CN109467596B - 转录因子sp1在调控猪rtl1基因表达中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了转录因子SP1在调控猪RTL1基因表达中的应用。本发明以RTL1为研究对象，通过构建猪RTL1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，并找到RTL1的核心启动子区；再验证转录因子SP1与RTL1核心启动子区之间的相互作用；随后构建SP1超表达载体和合成小干扰RNA，检测SP1对RTL1的影响；还构建了转录因子SP1结合位点突变型荧光表达载体SP1‑mut转染PK15细胞和C2C12细胞后检测荧光素酶活性。本发明首次证实转录因子SP1对RTL1基因转录调控的影响，为RTL1的表达调控带来了更深层次的认知，运用于家畜肉质性状的改良及肌肉发育分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。

Description

转录因子SP1在调控猪RTL1基因表达中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及转录因子SP1在调控猪RTL1基因表达中的应用。
背景技术
RTL1基因(反转录转座子1基因，retrotransposon-like-1)，又名父本表达基因11(paternally expressed gene 11,Peg11),在人和小鼠中为父本表达的印记基因，没有内含子序列。RTL1基因在胚胎和胎盘组织中表达量很高，对母体胎盘与胎儿的营养传递起着重要作用，敲除该基因的小鼠表现为胎儿死亡率升高、新生儿生长停滞、胎盘尺寸偏小；与人的胎儿发育和新生儿的生长也有密切关系。该基因位于DLK1-DIO3印记区域，此区域基因对肌肉发育有一定的影响，在转基因小鼠中异位表达RTL1基因，会导致肌肉肥大；此外，该基因与callipyge绵羊的肌肉肥大相关，双肌臀的绵羊中RTL1基因的表达量是正常绵羊中的12倍。
基因表达调控研究是当前分子生物学研究的热点之一，而转录水平的调控是基因表达过程中最重要的第一步，转录因子是能与基因特定序列专一性结合，从而调节目的基因表达的蛋白质分子。转录因子在转录调控过程中直接或间接地识别和结合在顺式作用元件的核心序列上，参与调控靶基因的转录。因此筛选与鉴定基因的转录因子成为研究基因表达调控最为重要的一步，并为研究基因表达调控奠定基础。而有关RTL1基因的调控方面未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了转录因子SP1在调控猪RTL1基因表达中的应用，首次证实转录因子SP1对RTL1基因转录调控的影响：通过双荧光素酶报告系统找到RTL1基因的核心启动子区，进而利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)验证转录因子SP1与RTL1核心启动子区之间的相互作用、构建SP1超表达载体和合成小干扰RNA(SP1-siRNA)检测SP1对RTL1的影响、以及构建了转录因子SP1结合位点突变型荧光表达载体SP1-mut转染PK15细胞和C2C12细胞后检测荧光素酶活性。
为实现上述目的，本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供了转录因子SP1在调控猪RTL1基因表达中的应用。转录因子SP1可以上调RTL1基因的表达。
本发明的目的之二在于提供了抑制转录因子SP1表达的siRNA，其特征在于，其为以下三条siRNA中的至少一种：
siRNA1，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
siRNA2，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
siRNA3，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述siRNA为siRNA1。
具体地，所述siRNA1、siRNA2、siRNA3序列的3’端均垂悬有dTdT。
本发明的目的之三在于提供了所述的抑制转录因子SP1表达的siRNA在抑制猪RTL1基因表达中的应用。
本发明的目的之四在于提供了转录因子SP1与RTL1基因的结合位点突变型载体，该载体包含如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
本发明的目的之五在于提供了转录因子SP1的超表达载体，所述超表达载体上包含转录因子SP1的CDS区域。
具体地，将SP1的CDS区域连入pcDNA3.1真核表达载体中，构建转录因子超表达载体pc-SP1。
本发明的目的之六在于提供了所述的超表达载体在促进猪RTL1基因表达中的应用。
本发明具有的有益效果是：
1、在研究猪RTL1基因的调控机制上，本发明人发现了转录因子SP1能够与RTL1基因上游的启动子区相互作用从而上调RTL1基因的表达。本发明是首次证实转录因子SP1对RTL1基因转录调控的影响：通过双荧光素酶报告系统找到RTL1基因的核心启动子区，进而利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)验证转录因子SP1与RTL1核心启动子区之间的相互作用、构建SP1超表达载体和合成小干扰RNA(SP1-siRNA)检测SP1对RTL1的影响、以及构建了转录因子SP1结合位点突变型荧光表达载体SP1-mut转染PK15细胞和C2C12细胞后检测荧光素酶活性。为RTL1的表达调控带来了更深层次的认知，运用于家畜肉质性状的改良及肌肉发育分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。
2、本发明技术方案设计周详，结果可靠。为证实转录因子SP1对RTL1基因转录调控作用以及细胞功能上的影响，本发明从多层次、多角度验证，在转录活性、mRNA水平以及蛋白水平验证。
附图说明
图1为实施例1中的pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5、和pGL3-Basic分别转染C2C12细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果；图中：纵坐标Related LuciferaseActivity表示相对荧光素酶活性值，Basic为空白对照；
图2为实施例2中转录因子SP1与RTL1基因核心启动子结合的染色质免疫共沉淀(ChIP)后PCR的电泳图；
图3为实施例3中转录因子SP1结合位点突变型荧光表达载体SP1-mut和pGL3-P2野生型载体、以及pGL3 Basic分别转染PK15细胞和C2C12细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果；图中：纵坐标Related Luciferase Activity表示相对荧光素酶活性值，P2为对照组，**P<0.01；
图4为实施例4中pGL3-P2分别与转录因子SP1的超表达载体pc-SP1和pcDNA3.1空白对照共转染于PK15细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果；图中：纵坐标RelatedLuciferase Activity表示相对荧光素酶活性值，pcDNA3.1为空白对照，**P<0.01；
图5为实施例4中转录因子SP1的超表达载体pc-SP1对RTL1基因表达量的影响；
图6为实施例5中转染SP1-siRNA后，荧光定量PCR检测对SP1基因mRNA水平干扰效果图；
图7为实施例5中转染SP1-siRNA后，荧光定量PCR检测对RTL1基因启动子活性的影响图；
图8为实施例5中转染SP1-siRNA后，western-blot检测对RTL1基因蛋白水平干扰效果图。
具体实施方式
实施例1猪RTL1基因的核心启动子区的确定
1、猪RTL1基因启动子区的生物学信息分析
根据NCBI中猪RTL1基因的序列，设计引物RPF1(如SEQ ID NO:9所示)、RPR1(如SEQID NO:10所示)，克隆获得RTL1基因5’上游序列包括其第一外显子的一部分共1475bp(-1394/+81)的核苷酸序列(如SEQ ID NO:8所示)。
运用在线网站(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测发现-1027bp到-978bp区段可能是基因的核心启动子区。
2、引物设计
为了进一步验证，以上述获得的RTL1基因5’上游序列为模板，利用Primer5软件设计用于扩增获得启动子区5段缺失片段(P1-P5)的5条上游缺失片段引物(P1F-P5F)和1条共用的下游引物PR，每条上游引物的5’端添加Mlu I(A↓CGCGT)酶切位点及保护碱基CG，下游引物的5’端添加Xho I(C↓TCGAG)酶切位点及保护碱基CC(下划线部分表示酶切位点)，其序列如下表1：
表1
Figure GDA0003128588640000051
3、扩增启动子缺失片段和PCR产物回收
利用设计的引物P1F到P5F分别与PR形成引物对，以所述克隆获得的核苷酸序列(如SEQ ID NO:8所示)为模板，采用Touch-down PCR策略扩增进行PCR扩增，获得启动子的5条不同长度的缺失片段，(产物长度分别为1394bp、1046bp、940bp、529bp、205bp)PCR产物采用Omega Bio-tek公司的凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行。
4、构建启动子缺失片段荧光素酶报告载体
对这5条片段进行琼脂糖凝胶回收后与pGL3-Basic载体依次经Mlu I和Xho I双酶切，用T4连接酶将缺失片段连入pGL3-Basic载体，然后进行克隆、提取质粒，测序确定质粒的正确性，命名为P1-P5。使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(Omega E.Z.N.A.TMEndo-Free PlasmidMini KitISpin)对所述的P1-P5重组质粒进行抽提，具体步骤见试剂盒说明书。
5、利用荧光素酶报告载体转染C2C12细胞
将构建好的载体P1-P5依次转入C2C12细胞，以pGL3-Basic为阴性对照，转染24h后测定双荧光素酶活性，确定核心启动子区，具体步骤如下：
(1)在转染前1天，按1×105密度将C2C12细胞接种于24孔板内，继续培养至细胞密度到80％；
(2)将每孔转染的0.8μg质粒加入50μL OPTI-MEM培养基中混匀，取2.0μLLipofectamine 2000和1/20μg pRL-TK加入50μL OPTI-MEM培养基中混匀，室温静置5min；
(3)将(2)中的两份混合液混合均匀，室温静置20min。
(4)期间吸除各孔中原有的细胞培养基，用OPTI-MEM清洗两遍。
(5)将每孔细胞加入(3)中混合液100μL，后用OPTI-MEM补至为500μL。
(6)置于37℃，5％CO2细胞培养箱培养24h后收集细胞，利用1×PLB(Passivelysis buffer)裂解细胞，获得的细胞裂解液于-70℃冰箱中保存、待检测。
6、荧光素酶活性检测
采用Promega公司的
Figure GDA0003128588640000071
Reporter Assay System试剂盒，在功能酶标仪中检测荧光载体的相对荧光活性。在进行双荧光素酶检测前将荧光素酶分析缓冲液Ⅱ(LARⅡ)和Stop&Glo Reagent平衡至室温，吸取10μL细胞裂解液加入酶标板中，先加入50μL的LARⅡ读取样品中荧火虫荧光素酶的活性值A，再加入50μL的Stop&Glo Reagent读取样品中海肾荧光素酶的活性值B。A/B比值即代表该荧光载体的活性，每组设3个重复。
采用SAS8.0软件对所得结果进行单因素方差分析，P<0.05时为差异显著，P<0.01时为差异极显著。5个启动子缺失片段的相对荧光活性检测结果如图1所示。P2(-1084/+81，如SEQ ID NO:17所示)活性最高，说明此区段存在核心启动子区，与网站NNPP预测结果一致。
实施例2转录因子SP1与RTL1基因核心启动子结合的确定
1、生物学信息分析
利用TESS网站(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)和
TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)网站预测启动子区潜在的转录因子结合位点，发现分值较高的转录因子SP1结合位点，位于(-247bp/-239bp)。
2、免疫共沉淀
通过PK15细胞的染色质免疫共沉淀(ChIP)实验检测转录因子SP1与RTL1启动子在体内环境中的结合情况。采用美国Millipore公司的EZ-ChIPTM ChromatinImmunoprecipitation Kit试剂盒，具体操作过程参照试剂盒使用说明。主要步骤为：
(1)培养并收集PK15细胞备用，利用超声波破碎处理PK15细胞基因组，在冰上破碎细胞，使得染色质DNA成为200-1000bp的片段，4℃、12000r/min离心10min，弃掉不溶物；
(2)染色质免疫沉淀：每100ul溶解物中含有1x106个细胞，加入900uL含蛋白酶抑制剂的ChIP稀释缓冲液、60uL蛋白G-琼脂糖，4℃旋转孵育60min，5000r/min离心1min获得琼脂糖颗粒(去除非特异性结合的分子)，将上清转移至新的离心管中，并取出10uL(1％)作为input对照。在剩余上清液中，加入相应的抗体到上清液中，其中，添加IgG抗体组作为阴性对照组，破碎后不加抗体处理的PK15细胞DNA(Input组)作为阳性对照组；添加SP1抗体组作为实验组，4℃旋转孵育过夜，然后加入60uL蛋白G-琼脂糖，4℃旋转孵育60min(以收集抗体/转录因子复合体)，5000r/min，小心移除上清液(内含未结合及非特异性DNA)。最后一次用低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液、LiCL洗涤缓冲液、TE缓冲液洗涤蛋白G/抗体/转录因子/DNA复合物。
(3)解交联及DNA纯化：向复合物中加入200uL洗脱缓冲液，轻弹管壁混匀，室温放置15min，5000r/min离心1min，收集上清液，加入5mol/LNaCl，并于65℃水浴5h，以解交联获得游离DNA，加入RNaseA37℃孵育30min，然后加入0.5mol/L EDTA、1mol/L Tris-HCl(pH6.5)、蛋白酶K于45℃孵育60min；采用试剂盒配合离心柱纯化获得DNA。
(4)PCR鉴定
用于检测SP1结合位点的PCR引物为：
表2
Figure GDA0003128588640000081
Figure GDA0003128588640000091
采用20uL反应体系。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min。扩增产物送去测序。
3、实验结果
分析RTL1基因启动子区序列，选择保守区域且包含预测的SP1转录因子结合位点的序列设计PCR引物，以免疫沉淀的DNA片段为模板，目的片段为163bp。如图2所示，结果表明，实验组和Input对照均有目的扩增条带，而阴性对照组没有检测到目的扩增条带，说明实验结果正确可信。采用SP1抗体免疫沉淀的DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的扩增条带，且对扩增产物测序鉴定序列正确无误，证实PK15细胞中SP1转录因子可与RTL1基因启动子区序列结合。
实验结果证明：在体内环境中，转录因子SP1可以与RTL1启动子发生特异性地结合。说明转录因子SP1参与RTL1基因的表达调控。
实施例3转录因子SP1结合位点突变型荧光素酶报告载体的活性检测
一、突变型载体SP1-mut的构建
以野生型P2载体为模板，运用重组PCR快速基因定点突变法，构建转录因子SP1结合位点突变载体SP1-mut。
1、结合位点突变引物的设计
以野生型P2载体为模板，针对SP1结合位点GGGGCGGGG设计突变引物如下，下划线为突变后的碱基，上下游引物反向互补，且有47bp的序列重叠。上游引物(SP1-mut-F)和下游引物(SP1-mut-R)如下：
表3
Figure GDA0003128588640000101
2、重叠片段的扩增
将引物P2F作为上游引物，SP1-mut-R作为下游引物，扩增出片段F1，将SP1-mut-F作为上游引物，PR作为下游引物，扩增出片段F2，片段F1与F2的重叠部分即为引物SP1-mut-F与SP1-mut-R重叠的部分。野生型P2载体突变后的序列如SEQ ID NO.7所示。
3、结合位点突变载体的构建
将片段F1与F2通过融合PCR进行连接，二者连接为一体，即完成转录因子SP1结合位点突变载体的构建。
二、双荧光素酶活性检测
将野生型载体和突变型载体SP1-mut以瞬时转染的方式分别转染PK15细胞和C2C12细胞，24h后进行双荧光素酶活性检测。
三、结果
结果如图3所示，在两种细胞中，SP1结合位点突变后，启动子活性明显降低(P﹤0.01)，推测SP1对启动子活性有增强作用。
实验例4转录因子SP1超表达载体的构建及对RTL1的调控作用
一、转录因子SP1超表达载体的构建以及对RTL1核心启动子荧光活性的调控作用
根据猪SP1基因(GeneBank登录号：GBZA01000625.1)CDS序列，设计引物：在上下游引物5’端分别加入相应的酶切位点和保护碱基，同时为了保证载体的表达效率，在其翻译起始位点前加入Kozaka序列GCCACC。其中和SP1超表达载体的构建利用的内切酶为HindⅢ和kpnⅠ。以大白猪肌肉组织的cDNA为模板，将SP1的CDS区域连入pcDNA3.1真核表达载体中，构建转录因子SP1的超表达载体pc-SP1。
表4
Figure GDA0003128588640000111
将pc-SP1与核心启动子报告基因载体P2进行共转染，以P2作为对照，转染24h后，用双荧光素酶报告系统检测启动子活性的变化。结果如图4所示，超表达SP1之后，RTL1基因启动子活性显著升高(P﹤0.01)，说明SP1能够提高RTL1基因的启动子活性。
二、转录因子SP1超表达载体对RTL1基因表达量的影响
将上述构建的转录因子超表达载体pc-SP1，通过瞬时转染，转入猪的骨骼肌卫星细胞，以转入空载体pcDNA3.1的细胞作为阴性对照，转染48小时候，收集细胞，提取蛋白，检测RTL1基因的表达量。结果如图5所示，超表达SP1之后，RTL1基因表达量显著升高(P﹤0.01)，说明SP1对RTL1基因的表达有促进作用。
实施例5 SP1-siRNA
1、SP1-siRNA的设计、合成
根据Genbank中转录因子SP1的序列，利用BLOCK-iT RNAi Designer软件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do)，针对转录因子SP1基因不同靶位点设计3条siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)，并设计siRNA阴性对照(NC)，序列由广州锐博生物科技有限公司合成。
表5
Figure GDA0003128588640000121
2、siRNA的转染
分别转染猪PK15细胞，转染试剂为锐博公司的riboFECTTM CP：
(1)转染前一天，将细胞按照1×105个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板中；
(2)用120μl 1×riboFECTTM CP Buffer稀释5μl 20μM siRNA，轻轻混匀；
(3)向上述(2)中加入12μl riboFECTTM CP Reagent，轻轻吹打混匀，室温放置15min；
(4)用PBS将6孔板中的细胞清洗3次，去掉PBS，将(3)的混合液接种至细胞板，再加入完全培养基，补充至每个孔终体积为2ml。
3、荧光定量PCR检测siRNA对SP1 mRNA水平干扰效率
将干扰组(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)与阴性对照组(NC)分别转染PK15细胞，转染24h后收集细胞，Trizo1提取总RNA，TaKaRa Primer Script RT反转录试剂盒进行反转录，采用Bio-Rad公司的SYBR Green荧光染料，Roche公司LightCycler 480荧光定量PCR仪，以β-actin作为内参，进行荧光定量PCR实验，用2-ΔΔCt法计算每个基因的相对mRNA表达量，每组实验做3个平行，每个实验重复三次：反应体系为20μ1；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃，15s循环40次。
结果表明：如图6所示，相比于阴性对照组(NC)siRNA-1～siRNA-3均有一定的干扰效果，其中siRNA-1的干扰效果最好，因此本发明实施例选用siRNA-1进行后续试验。
4、转染siRNA后，荧光定量PCR检测对RTL1基因启动子活性的影响
将siRNA-1和核心启动子报告基因载体P2以瞬时转染的方式共转染PK15细胞，以不转染siRNA-1作为阴性对照，用双荧光素酶报告系统检测启动子活性的变化。24h后进行双荧光素酶活性检测，结果如图7所示，siRNA-1对启动子活性有抑制作用。
5、Western Blot检测siRNA对RTL1蛋白表达的抑制情况
将干扰组(siRNA-1)与阴性对照组(NC)分别转染C2C12细胞，转染48h后收集细胞，采用碧云天生物技术公司的RIPA裂解液(P0013B)提取蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，具体方法参照试剂盒的说明书。将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，再调平上样量用SDS-聚丙稀铣胺凝胶电泳跑胶。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，200mA转膜1小时，之后抗体孵育，一抗孵育3小时，二抗孵育30分钟，显色曝光。
结果如图8所示，表明siRNA-1能够限制抑制RTL1蛋白表达。说明siRNA干扰SP1的表达，而转录因子SP1能够上调RTL1基因的表达，因而SP1被干扰后，RTL1基因的表达会被下调。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 转录因子SP1在调控猪RTL1基因表达中的应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggcaaagu auauggcaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uugccauaua cuuugccgc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacgagcuu cagagacau 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
augucucuga agcucgucc 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccacuccuu cacuuauua 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uaauaaguga aggaguggc 19
<210> 7
<211> 1046
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaagaaca aggggggcag tctgagcaac gcggagcttt taggaggggt ggggaactga 60
tgccaggatc tcctcgacag ctcagagcgg gggagaacgc tgcctggaag cggcccagag 120
aggggaaagg gaaaagtgag caaaaattcc gatgtggaat cgagtcatgt atgcgcatgt 180
ctctggcaca cagtaggtgt ttttatcaag gtttaaaggg gaaaaaaaga aaagccagaa 240
tccagattcc ctacatccac ctgccctcaa tttgaatcca ggagaggaaa caagcgctat 300
ttggggcggc tgacccgacc gacgggcgag cggtcaaagg cccattttct cttcttgccc 360
tgagcctgtc gaagggcagg catccgggct agagattccc acctccgacc agggaggccc 420
ggcctgccag gggtggcttt ggacggcacc gagaggcgac ctctgtgact tgcggctgac 480
cagagaaggg agggcagatt gaccgggcac gtgtgccagg gttgaaacga agccaccagt 540
gcatcctgcc aggtacccgc ctgccctgga gaaggcactg ggcccatcgc gccacagaat 600
ttatgggctg tgaatttctc acagccacac gggaagtagg ctggccagac aggcagaggg 660
taagcccgag tgagccggca ggaaggtcag aggctgacag gttctctctc cccccgggat 720
atcgagagcc ctgagttgga aacgggggca gggggtgggg gggtgctttc ctcagtttct 780
ctctgttctg gtgccttggg catctgattt gtcccagaga ccctgacctc gccagaccct 840
caacggctgc ctttacttat tcccaccccc acccccccag gttctgaccg ctgctgtccc 900
agtcgcagac cggacgcacc gcgaccttac ccgtcttcag agggcactcc tttccatccg 960
acgacatgat agaaccctct gaagactcat ttgagacgat gatggagcgt aagaatccat 1020
catcaaaaca aatggagtcc tccgag 1046
<210> 8
<211> 1475
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 8
agccagtgag gagttttacg catgggattt tttttttttt tttaatagct tggcccagtg 60
gctaaaaaga aaactgagaa ggaacccaaa gggctacatg cgtgcagagc aggatgtgca 120
gagctcagag tggatgagca gaagcagcac gcaaataacc ccaaccaaaa cagctctgtg 180
aatcctaccc acgaacgcca cccatgccaa ggcagtcaga ggtcaccgtc acctcctgcc 240
ctctgcacac cctctccccc tactgaacat cccagctcta cccatgctgg cgggggaatc 300
aaaccagctc cagagaaggg gtgtccacta aagaaccaag agatcgggcc caccttggaa 360
agactgcagg ggcgggtaaa catgcctgca caggcggaac taaggccaaa tgtctcaagt 420
tcctgaaccc ccaagaacaa ggggggcagt ctgagcaacg cggagctttt aggaggggtg 480
gggaactgat gccaggatct cctcgacagc tcagagcggg ggagaacgct gcctggaagc 540
ggcccagaga ggggaaaggg aaaagtgagc aaaaattccg atgtggaatc gagtcatgta 600
tgcgcatgtc tctggcacac agtaggtgtt tttatcaagg tttaaagggg aaaaaaagaa 660
aagccagaat ccagattccc tacatccacc tgccctcaat ttgaatccag gagaggaaac 720
aagcgctatt tggggcggct gacccgaccg acgggcgagc ggtcaaaggc ccattttctc 780
ttcttgccct gagcctgtcg aagggcaggc atccgggcta gagattccca cctccgacca 840
gggaggcccg gcctgccagg ggtggctttg gacggcaccg agaggcgacc tctgtgactt 900
gcggctgacc agagaaggga gggcagattg accgggcacg tgtgccaggg ttgaaacgaa 960
gccaccagtg catcctgcca ggtacccgcc tgccctggag aaggcactgg gcccatcgcg 1020
ccacagaatt tatgggctgt gaatttctca cagccacacg ggaagtaggc tggccagaca 1080
ggcagagggt aagcccgagt gagccggcag gaaggtcaga ggctgacagg ttctctctcc 1140
ccccgggggg gcgggggccc tgagttggaa acgggggcag ggggtggggg ggtgctttcc 1200
tcagtttctc tctgttctgg tgccttgggc atctgatttg tcccagagac cctgacctcg 1260
ccagaccctc aacggctgcc tttacttatt cccaccccca cccccccagg ttctgaccgc 1320
tgctgtccca gtcgcagacc ggacgcaccg cgaccttacc cgtcttcaga gggcactcct 1380
ttccatccga cgacatgata gaaccctctg aagactcatt tgagacgatg atggagcgta 1440
agaatccatc atcaaaacaa atggagtcct ccgag 1475
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agccagtgag gagttttacg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcggaggac tccatttgtt 20
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgacgcgtag ccagtgagga gttttac 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgacgcgtcc caccttggaa agactgc 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgacgcgtgc aacgcggagc ttttagg 27
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgacgcgtct ttggacggca ccgaga 26
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgacgcgtgg gtgctttcct cagtttc 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccctcgaggt cgtcggatgg aaaggag 27
<210> 17
<211> 1046
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 17
cccaagaaca aggggggcag tctgagcaac gcggagcttt taggaggggt ggggaactga 60
tgccaggatc tcctcgacag ctcagagcgg gggagaacgc tgcctggaag cggcccagag 120
aggggaaagg gaaaagtgag caaaaattcc gatgtggaat cgagtcatgt atgcgcatgt 180
ctctggcaca cagtaggtgt ttttatcaag gtttaaaggg gaaaaaaaga aaagccagaa 240
tccagattcc ctacatccac ctgccctcaa tttgaatcca ggagaggaaa caagcgctat 300
ttggggcggc tgacccgacc gacgggcgag cggtcaaagg cccattttct cttcttgccc 360
tgagcctgtc gaagggcagg catccgggct agagattccc acctccgacc agggaggccc 420
ggcctgccag gggtggcttt ggacggcacc gagaggcgac ctctgtgact tgcggctgac 480
cagagaaggg agggcagatt gaccgggcac gtgtgccagg gttgaaacga agccaccagt 540
gcatcctgcc aggtacccgc ctgccctgga gaaggcactg ggcccatcgc gccacagaat 600
ttatgggctg tgaatttctc acagccacac gggaagtagg ctggccagac aggcagaggg 660
taagcccgag tgagccggca ggaaggtcag aggctgacag gttctctctc cccccggggg 720
ggcgggggcc ctgagttgga aacgggggca gggggtgggg gggtgctttc ctcagtttct 780
ctctgttctg gtgccttggg catctgattt gtcccagaga ccctgacctc gccagaccct 840
caacggctgc ctttacttat tcccaccccc acccccccag gttctgaccg ctgctgtccc 900
agtcgcagac cggacgcacc gcgaccttac ccgtcttcag agggcactcc tttccatccg 960
acgacatgat agaaccctct gaagactcat ttgagacgat gatggagcgt aagaatccat 1020
catcaaaaca aatggagtcc tccgag 1046
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acagccacac gggaagta 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gagagaaact gaggaaagca 20
<210> 20
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caggttctct ctccccccgg gatatcgaga gccctgagtt ggaaacggg 49
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgtttccaac tcagggctct cgatatcccg gggggagaga gaacctg 47
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cccaagcttg ccaccatgag cgaccaagat cactcc 36
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggggtacctc agaagccatt gccactgat 29

Claims (10)

1.猪转录因子SP1在调控猪RTL1基因表达中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转录因子SP1对RTL1基因的启动子活性具有增强作用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过抑制所述转录因子SP1的表达，抑制猪RTL1基因的表达。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，通过siRNA抑制转录因子SP1的表达，其中所述siRNA选自以下三条siRNA中的至少一种：
siRNA1，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
siRNA2，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
siRNA3，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述siRNA为siRNA1。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述siRNA1、siRNA2、siRNA3序列的3’端均垂悬有dTdT。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过促进所述转录因子SP1的表达，促进猪RTL1基因的表达。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，通过构建转录因子SP1的超表达载体，促进转录因子SP1的表达。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述超表达载体上包含转录因子SP1的CDS区域。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，将SP1的CDS区域连入pcDNA3.1真核表达载体中，构建转录因子超表达载体pc-SP1，所用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1339498A (zh) * 2000-08-23 2002-03-13 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人转录因子sp1作用蛋白11.99和编码这种多肽的多核苷酸
CN101701217A (zh) * 2009-11-18 2010-05-05 王理伟 一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA及其用途
CN107921111A (zh) * 2015-08-28 2018-04-17 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1339498A (zh) * 2000-08-23 2002-03-13 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人转录因子sp1作用蛋白11.99和编码这种多肽的多核苷酸
CN101701217A (zh) * 2009-11-18 2010-05-05 王理伟 一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA及其用途
CN107921111A (zh) * 2015-08-28 2018-04-17 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sus scrofa Sp1 transcription factor mRNA, partial cds;None;《GenBank Database》;20160726;Accession NO：U57347.3 *
Transcription Factor Sp1 Promotes the Expression of Porcine ROCK1 Gene;Zhang 等;《International Journal of Molecular Sciences》;20160115;第17卷(第112期);第7页4.5 *
Zhang 等.Transcription Factor Sp1 Promotes the Expression of Porcine ROCK1 Gene.《International Journal of Molecular Sciences》.2016,第17卷(第112期), *
上调转录因子Sp1对胃癌细胞MKN-45增殖的影响;周尘飞 等;《中华实验外科杂志》;20120112;第28卷(第11期);第1903-1905页 *
转录因子Sp1调控人NDRG2转录机制研究;曲璇;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20091215(第12（2009）期);E059-21 *

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