CN114539426A - 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法 - Google Patents

一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种含干扰素α的融合蛋白，该融合蛋白由以下模块依次串联得到：猪血清白蛋白rpoALB、冠状病毒nsp5切割位点nsp5 site、干扰素α融合蛋白IFNα依次串联构成；本发明还提供表达所述融合蛋白的重组菌株以及上述融合蛋白的制备方法。本发明的rpoALB‑nsp5 site‑IFNα融合蛋白，抗病毒活性高，半衰期长，可以降低感染病毒后仔猪的发病率和死亡率。

Description

一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其 制备方法
技术领域
本发明涉及一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV），猪δ冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus，PDCoV）以及猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritis virus TGEV）三种冠状病毒的联合感染或者单独感染是养殖业的天敌。
干扰素α（IFNα）具有抗病毒、抗肿瘤、抗增殖和免疫调节作用。目前，猪 α-干扰素在大肠杆菌、毕赤酵母和动物细胞等表达系统中均实现了表达。重组猪 α-干扰素蛋白活性分析表明其对口蹄疫病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪伪狂犬病病毒等均具有抑制作用，并与多种抗原配伍免疫具有免疫佐剂功能，因此，作为广谱抗病毒药可用于猪病毒性疾病的防治。但是干扰素α在体内的半衰期较短限制其应用，所以有必要开发IFNα长效蛋白药物。
近年来，IFNα半衰期的研究取得了很大的进展，许多技术已经被提出并测试延长治疗性蛋白的作用时间，如与其他蛋白基因融合（免疫球蛋白域或血清蛋白，如白蛋白）、与聚合物结合（PEG化修饰等）。但以上方法均降低了干扰素α的活性。因此，亟需开发了一种新型的不降低干扰素α活性的长效策略。
猪冠状病毒在感染宿主后能抑制机体的天然免疫反应，从而导致病毒的免疫逃逸和持续性感染。已有研究表明，非结构蛋白Nsp5蛋白在这方面起到重要作用。Nsp5是一种与微RNA病毒3C蛋白酶类似的蛋白酶，称为3C样蛋白酶。该蛋白酶具有切割活性，可以将多聚前体蛋白切割为成熟的非结构蛋白。除了具有切割活性外，还发现冠状病毒的Nsp5是一种干扰素的拮抗分子，识别NEMO等先天免疫分子上的特异位点并切割，阻止干扰素的合成，在病毒的免疫调控中发挥重要作用。
为了降低Nsp5诱导的免疫抑制，因此，开发Nsp5分子抑制剂一直是目前研究抗猪冠状病毒药物的重点。
因此，降低冠状病毒的免疫逃逸，提高IFNα长效蛋白的活性，是目前的亟需解决的技术难题。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种重组猪血清白蛋白-冠状病毒nsp5切割位点-干扰素α融合蛋白制备（以下简称“rpoALB-nsp5 site-IFNα”）及猪冠状病毒治疗上的应用，实现以下发明目的：
提高融合蛋白的抗病毒活性，延长融合蛋白的半衰期，减缓其活性的下降。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种含干扰素α的融合蛋白，该融合蛋白由以下模块依次串联得到：
猪血清白蛋白rpoALB、冠状病毒nsp5切割位点nsp5 site、干扰素α融合蛋白IFNα依次串联构成。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述rpoALB的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述nsp5 site的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；所述IFNα的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
该融合蛋白的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；该融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
一种表达所述融合蛋白的重组菌株，所述重组菌株为重组毕赤酵母。
所述重组毕赤酵母的保藏号为CCTCC NO：M 20211522。
所述制备方法包括一级种子繁殖、二级种子繁殖、一级发酵、二级发酵、纯化。
所述一级种子繁殖，将表达融合蛋白的重组毕赤酵母冻干菌种，接种于YPD液体培养基，27-29℃、200-250r/min摇床振荡培养过夜，作为一级种子；所述冻干菌种与YPD液体培养基的质量体积比为1g：45-55mL。
所述二级种子繁殖，将一级种子按1.5%的体积比接种于YPD液体培养基，27-29℃、200-250r/min摇床振荡培养23-25h，作为二级种子。
所述一级发酵，将二级种子按照2%（V/V）的接种量接入含0.05%（V/V）的BMGY培养基中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速200-250rpm，发酵温度为27.5-28.5℃，发酵至OD值长到1.2以上。
所述二级发酵，将一级发酵后的液体全部接种到含0.05%（V/V）的BMMY培养基中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速200-250rpm，温度全程控制到27.5-28.5℃，全程控制pH 5.7-5.8，培养到19-21h流加1%（V/V）甲醇，培养到67-69h，得到二级发酵液。
本发明表达rpoALB- nsp5 site-IFNα的重组毕赤酵母X-33-chIFNα，分类命名为：毕赤酵母Pichia pastoris，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2021年12月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 20211522。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
（1）本发明的rpoALB- nsp5 site-IFNα融合蛋白，猪血清白蛋白作为天然的蛋白质分子具有超长的半衰期与IFNα融合表达可以有效延长IFNα半衰期。冠状病毒nsp5切割位点(KLAQLQVAYHQ)的共表达，一方面使部分nsp5作用于融合蛋白，避免nsp5对NEMO等先天免疫分子切割，从而解除IFN-I信号通路的抑制，阻断冠状病毒的免疫逃脱。另一面nsp5切割冠状病毒nsp5切割位点，可以释放出IFNα，激活JAK-STAT信号通路，诱导直接发挥抗病毒效应的干扰诱导基因(Interferon Stimulated Genes，ISGs)的表达，促进机体抵抗病毒能力，提高干扰素疗法清除病毒效果。
本发明所述rpoALB-nsp5 site-IFNα融合蛋白，对水泡性口炎病毒的抗病毒活性为3.25×106 IU /mL；
本发明所述rpoALB-nsp5 site-IFNα融合蛋白，活性下降50%的时间为24.5h；
本发明所述rpoALB-nsp5 site-IFNα融合蛋白，可以降低感染病毒后仔猪的发病率和死亡率。
（2）本发明采用毕赤酵母工程菌株生产重组rpoALB- nsp5 site-IFNα，并建立了发酵纯化工艺，具有很高的应用价值和工业实用性。
附图说明
图1为rpoALB- nsp5 site-IFNα的融合蛋白模块示意图；
图2为表达rpoALB- nsp5 site-IFNα的重组毕赤酵母的阳性克隆电泳图；
图3为rpoALB- nsp5 site-IFNα融合蛋白鉴定的电泳图；
图4为rpoALB- nsp5 site-IFNα融合蛋白的体外活性图；
其中4a加入rpoALB- nsp5 site-IFNα融合蛋白后，再攻毒后的细胞形态图；
4b为未加入rpoALB- nsp5 site-IFNα融合蛋白，进行攻毒后的细胞形态图；
图5为表达rpoALB- nsp5 site-IFNα的重组毕赤酵母经发酵、纯化得到的融合蛋白的SDS-PAGE图；
图6为rpoALB- nsp5 site-IFNα血浆稳定性的折线图。
具体实施方式
实施例1一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法
一、将融合基因片段rpoALB-nsp5 site-IFNα插入分泌表达载体pPICZαA载体
rpoALB-nsp5 site-IFNα的融合蛋白模块示意见图1(完整核酸序列见附录SEQ IDNO.1和氨基酸序列见SEQ ID NO.2)。
rpoALB-nsp5 site-IFNα的融合蛋白各模块的核酸序列
(1) rpoALB核酸序列(SEQ ID NO.3)
(3) nsp5 site 核酸序列(SEQ ID NO.4)
(4) IFNα核酸序列(SEQ ID NO.5)。
分别按rpoALB的核酸序列、nsp5 site的核酸序列、IFNα核酸序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成其整个表达框，并插入pPICZαA载体Kpn I-XbaI位点，构建pPICZαA-rpoALB-nsp5 site-IFNα，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用生工生物工程（上海）股份有限公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得1μg/μL的重组质粒。
二、电转化以及阳性菌株的筛选
对上述获得的pPICZαA-rpoALB-nsp5 site-IFNα重组质粒进行限制性内切酶SacⅠ消化，具体操作为： 30μL ddH2O、4 μL 10×FuniCut™ Buffer、4 μL上述质粒、2 μLFuniCut™ SacI，37°C孵育15 min，然后采用异丙醇法快速纯化DNA，具体操作为：在上述消化后的体系加0.6倍体积的异丙醇于室温下充分混匀，于4℃离心25min，用乙醇清洗DNA 沉淀；在4℃再次离心25min，弃上清液，使DNA 沉淀干燥后，用20μL TE 缓冲液重新溶解DNA沉淀，得到DNA溶液，最后与毕赤酵母X-33感受态菌悬液以1：8 (V/V)混合后进行电转(2000V， 25 µF，200 Ω，电击 5 ms)，电转后，立即加入1 mL预冷的1 mol/L 山梨醇，于 28 ℃静置1.5 h；然后加入1 mL YPD，于150 r/min、 28 ℃培养1.5 h；离心收集菌体，涂布于含100μg/mL 博来霉素的YPD平板，于28 ℃培养至酵母单菌落长出；挑取长势良好的酵母菌落，以其基因组DNA为模板、以5'AOX1（5´-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3´）和3'AOX1（5´-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3´）为引物进行PCR，对重组毕赤酵母菌株 X-33/pPICZαA-rpoALB-nsp5 site-IFNα进行验证。经1.5%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳后，在预期分子量(2863bp)处有明显条带，获得表达rpoALB-nsp5 site-IFNα的重组毕赤酵母，保藏名称为X-33-chIFNα(图2)；将重组毕赤酵母制成冻干粉保存备用。
所述毕赤酵母X-33感受态菌悬液的制备方法为：
挑取毕赤酵母X33单菌落接种于50 mL YPD液体培养基中，28℃震荡过夜培养；按照0.2%（体积比）接种量重新接种于50 mL YPD液体培养基中，28℃震荡培养至OD600=1.3。将培养液装于50mL离心管中，4℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。离心管中加入35mL预冷的无菌水，轻轻吹打重悬菌体。4℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。离心管中加入18mL预冷的无菌水，轻轻吹打重悬菌体。4℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。离心管中加入5mL预冷的1M山梨醇，轻轻吹打重悬菌体。4℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。离心管中加入1mL预冷的1M山梨醇重悬菌体，即得到酵母感受态细胞。
所述YPD培养基，其有效成分包括：1%（质量体积比）酵母粉，2%（质量体积比）胰蛋白胨，2%（质量体积比）葡萄糖。
三、 rpoALB-nsp5 site-IFNα融合蛋白的鉴定
取步骤二得到的重组菌株冻干粉1克接种于50 mL YPD培养基，于28 ℃、250 r/min培养12 h。取10 mL上述培养液转接于50 mL BMGY培养基；在同样条件下继续培养24 h，离心收集菌体，全部菌体转接于甲醇浓度为 1.5%（V/V）的50 mL BMMY培养基，于28 ℃、250r/min继续培养64 h，得到发酵液，取培养上清液用于SDS-PAGE。结果表明在88.0 kD 处有明显条带 (图3)。
四、rpoALB- nsp5 site-IFNα体外活性的鉴定
按照步骤三制备的发酵液按照《2017年版兽药质量标准》，采用MDBK-VSV检测系统和细胞病变抑制法检测融合蛋白活性。结果表明发酵液中重组rpoALB-nsp5 site-IFNα在MDBK-VSV 系统中对水泡性口炎病毒的抗病毒活性为3.25×106 IU /mL。具体见图4；
图4a中的细胞形态完好，图4b中的细胞发生病变。
五、rpoALB- nsp5 site-IFNα蛋白的制备
（1）一级种子繁殖 将步骤二得到1支冻干菌种（1g）接种于50mL YPD液体培养基，28℃、220r/min摇床振荡培养过夜，作为一级种子。
（2）二级种子繁殖 取一级种子按1.5%（V/V）接种于200mL YPD液体培养基，28℃、220r/min摇床振荡培养24h，作为二级种子。
（3）一级发酵：50L发酵罐，装液量30L，培养基为BMGY培养基，并加入0.05%消泡剂（V/V），121℃ 灭菌30 min，降温至28℃备用。
将二级种子按照2%（体积比）的接种量接入发酵罐中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速225rpm，温度全程控制到28℃，发酵时间26h小时(OD值长到1.2以上)。
（4）二级发酵
200L发酵罐，装液量120L，培养基为BMMY培养基，并加入0.05%消泡剂（V/V），121℃灭菌30 min，降温至28℃备用。
将一级发酵后的液体全部接种到二级发酵罐中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速225rpm，温度全程控制到28℃，全程控制PH 5.75，培养到20h流加1%（V/V）甲醇，培养到68h放罐，得到二级发酵液。连续3批发酵液抗病毒活性见下表1
表1连续3批本发明发酵液上清抗病毒检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（五）纯化工艺 将二级发酵液8000r/min离心30min，收集上清液，再将上清液通过30kD孔径超滤膜包将发酵液上清浓缩10倍。在浓缩后的上清中加入等量的平衡缓冲液并调pH 至 7.4，加入钴柱中与介质充分结合。分别使用含 5 mmol/L 和 150 mmol/L 咪唑的缓冲液进行洗涤和洗脱。
将含目标蛋白脱液合并，使用 50 kD 超滤管超滤去除杂带、浓缩目标蛋白。结果表明该纯化工艺可以有效地除去大多数降解条带，保留较高纯度的rpoALB- nsp5 site-IFNα全长条带(图5)。
实施例2 rpoALB- nsp5 site-IFNα血浆稳定性检测
采集健康BALB/c小鼠血液，离心收集血浆，用PBS稀释成50%血浆（V/V），分别将上述纯化后rpoALB- nsp5 site-IFNα和纯化后的IFNα（具体制备标准见专利CN201911058504.8）加入50%血浆，终浓度为10µg/mL，37℃孵育0、0.25、0.5、1.0、3.0、6.0、12和24h，各取100µl，12000g离心30min，收集上清液。按照《2017年版兽药质量标准》，采用MDBK-VSV检测系统和细胞病变抑制法检测融合蛋白活性。结果表明IFNα活性下降50%的时间约为6h，rpoALB- nsp5 site-IFNα活性下降50%的时间为24.5 h。具体见图6。
实施例3 rpoALB- nsp5 site-IFNα的实验室防治试验
将30 头刚出生未吃初乳的仔猪随机分成3组，每组10头，第1组为rpoALB- nsp5site-IFNα治疗组； 第 2 组为IFNα治疗组（具体制备标准见专利CN201911058504.8）；第 3组为未进行治疗组。各组仔猪注射器灌服 3mL PED 病毒液( 病毒浓度为 1×106 TCID50/mL)，随后立即，试验组仔猪肌肉注射实施例1得到的纯化后rpoALB- nsp5 site-IFNα (抗病毒活性为1× 106 IU /mL)，每次用量2ml，每天1次，连续3天；第 2 组仔猪肌肉注射IFNα（(抗病毒活性为1× 106 IU /mL），每次用量2ml，每天1次，连续3天；空白对照组仔猪肌肉注射同等剂量生理盐水2mL，每天1次，连续3天。观察防治效果，统计发病及死亡情况。结果表明第 1 组在仔猪肌肉注射rpoALB- nsp5 site-IFNα后，发病率20%，死亡率为0%。第 2组仔猪肌肉注射IFNα后发病率30%，死亡率为20%； 第3 组未采取治疗措施仔猪，则全部发病死亡，发病率和死亡率为 100 %。具体见表2。
表2 rpoALB- nsp5 site-IFNα的实验室治疗结果
Figure 363476DEST_PATH_IMAGE002
。
序列表
<110> 山东仙普爱瑞科技股份有限公司
<120> 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2298
<212> DNA
<213> 欧亚野猪(Sus scrofa)
<400> 1
cgtggcgttt tccgtcgtga tacatacaaa tctgaaatcg ctcatcgttt caaagatctt 60
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cctcaagttt ctacacctac acttgttgaa gttgctcgta aacttggcct tgttggctct 1320
cgttgctgca aacgtcctga agaagaacgt ctttcttgcg ctgaagatta cctttctctt 1380
gttcttaacc gtctttgcgt tcttcatgaa aaaacacctg tttctgaaaa agttacaaaa 1440
tgctgcacag aatctcttgt taaccgtcgt ccttgcttct ctgctcttac acctgatgaa 1500
acatacaaac ctaaagaatt cgttgaaggc acattcacat tccatgctga tctttgcaca 1560
cttcctgaag atgaaaaaca aatcaaaaaa caaacagctc ttgttgaact tcttaaacat 1620
aaacctcatg ctacagaaga acaacttcgt acagttcttg gcaacttcgc tgctttcgtt 1680
caaaaatgct gcgctgctcc tgatcatgaa gcttgcttcg ctgttgaagg ccctaaattc 1740
gttatcgaaa tccgtggcat ccttgctaag ttggctcaat tgcaagttgc ttaccaccaa 1800
tgtgacttgc cacaaactca ctctttggct cacactagag ctttgagatt gttggctcaa 1860
atgagaagaa tctctccatt ctcttgtttg gactacagaa gagacttcgg tttcccacaa 1920
gaagctttgg gtggtaacca agttcaaaag gctcaagcta tggctttggt tcacgaaatg 1980
ttgcaacaaa ctttccaatt gttctctact gaaggttctg ctgctgcttg ggacgaatct 2040
ttgttgcacc aattctgtac tggtttggac caacaattga gagacttgga agcttgtgtt 2100
atgcaagaag ctggtttgga aggtactcca ttgttggaag aagactctat cttggctgtt 2160
agaaagtact tccacagatt gactttgtac ttgcaagaaa agtcttactc tccatgtgct 2220
tgggaaatcg ttagagctga agttatgaga gctttctctt cttctactaa cttgcaagac 2280
agattgagaa agaaggaa 2298
<210> 2
<211> 767
<212> PRT
<213> 欧亚野猪(Sus scrofa)
<400> 2
Met Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Ala His
1 5 10 15
Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile
20 25 30
Ala Phe Ser Gln His Leu Gln Gln Cys Pro Tyr Glu Glu His Val Lys
35 40 45
Leu Val Arg Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu
50 55 60
Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Ile His Thr Leu Phe Gly Asp Lys
65 70 75 80
Leu Cys Ala Ile Pro Ser Leu Arg Glu His Tyr Gly Asp Leu Ala Asp
85 90 95
Cys Cys Glu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His
100 105 110
Lys Asn Asp Asn Pro Asp Ile Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Val Ala
115 120 125
Leu Cys Ala Asp Phe Gln Glu Asp Glu Gln Lys Phe Trp Gly Lys Tyr
130 135 140
Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
145 150 155 160
Leu Tyr Tyr Ala Ile Ile Tyr Lys Asp Val Phe Ser Glu Cys Cys Gln
165 170 175
Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Glu His Leu Arg
180 185 190
Glu Lys Val Leu Thr Ser Ala Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser
195 200 205
Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Leu Ala Arg
210 215 220
Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Glu Ile Ser Lys Ile
225 230 235 240
Val Thr Asp Leu Ala Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu
260 265 270
Asn Gln Asp Thr Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro
275 280 285
Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Ala Lys Arg Asp Glu Leu
290 295 300
Pro Ala Asp Leu Asn Pro Leu Glu His Asp Phe Val Glu Asp Lys Glu
305 310 315 320
Val Cys Lys Asn Tyr Lys Glu Ala Lys His Val Phe Leu Gly Thr Phe
325 330 335
Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu
340 345 350
Leu Arg Ile Ala Lys Ile Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Asp Cys Cys Ala
355 360 365
Lys Glu Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp Lys Phe Gln
370 375 380
Pro Leu Val Asp Glu Pro Lys Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu
385 390 395 400
Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val Arg
405 410 415
Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val
420 425 430
Ala Arg Lys Leu Gly Leu Val Gly Ser Arg Cys Cys Lys Arg Pro Glu
435 440 445
Glu Glu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Val Leu Asn
450 455 460
Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val Thr
465 470 475 480
Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala
485 490 495
Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Lys Pro Lys Glu Phe Val Glu Gly Thr
500 505 510
Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu Asp Glu Lys Gln
515 520 525
Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro His
530 535 540
Ala Thr Glu Glu Gln Leu Arg Thr Val Leu Gly Asn Phe Ala Ala Phe
545 550 555 560
Val Gln Lys Cys Cys Ala Ala Pro Asp His Glu Ala Cys Phe Ala Val
565 570 575
Glu Gly Pro Lys Phe Val Ile Glu Ile Arg Gly Ile Leu Ala Lys Leu
580 585 590
Ala Gln Leu Gln Val Ala Tyr His Gln Cys Asp Leu Pro Gln Thr His
595 600 605
Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg
610 615 620
Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp Tyr Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro
625 630 635 640
Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala
645 650 655
Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu
660 665 670
Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr
675 680 685
Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu
690 695 700
Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala
705 710 715 720
Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser
725 730 735
Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ala
740 745 750
Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gln Asp Arg Leu Arg Lys Lys Glu
755 760 765
<210> 3
<211> 1767
<212> DNA
<213> 欧亚野猪(Sus scrofa)
<400> 3
cgtggcgttt tccgtcgtga tacatacaaa tctgaaatcg ctcatcgttt caaagatctt 60
ggcgaacaat acttcaaagg ccttgttctt atcgctttct ctcaacatct tcaacaatgc 120
ccttacgaag aacatgttaa acttgttcgt gaagttacag aattcgctaa aacatgcgtt 180
gctgatgaat ctgctgaaaa ctgcgataaa tctatccata cacttttcgg cgataaactt 240
tgcgctatcc cttctcttcg tgaacattac ggcgatcttg ctgattgctg cgaaaaagaa 300
gaacctgaac gtaacgaatg cttccttcaa cataaaaacg ataaccctga tatccctaaa 360
cttaaacctg atcctgttgc tctttgcgct gatttccaag aagatgaaca aaaattctgg 420
ggcaaatacc tttacgaaat cgctcgtcgt catccttact tctacgctcc tgaacttctt 480
tactacgcta tcatctacaa agatgttttc tctgaatgct gccaagctgc tgataaagct 540
gcttgccttc ttcctaaaat cgaacatctt cgtgaaaaag ttcttacatc tgctgctaaa 600
caacgtctta aatgcgcttc tatccaaaaa ttcggcgaac gtgctttcaa agcttggtct 660
cttgctcgtc tttctcaacg tttccctaaa gctgatttca cagaaatctc taaaatcgtt 720
acagatcttg ctaaagttca taaagaatgc tgccatggcg atcttcttga atgcgctgat 780
gatcgtgctg atcttgctaa atacatctgc gaaaaccaag atacaatctc tacaaaactt 840
aaagaatgct gcgataaacc tcttcttgaa aaatctcatt gcatcgctga agctaaacgt 900
gatgaacttc ctgctgatct taaccctctt gaacatgatt tcgttgaaga taaagaagtt 960
tgcaaaaact acaaagaagc taaacatgtt ttccttggca cattccttta cgaatactct 1020
cgtcgtcatc ctgattactc tgtttctctt cttcttcgta tcgctaaaat ctacgaagct 1080
acacttgaag attgctgcgc taaagaagat cctcctgctt gctacgctac agttttcgat 1140
aaattccaac ctcttgttga tgaacctaaa aaccttatca aacaaaactg cgaacttttc 1200
gaaaaacttg gcgaatacgg cttccaaaac gctcttatcg ttcgttacac aaaaaaagtt 1260
cctcaagttt ctacacctac acttgttgaa gttgctcgta aacttggcct tgttggctct 1320
cgttgctgca aacgtcctga agaagaacgt ctttcttgcg ctgaagatta cctttctctt 1380
gttcttaacc gtctttgcgt tcttcatgaa aaaacacctg tttctgaaaa agttacaaaa 1440
tgctgcacag aatctcttgt taaccgtcgt ccttgcttct ctgctcttac acctgatgaa 1500
acatacaaac ctaaagaatt cgttgaaggc acattcacat tccatgctga tctttgcaca 1560
cttcctgaag atgaaaaaca aatcaaaaaa caaacagctc ttgttgaact tcttaaacat 1620
aaacctcatg ctacagaaga acaacttcgt acagttcttg gcaacttcgc tgctttcgtt 1680
caaaaatgct gcgctgctcc tgatcatgaa gcttgcttcg ctgttgaagg ccctaaattc 1740
gttatcgaaa tccgtggcat ccttgct 1767
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 欧亚野猪(Sus scrofa)
<400> 4
aagttggctc aattgcaagt tgcttaccac caa 33
<210> 5
<211> 498
<212> DNA
<213> 欧亚野猪(Sus scrofa)
<400> 5
tgtgacttgc cacaaactca ctctttggct cacactagag ctttgagatt gttggctcaa 60
atgagaagaa tctctccatt ctcttgtttg gactacagaa gagacttcgg tttcccacaa 120
gaagctttgg gtggtaacca agttcaaaag gctcaagcta tggctttggt tcacgaaatg 180
ttgcaacaaa ctttccaatt gttctctact gaaggttctg ctgctgcttg ggacgaatct 240
ttgttgcacc aattctgtac tggtttggac caacaattga gagacttgga agcttgtgtt 300
atgcaagaag ctggtttgga aggtactcca ttgttggaag aagactctat cttggctgtt 360
agaaagtact tccacagatt gactttgtac ttgcaagaaa agtcttactc tccatgtgct 420
tgggaaatcg ttagagctga agttatgaga gctttctctt cttctactaa cttgcaagac 480
agattgagaa agaaggaa 498

Claims (10)

1.一种含干扰素α的融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白由以下模块依次串联得到：
猪血清白蛋白rpoALB、冠状病毒nsp5切割位点nsp5 site、干扰素α融合蛋白IFNα依次串联构成。
2.根据权利要求1所述的一种含干扰素α的融合蛋白，其特征在于：所述rpoALB的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述nsp5 site的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；所述IFNα的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求1所述的一种含干扰素α的融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；该融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
4.一种表达权利要求1所述融合蛋白的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为重组毕赤酵母。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于：所述重组毕赤酵母的保藏号为CCTCCNO：M 20211522。
6.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括一级种子繁殖、二级种子繁殖、一级发酵、二级发酵、纯化。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述一级种子繁殖，将表达融合蛋白的重组毕赤酵母冻干菌种，接种于YPD液体培养基，27-29℃、200-250r/min摇床振荡培养过夜，作为一级种子；所述冻干菌种与YPD液体培养基的质量体积比为1g：45-55mL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述二级种子繁殖，将一级种子按1.5%的体积比接种于YPD液体培养基，27-29℃、200-250r/min摇床振荡培养23-25h，作为二级种子。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述一级发酵，将二级种子按照2%（V/V）的接种量接入含0.05%（V/V）的BMGY培养基中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速200-250rpm，发酵温度为27.5-28.5℃，发酵至OD值长到1.2以上。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述二级发酵，将一级发酵后的液体全部接种到含0.05%（V/V）的BMMY培养基中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速200-250rpm，温度全程控制到27.5-28.5℃，全程控制pH 5.7-5.8，培养到19-21h流加1%（V/V）甲醇，培养到67-69h，得到二级发酵液。
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