CN109963598A - 用于治疗癌症的基于crispr/cas9的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述用于预防、抑制或治疗受试者中的癌症的方法。本文还提供改变细胞，例如癌细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法。这种方法可以包括利用修饰的核酸酶系统，例如成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)9(CRISPR‑Cas9)，其包含双向H1启动子和针对包装在致密的腺相关病毒(AAV)颗粒中的癌基因(rAAV‑Onco‑CRISPR)或肿瘤抑制基因(rAAV‑TSG)的gRNA。这种方法可以包括与核酸酶系统共同施用或同时提供重组腺相关病毒包装腺病毒(Ad‑rAAVpack)。

Description

用于治疗癌症的基于CRISPR/CAS9的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2016年7月5日提交的美国临时申请号62/358,339的权益，其全部内容通过引用并入本文。
政府支持声明
本发明是在国家癌症研究所授予的R01CA157535的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景
成功和有效靶向癌症相关或癌症特异性分子(例如基因，蛋白质，酶)的主要挑战之一是缺乏特异性。目前在临床前验证中的化学疗法和试剂在抑制所选分子方面是有效的，但对靶标不是特异性的。事实上，这通常是化学疗法所经历的不希望的和不合乎需要的毒性的主要原因。虽然基因治疗策略例如shRNA或siRNA对分子靶标非常特异，但它们向肿瘤的选择性递送是一项重大挑战。
此外，siRNA具有以1:1的比率失活或中和靶标的限制，这将需要恒定和高水平的特异性RNA递送至肿瘤。另一方面，shRNA一旦被引入肿瘤中，就可以整合到宿主基因组中并产生可以干扰特定靶标的连续反义寡聚物。
临床前报告表明癌症的分子靶向显著改进治疗效果(Gharwan, H. & Groninger,H. Nat. Rev. Clin. Oncol.(2015))。然而，大多数抗癌剂的成功临床转化仍然是一个挑战(Rothenberg, ML等人. Nat. Rev. Cancer. 3, 303-309(2003)；Le Tourneau, C等人.Target Oncol. 5, 65-72(2010))。尽管基于核酸的反义治疗方法(例如siRNA，shRNA)在分子特异性和有效抑制方面具有优势，但某些固有的局限性妨碍它们在临床应用中的成功(Ganapathy-Kanniappan S等人. Mol Cancer. 2013；12: 152,4598-12-152., Pecot, CV等人. Nat. Rev. Cancer. 11, 59-67(2011))。
因此，强烈需要开发在癌症治疗中具有增强的靶特异性的创新治疗策略和组合物。
简述
除非另有说明，本发明的实践通常将采用在本领域的技术内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如DNA)技术、免疫学和RNA干扰(RNAi)的常规技术。这些技术中的某些的非限制性描述可在以下出版物中找到：Ausubel, F.,等人,(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science, 和Current Protocols in Cell Biology, 都是John Wiley & Sons, N.Y., 2008年12月的版本；Sambrook, Russell, 和Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001；Harlow, E.和Lane, D., Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,1988；Freshney, R. I., “Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique”,第5版, John Wiley & Sons, Hoboken, N.J., 2005。关于治疗剂和人类疾病的非限制性信息可在Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第11版,McGraw Hill, 2005, Katzung, B.(ed.) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill/Appleton & Lange第10版(2006)或第11版(2009年7月)中找到。关于基因和遗传障碍的非限制性信息可在以下中找到：McKusick, V. A.：Mendelian Inheritance in Man. ACatalog of Human Genes and Genetic Disorders. Baltimore：Johns HopkinsUniversity Press, 1998(第12版)或更新近的在线数据库：Online MendelianInheritance in Man, OMIM™. McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University(Baltimore, Md.) and National Center forBiotechnology Information, National Library of Medicine(Bethesda, Md.), 2010年5月1日(可在World Wide Web：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/上得到)，和OnlineMendelian Inheritance in Animals(OMIA) (一个动物物种(人和小鼠除外)的基因、遗传障碍和特征的数据库，可在World Wide Web：http://omia.angis.org.au/contact.shtml上得到)。本文提及的所有专利、专利申请和其它出版物(例如，科学文章，书籍，网站和数据库)通过引用整体并入。如果说明书和任何并入的参考文献之间存在冲突，则应以说明书(包括其任何修改，可以基于并入的参考文献)为准。除非另有说明，否则本文使用标准的本领域接受的术语含义。本文使用各种术语的标准缩写。
本文描述用于治疗癌症的方法。该方法使用修饰的核酸酶系统，例如成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)9(CRISPR-Cas9)，用于在治疗上靶向癌基因突变或修复缺陷型肿瘤抑制基因。基于CRISPR-Cas9的基因编辑可用于失活或校正导致癌症的癌基因突变，从而提供用于治疗癌症潜在原因的基因治疗方法。
因此，本发明的一个方面涉及预防，抑制或治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的核酸酶系统(例如，CRISPR-Cas9)，其包含基因组靶向核酸酶(例如，Cas9蛋白)和包含至少一种靶向基因组序列，例如致癌突变(例如rAAV-Onco-CRISPR)或肿瘤抑制基因(例如rAAV-TSG)的指导RNA。该方法可以进一步包括将具有在体内包装重组腺相关病毒的能力的腺病毒(例如，腺相关病毒包装腺病毒；“Ad-rAAVpack”)与rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG结合或同时共同施用，如本文所述。
本发明的另一方面提供预防，抑制或治疗癌症的方法，其利用包含先前在WO2015/195621 (通过引用整体并入本文)中描述的非天然存在的CRISPR-Cas系统的修饰的组合物。这种修饰使用靶向癌症致癌突变的某些gRNA，例如但不限于KRAS，PIK3CA或IDH1，或肿瘤抑制基因中的突变。在一些实施方案中，组合物包含(a)包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统(例如，CRISPR-Cas9)，所述载体包含：i)可操作地连接到至少一种编码核酸酶系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的启动子(例如，双向H1启动子)，其中gRNA与受试者的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中DNA分子编码在细胞中表达的一种或多种基因产物；ii)可操作地连接到编码基因组靶向核酸酶(例如Cas9蛋白)的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，其中组分(i)和(ii)位于系统的相同或不同载体上，其中gRNA靶向并与靶序列杂交，且核酸酶切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒(例如，Ad-rAAVpack)与含有核酸酶系统的腺相关病毒同时或共同施用。Ad-rAAVpack也可以与不编码核酸酶-gRNA系统，而是编码可以促进肿瘤的破坏或增加免疫系统对肿瘤的识别的基因的rAAV一起采用。例如，Ad-rAAVpack可以指导编码转基因例如干扰素-α或野生型p53的伴侣rAAV的包装。例如，AAV-onco-CRISPR或AAV-TSG可单独或与Ad-rAAVpack串联递送。相比之下，Ad-rAAVpack可以与任何rAAV一起使用，无论它是否被工程化以递送核酸酶-gRNA。在一些实施方案中，将核酸酶系统包装到单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。在一些实施方案中，启动子包含：a)在至少一种编码gRNA的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件；和b)在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件。
本发明的另一方面提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括向所述细胞中引入先前在WO2015/195621 (通过引用整体并入本文)中描述的修饰的非天然存在的CRISPR-Cas系统。这种修饰使用靶向致癌突变，例如但不限于KRAS、PIK3CA或IDH1，或肿瘤抑制基因的某些gRNA。在一些实施方案中，所述方法包括向细胞中引入组合物，所述组合物包含(a)包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统(例如，CRISPR-Cas9)，所述载体包含：i)可操作地连接到至少一种编码核酸酶系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的启动子(例如，双向H1启动子)，其中gRNA与受试者的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中DNA分子编码一种或多种在细胞中表达的基因产物；和ii)可操作地连接到编码基因组靶向核酸酶(例如，Cas9蛋白)的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，其中组分(i)和(ii)位于系统的相同或不同载体上，其中gRNA靶向并与靶序列杂交，且核酸酶切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒(例如，Ad-rAAVpack)与含有核酸酶系统的腺相关病毒同时或共同施用。在一些实施方案中，将核酸酶系统包装到单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。在一些实施方案中，启动子包含：a)在至少一种编码gRNA的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件；和b)在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件。
本发明的一个方面涉及预防，抑制或治疗有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括：
(a)提供包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统，所述载体包含：i)可操作地连接到至少一种编码核酸酶系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的启动子，其中所述gRNA与受试者的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中DNA分子编码细胞中表达的一种或多种癌基因产物；和ii)可操作地连接到编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，其中组分(i)和(ii)位于系统的相同或不同载体上，其中gRNA靶向并与靶序列杂交且核酸酶切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达；和(b)向受试者施用治疗有效量的系统。
在一些实施方案中，该方法还包括提供重组腺相关病毒包装腺病毒(Ad-rAAVpack)的步骤。
在一些实施方案中，Ad-rAAVpack与核酸酶系统同时提供或共同施用。
在一些实施方案中，该系统是CRISPR-Cas9。
在一些实施方案中，将系统包装到单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒包含腺病毒基因中的至少一个缺失。
在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒选自腺病毒血清型2，腺病毒血清型5或腺病毒血清型35。
在一些实施方案中，包装病毒是腺病毒血清型5。
在一些实施方案中，腺病毒基因选自E1A，E1B，E2A，E2B，E3，E4，L1，L2，L3，L4或L5。
在一些实施方案中，腺病毒基因是E3。
在一些实施方案中，该系统使一种或多种基因产物失活。
在一些实施方案中，核酸酶系统切除至少一个基因突变。
在一些实施方案中，启动子是H1启动子。
在一些实施方案中，H1启动子是双向的。H1启动子是pol II和pol III启动子二者。
在一些实施方案中，H1启动子包含：a)在至少一种编码gRNA的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件；和b)在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件。
在一些实施方案中，基因组靶向的核酸酶是Cas9蛋白。
在一些实施方案中，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。
在一些实施方案中，启动子可操作地连接到至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或十个gRNA。
在一些实施方案中，靶序列是癌基因或肿瘤抑制基因。
在一些实施方案中，靶序列是包含至少一个突变的癌基因。
在一些实施方案中，靶序列是选自Her2，PIK3CA，KRAS，HRAS，IDH1，NRAS，EGFR，MDM2，TGF-β，RhoC，AKT，c-myc，β-连环蛋白，PDGF，C-MET，PI3K-110α，CDK4，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，雌激素受体基因，孕酮受体基因，ErbB1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物1)，ErbB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)，PLK3，KIRREL，ErbB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)，TGFα，ras-GAP，Shc，Nck，Src，Yes，Fyn，Wnt，Bcl2，PyV MT抗原和SV40 T抗原的癌基因。
在一些实施方案中，靶序列是选自KRAS，PIK3CA或IDH1的癌基因。
在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是KRAS。
在一些实施方案中，KRAS包含选自G13D，G12C或G12D的突变。
在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：11-14，或其组合。
在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是PIK3CA。
在一些实施方案中，PIK3CA包含选自E345K，D549N或H1047R的突变。
在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：15-18，或其组合。
在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是IDH1。
在一些实施方案中，IDH1包含R132H突变。
在一些实施方案中，gRNA序列选自SEQ ID NO：1-10所示的核苷酸序列，或其组合。
在一些实施方案中，核酸酶系统通过全身施用来给予。
在一些实施方案中，全身施用选自口服，静脉内，皮内，腹膜内，皮下和肌肉内施用。
在一些实施方案中，核酸酶系统肿瘤内或肿瘤周围施用。
在一些实施方案中，所述受试者用至少一种另外的抗癌剂治疗。
在一些实施方案中，抗癌剂选自紫杉醇，顺铂，托泊替康，吉西他滨，博来霉素，依托泊苷，卡铂，多西他赛，多柔比星，托泊替康，环磷酰胺，曲贝替定，奥拉帕尼，他莫昔芬，来曲唑和贝伐单抗。
在一些实施方案中，所述受试者用至少一种另外的抗癌疗法治疗。
在一些实施方案中，抗癌疗法是辐射疗法，化学疗法或手术。
在一些实施方案中，癌症是实体瘤。
在一些实施方案中，癌症选自脑癌，胃肠癌，口腔癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌，肝癌，咽喉癌，胃癌和肾癌。
在一些实施方案中，癌症是脑癌。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。
在一些实施方案中，哺乳动物是人。
在一些实施方案中，受试者中的细胞增殖被抑制或减少。
在一些实施方案中，受试者中的恶性肿瘤被抑制或减少。
在一些实施方案中，受试者中肿瘤坏死增强或增加。
本发明的另一方面涉及改变细胞中一种或多种基因产物表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括向细胞中引入：(i)包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统，所述载体包含：a)可操作地连接到至少一种编码核酸酶系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的启动子，其中gRNA与DNA分子的靶序列杂交；和
b)可操作地连接到编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，
其中组分(a)和(b)位于系统的相同或不同载体上，其中gRNA靶向并与靶序列杂交，且核酸酶切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。
在一些实施方案中，该方法还包括提供重组腺相关病毒包装腺病毒(Ad-rAAVpack)。
在一些实施方案中，Ad-rAAVpack与核酸酶系统同时提供或共同施用。
在一些实施方案中，该系统是CRISPR-Cas9。
在一些实施方案中，将系统包装到单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
在一些实施方案中，包装病毒包含腺病毒基因中的至少一个缺失。
在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒选自腺病毒血清型2，腺病毒血清型5或腺病毒血清型35。
在一些实施方案中，腺病毒包装病毒是腺病毒血清型5。
在一些实施方案中，腺病毒基因选自E1A，E1B，E2A，E2B，E3，E4，L1，L2，L3，L4或L5。
在一些实施方案中，腺病毒基因是E3。
在一些实施方案中，该系统使一种或多种基因产物失活。
在一些实施方案中，核酸酶系统切除至少一个基因突变。
在一些实施方案中，启动子是H1启动子。
在一些实施方案中，H1启动子是双向的。
在一些实施方案中，H1启动子包含：a)在至少一种编码gRNA的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件；和b)在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件。
在一些实施方案中，基因组靶向的核酸酶是Cas9蛋白。
在一些实施方案中，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。
在一些实施方案中，启动子可操作地连接到至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或十个gRNA。
在一些实施方案中，靶序列是癌基因或肿瘤抑制基因。
在一些实施方案中，靶序列是选自EP300，FBXW7，GATA1，GATA2，NOTCH1，NOTCH2，EXT1，EXT2，PTCH1，SMO，SPOP，SUFU，APC，AXIN1，CDH1，CTNNB1，EP300，FAM123B，GNAS，HNF1A，NF2，PRKAR1A，RNF43，SOX9，ARID1A，ARID1B，ARID2，ASXL1，ATRX，CREBBP，DNMT1，DNMT3A，EP300，EZH2，H3F3A，HIST1H3B，IDH1，IDH2，KDM5C，KDM6A，MEN1，MLL2，MLL3，NCOA3，NCOR1，PAX5，PBRM1，SETD2，SETBP1，SKP2，SMARCA4，SMARCB1，SPOP，TET2，WT1，AR，BCOR，CREBBP，DAXX，DICER1，GATA3，IKZF1，KLF4，LMO1，PHOX2B，PHF6，PRDM1，RUNX1，SBDS，SF3B1，SRSF2，U2AF1，ABL1，BCL2，CARD11，CASP8，CCND1，CDC73，CDK4，CDKN2A，CDKN2C，CYLD，DAXX，FUBP1，MDM2，MDM4，MED12，MYC，MYCL1，MYCN，MYD88，NFE2L2，NPM1，PPM1D，PPP2R1A，RB1，TNFAIP3，TRAF7，TP53，ALK，B2M，BRAF，CBL，CEBPA，CSF1R，CIC，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，HRAS，KIT，KRAS，MAP2K1，MAP3K1，MET，NRAS，NF1，PDGFRA，PTPN11，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，VHL，AKT1，ALK，B2M，CBL，CEBPA，CSF1R，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLCN，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，GPC3，KIT，MET，NKX21，PRKAR1A，PIK3CA，PIK3R1，PDGFRA，PTEN，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，STK11，TSC1，TSC2，TSHR，VHL，WAS，CRLF2，FGFR2，FGFR3，FLT3，JAK1,JAK2，JAK3,KIT，MPL，SOCS1，VHL，B2M，CEBPA，ERK1，GNA11，GNAQ，MAP2K4，MAP3K1，NKX21，TNFAIP3，TSHR，WAS，ACVR1B，BMPR1A，FOXL2，GATA1，GATA2，GNAS，EP300，MED12，SMAD2，SMAD4，ATM，BAP1，BLM，BRCA1，BRCA2，BRIP1，BUB1B，CHEK2，ERCC2，ERCC3，ERCC4，ERCC5，FANCA，FANCC，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCG，MLH1，MSH2，MSH6，MUTYH，NBS1，PALB2，PMS1，PMS2，RECQL4，STAG2，TP53，WRN，XPA和XPC的癌症驱动基因。
在一些实施方案中，靶序列是选自Her2，PIK3CA，KRAS，HRAS，IDH1，NRAS，EGFR，MDM2，TGF-β，RhoC，AKT，c-myc，β-连环蛋白，PDGF，C-MET，PI3K-110α，CDK4，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，雌激素受体基因，孕酮受体基因，ErbB1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物1)，ErbB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)，PLK3，KIRREL，ErbB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)，TGFα，ras-GAP，Shc，Nck，Src，Yes，Fyn，Wnt，Bcl2，PyV MT抗原和SV40 T抗原的癌基因。
在一些实施方案中，靶序列是选自KRAS，PIK3CA或IDH1的癌基因。
在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是KRAS。
在一些实施方案中，KRAS包含选自G13D，G12C或G12D的突变。
在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：11-14，或其组合。
在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是PIK3CA。
在一些实施方案中，PIK3CA包含选自E345K，D549N或H1047R的突变。
在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：15-18，或其组合。
在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是IDH1。
在一些实施方案中，IDH1包含R132H突变。
在一些实施方案中，gRNA序列选自SEQ ID NO：1-10所示的核苷酸序列，或其组合。
在一些实施方案中，一种或多种基因产物的表达被降低。
在一些实施方案中，细胞是真核或非真核细胞。
在一些实施方案中，真核细胞是哺乳动物或人细胞。
在一些实施方案中，真核细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，细胞中的细胞增殖被抑制或减少。
在一些实施方案中，细胞中的细胞凋亡被增强或增加。
当前公开的主题的某些方面已经在上文中陈述，其全部或部分地由当前公开的主题解决，当结合如最佳在下文描述的所附实施例和附图进行描述时，其它方面将变得明显。
附图简述
已经一般性地描述当前公开的主题，现在将参考附图，附图不一定按比例绘制，且其中：
图1显示Ad和AAV之间的关系。野生型AAV只能在Ad感染的细胞中增殖。野生型AAV的致密的单链DNA基因组含有侧翼是反向末端重复(ITR)的两个基因(右)。AAV复制所需的其余遗传元件由Ad反式提供。野生型Ad引起自限性裂解性感染，而修饰的病毒经常用作转基因递送的载体。
图2显示双病毒基因递送系统。除了AAV复制所需的其它反式因子外，重组病毒Ad-rAAVpack还表达AAV rep和cap。因此，Ad-rAAVpack促进共感染的rAAV的体内复制。这些伴侣rAAV可以配备有CRISPR-Cas9元件或转基因，如肿瘤抑制因子。这种两病毒系统可用于在体内增殖任何类型的rAAV。
图3显示溶癌疗法的双重病毒方法。Ad-rAAVpack与伴侣rAAV一起应用于肿瘤，该rAAV被编程以靶向肿瘤特异性驱动突变。rAAV将对不含突变的肿瘤没有影响。由于通过E1B突变施加的宿主范围限制，Ad-rAAVpack将选择性地在肿瘤细胞中增殖。已显示E1B中的几个突变赋予该宿主范围限制。在一些实施方案中，使用称为sub19的四氨基酸突变(Chahal等人.( 2013) 87:4432-44。用Ad-rAAVpack生产性感染的细胞将裂解，将新复制的Ad-rAAVpack和rAAV引入局部环境。由于驱动基因的丧失，仅用rAAV感染的细胞将被生长抑制。这些细胞可以增加肿瘤的免疫原性。
图4包含三个图，A，B和C，显示RNA指导的核酸酶用于KRAS的致癌失活的用途。
图5包含两个图，A和B，显示RNA指导的核酸酶用于PIK3CA的致癌失活的用途。
详述
现在将参考附图在下文中更全面地描述当前公开的主题，附图中详述当前公开的主题的一些但非全部实施方案。相同的数字始终指代相同的要素。当前公开的主题可以以许多不同的形式体现且不应该被解释为限于这里阐述的实施方案；相反，提供这些实施方案使得本公开将满足适用的法律要求。实际上，当前公开的主题所属领域的技术人员将会想到本文阐述的当前公开的主题的许多修改和其它实施方案，其具有前述描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应当理解，当前公开的主题不限于所公开的特定实施方案，且修改和其它实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。
基因组编辑技术，如锌指核酸酶(ZFN)(Porteus和Baltimore(2003) Science300: 763；Miller等人(2007) Nat. Biotechnol. 25:778-785；Sander等人(2011) Nature Methods 8:67-69；Wood等人(2011) Science 333:307)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)(Wood等人(2011) Science 333:307；Boch等人(2009) Science 326:1509-1512；Moscou和Bogdanove(2009) Science 326:1501；Christian等人(2010) Genetics 186:757-761；Miller等人(2011) Nat. Biotechnol. 29:143-148；Zhang等人(2011) Nat. Biotechnol. 29:149-153；Reyon等人(2012) Nat. Biotechnol. 30:460-465)已经赋予产生靶向基因组修饰的能力并提供精确校正疾病突变的潜力。虽然有效，这些技术受到实际限制的阻碍，因为ZFN和TALEN对都需要针对给定的DNA靶位点合成大而独特的识别蛋白。最近几个小组报告了通过使用工程化II型CRISPR/Cas9系统进行高效基因组编辑，该系统克服了这些关键限制(Cong等人(2013) Science 339:819-823；Jinek等人(2013) eLife 2:e00471；Mali等人(2013) Science 339:823-826；Cho等人(2013) Nat. Biotechnol. 31:230-232；Hwang等人(2013) Nat. Biotechnol. 31:227-229)。与相对耗时且难以制备的ZFN和TALEN不同，依赖于与合成指导RNA(gRNA)偶联的Cas9蛋白的核酸酶活性的CRISPR构建体合成简单且快速且可以多路复用。然而，尽管它们的合成相对容易，CRISPR具有与其可靶向基因组空间的获得相关的技术限制，这是Cas9本身的性质和其gRNA的合成的函数。
被CRISPR系统切割需要将gRNA与20个核苷酸DNA序列和必需的原型间隔区相邻基序(PAM)进行互补碱基配对，PAM是在靶位点的3'处发现的短核苷酸基序(Jinek等人(2012)Science 337：816-821)。理论上，人们可以使用CRISPR技术靶向基因组中的任何独特的N20-PAM序列。PAM序列的DNA结合特异性(取决于所用特定Cas9的起源种类而变化)提供一个约束。目前，限制性最小且最常用的Cas9蛋白来自化脓性链球菌，其识别序列NGG，且因此，可以靶向基因组中任何独特的21-核苷酸序列，然后是两个鸟苷核苷酸(N20NGG)。由蛋白质组分强加的可用靶向空间的扩展限于发现和使用具有改变的PAM要求的新型Cas9蛋白(Cong等人(2013) Science 339: 819-823；Hou等人(2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,110(39):15644-9)，或等待经由诱变或定向进化产生新型Cas9变体。CRISPR系统的第二个技术限制源于在5’鸟苷核苷酸处起始的gRNA表达。III型RNA聚合酶III启动子种类的使用特别适合于gRNA表达，因为这些短的非编码转录物具有明确的末端，且转录的所有必需元件，排除1+核苷酸，包含在上游启动子区域。然而，由于常用的U6启动子需要鸟苷核苷酸来启动转录，使用U6启动子进一步限制GN19NGG的基因组靶向位点(Mali等人(2013) Science339:823-826；Ding等人(2013) Cell Stem Cell 12:393-394)。替代方法，如通过T7，T3或SP6启动子的体外转录，也需要启动一种或多种鸟苷核苷酸(Adhya等人(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:147-151；Melton等人(1984) Nucleic Acids Res. 12:7035-7056；Pleiss等人(1998) RNA 4:1313-1317)。
当前公开的主题涉及CRISPR/Cas9系统的修饰以靶向致癌突变或肿瘤抑制基因，其使用H1启动子来表达指导RNA(gRNA或sgRNA)(WO2015/19561，通过引用整体并入本文)。这种修饰的CRISPR/Cas9系统与重组腺相关包装病毒的组合可以精确地靶向癌症中的致癌突变，或促进缺陷肿瘤抑制基因的修复，具有更高的功效、安全性和精度。此外，该修饰提供紧密CRISPR/Cas9系统，其允许相对于现有的CRISPR、TALEN或锌指技术更高分辨率的癌基因靶向。
因此，本发明的一个方面涉及具有复制能力的腺病毒(Ad)，其含有伴侣重组腺相关病毒(rAAV)的复制和包装所需的所有反式元件。该双病毒系统允许两种病毒串联复制，且从而促进rAAV在体内施用位点的局部增殖。在一些实施方案中，该系统包含Ad E1B基因中的突变，用于对癌细胞的部分限制，且因此将促进配备有驱动基因特异性CRISPR或设计用于阻止癌细胞增殖的其它遗传元件的rAAV的肿瘤特异性增殖。
尚未报告任何用途的双Ad-AAV系统的应用。该系统的新颖之处在于可以使均匀非复制的治疗性rAAV具有复制能力。
本发明的另一方面涉及可以靶向功能突变获得的组合物，其已知有助于许多类型癌症的生长。在常见癌症中发现的许多致癌突变在性质上是复发性的，即，在给定类型的癌症中高比例地发生完全相同的突变。目前靶向复发性癌基因突变的努力通常采用小分子抑制剂或策略来实现DNA损伤的合成致死性。例如，最普遍的癌基因KRAS尚未成功靶向，且仍然是“不可药用的”。这种组合物包含gRNA，其指导几个最常见突变位点的有效的核酸酶(即，Cas9)介导切割。值得注意的是，包含gRNA的这些组合物对突变等位基因具有高度特异性，且将因此对具有野生型等位基因的细胞几乎没有影响。
I.使用H1启动子表达CRISPR指导RNA
A.组合物
在一些实施方案中，用于预防，抑制或治疗癌症的当前公开的方法利用包含先前在WO2015/195621中描述的非天然存在的CRISPR-Cas系统的修饰的组合物(通过引用整体并入本文)。这种修饰使用靶向致癌突变，例如但不限于KRAS，PIK3CA或IDH1，或肿瘤抑制基因的某些gRNA。在一些实施方案中，组合物包含(a)包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统(例如，CRISPR-Cas9)，所述载体包含：i)可操作地连接到至少一种编码核酸酶系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的启动子(例如，双向H1启动子)，其中gRNA与受试者的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中DNA分子编码在细胞中表达的一种或多种基因产物；ii)可操作地连接到编码基因组靶向核酸酶(例如，Cas9蛋白)的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，其中组分(i)和(ii)位于系统的相同或不同载体上，其中gRNA靶向并与靶序列杂交，且核酸酶切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒(例如Ad-rAAVpack)与含有核酸酶系统(即双病毒包装系统)的腺相关病毒同时或共同施用。在一些实施方案中，将使用不具有包装腺病毒的单个腺相关病毒(AAV)颗粒。在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)可包含11种人腺相关病毒血清型(例如血清型1-11)中的任何一种。在一些实施方案中，腺病毒(AAV)可包含51种人腺病毒血清型中的任何一种。在一些实施方案中，用于体内包装rAAV的腺病毒(即腺相关病毒包装腺病毒)包含腺病毒基因中的至少一个缺失。在一些实施方案中，包装腺病毒选自腺病毒血清型2，腺病毒血清型5或腺病毒血清型35。在一些实施方案中，腺相关包装腺病毒是腺病毒血清型5。在一些实施方案中，腺病毒基因选自E1A，E1B，E2A，E2B，E3，E4，L1，L2，L3，L4或L5。在一些实施方案中，腺病毒基因是E3。在一些实施方案中，该系统使一种或多种基因产物失活。在一些实施方案中，核酸酶系统切除至少一个基因突变。在一些实施方案中，启动子包含：a)在至少一种编码gRNA的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件；和b)在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件。在一些实施方案中，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。在一些实施方案中，启动子可操作地连接到至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或十个gRNA。在一些实施方案中，靶序列是癌基因或肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，靶序列是包含至少一个突变的癌基因。在一些实施方案中，靶序列是选自Her2，PIK3CA，KRAS，HRAS，IDH1，NRAS，EGFR，MDM2，TGF-β，RhoC，AKT，c-myc，β-连环蛋白，PDGF，C-MET，PI3K-110α，CDK4，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，雌激素受体基因，孕酮受体基因，ErbB1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物1)，ErbB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)，PLK3，KIRREL，ErbB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)，TGFα，ras-GAP，Shc，Nck，Src，Yes，Fyn，Wnt，Bcl2，PyV MT抗原，和SV40 T抗原的癌基因。在一些实施方案中，靶序列是选自EP300，FBXW7，GATA1，GATA2，NOTCH1，NOTCH2，EXT1，EXT2，PTCH1，SMO，SPOP，SUFU，APC，AXIN1，CDH1，CTNNB1，EP300，FAM123B，GNAS，HNF1A，NF2，PRKAR1A，RNF43，SOX9，ARID1A，ARID1B，ARID2，ASXL1，ATRX，CREBBP，DNMT1，DNMT3A，EP300，EZH2，H3F3A，HIST1H3B，IDH1，IDH2，KDM5C，KDM6A，MEN1，MLL2，MLL3，NCOA3，NCOR1，PAX5，PBRM1，SETD2，SETBP1，SKP2，SMARCA4，SMARCB1，SPOP，TET2，WT1，AR，BCOR，CREBBP，DAXX，DICER1，GATA3，IKZF1，KLF4，LMO1，PHOX2B，PHF6，PRDM1，RUNX1，SBDS，SF3B1，SRSF2，U2AF1，ABL1，BCL2，CARD11，CASP8，CCND1，CDC73，CDK4，CDKN2A，CDKN2C，CYLD，DAXX，FUBP1，MDM2，MDM4，MED12，MYC，MYCL1，MYCN，MYD88，NFE2L2，NPM1，PPM1D，PPP2R1A，RB1，TNFAIP3，TRAF7，TP53，ALK，B2M，BRAF，CBL，CEBPA，CSF1R，CIC，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，HRAS，KIT，KRAS，MAP2K1，MAP3K1，MET，NRAS，NF1，PDGFRA，PTPN11，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，VHL，AKT1，ALK，B2M，CBL，CEBPA，CSF1R，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLCN，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，GPC3，KIT，MET，NKX21，PRKAR1A，PIK3CA，PIK3R1，PDGFRA，PTEN，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，STK11，TSC1，TSC2，TSHR，VHL，WAS，CRLF2，FGFR2，FGFR3，FLT3，JAK1,JAK2，JAK3,KIT，MPL，SOCS1，VHL，B2M，CEBPA，ERK1，GNA11，GNAQ，MAP2K4，MAP3K1，NKX21，TNFAIP3，TSHR，WAS，ACVR1B，BMPR1A，FOXL2，GATA1，GATA2，GNAS，EP300，MED12，SMAD2，SMAD4，ATM，BAP1，BLM，BRCA1，BRCA2，BRIP1，BUB1B，CHEK2，ERCC2，ERCC3，ERCC4，ERCC5，FANCA，FANCC，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCG，MLH1，MSH2，MSH6，MUTYH，NBS1，PALB2，PMS1，PMS2，RECQL4，STAG2，TP53，WRN，XPA，和XPC的癌症驱动基因。在一些实施方案中，靶序列是选自KRAS，PIK3CA或IDH1的癌基因。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是KRAS。在一些实施方案中，KRAS包含选自G13D，G12C或G12D的突变。在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：11-14，或其组合。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是PIK3CA。在一些实施方案中，PIK3CA包含选自E345K，D549N或H1047R的突变。在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：15-18，或其组合。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因IDH1。在一些实施方案中，IDH1包含R132H突变。在一些实施方案中，gRNA序列选自SEQ ID NO：1-10所示的核苷酸序列，或其组合。
在一些实施方案中，双病毒包装系统允许治疗性rAAV在体内迭代复制。在一些实施方案中，双病毒包装系统包含称为Ad-rAAVpack的腺病毒5，其中来自野生型AAV的rep和cap基因取代Ad E3基因。Ad E3通常起到使病毒逃避宿主免疫响应的作用，但不是裂解感染和包装AAV所必需的。因为rep-cap盒仅比E3基因大~lkb，Ad-rAAVpack的总大小完全在公布的Ad包装容量内。Ad-rAAVpack具有复制和包装伴侣rAAV(例如rAAV-TSG或rAAV-Onco-CRISPR)所需的所有反式元件。用Ad-rAAVpack和治疗性rAAV共同感染靶组织允许rAAV在体内增殖，潜在地增加转基因递送的效率。
在一些实施方案中，当前公开的预防，抑制或治疗癌症利用包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：a)可操作地连接到至少一种编码CRISPR-Cas系统引导RNA(gRNA)的核苷酸序列的H1启动子，其中gRNA与细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中DNA分子编码在细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)可操作地连接到编码Cas9蛋白的核苷酸序列的细胞中的调节元件，其中组分(a)和(b)位于系统的相同或不同载体上，其中gRNA靶向并与靶序列杂交且Cas9蛋白切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒(例如，Ad-rAAVpack)与含有CRISPR-Cas系统的腺相关病毒同时或共同施用。
在一些实施方案中，当前公开的主题提供包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：a)可操作地连接到至少一种编码CRISPR-Cas系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的H1启动子，其中gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中DNA分子编码真核细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)可操作地连接到编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列的在真核细胞中可操作的调节元件，其中组分(a)和(b)位于系统的相同或不同载体上，由此gRNA靶向且与靶序列杂交且Cas9蛋白切割DNA分子，且从而改变一种或多种基因产物的表达。在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒(例如Ad-rAAVpack)与含有CRISPR-Cas系统的腺相关病毒同时或共同施用。在一个方面，靶序列可以是以任何核苷酸例如N20NGG开始的靶序列。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列AN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列GN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列CN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列TN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列AN19NGG或GN19NGG。在另一方面，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。在另一方面，Cas9蛋白经密码子优化以在真核细胞中表达。在另一方面，真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一方面，一种或多种基因产物的表达被降低。
当前公开的主题还提供包含含有双向H1启动子的载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，其中双向H1启动子包含：a)在至少一种编码CRISPR-Cas系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件，其中gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中DNA分子编码在真核细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)在编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件，由此gRNA靶向并与靶序列杂交，且Cas9蛋白切割DNA分子，且由此一种或多种基因产物的表达被改变。在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒(例如，Ad-rAAVpack)与含有CRISPR-Cas系统的腺相关病毒同时或共同施用。在一个方面，靶序列可以是以任何核苷酸，例如N20NGG开始的靶序列。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列AN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列GN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列CN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列TN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列AN19NGG或GN19NGG。在另一方面，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。在另一方面，Cas9蛋白经密码子优化以在真核细胞中表达。在另一方面，真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一方面，一种或多种基因产物的表达被降低。
在一些实施方案中，CRISPR复合物包含一个或多个足够强度以在细胞(例如真核细胞)的核中以可检测的量驱动CRISPR复合物的积累的核定位序列。不希望受理论束缚，据信核定位序列对于真核生物中的CRISPR复合物活性不是必需的，但包括这种序列，增强系统的活性，尤其是靶向核中的核酸分子。在一些实施方案中，CRISPR酶是II型CRISPR系统酶。在一些实施方案中，CRISPR酶是Cas9酶。在一些实施方案中，Cas9酶是肺炎链球菌，化脓性链球菌或嗜热链球菌Cas9，且可以包括衍生自这些生物体的突变的Cas9。酶可以是Cas9同系物或直向同源物。
如本文所用，“腺病毒”是具有36kb基因组的DNA病毒。存在51种人腺病毒血清型，基于它们对其它已知腺病毒血清型的抗血清的中和抗性而被区分。尽管大多数腺病毒载体衍生自血清型2和5，但也可以使用其它血清型如35型。野生型腺病毒基因组分为早期(E1至E4)和晚期(L1至L5)基因。可以将腺病毒载体制备成可复制的或非复制的。外源基因可以插入腺病毒基因组的三个区域(E1，E3或E4)以及主要晚期启动子的后面。腺病毒基因组指导腺病毒生产的能力取决于E1中的序列。
参与肿瘤抑制的蛋白质的实例可例如包括ATM(共济失调性毛细血管扩张症突变)，ATR(共济失调性毛细血管扩张症和Rad3相关)，EGFR(表皮生长因子受体)，ERBB2(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物2)，ERBB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)，ERBB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)，Notch 1，Notch2，Notch3，或Notch 4。
可以有用编辑的肿瘤抑制基因的实例是Rb，P53，INK4a，PTEN，LATS，Apaf1，Caspase 8，APC，DPC4，KLF6，GSTP1，ELAC2/HPC2，NKX3.1，ATM，CHK2，ATR，BRCA1，BRCA2，MSH2，MSH6，PMS2，Ku70，Ku80，DNA/PK，XRCC4，神经纤维瘤病1型，神经纤维瘤病2型，腺瘤性结肠息肉病，tWilms肿瘤抑制蛋白，Patched，STAG2，和FHIT。
可用于本发明的重组癌基因的实例包括Her2，KRAS，HRAS，NRAS，EGFR，MDM2，TGF-β，RhoC，AKT，c-myc，β-连环蛋白，PDGF，C-MET，PI3K-110α，CDK4，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，雌激素受体基因，孕酮受体基因，ErbB1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物1)，ErbB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)，PLK3，KIRREL，ErbB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)，TGFα，ras-GAP，Shc，Nck，Src，Yes，Fyn，Wnt，Bcl2，PyV MT抗原，和SV40 T抗原。优选的癌基因是Her2，C-MET，PI3K-CA和AKT，和Her2(也称为neu或ErbB2(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物2))。
如本文所用，“癌症驱动基因”包括癌基因，包括但不限于EP300，FBXW7，GATA1，GATA2，NOTCH1，NOTCH2，EXT1，EXT2，PTCH1，SMO，SPOP，SUFU，APC，AXIN1，CDH1，CTNNB1，EP300，FAM123B，GNAS，HNF1A，NF2，PRKAR1A，RNF43，SOX9，ARID1A，ARID1B，ARID2，ASXL1，ATRX，CREBBP，DNMT1，DNMT3A，EP300，EZH2，H3F3A，HIST1H3B，IDH1，IDH2，KDM5C，KDM6A，MEN1，MLL2，MLL3，NCOA3，NCOR1，PAX5，PBRM1，SETD2，SETBP1，SKP2，SMARCA4，SMARCB1，SPOP，TET2，WT1，AR，BCOR，CREBBP，DAXX，DICER1，GATA3，IKZF1，KLF4，LMO1，PHOX2B，PHF6，PRDM1，RUNX1，SBDS，SF3B1，SRSF2，U2AF1，ABL1，BCL2，CARD11，CASP8，CCND1，CDC73，CDK4，CDKN2A，CDKN2C，CYLD，DAXX，FUBP1，MDM2，MDM4，MED12，MYC，MYCL1，MYCN，MYD88，NFE2L2，NPM1，PPM1D，PPP2R1A，RB1，TNFAIP3，TRAF7，TP53，ALK，B2M，BRAF，CBL，CEBPA，CSF1R，CIC，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，HRAS，KIT，KRAS，MAP2K1，MAP3K1，MET，NRAS，NF1，PDGFRA，PTPN11，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，VHL，AKT1，ALK，B2M，CBL，CEBPA，CSF1R，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLCN，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，GPC3，KIT，MET，NKX21，PRKAR1A，PIK3CA，PIK3R1，PDGFRA，PTEN，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，STK11，TSC1，TSC2，TSHR，VHL，WAS，CRLF2，FGFR2，FGFR3，FLT3，JAK1,JAK2，JAK3,KIT，MPL，SOCS1，VHL，B2M，CEBPA，ERK1，GNA11，GNAQ，MAP2K4，MAP3K1，NKX21，TNFAIP3，TSHR，WAS，ACVR1B，BMPR1A，FOXL2，GATA1，GATA2，GNAS，EP300，MED12，SMAD2，SMAD4，ATM，BAP1，BLM，BRCA1，BRCA2，BRIP1，BUB1B，CHEK2，ERCC2，ERCC3，ERCC4，ERCC5，FANCA，FANCC，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCG，MLH1，MSH2，MSH6，MUTYH，NBS1，PALB2，PMS1，PMS2，RECQL4，STAG2，TP53，WRN，XPA，和XPC。另见Vogelstein等人.(2013) Science 339:1546的综合清单。
通常，且在整个说明书中，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。载体包括但不限于单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或二者的核酸分子，以及本领域已知的其它多种多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中有另外的DNA片段可插入，例如通过标准分子克隆技术。另一种类型的载体是病毒载体，其中载体衍生的DNA或RNA序列存在于载体中以包装到病毒(例如逆转录病毒，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒，复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)中。病毒载体还包括被病毒携带的多核苷酸，用于转染宿主细胞。
某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，且从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“表达载体”。在重组DNA技术中有用的常见表达载体通常是质粒的形式。
重组表达载体可以包含适合于在宿主细胞中表达核酸的形式的当前公开的主题的核酸，这表示重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于可操作地连接到待表达的核酸序列的用于表达的宿主细胞选择。
在重组表达载体内，“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以允许表达核苷酸序列的方式连接到调节元件(例如当载体被引入宿主细胞时，在体外转录/翻译系统中或在宿主细胞中)。
术语“调节元件”旨在包括启动子，增强子，内部核糖体进入位点(IRES)和其它表达控制元件(例如转录终止信号，例如多腺苷酸化信号和多聚U序列)。这种调节元件描述于例如Goeddel(1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, Calif中。调节元件包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列(例如，组织特异性调节序列)表达的那些。组织特异性启动子可以主要在期望的目标组织，例如肌肉，神经元，骨，皮肤，血液，特定器官(例如肝脏，胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)中指导表达。调节元件也可以以时间依赖性方式指导表达，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式，其可以是或可以不是组织或细胞类型特异性的。
在一些实施方案中，载体包含一种或多种pol III启动子，一种或多种pol II启动子，一种或多种pol I启动子，或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子的实例包括但不限于逆转录病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)，巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(例如，Boshart等人.(1985) Cell 41:521-530)，SV40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，β-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子。
术语“调节元件”也包含增强元件，例如WPRE；CMV增强子；HTLV-I的LTR中的R-U5′区段(Takebe等人.(1988) Mol. Cell. Biol.8:466-472)；SV40增强子；和兔β-珠蛋白的外显子2和3之间的内含子序列(O’Hare等人.(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78(3):1527-31)。本领域技术人员应当理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择，所需表达水平等因素。可以将载体引入宿主细胞中，从而产生转录物，蛋白质或肽，包括由本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如，成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)转录物，蛋白质，酶，其突变体形式，其融合蛋白等)。有利的载体包括慢病毒和腺相关病毒，且还可以选择这些载体的类型用于靶向特定类型的细胞。
术语“多核苷酸”，“核苷酸”，“核苷酸序列”，“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的聚合形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区，由连锁分析定义的loci(基因座)，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转移RNA，核糖体RNA，短干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)，微RNA(miRNA)，核酶，cDNA，重组多核苷酸，支链多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离DNA，任何序列的分离RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。在聚合后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。
在当前公开的主题的方面，术语“嵌合RNA”，“嵌合指导RNA”，“指导RNA”，“单指导RNA”和“合成指导RNA”可互换使用，且是指包含指导序列的多核苷酸序列。术语“指导序列”是指指导RNA内的约20bp序列，其指定靶位点且可与术语“指导”或“间隔区”互换使用。
如本文所用，术语“野生型”是本领域技术人员理解的术语且是指生物体，菌株，基因的典型形式或特征在于它在自然界中存在，区别于突变体或变体形式。
如本文所用，术语“变体”应当被认为是指具有偏离自然界中存在的模式的品质的展示。
术语“非自然存在”或“工程化”可互换使用且表明人手的参与。当提及核酸分子或多肽时，术语是指核酸分子或多肽至少基本上不含至少一种在自然界中天然缔合和如在自然界中发现的其它组分。
“互补性”是指核酸通过传统的Watson-Crick或其它非传统类型与另一种核酸序列形成一个或多个氢键的能力。百分比互补性表示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中的5，6，7，8，9，10为50%，60%，70%，80%，90%和100%互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。如本文所用的“基本上互补”是指8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50或更多个核苷酸的区域中至少60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，97%，98%，99%或100%的互补程度，或指在严格条件下杂交的两种核酸。
如本文所用，杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的核酸主要与靶序列杂交且基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件通常是序列依赖性的，且取决于许多因素而变化。通常，序列越长，序列与其靶序列特异性杂交的温度越高。在Tijssen(1993),Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-HybridizationWith Nucleic Acid Probes Part 1, 第二章"Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y中详细描述严格条件的非限制性实例。
“杂交”是指其中一种或多种多核苷酸反应形成复合物的反应，所述复合物经由核苷酸残基的碱基之间的氢键稳定。氢键可以通过Watson Crick碱基配对，Hoogstein结合或以任何其它序列特异性方式发生。复合物可包含形成双链结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，单一自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的步骤，例如PCR的起始，或酶对多核苷酸的切割。能够与给定序列杂交的序列称为给定序列的“互补序列”。
如本文所用，“表达”是指多核苷酸从DNA模板(例如进入和mRNA或其它RNA转录物)转录的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽，多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中剪接mRNA。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，且可以被非氨基酸中断。该术语还包括已经修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化或任何其它操作，例如与标记组分的缀合。
如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体二者，以及氨基酸类似物和肽模拟物。
除非另有说明，本发明当前公开的主题的实践采用免疫学，生物化学，化学，分子生物学，微生物学，细胞生物学，基因组学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内(Sambrook, Fritsch 和Maniatis(1989) Molecular Cloning：A LaboratoryManual, 第2版；Ausubel等人, eds.(1987) Current Protocols in MolecularBiology)；MacPherson等人, eds.(1995) Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)：PCR 2：A Practical Approach)；Harlow和Lane, eds.(1988) Antibodies, ALaboratory Manual；Freshney, ed.(1987) Animal Cell Culture)。
当前公开的主题的若干方面涉及包含一个或多个载体的载体系统，或载体本身。可以设计载体用于在原核或真核细胞中表达CRISPR转录物(例如核酸转录物，蛋白质或酶)。例如，CRISPR转录物可以在细菌细胞，例如大肠杆菌，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)，酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel(1990) GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,Calif中进一步讨论。或者，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
可以在原核生物中引入和繁殖载体。在一些实施方案中，原核生物用于扩增待引入真核细胞的载体的副本或作为待引入真核细胞的载体的产生中的中间载体(例如，扩增作为病毒载体包装系统的一部分的质粒)。在一些实施方案中，原核生物用于扩增载体的副本并表达一种或多种核酸，例如提供一种或多种蛋白质的来源以递送至宿主细胞或宿主生物。蛋白质在原核生物中的表达通常在大肠杆菌中用含有组成型或诱导型启动子的载体进行，所述启动子指导融合蛋白或非融合蛋白的表达。
融合载体向其中编码的蛋白质，例如向重组蛋白质的氨基末端加入许多氨基酸。这种融合载体可以用于一个或多个目的，例如：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解度；和(iii)通过在亲和纯化中充当配体来帮助纯化重组蛋白。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解切割位点，以使在融合蛋白纯化后重组蛋白与融合部分分离。这些酶及其同源识别序列包括因子Xa，凝血酶和肠激酶。示例融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson(1988) Gene 67：31-40)，pMAL(New England Biolabs, Beverly, Mass.)和pRIT5(Pharmacia, Piscataway,N.J.)，其分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E结合蛋白或蛋白A到靶重组蛋白。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann等人(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier等人(1990) Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.)。
在一些实施方案中，载体是酵母表达载体。用于在酵母Saccharomyces cerivisae中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari，等人(1987) EMBO J. 6：229-234)，pMFa(Kuijan和Herskowitz(1982) Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz等人(1987) Gene 54：113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)，和picZ(InVitrogenCorp，San Diego，Calif.)。
在一些实施方案中，载体能够使用哺乳动物表达载体驱动哺乳动物细胞中一种或多种序列的表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(1987) Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987) EMBO J. 6：187-195)。当在哺乳动物细胞中使用时，表达载体的控制功能通常由一种或多种调节元件提供。例如，常用的启动子衍生自多瘤病毒，腺病毒2，巨细胞病毒，猿猴病毒40和本文公开的以及本领域已知的其它。对于原核细胞和真核细胞二者的其它合适的表达系统，参见例如Sambrook等人(1989) Molecular Cloning：ALaboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.的第16章和第17章。
在一些实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够优先指导核酸在特定细胞类型中的表达(例如，组织特异性调节元件用于表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等人(1987) Genes Dev. 1：268-277)，淋巴特异性启动子(Calame和Eaton(1988) Adv. Immunol. 43：235-275)，特别是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore(1989) EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白(Baneiji等人(1983) Cell 33：729-740；Queen和Baltimore(1983) Cell 33：741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund等人(1985) Science 230：912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还包括发育调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990) Science 249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989) Genes Dev. 3：537-546)。
在一些实施方案中，调节元件可操作地连接到CRISPR系统的一种或多种元件以驱动CRISPR系统的一种或多种元件的表达。通常，CRISPR(成簇规则间隔短回文重复)，也称为SPIDR(SPacer Interspersed Direct Repeats)，构成通常对特定细菌物种特异的DNA基因座家族。CRISPR基因座包含在大肠杆菌中识别的不同类型的散布短序列重复(SSR)(Ishino等人(1987) J. Bacteriol., 169：5429-5433；和Nakata等人(1989) J. Bacteriol.,171：3553-3556)和相关基因。在Haloferax mediterranei，Streptococcus pyogenes, Anabaena，和Mycobacterium tuberculosis(Groenen等人(1993) Mol. Microbiol., 10：1057-1065；Hoe等人(1999) Emerg. Infect. Dis., 5：254-263；Masepohl等人(1996)Biochim. Biophys. Acta 1307：26-30；和Mojica等人(1995) Mol. Microbiol., 17：85-93)中识别类似的散布SSR。CRISPR基因座通常由于重复序列的结构而不同于其它SSR，其被称为短规则间隔重复序列(SRSR)(Janssen等人(2002) OMICS J. Integ. Biol., 6：23-33；和Mojica等人(2000) Mol. Microbiol., 36：244-246)。通常，重复序列是以簇形式出现的短元件，这些元件由具有基本恒定长度的独特插入序列规则地间隔开(Mojica等人(2000) Mol. Microbiol., 36：244-246)。尽管重复序列在菌株之间是高度保守的，但散布重复序列的数量和间隔区的序列通常因菌株而异(van Embden等人(2000) J. Bacteriol., 182：2393-2401)。已在多于40种原核生物中识别CRISPR基因座(例如Jansen等人(2002) Mol. Microbiol., 43：1565-1575；和Mojica等人(2005) J. Mol. Evol. 60：174-82)，包括但不限于气火菌属，热棒菌属，硫化叶菌属，古生球菌属，Halocarcula，甲烷细菌属，产甲烷球菌属，甲烷八叠球菌属，甲烷火菌属，火球菌属，嗜酸菌属，Thernioplasnia，棒状杆菌属，分支杆菌属，链霉菌属，Aquifrx，Porphvromonas，绿硫细菌属，栖热菌属，芽孢杆菌属，李斯特菌属，葡萄球菌，梭菌属，高温厌氧杆菌属，支原菌，梭菌属，Azarcus，色素细菌属，奈瑟氏菌属，亚硝化单胞菌属，脱硫弧菌属，地杆菌属，Myrococcus，弯曲杆菌属，沃廉菌属，不动杆菌属，欧文氏菌属，埃希氏杆菌属，军团杆菌属，甲基球菌属，巴斯德菌属，发光杆菌属，沙门氏菌属，黄杆菌属，耶尔森氏菌属，密螺旋体属和热袍菌属。
通常，“CRISPR系统”统称为转录物和涉及表达或指导CRISPR相关(“Cas”)基因活性的其它元件，包括编码Cas基因的序列，指导序列(在内源CRISPR系统的背景下也称为“间隔物”)，或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。在一些实施方案中，CRISPR系统的一种或多种元件衍生自I型，II型或III型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统的一种或多种元件衍生自包含内源CRISPR系统的特定生物，例如化脓性链球菌。通常，CRISPR系统的特征在于促进靶序列位点处的CRISPR复合物形成的元件(在内源CRISPR系统的背景下也称为原型间隔区)。
在形成CRISPR复合物的背景下，“靶序列”是指引导序列被设计为具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。不一定需要完全互补，只要存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成。靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施方案中，靶序列可以在真核细胞的细胞器，例如，线粒体或叶绿体内。可用于重组到包含靶序列的靶基因座的序列或模板称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在当前公开的主题的方面，外源模板多核苷酸可以称为编辑模板。在当前公开的主题的一个方面，重组是同源重组。
在一些实施方案中，载体包含一个或多个插入位点，例如限制性内切核酸酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个插入位点(例如，大约或大于约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个插入位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的指导序列时，单个表达构建体可用于将CRISPR活性靶向细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可包含大约或大于约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20或更多个指导序列。在一些实施方案中，可以提供大约或大于约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个这样的含有引导序列的载体，并任选地将其递送至细胞。
在一些实施方案中，载体包含可操作地连接到编码CRISPR酶，例如Cas蛋白的酶编码序列的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1，Cas1B，Cas2，Cas3，Cas4，Cas5，Cas6，Cas7，Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)，Cas10，Csy1，Csy2，Csy3，Cse1，Cse2，Csc1，Csc2，Csa5，Csn2，Csm2，Csm3，Csm4，Csm5，Csm6，Cmr1，Cmr3，Cmr4，Cmr5，Cmr6，Csb1，Csb2，Csb3，Csx17，Csx14，Csx10，Csx16，CsaX，Csx3，Csx1，Csx15，Csf1，Csf2，Csf3，Csf4，其同系物或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，化脓性链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在登录号Q99ZW2的SwissProt数据库中找到。在一些实施方案中，未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，例如Cas9。在一些实施方案中，CRISPR酶是Cas9，且可以是来自化脓性链球菌或肺炎链球菌的Cas9。
在一些实施方案中，CRISPR酶指导靶序列位置处的一条或两条链的切割，例如靶序列内和/或靶序列的互补序列内。在一些实施方案中，CRISPR酶指导来自靶序列的第一个或最后一个核苷酸的约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，50，100，200，500或更多碱基对内的一条或两条链的切割。在一些实施方案中，载体编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。
在一些实施方案中，编码CRISPR酶的酶编码序列经密码子优化以在特定细胞(例如真核细胞)中表达。真核细胞可以是特定生物体的那些或衍生自特定生物，例如哺乳动物，包括但不限于人，小鼠，大鼠，兔，狗或非人灵长类动物。通常，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如，大约或大于约1，2，3，4，5，10，15，20，25，50或更多个密码子)，同时保持天然氨基酸序列来修饰核酸序列以增强目的宿主细胞中表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特别的偏差。密码子偏差(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，信使RNA的翻译效率继而被认为取决于被翻译的密码子的性质和特定的转移RNA(tRNA)分子的可用性等其它。所选择的tRNA在细胞中的优势通常是肽合成中最频繁使用的密码子的反映。因此，可以基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中最佳基因表达。密码子使用表很容易获得，例如，在“密码子使用数据库”中，且这些表可以以多种方式调整。见Nakamura等人(2000) Nucl. Acids Res. 28：292。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可用的，例如Gene Forge(Aptagen；Jacobus, Pa.)也是可用的。在一些实施方案中，编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如，1，2，3，4，5，10，15，20，25，50或更多个或所有密码子)对应于特定氨基酸的最频繁使用的密码子。
通常，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交且将CRISPR复合物与靶序列直接序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法最佳比对时，引导序列及其相应的靶序列之间的互补程度为大约或大于约50%，60%，75%，80%，85%，90%，95%，97.5%，99%或更多。可以使用用于对准序列的任何合适的算法来确定最佳对准，其非限制性示例包括Smith-Waterman算法，Needleman-Wunsch算法，基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)，ClustalW，ClustalX，BLAT，Novoalign(Novocraft Technologies，ELAND(Illumina，San Diego，Calif.)，SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方案中，指导序列为大约或大于约5，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，75或更多个核苷酸长度。在一些实施方案中，指导序列小于约75，50，45，40，35，30，25，20，15，12或更少个核苷酸长度。
可以通过任何合适的测定来评估指导序列指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括待测试的指导序列，可以提供给具有相应靶序列的宿主细胞，例如通过用编码CRISPR序列的组分的载体转染。然后评估靶序列内的优先切割，例如通过本文所述的Surveyor测定。通过提供靶序列，CRISPR复合物的组分，包括待测试的指导序列和不同于测试指导序列的对照指导序列，并比较在测试和对照指导序列反应之间的靶序列的结合或切割速率，可以在试管中评估靶多核苷酸序列的切割。其它测定是可能的，且本领域技术人员将想到。
可以选择引导序列以靶向任何靶序列。在一些实施方案中，靶序列是细胞基因组内的序列。示例性靶序列包括靶基因组中独特的靶序列。可以选择引导序列以靶向任何靶序列。在一些实施方案中，靶序列是细胞基因组内的序列。示例性靶序列包括靶基因组中独特的靶序列。例如，在一些实施方案中，靶序列是癌基因(例如，具有致癌突变)或肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，靶序列是包含至少一个突变的癌基因。在一些实施方案中，靶序列是选自Her2，PIK3CA，KRAS，HRAS，IDH1，NRAS，EGFR，MDM2，TGF-β，RhoC，AKT，c-myc，β-连环蛋白，PDGF，C-MET，PI3K-110α，CDK4，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，雌激素受体基因，孕酮受体基因，ErbB1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物1)，ErbB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)，PLK3，KIRREL，ErbB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)，TGFα，ras-GAP，Shc，Nck，Src，Yes，Fyn，Wnt，Bcl2，PyV MT抗原，和SV40 T抗原的致癌因子。在一些实施方案中，靶序列是选自EP300，FBXW7，GATA1，GATA2，NOTCH1，NOTCH2，EXT1，EXT2，PTCH1，SMO，SPOP，SUFU，APC，AXIN1，CDH1，CTNNB1，EP300，FAM123B，GNAS，HNF1A，NF2，PRKAR1A，RNF43，SOX9，ARID1A，ARID1B，ARID2，ASXL1，ATRX，CREBBP，DNMT1，DNMT3A，EP300，EZH2，H3F3A，HIST1H3B，IDH1，IDH2，KDM5C，KDM6A，MEN1，MLL2，MLL3，NCOA3，NCOR1，PAX5，PBRM1，SETD2，SETBP1，SKP2，SMARCA4，SMARCB1，SPOP，TET2，WT1，AR，BCOR，CREBBP，DAXX，DICER1，GATA3，IKZF1，KLF4，LMO1，PHOX2B，PHF6，PRDM1，RUNX1，SBDS，SF3B1，SRSF2，U2AF1，ABL1，BCL2，CARD11，CASP8，CCND1，CDC73，CDK4，CDKN2A，CDKN2C，CYLD，DAXX，FUBP1，MDM2，MDM4，MED12，MYC，MYCL1，MYCN，MYD88，NFE2L2，NPM1，PPM1D，PPP2R1A，RB1，TNFAIP3，TRAF7，TP53，ALK，B2M，BRAF，CBL，CEBPA，CSF1R，CIC，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，HRAS，KIT，KRAS，MAP2K1，MAP3K1，MET，NRAS，NF1，PDGFRA，PTPN11，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，VHL，AKT1，ALK，B2M，CBL，CEBPA，CSF1R，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLCN，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，GPC3，KIT，MET，NKX21，PRKAR1A，PIK3CA，PIK3R1，PDGFRA，PTEN，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，STK11，TSC1，TSC2，TSHR，VHL，WAS，CRLF2，FGFR2，FGFR3，FLT3，JAK1,JAK2，JAK3,KIT，MPL，SOCS1，VHL，B2M，CEBPA，ERK1，GNA11，GNAQ，MAP2K4，MAP3K1，NKX21，TNFAIP3，TSHR，WAS，ACVR1B，BMPR1A，FOXL2，GATA1，GATA2，GNAS，EP300，MED12，SMAD2，SMAD4，ATM，BAP1，BLM，BRCA1，BRCA2，BRIP1，BUB1B，CHEK2，ERCC2，ERCC3，ERCC4，ERCC5，FANCA，FANCC，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCG，MLH1，MSH2，MSH6，MUTYH，NBS1，PALB2，PMS1，PMS2，RECQL4，STAG2，TP53，WRN，XPA，和XPC的癌症驱动基因。在一些实施方案中，靶序列是选自KRAS，PIK3CA或IDH1的癌基因。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是KRAS。在一些实施方案中，KRAS包含选自G13D，G12C或G12D的突变。在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：11-14，或其组合。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是PIK3CA。在一些实施方案中，PIK3CA包含选自E345K，D549N或H1047R的突变。在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：15-18，或其组合。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因IDH1。在一些实施方案中，IDH1包含R132H突变。在一些实施方案中，gRNA序列选自SEQ ID NO：1-10所示的核苷酸序列，或其组合。
在一些实施方案中，靶序列可以与SEQ ID NO：11-18所示的核苷酸序列60%，65%，70%,75%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%同源。
术语“同源”是指“%同源性”且在本文中可与术语“%同一性”互换使用，且涉及当使用序列比对程序比对时核酸序列同一性的水平。
例如，如本文所用，80%同源性意指与通过定义的算法确定的80%序列同一性的相同事物，且因此给定序列的同系物在给定序列的长度上具有大于80%的序列同一性。序列同一性的示例性水平包括但不限于与SEQ ID NO：1-18所示的核苷酸序列约80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%或更高的序列同一性。
在一些实施方案中，CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如，除了CRISPR酶外，大约或大于约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个结构域)的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何另外的蛋白质序列，且任选地任何两个结构域之间的接头序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白质结构域的实例包括但不限于表位标签，报告基因序列和具有一种或多种以下活性的蛋白质结构域：甲基酶活性，去甲基酶活性，转录激活活性，转录抑制活性，转录释放因子活性，组蛋白修饰活性，RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签，V5标签，FLAG标签，流感血凝素(HA)标签，Myc标签，VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)，辣根过氧化物酶(HRP)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，荧光素酶，绿色荧光蛋白(GFP)，HcRed，DsRed，青色荧光蛋白(CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)和自发荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可以与编码蛋白质或蛋白质片段的基因序列融合，所述蛋白质或蛋白质片段结合DNA分子或结合其它细胞分子，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)，S标签，Lex A DNA结合结构域(DBD)融合体，GAL4A DNA结合结构域融合体和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合体。可能形成包含CR ISPR酶的融合蛋白的一部分的其它结构域描述于US20110059502中，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，标记的CRISPR酶用于识别靶序列的位置。
在当前公开的主题的一个方面，将包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)，辣根过氧化物酶(HRP)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，荧光素酶，绿色荧光蛋白(GFP)，HcRed，DsRed，青色荧光蛋白(CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)和自发荧光蛋白(包括蓝色荧光蛋白(BFP))的报告基因引入细胞中以编码基因产物，其用作用于测量基因产物表达的改变或修饰的标记。在当前公开的主题的另一个实施方案中，可以经由载体将编码基因产物的DNA分子引入细胞中。在当前公开的主题的优选实施方案中，基因产物是荧光素酶。在当前公开的主题的另一个实施方案中，降低基因产物的表达。
通常，当前公开的主题的启动子实施方案包括：1)完整的Pol III启动子，其包括TATA盒，近端序列元件(PSE)和远端序列元件(DSE)；和2)包括以相反方向与DSE的5’末端融合的PSE和TATA盒的第二种基本Pol III启动子。以其核苷酸序列命名的TATA盒是Pol III特异性的主要决定因素。它通常位于相对于转录序列nt. −23和−30之间的位置，且是转录序列开始的主要决定因素。PSE通常位于nt. −45和−66之间。DSE增强基本Pol III启动子的活性。在H1启动子中，PSE和DSE之间没有间隙。
双向启动子由以下组成：1)完整的，常规的，单向Pol III启动子，其包含3个外部控制元件：DSE，PSE和TATA盒；和2)包含以相反方向与DSE的5’末端融合的PSE和TATA盒的第二基本Pol III启动子。被TATA结合蛋白识别的TATA盒对于将Pol III募集到启动子区域是必需的。通过SNAPc与PSE的相互作用稳定TATA结合蛋白与TATA盒的结合。这些元件一起正确定位Pol III，以便它可以转录表达的序列。DSE对于Pol III启动子的完全活性也是必需的(Murphy等人(1992) Mol. Cell Biol. 12：3247-3261；Mittal等人(1996) Mol. Cell Biol. 16：1955-1965；Ford和Hernandez(1997) J.Biol.Chem., 272：16048-16055；Ford等人(1998) Genes, Dev., 12：3528-3540；Hovde等人(2002) Genes Dev. 16：2772-2777)。通过转录因子Oct-1和/或SBF/Staf与它们在DSE内的基序的相互作用，转录增强高达100倍(Kunkel和Hixon(1998) Nucl. Acid Res., 26：1536-1543)。由于正向和反向的碱性启动子指导序列在双链DNA模板的相对链上的转录，反向定向的基本启动子的正链附加到DSE负链的5’末端。在H1启动子控制下表达的转录物由4或5个T的完整序列终止。
在H1启动子中，DSE与PSE和TATA盒子相邻(Myslinski等人(2001) Nucl. Acid Res. 29：2502-2509)。为了最小化序列重复，通过产生杂合启动子使该启动子双向化，其中通过附加衍生自U6启动子的PSE和TATA盒来控制反向转录。为了促进双向H1启动子的构建，还可以在反向定向的基本启动子和DSE之间插入小间隔序列。
B.方法
在一些实施方案中，当前公开的主题还提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将先前在WO2015/195621中描述的修饰的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入细胞中(通过引用整体并入本文)。这种修饰使用靶向致癌突变，例如但不限于KRAS，PIK3CA或IDH1或肿瘤抑制基因的某些gRNA。在一些实施方案，所述方法包括向细胞中引入组合物，所述组合物包含(a)包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统(例如，CRISPR-Cas9)，所述载体包含：i)可操作地连接到至少一种编码核酸酶系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的启动子(例如，双向H1启动子)，其中gRNA与受试者的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中DNA分子编码在细胞中表达的一种或多种基因产物；和ii)可操作地连接到编码基因组靶向核酸酶(例如Cas9蛋白)的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，其中组分(i)和(ii)位于系统的相同或不同载体上，其中gRNA靶向并与靶序列杂交，且核酸酶切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒(例如Ad-rAAVpack)与含有核酸酶系统(即双病毒包装系统)的腺相关病毒同时或共同施用。在一些实施方案中，将采用不具有包装腺病毒的单个腺相关病毒(AAV)颗粒。在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)可包含11种人腺相关病毒血清型(例如血清型1-11)中的任何一种。在一些实施方案中，腺病毒(AAV)可包含51种人腺病毒血清型中的任何一种。在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒包含腺病毒基因中的至少一个缺失。在一些实施方案中，包装腺病毒选自腺病毒血清型2，腺病毒血清型5或腺病毒血清型35。在一些实施方案中，腺相关病毒包装病毒是腺病毒血清型5。在一些实施方案中，腺病毒基因选自E1A，E1B，E2A，E2B，E3，E4，L1，L2，L3，L4或L5。在一些实施方案中，该系统使一种或多种基因产物失活。在一些实施方案中，核酸酶系统切除至少一个基因突变。在一些实施方案中，启动子包含：a)在至少一种编码gRNA的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件；和b)在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件。在一些实施方案中，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。在一些实施方案中，启动子可操作地连接到至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或十个gRNA。在一些实施方案中，靶序列是癌基因或肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，靶序列是包含至少一个突变的癌基因。在一些实施方案中，靶序列选自Her2，PIK3CA，KRAS，HRAS，IDH1，NRAS，EGFR，MDM2，TGF-β，RhoC，AKT，c-myc，β-连环蛋白，PDGF，C-MET，PI3K-110α，CDK4，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，雌激素受体基因，孕酮受体基因，ErbB1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物1)，ErbB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)，PLK3，KIRREL，ErbB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)，TGFα，ras-GAP，Shc，Nck，Src，Yes，Fyn，Wnt，Bcl2，PyV MT抗原，和SV40 T抗原。在一些实施方案中，靶序列是选自EP300，FBXW7，GATA1，GATA2，NOTCH1，NOTCH2，EXT1，EXT2，PTCH1，SMO，SPOP，SUFU，APC，AXIN1，CDH1，CTNNB1，EP300，FAM123B，GNAS，HNF1A，NF2，PRKAR1A，RNF43，SOX9，ARID1A，ARID1B，ARID2，ASXL1，ATRX，CREBBP，DNMT1，DNMT3A，EP300，EZH2，H3F3A，HIST1H3B，IDH1，IDH2，KDM5C，KDM6A，MEN1，MLL2，MLL3，NCOA3，NCOR1，PAX5，PBRM1，SETD2，SETBP1，SKP2，SMARCA4，SMARCB1，SPOP，TET2，WT1，AR，BCOR，CREBBP，DAXX，DICER1，GATA3，IKZF1，KLF4，LMO1，PHOX2B，PHF6，PRDM1，RUNX1，SBDS，SF3B1，SRSF2，U2AF1，ABL1，BCL2，CARD11，CASP8，CCND1，CDC73，CDK4，CDKN2A，CDKN2C，CYLD，DAXX，FUBP1，MDM2，MDM4，MED12，MYC，MYCL1，MYCN，MYD88，NFE2L2，NPM1，PPM1D，PPP2R1A，RB1，TNFAIP3，TRAF7，TP53，ALK，B2M，BRAF，CBL，CEBPA，CSF1R，CIC，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，HRAS，KIT，KRAS，MAP2K1，MAP3K1，MET，NRAS，NF1，PDGFRA，PTPN11，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，VHL，AKT1，ALK，B2M，CBL，CEBPA，CSF1R，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLCN，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，GPC3，KIT，MET，NKX21，PRKAR1A，PIK3CA，PIK3R1，PDGFRA，PTEN，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，STK11，TSC1，TSC2，TSHR，VHL，WAS，CRLF2，FGFR2，FGFR3，FLT3，JAK1,JAK2，JAK3,KIT，MPL，SOCS1，VHL，B2M，CEBPA，ERK1，GNA11，GNAQ，MAP2K4，MAP3K1，NKX21，TNFAIP3，TSHR，WAS，ACVR1B，BMPR1A，FOXL2，GATA1，GATA2，GNAS，EP300，MED12，SMAD2，SMAD4，ATM，BAP1，BLM，BRCA1，BRCA2，BRIP1，BUB1B，CHEK2，ERCC2，ERCC3，ERCC4，ERCC5，FANCA，FANCC，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCG，MLH1，MSH2，MSH6，MUTYH，NBS1，PALB2，PMS1，PMS2，RECQL4，STAG2，TP53，WRN，XPA，和XPC的癌症驱动基因。在一些实施方案中，靶序列是选自KRAS，PIK3CA或IDH1的癌基因。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是KRAS。在一些实施方案中，KRAS包含选自G13D，G12C或G12D的突变。在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：11-14，或其组合。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是PIK3CA。在一些实施方案中，PIK3CA包含选自E345K，D549N或H1047R的突变。在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：15-18，或其组合。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因IDH1。在一些实施方案中，IDH1包含R132H突变。在一些实施方案中，gRNA序列选自SEQ ID NO：1-10所示的核苷酸序列，或其组合。
在一些实施方案中，当前公开的主题还提供改变细胞中一种或多种基因产物表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入细胞中，所述载体包含：a)可操作地连接到至少一种编码CRISPR-Cas系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的H1启动子，其中所述gRNA与DNA分子的靶序列杂交；和b)可操作地连接到编码Cas9蛋白的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，其中组分(a)和(b)位于系统的相同或不同载体上，其中gRNA靶向并与靶序列杂交且Cas9蛋白切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。
在一些实施方案中，当前公开的主题还提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入细胞中，所述载体包含：a)可操作地连接到至少一种编码CRISPR-Cas系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的H1启动子，其中gRNA与DNA分子的靶序列杂交；和b)可操作地连接到编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列的在真核细胞中可操作的调节元件，其中组分(a)和(b)位于系统的相同或不同载体上，由此gRNA靶向且与靶序列杂交且Cas9蛋白切割DNA分子，且从而改变一种或多种基因产物的表达。在一个方面，靶序列可以是以任何核苷酸，例如N20NGG开始的靶序列。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列AN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列GN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列CN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列TN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列AN19NGG或GN19NGG。在另一方面，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。在又一方面，Cas9蛋白经密码子优化以在真核细胞中表达。在另一方面，真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一方面，一种或多种基因产物的表达被降低。
当前公开的主题还提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含含有双向H1启动子的载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入细胞中，其中双向H1启动子包含：a)在至少一个编码CRISPR-Cas系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件，其中gRNA与DNA分子的靶序列杂交；和b)在编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件，由此gRNA靶向并与靶序列杂交，且Cas9蛋白切割DNA分子，并由此改变一种或多种基因产物的表达。在一个方面，靶序列可以是以任何核苷酸，例如N20NGG开始的靶序列。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列AN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列GN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列CN19NGG。在一些实施方案中，靶序列包含核苷酸序列TN19NGG。在另一方面，靶序列包含核苷酸序列AN19NGG或GN19NGG。在另一方面，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。在又一方面，Cas9蛋白经密码子优化以在真核细胞中表达。在另一方面，真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一方面，一种或多种基因产物的表达被降低。
在一些方面，当前公开的主题提供包括将一种或多种多核苷酸，例如一种或多种本文所述的载体，其一种或多种转录物，和/或由其转录的一种或多种蛋白质递送至宿主细胞的方法。在一些方面，当前公开的主题还提供由这些方法产生的细胞，以及包含这些细胞或由这些细胞产生的生物体(例如动物，植物或真菌)。在一些实施方案中，将与指导序列组合(并任选与其复合)的CRISPR酶递送至细胞。常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于在哺乳动物细胞或靶组织中引入核酸。这种方法可用于将编码CRISPR系统组分的核酸施用到培养中或宿主生物体中的细胞。非病毒载体递送系统包括DNA质粒，RNA(例如本文所述载体的转录物)，裸核酸和与递送媒介物(例如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加或整合的基因组。对于基因治疗程序的综述，参见Anderson(1992) Science 256：808-813；Nabel和Felgner(1993) TIBTECH 11：211-217；Mitani和Caskey(1993) TIBTECH 11：162-166；Dillon(1993) TIBTECH 11：167-175；Miller(1992) Nature 357：455-460；Van Brunt(1998) Biotechnology 6(10)：1149-1154；Vigne(1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8：35-36；Kremer和Perricaudet(1995) British Medical Bulletin 51(1)：31-44；Haddada等人(1995)Current Topics in Microbiology and Immunology. Doerfler和Bohm(eds)；和Yu等人(1994) Gene Therapy 1：13-26。
非病毒递送核酸的方法包括脂转染，核转染，微注射，生物射弹，病毒体，脂质体，免疫脂质体，聚阳离子或脂质:核酸缀合物，裸DNA，人工病毒粒子和DNA的试剂增强摄取。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386，4,946,787；和4,897,355)且脂转染试剂商业销售(例如Transfectam™和Lipofectin™)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括以下的那些：Felgner, WO 91/17424；WO 91/16024。可以递送到细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
脂质:核酸复合物的制备，包括靶向脂质体如immunolipid复合物，是本领域技术人员熟知的(例如Crystal(1995) Science 270：404-410；Blaese等人(1995) Cancer Gene Ther. 2：291-297：Behr等人(1994) Bioconjugate Chem. 5：382-389；Remy等人(1994)Bioconjugate Chem. 5：647-654；Gao等人(1995) Gene Therapy 2：710-722；Ahmad等人(1992) Cancer Res. 52：4817-4820；美国专利号4,186,183，4,217,344，4,235,871，4,261,975，4,485,054，4,501,728，4,774,085，4,837,028，和4,946,787)。
使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送核酸利用高度进化的方法将病毒靶向体内的特定细胞并将病毒载荷运输至细胞核。病毒载体可以直接施用到患者(体内)或它们可以用于体外处理细胞，且可以任选地将修饰的细胞施用到患者(离体)。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺相关和单纯疱疹病毒载体。用逆转录病毒，慢病毒和腺相关病毒基因转移方法可以在宿主基因组中整合，通常导致插入的转基因的长期表达。另外，已经在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
逆转录病毒的趋向性可以通过掺入外来包膜蛋白，扩展靶细胞的潜在靶标群来改变。慢病毒载体是逆转录病毒载体，其能够转导或感染非分裂细胞且通常产生高病毒滴度。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体由具有高达6-10kb外源序列的包装能力的顺式作用长末端重复序列组成。最小顺式作用LTR足以用于载体的复制和包装，然后将其用于将治疗基因整合到靶细胞中以提供永久性转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)，长臂猿白血病病毒(GaLV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些(例如Buchscher等人(1992) J. Virol. 66：2731-2739；Johann等人(1992) J. Virol. 66：1635-1640；Sommnerfelt等人(1990) J. Virol. 176：58-59；Wilson等人(1989) J. Virol. 63：2374-2378；Miller等人(1991) J. Virol. 65：2220-2224；PCT/US94/05700)。在其中优选瞬时表达的应用中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体在许多细胞类型中具有非常高的转导效率，且不需要细胞分裂。用这样的载体，已经获得表达的高滴度和水平。该载体可以在相对简单的系统中大量生产。腺相关病毒(“AAV”)载体也可用于用靶核酸转导细胞，例如，在核酸和肽的体外生产中，以及用于体内和离体基因治疗程序(例如West等人(1987) Virology 160：38-47；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin(1994) Human Gene Therapy 5：793-801；Muzyczka(1994) J. Clin. Invest. 94：1351。重组AAV载体的构建描述于许多出版物中，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等人(1985) Mol. Cell. Biol. 5：3251-3260；Tratschin等人(1984) Mol. Cell. Biol. 4：2072-2081；Hermonat和Muzyczka(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81：6466-6470；和Samulski等人(1989) J. Virol. 63：03822-3828。
包装细胞通常用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这些细胞包括包装腺病毒的293个细胞和包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。用于基因治疗的病毒载体通常通过产生将核酸载体包装到病毒颗粒中的细胞系来产生。载体通常含有包装和随后整合到宿主中所需的最小病毒序列，其它病毒序列被待表达的多核苷酸的表达盒取代。缺失的病毒功能通常由包装细胞系反式提供。例如，用于基因治疗的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的ITR序列，其是包装，转基因表达和整合到宿主基因组中所必需的。病毒DNA包装在细胞系中，该细胞系含有编码其它AAV基因的辅助质粒，即rep和cap，但缺少ITR序列。细胞系可以用腺病毒作为辅助物感染；293细胞及其衍生物含有腺病毒DNA，且因此对于AAV包装不需要腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因的表达。由于缺乏ITR序列，辅助质粒未以显著量包装。用腺病毒污染可以通过例如腺病毒比AAV更敏感的热处理来减少。将核酸递送至细胞的其它方法是本领域技术人员已知的。例如，见US20030087817，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染宿主细胞。在一些实施方案中，细胞在其天然存在于受试者中时被转染。在一些实施方案中，转染的细胞取自受试者。在一些实施方案中，细胞衍生自取自受试者的细胞，例如细胞系。用于组织培养的多种细胞系是本领域已知的。细胞系的实例包括但不限于C8161，CCRF-CEM，MOLT，mIMCD-3，NHDF，HeLa-S3，Huh1，Huh4，Huh7，HUVEC，HASMC，HEKn，HEKa，MiaPaCell，Panel，PC-3，TF1，CTLL-2，C1R，Rat6，CV1，RPTE，A10，T24，J82，A375，ARH-77，Calu1，SW480，SW620，SKOV3，SK-UT，CaCo2，P388D1，SEM-K2，WEHI-231，HB56，TIB55，Jurkat，J45.01，LRMB，Bcl-1，BC-3，IC21，DLD2，Raw264.7，NRK，NRK-52E，MRC5，MEF，Hep G2，HeLa B，HeLa T4，COS，COS-1，COS-6，COS-M6A，BS-C-1猴肾上皮细胞，BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞，3T3 Swiss，3T3-L1，132-d5人胎儿成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞，293-T，3T3，721，9L，A2780，A2780ADR，A2780cis，A172，A20，A253，A431，A-549，ALC，B16，B35，BCP-1细胞，BEAS-2B，bEnd.3，BHK-21，BR 293，BxPC3，C3H-10T1/2，C6/36，Cal-27，CHO，CHO-7，CHO-IR，CHO-K1，CHO-K2，CHO-T，CHO Dhfr −/−，COR-L23，COR-L23/CPR，COR-L23/5010，COR-L23/R23，COS-7，COV-434，CMLT1，CMT，CT26，D17，DH82，DU145，DuCaP，EL4，EM2，EM3，EMT6/AR1，EMT6/AR10.0，FM3，H1299，H69，HB54，HB55，HCA2，HEK-293，HeLa，Hepa1c1c7，HL-60，HMEC，HT-29，Jurkat，JY细胞，K562细胞，Ku812，KCL22，KG1，KYO1，LNCap，Ma-MeI 1-48，MC-38，MCF-7，MCF-10A，MDA-MB-231，MDA-MB-468，MDA-MB-435，MDCK II，MDCK II，MOR/0.2R，MONO-MAC 6，MTD-1A，MyEnd，NCI-H69/CPR，NCI-H69/LX10，NCI-H69/LX20，NCI-H69/LX4，NIH-3T3，NALM-1，NW-145，OPCN/OPCT细胞系，Peer，PNT-1A/PNT 2，RenCa，RIN-5F，RMA/RMAS，Saos-2细胞，Sf-9，SkBr3，T2，T-47D，T84，THP1细胞系，U373，U87，U937，VCaP，Vero细胞，WM39，WT-49，X63，YAC-1，YAR及其转基因品种。细胞系可从本领域技术人员已知的多种来源获得(参见，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassus，VA))。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种载体转染的细胞用于建立包含一种或多种载体衍生序列的新细胞系。在一些实施方案中，用如本文所述的CRISPR系统的组分瞬时转染(例如通过瞬时转染一种或多种载体，或用RNA转染)，并通过CRISPR复合物的活性修饰的细胞用于建立包含含有修饰但缺乏任何其它外源序列的细胞的新细胞系。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染的细胞，或衍生自此类细胞的细胞系用于评估一种或多种测试化合物。
在一些实施方案中，本文描述的一种或多种载体用于产生非人转基因动物。在一些实施方案中，转基因动物是哺乳动物，例如小鼠，大鼠或兔。在某些实施方案中，生物体或受试者是植物。产生转基因动物的方法是本领域已知的，且通常以细胞转染方法开始，例如本文所述。
在一个方面，当前公开的主题提供修饰真核细胞中靶多核苷酸的方法，所述方法可以是体内，离体或体外。在一些实施方案中，该方法包括从人或非人动物取样细胞或细胞群，以及修饰一个或多个细胞。培养可以在离体的任何阶段发生。甚至可以将一个或多个细胞重新引入非人动物中。
在一个方面，当前公开的主题提供修饰真核细胞中靶多核苷酸的方法。在一些实施方案中，该方法包括允许CRISPR复合物结合到靶多核苷酸以实现靶多核苷酸的切割，从而修饰靶多核苷酸，其中CRISPR复合物包含与指导序列复合的CRISPR酶，所述指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。
在一个方面，当前公开的主题提供修饰真核细胞中多核苷酸表达的方法。在一些实施方案中，该方法包括使CRISPR复合物与多核苷酸结合使得结合导致多核苷酸的表达增加或减少；其中CRISPR复合物包含与指导序列复合的CRISPR酶，所述指导序列与多核苷酸内的靶序列杂交。
在一个方面，当前公开的主题提供使用CRISPR系统的一种或多种元件的方法。当前公开的主题的CRISPR复合物提供修饰靶多核苷酸的有效手段。当前公开的主题的CRISPR复合物具有多种用途，包括在多种细胞类型中修饰(例如，缺失，插入，易位，失活，激活)靶多核苷酸。因此，当前公开的主题的CRISPR复合物在例如基因治疗，药物筛选，疾病诊断和预后中具有广泛的应用。示例性的CRISPR复合物包含与指导序列复合的CRISPR酶，所述指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。
CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是真核细胞内源或外源的任何多核苷酸。例如，靶多核苷酸可以是驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。靶多核苷酸可以是编码基因产物(例如蛋白质)或非编码序列(例如调节多核苷酸或垃圾DNA)的序列。不希望受理论束缚，据信靶序列应与PAM(原型间隔相邻基序)缔合；也就是说，通过CRISPR复合物识别的短序列。PAM的精确序列和长度要求根据所用的CRISPR酶而不同，但PAM通常是与原型间隔区相邻的2-5个碱基对序列(即靶序列)。PAM序列的实例在下面的实施例部分中给出，且技术人员将能够识别用于给定CRISPR酶的其它PAM序列。
靶多核苷酸的实例包括与信号传导生化途径相关的序列，例如信号传导生化途径相关基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关基因或多核苷酸。“疾病相关”基因或多核苷酸是指与非疾病控制的组织或细胞相比，在衍生自疾病影响组织的细胞中以异常水平或异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。它可能是在异常高水平下表达的基因；它可以是以异常低水平表达的基因，其中改变的表达与疾病的发生和/或进展相关。疾病相关基因还指具有一个或多个突变或遗传变异的基因，其直接负责疾病病因或与负责疾病病因的基因连锁不平衡。转录或翻译的产物可能是已知的或未知的，且可能处于正常或异常水平。
当前公开的主题的实施方案还涉及与敲除基因，扩增基因和修复与DNA重复不稳定性和神经障碍相关的特定突变有关的方法和组合物(Robert D. Wells, TetsuoAshizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, 第二版, AcademicPress, 2011年10月13日-Medical)。已经发现串联重复序列的特定方面负责多于20种人类疾病(McIvor等人(2010) RNA Biol. 7(5)：551-8)。可以利用CRISPR-Cas系统来校正基因组不稳定性的这些缺陷。
C.制剂
在一个方面，本发明提供药学上可接受的组合物，其包含双病毒包装系统(即，rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack)，与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。在另一方面，组合物可以原样施用或与药学上可接受的载体混合施用且也可以与其它抗癌疗法联合施用，例如化学治疗剂，清除剂化合物，辐射疗法，生物疗法等。因此，联合疗法包括组合物的顺序，同时和分开或共同施用，其中当施用后续化合物时，第一次施用的治疗效果尚未完全消失。
如下面详细描述的，本发明的药物组合物可以特别配制成以固体或液体形式施用，包括适合于以下的那些：(1)口服施用，例如，浸液(水溶液或非水溶液或悬浮液)，片剂，例如用于口腔，舌下和全身吸收的靶向的那些，大丸剂，粉末，颗粒，施加到舌头的糊剂；(2)肠胃外施用，例如，通过皮下，肌肉内，静脉内或硬膜外注射，例如无菌溶液或悬浮液，或缓释制剂；(3)局部施加，例如，作为施加到皮肤的乳膏，软膏或受控释放的贴剂或喷雾；(4)阴道内或直肠内，例如，子宫托，乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)眼睛；(7)透皮；或(8)鼻腔。
如上所述，包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))的组合物的某些实施方案可含有碱性官能团，例如氨基或烷基氨基，且因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或通过使其游离碱形式的本发明的纯化化合物与合适的有机或无机酸分开反应，并在随后的纯化期间分离由此形成的盐制备。代表性的盐包括氢溴酸盐，盐酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，硝酸盐，乙酸盐，戊酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，硬脂酸盐，月桂酸盐，苯甲酸盐，乳酸盐，磷酸盐，甲苯磺酸盐，柠檬酸盐，马来酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，萘甲酸盐，甲磺酸盐，葡庚糖酸盐，乳糖酸盐和十二烷基磺酸盐等(参见，例如，Berge等人.(1977) “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66:1-19)。
本发明的化合物的药学上可接受的盐包括化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如，来自无毒的有机或无机酸。例如，这种常规的无毒盐包括衍生自无机酸的那些，例如盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，氨基磺酸盐，磷酸盐，硝酸盐等；和由有机酸制备的盐，如乙酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，乙醇酸盐，硬脂酸盐，乳酸盐，苹果酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，抗坏血酸盐，棕榈酸盐，马来酸盐，羟基马来酸盐，苯乙酸盐，谷氨酸盐，苯甲酸盐，水杨酸盐，磺胺酸盐，2-乙酰氧基苯甲酸盐，富马酸盐，甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，乙烷二磺酸盐，草酸盐，羟乙基磺酸盐等。
在其它情况下，包含本发明的双病毒包装系统(即，rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack)的组合物可含有一个或多个酸性官能团，且因此，能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。这些盐同样可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或通过使其游离酸形式的纯化化合物与合适的碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物，碳酸盐或碳酸氢盐)，与氨，或与药学上可接受的有机伯，仲或叔胺分开反应来制备。代表性的碱金属或碱土金属盐包括锂盐，钠盐，钾盐，钙盐，镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺，二乙胺，乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，哌嗪等(参见，例如，Berge等，同上)。
润湿剂，乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，脱模剂，包衣剂，甜味剂，调味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，半胱氨酸盐酸盐，硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基化羟基苯甲醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸等。
包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack)制剂的组合物包括适用于肿瘤内，口服，鼻腔，局部(包括口腔和舌下)，直肠，阴道和/或肠胃外施用的组合物。制剂可以方便地以单位剂型存在且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的化合物的量。
在某些实施方案中，包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack)的组合物制剂可包含其它载体以允许更高的稳定性，以允许更高的稳定性，体内不同的释放性质，靶向特定位点，或将允许向受试者或受试者中的靶标更有效地递送双病毒包装系统(即rAAV(例如rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack)的任何其它所需的特征，例如但不限于脂质体，微球，纳米球，纳米颗粒，气泡，胶束形成剂，例如胆汁酸，和聚合物载体，例如聚酯和聚酸酐。在某些实施方案中，前述制剂使得本发明的化合物经口服生物可利用。
双病毒包装系统的液体剂量制剂(即rAAV(例如rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack)包括药学上可接受的乳液，微乳液，溶液，悬浮液，糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，油(特别是棉籽，花生，玉米，胚芽，橄榄，蓖麻和芝麻油)，甘油，四氢呋喃醇，聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。
除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂，如润湿剂，乳化剂和悬浮剂，甜味剂，调味剂，着色剂，芳香剂和防腐剂。
除活性化合物外，悬浮液可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇，聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂和黄蓍胶，及其混合物。
适合于口服施用的制剂可以是胶囊，扁囊剂，丸剂，片剂，锭剂(使用调味基础，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)，粉末，颗粒的形式，或作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳液，或作为酏剂或糖浆，或作为软锭剂(pastilles)(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为口腔清洗剂等，每个都含有预定量的活性成分。包含本发明的双病毒包装系统(即rAAV(例如rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack)的组合物也可以作为大丸剂，药糖剂或糊剂施用。
在固体剂型(例如，胶囊，片剂，丸剂，糖衣丸，粉末，颗粒等)中，活性成分与一种或多种药学上可接受的载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下任一种：(1)填充剂或增量剂，如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇，单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土粘土；(9)润滑剂，例如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，十二烷基硫酸钠及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊，片剂和丸剂的情况下，组合物还可包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可用作软和硬壳明胶胶囊中的填充剂，使用诸如乳糖(loctose)或乳糖(milk sugar)等赋形剂，以及高分子量聚乙二醇等。
片剂可以通过压缩或模塑制成，任选地用一种或多种辅助成分。可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂来制备压缩片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制备。
片剂和其它固体剂型，例如糖衣丸，胶囊，丸剂和颗粒，可任选地用包衣和外壳获得或制备，例如肠溶包衣和药物配制领域熟知的其它包衣。它们也可以配制成提供其中的活性成分缓慢或受控释放，例如，使用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线，其它聚合物基质，脂质体和/或微球。组合物也可以配制成快速释放，例如冷冻干燥。它们可以通过例如通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可以在使用前立即溶解在无菌水或一些其它无菌可注射介质中。这些组合物还可以任选地含有遮光剂且可以是仅或优选在胃肠道的某一部分中，任选地以延迟的方式释放一种或多种活性成分的组合物。可以使用的嵌入组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果合适，活性成分也可以是一种或多种上述赋形剂的微胶囊形式。
用于直肠或阴道施用的制剂可以作为栓剂提供，其可以通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载体混合来制备，所述赋形剂或载体包括例如可可脂，聚乙二醇，栓剂蜡或水杨酸盐，且在室温下为固体，但在体温下为液体，且因此将在直肠或阴道腔内融化并释放活性化合物。
适用于阴道施用的制剂还包括含有本领域已知的合适载体的子宫托，棉塞，乳膏，凝胶，糊剂，泡沫或喷雾制剂。
用于局部或透皮施用包含本发明的双病毒包装系统(即，rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack)的组合物的剂型包括粉末，喷雾，软膏，糊剂，乳膏，洗剂，凝胶，溶液，贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体，并与可能需要的任何防腐剂，缓冲剂或推进剂混合。
除了本发明的活性化合物之外，软膏，糊剂，乳膏和凝胶可以含有赋形剂，例如动物和植物脂肪，油，蜡，石蜡，淀粉，黄蓍胶，纤维素衍生物，聚乙二醇，硅氧烷，膨润土，硅酸，滑石和氧化锌，或其混合物。
粉末和喷雾可含有赋形剂，例如乳糖，滑石，硅酸，氢氧化铝，硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾可另外含有常规推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代的烃，如丁烷和丙烷。
透皮贴剂具有向身体提供受控递送的附加优点。这些剂型可以通过将化合物溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加化合物在皮肤上的通量。可以通过提供速率控制膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制这种通量的速率。
眼科制剂，眼用软膏，粉末，溶液等也包括在本发明的范围内。
适用于肠胃外或瘤内施用的药物组合物可包含无菌等渗水溶液或非水溶液，分散液，悬浮液或乳液，或无菌粉末，其可在使用前重构成无菌可注射溶液或分散液，其可含有糖，醇，抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂，使制剂与预期接受者的血液或悬浮剂或增稠剂等渗的溶质。
可用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，如橄榄油和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
在某些实施方案中，根据本文提供的方法和组合物，上述药物组合物可以与本领域已知的其它药理活性化合物(“第二活性剂”)组合。第二活性剂可以是大分子(例如蛋白质)或小分子(例如合成的无机，有机金属或有机分子)。在一个实施方案中，第二活性剂独立地或协同地帮助治疗癌症。
例如，化学治疗剂是抗癌剂。术语化学治疗剂包括但不限于基于铂的试剂，例如卡铂和顺铂；氮芥烷化剂；亚硝基脲烷基化剂，如卡莫司汀(BCNU)和其它烷化剂；抗代谢物，如甲氨蝶呤；嘌呤类似物抗代谢物；嘧啶类似物抗代谢物，如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨；激素抗肿瘤药，如戈舍瑞林，亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗肿瘤药，如紫杉烷(如多西他赛和紫杉醇)，阿地白介素，白细胞介素-2，依托泊苷(VP-16)，干扰素α和维甲酸(ATRA)；抗生素天然抗肿瘤药，如博来霉素，放线菌素，柔红霉素，多柔比星和丝裂霉素；和长春花生物碱天然抗肿瘤药，如长春碱和长春新碱。
此外，即使不考虑抗肿瘤剂本身，下列药物也可以与抗肿瘤剂组合使用：放线菌素；柔红霉素HC1；多西他赛；多柔比星HC1；阿法依泊汀(epoetin alfa)；依托泊苷(VP-16)；更昔洛韦钠；硫酸庆大霉素；干扰素α；醋酸亮丙瑞林；哌替啶HCl；美沙酮HC1；雷尼替丁HCl；长春碱硫酸盐；和齐多夫定(AZT)。例如，最近氟尿嘧啶与肾上腺素和牛胶原一起配制以形成特别有效的组合。
此外，还可以使用下列氨基酸，肽，多肽，蛋白质，多糖和其它大分子：白介素1至18，包括突变体和类似物；干扰素或细胞因子，如干扰素α，β和γ；激素，如促黄体激素释放激素(LHRH)和类似物，和促性腺激素释放激素(GnRH)；生长因子，如转化生长因子-β(TGF-β)，成纤维细胞生长因子(FGF)，神经生长因子(NGF)，生长激素释放因子(GHRF)，表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)，肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素生长因子(IGF)；肿瘤坏死因子-α & β(TNF-α & β)；入侵抑制因子-2(IIF-2)；骨形态发生蛋白1-7(BMP 1-7)；生长抑素；胸腺素-α -1；γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；补充因子；抗血管生成因子；抗原材料；和前药。
与本文所述的组合物和治疗方法一起使用的化学治疗剂包括但不限于烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如benzodopa，卡波醌，meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺，曲他胺，三乙烯基磷酰胺，三乙烯基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(特别是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新，卡折来新和bizelesin合成类似物)；cryptophycin (特别是cryptophycin1和cryptophycin8)；多拉司他汀；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥，如苯丁酸氮芥，萘氮芥，氯磷酰胺，雌莫司汀，异环磷酰胺，双氯乙基甲胺，盐酸甲氧氮芥，美法仑，新恩比兴，苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，曲磷胺，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀和雷尼莫司汀；抗生素如烯二炔类抗生素(如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γl和卡奇霉素ωl；dynemicin，包括dynemicin A；双膦酸盐，如氯膦酸盐；esperamicin；以及新抑癌蛋白发色团和相关色蛋白烯二炔抗生物色团，aclacinomysins，放线菌素，authrarnycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C，carabicin，caminomycin，嗜癌菌素，chromomycinis，放线菌素D，道诺霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素(包括吗啉代-阿霉素，氰基吗啉代-阿霉素，2-吡咯啉代-阿霉素和脱氧阿霉素(deoxydoxoricicin))，表柔比星，依索比星，伊达比星，麻西罗霉素，丝裂霉素如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素类，培洛霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑菌素，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸，甲氨蝶呤，蝶罗呤，曲美沙特；嘌呤类似物如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮杂尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，多西氟尿苷，依那西班，氟尿苷；雄性激素如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸酯，环硫雄醇，美雄烷，睾内酯；抗肾上腺素如氨鲁米特，米托坦，trilostane；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；地美可辛；地吖醌；elformithine；依利醋铵；epothilone；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登素类如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物)；雷佐生；根霉素；sizofuran；螺环锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2''-三氯三乙基胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素，verracurin A，杆孢菌素A和anguidine)；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂配位配合物，如顺铂，奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A，如维甲酸；卡培他滨；和任何上述的药学上可接受的盐，酸或衍生物。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可包含其它生物活性物质，包括治疗药物或前药，例如，其它化学治疗剂，清除剂化合物，抗生素，抗病毒剂，抗真菌剂，抗炎药，血管收缩剂和抗凝血剂，用于癌症疫苗应用或相应前药的抗原。
示例性清除剂化合物包括但不限于含硫醇的化合物，例如谷胱甘肽，硫脲和半胱氨酸；醇例如甘露醇，被取代的酚；醌，被取代的酚，芳基胺和硝基化合物。
可以使用各种形式的化学治疗剂和/或其它生物活性剂。这些包括但不限于具有生物活性的不带电荷分子，分子复合物，盐，醚，酯，酰胺等形式。
II. 治疗癌症的方法
当前公开的主题提供预防，抑制或治疗有需要的受试者(例如人)的癌症的方法。该方法包括以下步骤：(a)提供包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统(例如，CRISPR-Cas9)，所述载体包含：i)可操作地连接到至少一种编码核酸酶系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的启动子(例如，双向H1启动子)，其中gRNA与受试者的细胞(例如，癌细胞)中的DNA分子的靶序列杂交，且其中DNA分子编码一种或多种在细胞中表达的基因产物；ii)可操作地连接到编码基因组靶向核酸酶(例如Cas9)的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，其中组分(i)和(ii)位于系统的相同或不同载体上，其中gRNA靶向并与靶序列杂交，且核酸酶切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达或失活；和(b)向受试者施用有效量的系统。在一些实施方案中，腺相关病毒包装腺病毒(例如Ad-rAAVpack)与含有核酸酶系统的腺相关病毒(即双病毒包装系统)同时或共同施用。在一些实施方案中，将系统包装到不具有包装腺病毒的单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)可包含11种人腺病毒血清型(例如，血清型1-11)中的任一种。在一些实施方案中，腺相关包装腺病毒包含腺病毒基因中的至少一个缺失。在一些实施方案中，包装腺病毒选自腺病毒血清型2，腺病毒血清型5或腺病毒血清型35。在一些实施方案中，包装病毒是腺病毒血清型5。在一些实施方案中，腺病毒基因选自E1A，E1B，E2A，E2B，E3，E4，L1，L2，L3，L4或L5。在一些实施方案中，腺病毒基因是E3。在一些实施方案中，该系统使一种或多种基因产物失活。在一些实施方案中，核酸酶系统切除至少一个基因突变。在一些实施方案中，启动子包含：a)在至少一种编码gRNA的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件；和b)在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件。在一些实施方案中，Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。在一些实施方案中，启动子可操作地连接到至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或十个gRNA。在一些实施方案中，靶序列是癌基因或肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，靶序列是包含至少一个突变的癌基因。在一些实施方案中，靶序列是选自Her2，PIK3CA，KRAS，HRAS，IDH1，NRAS，EGFR，MDM2，TGF-β，RhoC，AKT，c-myc，β-连环蛋白，PDGF，C-MET，PI3K-110α，CDK4，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，雌激素受体基因，孕酮受体基因，ErbB1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物1)，ErbB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)，PLK3，KIRREL，ErbB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)，TGFα，ras-GAP，Shc，Nck，Src，Yes，Fyn，Wnt，Bcl2，PyV MT抗原，和SV40 T抗原的癌基因。在一些实施方案中，靶序列是选自EP300，FBXW7，GATA1，GATA2，NOTCH1，NOTCH2，EXT1，EXT2，PTCH1，SMO，SPOP，SUFU，APC，AXIN1，CDH1，CTNNB1，EP300，FAM123B，GNAS，HNF1A，NF2，PRKAR1A，RNF43，SOX9，ARID1A，ARID1B，ARID2，ASXL1，ATRX，CREBBP，DNMT1，DNMT3A，EP300，EZH2，H3F3A，HIST1H3B，IDH1，IDH2，KDM5C，KDM6A，MEN1，MLL2，MLL3，NCOA3，NCOR1，PAX5，PBRM1，SETD2，SETBP1，SKP2，SMARCA4，SMARCB1，SPOP，TET2，WT1，AR，BCOR，CREBBP，DAXX，DICER1，GATA3，IKZF1，KLF4，LMO1，PHOX2B，PHF6，PRDM1，RUNX1，SBDS，SF3B1，SRSF2，U2AF1，ABL1，BCL2，CARD11，CASP8，CCND1，CDC73，CDK4，CDKN2A，CDKN2C，CYLD，DAXX，FUBP1，MDM2，MDM4，MED12，MYC，MYCL1，MYCN，MYD88，NFE2L2，NPM1，PPM1D，PPP2R1A，RB1，TNFAIP3，TRAF7，TP53，ALK，B2M，BRAF，CBL，CEBPA，CSF1R，CIC，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，HRAS，KIT，KRAS，MAP2K1，MAP3K1，MET，NRAS，NF1，PDGFRA，PTPN11，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，VHL，AKT1，ALK，B2M，CBL，CEBPA，CSF1R，EGFR，ERBB2，FGFR2，FGFR3，FH，FLCN，FLT3，GNA11，GNAQ，GNAS，GPC3，KIT，MET，NKX21，PRKAR1A，PIK3CA，PIK3R1，PDGFRA，PTEN，RET，SDH5，SDH8，SDHC，SDHD，STK11，TSC1，TSC2，TSHR，VHL，WAS，CRLF2，FGFR2，FGFR3，FLT3，JAK1,JAK2，JAK3,KIT，MPL，SOCS1，VHL，B2M，CEBPA，ERK1，GNA11，GNAQ，MAP2K4，MAP3K1，NKX21，TNFAIP3，TSHR，WAS，ACVR1B，BMPR1A，FOXL2，GATA1，GATA2，GNAS，EP300，MED12，SMAD2，SMAD4，ATM，BAP1，BLM，BRCA1，BRCA2，BRIP1，BUB1B，CHEK2，ERCC2，ERCC3，ERCC4，ERCC5，FANCA，FANCC，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCG，MLH1，MSH2，MSH6，MUTYH，NBS1，PALB2，PMS1，PMS2，RECQL4，STAG2，TP53，WRN，XPA，和XPC的癌症驱动基因。在一些实施方案中，靶序列是选自KRAS，PIK3CA或IDH1的癌基因。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是KRAS。在一些实施方案中，KRAS包含选自G13D，G12C或G12D的突变。在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：11-14，或其组合。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因是PIK3CA。在一些实施方案中，PIK3CA包含选自E345K，D549N或H1047R的突变。在一些实施方案中，靶序列选自SEQ ID NO：15-18，或其组合。在一些实施方案中，靶序列是癌基因，所述癌基因IDH1。在一些实施方案中，IDH1包含R132H突变。在一些实施方案中，gRNA序列选自SEQ ID NO：1-10所示的核苷酸序列，或其组合。在一些实施方案中，核酸酶系统经由全身施用来施用。在一些实施方案中，全身施用选自口服，静脉内，皮内，腹膜内，皮下和肌肉内施用。在一些实施方案中，核酸酶系统肿瘤内或肿瘤周围施用。在一些实施方案中，权利要求1的方法，其中所述受试者用至少一种另外的抗癌剂治疗。在一些实施方案中，抗癌剂选自紫杉醇，顺铂，托泊替康，吉西他滨，博来霉素，依托泊苷，卡铂，多西他赛，多柔比星，托泊替康，环磷酰胺，曲贝替定，奥拉帕尼，他莫昔芬，来曲唑和贝伐单抗。在一些实施方案中，所述受试者用至少一种另外的抗癌疗法治疗。在一些实施方案中，抗癌疗法是辐射疗法，化学疗法或手术。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，癌症选自脑癌，胃肠癌，口腔癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌，肝癌，咽喉癌，胃癌和肾癌。在一些实施方案中，癌症是脑癌。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，受试者中的细胞增殖被抑制或减少。在一些实施方案中，受试者中的恶性肿瘤被抑制或减少。在一些实施方案中，受试者中肿瘤坏死增强或增加。
已公开E1B缺陷型腺病毒有效感染和裂解肿瘤细胞的能力。虽然已经证明这种癌细胞趋向性的基础的机理比最初想象的更复杂，但由Onyx开发的溶癌腺病毒(称为Onyx-015)在一些临床试验中表现良好，且目前在中国以Oncorine销售。与ONYX-015相比，Ad-rAAVpack设计具有微妙的E1B突变，可防止病毒抑制对感染的先天免疫响应，但保留将病毒RNA导出至细胞质的能力。由干扰素介导的这种响应通常在许多癌细胞中丧失。
Ad-rAAVpack在癌症中的应用提出了几种策略选择。伴侣rAAV可含有紧密的肿瘤抑制因子或免疫刺激剂如干扰素。或者，伴侣rAAV可以配备有CRISPR-Cas9系统(例如，AAV-H1-CRISPR系统)。包含在这种rAAV中的gRNA可以被编程以特异性地靶向致癌突变，或促进缺陷肿瘤抑制基因的修复。
双重病毒系统对于单独rAAV的癌症治疗的预测优势是靶向基因递送/靶向遗传改变的程度和持续时间。一剂量的治疗性rAAV施用可能会靶向可接近肿瘤中的许多细胞。如果这样修饰的细胞比例不足以显著影响疾病的进程，Ad-rAAVpack可与rAAV组合。通过匹配肿瘤本身的复制潜力，双病毒包装系统可以在更长的时间尺度上提供靶向更大比例的癌细胞的独特机会。不希望受理论束缚，在图3中显示这种双重病毒溶癌疗法可以如何起作用的实例。
为了靶向致癌突变，可以设计伴侣rAAV以高度特异性的方式失活复发性致癌突变。本文提供一组gRNA，其可选择性地破坏癌症相关癌基因形式的KRAS，PIK3CA和IDH1。总的来说，KRAS和PIK3CA中的这些特异性突变在肺部和整个GI道的大多数癌症中发现。在大约30%的神经胶质瘤中发现IDH1 R132突变。这些脑肿瘤对所有常规治疗形式都特别难以治愈。这些gRNA中的每一个主要靶向突变等位基因而不会在剩余的野生型等位基因中引起脱靶效应。
术语“施用”是指向受试者提供药剂或组合物，且包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。
如本文所用，术语“障碍”通常是指将受益于用针对一种识别的靶标或途径的化合物治疗的任何病症，包括可以针对一种识别的靶标或途径通过有效量的化合物或其药学上可接受的盐治疗的任何疾病、障碍或病症。
如本文所用的术语“癌症”是指细胞的异常生长，其倾向于以不受控制的方式增殖，且在一些情况下，转移(扩散)。癌症的类型包括但不限于在疾病的任何阶段在具有或不具有转移的情况下实体瘤(例如膀胱，肠，脑，乳房，子宫内膜，心脏，肾，肺，子宫，淋巴组织(淋巴瘤)，卵巢，胰腺或其它内分泌器官(甲状腺)的肿瘤)，前列腺，皮肤(黑素瘤或基底细胞癌)或血液肿瘤(如白血病和淋巴瘤)。
癌症的其它非限制性实例包括肝细胞癌(HCC)，急性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)，脑干胶质瘤，脑肿瘤，脑和脊髓肿瘤，乳腺癌，支气管肿瘤，伯基特淋巴瘤，宫颈癌，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，结肠癌，结直肠癌，颅咽管瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，胚胎肿瘤，子宫内膜癌，室管膜母细胞瘤，室管膜瘤，食管癌，尤文肉瘤肿瘤家族，眼癌，视网膜母细胞瘤，胆囊癌，胃(gastric)(胃(stomach))癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤(GIST)，胃肠道间质细胞瘤，生殖细胞肿瘤，胶质瘤，毛细胞白血病，头颈癌，肝细胞癌(肝癌)，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，眼内黑素瘤，胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)，卡波西肉瘤，肾癌，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，喉癌，白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，毛细胞白血病，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，成神经管细胞瘤，髓上皮瘤，黑素瘤，间皮瘤，口腔癌，慢性粒细胞白血病，骨髓性白血病，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，口癌，口咽癌，骨肉瘤，骨恶性纤维组织细胞瘤，卵巢癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低恶性潜能肿瘤，胰腺癌，乳头状瘤病，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，中间分化的松果体实质肿瘤，松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体瘤，浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤，胸膜肺母细胞瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞(肾)癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，肉瘤，尤文肉瘤肿瘤家族，肉瘤，卡波西，Sezary综合症，皮肤癌，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，胃(gastric)(胃(stomach))癌，幕上原始神经外胚层肿瘤，T细胞淋巴瘤，睾丸癌，咽喉癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，维尔姆斯瘤。
如本文所用，术语“治疗”可以包括逆转，减轻，抑制该术语所适用的疾病、障碍或病症，或这种疾病、障碍或病症(例如，癌症)的一种或多种症状或表现的进展，预防或降低其概率。在一些实施方案中，该治疗减少癌细胞。例如，与在进行治疗之前受试者中的癌细胞或在未进行治疗的受试者中的癌细胞相比，治疗可以使癌细胞减少至少5%，10%，15%，20%，25%，30%，33%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，66%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高。在一些实施方案中，治疗完全抑制受试者中的癌细胞。
在一些实施方案中，在施用到受试者之前，将系统包装到单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。治疗、施用或疗法可以是连续的或间歇的。连续治疗、施用或疗法是指基于至少每天治疗而不中断治疗一天或多天。间歇性治疗或施用，或以间歇方式治疗或施用，是指不是连续的，而是循环性的治疗。根据当前公开的方法的治疗可以导致疾病、障碍或病症的完全缓解或治愈，或疾病、疾病或病症的一种或多种症状的部分改进，且可以是暂时的或永久的。术语“治疗”还旨在包括预防、疗法和治愈。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生有益或所需结果的试剂的量。治疗有效量可以根据以下一个或多个而变化：受试者和待治疗的疾病状况，受试者的体重和年龄，疾病状况的严重性，施用方式等，其可以容易地由本领域普通技术人员确定。该术语还适用于将提供用于通过本文所述的任何一种成像方法检测的图像的剂量。具体剂量可以根据以下一种或多种而变化：所选择的特定试剂，要遵循的投配方案，是否与其它化合物组合施用，施用时间，待成像的组织和其中携带的物理递送系统。如本领域普通技术人员所理解的，试剂的有效量可以根据诸如所需的生物学终点，待递送的试剂，药物组合物的组成，靶组织或细胞等因素而变化。更具体地，术语“有效量”是指足以产生所需效果的量，例如减少或改进疾病，障碍或病症或其一种或多种症状的严重性，持续时间，进展或发作；防止疾病，障碍或病症的发展，引起疾病，障碍或病症的消退；防止与疾病，障碍或病症相关的症状的复发，发展，发作或进展，或增强或改进另一种疗法的预防或治疗效果。
术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibits)”意指在治疗受试者之前在受试者中与未治疗的对照受试者，细胞，生物途径或生物活性或与靶标(例如实体恶性肿瘤的生长)相比，减少，抑制，减弱，降低，阻止或稳定疾病，障碍或病症的发展或进展，生物途径的活性或生物活性，例如实体恶性肿瘤的生长，例如至少10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，98%，99%，或甚至100%。术语“减少”是指抑制，压制，减弱，降低，阻止或稳定癌症疾病，障碍或病症的症状。应当理解，尽管不排除，治疗疾病，障碍或病症并不要求完全消除与其相关的疾病，障碍，病症或症状。
术语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过量毒性，刺激，过敏响应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物，材料，组合物和/或剂型。
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料，组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂，稀释液，赋形剂或溶剂包封材料，涉及将本发明的化合物从一个器官或身体的部分携带或运输到另一个器官或身体的部分。在与制剂的其它成分相容且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖，葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素，乙基纤维素和醋酸纤维素钠；(4)粉末黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油，山梨糖醇，甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酸酐；和(22)药物制剂中使用的其它无毒相容物质。
“药学上可接受的盐”是指化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。
术语“预防(prevent)”，“预防(preventing)”，“预防(prevention)”，“预防性治疗”等是指降低在没有疾病，障碍或病症，但有发生疾病，障碍或病症的风险或易于发生疾病，障碍或病症的受试者中发生疾病，障碍或病症的概率。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。在他们许多实施方案中通过当前公开的方法治疗的受试者理想地是人受试者，但应当理解本文所述的方法对于所有脊椎动物物种都是有效的，脊椎动物物种旨在包括在术语“受试者”中。因此，“受试者”可以包括用于医学目的，例如用于现有病症或疾病的治疗或用于预防病症或疾病发作的预防性治疗的人受试者，或用于医学，兽医目的或发展目的的动物受试者。合适的动物受试者包括哺乳动物，包括但不限于灵长类动物，例如人，猴，猿等；牛科动物，例如牛(cattle)，牛(oxen)等；绵羊科动物，例如绵羊(sheep)等；山羊科动物，例如山羊(goat)等；猪科动物，例如猪(pigs)，猪(hogs)等；马科动物，例如马，驴，斑马等；猫科动物，包括野猫和家猫；犬科动物，包括狗；兔类动物，包括兔子，野兔等；和啮齿动物，包括小鼠，大鼠等。动物可以是转基因动物。在一些实施方案中，受试者是人，包括但不限于胎儿，新生儿，婴儿，青少年和成人受试者。此外，“受试者”可以包括患有或怀疑患有病症或疾病的患者。
术语“有需要的受试者”是指被识别为需要疗法或治疗的受试者。
术语“全身施用(systemic administration)”，“全身施用(administeredsystemically)”，“外周施用(peripheral administration)”和“外周施用(administeredperipherally)”是指将化合物，药物或其它材料以除了直接外的方式施用到中枢神经系统，使其进入患者的系统且因此，进行代谢和其它类似过程，例如皮下施用。
术语“治疗剂”或“药剂”是指能够对宿主具有所需生物学作用的试剂。化学治疗剂和基因毒性剂是与生物学相反，通常已知是化学来源的或分别通过特定的作用机制引起治疗效果的治疗剂的实例。生物来源的治疗剂的实例包括生长因子，激素和细胞因子。多种治疗剂是本领域已知的，且可以通过它们的作用来识别。某些治疗剂能够调节细胞增殖和分化。实例包括化学治疗核苷酸，药物，激素，非特异性(例如非抗体)蛋白，寡核苷酸(例如结合靶核酸序列(例如mRNA序列)的反义寡核苷酸)，肽和肽模拟物。
术语“治疗效果”是指由药理学活性物质引起的动物，特别是哺乳动物，且更特别是人类的局部或全身作用。
如本文所用的术语“治疗有效量”和“有效量”是指化合物，材料或包含本发明的化合物的组合物的量，其在动物中的至少一个细胞亚群中在适用于任何医学治疗的合理利益/风险比下有效产生一些所需的治疗效果。
术语“肿瘤”，“实体恶性肿瘤”或“赘生物”是指由细胞的异常或不受调节的生长形成的损伤。优选地，肿瘤是恶性的，例如由癌症形成的肿瘤。
上述组合物，试剂盒和检测，诊断和预后方法可用于帮助选择合适的治疗方案并识别将受益于更积极治疗的个体。
如上所述，治疗癌症的方法包括手术，免疫疗法，化学疗法，辐射疗法，化学疗法和辐射疗法的组合，或生物疗法。已经用于治疗癌症的化学治疗剂包括但不限于多柔比星(阿霉素)，顺铂，异环磷酰胺和皮质类固醇(泼尼松)。通常，这些试剂组合使用以提高其有效性。用于治疗癌症的组合包括顺铂，多柔比星，依托泊苷和环磷酰胺的组合，以及顺铂，多柔比星，环磷酰胺和长春新碱的组合。
因此，发现上述方法特别用于为早期癌症患者选择合适的治疗。在疾病早期诊断出患有癌症的大多数个体在手术和/或辐射疗法后享有长期存活而无需进一步的辅助疗法。然而，这些个体中的很大一部分将遭受疾病复发或死亡，导致一些或全部早期癌症患者应接受辅助疗法(如化学疗法)的临床推荐。本发明的方法可以识别具有早期癌症的个体的这种高风险，不良预后群体，且从而可以用于确定哪些将受益于继续和/或更积极的疗法以及治疗后的密切监测。例如，可以选择患有早期癌症且通过本文公开的方法评估为具有不良预后的个体用于更积极的辅助疗法，例如化学疗法，在手术和/或辐射治疗之后。在特定实施方案中，本发明的方法可以与标准程序和治疗联合使用以允许医生做出更明智的癌症治疗决定。
术语“对癌症疗法的响应”或“癌症疗法的结果”涉及过度增殖性障碍(例如癌症)对癌症疗法，优选对新辅助或辅助化学疗法开始后肿瘤质量和/或体积的变化的任何响应。可以评估过度增殖性障碍响应，例如针对功效或在新辅助或辅助情况中，其中可以将全身介入后肿瘤的大小与如通过CT，PET，乳房X线照片，超声波或触诊测量的初始大小和尺寸进行比较。在实体癌的活检或手术切除后，还可以通过卡尺测量或肿瘤的病理检查来评估响应。可以以定量方式如肿瘤体积百分比变化或以定性方式如“病理完全响应”(pCR)，“临床完全缓解”(cCR)，“临床部分缓解”(cPR)，“临床稳定疾病”(cSD)，“临床进展性疾病”(cPD)或其它定性标准记录响应。过度增殖性障碍响应的评估可以在新辅助或辅助疗法开始后早期进行，例如在几小时，几天，几周后或优选在几个月后进行。响应评估的典型终点是新辅助化学疗法终止时或手术除去残留的肿瘤细胞和/或肿瘤床时。这通常是在新辅助疗法开始后三个月。在一些实施方案中，本文所述治疗性治疗的临床功效可通过测量从疗法结束至少6个月的某时间点的临床受益率(CBR)来确定。临床受益率通过确定完全缓解(CR)的患者的百分比，部分缓解(PR)的患者的数量和患有稳定疾病(SD)的患者的数量的总和来测量。该公式的简写是CBR = CR + PR + SD(6个月中)。在一些实施方案中，特定癌症治疗方案的CBR为至少25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%或更多。
用于评估对癌症疗法的响应的其它标准与“存活”有关，其包括以下所有：存活直至死亡，也称为总存活(其中所述死亡可以与病因无关或与肿瘤相关)；“无复发存活”(其中术语复发应包括局部和远处复发二者)；无转移存活；无疾病存活(其中术语疾病应包括癌症和与之相关的疾病)。所述存活的长度可以通过参考限定的起始点(例如，诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如，死亡，复发或转移)来计算。此外，治疗功效的标准可以扩展以包括对化学疗法的响应，存活概率，给定时间段内转移的概率以及肿瘤复发的概率。例如，为了确定适当的阈值，可以将特定的癌症治疗方案施用到受试者群体且结果可以与在施用任何癌症疗法之前确定的本文所述的一个或多个SNP或indels的副本数，表达水平，活动水平等关联。结果测量可以是对新辅助设置中给予的疗法的病理响应。或者，对于已知测量值的癌症疗法后的受试者，可以在一段时间内监测结果测量，例如总存活和无疾病存活。在某些实施方案中，向每个受试者施用相同剂量的癌症治疗剂。在相关的实施方案中，施用的剂量是本领域已知的癌症治疗剂的标准剂量。监测受试者的时间段可以变化。例如，可以监测受试者至少2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，45，50，55，或60个月。结果还可以通过“风险比”(一个患者组与另一个的死亡率之比；提供在某个时间点的死亡概率)，“总存活”(OS)和/或“无进展存活”来测量。在某些实施方案中，预后包括1年，2年，3年，4年或任何其它合适时间点的总存活率的概率。通过本领域已知的技术测量与本发明所有方面的不良结果的预后相关的显著性。例如，可以通过计算优势率来测量显著性。在另一个实施方案中，显著性通过百分比来测量。在一个实施方案中，当优势率为0.8或更小或至少约1.2，包括但不限于：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0和40.0时，测量不良结果的显著风险。在另一个实施方案中，相对于相关结果(例如准确性，灵敏性，特异性，5年存活，10年存活，无转移存活，阶段预测等)，风险的显著增加或降低为至少约20%，包括但不限于约25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%和更大，或其间的任何范围。在另一个实施方案中，风险的显著增加为至少约50%。因此，本发明进一步提供对癌症患者作出治疗决定的方法，包括根据本发明的不同方面和实施方案进行预测癌症患者，且然后根据其它已知临床和病理危险因素对结果进行权衡的方法，以确定癌症患者的治疗过程。例如，通过本发明的方法显示通过组合化学疗法治疗具有增加的不良结果风险的癌症患者可以用更积极的疗法治疗，包括但不限于辐射疗法，外周血干细胞移植，骨髓移植，或临床研究中的新型或实验性疗法。另外，应当理解，可以根据增强的灵敏性和/或特异性标准通过本文描述的方法预测癌症疗法响应。例如，灵敏性和/或特异性可以是至少0.80，0.81，0.2，0.83，0.84，0.85，0.86，0.87，0.88，0.89，0.90，0.91，0.92，0.93，0.94，0.95，0.96，0.97，0.98，0.99或更高，其间的任何范围，或灵敏性和特异性各自的任何组合。
术语“致敏”是指以允许用癌症疗法(例如，化学疗法或辐射疗法)更有效地治疗相关癌症的方式改变癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方案中，正常细胞不受影响的程度导致正常细胞被癌症疗法(例如，化学疗法或辐射疗法)过度损伤。根据用于下文所述的特定治疗和方法的本领域已知方法测量对治疗性治疗的增加灵敏性或降低灵敏性，包括但不限于细胞增殖测定(Tanigawa N, Kern D H, Kikasa Y, Morton D L, Cancer Res 1982；42:2159-2164)，细胞死亡测定(Weisenthal L M, Shoemaker R H, Marsden J A, Dill P L,Baker J A, Moran E M, Cancer Res 1984；94: 161-173；Weisenthal L M, Lippman ME, Cancer Treat Rep 1985；69: 615-632；Weisenthal L M, In: Kaspers G J L,Pieters R, Twentyman P R, Weisenthal L M, Veerman A J P, eds. Drug Resistancein Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers, 1993:415-432；Weisenthal L M, Contrib Gynecol Obstet 1994；19: 82-90)。还可以通过测量一段时间(例如对于人为6个月且对于小鼠为4-6周)内的肿瘤大小减少来测量动物中的灵敏性或抗性。与不存在这种组合物或方法的治疗灵敏性或抗性相比，如果治疗灵敏性增加或抗性降低为25%或更多，例如30%，40%，50%，60%，70%，80%或更高，组合物或方法使对治疗性治疗的响应致敏2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，15倍，20倍或更多。对治疗性治疗的灵敏性或抗性的确定在本领域是常规的且在普通熟练的临床医生的技能范围内。应当理解，本文描述的用于增强癌症疗法功效的任何方法可以同样地应用于使过度增殖或其它癌细胞(例如，抗性细胞)对癌症疗法敏感的方法。
术语“存活”包括以下所有：存活直至死亡，也称为总存活(其中所述死亡可与病因无关或与肿瘤相关)；“无复发存活”(其中术语复发应包括局部和远处复发)；无转移存活；无疾病存活(其中术语疾病应包括癌症和与其相关的疾病)。所述存活的长度可以通过参考限定的起始点(例如诊断时间或治疗开始时间)和终点(例如死亡，复发或转移)来计算。此外，治疗功效的标准可以扩展以包括对化学疗法的响应，存活概率，给定时间段内转移的概率以及肿瘤复发的概率。
本发明进一步提供预防，延迟，减少和/或治疗癌症(包括癌性肿瘤)的新型治疗方法。在一个实施方案中，治疗方法包括向受试者(例如，有需要的受试者)单独施用有效量的双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack)或rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG。有需要的受试者可以包括，例如，已被诊断患有肿瘤(包括癌前肿瘤，癌症)的受试者，或已经治疗的受试者，包括对先前治疗难以治疗的受试者。
本发明的方法可用于治疗任何癌性或癌前肿瘤。在某些实施方案中，癌性肿瘤可位于选自脑，结肠，泌尿生殖器，肺，肾，前列腺，胰腺，肝，食道，胃，造血(hematopoietic)，乳腺，胸腺，睾丸，卵巢，皮肤，骨髓和/或子宫组织。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗任何癌症。可通过本发明的方法和组合物治疗的癌症包括但不限于来自膀胱，血液，骨，骨髓，脑，乳腺，结肠，食道，胃肠，牙龈，头，肾，肝，肺，鼻咽，颈部，卵巢，前列腺，皮肤，胃，睾丸，舌头或子宫的癌细胞。另外，癌症可具体地具有以下组织学类型，但不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化癌；巨大和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌；恶性类癌；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；和恶性母细胞瘤(roblastoma)；支持细胞癌；恶性睾丸间质细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；肉瘤；恶性间质瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾癌；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；原纤维星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；类肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；大细胞弥漫性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样真菌病；其它指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜酸粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。
本文所述的组合物可通过任何合适的施用途径递送，包括口服，经鼻，透粘膜，眼，直肠，阴道内，肠胃外，包括肌肉内，皮下，髓内注射，以及鞘内，直接心室内，静脉内，关节内，胸骨内，滑膜内，肝内，病灶内，颅内，腹膜内，鼻内或眼内注射，脑池内，局部，如通过粉末，软膏或滴剂(包括眼药水)，包括口腔和舌下，透皮，通过吸入喷雾，或本领域已知的其它递送模式。
如本文所用的术语“全身施用(systemic administration)”，“全身施用(administered systemically)”，“外周施用(peripheral administration)”和“外周施用(administered peripherally)”是指单独包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))或rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG的组合物的施用，使得它进入患者的系统，且因此进行代谢和其它类似过程。
如本文所用的术语“肠胃外施用(parenteral administration)”和“胃肠外施用(administered parenterally)”是指除肠内和局部施用外的施用方式，通常通过注射，且包括但不限于静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，眼内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，包膜下，蛛网膜下，椎管内和胸骨内注射，肿瘤内注射和输注。
在某些实施方案中，通常(例如，经由口服或肠胃外施用)递送药物组合物。在某些其它实施方案中，药物组合物通过直接注射到肿瘤中或直接注射到肿瘤的血液供应(例如，动脉或静脉血液供应)中局部递送。在一些实施方案中，药物组合物通过一般和局部施用二者递送。例如，可以通过将含有本文所述的组合物的组合物直接注射到肿瘤或肿瘤的血液供应中与口服施用本发明的药物组合物组合治疗患有肿瘤的受试者。如果使用局部和一般施用二者，则可以在一般施用之前，同时和/或之后进行局部施用。
在某些实施方案中，本发明的治疗方法，包括治疗癌性或癌前肿瘤，包括将本文所述的组合物与第二试剂和/或疗法组合施用到受试者。“与......组合”是指单独的双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))或rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG与一种或多种治疗剂同时，顺序或其组合进行施用。因此，施用单独包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))或rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG的组合物和/或治疗剂的组合的受试者可以在相同时间(即，同时)或在不同时间(即在同一天或不同天，以任一顺序，顺序地)接收包含如本文所述的双病毒包装系统的组合物和一种或多种治疗剂，只要在受试者中实现两种试剂组合的效果。当顺序施用时，可以在彼此的1，5，10，30，60，120，180，240min或更长内施用试剂。在其它实施方案中，顺序施用的试剂可以在彼此的1，5，10，15，20天或更多天内施用。
当组合施用时，引起特定生物响应的每种试剂的有效浓度可以小于单独施用时每种试剂的有效浓度，从而允许相对于如果试剂作为单一试剂施用将需要的剂量，一种或多种试剂的剂量减小。多种试剂的作用可以但不必是加和或协同。可以多次施用试剂。在这种组合疗法中，第一施用试剂的治疗效果不会因后续试剂的顺序，同时或分开施用而减少。
在某些实施方案中，这种方法包括将包含本文所述的组合物的药物组合物与一种或多种化学治疗剂和/或清除剂化合物(包括本文所述的化学治疗剂)以及本领域已知的其它试剂联合施用。联合疗法包括以当施用后续化合物时，施用的包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))的组合物的治疗效果并未完全消失的方式顺序，同时和分开或共同施用组合物。在一个实施方案中，第二试剂是化学治疗剂。在另一个实施方案中，第二试剂是清除剂化合物。在另一个实施方案中，第二试剂是辐射疗法。在另一个实施方案中，除组合物外还可以施用辐射疗法。在某些实施方案中，第二试剂可以在单独的药物组合物中共同配制。
在一些实施方案中，本发明的主题药物组合物将以足以向患者递送治疗有效量的作为预防性或治疗性治疗的一部分的掺入的治疗剂或其它材料的量掺入待递送的一种或多种物质。颗粒中活性化合物的所需浓度将取决于药物的吸收，失活和排泄速率以及化合物的递送速率。应当注意，剂量值也可随待缓解的病症的严重性而变化。应进一步理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整特定剂量方案。通常，剂量将使用本领域技术人员已知的技术确定。
剂量可以基于单独包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))或rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG的组合物的量，每kg体重患者。例如，考虑一系列量的组合物或包封在其中的化合物，包括约0.001，0.01，0.1，0.5，1，10，15，20，25，50，75，100，150，200 or 250 mg或更多这种组合物每kg患者体重。其它量是本领域技术人员已知的且容易确定。
在某些实施方案中，单独包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))或rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG的组合物的剂量将通常为约0.001mg至约250mg/kg体重范围，特别是约50mg至约200mg/kg范围，且更具体地约100mg至约200mg/kg范围。在一个实施方案中，剂量为约150mg至约250mg/kg范围。在另一个实施方案中，剂量为约200mg/kg。
在一些实施方案中，单独包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))或rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG的组合物在药物组合物中的摩尔浓度将小于或等于约2.5 M，2.4 M，2.3 M，2.2 M，2.1 M，2 M，1.9 M，1.8 M，1.7 M，1.6 M，1.5 M，1.4 M，1.3 M，1.2 M，1.1 M，1 M，0.9 M，0.8 M，0.7 M，0.6 M，0.5 M，0.4 M，0.3 M或0.2 M。在一些实施方案中，单独包含双病毒包装系统(即，rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))或rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG的组合物的浓度将小于或等于约0.10 mg/ml，0.09 mg/ml，0.08 mg/ml，0.07 mg/ml，0.06 mg/ml，0.05 mg/ml，0.04 mg/ml，0.03 mg/ml或0.02 mg/ml。
可以改变本发明的组合物中活性成分的实际剂量水平，以便在对患者没有毒的情况下获得有效获得特定患者、组合物和施用方式的所需治疗响应的活性成分的量。
所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所用制剂中特定治疗剂或其酯，盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，排泄或代谢的速率。使用的特定治疗剂的排泄或代谢速率，治疗的持续时间，与所用特定化合物组合使用的其它药物，化合物和/或材料，所治疗患者的年龄，性别，体重，病症，一般健康和既往病史，以及医学领域中众所周知的因素。
具有本领域普通技能的医生或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于为了实现期望治疗效果所需的水平开出和/或施用药物组合物中采用的本发明的化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到期望的效果。
通常，本发明的化合物的合适日剂量是化合物的量，其是有效产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量将通常取决于上述因素。
如果需要，活性化合物的有效日剂量可以作为在一天中以适当的间隔分开施用的两个，三个，四个，五个，六个或更多个亚剂量，任选地以单位剂型施用。
施用的确切时间和在给定患者中将产生最有效治疗的任何特定化合物的量将取决于特定化合物的活性，药代动力学和生物利用度，患者的生理状况(包括年龄，性别，疾病类型和阶段，一般身体状况，对给定剂量和药物类型的响应性)，施用途径等。本文提供的指南可用于优化治疗，例如，确定最佳时间和/或施用量，这将仅需要常规实验，包括监测受试者和调整剂量和/或时间。
在治疗受试者时，可以通过在24小时时间期间的预定时间测量一个或多个相关指数来监测患者的健康。治疗的所有方面，包括施用和配制的补充、量、次数可以根据这种监测的结果优化。可以定期重新评估患者以通过测量相同参数来确定改进程度，第一次这样的重新评估通常发生在疗法开始后四周结束时，且后续的重新评估在疗法期间每四至八周且然后每三个月进行。疗法可能持续数月或甚至数年，最少一个月是人类的疗法的典型时长。例如，可以基于这些重新评估来调整所施用的试剂的量和施用时间。
可以用小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，剂量可以通过小增量增加，直到达到最佳治疗效果。
如上所述，单独包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))或rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG的组合物可以与辐射疗法组合施用。可以作为每日剂量给予受试者优化剂量的辐射疗法。辐射疗法的优化的每日剂量可以是，例如，约0.25至0.5Gy，约0.5至1.0Gy，约1.0至1.5Gy，约1.5至2.0Gy，约2.0至2.5Gy，和约2.5至3.0Gy。示例性每日剂量可以是例如约2.0至3.0Gy。例如，如果肿瘤对较低剂量的辐射具有抗性，则可以施用更高剂量的辐射。高剂量的辐射可以达到例如4Gy。此外，在治疗过程中施用的总辐射剂量可以是例如约50至200Gy范围。在一个示例性实施方案中，在治疗过程中施用的总辐射剂量是例如约50至80Gy范围。在某些实施方案中，可以在例如1，2，3，4或5min的时间间隔内给予辐射剂量，其中时间量取决于辐射源的剂量率。
在某些实施方案中，可以施用每日剂量的优化辐射，例如，每周4或5天，持续约4至8周。在备选实施方案中，每日剂量的优化辐射每日施用7天(一周)，持续约4至8周。在某些实施方案中，每日剂量的辐射可以给予单剂量。或者，每日剂量的辐射可以作为多个剂量给出。在另一个实施方案中，优化的辐射剂量可以是比患者每日可耐受的更高剂量的辐射。因此，可以向患者施用高剂量的辐射，但在较低频率的投配方案中。
可用于癌症治疗的辐射类型在本领域中是公知的且包括电子束，来自线性加速器或来自辐射源例如钴或铯，质子和中子的高能光子。示例性电离辐射是x射线辐射。
施用辐射的方法是本领域熟知的。示例性方法包括但不限于外部束辐射，内部束辐射和辐射性药物。在外部束辐射中，线性加速器用于将高能x射线递送到受癌症影响的身体区域。由于辐射源来自身体外部，外部束辐射可用于以均匀辐射剂量治疗身体的大区域。内部辐射疗法，也称为近距离辐射疗法，涉及将高剂量的辐射递送到身体中的特定部位。两种主要类型的内部辐射疗法包括间隙辐射，其中辐射源放置在受影响的组织中，以及腔内辐射，其中辐射源放置在距受影响的区域短距离的体内腔中。辐射性材料也可通过附着于肿瘤特异性抗体而递送至肿瘤细胞。内部辐射疗法中使用的辐射性材料通常包含在小胶囊，丸剂，线，管或植入物中。相反，辐射性药物是可以口服，静脉内或直接给予体腔中的未密封的辐射源。
辐射疗法还可以包括立体定向手术或立体定向辐射疗法，其中可以使用线性加速器或伽马刀和三维适形辐射疗法(3DCRT)将精确量的辐射递送到小肿瘤区域，三维适形辐射疗法是计算机辅助疗法以在辐射治疗之前绘制肿瘤的位置。
主题化合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的例如用于测定LD50和ED50的标准药学程序测定。表现出大治疗指数的组合物是优选的。在一些实施方案中，LD50(致死剂量)可以测量且对于包含本文描述的双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))的组合物，相对于单独的rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG可以是例如至少10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，200%，300%，400%，500%，600%，700%，800%，900%，1000%或更多减少。类似地，可以测量ED50(即，实现症状的半数最大抑制的浓度)且对于包含本文描述的双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))的组合物，相对于单独的rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG可以是例如至少10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，200%，300%，400%，500%，600%，700%，800%，900%，1000%或更多增加。而且，类似地，可以测量IC50(即，实现对癌细胞的半数最大细胞毒性或细胞抑制作用的浓度)且对于包含本文描述的双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))的组合物，相对于单独的rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG可以是例如至少10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，200%，300%，400%，500%，600%，700%，800%，900%，1000%或更多增加。尽管可以使用表现出毒副作用的化合物，但应当注意设计将化合物靶向所需部位的递送系统，以减少副作用。
在一些实施方案中，当前公开的方法在测定中产生至少约10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，或甚至100%的癌细胞生长的抑制。
在任何上述方法中，施用包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))的组合物可导致与施用包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))的组合物之前的实体恶性肿瘤相比，在受试者中的实体恶性肿瘤中至少约10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，或甚至100%减少。
在一些实施方案中，预防性施用治疗有效量的包含双病毒包装系统(即rAAV(例如，rAAV-Onco-CRISPR或rAAV-TSG)和Ad-rAAVpack))的组合物以防止在受试者中形成实体恶性肿瘤。
在一些实施方案中，受试者是人。在其它实施方案中，受试者是非人的，例如哺乳动物。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。任何补充剂或可替代地其中任何组分的剂量优选在毒性很小或没有毒性的包括ED50的循环浓度范围内。剂量可在取决于所用的剂型和所用的施用途径的此范围内变化。对于本发明的试剂，最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中测定的IC50。这些信息可用于更准确地确定人中的有用剂量。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。
IV. 一般定义
尽管本文采用特定术语，但它们仅以一般性和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与当前所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
根据长期存在的专利法惯例，术语“一”，“一个”和“该”在本申请(包括权利要求)中使用时指的是“一个或多个”。因此，例如，对“受试者”的提及包括多个受试者，除非上下文明显相反(例如，多个受试者)，等等。
在整个说明书和权利要求书中，术语“包含(comprise)”，“包含(comprises)”和“包含(comprising)”以非排他性的意义使用，除非上下文另有要求。同样地，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中的项目的叙述不排除可以替换或添加到所列项目的其它类似项目。
为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有说明，否则表示说明书和权利要求中使用的数量，大小，尺寸，比例，形状，制剂，参数，百分比，参数，数量，特征和其它数值的所有数字，应理解为在所有情况下都用术语“约”修饰，即使术语“约”可能没有明确地以值，数量或范围出现。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数不是且不必是精确的，而是可以根据需要近似和/或更大或更小，反映公差，转换因子，四舍五入，测量误差等，以及本领域技术人员已知的其它因素，取决于试图通过当前公开的主题获得的所需性质。例如，当提及值时，术语“约”可以意味着包括从指定量的变化，在一些实施方案中±100%，在一些实施方案中±50%，在一些实施方案中±20%，在一些实施方案中±10%，在一些实施方案中±5%，在一些实施方案中±1%，在一些实施方案中±0.5%，且在一些实施方案中±0.1%，因为这样的变化适合于实施所公开的方法或采用所公开的组合物。
此外，当与一个或多个数字或数值范围结合使用时，术语“约”应理解为指代所有这样的数字，包括范围中的所有数字并通过扩展阐述的数值上方和下方的边界来修改该范围。由端点表述的数值范围包括所有数字，例如整数，包括包含在该范围内的其分数(例如，1至5的叙述包括1，2，3，4和5，以及其分数，例如，1.5，2.25，3.75，4.1等)，以及该范围内的任何范围。
例证
包括以下实施例为本领域普通技术人员实施当前公开的主题的代表性实施方案提供指导。鉴于本公开和本领域的一般技术水平，本领域技术人员可以理解，以下实施例仅旨在是示例性的，且可以采用许多变化、修改和变更而不脱离当前公开的主题的范围。以下合成描述和具体实施例仅预期用于说明的目的，且不应解释为以任何方式限制通过其它方法制备本公开的化合物。
实施例1
用于体内复制治疗性腺相关病毒的双病毒包装系统
背景：重组腺相关病毒(rAAV)是组织特异性体内基因疗法的优选载体。这些致密病毒是非致病性的且可以高效地感染增殖性和静止性细胞群二者。野生型AAV属于Dependoparvovirus属，且最初在腺病毒(Ad)感染的细胞中发现。这些简单的病毒只包含两个基因，rep和cap(图1)。AAV感染周期所需的剩余基因由Ad反式提供。在治疗性rAAV的设计中，野生型病毒基因被转基因取代。因此，rAAV必须在体外包装。在标准rAAV包装系统中，通过包装细胞系293提供几种所需的反式因子，该细胞系最初通过用腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞产生。其余的反式因子(包括AAV rep和cap基因)在质粒上递送，所述质粒与病毒转基因构建体一起共转染。保留在“gutless”rAAV中的唯一病毒遗传元件是两个反向末端重复(ITR)。因此，通过体外包装产生的感染性病毒颗粒是复制缺陷的。
转基因可以通过rAAV有效地递送到组织，但这是“一次性”过程；在注射部位附近没有产生新的病毒。对于很多应用，单次施用rAAV可以修饰足以实现显著临床响应的靶细胞比例。对于其它应用，可以通过单次rAAV处理修饰的细胞比例可能不足以实现期望的响应。该限制与rAAV对抗肿瘤疾病的治疗用途特别相关，在肿瘤疾病中组织是无序的且靶细胞的数量趋于增加。
本文提供一种病毒系统，其中治疗性rAAV可以在体内迭代复制。该系统的核心是腺病毒5的新衍生物，称为Ad-rAAVpack，其中来自野生型AAV的rep和cap基因取代Ad E3基因(图2)。Ad E3通常起到使病毒逃避宿主免疫响应的作用，但不是裂解感染和AAV包装所必需的。因为rep-cap盒仅比E3基因大~lkb，Ad-rAAVpack的总大小完全在公布的Ad包装容量内。
Ad-rAAVpack具有复制和包装伴侣rAAV所需的所有反式元件。因此，用Ad-rAAVpack和治疗性rAAV共同感染靶组织将允许rAAV在体内增殖，潜在地提高转基因递送的效率。最终，双重感染的程度可能受宿主免疫响应的限制。
实施例2
方法
质粒构建：为了产生H1双向构建体，将人密码子优化的Cas9基因和SV40终止子与230bpH1启动子融合，其中内源性地发现pol II转录物(负链)。在H1启动子和gRNA支架之间，AvrII位点被工程化以允许插入靶序列。然后将SV40[rev]::hcas9[rev]::H1::gRNA支架::pol III终止子序列克隆到NdeI/XbaI消化的pUC19载体中。为了产生本研究中使用的各种gRNA，重叠寡聚物通过使用两步扩增Phusion Flash DNA聚合酶(Thermo FisherScientific，Rockford，IL)的PCR退火和扩增，且随后使用与2倍体积的25%PEG和1.5M NaCl混合的羧酸酯修饰的Sera-Mag磁珠(Thermo Fisher Scientific)纯化。然后将纯化的PCR产物重悬于H2O中，并使用NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)定量。gRNA表达的构建体使用略有修改的Gibson Assembly(New England Biolabs, Ipswich, MA)(Gibson等人.(2009) Nature Methods 6:343-345)产生。总反应体积从20μl减少到2μl。
人胚肾(HEK)细胞系293T(Life Technologies, Grand Island, NY)在用10%胎牛血清(Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY)和2mM GlutaMAX(Invitrogen)补充的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)中用5% CO2/20% O2在37℃下维持。
用于基因组修饰的Surveyor测定和测序分析：对于Surveyor分析，通过在QuickExtract溶液(Epicentre, Madison, WI)中重悬细胞提取基因组DNA，在65℃下温育15min，且然后在98℃下温育10 min。使用DNA Clean and Concentrator(Zymo Research,Irvine, CA)清洁提取溶液，并通过NanoDrop(Thermo Fisher Scientific)定量。使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)从100ng基因组DNA扩增CRISPR靶位点周围的基因组区域。合并多个独立的PCR反应并使用Qiagen MinElute Spin柱遵循制造商方案(Qiagen, Valencia, CA)纯化。在12.5mM Tris-HCl(pH 8.8)，62.5mM KCl和1.875mMMgCl2中含有400 ng PCR产物的8μl体积变性并缓慢再退火以允许形成异源双链体：95℃持续10min，95℃至85°C以-1.0°C/秒降温，85°C持续1秒，85°C至75°C以-1.0°C/秒降温，75°C持续1秒，75°C至65°C以-1.0°C/秒降温，65°C持续1秒，65°C至55°C以-1.0°C/秒降温，55°C持续1秒，55°C至45°C以-1.0°C/秒降温，45°C持续1秒，45°C至35°C以-1.0°C/秒降温，35°C持续1秒，35°C至25°C以-1.0°C/秒降温，且然后保持在4°C。将1μl Surveyor Enhancer和1μl Surveyor核酸酶(Transgenomic, Omaha, NE)加入到每个反应中，在42℃下温育60min，之后，将1μl终止溶液加入到反应中。使用DNA 1000芯片(Agilent，Santa Clara，CA)在2100生物分析仪上定量1μl反应。对于凝胶分析，将2μl的6X上样缓冲液(New England Biolabs)加入到剩余的反应中并负载到含有溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶上。凝胶在Gel Logic 200成像系统(Kodak，Rochester，NY)上可视化，并使用ImageJ v. 1.46定量。NHEJ频率使用二项式衍生的方程来计算：
%基因修饰=；
其中“a”和“b”的值等于背景扣除后切割片段的积分面积，且“c”等于背景扣除后未切割的PCR产物的积分面积(Guschin等人.(2010) Methods in Molecular Biology 649:247-256)。
内部开发一种软件(http://crispr.technology)以设计与复发性致癌突变退火的独特gRNA。这些gRNA可以指导这些突变等位基因的CRISPR/Cas9介导的破坏。这些gRNA与Cas9蛋白的肿瘤内递送可以抑制具有这些突变的肿瘤的生长。以这种方式靶向的特定癌基因是：
总的来说，KRAS和PIK3CA中的这些特异性突变在肺部和整个GI中的大多数癌症中发现。在大约30%的神经胶质瘤中发现IDH1 R132突变。这些脑肿瘤对所有常规疗法形式都特别难以治愈。这些gRNA中的每一个主要靶向突变等位基因。
人H1::靶标:gRNA支架
靶标: WT KRAS
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO：11)
人H1::靶标:gRNA支架
靶标: KRAS G12C
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGTAGTTGGAGCTTGTGGCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO：12)
人H1::靶标:gRNA支架
靶标: KRAS G12D
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGTAGTTGGAGCTGATGGCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO：13)
人H1::靶标:gRNA支架
靶标: KRAS G13D
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGTAGTTGGAGCTGGTGACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO：14)
人H1::靶标:gRNA支架
靶标: WT PIK3CA
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO：15)
人H1::靶标:gRNA支架
靶标: PIK3CA E545K
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCTCTCTCTGAAATCACTAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO：16)
人H1::靶标:gRNA支架
靶标: PIK3CA E549N
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCAAGATTTTCTATGGAGTCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO：17)
人H1::靶标:gRNA支架
靶标: PIK3CA H1047R
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCCAAATGAATGATGCACGTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO：18)
参考文献
本说明书中提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献指示了当前公开的主题所属领域的技术人员的水平。所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物，专利申请，专利和其它参考文献被具体和单独地指出通过引用并入。应当理解，尽管本文提及了许多专利申请，专利和其它参考文献，但这些参考文献并不构成承认任何这些文献构成本领域公知常识的一部分。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例详细地描述了前述主题，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。

Claims (83)

1.一种预防、抑制或治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括：
(a)提供包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统，所述载体包含：
i)可操作地连接到至少一种编码核酸酶系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的启动子，其中所述gRNA与所述受试者的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种癌基因产物；
ii)可操作地连接到编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，
其中组分(i)和(ii)位于系统的相同或不同载体上，其中所述gRNA靶向并与靶序列杂交且所述核酸酶切割所述DNA分子以改变所述一种或多种基因产物的表达；
(b)向受试者施用治疗有效量的所述系统。
2.权利要求1的方法，还包括提供重组腺相关病毒包装腺病毒(Ad-rAAVpack)的步骤。
3.权利要求2的方法，其中所述Ad-rAAVpack与所述核酸酶系统同时提供或共同施用。
4.权利要求1的方法，其中所述系统是CRISPR-Cas9。
5.权利要求1的方法，其中所述系统被包装到单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
6.权利要求1的方法，其中所述腺相关病毒包装腺病毒包含腺病毒基因中的至少一个缺失。
7.权利要求6的方法，其中所述腺相关病毒包装腺病毒选自腺病毒血清型2、腺病毒血清型5或腺病毒血清型35。
8.权利要求7的方法，其中所述包装病毒是腺病毒血清型5。
9.权利要求6-8中任一项的方法，其中所述腺病毒基因选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4或L5。
10.权利要求9的方法，其中所述腺病毒基因是E3。
11.权利要求1的方法，其中所述系统使一种或多种基因产物失活。
12.权利要求1的方法，其中所述核酸酶系统切除至少一个基因突变。
13.权利要求1的方法，其中所述启动子是H1启动子。
14.权利要求13的方法，其中所述H1启动子是双向的。
15. 权利要求14的方法，其中所述H1启动子包含：
a)在至少一种编码gRNA的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件；和
b)在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件。
16.权利要求1的方法，其中所述基因组靶向核酸酶是Cas9蛋白。
17.权利要求16的方法，其中所述Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。
18.权利要求13-15中任一项的方法，其中所述启动子可操作地连接到至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个gRNA。
19.权利要求1的方法，其中所述靶序列是癌基因或肿瘤抑制基因。
20.权利要求1的方法，其中所述靶序列是包含至少一个突变的癌基因。
21. 权利要求18-20中任一项的方法，其中所述靶序列是选自Her2、PIK3CA、KRAS、HRAS、IDH1、NRAS、EGFR、MDM2、TGF-β、RhoC、AKT、c-myc、β-连环蛋白、PDGF、C-MET、PI3K-110α、CDK4、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、雌激素受体基因、孕酮受体基因、ErbB1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物1)、ErbB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)、PLK3、KIRREL、ErbB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)、TGFα、ras-GAP、Shc、Nck、Src、Yes、Fyn、Wnt、Bcl2、PyV MT抗原和SV40 T抗原的癌基因。
22.权利要求20的方法，其中所述靶序列是选自KRAS、PIK3CA或IDH1的癌基因。
23.权利要求22的方法，其中所述靶序列是癌基因，所述癌基因是KRAS。
24.权利要求23的方法，其中所述KRAS包含选自G13D、G12C或G12D的突变。
25. 权利要求23-24中任一项的方法，其中所述靶序列选自SEQ ID NO：11-14，或其组合。
26.权利要求22的方法，其中所述靶序列是癌基因，所述癌基因是PIK3CA。
27.权利要求26的方法，其中所述PIK3CA包含选自E345K、D549N或H1047R的突变。
28. 权利要求26-27中任一项的方法，其中所述靶序列选自SEQ ID NO：15-18，或其组合。
29.权利要求22的方法，其中所述靶序列是癌基因，所述癌基因是IDH1。
30.权利要求29的方法，其中所述IDH1包含R132H突变。
31. 权利要求1的方法，其中所述gRNA序列选自SEQ ID NO：1-10所示的核苷酸序列，或其组合。
32.权利要求1的方法，其中所述核酸酶系统经由全身施用来给予。
33.权利要求32的方法，其中所述全身施用选自口服、静脉内、皮内、腹膜内、皮下和肌肉内施用。
34.权利要求1的方法，其中所述核酸酶系统经肿瘤内或肿瘤周围施用。
35.权利要求1的方法，其中所述受试者用至少一种另外的抗癌剂治疗。
36.权利要求35的方法，其中所述抗癌剂选自紫杉醇、顺铂、托泊替康、吉西他滨、博来霉素、依托泊苷、卡铂、多西他赛、多柔比星、托泊替康、环磷酰胺、曲贝替定、奥拉帕尼、他莫昔芬、来曲唑和贝伐单抗。
37.权利要求1的方法，其中所述受试者用至少一种另外的抗癌疗法治疗。
38.权利要求37的方法，其中所述抗癌疗法是放射疗法、化学疗法或手术。
39.权利要求1的方法，其中所述癌症是实体瘤。
40.权利要求1的方法，其中所述癌症选自脑癌、胃肠癌、口腔癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、咽喉癌、胃癌和肾癌。
41.权利要求40的方法，其中所述癌症是脑癌。
42.权利要求1的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
43.权利要求33的方法，其中所述哺乳动物是人。
44.权利要求1的方法，其中所述受试者中的细胞增殖被抑制或减少。
45.权利要求1的方法，其中所述受试者中的恶性肿瘤被抑制或减少。
46.权利要求1的方法，其中所述受试者中的肿瘤坏死被增强或增加。
47.一种改变细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括向所述细胞中引入：
(i)包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统，所述载体包含：
a)可操作地连接到至少一种编码核酸酶系统指导RNA(gRNA)的核苷酸序列的启动子，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交；和
b)可操作地连接到编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的在细胞中可操作的调节元件，
其中组分(a)和(b)位于系统的相同或不同载体上，其中所述gRNA靶向并与所述靶序列杂交且所述核酸酶切割所述DNA分子以改变所述一种或多种基因产物的表达。
48.权利要求47的方法，还包括提供重组腺相关病毒包装腺病毒(Ad-rAAVpack)。
49.权利要求48的方法，其中所述Ad-rAAVpack与所述核酸酶系统同时提供或共同施用。
50.权利要求47的方法，其中所述系统是CRISPR-Cas9。
51.权利要求47的方法，其中所述系统被包装到单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
52.权利要求47的方法，其中所述包装病毒包含腺病毒基因中的至少一个缺失。
53.权利要求52的方法，其中所述腺相关病毒包装腺病毒选自腺病毒血清型2、腺病毒血清型5或腺病毒血清型35。
54.权利要求53的方法，其中所述腺病毒包装病毒是腺病毒血清型5。
55.权利要求52-54中任一项的方法，其中所述腺病毒基因选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4或L5。
56.权利要求55的方法，其中所述腺病毒基因是E3。
57.权利要求47的方法，其中所述系统使一种或多种基因产物失活。
58.权利要求47的方法，其中所述核酸酶系统切除至少一个基因突变。
59.权利要求47的方法，其中所述启动子是H1启动子。
60.权利要求59的方法，其中所述H1启动子是双向的。
61. 权利要求60的方法，其中所述H1启动子包含：
a)在至少一种编码gRNA的核苷酸序列的一个方向上提供转录的控制元件；和
b)在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上提供转录的控制元件。
62.权利要求47的方法，其中所述基因组靶向核酸酶是Cas9蛋白。
63.权利要求62的方法，其中所述Cas9蛋白经密码子优化以在细胞中表达。
64.权利要求59-61中任一项的方法，其中所述启动子可操作地连接到至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个gRNA。
65.权利要求47的方法，其中所述靶序列是癌基因或肿瘤抑制基因。
66.权利要求47的方法，其中所述靶序列是选自EP300、FBXW7、GATA1、GATA2、NOTCH1、NOTCH2、EXT1、EXT2、PTCH1、SMO、SPOP、SUFU、APC、AXIN1、CDH1、CTNNB1、EP300、FAM123B、GNAS、HNF1A、NF2、PRKAR1A、RNF43、SOX9、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATRX、CREBBP、DNMT1、DNMT3A、EP300、EZH2、H3F3A、HIST1H3B、IDH1、IDH2、KDM5C、KDM6A、MEN1、MLL2、MLL3、NCOA3、NCOR1、PAX5、PBRM1、SETD2、SETBP1、SKP2、SMARCA4、SMARCB1、SPOP、TET2、WT1、AR、BCOR、CREBBP、DAXX、DICER1、GATA3、IKZF1、KLF4、LMO1、PHOX2B、PHF6、PRDM1、RUNX1、SBDS、SF3B1、SRSF2、U2AF1、ABL1、BCL2、CARD11、CASP8、CCND1、CDC73、CDK4、CDKN2A、CDKN2C、CYLD、DAXX、FUBP1、MDM2、MDM4、MED12、MYC、MYCL1、MYCN、MYD88、NFE2L2、NPM1、PPM1D、PPP2R1A、RB1、TNFAIP3、TRAF7、TP53、ALK、B2M、BRAF、CBL、CEBPA、CSF1R、CIC、EGFR、ERBB2、FGFR2、FGFR3、FH、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、KIT、KRAS、MAP2K1、MAP3K1、MET、NRAS、NF1、PDGFRA、PTPN11、RET、SDH5、SDH8、SDHC、SDHD、VHL、AKT1、ALK、B2M、CBL、CEBPA、CSF1R、EGFR、ERBB2、FGFR2、FGFR3、FH、FLCN、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、GPC3、KIT、MET、NKX21、PRKAR1A、PIK3CA、PIK3R1、PDGFRA、PTEN、RET、SDH5、SDH8、SDHC、SDHD、STK11、TSC1、TSC2、TSHR、VHL、WAS、CRLF2、FGFR2、FGFR3、FLT3、JAK1、JAK2、JAK3、KIT、MPL、SOCS1、VHL、B2M、CEBPA、ERK1、GNA11、GNAQ、MAP2K4、MAP3K1、NKX21、TNFAIP3、TSHR、WAS、ACVR1B、BMPR1A、FOXL2、GATA1、GATA2、GNAS、EP300、MED12、SMAD2、SMAD4、ATM、BAP1、BLM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、BUB1B、CHEK2、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBS1、PALB2、PMS1、PMS2、RECQL4、STAG2、TP53、WRN、XPA和XPC的癌症驱动基因。
67. 权利要求64-65中任一项的方法，其中所述靶序列是选自Her2、PIK3CA、KRAS、HRAS、IDH1、NRAS、EGFR、MDM2、TGF-β、RhoC、AKT、c-myc、β-连环蛋白、PDGF、C-MET、PI3K-110α、CDK4、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、雌激素受体基因、孕酮受体基因、ErbB1(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物1)、ErbB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)、PLK3、KIRREL、ErbB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)、TGFα、ras-GAP、Shc、Nck、Src、Yes、Fyn、Wnt、Bcl2、PyV MT抗原和SV40 T抗原的癌基因。
68.权利要求18的方法，其中所述靶序列是选自KRAS、PIK3CA或IDH1的癌基因。
69.权利要求68的方法，其中所述靶序列是癌基因，所述癌基因是KRAS。
70.权利要求69的方法，其中所述KRAS包括选自G13D、G12C或G12D的突变。
71. 权利要求69-70中任一项的方法，其中所述靶序列选自SEQ ID NO：11-14，或其组合。
72.权利要求66的方法，其中所述靶序列是癌基因，所述癌基因是PIK3CA。
73.权利要求70的方法，其中所述PIK3CA包含选自E345K、D549N或H1047R的突变。
74. 权利要求70-71中任一项的方法，其中所述靶序列选自SEQ ID NO：15-18，或其组合。
75.权利要求66的方法，其中所述靶序列是癌基因，所述癌基因是IDH1。
76.权利要求73的方法，其中所述IDH1包含R132H突变。
77. 权利要求47的方法，其中所述gRNA序列选自SEQ ID NO：1-10所示的核苷酸序列，或其组合。
78.权利要求47的方法，其中所述一种或多种基因产物的表达被降低。
79.权利要求47的方法，其中所述细胞是真核或非真核细胞。
80.权利要求79的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。
81.权利要求80的方法，其中所述真核细胞是癌细胞。
82.权利要求47的方法，其中所述细胞中的细胞增殖被抑制或减少。
83.权利要求47的方法，其中所述细胞中的细胞凋亡被增强或增加。
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