CN101701217A - 一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA，所述的siRNA的长度为16～30bp。本发明还公开了含有该siRNA的重组载体，该重组载体通过脂质体转染法转染宿主细胞，即得到Sp1基因沉默的细胞。本发明的siRNA序列能够有效降解转录因子Sp1基因的mRNA，从而特异性抑制Sp1基因的表达。一方面可用于制备与Sp1基因相关疾病的治疗药物，如肿瘤、细胞凋亡相关疾病，另一方面对于研究Sp1蛋白在肝癌中的作用和肝癌的治疗具有重要的意义。

Description

一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA，siRNA的核苷酸序列及含有siRNA的重组载体，以及它们的用途。

背景技术

转录因子Sp1(Specificity protein 1)是一种DNA结合蛋白，是第一种被克隆和纯化的转录因子，属于Sp/Kǘppel样转录因子家族，其主要特征是含有高度保守的DNA结合区。它由3个保守的Cys2His2锌指结构相互特异结合而形成，锌指之间可能参与蛋白之间的相互作用。通常认为Sp1以细胞和启动子的特异性方式调控GC伏击区启动子的基因表达，虽然Sp1自发现以来就被认为是一种基础的转录因子，但越来越多的证据表明它是控制细胞功能的上游基因，受Sp1调节的下游基因众多，它广泛的参与和调节一系列的生物功能，包括细胞生长、分化和肿瘤的发展与演进等。

由于通过抑制上游因子的表达可以抑制下游多种基因的表达。因此，针对上游转录因子的靶向治疗已成为研究的热点。肿瘤分子靶向治疗的特点是高效、特异、安全。但是肿瘤基因靶向治疗面临的最大问题是缺乏肿瘤高特异性的相关基因和无毒、高效的基因治疗载体。

小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)具有严格的序列特异性、高效性和生物遗传性，可以特异、高效地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。自RNAi现象发现后，因其操作简单、特异性高、能迅速而方便地使某个基因失去功能等特点，获得了生物学家的青睐而首先被应用于功能基因组和反向遗传学的研究。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对缺乏转录因子Sp1基因的特异性抑制剂的不足，提供一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA及抑制所用的重组载体和方法，所述的siRNA特异性地在mRNA水平靶向Sp1基因，有效抑制Sp1表达，使肿瘤细胞增殖减慢，瘤体生长受到明显抑制。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA，所述的siRNA对应的靶序列是人转录因子Sp1基因编码区的mRNA，所述的siRNA的长度为16～30bp。所述的siRNA的长度较佳的为18～25bp。更佳的，所述的siRNA是由下述核苷酸序列序列的任意一种或几种：

A：5’-GGTGCAAACCAACAGATTA-3’

3’-CCACGTTTGGTTGTCTAAT-5’

B：5’-CCAACAGATTATCACAAAT-3’

3’-GGTTGTCTAATAGTGTTTA-5’

C：5’-GGAAGTGGAGGCAACATCA-3’

3’-CCTTCACCTCCGTTGTAGT-5’

A由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成，B由SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4组成，C由SEQ ID NO.5由SEQ ID NO.6组成。siRNA的核苷酸序列由正义链和反义链组成，SEQ ID NO.1是正义链，SEQ ID NO.2是反义链，SEQ ID NO.3是正义链，SEQ ID NO.4是反义链，SEQ ID NO.5是正义链，SEQ ID NO.6是反义链。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种重组载体，其含有如上所述的编码抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA。

根据本发明，所述的重组载体所用的载体可以是本领域常规的载体，包括各种质粒，本发明优选pGCsi3.0GFP质粒。将所述siRNA片段连接到载体如pGCsi3.0GFP质粒中，即得本发明的重组载体。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：一种转录因子Sp1基因沉默的细胞，含有如上所述的重组载体。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是：一种如上所述的转录因子Sp1基因沉默的细胞的制备方法，包括将如上所述的的重组载体转化或转染宿主细胞。转化或转染的方法可以是本领域常规的方法，优选脂质体转染法。

本发明中，所述的重组载体含有编码抑制Sp1基因表达的siRNA，转化或转染宿主细胞后，转录出siRNA，降解Sp1的mRNA，使宿主细胞内源的Sp1基因沉默。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之五是：一种如上所述的siRNA的用途，用于制备转录因子Sp1抑制剂，或者用于制备治疗或预防转录因子Sp1相关疾病的药物组合物，如治疗或抑制肿瘤的药物、肝癌靶向药物等。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之六是：一种药物组合物，至少包括一种如上所述的抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA为活性成分和一种药用载体。所述的载体是常规的药用载体，如填充剂、稀释剂和赋形剂等。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明的siRNA序列能够有效降解转录因子Sp1基因的mRNA，从而特异性抑制Sp1基因的表达。一方面，本发明提供的siRNA序列，可用于制备与Sp1基因相关疾病的治疗药物，如肿瘤、细胞凋亡相关疾病。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是测序结果图。

图2是载体构建示意图。

图3是转染后在荧光倒置显微镜下观察的转染率。A，转染24h后；B，转染48h后。

图4是对照组的瞬时转染率。

图5是siRNA 24h组的瞬时转染率。

图6是siRNA 48h组的瞬时转染率。

图7是CCK8法检测细胞增殖率。

图8是各组间Western Blot分析结果。1.Huh-7，2.Huh-7/Neg-siRNA，3.Huh-7/Sp1-siRNA。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。

实施例1  针对转录因子Sp1的siRNA序列的设计

1、寡居核苷酸的设计与合成

根据Gennbank中报道的Sp1核苷酸序列(NM-138473)，针对Sp1基因编码区选取19个核苷酸作为siRNA作用靶点，共选择3条靶序列，各设计1条19nt的随机寡居核苷酸序列。该个siRNA对Sp1基因的作用靶序列见表1。

表1.SiRNA靶序列

	序列	位置
			1	5’-CAGGTGCAAACCAACAGATTATTCAAGACGTAATCTGTTGGTTTGCACCTG-3’	721-739
2	5’-AACCAACAGATTATCACAAATTTCAAGACGATTTGTGATAATCTGTTGGTT-3’	729-747
			3	5’-GAGGAAGTGGAGGCAACATCATTCAAGACGTGATGTTGCCTCCACTTCCTC-3’	751-769

由上海吉凯基因技术公司化学分别合成序列如下3条寡聚核苷酸：

A：5’-GGTGCAAACCAACAGATTA-3’(SEQ ID NO.1)，

3’-CCACGTTTGGTTGTCTAAT-5’(SEQ ID NO.2)，

作用于转录因子Sp1mRNA的第721-739位；

B：5’-CCAACAGATTATCACAAAT-3’(SEQ ID NO.3)，

3’-GGTTGTCTAATAGTGTTTA-5’(SEQ ID NO.4)，

作用于转录因子Sp1mRNA的第729-747位；

C：5’-GGAAGTGGAGGCAACATCA-3’(SEQ ID NO.5)，

3’-CCTTCACCTCCGTTGTAGT-5’(SEQ ID NO.6)，

作用于转录因子Sp1mRNA的第751-769位。

2、寡聚核苷酸的退火

将上述3条寡聚核苷酸分别用无菌双蒸水溶解，溶液浓度为1.5mg/ml。各取1μl相互配对的寡聚核苷酸加入20μl退火缓冲液(10mmol/L Tris，pH7.5，50mmol/L NaCl，1mmol EDTA)。在PCR扩增仪上进行退火，退火程序为：90℃4min→85℃4min→80℃4min→75℃4min→70℃10min→65℃10min→60℃5min，然后缓慢降至室温，-20℃保存。

3、退火后的产物进行核苷酸测序，结果见图1。

实施例2含有针对转录因子Sp1的siRNA的质粒构建

1、实验材料：T4连接酶，pGCsi3.0GFP质粒，大肠杆菌DH10β，含卡那霉素的LB培养液，质粒抽取试剂盒；购自上海吉凯基因技术有限公司。

2、实验方法：将实施例1退火后的寡聚核苷酸与pGCsi3.0GFP质粒酶切片段用T4连接酶连接过夜后，再转入处于感受态的大肠杆菌DH10β，在含有卡那霉素的琼脂糖平板上过夜生长，随机挑取单个菌落，放入含卡那霉素的LB培养液中扩增，并提取质粒，命名为siSp1/pGCsi3.0GFP。制成含荧光蛋白GFP的siSp1/pGCsi3.0GFP。

3、实验结果：载体构建示意图见图2。

实施例3培养阳性克隆的Huh-7/Sp1-siRNA细胞

1、实验材料：Huh-7人肝癌细胞株(上海肿瘤研究所)，标记有绿色荧光蛋白(GFP)的Huh-7人肝癌细胞株，DEDM(高糖)培养液，胰蛋白酶，脂质体转染试剂盒HilyMax，10％胎牛血清；购自日本Dojindo公司。

2、实验方法：

1)细胞培养Huh-7系肝癌细胞系，贴壁生长，接种于无菌培养瓶中，用10％胎牛血清、100μg/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DEDM(高糖)培养液，在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下传代培养，选用活力良好，台盼蓝测定活细胞数＞90％，处于对数生长期的细胞进行实验。

2)转染前一天将处于对数生长期的细胞以100000个/孔(细胞密度为50％)接种于24孔板，在37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养。

3)在2个1.5ml灭菌Eppendorf管中配置对照液，配方如下：DEDM(高糖)培养液30μl，Sp1siRNA空载体质粒(即pGCsi3.0GFP)0.5μg，和HilyMax2μl。

在22个1.5ml灭菌Eppendorf管中配置转染液，配方如下：DEDM(高糖)培养液30μl，Sp1siRNA质粒(即siSp1/pGCsi3.0GFP)0.5μg，和HilyMax2μl。

4)混合上述溶液直至澄清透明，并于室温下静置15min。

5)将前一天所接种的24孔板中的培养液弃掉，每孔加入含10％胎牛血清、无任何抗生素的DEDM(高糖)培养液200μl，轻轻混匀。

6)A1，A4孔加入步骤3)所配置的对照液，其余22孔加入转染液，并轻轻混匀。

7)将24孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养4h后取出。

8)弃去各孔中的培养液，每孔加入含10％胎牛血清，无任何抗生素的DEDM(高糖)培养液200μl，轻轻混匀。

9)将24孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，48h之内在荧光倒置显微镜下观察转染效果。

10)24h后将此24孔板中的A1-A3，B1-B3，C1-C3和D1-D3孔细胞逐孔用胰酶消化，并置于15ml离心管中1000rpm，7min离心，弃去上清液，用PBS液洗涤一次，再次1000rpm，7min离心，PBS液洗涤，取出1ml以备流式检测转染率。

11)48h后将此24孔板中的A4-A6，B4-B6，C4-C6和D4-D6孔细胞逐孔用胰酶消化，并置于15ml离心管中1000rpm，7min离心，弃去上清液，用PBS液洗涤一次，再次1000rpm，7min离心，PBS液洗涤，取出1ml以备流式检测转染率。

3、实验结果

3.1对于Huh-7细胞，24h后转染率见图3A，48h后转染率见图3B。

3.2经过流式细胞仪检测，对照组见图4、表2，siRNA 24h组见图5、表3，siRNA48h组见图6、表4，48h转染效率明显增加。

表2

标记	左	右	事件	概率％	总计％
						Al1(所有)	1	9910	5112	100.00	51.12
M1(标记物)	10	1963	171	3.35	1.71

表3

标记	左	右	事件	概率％	总计％
						Al1(所有)	1	9910	6213	100.00	62.13
M1(标记物)	7	1959	2154	34.67	21.54

表4

标记	左	右	事件	概率％	总计％
						Al1(所有)	1	9910	4869	100.00	48.69
M1(标记物)	19	3652	2096	43.05	20.96

3.3转染了Sp1 siRNA的Huh-7细胞命名为Huh-7/Sp1-siRNA细胞，由上海康城生物工程有限公司筛选，选择阳性细胞克隆继续以上条件培养。

同时设计以下随机序列，作为阴性对照(Neg2siRNA)：

正义链5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，

反义链3’-AAGAGGCTTGCACAGTGCA-5’。

按照实施例1、2、3相同的步骤条件将该对照序列导入Huh-7细胞。转染了对照序列的Huh-7细胞命名为Huh-7/Neg-siRNA细胞。

下面通过效果实施例来进一步说明本发明的有益效果。

效果实施例1针对转录因子Sp1的siRNA对Huh-7肝癌细胞增殖的影响

1、实验材料：Huh-7细胞，Huh-7/Sp1-siRNA细胞，Huh-7/Neg-siRNA细胞，10％胎牛血清，DEDM(高糖)培养液，胰蛋白酶，CCK8细胞增殖试剂盒(购自日本Dojindo公司)。

2、实验方法

2.1将Huh-7细胞，Huh-7/Sp1-siRNA细胞，Huh-7/Neg-siRNA细胞分别接种于无菌培养瓶中，用含10％胎牛血清、100μg/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DEDM(高糖)培养液，在37℃，5％CO₂饱和湿度条件下传代培养，选用活力良好，台盼蓝测定活细胞数＞90％，处于对数生长期的细胞进行实验。

2.2取处于对数生长期的Huh-7细胞，Huh-7/Sp1-siRNA细胞和Huh-7/Neg-siRNA细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，以每孔约10⁴个细胞接种于96孔板，分为12h、24h、36h、48h、72h共5组，每组设6个复孔，到时间点后每孔加入10μl CCK8试剂，置于37℃培养箱中培养4h后选择450nm波长，酶标仪测定各孔的吸收度值(A)，各测定3次，取平均值。计算细胞增殖率，并制作增殖曲线。

3、实验结果

在细胞培养开始后，Huh-7/Sp1-siRNA细胞增殖较为缓慢，在24h以前，Huh-7/Neg-siRNA细胞及Huh-7/Sp1-siRNA细胞的增殖无显著性差异(P＞0.05)，而24h之后，两者的差异才有统计学意义(P＜0.05＝，具体见表5，图7。

表5.CCK8法检测细胞增殖率

4、结论：通过siRNA抑制Sp1表达，可见肿瘤细胞生长受到抑制，Sp1在细胞生长中起重要作用，siRNA有抑制肿瘤细胞增殖的作用。

效果实施例2  针对转录因子Sp1的siRNA对瘤组织转录因子Sp1表达的影响

1、实验材料：3只4-6周龄，体重20-25g，雌雄不限的BALB/C SPF级裸鼠，Huh-7细胞，Huh-7/Sp1-siRNA细胞，Huh-7/Neg-siRNA细胞。

2、实验方法：

2.1肝癌实体瘤裸鼠荷瘤模型的建立

随机选取3只4-6周龄，体重20-25g，雌雄不限的BALB/C SPF级裸鼠。

将Huh-7细胞，Huh-7/Sp1-siRNA细胞，Huh-7/Neg-siRNA细胞三种细胞培养24h，经台盼蓝染色和细胞计数，制备成活细胞比率大于90＞％，细胞浓度约为1.5×10⁶/ml的单细胞悬液。于每只裸鼠右前肢略上部位分别皮下接种Huh-7、Huh-7/Sp1-siRNA、Huh-7/Neg-siRNA细胞悬液各0.2ml，并于腹部作不同染色以标记。以皮下结节直径超过0.5cm为瘤标准，SPF级标准饲养。4周后颈椎脱臼法处死所有动物，75％酒精消毒，剥取肿瘤，选取外围生长良好、无变性坏死、半透明鱼肉状的瘤组织，于生理盐水中切成1.5-2mm²大小的瘤块。

2.2瘤组织的种植与获取

随机选取BALB/C SPF级裸鼠24只，4-6周龄，体重20-25g，雌雄不限。

随机分为3组，分别为Huh-7组、Sp1-siRNA组、Neg-siRNA组(每组8只)。用20号套管针吸取2.1步骤中的瘤块一块，接种于每只裸鼠的右前肢略上部的皮下。以动物接种瘤块为实验起点，接种后每天观察接种部位有无破溃红肿出血，每3天用游标卡尺测肿瘤长(L)宽径(W)，观察肿瘤体积变化，按V(mm³)＝L×W²/2换算出肿瘤的近似体积。4周后颈椎脱臼法处死所有动物，置入动物体内生物发光成像系统中观察肿瘤生长情况，然后75％酒精消毒，剥取肿瘤，并测量体积，均选取外围生长良好、无变性坏死、半透明鱼肉状的瘤组织，于生理盐水中切成1.5-2mm²大小的瘤块。

2.3瘤组织转录因子Sp1表达的测定

随机选取2.2步骤各组织中的瘤块4块，送至上海康城生物工程有限公司对瘤组织中的转录因子Sp1进行Western Blot分析。

3结果

3.1瘤组织转录因子Sp1表达的测定

将动物模型中瘤体分别提取细胞总蛋白，Western blot检测Sp1蛋白的表达变化。检测结果表明，与空白组及阴性对照组相比，Huh-7/Sp1-siRNA的Sp1蛋白变化已被显著抑制。见图8。各细胞株中作为蛋白上样量标定的β-actin蛋白无明显变化。

3.2裸鼠皮下瘤生长情况，见表6。

表6.三组裸鼠皮下瘤生长情况

组别	7天	14天	21天	28天
					1	132.40±15.32	179.63±19.74	204.35±5.68	252.70±17.68
2	128.54±13.61	167.70±10.83	202.10±7.37	262.38±16.27
					3	110.75±11.64	143.92±9.30	187.53±11.58	248.77±20.37

注：1，Huh-7组；2，Huh-7/Neg-siRNA组；3，Huh-7/Sp1-siRNA组。

4结论：siRNA通过抑制瘤组织Sp1的表达，从而抑制胰腺癌、肠癌、胃癌、肝癌等肿瘤组织的生长。

序列表

<110>王理伟

<120>一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA及其用途

<130>P4-091596C

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>siRNA正义链

<400>1

ggtgcaaacc aacagatta    19

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>siRNA反义链

<400>2

taatctgttg gtttgcacc    19

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>siRNA正义链

<400>3

ccaacagatt atcacaaat    19

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>siRNA反义链

<400>4

atttgtgata atctgttgg    19

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>siRNA正义链

<400>5

ggaagtggag gcaacatca    19

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>siRNA反义链

<400>6

tgatgttgcc tccacttcc    19

Claims (10)

1.一种抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA对应的靶序列是人转录因子Sp1基因编码区的mRNA，所述的siRNA的长度为16～30bp。

2.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA是由下述核苷酸序列序列的任意一种或几种：

A：5’-GGTGCAAACCAACAGATTA-3’

3’-CCACGTTTGGTTGTCTAAT-5’

B：5’-CCAACAGATTATCACAAAT-3’

3’-GGTTGTCTAATAGTGTTTA-5’

C：5’-GGAAGTGGAGGCAACATCA-3’

3’-CCTTCACCTCCGTTGTAGT-5’。

3.如权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA的核苷酸序列由正义链和反义链组成，SEQ ID NO.1是正义链，SEQ ID NO.2是反义链，SEQ ID NO.3是正义链，SEQ ID NO.4是反义链，SEQ ID NO.5是正义链，SEQ ID NO.6是反义链。

4.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求1～3任一项所述的抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体所用的载体是pGCsi3.0GFP质粒。

6.一种转录因子Sp1基因沉默的细胞，其特征在于，含有如权利要求4或5所述的重组载体。

7.一种如权利要求6所述的转录因子Sp1基因沉默的细胞的制备方法，其特征在于，包括将权利要求4或5所述的的重组载体转化或转染宿主细胞。

8.一种如权利要求1所述的siRNA的用途，其特征在于，用于制备转录因子Sp1抑制剂，或者用于制备治疗或预防转录因子Sp1相关疾病的药物组合物。

9.一种如权利要求1所述的siRNA的用途，其特征在于，用于制备胰腺癌、肠癌、胃癌、肝癌等肿瘤抑制剂中的应用。

10.一种药物组合物，其特征在于，至少包括一种如权利要求1所述的抑制转录因子Sp1基因表达的siRNA为活性成分和一种药用载体。

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