CN110772646A - 共载多烯紫杉醇与crispr/cas9脂质体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9脂质体及应用。构建针对E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，并能有效阻断E6和E7基因表达从而诱导抑癌基因P53的表达；制备共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体，加入宫颈癌症细胞Hela细胞中，检测效果。本发明将传统的化疗药物多烯紫杉醇与目前热门的基因疗法CRISPR/Cas系统，共同用于宫颈癌症的治疗，可以有效降低化疗药物的耐药性，通过协同/联合治疗效应提高宫颈癌症治疗效果。

Description

共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9脂质体及应用
技术领域
本发明涉及一种用于宫颈癌症的治疗的共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体，属生物技术和医药技术领域。
背景技术
子宫颈癌是全球发病率位居第二的女性恶性肿瘤，仅次于乳腺癌。高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染已被确定是子宫颈癌的致病因素，特别是病毒的早期基因E6、E7的表达产物在宫颈上皮细胞的恶性转化和恶性表型维持中都起着最重要的作用。同时表达高危型HPV的宫颈癌细胞株在阻断E6、E7的情况下会发生恶性表型的逆转，同时会增加抑癌基因P53的表达，诱导癌细胞凋亡。
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来消除入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链RNA。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，引导Cas9对DNA的进行定点切割，从而阻断基因表达，CRISPR/Cas系统具有操作简单，剪切效率高等特点。
多烯紫杉醇是近年国际市场上最热门的抗癌药物，被认为是人类未来20年间最有效的抗癌药物之一。但其在植物体中含量极低，加上紫杉本身资源贫乏，因此开发利用受限。另外，尽管多烯紫杉醇的化学合成已经完成，但由于需要的条件严格，产量低，经费高，不具有产业意义。因此有效利用现有多烯紫杉醇具有重要意义。
为克服传统化疗在临床抗肿瘤治疗中的局限性，联合用药策略作为一种新的抗肿瘤治疗方法被应用。它是基于协同递送纳米颗粒系统，将化疗药物与CRISPR/Cas系统等其他治疗方法相结合。纳米颗粒可以同时将两种或两种以上的药物共同递送到肿瘤区域，从而通过协同/联合治疗效应提高肿瘤治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于宫颈癌症的治疗的共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体。
本发明的技术方案包括：
一种共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体的制备方法，构建针对宫颈癌症细胞E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，与化疗药物多烯紫杉醇协同/联合作用提高宫颈癌症的治疗效果；同时应用阳离子脂质材料(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺包载化疗药物多烯紫杉醇以及针对宫颈癌症细胞E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，即得共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体。
共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建针对宫颈癌症细胞E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，命名为E6E7；
(2)使用薄膜分散法，以阳离子脂质材料(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)包载化疗药物多烯紫杉醇(DOC)，以载药DOTAP包载针对宫颈癌症细胞E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，即得脂质体DOTAP@E6E7+DOC；
(3)将DOTAP@E6E7+DOC加入宫颈癌症细胞中，CRISPR/CAS9阻断E6和E7基因表达从而诱导抑癌基因P53的表达，同时释放多烯紫杉醇，诱导细胞发生坏死和凋亡，在阻断E6和E7的基础上发挥协同/联合抗肿瘤作用。
所述步骤(2)具体包括如下步骤：
1)在反应容器中将0.5～2mg(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)溶解在2～5ml二氯甲烷中；
2)加入0.5～2mg的多烯紫杉醇，以50～60W的功率超声完全溶解多烯紫杉醇；
3)在30～40℃真空中旋转蒸发去除二氯甲烷后形成薄膜；
4)加入0.3～0.5微克E6E7质粒，以50～60W的功率超声，使薄膜完全悬起；
5)以12,000～13,000转/分钟，离心10～20分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，即得到脂质体DOTAP@E6E7+DOC。
所述方法制备得到的脂质体。
一种共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体在制备治疗宫颈癌症药物中的应用。
本发明有益效果：将传统的化疗药物多烯紫杉醇与目前热门的基因疗法CRISPR/Cas系统，共同用于宫颈癌症的治疗，可以有效降低化疗药物的耐药性，通过协同/联合治疗效应提高宫颈癌症治疗效果。在生物技术和医药技术领域具有较大的应用情景。
附图说明
图1：脂质体DOTAP@E6E7+DOC的透射电子显微镜照片(形貌分析)；
图2：实时定量基因扩增荧光检测系统检测各药物组人宫颈癌细胞(Hela细胞)中E6/E7表达结果分析；
图3：蛋白质印迹法检测各药物组诱导人宫颈癌细胞(Hela细胞)中P53蛋白表达结果分析；
图4：MTT比色法检测各种药物组对人宫颈癌细胞(Hela细胞)的细胞毒性分析；
图5：流式细胞仪检测各种药物组诱导人宫颈癌细胞(Hela细胞)凋亡分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例中将对本发明作进一步的阐述。
1.构建针对E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒步骤如下
1.1 sgRNA寡核苷酸链合成
使用CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)根据评分系统，分别设计2个针对HPV18 E6和E7基因的20bp的sgRNA：E6-sgRNA和E7-sgRNA。编码链模板5′端添加CACC，非编码链模板3′端添加AAAC，与BsmbI酶切后形成的粘性末端互补，设计2对CRISPR寡核苷酸链。
E6和E7基因靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列
E6-sgRNA-F：5’-CACC GGCGCTTTGAGGATCCAACA-3’(SEQ ID No.1)；
E6-sgRNA-R：5’-AAAC TGTTGGATCCTCAAAGCGCC-3’(SEQ ID No.2)；
E7-sgRNA-F：5’-CACC GGAGCAATTAAGCGACTCAG-3’(SEQ ID No.3)；
E7-sgRNA-R：5’-AAAC CTGAGTCGCTTAATTGCTCC-3’(SEQ ID No.4)；
1.2载体构建
使用BsmbI酶切1～2μg CRISPR/CAS9质粒，30～60min，37℃，使用天根胶回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。将sgRNA连接至酶切后的质粒，16～25℃孵育2～16h。将连接后的质粒转化至感受态细胞中，均匀涂至氨苄抗性的LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，形成单菌落，挑取单个菌落扩大培养并质粒小提，测序鉴定质粒构建成功，命名为E6E7。
2.制备脂质体DOTAP@E6E7+DOC步骤如下
1)在反应容器中将0.5～2mg(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)溶解在2～5ml二氯甲烷中；
2)加入0.5～2mg的多烯紫杉醇，以50～60W的功率超声完全溶解多烯紫杉醇；
3)在30～40℃真空中旋转蒸发去除二氯甲烷后形成薄膜。
4)加入0.3～0.5微克E6E7质粒，以50～60W的功率超声，使薄膜完全悬起。
5)以12,000～13,000转/分钟，离心10～20分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，即得到脂质体DOTAP@E6E7+DOC。
3.脂质体DOTAP@E6E7+DOC转染Hela细胞的方法如下：
1)将脂质体DOTAP@E6E7+DOC 50～100微升加入至一24孔板或48孔板的海拉(Hela)细胞中；
2)于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24～48小时；
实施例1：
构建针对E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，具体步骤如下：
1)sgRNA寡核苷酸链合成：使用CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)根据评分系统，分别设计2个针对HPV18 E6和E7基因的20bp的sgRNA：E6-sgRNA和E7-sgRNA。编码链模板5′端添加CACC，非编码链模板3′端添加AAAC，与BsmbI酶切后形成的粘性末端互补，设计2对CRISPR寡核苷酸链。
E6和E7基因靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列
E6-sgRNA2-F：5’-CACC GAAGCTACCTGATCTGTGCA-3’(SEQ ID No.5)；
E6-sgRNA2-R：5’-AAAC TGCACAGATCAGGTAGCTTC-3’(SEQ ID No.6)；
E7-sgRNA2-F：5’-CACC GAAGAAAACGATGAAATAGA-3’(SEQ ID No.7)；
E7-sgRNA2-R：5’-AAAC TCTATTTCATCGTTTTCTTC-3’(SEQ ID No.8)；
2)载体构建：使用BsmbI酶切1μg CRISPR/CAS9质粒，60min，37℃，使用天根胶回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。将sgRNA连接至酶切后的质粒，25℃孵育2h。将连接后的质粒转化至感受态细胞中，均匀涂至氨苄抗性的LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12小时，形成单菌落，挑取单个菌落扩大培养并质粒小提，测序鉴定质粒构建成功。
实施例2：
脂质体DOTAP@E6E7+DOC的制备方法，具体步骤如下：
1)在反应容器中将0.5mg(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)溶解在2ml二氯甲烷中；
2)加入0.5mg的多烯紫杉醇，以50W的功率超声完全溶解多烯紫杉醇；
3)在40℃真空中旋转蒸发去除二氯甲烷后形成薄膜。
4)加入0.3微克E6E7质粒，以50W的功率超声，使薄膜完全悬起。
5)以12,000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍，即得到脂质体DOTAP@E6E7+DOC。
实施例3：
脂质体DOTAP@E6E7+DOC的制备方法，具体步骤如下：
1)在反应容器中将1mg(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)溶解在2ml二氯甲烷中；
2)加入1mg的多烯紫杉醇，以60W的功率超声完全溶解多烯紫杉醇；
3)在40℃真空中旋转蒸发去除二氯甲烷后形成薄膜。
4)加入0.5微克E6E7质粒，以60W的功率超声，使薄膜完全悬起。
5)以13,000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，即得到脂质体DOTAP@E6E7+DOC。
实施例4：
形态观察：取脂质体DOTAP@E6E7+DOC经离心分离后，取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于碳支持膜上制样，用2％的磷钨酸负染，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到脂质体DOTAP@E6E7+DOC直径在80～150nm范围内。所制得的脂质体DOTAP@E6E7+DOC如图1所示。
实施例5：
形态观察：取脂质体DOTAP@E6E7+DOC经离心分离后，取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于碳支持膜上制样，用5％的磷钨酸负染，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到脂质体DOTAP@E6E7+DOC直径在80～150nm范围内。所制得的脂质体DOTAP@E6E7+DOC如图1所示。
实施例6：
脂质体DOTAP@E6E7+DOC诱导人宫颈癌细胞(Hela细胞)中P53蛋白表达。用DMEM培养基配制0.1毫克每毫升的脂质体DOTAP@E6E7+DOC，并与Hela细胞于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育24小时，收集细胞。用蛋白质印迹法检测P53蛋白表达情况。检测结果显示：脂质体DOTAP@E6E7+DOC诱导人宫颈癌细胞(Hela细胞)中抑癌基因P53蛋白表达，结果如图3所示。
实施例7：
脂质体DOTAP@E6E7+DOC诱导人宫颈癌细胞(Hela细胞)死亡。用DMEM培养基配制0.1毫克每毫升的脂质体DOTAP@E6E7+DOC，并与Hela细胞于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育24小时。然后用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞存活效率。MTT检测结果显示：脂质体DOTAP@E6E7+DOC导致人宫颈癌细胞(Hela细胞)存活率降低，结果如图4所示。
实施例8：
脂质体DOTAP@E6E7+DOC诱导人宫颈癌细胞(Hela细胞)凋亡。用DMEM培养基配制0.1毫克每毫升的脂质体DOTAP@E6E7+DOC，并与Hela细胞于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育24小时。然后用细胞凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。凋亡检测结果显示：脂质体DOTAP@E6E7+DOC导致人宫颈癌细胞(Hela细胞)凋亡率升高，结果如图5所示。
本发明公开和提出的一种共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体用于宫颈癌症的治疗，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
<110> 天津大学
<120> 共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9脂质体及应用
<160> 6
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caccggcgct ttgaggatcc aaca 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaactgttgg atcctcaaag cgcc 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccggagca attaagcgac tcag 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaacctgagt cgcttaattg ctcc 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caccgaagct acctgatctg tgca 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaactgcaca gatcaggtag cttc 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caccgaagaa aacgatgaaa taga 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaactctatt tcatcgtttt cttc 24

Claims (5)

1.一种共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体的制备方法，其特征在于，构建针对宫颈癌症细胞E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，与化疗药物多烯紫杉醇协同/联合作用提高宫颈癌症的治疗效果；同时应用阳离子脂质材料(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺包载化疗药物多烯紫杉醇以及针对宫颈癌症细胞E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，即得共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体。
2.根据权利要求1所述的共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建针对宫颈癌症细胞E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，命名为E6E7；
(2)使用薄膜分散法，以阳离子脂质材料(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)包载化疗药物多烯紫杉醇(DOC)，以载药DOTAP包载针对宫颈癌症细胞E6和E7基因的CRISPR/CAS9表达质粒，即得脂质体DOTAP@E6E7+DOC；
(3)将DOTAP@E6E7+DOC加入宫颈癌症细胞中，CRISPR/CAS9阻断E6和E7基因表达从而诱导抑癌基因P53的表达，同时释放多烯紫杉醇，诱导细胞发生坏死和凋亡，在阻断E6和E7的基础上发挥协同/联合抗肿瘤作用。
3.根据权利要求1所述的共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下步骤：
1)在反应容器中将0.5～2mg(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)溶解在2～5ml二氯甲烷中；
2)加入0.5～2mg的多烯紫杉醇，以50～60W的功率超声完全溶解多烯紫杉醇；
3)在30～40℃真空中旋转蒸发去除二氯甲烷后形成薄膜；
4)加入0.3～0.5微克E6E7质粒，以50～60W的功率超声，使薄膜完全悬起；
5)以12,000～13,000转/分钟，离心10～20分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，即得到脂质体DOTAP@E6E7+DOC。
4.权利要求1-3任意一项权利要求所述方法制备得到的脂质体。
5.一种共载多烯紫杉醇与CRISPR/CAS9的脂质体在制备治疗宫颈癌症药物中的应用。
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