CN112175905B - 一种高效敲除nk细胞中cd96基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其中：sgRNA的序列选自SEQ ID NO.1～10所示序列中的任意一种。采用本发明所述方法可实现对NK细胞中CD96基因的敲除，不仅敲除效率较高，而且所获得的不表达CD96的NK细胞可解除CD155+肿瘤细胞对NK细胞的免疫抑制作用，相对于野生型NK细胞，在体内、体外实验中均展现出更强的抗肿瘤活性，明显提高了NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，可望开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂。

Description

一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法

技术领域

本发明涉及一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，属于基因编辑技术领域。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是机体重要的免疫细胞，来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞，它不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。

研究表明：虽然NK细胞具有强大的天然抗肿瘤功能，且无需肿瘤细胞抗原(靶点)预先致敏即可识别并攻击肿瘤细胞，但瘤体组织内活化NK细胞数量少、活性低是针对实体肿瘤的NK细胞免疫治疗疗效的主要障碍，尽管采用体外扩增方法可获得高数量、高纯度NK细胞，但过继输注的NK细胞只有很少部分透过毛细血管进入实体肿瘤微环境，接触并杀伤肿瘤细胞，并不能解决瘤体组织内活化NK细胞数量少这个问题；另外，研究者陆续发现TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)是新的免疫检查点之一，它与配体PVR/CD155(脊髓灰质炎病毒受体)结合可显著抑制T细胞或NK细胞的免疫应答；而CD96和TIGIT共同拥有一个受体，即PVR/CD155(脊髓灰质炎病毒受体)，在小鼠模型中敲除CD96基因可增强NK细胞的抗肿瘤活性。

尽管抗CD96抗体在动物水平的研究中展现出了理想的疗效，但目前还没有靶向CD96的药物被批准上市。

另外，基因编辑技术是研究功能基因组的重要技术手段，目前已经发展了四代基因编辑技术：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、CRISPR等，其中，CRISPR系统因其高效、廉价而被广泛应用。CRISPR/Cas9是一种来源于原核生物的新型核酸酶系统，它由导向序列sgRNA和核酸酶Cas9两种元件组成，目前采用CRISPR/Cas9系统已经成功的在人、鼠、斑马鱼、拟南芥、水稻、果蝇、家蚕等物种中实现了基因敲除，但至今未见对NK细胞中CD96基因进行敲除的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，从而获得不表达CD96的NK细胞，以提高NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，使其能开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂，为过继免疫治疗肿瘤及病毒感染性疾病(例如HIV/AIDS、新型冠状病毒肺炎/COVID-19)提供新的生物制剂。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其中：sgRNA的序列选自SEQ ID NO.1～10所示序列中的任意一种。

一种优选方案，sgRNA的序列选自SEQ ID NO.5或9或10所示序列。

一种优选方案，所述复合物中，sgRNA与Cas9蛋白的质量比为1:(3～5)。

进一步优选方案，所述复合物中，sgRNA与Cas9蛋白的质量比为1:4。

一种优选方案，所述sgRNA经过磷酸化修饰。

进一步优选方案，进行磷酸化修饰的位点为：3'端和5'端各3个硫代基和甲氧基。

一种优选方案，所述Cas9蛋白先经过大肠杆菌密码子优化，然后构建到Pet28a表达质粒骨架中。

进一步优选方案，所述Cas9蛋白具有SEQ ID NO.11所示序列。

一种实施方案，所述sgRNA的制备包括如下步骤：

a)退火，向每条sgRNA添加TAGG内切酶粘性末端上游序列及AAAC内切酶粘性末端的下游序列后一起进行退火处理；

b)线性化，将pUC57-sgRNA表达载体经过BsaI线性化；

c)连接，将退火产物连接到经过BsaI线性化的pUC57-sgRNA表达载体上，连接的载体通过转化、挑菌和鉴定后，对阳性克隆摇菌提取质粒并测定浓度；

d)PCR扩增，所用正向引物的序列为：TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG，所用反向引物的序列为：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC；

e)体外转录，利用T7转录试剂盒将sgRNA的DNA体外转录为RNA，凝胶电泳鉴定后用RNA回收。

与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：

本发明的研究结果显示：采用本发明所述方法可实现对NK细胞中CD96基因的敲除效率达到23％，不仅敲除效率较高，而且所获得的不表达CD96的NK细胞可解除CD155+肿瘤细胞对NK细胞的免疫抑制作用，相对于野生型NK细胞，在体内、体外实验中均展现出更强的抗肿瘤活性，明显提高了NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，可望开发成安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有明显的应用前景和临床应用价值，对过继免疫治疗肿瘤及病毒感染性疾病(例如HIV/AIDS、新型冠状病毒肺炎/COVID-19)具有重要意义。

附图说明

图1体现了CM137和EN138两种程序电转后NK细胞的活细胞百分比的对比情况，其中的control组为未经电转的NK细胞；

图2A体现了采用CM137程序电转不同的sgRNA/Cas9蛋白复合物后NK细胞的活细胞百分比的对比情况，其中的WT组为仅电转Cas9蛋白但未电转sgRNA的NK细胞；

图2B显示了电转靶向CD96的不同sgRNA后对CD96基因的敲除效率对比，其中的CD56是人NK细胞的表面标志物，WT组为仅电转Cas9蛋白但未电转sgRNA的NK细胞；

图3显示了电转靶向CD96的未经修饰的和经磷酸化修饰的sgRNA-10序列后，对CD96基因的敲除效率对比，其中的CD56是人NK细胞的表面标志物，WT组为仅电转Cas9蛋白但未电转sgRNA的NK细胞；

图4体现了敲除CD96基因后的NK细胞以及野生型NK细胞对H1975肺癌、HCT8结直肠癌、PC3前列腺癌、LM7骨肉瘤、HepG2肝癌、A375和色素瘤、MDA-MB-231乳腺癌、K562白血病细胞的体外杀伤活性对比；

图5体现了敲除CD96基因后的NK细胞以及野生型NK细胞，与H1975肺癌细胞或HepG2肝癌细胞体外共培养时NK细胞的脱颗粒水平对比；

图6A体现了敲除CD96基因后的NK细胞以及野生型NK细胞过继免疫治疗对肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的控制情况对比；

图6B体现了不同类型NK细胞过继免疫治疗对荷瘤小鼠体重的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，包括如下具体步骤：

一、NK细胞的扩增和培养

1)从液氮中取出冻存的人外周血单个核细胞(PBMC)，于37℃水浴迅速融化；

2)在一个新的15mL离心管中加入4mL含有10％FBS和1％青霉素/链霉素双抗的RPMI-1640完全培养液，将1mL PBMC悬液转移至15mL离心管中；

3)于室温250×g离心5min；

4)弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养液重悬细胞；

5)在一个新的75mL细胞培养瓶中加入19mL RPMI-1640培养液，将上述细胞悬液转移至培养瓶中；

6)向培养瓶中加入人重组IL-2蛋白，终浓度为200U/mL；

7)将培养瓶置于37℃、5％CO₂培养箱中，培养过夜后，将培养瓶中的PBMC进行细胞计数；

8)从液氮取出冻存的辐照EK562工程细胞，并于37℃水浴迅速融化；

9)在一个新的15mL离心管中加入4mL RPMI-1640完全培养液，将EK562细胞悬液转移至15mL离心管中；

10)于室温250×g离心5min；

11)弃去上清液，使用1mL RPMI-1640培养液重悬细胞并进行细胞计数；

12)按PBMC：EK562＝1：1的效靶比向培养瓶中加入EK562细胞；

13)将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1×10⁶个/mL范围内，根据培养液体积加入IL-2，终浓度为100U/mL；

14)培养至第7天时，将培养瓶中细胞进行计数，并按照PBMC：EK562＝1：1的效靶比向培养瓶中再次加入EK562细胞；

15)将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每两天换一次液并进行细胞计数，将细胞密度控制在0.5至1×10⁶个/mL范围内，根据培养液体积加入IL-2，终浓度为100U/mL；

16)培养至第14天后，培养瓶中NK细胞的纯度可达到95％以上。

二、sgRNA的制备

1)退火，向每条sgRNA(sgRNA的序列选自SEQ ID NO.1～10所示序列中的任意一种)添加TAGG内切酶粘性末端上游序列和加了AAAC内切酶粘性末端的下游序列后，一起通过程序(95℃，5min；95℃-85℃，-2℃/s；85℃-25℃，-0.1℃/s；保持在4℃)退火；

2)线性化，将pUC57-sgRNA表达载体(Addgene#51132)经过BsaI(NEB：R0539L)线性化，线性化体系为：pUC57-sgRNA表达载体2μg；缓冲溶液(NEB：R0539L)5μL；BsaI1μL；ddH2O补齐到50μL；

3)连接，将退火产物连接到经过BsaI线性化的pUC57-sgRNA表达载体上，连接体系为：T4连接缓冲溶液(NEB：M0202L)1μL，线性化载体20ng，退火的oligo片段(10μM)5μL，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL，ddH₂O补齐到10μL，于16℃连接一小时；连接的载体通过转化、挑菌、鉴定后对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)并测定浓度；

4)PCR扩增，所用正向引物sgRNA-F的序列为：TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG，所用反向引物sgRNA-R的序列为：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC；将含有T7启动子的sgRNA序列利用PCR扩增下来，凝胶电泳鉴定条带后用RNA-SECURE(Thermo，#AM7005)于65℃处理15分钟，然后将扩增产物回收(Axygene：AP-PCR-250G)并测定浓度；

5)体外转录，利用T7转录试剂盒(Thermo，#AM1354)将sgRNA的DNA体外转录为RNA，凝胶电泳鉴定后用RNA回收(Thermo，#AM1908)将sgRNA回收测浓度。

三、Cas9的制备和纯化

1)密码子优化，将Cas9蛋白进行大肠杆菌密码子优化，然后合成序列，并构建进Pet28a表达质粒骨架中，优化后的序列如SEQ ID NO.11所示；

2)质粒转化，将Pet28a-Cas9质粒用BL21感受态转化涂板，挑单克隆进行摇菌表达，准备2L培基在37℃、220rpm的摇床摇菌，待菌液OD值在0.6-0.8之间加IPTG 2mL(2M浓度)，诱导培养24小时后收菌；

3)收菌，将菌液高速离心：4000rpm 30min，弃上清；

4)破菌，用Buffer A将离心后的菌体吹散后，加入蛋白酶抑制剂，用高压破碎机将大肠杆菌破碎，高速离心后取上清；所述Buffer A的配方为：25mM Tris PH＝8.0，500mMNaCl，10％(v/v)甘油，0.22μM滤器过滤；

5)过柱，将破碎后的上清用0.45μM滤膜过滤后加入Buffer A润洗后的钴离子亲和层析柱(Clontech，635504)对带His标签的Cas9蛋白吸附；

6)去杂质，用40mL添加有5mM咪唑的Buffer A过柱子，以去除亲和力较低的杂质；

7)洗脱，用30mL添加有500mM咪唑的bufferA过柱子，置换出目的蛋白Cas9；

8)浓缩，Western blot鉴定后将洗脱下来的目的蛋白加入到蛋白浓缩柱中，3900rpm，20min；

9)浓缩后的蛋白进行离子交换层析(Ion exchange chromatography(IEC))，以除去与蛋白结合的核酸，然后再次浓缩，测定浓度后分装冻存备用。

四、电穿孔转染NK细胞

1)将Cas9蛋白和sgRNA以4:1的质量比混合，用枪头轻轻吹打混匀后，于室温放置15分钟；

2)准备细胞，用PBS清洗NK细胞并离心；

3)电转，用电转试剂盒(Lonza，V4XP-3032或V4XP-3024)准备电转液，用电转液将细胞和RNP(即：sgRNA与Cas9蛋白的复合物)重悬混匀后，加入电转杯中，注意不要有气泡，选择电转程序进行电转，电转后用枪头吸出液体放入提前预热的培养基中培养，最后根据需要培养进行检测。图1体现了CM137和EN138两种电转程序电转后NK细胞活细胞百分比的对比情况，由图1所示结果可见：采用CM137电转程序对细胞活性的影响更小。

实施例2

采用流式细胞术检测基因敲除效率：

1)收集野生型或敲除CD96基因后的NK细胞并使用含1％胎牛血清(FBS)的1×PBS洗涤两次；

2)用含1％FBS的PBS重悬细胞并计数，将细胞浓度调整至3×10⁶个/mL；

3)取上述细胞悬液50μL加入新的1.5mL离心管中，加入PE-anti TIGTI抗体1μL，于4℃避光孵育30min；

4)使用1％FBS 1×PBS洗涤两次；

5)用300μL 1％FBS 1×PBS重悬细胞并进行流式上机检测。

检测结果如图2A和2B所示，由图2A和2B所示结果可见：sgRNA-5、9和10具有更高的敲除效率，详见表1所示：

表1流式细胞术检测CD96敲除效率

由表1结果可见：在同等条件下，选自SEQ ID NO.5、9和10所示序列的sgRNA对NK细胞中CD96基因的敲除效率较高，且对细胞活力的影响较小。

实施例3

靶向CD96的磷酸化修饰的gRNA购自金斯瑞生物科技有限公司，具体磷酸化位点为：3'端和5'端各3个硫代基和甲氧基修饰。

CD96-10：GCTGTCTATCATCCCCAATA

由图3所示结果可见：野生型NK细胞CD56+/CD96+NK的百分率为96.5％，经磷酸化修饰的CD96-10 gRNA可将CD56+/CD96+NK细胞的百分率降低至67.4％，而未经磷酸化修饰的CD96-10 gRNA仅能降低至90.4％，表明经磷酸化修饰的sgRNA具有更好的稳定性和更强的活性，具体结果见表2所示：

表2流式细胞术检测CD96的敲除效率

名称	CD56+/CD96+NK细胞百分率(％)	敲除率(％)
			WT	96.5	0
磷酸化修饰的CD96-10	67.4	29.1
			未修饰的CD96-10	90.4	6.1

实施例4

一、生物发光法检测NK细胞体外杀伤活性

1)收集肿瘤细胞和NK细胞进行计数，向96孔板中加入肿瘤细胞，10000个/孔，终体积50μL；

2)收集野生型和敲除CD96基因后的NK细胞，计数后按NK细胞：肿瘤细胞(简记为E:T)＝0.5:1、1:1和2:1的比例，向96孔板中加入50μL NK细胞；

3)每组做三个重复孔，另设立肿瘤细胞单独培养以及NK细胞单独培养的对照孔；

4)培养24h后，每孔加入100μL

生物发光检测试剂(购自Promega公司)；

5)室温震荡1min后，静置10min，随后与酶标仪检测生物发光强度；

6)按以下公式计算NK细胞的杀伤活力：

Mean_Mix：NK细胞与肿瘤细胞共培养组的平均发光强度；

Mean_NK：NK细胞单独培养组的平均发光强度；

Mean_Tumor：肿瘤细胞单独培养组的平均发光强度。

如图4所示，野生型或敲除CD96基因后的NK细胞与肿瘤细胞共培养24小时后，通过生物发光法检测NK细胞对靶细胞的杀伤百分比，结果显示敲除CD96基因后的NK细胞相对于野生型NK细胞均具有更强的抗肿瘤活性，具体结果见表3所示：

表3敲除CD96基因后的NK细胞与野生型NK细胞的抗肿瘤活性比较

二、NK细胞脱颗粒水平检测

1)肿瘤细胞消化后进行细胞计数，将细胞浓度调整为3×10⁶个/mL；

2)取野生型或敲除CD96基因后的NK细胞，用RPMI-1640完全培养液洗涤两次并计数，将细胞浓度调整至3×10⁶个/mL；

3)取上述NK细胞100μL加入新的48孔板中，再加入100μL RPMI-1640完全培养液即为单独NK细胞组；

4)分别取上述肿瘤细胞和NK细胞各100μL，加入48孔板中，即为NK+肿瘤细胞组；

5)向上述各孔中加入5μL PE/Cy5-anti CD107A抗体或相应同型对照抗体，置于37℃、5％CO₂培养箱培养；

6)培养4h后，收集每孔细胞，并转移至新的1.5mL离心管中，使用1％FBS 1×PBS洗涤一次；

7)用50μL 1％FBS 1×PBS重悬细胞，每管加入1μL FITC-anti CD56抗体或相应同型对照抗体，于4℃孵育30min；

8)使用1％FBS 1×PBS洗涤两次，加入300μL 1％FBS 1×PBS重悬细胞并进行流式上机检测。

将野生型或敲除CD96基因后的NK细胞与肿瘤细胞进行共培养，通过流式检测NK细胞CD107A的荧光强度，可间接反映NK细胞的脱颗粒水平。CD107A阳性的NK细胞百分比越高，表明被活化的NK细胞越多，脱颗粒是NK细胞诱导肿瘤细胞死亡的重要手段之一。由图5可见，单独培养的NK细胞的CD107A的阳性百分比不超过3％，表明其处于静息状态，仅当NK细胞与肿瘤细胞共培养时，CD107A的阳性率才会大幅提高。与野生型NK细胞相比，敲除CD96基因后的NK细胞的CD107A的阳性率均显著提高，表明敲除CD96基因后的NK细胞识别和杀伤肿瘤细胞的活性更强。

三、敲除CD96基因后的NK细胞的抗肿瘤活性的体内检测

1)选取T、B和NK细胞均缺失的重症联合免疫缺陷(SCID-bg)小鼠作为荷瘤小鼠，订购小鼠均为雄性，5周龄，小鼠饲养于SPF级动物饲养室，适应性饲养一周后向其背部接种肿瘤细胞；

2)消化并收集H1975肺癌细胞，使用无血清RPMI-1640培养液重悬细胞；

3)将H1975细胞悬液浓度调整至3×10⁷个/mL；

4)取6周龄雄性SCID-Bg小鼠称重，按25mg/kg体重的剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉；

5)使用剃毛器将小鼠背部右侧靠近肩胛骨处毛发剃去，皮下注射上述细胞悬液100μL；

6)接种3天后，小鼠按体重随机分为2组，每组5只，分别接受野生型NK细胞和敲除CD96基因后的NK细胞过继免疫治疗：NK细胞经尾静脉注射给予，每只小鼠注射1×10⁷个NK细胞，每周注射1次；每3天测量一次小鼠瘤块大小，同时记录小鼠体重。

如图6A所示，经敲除CD96基因后的NK细胞(CD96-KO)治疗后，肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长受到明显抑制，经过3次NK细胞过继免疫治疗，CD96-KO组荷瘤小鼠瘤块体积较WT组缩小52％，详见表4所示：

表4荷瘤小鼠肿瘤体积

天数	WT组平均肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)	CD96-KO组平均肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)
			1	70±13	68±14
4	81±11	79±9
			7	95±11	82±23
10	164±61	110±24
			13	317±176	237±60
16	884±457	406±64

由图6A和表4结果可见：敲除CD96基因后的NK细胞在体内具有更强的抗肿瘤效应。此外，由图6B显示可见：荷瘤小鼠经NK细胞过继免疫治疗后，两组小鼠体重无明显差异，小鼠体重均随时间推移而缓慢增长，表明敲除CD96基因后的NK细胞与野生型NK细胞一样安全有效。

综上所述可见：本发明所获得的敲除CD96基因后的NK细胞在体内、体外相比普通NK细胞均具有更强的抗肿瘤活性，且敲除CD96基因后的NK细胞在体内具有良好的安全性，因此本发明所获得的敲除CD96基因后的NK细胞有望开发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有明显的应用前景和临床应用价值。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种高效敲除NK细胞中CD96基因的方法，所述方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以电穿孔转染方式将sgRNA与Cas9蛋白的复合物导入经扩增的NK细胞中，其特征在于：所述sgRNA的序列选自SEQ ID NO.5或9或10所示序列，且，所述sgRNA经过磷酸化修饰，进行磷酸化修饰的位点为：3'端和5'端各3个硫代基和甲氧基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述复合物中，sgRNA与Cas9蛋白的质量比为1:(3～5)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cas9蛋白先经过大肠杆菌密码子优化，然后构建到Pet28a表达质粒骨架中。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Cas9蛋白具有SEQ ID NO.11所示序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的制备包括如下步骤：

a)退火，向每条sgRNA添加TAGG内切酶粘性末端上游序列及AAAC内切酶粘性末端的下游序列后一起进行退火处理；

b)线性化，将pUC57-sgRNA表达载体经过BsaI线性化；

c)连接，将退火产物连接到经过BsaI线性化的pUC57-sgRNA表达载体上，连接的载体通过转化、挑菌和鉴定后，对阳性克隆摇菌提取质粒并测定浓度；

d)PCR扩增，所用正向引物的序列为：TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG，所用反向引物的序列为：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC；

e)体外转录，利用T7转录试剂盒将sgRNA的DNA体外转录为RNA，凝胶电泳鉴定后用RNA回收。

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