CN117304344B - 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 - Google Patents
一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117304344B CN117304344B CN202311595712.8A CN202311595712A CN117304344B CN 117304344 B CN117304344 B CN 117304344B CN 202311595712 A CN202311595712 A CN 202311595712A CN 117304344 B CN117304344 B CN 117304344B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fusion protein
- apn
- alpha
- seq
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 44
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 2-[3-nitro-2-(2-nitrophenyl)-4-oxochromen-8-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(C(C=2[N+]([O-])=O)=O)=C1OC=2C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108010049990 CD13 Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 4
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 abstract description 22
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 11
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 abstract description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 20
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 3
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 101150044330 apn gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003640 drug residue Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- -1 linker nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用,所述融合蛋白由氨肽酶N亲和肽、连接子、IFNα依次串联得到;所述氨肽酶N亲和肽的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示;所述连接子的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示;所述IFNα的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。本发明的融合蛋白表达量高,不仅保留干扰素广谱的抗病毒活性,还特异性的防治鸡传染性支气管炎病毒,可以降低感染病毒后鸡的发病率和死亡率。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用,属于遗传工程技术领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的急性、高度接触性病毒性传染病,主要引起雏鸡死亡、肉鸡的饲料报酬低、产蛋鸡的产蛋能力下降。该病主要通过接种疫苗进行防控,但由于疫苗交叉保护性差导致该病在免疫鸡群中仍时有发生。鸡α干扰素(IFN-α)是鸡免疫相关细胞产生的一种高活性、多功能的生物活性糖蛋白,具有抗病毒活性。鸡α干扰素抗病毒作用并不是直接杀死病毒,而是间接的通过机体细胞来发挥作用,鸡α干扰素通过自分泌或者旁分泌作用,与细胞膜表面上的特定受体结合后,引发级联性的信号放大过程,最后将信号传递到细胞核内,对一系列基因的表达进行调控,并介导各种生理生化反应。对于鸡用抗病毒生物制品来说,与传统的化学药物和疫苗相比,重组鸡IFN-α不会产生耐药性与药物残留等安全性问题。干扰素作为一种广谱抗病毒药物,如何提高干扰素的特异性抗病毒效果也将成为研究的重点。
氨肽酶N(APN)亲和肽是位于细胞表面的一种锌离子依赖的金属糖蛋白,是大多数Ⅰ型和Ⅱ型冠状病毒发生感染时的细胞受体。鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于Ⅲ型冠状病毒中的一种禽类冠状病毒,在进化上被认为是处于Ⅰ型和Ⅱ型冠状病毒之间。目前研究表明APN亲和肽是鸡传染性支气管炎病毒感染的功能性受体,且APN基因敲除鸡能够显著提高抗IBV感染能力,开发APN分子抑制剂一直是目前研究抗IBV药物的重点。
现有技术中未见鸡α干扰素与氨肽酶N亲和肽结合制备融合蛋白的报道。
发明内容
针对现有技术的上述不足,本发明提供一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用,实现以下发明目的:
在保留干扰素广谱抗病毒活性的条件下,还特异性的防治鸡传染性支气管炎病毒,降低感染病毒后鸡的发病率和死亡率;提高融合蛋白的表达量和抗病毒活性。
为解决上述技术问题,本发明采取以下技术方案:
一种融合蛋白,所述融合蛋白由氨肽酶N亲和肽、连接子、IFNα依次串联得到;所述氨肽酶N亲和肽的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示;所述连接子的核酸序列如序列表中SEQ ID NO. 8所示;所述IFNα的核酸序列如序列表中SEQ ID NO. 9所示。
所述融合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示,所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
一种表达所述融合蛋白的重组菌株,所述重组菌株为重组毕赤酵母。
所述重组菌株的保藏编号为CCTCC NO:M 20211521,分类命名为毕赤酵母Pichia pastoris,保藏日期为2021年12月1日。
所述的融合蛋白在制备治疗鸡传染性支气管炎药物中的应用。
本发明表达APN-G-(GGGGS)3-IFNα的重组毕赤酵母X-33-chIFNα,分类命名为:毕赤酵母Pichia pastoris,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为武汉市武汉大学,保藏日期为2021年12月1日,保藏编号为CCTCC NO:M 20211521。
相对于现有技术,本发明的有益效果在于:
(1)本发明所述APN-G-(GGGGS)3-IFNα融合蛋白,APN亲和肽可以与APN结合,阻止IBV与APN结合,进而抑制IBV对细胞的感染,加上鸡IFN-α自身的抗病毒作用,进一步提高了治疗效果,特定的柔性Linker的加入,有利于APN亲和肽和IFNα的独立表达,提高融合蛋白的稳定性。本发明的融合蛋白在保留干扰素广谱抗病毒活性的条件下,还特异性的防治鸡传染性支气管炎病毒,有更好的治疗效果。
(2)本发明对APN亲和肽、IFNα、连接子的核苷酸序列进行了优化,并采用特定长度的连接子,可以提高毕赤酵母中融合蛋白的表达量,提高融合蛋白的特异性抗病毒效果,降低感染病毒后鸡的发病率和死亡率。
本发明纯化后的融合蛋白中鸡α干扰素的浓度为17.52g/L;
本发明纯化后的融合蛋白的抗IBV病毒活性为1.09×106IU/mL;
本发明纯化后的融合蛋白用于感染IBV的鸡后,总发病率为20%,总死亡率为4%。
附图说明
图1为本发明重组毕赤酵母的阳性克隆电泳图;
图2为鉴定本发明APN-G-(GGGGS)3-IFNα融合蛋白特异性的SDS-PAGE图;
图3为本发明纯化后的APN-G-(GGGGS)3-IFNα融合蛋白的SDS-PAGE图。
具体实施方式
下述实施例中为了更方便表述,将氨肽酶N简称为APN。
实施例1一种含鸡α干扰素、氨肽酶N亲和肽的融合蛋白的制备方法
一、APN亲和肽的筛选
根据目前已知的APN亲和肽的氨基酸序列(表1),通过委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成,并委托山东省农业科学院进行APN亲和肽的体外活性检测,确定对IBV抑制效果最好的亲和肽。
表1 APN亲和肽的氨基酸序列
采用CEK-IBV检测系统检测APN亲和肽对IBV入侵CEK细胞的抑制作用,各APN亲和肽针对IBV的抗病毒活性见表2。
表2各APN亲和肽针对IBV的抗病毒活性检测结果
由表2可见,APN亲和肽a(命名为G)针对IBV的抗病毒活性最高,采用该APN亲和肽进行后续试验。
二、将融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα的基因片段插入分泌表达载体pPICZαA载体
优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα的核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.1所示,对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα由以下模块依次串联得到:
(1)APN亲和肽,其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.3所示;
(2)连接子,其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.4所示;
(3)IFNα,其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.5所示;
本发明针对上述SEQ ID NO.1序列进行了密码子优化,得到优化后融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα的核酸人工序列,如序列表中SEQ ID NO.6所示。
优化后融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα由以下模块依次串联得到:
(1)优化后APN亲和肽,其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.7所示;
(2)优化后连接子,其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.8所示;
(3)优化后IFNα,其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.9所示;
将优化后APN亲和肽的核酸人工序列、优化后连接子的核酸人工序列、优化后IFNα的核酸人工序列,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成其整个表达框,并插入pPICZαA载体EcoRI-KpnI位点,构建pPICZαA-APN-G-(GGGGS)3-IFNα,转化到E.coli(DH5α),经测序正确后,使用生工生物工程(上海)股份有限公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒,获得1μg/μL的重组质粒。
三、电转化以及阳性菌株的筛选
对上述获得的pPICZαA-APN-G-(GGGGS)3-IFNα重组质粒进行限制性内切酶SacⅠ消化,具体操作为:30μL ddH2O、4μL 10×FuniCut™ Buffer、4μL上述质粒、2μL FuniCut™SacI,37℃孵育15min。
采用异丙醇法快速纯化DNA,具体操作为:在上述体系加0.6倍体积的异丙醇于室温下充分混匀,于4℃离心25min,用乙醇清洗DNA 沉淀,在4℃再次离心25min,弃上清液,使DNA 沉淀干燥后,用20μL TE 缓冲液重新溶解DNA沉淀,得到DNA溶液。
最后将DNA溶液与毕赤酵母X-33感受态菌悬液以1:8 (V/V)混合后进行电转(2000V,25µF,200Ω,电击5ms),电转后,立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇,于28℃静置1.5h;然后加入1mL YPD,于150r/min、28℃培养1.5h;离心收集菌体,涂布于含100μg/mL博来霉素的YPD平板,于28℃培养至酵母单菌落长出;挑取长势良好的酵母菌落,以其基因组DNA为模板,进行PCR,对重组毕赤酵母菌株X-33/pPICZαA-APN-G-(GGGGS)3-IFNα进行验证,经1.5%(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳后,在预期分子量(1125bp)处有明显条带(图1),获得含有优化后融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα序列的重组毕赤酵母,命名为重组毕赤酵母X-33-chIFNα;将该重组毕赤酵母制成冻干粉保存备用,同时进行生物保藏。
所述毕赤酵母X-33菌株购自山东赛恩斯科技有限公司;
所述毕赤酵母X-33感受态菌悬液采用CN114539426A的实施例1中毕赤酵母X-33感受态菌悬液的制备方法制得。
四、APN-G-(GGGGS)3-IFNα融合蛋白的鉴定
取步骤三得到的重组毕赤酵母X-33-chIFNα冻干粉1支(1克)接种于50mL YPD培养基,于28℃、250r/min培养12h;取10mL上述培养液转接于50mL BMGY培养基;在同样条件下继续培养24h,离心收集菌体,全部菌体转接于甲醇浓度为1.5%(V/V)的50mL BMMY培养基,于28℃、250r/min继续培养64h,得到发酵液,取发酵液的上清液用于SDS-PAGE,结果表明在21.31kD 处有明显条带 (图2);
所述BMGY培养基,包括以下组分:1%(质量体积比)酵母粉、2%(质量体积比)胰蛋白胨、1.34%(质量体积比)YNB、4×10-5%(质量体积比)生物素、1%(V/V)甘油,100mM 的pH6.0的磷酸钾溶液补足100%。
所述的BMMY液体培养基,包括以下组分:1%(质量体积比)酵母粉、2%(质量体积比)胰蛋白胨、1.34%(质量体积比)YNB、4×10-5%生物素(质量体积比)、0.5%(V/V)甲醇,100mM的pH6.0的磷酸钾溶液补足100%。
五、融合蛋白的制备
参考CN110684681A实施例4的方法进行融合蛋白制备。具体步骤如下:
(1)菌株活化与筛选
将重组毕赤酵母X-33-chIFNα划线接种到含300μg/mL、600μg/mL、900μg/mL博来霉素的YPD固体培养基上,筛选出稳定多拷贝的高产菌种。
(2)一级种子培养
从第三次筛选的YPD固体培养基上挑取单菌落,接入装有250mL YPD液体培养基的1L三角瓶中,置于摇床中,在30℃、200rpm的条件下培养至OD600=0.7,作为一级种子液。
(3)二级种子培养
将4瓶一级种子液共1L接种到已灭菌的100L BMGY发酵培养基中,使用发酵种子罐培养,控制通气量在5L/min,温度30℃,转速200rpm,待OD600=0.7,为二级种子液备用。
(4)发酵培养
用泵将备好的100L二级种子液泵入1吨BMMY液体培养基中,发酵条件控制在转速200rpm,温度30℃,pH5.0,通气量10L/min。每4h取样一次测定其碳源剩余、菌体浓度,初期使用分光光度计测量其600nm吸光值(OD600),后期测量湿重作为参考。发酵期间通过调整转速和通气量使溶氧保持在30%以上,以溶氧电极数值上升到100%为标志表示初始碳源已消耗殆尽,即可进入边富集边诱导阶段,具体为以7mL/h/L的恒定速率补加浓度为0.1g/mL的山梨醇溶液,以2.5mL/h/L的恒定速率补加甲醇,发酵条件控制在转速200rpm,温度28℃,pH5.0,溶氧(DO)在20~30%之间,每6h取样1次,测OD600、细胞湿重及细胞干重,分析酵母菌生长状态,菌体湿重达400g/L以上时,停止补加山梨醇,转入菌体诱导阶段,具体为以10mL/h/L的速率补加甲醇,发酵条件控制在转速200rpm,温度28℃,pH6.0,DO在20~30%之间,湿重达到500g/L以上,结束发酵,得发酵液。
(5)纯化工艺
将上述发酵液在8000r/min下离心30min,收集上清液,再将上清液通过30kD孔径超滤膜包将发酵液上清浓缩10倍;在浓缩后的上清中加入等量的平衡缓冲液并调pH至7.4,加入钴柱中与介质充分结合;分别使用含5mmol/L和150mmol/L咪唑的缓冲液进行洗涤和洗脱。
将含目标蛋白脱液合并,使用30kD超滤管超滤去除杂带、浓缩目标蛋白,收集截留液为纯化后融合蛋白。SDS-PAGE结果表明本发明纯化工艺可以有效除去大多数降解条带,保留较高纯度的APN-G-(GGGGS)3-IFNα条带(图3)。采用鸡α干扰素定量检测试剂盒(江苏科晶生物科技有限公司)测定本发明纯化后融合蛋白中鸡α-干扰素,委托山东省农业科学院采用CEK-IBV检测系统进行融合蛋白的体外抗病毒活性检测,结果如下:
表3本发明融合蛋白中鸡α干扰素浓度 (g/L)
表4本发明融合蛋白的抗IBV病毒活性
实施例2 APN-G-(GGGGS)3-IFNα融合蛋白的实验室防治试验
将75只14日龄鸡随机分成3组,每组25只,第1组为本发明APN-G-(GGGGS)3-IFNα融合蛋白治疗组;第 2 组为IFNα治疗组;第3组为未进行治疗组。各组鸡滴鼻0.1mL IBV病毒液(病毒浓度为1.0×106.22EID50/0.1mL),随后立即,第1组鸡注射本发明纯化后APN-G-(GGGGS)3-IFNα融合蛋白,稀释1.3倍使用,每次用量2mL,每天1次,连续3天;第2组鸡静脉注射IFNα(采用CN110684681A实施例4的方法发酵得到IFNα,再采用上述步骤五纯化制得,纯化后的IFNα(浓度13.5g/L和IBV抗病毒活性为0.3×106IU/mL),每次用量2mL,每天1次,连续3天;第3组为空白对照组,鸡静脉注射同等剂量生理盐水2mL,每天1次,连续3天。
观察防治效果,统计发病及死亡情况。结果表明第1组在鸡静脉注射本发明APN-G-(GGGGS)3-IFNα后,发病率20%,死亡率为4%。第2组鸡静脉注射IFNα后发病率52%,死亡率为44%;空白对照组未采取治疗措施鸡,则全部发病死亡,发病率100%,死亡率为88%。具体见表5。
表5实验室治疗结果
。
对比例1连接子的选择试验
为了将APN亲和肽和鸡α干扰素更好地进行连接,在二者之中分别加入柔性(GGGGS)0、(GGGGS)1、(GGGGS)5,其中(GGGGS)1的核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.10所示、(GGGGS)5的核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.11所示,分别按APN亲和肽的核酸人工序列(SEQ ID NO.7)、(GGGGS)n、IFNα核酸人工序列(SEQ ID NO.9)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成其整个表达框,并插入pPICZαA载体EcoRI-KpnI位点,构建pPICZαA-APN-G-(GGGGS)n-IFNα,转化到E.coli(DH5α),经测序正确后,使用生工生物工程(上海)股份有限公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒,获得1μg/μL的重组质粒。按照实施例1的方法获得表达APN-G-(GGGGS)n-IFNα的重组毕赤酵母并制备融合蛋白,委托山东省农业科学院检测融合蛋白的体外抗IBV病毒活性。
表6各融合蛋白体外抗IBV病毒活性检测结果
表6可见,融合蛋白中加入柔性Linker后,可以提高IBV的抑制率,实施例1制备的融合蛋白((GGGGS)3作为连接子)的体外抗IBV病毒活性为1.09×106IU/mL,明显高于其它连接子制备的融合蛋白,说明(GGGGS)3作为连接子更有利于毕赤酵母中鸡α干扰素的表达,融合蛋白的稳定性更好,抗病毒活性更高,因此选择柔性连接子(GGGGS)3作为构建重组氨肽酶N亲和肽-干扰素α融合蛋白制备的组成部分。
对比例2优化前融合蛋白中鸡α干扰素和抗病毒活性的测定
优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα基因序列SEQ ID NO.1委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成其整个表达框,并插入pPICZαA载体EcoRI-KpnI位点,构建优化前pPICZαA-APN-G-(GGGGS)3-IFNα,转化到E.coli(DH5α),经测序正确后,使用生工生物工程(上海)股份有限公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒,获得1μg/μL的优化前的重组质粒。将优化前的重组质粒采用实施例1方法步骤三的操作,进行电转化以及阳性菌株的筛选,得到含有优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα序列的重组毕赤酵母,并采用步骤四的操作,进行融合蛋白的鉴定,结果符合预期。
将含有优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα序列的重组毕赤酵母按实施例1的步骤五的操作进行发酵和纯化,得到优化前融合蛋白。将优化前融合蛋白进行3批次实验,采用鸡α干扰素定量检测试剂盒测定融合蛋白中鸡α-干扰素的浓度,委托山东省农业科学院采用CEK-IBV检测系统检测融合蛋白的抗IBV病毒活性。
表7优化前融合蛋白中鸡α干扰素的浓度 (g/L)
表8优化前融合蛋白的抗IBV病毒活性
本发明融合蛋白中鸡α-干扰素的浓度为17.52g/L,明显高于优化前融合蛋白,本发明融合蛋白的抗病毒活性为1.09×106IU/mL,也明显高于优化前融合蛋白。
Claims (4)
1.一种融合蛋白,其特征在于:所述融合蛋白由氨肽酶N亲和肽、连接子、IFNα依次串联得到;所述氨肽酶N亲和肽的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示;所述连接子的核酸序列如序列表中SEQ ID NO. 8所示;所述IFNα的核酸序列如序列表中SEQ ID NO. 9所示。
2.一种表达权利要求1所述融合蛋白的重组菌株,其特征在于:所述重组菌株为重组毕赤酵母。
3.根据权利要求2所述的重组菌株,其特征在于:所述重组菌株的保藏编号为CCTCCNO:M 20211521,分类命名为毕赤酵母Pichia pastoris,保藏日期为2021年12月1日。
4.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗鸡传染性支气管炎药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311595712.8A CN117304344B (zh) | 2023-11-28 | 2023-11-28 | 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311595712.8A CN117304344B (zh) | 2023-11-28 | 2023-11-28 | 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117304344A CN117304344A (zh) | 2023-12-29 |
CN117304344B true CN117304344B (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=89273929
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311595712.8A Active CN117304344B (zh) | 2023-11-28 | 2023-11-28 | 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117304344B (zh) |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101338314A (zh) * | 2008-06-16 | 2009-01-07 | 南京农业大学 | 一种重组鸡α干扰素基因及其重组载体 |
CN102041263A (zh) * | 2010-02-08 | 2011-05-04 | 河南省动物疫病预防控制中心 | 鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因 |
CN108220214A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-06-29 | 华南农业大学 | 一种高效表达重组鸡α干扰素的工程菌 |
CN110628852A (zh) * | 2019-11-01 | 2019-12-31 | 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 | 一种鸡α-干扰素的发酵工艺 |
CN110627893A (zh) * | 2019-11-01 | 2019-12-31 | 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 | 一种鸡α-干扰素的后提取工艺 |
CN110684681A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-01-14 | 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 | 一株生产鸡α-干扰素的工程菌及其应用 |
CN110846723A (zh) * | 2018-08-21 | 2020-02-28 | 华东理工大学 | 淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法及其在生物传感中的应用 |
CN113045670A (zh) * | 2019-12-27 | 2021-06-29 | 华南农业大学 | 一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白及其生产方法与应用 |
CN113999318A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-02-01 | 长春萤火虫生物科技有限公司 | 一种重组鸡干扰素融合蛋白及其应用 |
CN114539426A (zh) * | 2022-03-02 | 2022-05-27 | 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 | 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法 |
-
2023
- 2023-11-28 CN CN202311595712.8A patent/CN117304344B/zh active Active
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101338314A (zh) * | 2008-06-16 | 2009-01-07 | 南京农业大学 | 一种重组鸡α干扰素基因及其重组载体 |
CN102041263A (zh) * | 2010-02-08 | 2011-05-04 | 河南省动物疫病预防控制中心 | 鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因 |
CN108220214A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-06-29 | 华南农业大学 | 一种高效表达重组鸡α干扰素的工程菌 |
CN110846723A (zh) * | 2018-08-21 | 2020-02-28 | 华东理工大学 | 淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法及其在生物传感中的应用 |
CN110628852A (zh) * | 2019-11-01 | 2019-12-31 | 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 | 一种鸡α-干扰素的发酵工艺 |
CN110627893A (zh) * | 2019-11-01 | 2019-12-31 | 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 | 一种鸡α-干扰素的后提取工艺 |
CN110684681A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-01-14 | 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 | 一株生产鸡α-干扰素的工程菌及其应用 |
CN113045670A (zh) * | 2019-12-27 | 2021-06-29 | 华南农业大学 | 一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白及其生产方法与应用 |
CN113999318A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-02-01 | 长春萤火虫生物科技有限公司 | 一种重组鸡干扰素融合蛋白及其应用 |
CN114539426A (zh) * | 2022-03-02 | 2022-05-27 | 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 | 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Infectious bronchitis virus: Identification of Gallus gallus APN high-affinity ligands with antiviral effects;Xiaoqi Sun等;Antiviral Research;第186卷;第104998页 * |
重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究;程福亮;中国畜牧兽医;第41卷(第11期);第35-39页 * |
鸡α-干扰素对鸡传染性支气管炎的治疗试验;张圆等;黑龙江畜牧兽医(第3期);第87-88页 * |
鸡传染性支气管炎病毒N蛋白亲和肽的筛选及其抑制病毒感染作;于佳;中国学位论文全文数据库;第1-69页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117304344A (zh) | 2023-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CS273152B2 (en) | Method of mature human leucocytic interferon production | |
CN111004317B (zh) | 一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用 | |
CN102796758A (zh) | 重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用 | |
CN114539426B (zh) | 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法 | |
CN108840952A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN108840946A (zh) | 犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种犬长效干扰素 | |
CN117304344B (zh) | 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 | |
CN110904115B (zh) | 犬重组干扰素α7及其制备方法与应用、含有犬重组干扰素α7的表达载体及宿主细胞 | |
CN107353347A (zh) | 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN108840934B (zh) | 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
CN101974536B (zh) | 重组人干扰素β1a基因、其表达载体和重组人干扰素β1a的制备方法 | |
CN107383202A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN103397036B (zh) | 一种用于毕赤酵母表达重组人血清白蛋白的基因序列 | |
CN108794644A (zh) | 一种由牛白细胞介素2、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN103937828A (zh) | 一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术 | |
CN108794645A (zh) | 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN108864295A (zh) | 一种重组牛长效干扰素及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
CN113845599B (zh) | 一种重组猪干扰素融合蛋白及其应用 | |
CN108864300A (zh) | 鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素 | |
CN114836453A (zh) | 一种编码蛋白酶k的基因及表达蛋白酶k的菌株 | |
CN112251453A (zh) | 一种重组犬长效干扰素α的制备方法 | |
CN107266589A (zh) | 一种由犬白蛋白、犬干扰素γ和犬白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN107266590A (zh) | 一种由犬白蛋白、犬干扰素γ和犬干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
CN101948844B (zh) | α干扰素类似物的蛋白制备方法 | |
CN108864301A (zh) | 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |