14. 제13항에 있어서,
    MHC 분자에 결합된 항체.
  15. 제1항에 따른 펩티드, 제6항에 따른 핵산, 제7항에 따른 발현 벡터, 제8항에 따른 재조합 숙주 세포, 제12항에 따른 활성화된 T 림프구 또는 제13항에 따른 항체를 포함하는, 암 치료를 위한 약학 조성물로서, 상기 암이 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신장 세포 암종, 만성 림프성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 위-식도 연결부의 암을 비롯한 식도암, 담낭암 및 담관 암종, 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  16. 제1항에 따른 펩티드, 제6항에 따른 핵산, 제7항에 따른 발현 벡터, 제8항에 따른 세포, 제12항에 따른 활성화된 T 림프구 또는 제13항에 따른 항체를 용액 또는 동결건조된 형태로 함유하는 약학 조성물을 포함하는 용기를 포함하는, 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신장 세포 암종, 만성 림프성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 위-식도 연결부의 암을 비롯한 식도암, 담낭암 및 담관 암종, 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 치료를 위한 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    (iii) 완충제, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘, 및 (vii) 주사기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 키트.
  18. 서열식별번호 323의 아미노산 서열을 갖는 HLA 리간드에 반응성인 T 세포 수용체.
  19. 제18항에 있어서,
    용해성 또는 막-결합된 T 세포 수용체.
  20. 제18항에 있어서,
    용해성 분자로서 제공되는 T 세포 수용체.
  21. 제18항에 있어서,
    추가 효과기 기능을 보유하는 T 세포 수용체.
  22. 제21항에 있어서,
    추가 효과기 기능이 면역 자극 도메인 또는 독소인, T 세포 수용체.
  23. 제18항에 있어서,
    리간드가 펩티드-MHC 복합체의 일부인, T 세포 수용체.
  24. 제18항의 T 세포 수용체를 인코딩하는 핵산.
  25. 제24항에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터.
  26. 제24항에 따른 핵산, 제13항에 따른 항체를 인코딩하는 핵산, 또는 제25항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  27. 서열식별번호 323의 아미노산 서열을 갖는 HLA 리간드에 반응성인 T 세포 수용체의 생산 방법으로서,
    제26항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 T 세포 수용체를 상기 숙주 세포 및/또는 이의 배양 배지로부터 단리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  28. a) 서열식별번호 323의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드;
    b) a)에 따른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC 복합체와 반응성인 T 세포 수용체;
    c) a)에 따른 펩티드 및 HLA-DR 항원-연관 불변쇄(Ii)의 N-말단 아미노산 1 내지 80을 포함하는 융합 단백질;
    d) a) 내지 c) 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터;
    e) d)의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포;
    f) T 세포를 항원-제시 세포의 표면에 발현된 a)에 따른 펩티드와 시험관내에서 상기 T 세포를 항원-특이적 방식으로 활성화하기 위한 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하는 방법, 및 이러한 활성화된 T 세포를 자가조직 또는 다른 환자에게 이전하는 방법에 의해 수득되는 활성화된 T-림프구;
    g) a)에 따른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC 복합체 및/또는 a)에 따른 펩티드를 제시하는 세포에 대해 반응성이고, 면역-활성화 도메인 또는 독소와의 융합에 의해 잠재적으로 변형되는 항체 또는 용해성 T 세포 수용체;
    h) 서열식별번호 323의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와 MHC 분자의 복합체; 및
    i) a) 내지 h) 중 어느 하나에 따른 접합된 또는 표지된 펩티드 또는 골격(scaffold) 및 약학적으로 허용가능한 담체
    로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성 성분을 포함하는, 아교모세포종, 유방암, 대장암, 신장 세포 암종, 만성 림프성 백혈병, 간세포 암종, 비소세포 및 소세포 폐암, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 난소암, 췌장암, 위-식도 연결부의 암을 비롯한 식도암, 담낭암 및 담관 암종, 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 치료를 위한 약학 조성물.
  29. 제13항에 있어서,
    용해성 또는 막-결합된 항체.

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