CN1886148A - 被设计用于破坏NEMO寡聚化的肽对NF－κB活化的选择性抑制 - Google Patents

被设计用于破坏NEMO寡聚化的肽对NF－κB活化的选择性抑制 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抑制NF－κB信号途径的多肽和编码相同多肽的多核苷酸。本发明还提供了通过给有需要的对象施用本发明的多肽而调控和/或治疗炎症应答、肿瘤形成、病毒感染；调节细胞增殖和凋亡；以及调节抗原刺激的B或T淋巴细胞的方法。最后，本发明提供了鉴定调控NEMO寡聚化的多肽的方法。

Description

被设计用于破坏NEMO寡聚化的肽对NF-κB活化的选择性抑制
本发明涉及抑制NF-κB信号途径的多肽和编码相同的多肽的多核苷酸。本发明还提供了通过给所需处理的对象施用本发明的多肽而调控和/或治疗炎症应答、肿瘤发生、病毒感染；调节细胞增殖和凋亡；以及调节抗原刺激的B或T淋巴细胞的方法。最后，本发明提供了一种鉴定调控NEMO寡聚化的多肽的方法。
核因子-κB(NF-κB)信号传导是一种在炎症应答、肿瘤发生、病毒感染、细胞增殖和凋亡以及抗原刺激的B和T淋巴细胞的调节中都涉及到的重要的信号途径(Ghosh，1998，Annu.Rev.Immunol.；Karin，1999，J.Biol.Chem.；Israel，2000，Trends Cell Biol.；Santoro，2003，EMBO J.)。在哺乳动物细胞中，存在5种二聚体化的NF-κB家族成员：RelA、RelB、c-Rel、NF-κB2/p100/p52和NF-κB1/p105/p50。NF-κB的优势形式是一种由p50和RelA亚基构成的异二聚体的转录因子，通过与已知为IκB的蛋白抑制家族的成员结合，使得NF-κB被隔离在细胞浆内。在细胞因子TNF-α和白介素-1、内毒素(LPS)、微生物和病毒感染的刺激之下，促炎症信号汇集于经典的IκB激酶复合物(IKK)，这是一种由两个激酶亚基(IKKα/IKK-1和IKKβ/IKK-2)以及一个结构性/调节性亚基(NEMO/IKKγ)组成的蛋白复合物。一旦活化的IKK复合物将IκB蛋白磷酸化，就触发了IκB的泛素化以及随后的蛋白酶体的降解。然后游离的NF-κB可以移动到核内，启动或上调基因表达。尽管IKKα和IKKβ表现出惊人的结构相似性(52％)，但是精细的遗传学研究已经显示它们涉及两条活化NF-κB的途径(Pomerantz，2002，Mol Cell)。IKKβ是一种促炎症激酶，它作用于激活经典NF-κB复合物的活化，而IKKα与NF-κB诱导激酶(NIK)相关，它在非经典的NF-κB信号途径中发挥着重要作用(Senftleben，2001，Science)。IKKα在角化细胞分化中也发挥着作用，但是这个过程并不依赖于它的激酶活性(Hu，2001，Nature)。
NEMO蛋白(NF-κB必需调控物)在NF-κB途径活化中发挥着关键作用。NEMO蛋白与被称为IKK复合物的高分子量复合物中的IKKα和IKKβ蛋白激酶相关。IKK激酶经未知机制通过磷酸化而被活化，相信该机制是NEMO寡聚化的结果(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)。NEMO蛋白的存在是IKK活化的基础，因为NEMO缺陷细胞不能应答于多种刺激而活化NF-κB。NEMO是由一个N末端的包括一个大卷曲螺旋(CC1)的IKK结合结构域组成。C末端结构域作用为蛋白的调节部分，已经报道它经常作用为连接多种上游信号传导分子或病毒蛋白的结合模板(Ghosh，1998，Annu.Rev.Immunol.；Santoro，2003，EMBO J.)。有趣的是，主要是在分子的这个部分发现了引起IP和EDA-ID病变的突变(Dffinger，2001，Nature Gen.；Zonana，2000，Am.J.Hum.Genet.)。C末端结构域是由包括两个连续的卷曲螺旋基序CC2(246-286位残基)和LZ(390-412残基)的最小寡聚化结构域(Tegethoff，2003，Mol.Cell Biol.；Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)以及C末端的极远端的锌指基序组成。
应答于促炎症刺激而触发IKK活化的生化机制仍不清楚。已经证实活化T环上的两个丝氨酸残基的磷酸化诱导了IKKβ的活化。但是，导致这个磷酸化事件的机制仍不知道。一个可能的机制包括NEMO寡聚化所诱导的激酶的构型改变(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)。这种寡聚化状态的变化可以通过反式-自磷酸化的机制诱导T环活化(Zandi，1997，Cell；Tang，2003，J.Biol.Chem.)。与NEMO寡聚化在IKK活化中的作用相符合的是，在应答于多种刺激的NEMO缺陷细胞的活化中，最小寡聚化结构域内的突变不能通过遗传学互补解救NF-κB。此外，NEMO的强制寡聚化导致了IKK复合物的完全活化(Inohara，2000，J.Biol.Chem.；Poyet，2000，J.Biol.Chem.；Poyet，2001，J.Biol.Chem.)。最近，已经报道了NEMO应答于TNF-α的磷酸化和泛素化(Carter，2001，J.Biol.Chem.；Trompouky，2003，Nature；Kovalenko，2003，Nature)。但是，仍没有证实这些NEMO修饰是应答于一些促炎症刺激而活化IKK复合物的关键步骤。
对NF-κB活化的抑制形成了一个用于开发新的抗炎症和抗肿瘤药物的特殊靶点(May，2000，Science；Poulaki，2002，Am J Pathol..)。在NF-κB信号途径中发挥着作用的多种蛋白之中，IKK复合物代表着其中一种最有前途的用于发现新的特异的NF-κB抑制剂的分子靶点。为了将在体内的潜在的毒性作用最小化，治疗的成功将极大地依赖于NF-κB抑制剂阻断活化信号而不修饰基本水平的NF-κB活性的能力。May等描述了一种细胞可通透性肽抑制剂，它通过破坏组成型NEMO与IKK激酶的相互作用而特异地阻断促炎症的NF-κB活化(May，2000，Science；May，2002，J.Biol.Chem.)。经对肽的合理设计改变蛋白功能而调控蛋白-蛋白相互作用为新型治疗药物的基础研究和开发提供了重要工具(Souroujon，1998，Nat Biotechnol.)，特别是对表现出可变的和动态的结合性能的信号蛋白(Pawson，2003，Science)。在文献中已经描述了多个对肽调控物的研究，其中肽通过干扰定位(转移)(Lin，1995，J.Biol.Chem.)、补偿受体(Chang，2000，J.Biol.Chem.)、分子内相互作用(Souroujon，1998，Nat Biotechnol.)和寡聚化(Judice，1997，P.N.A.S.)而调节蛋白功能。在后者中，用不同的肽对HIV-1 gp41融合蛋白的抑制提供了清晰的概念证据(对其综述见Chan，1998，Cell and Eckert，2001，Ann.Rev.Biochem.)。
在这种理论下，对NF-κB活化的抑制提供了一种用于开放新的抗炎症和抗肿瘤药物的有希望的靶点，本发明者已经开始发现侯选的抗炎症和抗肿瘤药物，并提供了筛选相同的抗炎症和抗肿瘤药物的方法。
本发明的一个目的是提供了可用于调节和/或抑制NF-κB信号途径的衍生自NEMO的多肽。
为此，本发明提供了抑制NE-κB信号途径的NEMO衍生多肽。
在本发明的一个实施方式中，NEMO衍生多肽是CC2结构域(小鼠：SEQ ID NO：3或人：SEQ ID NO：14)。
在本发明的另一个实施方式中，NEMO衍生多肽是LZ结构域(小鼠：SEQ ID NO：7或人：SEQ ID NO：16)。
在本发明的一个优选的实施方式中，NEMO衍生多肽经一个间隔序列与一个具有高转导能力的多肽融合。
另外，本发明的另一个实施方式，是编码NEMO衍生多肽(无论是否具有间隔序列及具有高转导能力的多肽)的多核苷酸。
还在本发明的另一个实施方式中，是通过给有治疗需要的对象施用NEMO多肽而调控或治疗NF-κB信号途径所调节的疾病的方法。NF-κB信号途径所调节的疾病包括：炎症应答、肿瘤形成、和病毒感染。
本发明也提供了一种通过给有治疗需要的对象施用NEMO衍生多肽而调节细胞增殖或凋亡的方法。
仍在本发明的另一个实施方式中，是一种通过给有治疗需要的对象施用NEMO衍生多肽而调节抗原刺激的B或T淋巴细胞的方法。
还在另一个实施方式中，本发明还提供了一种鉴定调控NEMO寡聚化的多肽的方法，通过：
a)鉴定出侯选多肽序列；
b)通过用一个间隔序列连接所述的侯选多肽序列与一个具有高转导能力的多肽，生成一个多肽融合构建体；
c)将一种细胞培养物与多肽融合构建体接触；和
d)监测NF-κB信号途径的活性；
e)比较存在所述多肽融合构建体时的NF-κB信号途径的活性与没有所述多肽融合构建体时的NF-κB信号途径的活性，以确定出所述多肽融合构建体造成的相对抑制；和
f)将所述多肽融合构建体造成的相对抑制与NEMO寡聚化相关联。
上面的目的着重于本发明的某些部分。在下面对发明的详细描述中可以找到本发明的其他目的、部分和实施方式。
当通过参照以下的图并结合下面的详细描述更好地理解本发明时，可以容易地获得对本发明以及许多本发明的伴随优点的更完整的认识。
图1：NEMO蛋白的功能结构域。
(A)小鼠的NEMO蛋白含有412个氨基酸以及多个结构域，包括N末端的IKK结合结构域和寡聚化结构域、富脯氨酸基序(PPP)和C末端的锌指基序(ZF)。显示了利用Wolf等(1997，Protein Sci.)开发的算法得到的卷曲螺旋预测(白框)和NLM保守基序(黑框)。标明了对应于第二卷曲螺旋(CC2)和亮氨酸拉链(LZ)基序的NEMO253-337序列(SEQ ID NO：12的235-337位残基)，它包含了所有的NEMO寡聚化所需的决定子(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)，NLM保守基序(SEQ ID NO：12的293-322位残基)用下划线标出，以及用序列下方的圆筒表示卷曲螺旋序列。序列上方的字母表示“a”和“d”位点的七次重复，这是卷曲螺旋序列的重要特点(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol.)。对来自小鼠(Mm)、人(Hs)、牛(Bt)和果蝇(Dm)的NEMO蛋白的多个序列对比显示NEMO样基序(NLM)共享不同种属的NRP/optineurin、ABIN-1/Naf1、ABIN-2和ABIN-3/LIND(分别是SEQ ID NOs：19-29)。通过利用CLUSTAL W(Thompson，1994，N.A.R.)对PSI-BLAST生成的序列片段的最高积分对的分析以及重新排列对比构建出多个序列对比。分别用(！)或(*)表示相同的和相似的氨基酸残基(阴影部分)。
图2：NEMO肽摄取的流式细胞术分析
(A)通过与Antennapedia肽缀合而介导NEMO肽的细胞转运。将70Z/3细胞在不存在(W/O)或存在所示的2μM BODIPY标记的Ant-CC2野生型肽(WT)、或Ant-CC2突变型肽(Mu)、或Ant-LZ(WT)野生型肽或Ant-LZ突变肽(Mu)时，在37℃下培养2h，或与对应于2μMBODIPY缀合的BSA(BODIPY-BSA)或BODIPY-FL本身的对照一起培养。(B)Antennapedia介导的70Z/3-C3细胞在37℃下5h对0、0.2、2和20μM Ant-CC2的摄取的浓度依赖性(左边)以及对在37℃下加入20μMAnt-CC2后0、0.5、1、2或5h时的BODIPY缀合的Ant-CC2的FACS的动力学分析。
图3：用细胞可通透性Ant-CC2和Ant-LZ肽对LPS诱导的NF-κB活化的抑制。
(A)用pIL1-β-半乳糖苷酶(携带有在NF-κB控制之下的β-半乳糖苷酶基因)稳定转染70Z3B淋巴细胞(见“材料和方法”)。将所生成的细胞株70Z3-C3孵育2个小时，有或没有20μM Antennapedia肽(Ant)、或BODIPY标记的Antennapedia肽(BODIPY-Ant)、或与CC2结合的BODIPY标记的Antennapedia肽(BODIPY-Ant-CC2)或LZ(BODIPY-Ant-LZ)肽。在细胞内吞摄取肽之后，用LPS(3μg/ml，左侧的(+))处理细胞5个小时，或不处理(右侧和左侧的(-))，并用β-半乳糖苷酶检测法测定NF-κB活性。误差栏表示三次不同试验的标准差。(B)用BODIPY-Ant-CC2肽(左侧)或BODIPY-Ant-LZ肽(右侧)对LPS诱导的NF-κB活化的抑制的浓度依赖性。如和(A)中一样，但用不同浓度的所示的肽处理细胞。通过确定IC50值(对应于与对照比较(无肽时)，对LPS诱导的NF-κB活性的50％抑制)，测定出每种肽抑制LPS诱导的NF-κB活化的能力。(C)、(D)N端Antennapedia融合序列对抑制NF-κB活化的影响。将对照(无肽)或CC2、或LZ肽(在其N末端具有(BODIPY-ANT-CC2、BODIPY-ANT-LZ)或不具有(CC2、LZ)Antennapedia序列)与70Z3-C3细胞一起孵育2个小时，随后用(+)或不用(-)LPS处理3个小时。然后用β-半乳糖苷酶检测法测定NF-κB活性。
图4：对应答于LPS的NF-κB活化的特异抑制依赖于CC2和LZ卷曲螺旋的疏水核心中的少数突变。
左侧图表示CC2(A)和LZ(B)肽的螺旋轮状图。视图取自分子顶部。从(a)到(g)位点是卷曲螺旋序列的基本特征(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol.)，它们代表每个肽序列中的序列位点。第一个(a)和第四个(d)位点通常是由疏水性氨基酸所占据，它们构成了平行的和反向平行的卷曲螺旋的疏水核心。显示了被引入到CC2变异体的(a)位点的突变(BODIPY-Ant-CC2(Mu)；如SEQ ID NO：3的6-40位残基所示，具有对应于SEQ ID NO：5的6-40位残基的甘氨酸突变)或LZ变异体的(d)位点的突变(BODIPY-Ant-(Mu))。在右侧图中，将70Z3-C3细胞孵育2个小时，没有(对照)或有10μM野生型(BODIPY-Ant-CC2(WT))或突变型(BODIPY-Ant-CC2(Mu))CC2肽(A)或野生型(BODIPY-Ant-LZ(WT))或突变型(BODIPY-Ant-(Mu))LZ肽(B)。然后充分地洗涤细胞以去除过多的还没有被细胞内吞的肽，然后将细胞稀释3倍，并容许在用(+)或不用(-)LPS处理5个小时之前生长24个小时。用β-半乳糖苷酶检测法测定NF-κB活性。误差栏代表两次独立试验的标准差。
图5：通过特异的卷曲螺旋链的形成而发生LZ肽对NF-κB活化的抑制。
(A)NEMO衍生LZ(SEQ ID NO：12的301-336位残基)和GCN4肽(SEQ ID NO：8的23-55位残基)的序列对比。利用CLUSTAL X排列对比两种卷曲螺旋基序。分别用(！)或(*)表示相同的和相似的氨基酸残基(阴影部分)。(B)GCN4卷曲螺旋的概况及螺旋轮状图(顶视图)。用其相对应的[a-g]位点显示出GCN4的氨基酸序列，并根据它们的保守程度框出不同于相应的NEMO衍生LZ序列的残基。表明了相同的(空方块)和相似的残基(空三角)。(C)细胞可通透性NEMO衍生LZ和GCN4肽对LPS诱导的NF-κB活化的抑制作用的比较。将70Z3-C3细胞孵育2个小时，没有(无肽)或有10μM Antennapedia融合LZ(BODIPY-Ant-LZ)或GCN4(BODIPY-Ant-GCN4)肽。然后充分地洗涤细胞以去除任何没有被细胞内吞的过量的肽，并稀释3倍以促进在用(+)或不用(-)LPS处理5个小时之前生长24个小时。用β-半乳糖苷酶检测法测定NF-κB活性。误差栏代表两次独立试验的标准差。
图6：具有或不具有Antennapedia序列的NEMO衍生多肽的寡聚化性能。
将10μM浓度的所有的肽都装柱到superdex75HR10/30柱中，柱已在含有0.1mM DDM的缓冲液中被平衡以提高回收(见“材料和方法”)。在左侧图中显示了与Antennapedia序列融合(BODIPY-Ant-CC2(WT)、BODIPY-Ant-CC2(Mu))或没有融合(CC2(WT)、CC2(Mu))的CC2突变体(虚线)和CC2野生型(实线)的色谱图，并在左侧图形中显示了与Antennapedia序列融合(BODIPY-Ant-LZ(WT)、BODIPY-Ant-LZ(Mu))或没有融合(LZ(WT)、LZ(Mu))的LZ突变体(虚线)和野生型(实线)的洗脱图。用箭头表示球蛋白标记物的洗脱体积：Oval，卵白蛋白(43kDa)；Chym，糜蛋白酶基因A(25kDa)；Ribo，核糖核酸酶(13.4kDa)和Apro，抑肽酶(6.5kDa)。
图7：Ant-CC2和Ant-LZ肽与CC2肽的结合。
(A)通过荧光各向异性用CC2直接滴定BODIPY-Ant-CC2(1μM)。用氨基酸分析确定CC2的浓度。标绘出毫单位(mA)BODIPY-Ant-CC2的各向异性数值对渐增浓度的CC2肽的曲线。将数据点安放到(fitted)(实线)KD为15.2μM的等温结合方程式中(材料和方法)。两条虚线代表化学当量滴度以及在CC2浓度为16μM时的相交线。假定为1μM浓度的BODIPY-Ant-CC2，得出复合化学计量为0.8。(B)通过荧光各向异性用CC2直接滴定BODIPY-Ant-LZ(1μM)。给出了单独毫单位(mA)的BODIPY-Ant-LZ(白框)时或存在CC2肽(30μM，灰框；100μM，黑框)时的各向异性数值。
图8：Ant-CC2和Ant-LZ肽诱导的视网膜母细胞瘤细胞株Y79的细胞死亡。
用不同浓度的Ant-CC2(WT)(实方块)或Ant-CC2(Mu)(空方块)(A)、或Ant-LZ(WT)(实心圆)或Ant-LZ(Mu)(空心圆)(B)、或Ant肽(空三角)(C)处理Rb细胞株Y793个小时(A、B)或16个小时(C)。然后用在“材料和方法”中所述的MTS检测法评价细胞存活。
除非有特别的定义，在此所用的所有技术和科学术语都具有与酶学、生物化学、细胞生物学、分子生物学、和材料科学领域的熟练人员所通常理解的相同含义。
在本发明的实践或测试中可以施用所有与在此所述的合适的方法和材料相似的或等价的方法和材料。通过引用将在此所提及的所有出版物、专利申请书、专利、或其他参考文献的全部内容并入本申请。本说明书包括定义将控制利益冲突。此外，材料、方法和实施例都只是举例说明，并不是一种对发明的限制，除非有不同的说明。
在本申请中，本发明者研究了被设计用于破坏NEMO寡聚化的肽对NF-κB活化的抑制。本发明者先前已经显示最小三聚体化区包括CC2-LZ卷曲螺旋亚结构域，以及分离的和/或纯化的CC2和LZ结构域彼此相互结合形成一种稳定的异二聚体的三聚体。这个结构模型使人想起来自HIV-1的gp41外功能结构域的折叠(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)。它包括一个中心的三链的卷曲螺旋(由NEMO的CC2卷曲螺旋基序组成)，围绕其周围的是来源于NEMO的C末端的LZ螺旋基序，它们以反向平行的方式包绕在CC2卷曲螺旋的外侧。根据这个模型，本发明者合理地设计出了两种对应于CC2或LZ亚结构域的优化部分的细胞可通透肽，它们模仿了NEMO亚基之间的接触区域。用FACS监测肽转导，以及在稳定转染的前B 70Z/3淋巴细胞中，用NF-κB依赖的β-半乳糖苷酶检测法定量了它们对LPS诱导的NF-κB活化的作用。本发明者也已经证实LZ肽和CC2肽(较小程度)特异地抑制了NF-κB活化，IC50值为μM范围。作用是特异的，因为对照肽包括突变的CC2和LZ肽以及异源的卷曲螺旋肽(GCN4)对NF-κB活化都没有抑制作用。此外，本发明者已经显示这些NF-κB肽抑制剂诱导了表现出组成性NF-κB活性的人视网膜母细胞瘤细胞株Y79的细胞死亡。总而言之，本发明者已经提供了一种通过靶向于NEMO寡聚化而抑制NF-κB途径的新的和有前途的策略。
本发明者已经证实NEMO构成了一种用于寻找抑制NF-κB信号途径的药物的优选靶点，因为这种蛋白作用为NF-κB活化途径的上游。在下面的文章中部分研究并发表了NEMO的作用以及它的各种结构域：“NEMO trimerizes through its coiled-coil C-terminal domain.”J Biol Chem，2002May 17；277(20)：17464-75.Agou F.et al.，通过引用将其拷贝并入本申请。
在本发明中，发明者已经合成了模拟寡聚化结构域(CC2结构域＝近40个残基)或LZ基序(LZ结构域＝近40个残基)的肽。这些肽的组合改变了NEMO的寡聚化或NEMO与蛋白效应物的结合，两者都抑制了NF-κB途径。
在本发明的一个方面，已经将肽药物与一种长度为16个氨基酸的肽(penetratin/Antennapedia)化学地组合，据此使得肽药物的细胞内转运成为可能。也可以将所形成的肽与一种荧光示踪物化学地结合，使得能通过FACS监测B淋巴细胞株的细胞内吞作用。
在B淋巴细胞中直接地测试这些肽的作用，这些B淋巴细胞已经稳定地整合了β-半乳糖糖苷酶携带基因，并且在基因的启动子的上游也具有一些转录因子(C3克隆)的活化位点(见下面的实施例)。
通过以LPS对B淋巴细胞进行刺激后测定这些肽的抑制作用，本发明者已经能成功地监测这些肽的抑制作用。
总的结果发现相当低剂量的(20μM)模拟“CC2”基序的肽的存在比对照肽减少了70％的NF-κB活性。在这个浓度，“亮氨酸拉链”肽的作用仍是更为显著的，因为其在培养基中的存在完全地清除了细胞应答。
这些NF-κB信号途径的新的抑制剂提供了一种作为抗炎症化合物以及也作为抗肿瘤化合物的主要优点，它们可以被用于癌症和其他疾病的治疗和/或预防。
本发明涉及被用于调控NEMO的寡聚化的化合物、肽、或组合物。具体地，在此下面所描述的肽化合物可以是分离的和/纯化的或与或没有与载体试剂结合的形式。要明白本发明也包含具有与NEMO衍生多肽具有至少70％同源性的肽，只要同源物具有所述的抑制活性。下面提供了用于评价NEMO衍生多肽以及其同源物的抑制活性的方法，并在本申请的实施例部分有举例说明。当与对照肽比较，NF-κB活性减少至少50％时，就认为本发明的肽及其剂量具有抑制活性。
本发明也涉及含有所述肽的药物组合物，特别是在制备用于治疗炎症应答、肿瘤形成、病毒感染、调节细胞增殖和凋亡以及抗原刺激的药物的药物组合物。在一个优选的实施方式中，含有所述肽的药物组合物可用于治疗癌症。
本发明也包括获得、制备、和鉴定抑制NF-κB信号途径的肽和化合物的方法，特别是通过70Z/3-C3细胞株，70Z/3-C3是在2003年4月1日保藏于法国微生物保藏中心(CNCM，28rue du Docteur Roux，75724PARIS Cedex 15，法国)的细胞株，保藏号为I-3004。
术语“减少”或“抑制”在此意味着直接或间接地降低NF-κB途径中的一种或多种酶的细胞内活性。短句“抑制NF-κB途径”优选地意味着通过破坏NEMO寡聚化而抑制NF-κB途径。
术语“增强”在此意思是增加由相应DNA编码的NEMO衍生肽的细胞内活性或浓度。在对细菌细胞的各种操作的帮助下，可以实现增强作用。为了获得增强作用，特别是过度表达，可以增加相应基因的拷贝，可以使用强启动子，或可以突变位于结构基因上游的启动子和调节区域或核糖体结合位点。整合结构基因上游的表达框以相同的方式发挥作用。另外，通过采用诱导型启动子增加表达也是可能的。也可以使用编码具有高活性的相应酶的基因。通过延长mRNA寿命的措施也可以提高表达。此外，作为总的结果，阻止酶的降解也就增加了酶活性。因此，可以以任何所需的方式任意地组合这些措施。例如如在Methods in PlantMolecular Biology，Maliga et al，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1995)中所述的，这些和其他的用于改变植物中的基因活性的方法是已知的。
也可以使用编码相应的或不同的具有高活性的抑制NF-κB途径的NEMO衍生肽的基因。优选地，相应的酶比天然形式的NEMO蛋白具有更高的抑制NF-κB途径的能力，更优选地至少是5％、10％、25％或50％更多的抑制。最优选地，与存在天然NEMO蛋白时的NF-κB途径比较，本发明的NEMO衍生肽减少NF-κB途径至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％。
在本申请中，一种多核苷酸序列与本发明的序列是“同源的”，条件是它的至少70％、优选地至少80％、最优选地至少90％的碱基组成和碱基序列对应于本发明的序列。根据本发明，“同源蛋白”或“同源肽”被理解为包括含有至少70％、优选地至少80％、最优选地至少90％的氨基酸序列都对应于NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列(对于人来源的NEMO)的蛋白(肽)，其中对应被理解为意思是相对应的氨基酸或是相同的或是互为同源的氨基酸。如本发明的实施例所表明的，还要明白CC2的同源肽优选地保留了卷曲螺旋基序结构以及LZ的同源肽优选地保留了螺旋基序结构。用通过对SEQ ID NO：3、SEQID NO：7、SEQ ID NO：14、和SEQ ID NO：16的鉴定以及下面实施例中的详细描述所提供的指导，对本发明范围内的理论突变的筛选将不会要求超出本领域人员的技术水平以外的技术。更具体地，作为本领域的一种常规技术，通过对侯选序列(即对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14、和SEQ ID NO：16的区域)的鉴定，技术人员将检测并筛选所述序列的一种或所有可能的预突变，以鉴定出具有相同的或更好的治疗疗效的突变体。
用语“同源氨基酸”表示那些具有对应性能的氨基酸，特别是其电荷、疏水性状、立体性能等等。
通过使用已知的软件或计算机程序例如BestFti或Gap配对比较程序(GCG Wisconsin Package，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin 53711)可以常规地确定出核苷酸或氨基酸序列的同源性、序列相似性或序列相同性。BestFit使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981))的局部同源性算法以找出两个序列之间的最佳相同性或相似性的片段。Gap实施总体对比：利用Needleman和Wunsh(J.Mol.Biol.48：443-453(1970))的方法进行一种序列的所有氨基酸与另一种相似序列的所有氨基酸的对比。当使用例如BestFit的序列对比程序确定序列同源性、相似性或相同性的程度时，可以使用缺省设置，或可以选择合适的积分矩阵以优化相同性、相似性或同源性积分。相似地，当使用例如BestFIt的程序确定两种不同氨基酸序列之间的序列相同性、相似性或同源性时，可以使用缺省设置，或可以选择合适的积分矩阵例如blosum45或blosum80以优化相同性、相似性或同源性积分。
本发明也涉及编码NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：16)(对于人来源的NEMO)或其片段的多核苷酸，通过用含有编码NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：16)(对于人来源的NEMO)的所述多核苷酸或其片段的序列的探针与对应的基因库的杂交以及对所述DNA序列的分离的方式，通过筛选可以得到这些多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸序列适合用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离那些表现出与编码NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：16)(对于人来源的NEMO)的序列或其片段的高度相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列也适合用作用于生成DNA的聚合酶链反应(PCR)的引物，所述DNA编码具有抑制NF-κB途径的能力的NEMO衍生多肽。
寡核苷酸例如那些作用为探针或引物的寡核苷酸可以含有30多个核苷酸，优选地最多到30个，更优选地最多到20个，最优选地含有至少15个连续核苷酸。具有长度为至少40个或50个核苷酸的寡核苷酸也是适合的。
术语“分离的和/或纯化的”意思是与其天然环境分开。
术语“多核苷酸”通常指的是多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，并且可以表示未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。
术语“多肽”被理解为意思是含有两个或多个经肽键连接在一起的氨基酸的肽或蛋白。
本发明的多肽包括对应于NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：16)(对于人来源的NEMO)的多肽或其片段，特别是那些具有抑制NF-κB途径的生物活性的多肽，本发明的多肽也包括那些其氨基酸序列的70％、优选地至少80％与对应于NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：16)(对于人来源的NEMO)的多肽或其片段同源的多肽，以及最优选地包括那些表现出与对应于NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ IDNO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：16)(对于人来源的NEMO)的多肽或其片段具有至少90％到95％同源性的多肽，并且它们都具有所述的活性。
本发明也涉及通过对遗传密码子的降解编码编码NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：16)(对于人来源的NEMO)的DNA序列或其片段。本领域人员知道上面所提及的DNA序列可以依据于小鼠来源的NEMO(SEQID NO：11)和人来源的NEMO(SEQ ID NO：17)的全长DNA序列，以及据此可以用这些序列查明本发明的这些序列的范围。
以相同的方式，本发明还涉及与编码NEMO的CC2区域(SEQ IDNO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ IDNO：16)(对于人来源的NEMO)的DNA序列或其片段杂交的DNA序列。
此外，本领域人员也知道作为“有义突变”的蛋白中的保守氨基酸取代例如用丙氨酸对甘氨酸的取代或谷氨酸对天冬氨酸的取代不会造成蛋白活性的任何根本的变化，即它们在功能上是中性的。也知道蛋白的N或C末端的变化基本上不会损害蛋白的功能，并且甚至可能稳定所述的功能。
以相同的方式，本发明也涉及与编码NEMO的CC2区域(SEQ IDNO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ IDNO：16)(对于人来源的NEMO)的DNA序列或其片段杂交的DNA序列。本发明也涉及利用从编码NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：3)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：7)(对于小鼠来源的NEMO)以及NEMO的CC2区域(SEQ ID NO：14)或NEMO的LZ区域(SEQ ID NO：16)(对于人来源的NEMO)的DNA序列或其片段所产生的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应(PCR)所生成的DNA序列。这种类型的寡核苷酸的长度通常为至少15个核苷酸。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指的是在该条件下，多核苷酸将与其靶序列以比其他序列可检测到的更高程度杂交(例如，比背景至少高2倍)。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中可以有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探查)。或者，可以调整严格条件以容许序列中的错配，这样可以检测出更低程度的相似性(异源探查)。
严格条件通常是那些盐浓度小于约1.5M Na离子(在pH为7.0到8.3时，通常为约0.01到1.0M Na离子浓度(或其他盐))和温度至少是约30℃(短探针，例如10到50个核苷酸)以及至少是约60℃(长探针，例如超过50个核苷酸)的条件。通过加入去稳定剂例如甲酰胺也可以实现严格条件。举例说明的低严格条件包括用30到35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃下杂交，以及用1X到2XSSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M枸橼酸钠)在50到55℃下洗涤。举例说明的中度严格条件包括在40到45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS溶液中在37℃下杂交，以及用0.5X到1X SSC在55到60℃下洗涤。举例说明的高度严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS在37℃下杂交，以及用0.1X SSC在60到65℃下洗涤。
特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交，从Meinkoth和Wahl的方程式(Anal.Biochem.，138：267-284(1984))：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L中可以近似得到Tm；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比；％form是杂交溶液中的甲酰胺的百分比，以及L是杂交体的碱基对的长度。Tm是其中50％的互补靶序列与完全匹配探针杂交时的温度(在给定的离子强度和pH值下)。每1％错配使得Tm降低约1℃；因此，可以调整Tm、杂交和/或洗涤条件使得与所需相同性的序列发生杂交。例如，如果要寻找有着近似90％相同性的序列，可以降低Tm 10℃。在给定的离子强度和pH值下，所选定的严格条件通常比特异序列及其互补序列的热熔点(Tm)约低5℃。但是，高度严格条件可以利用在比热熔点(Tm)低1、2、3或4℃下进行杂交和/或洗涤；中度严格条件可以利用在比热熔点(Tm)低6、7、8、9、或10℃下进行杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用在比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20℃下进行杂交和/或洗涤。利用方程式、杂交和洗涤组成、以及所需的Tm，本领域的一般人员明白这内在地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变异。如果所需程度的错配使得Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选地增加SSC浓度使得可以使用更高的温度。在Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(2000)中可以找到对核酸杂交的详细指南。
因此，根据上述的信息，本领域人员可以鉴定并分离和/或纯化多核苷酸，其与本多核苷酸基本上相似。在这样分离到的这些多核苷酸中，可以将多核苷酸用作例如抑制NF-κB途径的多核苷酸。
本发明的一个实施方式是筛选与本发明的多核苷酸基本上同源的多核苷酸的方法，优选地是那些编码具有抑制NF-κB途径的能力的蛋白的多核苷酸。
本发明的多核苷酸序列可以被携带于一种或多种合适的质粒载体上，如在植物等领域所已知的那样。
在一个实施方式中，用适合于细胞类型的合适载体将其携带在细菌或真菌的菌株上，这对于繁殖多核苷酸可能是有益的。在这些细胞类型中繁殖多核苷酸并生成蛋白的常见方法在本领域是已知的，以及在例如Maniatis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1982)and Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1989)中有所描述。
依据SEQ ID NO：3(NEMO蛋白的CC2区域，即SEQ ID NO：12的246-286位氨基酸)和SEQ ID NO：7(NEMO蛋白的LZ区域，即SEQ IDNO：12的390-412位氨基酸)描述上述的实施方式，其中SEQ ID NO：12是小鼠来源的NEMO。还根据SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16(两者都来源于SEQ ID NO：18，人来源的NEMO)描述了上述的实施方式。但是，要明白本发明优选地提供了NEMO蛋白的肽衍生物，它可以被内吞到真核细胞内。通过NEMO肽衍生物、或其同源物与具有高转导能力的多肽的融合可以传导对NEMO衍生物的内吞作用。熟练人员可以容易地知道术语“高转导能力”在此意思是多肽和其融合蛋白容易横穿细胞膜，使得融合肽被内吞到细胞环境内。具有高转导能力的肽的实例包括：Antennapedia/penetratin蛋白(Ant)(Prochiantz，2000，Curr.Opin.CellBiol.)的第三螺旋、TAT来源肽(Fawel，1994，P.N.A.S.)、来自HSV-1的VP22(Stroh C.2003，Oncogene)、Pep1(Morris，2001，Nature Biotech.)。
为了举例说明本发明以及其用处，本发明者已经将SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7与内吞肽Ant(SEQ ID NO：1)融合，两者被短SKGMQ连接子(SEQ ID NO：9)或LKAQADI连接子(SEQ ID NO：10)所分离。所形成的Ant-CC2构建体具有序列：CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMQLEDLRQQLQQAEEALVAKQELIDKLKEEAEQHKIV(SEQ ID NO：2)，其中已经加入了N末端的半胱氨酸，用于结合荧光团以促进对内吞作用和/或抑制的检测。所形成的Ant-LZ构建体具有序列：CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEYLQEQLEQLQREFNKL(SEQ ID NO：6)，其中已经加入了N末端的半胱氨酸，用于结合荧光团以促进对内吞作用和/或抑制的检测。
在本发明中，N末端的半胱氨酸是一种任选的添加，例如可以从最终的抑制肽中删除这个残基。另外，在本发明中，具有高转导能力的肽(例如Ant)与CC2或LZ肽之间的连接子可以是不同的序列和/或长度，只要连接子序列没有显著地减弱CC2或LZ肽的抑制性能。为此，连接子的长度范围可以是1-35个氨基酸，优选地是2-25个氨基酸，最优选地是4-10个氨基酸。在本发明的一个特别优选的实施方式中，连接子序列是SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的序列。
如上所述，要明白CC2的同源肽优选地保留卷曲螺旋结构以及LZ的同源肽优选地保留螺旋基序结构，既便在如上所述的融合构建体中也是如此。这样，本发明包括在上面的同源性规定范围之内的SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：6(小鼠来源)以及SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15(人来源)的同源肽，并且所述的同源肽分别保留了CC2和LZ的结构以及抑制NF-κB途径的能力。
在本发明的一个实施方式中，本发明者探讨了野生型NEMO的N末端结构域，特别是在图1A中所示的NLM保守基序(SEQ ID NO：12的293-322位残基)。至此，生成了下面的序列(见表1的相应序列)：
NLM-DR(SEQ ID NO：30)
Ant.NLM-DR(SEQ ID NO：31)
Tat NLM-DR(SEQ ID NO：32)
R7-NLM-DR(SEQ ID NO：33)
R9-NLM-DR(SEQ ID NO：34)
NLM-DR是一种来源于在图1A所设定的更大的30个氨基酸的保守NLM基序的21个氨基酸“基序”(以及对应的覆盖相同的氨基酸范围的野生型NLM)。NLM-DR已经是野生型NLM序列的突变形式，其中野生型序列中的11位残基上的天冬氨酸已经被精氨酸所取代(见表1和SEQID NO：30)。如结构研究所确认的，选择出这个突变，因为所形成的多肽将促进分子内形成盐桥连接，容许稳定螺旋形式的肽。
从圆二色性研究(CD)中，发现CC2和LZ肽都采用螺旋结构，并依赖于它们的浓度。CC2形成了比LZ更为稳定的螺旋。RMN和RayonX衍射研究已经确认了CC2的结构。通过CD研究，NLM-DR肽一直被构建作为比野生型肽更为稳定的螺旋。
尽管在这个实施例中所利用的多肽为21个氨基酸长度，但是在本发明中要关注的是NLM片段的可操作的大小可以短到15个氨基酸。另外，任何能增强螺旋性以及肽与其分子靶点之间的分子之间相互作用的NLM多肽序列内的突变将是特别有意义的，并在本发明的范围之内。
在本发明中，推测Antennapedia介导的肽单聚体化可能是关键的。具体地，推测单聚体化容许它们干扰NEMO寡聚化。
核因子-κB(NF-κB)信号传导是一种必需的信号途径，它涉及炎症应答、肿瘤形成、病毒感染、细胞增殖和凋亡的调节；以及对抗原刺激的B和T淋巴细胞的调节(Ghosh，1998，Annu.Rev.Immunol.；Karin，1999，J.Biol.Chem.；Israel，2000，Trends Cell Biol.；Santoro，2003，EMBOJ..)。这样，本发明的肽可用于调控和/或治疗炎症应答、肿瘤形成、病毒感染；调节细胞增殖和凋亡；以及调节抗原刺激的B或T淋巴细胞。因此，本发明提供了一种治疗所述病变的方法，通过给有治疗需要的对象施用本发明的肽。
在本发明中，“有治疗需要的对象”可以是人、家养动物、农场动物、或一般在野地发现的动物。例如，对象可以选自人、狗、猫、马、牛、小鼠、豚鼠、羊、猪等。
所施用的肽的量清楚地依赖于其所被施用的对象。对于对象是人的情况，所施用的肽的量将依赖于各种因素，包括患者的年龄、病变的严重度以及患者的既往病史，并且一直都在给药医师的合理判断之内。单次或分开剂量施用给人或其他哺乳动物的本发明的化合物的总的每日剂量可以是单次或多次剂量的例如从0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天的肽的量，优选地是从0.1mg/Kg/天到20mg/Kg/天的肽的量，更优选地是从0.1mg/Kg/天到10mg/Kg/天肽的量。单次剂量组合物可以包含这些量或其约数以补足每日剂量。在一个优选的实施方式中，优选剂量是每日两次施用10mg/患者。在特别优选的实施方式中，施用途径是静脉内施用。
也可以施用本发明的肽作为一种药物施用组合物的成分。换句话说，肽可存在于用于施用给有治疗需要的对象的剂型中。本发明的肽可以是用于抑制NF-κB途径或用于治疗炎症应答、肿瘤形成、病毒感染、细胞增殖和凋亡以及调节抗原刺激的唯一的活性成分。或者，本组合物也可以含有一种或多种可以用于治疗相同的病变的化合物。本发明的肽也可以是在组合物中，该组合物包含一种或多种用于治疗非NF-κB途径所引起的疾病的化合物。
可以单独地或联合一种或多种可药用载体施用治疗有效量的适合于本发明施用的肽。术语“可药用载体”在此意思是无毒的、惰性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、装胶囊材料或任何类型的辅助剂型。可以用作可药用载体的材料的一些实例是糖例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂例如可可脂和栓剂蜡；油例如花生油、棉花籽油、红花油、芝麻油、玉米油和大豆油；乙二醇例如丙二醇；酯例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等张盐水；Ringer液；乙醇和磷酸缓冲液、以及其他的无毒性的兼容的润滑剂例如月桂硫酸钠和硬脂酸镁、以及显色剂、释放剂、包被剂、甜化剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中，根据制剂者的判断。
可以将适合于在本发明中施用的药物组合经口服、经直肠、经鼻、肠外(例如肌肉内、腹腔内、静脉内或皮下注射、或植入)、经脑池内、阴道内、腹腔内、舌下、局部(例如作为粉剂、软膏、或滴剂)、口腔内、经口喷雾、或经鼻喷雾施用给人和其他的动物。可以以适合于每种施用途径的剂型制成药物组合物。
用于口服施用的液体剂型包括可药用的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性NEMO衍生多肽之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂。惰性稀释剂可以包括水或其他溶剂、稳定剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁烯乙二醇、而甲基酰胺、油(特别是，棉花籽油、落花生油、玉米油、芽孢油、橄榄油、蓖麻油、和芝麻油)、甘油、2-四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和山梨糖的脂肪酸酯、以及它们的混和物。用于口服施用的液体剂型也可以包含佐剂，其包括湿化剂、乳化剂和悬浮剂、甜化剂、调味剂和芳香剂。用于口服施用的其他剂型包括例如在存在无毒性的悬浮剂例如羧甲基纤维素钠的水媒介中含有活性NEMO衍生多肽的水悬浮液，以及在合适的植物油例如花生油中含有本发明的NEMO衍生多肽的油性悬浮液。
根据已知技术利用合适的分散剂或湿化剂及悬浮剂可以制剂成可注射制剂例如无菌可注射的水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是一种无毒的可肠外使用的稀释剂或溶剂的无菌的可注射溶液、悬浮液或乳剂(例如1，3-丁二醇溶液)。在可用的载体和溶剂中，可以被采用的是水、Ringer液、U.S.P.和等张氯化钠溶液。另外，无菌的、非挥发性油通常被用作一种溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的非挥发性油，包括合成的甘油单酯或双酯。另外，在注射剂的制备中可以使用脂肪油例如油酸。
例如可以经截菌滤器通过过滤、或者可以通过与无菌固体组合物形式的灭菌剂(在使用之前，可以将其溶解或分散在无菌水或其他的无菌可注射介质中)结合将可注射制剂灭菌。
为了延长发明的NEMO衍生多肽的作用，常常需要减慢皮下或肌肉内注射的肽的吸收。通过使用具有弱水溶性的晶体或非晶体物质的液态悬浮液可以实现这一点。那么NEMO衍生多肽的吸收率将依赖于它的溶解率，这可以依次地依赖于晶体大小和晶体形式。或者，将药物溶解或悬浮在油性载体中可以实现肠外施用的NEMO衍生多肽形式的延迟吸收。通过形成NEMO衍生多肽的可生物降解聚合物(例如聚乳酸-聚乙醇酸交酯)的微胶囊化基质可以制成可注射的长效剂型。依据NEMO衍生多肽与聚合物的比例以及所采用的特殊聚合物的性质，可以控制NEMO衍生多肽释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括多正酯类和聚酐。通过将NEMO衍生多肽装入与身体组织相兼容的脂质体或微乳剂，也可以制备长效的可注射剂型。
用于经直肠或阴道施用的组合物优选地是栓剂，通过混和本发明的NEMO衍生多肽与合适的非刺激性的赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡可以制备这些栓剂，这些赋形剂或载体在室温下是固体，而在体温下是液体，因此可以溶解在直肠或阴道腔内并释放出肽。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、药丸、小球粒(prill)、粉剂和颗粒。在这些固体剂型中，将肽与至少一种惰性的、可药用的赋形剂或载体混和。另外，固体剂型可以含有一种或多种添加剂、填充剂、粘合剂、湿化剂、崩解剂、阻滞剂、促吸收剂、湿润剂、吸收剂、或润滑剂。合适的添加剂或填充剂的实例包括淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和硅酸、柠檬酸钠和磷酸二钙。合适的粘合剂的实例包括微晶纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和阿拉伯胶。甘油是合适的湿化剂的实例。合适的崩解剂的实例包括琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、玉米淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠。石蜡是合适的延缓溶解剂的实例。任何季铵化合物都可以作为促吸收剂。合适的湿润剂的实例包括十六醇和单硬脂酸甘油酯。合适的吸收剂的实例包括高岭土和膨润粘土。合适的润滑剂的实例包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂硫酸钠。对于胶囊、片剂和药丸而言，剂型也可以包括缓冲剂。
如果需要，利用已知的方法和赋形剂可以将片剂包衣，其可以包括利用例如羧丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯的肠溶包衣。按本领域人员已知的方式可以将片剂制剂，使得能获得本发明的NEMO衍生多肽的持续释放。如果需要，用已知方法可以给这些片剂提供肠溶包衣，例如通过使用醋酸邻苯二甲酸纤维素。它们可以任选地含有遮光剂，并且它们可以是一种组合物，它们仅仅或优选地在肠道的某一部分释放出活性成分，任选地以延迟的方式。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
相似地，用已知的方法可以制备胶囊例如硬的或软的明胶胶囊(含有活性肽以及有或没有添加的赋形剂)，如果需要，用已知的方式可以给其提供肠溶包衣。利用已知方法可以将胶囊的内容物制剂成能给出活性NEMO衍生多肽的持续释放。在这些固体剂型中，可以将活性NEMO衍生多肽与至少一种惰性稀释剂例如蔗糖、乳糖或淀粉混和。在正常的实践过程中，这些剂型也可以包括除惰性稀释剂以外的附加物，例如压片润滑剂和其他压片辅助物例如硬脂酸镁和微晶纤维素。对于胶囊、片剂和药丸而言，剂型也可以包括缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，以及它们可以是一种组合物，它们仅仅或优选地在肠道的某一部分释放出活性成分，任选地以延迟的方式。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
利用这些赋形剂例如乳糖或奶糖以及高分子量的聚乙二醇等等，也可以将相似类型的固体组合物用作软的和硬填充的明胶胶囊中的填充剂。
如果需要，本明的NEMO衍生多肽可以与缓释或靶向转运系统例如聚合物基质、脂质体和微球体等结合。例如通过经截细菌滤器的过滤，或者通过与无菌固体组合物形式的灭菌剂(在使用之前，可以将它们即刻溶解在无菌水或一些其他的无菌注射介质中)的结合可以将它们灭菌。
可以将NEMO衍生多肽制剂成颗粒，有或没有附加的赋形剂。颗粒可以被患者所直接摄入或在摄入之前它们可以被添加到合适的液体载体(例如水)中。颗粒可以含有崩解剂，例如从一种酸和一种碳酸盐或碳酸氢盐结合所形成的泡腾剂，以促进在液体介质中的分散。
用于局部或经皮施用本发明的肽的剂型包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。经皮贴片具有额外的优点，即为身体提供了肽的可控转运。或通过提供速率可控膜或通过将肽分散在聚合物基质或胶中可以控制速率。在无菌条件下，可以将活性成分与一种可药用载体或任何所需的防腐剂或缓冲剂(如果需要)混和。将肽溶解或分散在合适的介质中可以制成这样的剂型。也可以使用吸收增强剂以增加肽穿透皮肤。眼科剂型、滴耳剂、眼膏、粉剂和溶液也是在本发明的范围之内。
用于局部施用的剂型可以包括一种基质，本发明的药用的NEMO衍生多肽可分散于其中，这样使得肽可以与皮肤接触，以便经皮施用肽。通过混和药用的活性NEMO衍生多肽与局部载体(例如动物和植物脂肪、油、凡士林油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润粘土、硅酸、滑石粉和氧化锌、或它们的混和物)，以及与强的经皮促进剂例如二甲基亚砜或丙二醇一起可以制备出合适的经皮组合物。或者，活性NEMO衍生多肽可以被分散在可药用的糊剂、乳膏、胶或软膏基质中。在局部用剂型中所含有的活性NEMO衍生多肽的量将是使得在局部用剂型预期被用于皮肤之上的时间段内转运出治疗有效量的肽的量。
除本发明的NEMO衍生多肽以外，粉剂和喷雾剂可以含有赋形剂例如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末、或这些物质的混和物。喷雾剂可以另外含有常用的推进剂例如氯氟代烃。可以将治疗活性的NEMO衍生多肽制剂成一种组合物，它可以被作为气溶胶分散到患者的口腔或鼻腔内。可以从泵组件或者从含有挥发性推进剂的加压组件中施用这些气溶胶。
也可以通过或从外在来源的连续输注(例如通过静脉内输注)或从放置在身体内的NEMO衍生多肽的来源的连续输注施用在本发明的方法中所用的治疗活性的NEMO衍生多肽。内在来源包括含有NEMO衍生多肽的植入型储存药盒，例如通过渗透可以持续地释放出所输注的多肽，以及植入物可以是(a)一种例如非常保守的水溶性衍生物(例如十二烷酸盐或亲脂酯)形式的液体例如所输注的肽的油性悬浮液，或者可以是(b)一种所输注的NEMO衍生多肽的植入支持物形式的固体，例如合成树脂或蜡状材料。支持物可以是含有全部量的肽的单一体，或一系列的多个体，每个都含有部分量的所转运的肽。在内在来源中所存在的活性肽的量应当是使得在一段长时间内转运了治疗有效量的肽的量。
本发明也涉及有效量的组合物在制备用于调控或治疗有治疗需要的对象中由NF-κB信号途径所调节的疾病的药物中的用途，组合物包括本发明的多肽融合构建体以及一种或多种可药用载体或赋形剂。
根据所述用途的一个有利的实施方式，由NF-κB信号途径所调节的所述疾病选自由炎症应答、肿瘤形成、和病毒感染所组成的组。
本发明也涉及有效量的组合物在制备用于调节有治疗需要的对象中的细胞增殖或凋亡的药物中的用途，组合物包括本发明的多肽融合构建体以及一种或多种可药用载体或赋形剂。
本发明也涉及有效量的组合物在制备用于调节有治疗需要的对象中的抗原刺激的B或T淋巴细胞的药物中的用途，组合物包括本发明的多肽融合构建体以及一种或多种可药用载体或赋形剂。
根据所述用途的一个有利的实施方式，所述对象是人。
根据所述用途的另一个有利的实施方式，所述的有效量的范围从0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天。
根据所述用途的另一个有利的实施方式，用从由口服、经直肠、经鼻、肠外、经脑池内、阴道内、腹腔内、舌下、局部用、和口腔内施用所组成的组中选出的方式施用所述的组合物。
根据所述用途的另一个有利的实施方式，优选地静脉内施用所述的组合物。
本发明还提供了一种鉴定调控NEMO寡聚化的多肽的方法，通过：
a)鉴定出侯选多肽序列；
b)通过经间隔序列将所述的侯选多肽序列与具有高转导能力的多肽连接生成了多肽融合构建体；
c)将细胞培养物与多肽融合构建体接触；和
d)检测NF-κB信号途径的活性；
e)比较存在所述多肽融合构建体时的NF-κB信号途径的活性与没有所述多肽融合构建体时的NF-κB信号途径的活性，以确定所述多肽融合构建体造成的相对抑制；和
f)将所述多肽融合构建体造成的相对抑制与NEMO寡聚化相关联。
在这个方法中，侯选多肽序列优选地具有卷曲螺旋或螺旋结构。更优选地，侯选多肽序列具有20-60个氨基酸。来源于NEMO的候选多肽序列也是优选的。
如在上面的实施方式中所说明的那样，间隔序列的长度范围可以为1到35个氨基酸，但是也可以采用更短的长度(见上)。间隔序列的实例包括：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。另外，具有高转导能力的多肽的实例是具有氨基酸序列SEQ ID NO：11的多肽。
在一个优选的实施方式中，细胞培养物含有已经被NF-κB依赖性β-半乳糖糖苷酶报道基因所转染的前B 70Z/3淋巴细胞。
为了确定多肽融合构建体的确已经结合到细胞培养物所含的细胞内，要求多肽融合构建体具有N末端的半胱氨酸残基。这样，通过半胱氨酸残基与荧光团(例如，BODIPY)的化学反应可以标记多肽融合构建体，使得能通过例如FACS的技术监测细胞摄取。
因此，鉴定调控NEMO寡聚化的多肽的方法也可以包括下面的步骤：
b-1)标记所述的多肽融合构建体；和
c-1)监测对标记的多肽融合构建体的细胞摄取。
另外，通过用标记肽显示NEMO在体内与肽相结合的破坏试验(pull down experiment)，本领域人员也能将NF-κB途径抑制与NEMO寡聚化的调控相关联。可以描述与该肽相结合的NEMO蛋白的寡聚化状态(交联、凝胶过滤)。在体外，荧光Antennapedia标记的CC2或LZ肽与CC2或LZ肽相结合(模拟NEMO寡聚化)所造成的各向异性抑制的增加也能被用于测试在体内抑制NF-κB途径的化合物。
已经概括地描述了本发明，通过参照某些特殊的实施例可以获得更多的了解，除非有其他的说明，实施例在此仅仅是作为举例说明的目的，其无意于限制本发明。
实施例
材料和方法
细胞培养、稳定转染和细胞株
在Courtois等(1997Mol.cell.Biol.)中描述了小鼠前B 70Z/3的生长条件。如在Courtois等中所述的，用质粒cx12lacZ-kB(G.R.Crabtree的馈赠)经电穿孔制备70Z3-C3稳定细胞株，在其IL-2启动子上携带有三个串连拷贝的NF-κB位点(Fiering et al.，1990)，人视网膜母细胞瘤细胞株Y79购自美国标准菌库(Manassas，VA)，并将其培养在加有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基中。
FACS分析
将0.5ml 0.5×106个70Z/3-C3细胞和如图示中所示的不同浓度的肽在37℃下培养不同的时间。将细胞悬浮液在室温下1000xg离心，然后用PBS缓冲液(1ml)洗涤细胞沉淀物3次，并最后将其重新悬浮在500μl含有0.1％叠氮钠的PBS缓冲液中。用FACSabliur(BD生物科学)进行荧光分析，选择每个标本的最小15,000个事件。所有试验都进行两次。
肽的分析和纯化
如Mousson等在2002年(Biochemistry，41 p13611-p13616)中所述的那样，利用连续流式Fmoc/tBu化学(Chan，WC，and White，P.D.(2000)；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis.A pratical approach)在AppliedBiosystems(Foster City，CA)Pioneer肽合成器上合成肽。所有化学试剂都购自Applied Biosystems。用乙酰基阻断肽的N末端，并用氨基阻断C末端。为了随后的特异性标记(见表1)，将单个额外的半胱氨酸残基结合到肽的N末端。
表1：NEMO衍生肽的序列
名称 序列1 理论分子量(Da)  试验分子量(Da) 与人NEMO序列的构建体
BODIPY-Ant B-CRQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：1) 2805.19  2805.06±0.52
BODIPY-Ant-CC2(WT) B-CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMOLED LROOLOO AEEALVAKOELIDKLKEEAEOHKIV(SEO ID NO：2) 7433.01  7433.33±0.46 B-CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMO LEDLKOOLO OAEEALVAKOEVIDKLKEEAEOHKIV(SEO ID NO：13)
CC2(WT) SKGMQ LEDLROOLOOAEEALVAKOELIDKLKEEAEOHKIV(SEQ ID NO：3) 4155.75  4155.86±0.53 SKGMQ LEDLKOOLOOAEEALVAKOEVIDKLKEEAEOH KIV(SEQ ID NO：14)
BODIPY-Ant-CC2(Mu) B-CRQIKIWFQNRRMKWKKSKGMQLEDLRQQ GQQAEEA GVAKQEL GDKLKEEAEQHKIV(SEQ ID NO：4) 7265.18  7265.04±0.35
CC2(Mu) SKGMQLEDLRQQ GQQAEEA GVAKQEL GDKLKEEAEQHKIV(SEQ ID NO：5) 3987.43  3987.43±0.55
BODIPY-Ant-LZ(WT) B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADI YKADFOAE RHAREKLVEKKEYLOEOLEOLOREFNKL(SEQ ID NO：6) 8064.2  8063.9±0.48 B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADI YKADFOAE OAREKLAEKKELLOEOLEOLOREYSKL(SEQ ID NO：15)
LZ(WT) LKAQADI YKADFOAERHAREKLVEKKEYLOEOLEOLOREFN KL(SEQ ID NO：7) 5318.08  5318.21±0.5 LKAQADI YKADFOAEROAREKLAEKKELLOEOLEOLO REYSKL(SEQ ID NO：16)
BODIPY-Ant-LZ(Mu) B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKADFQAERHAREKLVEKKEY SQEQLEQ SQREFNKL(SEQ ID NO：8) 8012.04  8011.98±0.26
LZ(Mu) LKAQADIYIKADFQAERHAREKLVEKKEY SQEQLEQ SQREFNKL(SEQ ID NO：9) 5265.92  5268.82±0.18
名称 序列1 理论分子量(Da)  试验分子量(Da) 与人NEMO序列的构建体
BODIPY-Ant-GCN4(WT) B-CRQIKIWFQNR RMKWKKSKGMQRMKOLEDK VEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER(SEQ ID NO：10) 7315.48  7314.76±0.40
NLM-DR LKAQADIYKA RFQAERHAREK(SEQ ID NO：30) 2570.94  2570.78+/-0.21  LKAQADIYKA RFQAERQAREK(SEQ ID NO：35)
BODIPY-Ant-NLM-DR B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKA RFQAEKHAREK(SEQ ID NO：31) 5317.08  5316.38+/-0.26  B-CRQIKIWFQNRRMKWKKLKAQADIYKA RFQAERQAREK(SEQ ID NO：36)
BODIPY-TAT-NLM-DR B-CYGRKKRRQRRRLKAQADIYKA RFQAERHAREK(SEQ ID NO：32) 4630.17  4630.11+/-0.22  B-CYGRKKRRQRRRLKAQADIYKA RFQAERQAREK(SEQ ID NO：37)
BODIPY-R7-NLM-DR B-CRRRRRRRLKAQADIYKA RFQAERHAREK(SEQ ID NO：33) 4181.65  4181.60+/-0.69  B-CRRRRRRRLKAQADIYKA RFQAERQAREK(SEQ ID NO：38)
BODIPY-R9-NLM-DR B-CRRRRRRRRRLKAQADIYKA RFQAERHAREK(SEQ ID NO：34) 4494.02  4493.81+/-0.23  B-CRRRRRRRRRLKAQADIYKA RFQAERQAREK(SEQ ID NO：39)
(1)在所有的肽中，N末端都含有一个半胱氨酸，以便于特异肽与马来酰亚胺基团的结合，如在“材料和方法”中所述的那样。用黑体突出显示与NEMO序列(纯文本)融合的Antennapedia、TAT和多精氨酸(R7或R9)的序列。可能涉及卷曲螺旋序列的残基用下划线标出，用黑体及下划线标出在CC2和LZ突变体中以及在NLM-DR中被取代的残基。B＝Bodipy(C末端的Bodipy修饰已经被从在序列列表中所示的序列中删除)。在本发明的范围之内，可以去除并如在此所述的施用Bodipy和/或N末端半胱氨酸。
利用逆相中压液相层析法，用0.08％三氟醋酸(TFA)水溶液(pH2.0)中的线性梯度的乙腈(1％/分钟)以18ml/min的流速进行60分钟，在Nucleoprep 20μM C18 100制备柱上直接对粗肽进行纯化。利用0.08％TFA水溶液(pH2.0)中的线性梯度的乙腈(0.5％/分钟)以1ml/min的流速进行20分钟，在Nucleosil 20μM C18 300分析柱上验证肽的纯度。荧光团bodipyFL N-(2氨乙基)马来酰亚胺(Molecular Probes)与巯基的缀合是在等摩尔条件下(pH6)和50mM乙酸铵缓冲液中进行30分钟(暗处)。然后将混和物装柱到Nucleoprep 20μM C18 100制备柱上以纯化BOPIDY缀合的肽。在细胞死亡试验中，用碘乙酰胺处理所有的没有被BODIPY标记的肽以阻止半胱氨酸残基的任何氧化。然后用氨基酸分析定量所有的纯化肽，并用阳离子电喷雾电离质谱法(ES+)最终鉴定。一旦用质谱法验证了肽的完整性以及缀合效率，在505nm或在280nm处(当肽含有芳香族残基时)测定肽的消光系数(见表1)。通过测定肽在280nm和在505nm处的吸光度以及计算吸光率定期地监测标记的稳定性。将所有的肽溶解在水中，储存浓度为2mM。
NF-κB抑制捡测法
在第一种操作中，将220μl加有10％胎牛血清(FCS)和50μM β-巯基乙醇的RPMI 1640的2.2×105个70Z/3-C3细胞放置在96孔板中，并与不同浓度的肽(0到20μM)在37℃、5％CO2孵箱中一起孵育。在两个小时之后，将相等部分的(100μl)每种细胞样本都转移到两个孔中，每个孔都含有105个各种细胞。然后用终浓度为0.5μg/ml的来自流产沙门氏菌(Salmonella abortus)的脂多糖(Sigma)处理一部分细胞5个小时，而另一部分细胞并不被处理。在5个小时之后，将细胞在室温下400xg离心5分钟，然后通过离心用冷PBS(250μl)洗涤细胞沉淀物3次。然后将细胞裂解在裂解缓冲液(25mM三磷酸缓冲液，pH值为7.8，其含有8mM氯化镁、1mM二硫赤藓糖醇、1％Triton X-100、15％甘油和蛋白酶抑制剂混和物(Roche))中，并将样本在4℃下离心20分钟以澄清裂解液。然后将上清保存在冰中，然后将30μl上清用于检测，利用galacton-star作为化学发光底物(BD Biosciences Clontech，Bronstein et al.，1989)，用板发光计(Berthold)测定β-半乳糖苷酶活性。通过将30μl裂解液与反应缓冲液(196μl)以及BD Biosciences所提供的Galacton-star底物(4μl)混和1个小时，以便测定反应的背景。在第二种操作以及一种更严格的检测法中，在内吞肽2个小时之后，将70Z/3-C3细胞(220μl培养基中的2.2×105个细胞)在室温下400xg离心，然后通过离心用200μlPBS洗涤细胞沉淀物3次。然后用完全培养基稀释细胞三倍，并容许细胞生长至少24个小时。下面的步骤与第一种操作一样。
细胞死亡检测法
利用Promega所提供的MTS检测法(CellTiter 96AQueousonesolution cell proliferation assay)进行对细胞死亡的检测。简单地，在37℃，450μl 0.3×106个Y79细胞被用50μl野生型Ant-CC2和Ant-LZ肽(0.1到20μM)或它们的突变型Ant-CC2(Mu)、Ant-LZ(Mu)或Ant处理，或留在无血清的RPMI培养基中未处理。在孵育1或14个小时之后，然后将一部分细胞悬浮液(200μl，0.12×106个细胞)转移到96孔板中，并与含有MTS化合物和phenazine ethosulfate的MTS溶液(40μl)混和。在两个小时之后，利用自动化酶标仪(Bio-TeK Instruments，INC)在490nm处的吸光率测定活细胞所生成的甲(formazan)的量。在显微镜下观察细胞存活，并将其估计为未处理对照值的百分比。通过混和MTS溶液与无细胞的RPMI培养基确定出反应的背景。为了增加细胞死亡检测法的敏感性，本发明者使用无BODIPY标记的肽，因为荧光团的吸收谱与甲产物的吸收谱相重叠。所有的试验都重复两次，在每个试验中，在复孔中重复每种试验条件。
分析凝胶过滤试验
如在Traincard等(2003)所述的那样，用过滤法确定肽的寡聚化状态。简单的，将500μl样本以0.4ml/min的恒定流速装柱到经含有200mM NaCl和0.1mM DDM的50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡过的Superdex 75HR 10/30柱中。在平衡缓冲液中所加入的DDM去污剂的存在使得肽在柱中的吸收被最小化，并增加了肽的回收。在相同的平衡缓冲液中，用蓝dextran 2000(空体积)、二硫赤藓糖醇(总体积)、牛血清白蛋白(67kDa，Rs＝35.2)、卵白蛋白(ovalbumine)(43kDa，Rs＝27.5)，胰糜蛋白酶原A(25kDa，Rs＝21.1)、核糖核酸酶A(13.7kDa，Rs＝16.4)、细胞色素C(12.4kDa，Rs＝17.7)和抑肽酶(6.5KDa，Rs＝13.5)标定柱。
荧光各向异性测定
用装配有激发和发射束的起偏振镜的PTI Quantamaster荧光计进行各向异性测定。该装置施用L构型的PMT。分别用495nm和520nm的激发和发射波长在22℃，在1cm径长的cuvette中进行所有的试验。将激发和发射单色器的通带分别设定在2和4nm。将稳态荧光各向异性表示为毫各向异性(mA)，并根据下面的公式计算：(1)A＝(IVV-GIVH)/(IVV+2GIVH)；(2)G＝IHV/IHH；其中A为各向异性，G是波长依赖性扭曲(distortion)的校正系数以及I是荧光强度组分(下标分别指的是在激发和发射起偏振镜中的垂直和水平位置)。至少进行试验两次，以及每个数据都是在2分钟内的20个记录值的结果。在50mM含有150mM KCl的Tris-HCl缓冲液(pH8)中进行所有的测定。本发明者验证了在所用的BODIPY-Ant-CC2和BODIPY-Ant-LZ浓度上，滤过作用是可忽略不计的。在各向异性测定之前，将BODIPY-Ant-CC2肽在22℃单独或与渐增浓度(1-125μM)的CC2预先孵育过夜。在各向异性测定之前，将BODIPY-Ant-LZ肽在22℃单独或与10μM和100μM浓度的CC2预先孵育过夜(见图7说明)。利用Kaleidagraph非线性回归软件(Synergy软件，reading PA)，通过将各向异性数据全部整合到如Agou等描述的等温结合方程(2004，J Biol Chem.)中，可估计出解离常数参数。从经各向异性数据的下降区和平台区所划出的直线(图7中的虚线)的交点可估计出结合化学计量。
结果
对阳断NF-κB活化的NEMO衍生肽的合理设计
本发明者先前已经证实NEMO的最小三聚体化区包括序列251到337(图1A)。该区域可能含有两个约35个残基的卷曲螺旋序列，位于N末端和C末端分别被称为CC2(残基253-285)和LZ(301-337)。尽管还没有确定出最小寡聚化结构域的结构，但是一些与荧光偏振联合的生化研究提示我们提出CC2/LZ三聚体可能形成了一个六链的螺旋束，其包括紧密扎捆的反向平行定位的CC2和LZ卷曲螺旋(Traincard，2003)，待发表)。此外PSI-BLAST搜索发现NEMO的这个区域含有一个被叫做“NEMO样基序”(NLM)的20个残基的保守基序，四种其他的蛋白共享该保守基序包括ABIN-1(Heyninck，1999，J.Cell.Biol.)、ABIN-2/NAF(Van Huffel，2001，J.Biol.Chem)、ABIN-3/LIND(Staege，2001，Immunogenetics)和NRP/optineurin(Schwamborn，2000，J.Biol.Chem)(图1B)。有趣的是，当绝大多数这些包含ABIN-1(Heyninck，2003，FEBSLetters)、NEMO的C末端结构域(Le Page，2001，Virology)和ABIN-2(Liu WK，2003，Biochemical Journal)或ABIN-3/LIND(Heyninck，2003，FEBS letters)蛋白的保守基序的蛋白在细胞内过度表达时，它们都显示出以显性负向的方式抑制NF-κB活化。两个其他的阐述与NF-κB相互作用的ABIN肽的参考文献也都提到了这一点：WO 99/57133和WO03/00280。
因为破坏NEMO寡聚化代表了一种用于抑制NF-κB活化的潜在的治疗策略，本发明者设计了模拟CC2或LZ序列的NEMO衍生的配体肽(表1)。注意到，与CC2肽不同，LZ肽在其N末端的极远端也含有NLM基序。为了介导所有的肽被摄取到细胞内，本发明者在肽的N末端缀合了一个功能性类似物，它包括来自Antennapedia/penetratin蛋白(Ant)的第三螺旋的16个氨基酸序列。该双向螺旋作用为一种内吞载体(Prochiantz，2000，Curr.Opin.Cell Biol.)。绝大多数Antennapedia融合肽被BODIPY荧光团所标记，以分析每种肽被转导到细胞内的能力。通过在N末端的极远端添加单个半胱氨酸残基进行特异的标记，并用质谱法验证序列的完整性(见“材料和方法”以及表1)。
Antennapedia融合肽介导的对NEMO衍生肽的细胞摄取
通过荧光激活细胞分选术(FACS)监测活细胞对BODIPY标记的NEMO肽的摄取，这是一种用于定量细胞内吞作用的常用方法。图2A显示了对经Ant-CC2(WT)、Ant-CC2(Mu)、Ant-LZ(WT)或Ant-LZ(Mu)BODIPY-肽在37℃处理过2小时的细胞的FACS分析，并将其与那些未处理细胞以及用相同浓度的游离BODIPY或用BODIPY缀合的BSA处理的对照细胞的各向异性进行比较。与Antennapedia肽将肽和蛋白转导到哺乳动物细胞内的作用一致，100％70Z3-C3细胞株被四种不同的NEMO肽相似地转导，说明在经处理的细胞群内所有的细胞都具有近似相同的细胞内浓度的NEMO衍生的BODIPY肽。比较分析说明未处理细胞和经BODIPY-BSA或游离BSA处理的细胞表现出相似的细胞荧光，验证了我们的在FACS分析之前的充分洗涤方案能将表面结合肽在测定NEMO肽内吞作用中的作用最小化(见“材料和方法”)。因此，这些数据说明所观察到的细胞荧光信号主要反映了所转导的NEMO肽的细胞内浓度，并不是在细胞膜表面上的非特异性吸附。
本发明者接下来研究了细胞摄取Ant-CC2 BODIPY肽的动力学和浓度依赖性，要牢记其他NEMO肽的转导也应当以相似的方式进行(图2B和2C)。在加入经0.2、2或20μM BODIPY-Ant-CC2肽在37℃处理过的70Z3-C3细胞5个小时后的FACS分析证实了细胞内浓度的线性依赖性是一种在文献中被广泛报道的Antennapedia融合肽的孵育浓度的函数(Lindsay，2002，Current Opinion in Pharmacology)。值得注意的是，经20μM Ant-CC2在37℃下处理过的细胞在30分钟时就已经达到了最大的细胞内浓度，并仍保持不变直到5个小时。因为，诱导应答于LPS的强的NF-κB活化的时间需要3-5个小时的细胞处理，这些结果说明每种肽的细胞内浓度在LPS刺激期间仍保持恒定。
细胞可通透性CC2和LZ对LPS诱导的NF-κB活化的特异性抑制
为了分析细胞可通透性BODIPY-Ant-CC2和BODIPY-Ant-LZ肽对LPS诱导的NF-κB活化的抑制能力，本发明者用p12XlacZ-kB稳定地转染了小鼠的前B 70Z3细胞株，它携带有在NF-κB转录因子控制下的β-半乳糖糖苷酶报道基因。当用LPS(3μg/ml)处理所形成的70Z3-C3细胞株5个小时时，观察到了LacZ基因的100倍活化，这说明我们的细胞检测法以极好的敏感性监测着应答于LPS的NF-κB活化(图3A，对照“无肽”)。有趣的是，细胞与20μM两种NEMO衍生肽的孵育显著地降低了NF-κB活化。这种下降在BODIPY-Ant-LZ中比在BODIPY-Ant-CC2中更为强烈。抑制作用是因为NEMO序列，因为含有或不含有N末端BODIPY标记的分离的和/或纯化的Antennapedia肽(BODIPY-Ant或Ant)诱导了与对照相同水平的NF-κB活化(图3A)。注意在没有LPS时所测定到的基础NF-κB活性在所有的样品中都是非常相似的，这说明CC2和LZ肽都消除了对LPS的应答性而不影响内在的基础的NF-κB活性。这对于最小化体内的细胞毒性是重要的，体内的细胞毒性主要是对NF-κB抑制所诱导的细胞凋亡所引起的(Chen，2003，Nature Med.)。
为了确定是否BODIPY-Ant-LZ或BODIPY-Ant-CC2肽是最有效的抑制剂，本发明者接下来测定了每种肽的浓度依赖性抑制。如在图3B中所示，两种NEMO肽都表现出对应答于LPS的NF-κB的NF-κB剂量依赖性抑制。BODIPY-Ant-LZ比BODIPY-Ant-CC2抑制NF-κB的作用更强，其IC50值分别是3μM和22μM(图3C)。这种惊人的差异可以被LZ序列中所含有的NLM基序所解释。与NEMO靶点的细胞内性质相同，没有与Antennapedia蛋白转导结构域(PTD)融合的LZ和CC2肽都表现出与对照相同水平的活化(图3D)，证实为了抑制NF-κB，NEMO衍生肽必须跨过细胞膜。总而言之，这些结果说明模拟NEMO寡聚化结构域的两种卷曲螺旋序列的肽是应答于LPS的NF-κB活化的有效的肽抑制剂。
LZ和CC2卷曲螺旋的疏水核心的突变破坏了它们对NF-κB信号途径的特异性抑制。
理论上，如果BODIPY-Ant-LZ或BODIPY-Ant-CC2肽通过与NEMO寡聚化结构域的特异结合而抑制NF-κB活化，破坏卷曲螺旋联系的突变因此应当表现出丧失了抑制NF-κB活化的能力。-螺旋的卷曲-螺旋相互作用已经被广泛地研究，并已经很好地证实了绝大多数控制它们的特异组装的规律(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol.)。七个重复的第一(a)和第四位点(d)所代表的卷曲螺旋界面通常被疏水性氨基酸所占据。大量地排除脯氨酸或甘氨酸以保持螺旋结构。核心的极性残基对亮氨酸的取代是失稳态的，尤其是变化发生在d位点时。考虑到这些原则，本发明者合成了一种BODIPY-Ant-LZ的变体(BODIPY-Ant-LZ(Mu))，其在d位点含有两个突变L→S；以及一种BODIPY-Ant-CC2的变体(BODIPY-Ant-CC2(Mu))，其在a位点含有两个突变L→G以及一个突变I→G(图4A和4B和表1)。为了测试这些突变对对NF-κB活化的潜在抑制的作用，本发明者开发出了一种更为严格的细胞检测法，它包括内吞肽2个小时，随后充分洗涤70Z3-C3细胞以去除细胞外培养基中的任何的残余肽。容许细胞在用LPS诱导NF-κB活化之前生长至少24个小时。通过这种方法，排除了与受体结合的LPS相互作用的肽。与上面所述的细胞检测法一样，BODIPY-Ant-CC2(WT)和BODIDY-Ant-LZ(WT)也抑制了NF-κB活化，分别降低1.7和5.8倍(图4A和4B)，当使用的浓度为10μM时。这说明肽没有竞争性地作用于LPS的受体结合。如预计的一样，CC2变体(BODIPY-Ant-CC2(Mu))的存在并没有影响NF-κB活化，因为β-半乳糖糖苷酶活性与对照中的活性相等(图4A，无肽)。应答于LPS，NF-κB在BODIPY-Ant LZ突变体中的活化比在野生型中更为强烈。但是，与BODIPY-Ant-CC2(Mu)不同，当与对照比较时，观察到了LZ突变体的轻微的抑制作用(15％)。总之，这些数据证实CC2和LZ突变体不能与野生型一样有效地抑制LPS诱导的NF-κB活化。
对NF-κB活化的抑制是由LZ肽的特异性卷曲螺旋相互作用介导的。
利用程序MULTICOIL(Wolf，1997，Protein Science)的计算分析预测5％在排序基因组中所发现的所有推测的ORFs被预测都含有卷曲螺旋基序(Newman，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，以及估计蛋白中的近2-4％氨基酸都采用卷曲螺旋折叠(Berger，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)。这种丰度带来了一个问题，就是是否NEMO衍生的LZ肽在体内保持了其卷曲螺旋相互作用配体的特异性。为了回答这个问题，本发明者合成了另外一种卷曲螺旋肽，其模拟GCN4亮氨酸拉链的序列，并测试了其抑制NF-κB活化的能力。BODIPY-Ant-GCN4在其N末端含有Antennapedia序列以及与CC2序列相同的短的SKGMQ连接子(SEQ IDNO：9)，以便于肽的转运(表1)。在其N末端也用BODIPY标记以使得用FACS监测它的细胞摄取(数据没有显示)。GCN4肽表现出与NEMO的LZ序列的低的序列相似性(22％)，但是相同残基主要都是在d位点上的亮氨酸(图5)。这些残基决定了绝大多数的影响卷曲螺旋寡聚化稳定性的能量(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol.)注意对卷曲螺旋特异性是重要的a位点(Vinson，2002，Mol.Cell.Biol)包括一组不同的氨基酸。虽然GCN4包括疏水性残基以及常用的精氨酸残基，而NEMO的LZ含有两个带电荷的氨基酸R和K(图4B和图5A)。因此位于卷曲螺旋界面上的这些残基似乎决定了卷曲螺旋相互作用的选择性。
图5B显示了10μM浓度的BODIPY-Ant-GCN4抑制应答于LPS的NF-κB活化的作用。为了比较卷曲螺旋序列的作用，本发明者使用了上面所述的严格的细胞检测法。与BODPY-Ant-LZ不同，BODIPY-Ant-GCN4没有抑制NF-κB活化的能力，因为NF-κB活化的水平接近于无肽的对照的水平。总而言之，这些结果强烈地支持NEMO的LZ肽通过选择性卷曲螺旋相互作用而抑制NF-κB活化的假说。
Antennapedia序列诱导NF-κB肽抑制剂的单聚体化
Antennapedia序列是一种蛋白转导结构域(PTD)，它采用了α螺旋的双相结构(Prochiantz，2000，Curr.Opin.Cell Biol.)。当与象CC2或LZ的卷曲螺旋序列的N末端融合时，Antennapedia能通过经分子内相互作用覆盖卷曲螺旋的疏水性界面而改变卷曲螺旋联系。为了检验Antennapedia肽的N-融合对CC2和LZ肽的寡聚化性能的作用，本发明者通过凝胶过滤法分析了在其N末端含有或不含有Antennapedia序列的肽。如图6所示，当与球蛋白标记物比较时，所有含有N末端融合Antennapedia的肽以对应于它们的单体形式的洗脱体积共洗脱。注意，本发明者必须在缓冲液中加入去污剂以降低其cmc，以便提高肽回收率。当以相同的10μM浓度被注射时，没有Antennapedia N融合的CC2野生型和LZ野生型肽都被寡聚化。如最近所报道的(Traincard et al)，CC2(WT)形成了三聚体，而LZ(WT)形成了二聚体。和预期的一样，当用甘氨酸残基取代其中三个脂肪族残基而化学地获得CC2突变体时，其丧失了寡聚化的能力(底下部分，虚线)。对于LZ(突变体)，在d位点的两个L→S突变的作用是较弱的。但是，本发明者仍能检测到10μM浓度的LZ突变体的二聚体化(虚线)，尽管与野生型LZ(实线)比较，突变已经显著地降低了二聚体的结合能力。总之，这些数据说明Antennapedia序列与CC2和LZ肽的N-融合改变了同型的卷曲螺旋相互作用，促进了NEMO衍生肽的单聚体化。此外，这些数据也显示在a和d位点上的残基变化改变了LZ和CC2肽的寡聚化。因此，这可能是合成肽形成了螺旋的卷曲螺旋结构。
具有和不具有N融合的Antennapedia序列的CC2和LZ肽的同型和异型相互作用。
因为N融合的Antennapedia修饰了CC2和LZ肽的寡聚化性能，本发明者接下来用荧光偏振研究了用BODIPY标记的Ant-CC2和Ant-LZ单体是否能与缺乏Antennapedia序列的NEMO衍生肽结合。这些CC2和LZ肽也可以被认作为细胞可通透性BODIPY-Ant-CC2和BODIPY-Ant-LZ(NF-κB抑制剂)的体内的结合靶点。图7显示了不同浓度的CC2肽与固定浓度的BODIPY-Ant-CC2的相互作用的典型的结合等温线。结合曲线的形状不是S形的，说明CC2与BODIPY-Ant-CC2的结合没有协同性。从各向异性的起始部分的切线和渐近线之间的截距中计算出的化学计量等于0.8。结合这个化学计量，解离常数KD为15.2μM。如本发明者先前所报道的(插入图7，Traincard等)，当用各种浓度的CC2肽滴定固定浓度的BODIPY-Ant-LZ时，也获得了相似的结果。总之，这些数据证实Ant-CC2和Ant-LZ单体在体外都能与包括NEMO的最小寡聚化结构域的CC2肽结合。
NF-κB抑制剂Ant-CC2和Ant-LZ能诱导人视网膜母细胞瘤细胞的细胞死亡，而它们的突变体Ant-CC2(Mu)和Ant-LZ(Mu)却不能。
组成性活化的NF-κB转录因子与肿瘤形成的一些方面有关已经变得非常清楚(Karin综述)，这包括几乎所有的六种导致正常人体细胞转化成癌细胞的细胞生理学的基本改变(Hanahan，2000，Cell for review)。这造成了对NF-κB抑制剂用作新的抗癌治疗的用途的极大关注。最近已经报告了极有前途的结果，它们利用蛋白酶体抑制剂或SN50肽阻断核转移(Orlowski，2002，Trends in Molecular Medicine；Mitsiades，2002，Blood)。但是，这些药物对NF-κB抑制的特异性已经被置疑。Poulaki等(2002，Am J Pathol.)最近显示用SN50肽处理人视网膜母细胞瘤(Rb)细胞株Y79诱导了癌细胞的凋亡。小鼠和人NEMO蛋白的序列对比说明NEMO的最小寡聚化结构域是严格保守的，提示可以在啮齿类动物和人体细胞中观察到相似的NF-κB抑制作用。
假定特异的NF-κB抑制可以触发癌细胞的凋亡，本发明者检测了细胞可通透性Ant-LZ和Ant-CC2肽对人视网膜母细胞瘤细胞存活率的作用。在这些试验中，本发明者使用没有N末端的BODIPY标记的NEMO衍生多肽，以避免对MTS检测法的任何干扰(见“材料和方法”)。如图7所示，本发明者发现了Y79细胞存活率的剂量依赖性，当用Ant-CC2(图8A)或Ant-LZ(图8B)处理细胞3个小时时。Ant-LZ肽对细胞死亡的作用比Ant-CC2的作用更强。对细胞死亡的诱导是明显的，因为当用20μM浓度的Ant-LZ和Ant-CC2肽分别处理癌细胞3个小时时，Rb细胞存活率分别是20％和65％。值得注意的是，用Ant-CC2(Mu)(图8A)或用Ant-CC2(Mu)(图8B)处理相同的细胞没有诱导出与WT肽一样强的细胞死亡。这些对细胞死亡的作用基本上要归功于NEMO序列，因为用Antennapedia肽处理Y79细胞株更长的时间也不影响细胞存活(图8C)。相反地，当存在5μM浓度的Ant-LZ和Ant-CC2时，分别有80％和55％的Y79细胞死亡(图8C)。总之，这些结果说明Ant-CC2和Ant-LZ肽的特异的NF-κB抑制诱导了Rb细胞株的细胞死亡，确认了特异性NF-κB抑制剂用作抗肿瘤化疗的用途。
在缺乏促炎性信号时，根据MTS检测法、在显微镜下的直接观察以及从FACS分析中推论出的前向散射-FSC和侧向散射-SSC参数，直到浓度为30μM时，被检测的所有的肽对于所检测的淋巴细胞B都没有可检测到的细胞毒性。但是，本发明者可以用FACS检测到浓度依赖性方式的轻微的细胞死亡，当在存在NEMO衍生多肽并用LPS刺激前B淋巴细胞时。在没有刺激时，20μM浓度的Ant-CC2造成的细胞死亡的比例为9％，而在LPS刺激之后，细胞死亡的比例增加到了13％(数据没有显示)。这与NF-κB途径在保护细胞避免凋亡上的作用是一致的。已经报告具有组成性NF-κB活性的Rb细胞株Y79中的细胞死亡是更为显著和快速的(Poulaki，2002，Am J Pathol.)。本发明在此没有用AnnexinV标记和TUNEL方法证实NEMO肽诱导的细胞死亡就是真正的凋亡。然而考虑到NF-κB途径在调节凋亡中的作用，NEMO衍生多肽所诱导的细胞死亡在其本质上就是凋亡是有可能的。
根据上面所得到的结果，不论未来NF-κB抑制剂的性质如何(有机的或模拟肽化合物)，靶向于NEMO寡聚化的抑制剂仍是比那些靶向于IKK激酶活性和NEMO激酶结合的抑制剂更为吸引人的和有前途的策略，因为该分子事件严格地依赖于促炎症信号。因此，这些药物将更少地干扰正常细胞中细胞存活所必需的基础的NF-κB活性。
衍生自野生型NEMO的N末端结构域的肽
本发明者研究了野生型NEMO的N末端结构域，特别是在图1A中所展示的NLM保守基序(SEQ ID NO：12的293-322位残基)。至今，生成了下面的序列(相应的序列见表1)：
NLM-DR(SEQ ID NO：30)
Ant.NLM-DR(SEQ ID NO：31)
Tat NLM-DR(SEQ ID NO：32)
R7-NLM-DR(SEQ ID NO：33)
R9-NLM-DR(SEQ ID NO：34)
NLM-DR是一种从在图1A中所设定的更大的30个氨基酸的保守NLM基序中衍生出的21个氨基酸的“基序”(以及相应的覆盖相同的氨基酸范围的野生型NLM)。NLM-DR是从野生型NLM序列中突变得到的，其中野生型序列中的第11位天冬氨酸残基已经被精氨酸所取代(见表1和SEQ ID NO：30)。
本发明者通过测定相应的协同性指数比较了NLM-DR和相应的NLM肽，这证实了NLM-DR突变肽优于野生型肽。
以Hill系数的方式对“协同性指数”的计算依据于下面的公式：
Boundmax×Ln/(KDn+Ln)
其中，
Boundmax是结合配体的最大浓度；
L是游离配体的浓度；
n是协同性指数以及
KD是蛋白对配体的亲和常数。
通过Hill系数计算的方式所计算出的协同性指数是：
■对于突变的NLM肽(NLM-DR)-解离常数为170μM以及协同性指数为1.4(1326μM)；
■对于野生型NLM肽(NLM)-解离常数Kd为240μM以及协同性指数为2.1(99642μM)；
如果将这些数值与从没有考虑到协同性的曲线中所得到的数值进行比较，NLM-DR肽的亲和力将比野生型NLM肽的亲和力高75倍。
本发明者也评价了上面所提及的NLM-DR形式的生物学相关性结果(IC50和毒性结果)(FACS)，当它们被应用于抑制NF-κB活化途径时。在表2中显示了这些结果：
表2：NLM-DR衍生肽的性能
  细胞毒性*   细胞摄取相对效率(FACS)   IC50
  MTS检测法   细胞形态学
  肽   FACS   显微镜下
  BODIPY-Ant-NLM-DR   no   +   +   +   1.1μM
  BODIPY-TAT-NLM-DR   no   no   no   +   1μM
  BODIPY-R9-NLM-DR   no   no   no   ++   0.9μM
  BODIPY-R7-NLM-DR   n.d.   no   no   ++++   0.9μM
*将用所标明的技术所分析的细胞毒性分级为无毒性(无)到高毒性(++++)；MTS细胞增殖检测法来自Promega；n.d.＝未确定。
对于上面的描述，对本发明的多种修饰和变异都是可能的。因此，要明白在所附的权利要求书的范围之内，可以不同于在此所具体描述的其他方式实践本发明。
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A hovel X-linked disorder of immune deficiency and hypohydroticectodermal dysplasia is allelic to incontinentia pigmenti and due tomutations in IKK-γ(NEMO).
Am.J.Hum.Genet.67，1555-1562.
序列表
<110>巴斯德研究院
国家健康与医学研究院
国立科学研究中心
<120>被设计用于破坏NEMO寡聚化的肽对NF-kB活化的选择性抑制
<150>US 60/530,418
<151>2003-12-18
<150>US 60/505,161
<151>2003-09-24
<160>39
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>1
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys
<210>2
<211>57
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>2
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln
            20                  25                  30
Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val
    50                  55
<210>3
<211>40
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>3
Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala
1               5                   10                  15
Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val
        35                  40
<210>4
<211>57
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>4
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Gly Gln Gln
            20                  25                  30
Ala Glu Glu Ala Gly Val Ala Lys Gln Glu Leu Gly Asp Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val
    50                  55
<210>5
<211>40
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>5
Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Gly Gln Gln Ala
1               5                   10                  15
Glu Glu Ala Gly Val Ala Lys Gln Glu Leu Gly Asp Lys Leu Lys Glu
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val
        35                  40
<210>6
<211>60
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>6
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu
            20                  25                  30
Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Gln Glu
        35                  40                  45
Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu
    50                  55                  60
<210>7
<211>43
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>7
Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Gln Glu Gln
            20                  25                  30
Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu
        35                  40
<210>8
<211>60
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>8
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu
            20                  25                  30
Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Ser Gln Glu
        35                  40                  45
Gln Leu Glu Gln Ser Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu
    50                  55                  60
<210>9
<211>43
<212>PRT
<213>Arti ficial  Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>9
Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Ser Gln Glu Gln
            20                  25                  30
Leu Glu Gln Ser Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu
        35                  40
<210>10
<211>55
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>10
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys Ser Lys Gly Met Gln Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu
            20                  25                  30
Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu
        35                  40                  45
Lys  Lys Leu Val Gly Glu Arg
     50                  55
<210>11
<211>1239
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>11
atgaacaagc acccctggaa gaaccagctg agtgagacgg tgcagcccag tggtggccca    60
gcagaggacc aggacatgct gggtgaagaa tcttctctgg ggaagcctgc aatgctacat    120
ctgccttcag agcagggtac tcctgagacc ctccagcgct gcctggaaga gaatcaagag    180
ctccgagacg ctatccggca gagcaatcag atgctgaggg aacgctgtga ggagctgctg    240
catttccagg tcagccagcg ggaggagaag gagttcctta tgtgcaaatt ccaggaagcc    300
cggaagctgg tggagagact gagcttggag aagcttgatc ttcggagtca gagggaacag    360
gccttaaagg agttggagca actgaagaaa tgccaacagc agatggctga ggacaaggcc    420
tctgtgaaag ctcaggtgac atcattgctc ggagaactcc aggagagcca gagccgtttg    480
gaggctgcca ccaaggatcg gcaagcttta gagggaagga ttcgagcagt tagtgagcag    540
gtcagacagc tggagagtga gcgggaggtg ctacagcagc agcacagcgt ccaggtggac    600
cagctgcgta tgcagaacca gagcgtggag gctgccttgc gaatggagcg gcaggctgct    660
tcagaggaga agcggaagct ggctcagttg caggcagcct atcaccaact cttccaagac    720
tacgacagcc acattaagag cagcaagggc atgcagctgg aagatctgag gcaacagctc    780
cagcaagctg aggaggccct ggtagccaaa caggaattga ttgataagct gaaagaggag    840
gctgagcagc acaagattgt gatggagact gtgccagtct tgaaggccca ggcggatatc    900
tacaaggctg acttccaagc tgagaggcat gcccgggaga agctggtgga gaagaaggag    960
tatttgcagg agcagctgga gcagctgcag cgcgagttca acaagctgaa agttggctgc    1020
catgagtcag ccaggattga ggatatgagg aagcggcatg tagagactcc ccagcctcct    1080
ttactccctg ctccagctca ccactccttt catttggcct tgtccaacca gcggaggagc    1140
cctcctgaag aacctcctga cttctgttgt ccgaagtgcc agtatcaggc tcctgatatg    1200
gacactctac agatacatgt catggagtgc atagagtag                           1239
<210>12
<211>412
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>12
Met Asn Lys His Pro Trp Lys Asn Gln Leu Ser Glu Thr Val Gln Pro
1               5                   10                  15
Ser Gly Gly Pro Ala Glu Asp Gln Asp Met Leu Gly Glu Glu Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu Gln Gly Thr Pro
        35                  40                  45
Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala
    50                  55                  60
Ile Arg Gln Ser Asn Gln Met Leu Arg Glu Arg Cys Glu Glu Leu Leu
65                  70                  75                  80
His Phe Gln Val Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe Leu Met Cys Lys
                85                  90                  95
Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Ser Leu Glu Lys Leu
            100                 105                 110
Asp Leu Arg Ser Gln Arg Glu Gln Ala Leu Lys Glu Leu Glu Gln Leu
        115                 120                 125
Lys Lys Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala Ser Val Lys Ala
    130                 135                 140
Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gln Ser Arg Leu
145                 150                 155                 160
Glu Ala Ala Thr Lys Asp Arg Gln Ala Leu Glu Gly Arg Ile Arg Ala
                165                 170                 175
Val Ser Glu Gln Val Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg Glu Val Leu Gln
            180                 185                 190
Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met Gln Asn Gln Ser
        195                 200                 205
Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Glu Arg Gln Ala Ala Ser Glu Glu Lys
    210                 215                 220
Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Ala Ala Tyr His Gln Leu Phe Gln Asp
225                 230                 235                 240
Tyr Asp Ser His Ile Lys Ser Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu
                245                 250                 255
Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu
            260                 265                 270
Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val Met
        275                 280                 285
Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp
    290                 295                 300
Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu
                325                 330                 335
Lys Val Gly Cys His Glu Ser Ala Arg Ile Glu Asp Met Arg Lys Arg
            340                 345                 350
His Val Glu Thr Pro Gln Pro Pro Leu Leu Pro Ala Pro Ala His His
        355                 360                 365
Ser Phe His Leu Ala Leu Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Pro Glu Glu
    370                 375                 380
Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys Gln Tyr Gln Ala Pro Asp Met
385                 390                 395                 400
Asp Thr Leu Gln Ile His Val Met Glu Cys Ile Glu
                405                 410
<210>13
<211>57
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>13
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gln Gln Leu Gln Gln
            20                  25                  30
Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys
        35                  40                  45
Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val
    50                  55
<210>14
<211>40
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>14
Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gln Gln Leu Gln Gln Ala
1               5                   10                  15
Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu
            20                  25                  30
Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val
        35                  40
<210>15
<211>60
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>15
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu
            20                  25                  30
Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu
        35                  40                  45
Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu
    50                  55                  60
<210>16
<211>43
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>16
Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu Gln
            20                  25                  30
Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu
        35                  40
<210>17
<211>2035
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>17
cgagctggac tgtttctact cctccctcct cctccactgc ggggtctgac cctactcctt    60
gtgtgaggac tcctctagtt cagagacata ttctgttcac caaacttgac tgcgctctat    120
cgaggtcgtt aaattcttcg gaaatgcctc acatatagtt tggcagctag cccttgccct    180
gttggatgaa taggcacctc tggaagagcc aactgtgtga gatggtgcag cccagtggtg    240
gcccggcagc agatcaggac gtactgggcg aagagtctcc tctggggaag ccagccatgc    300
tgcacctgcc ttcagaacag ggcgctcctg agaccctcca gcgctgcctg gaggagaatc    360
aagagctccg agatgccatc cggcagagca accagattct gcgggagcgc tgcgaggagc    420
ttctgcattt ccaagccagc cagagggagg agaaggagtt cctcatgtgc aagttccagg    480
aggccaggaa actggtggag agactcggcc tggagaagct cgatctgaag aggcagaagg    540
agcaggctct gcgggaggtg gagcacctga agagatgcca gcagcagatg gctgaggaca    600
aggcctctgt gaaagcccag gtgacgtcct tgctcgggga gctgcaggag agccagagtc    660
gcttggaggc tgccactaag gaatgccagg ctctggaggg tcgggcccgg gcggccagcg    720
agcaggcgcg gcagctggag agtgagcgcg aggcgctgca gcagcagcac agcgtgcagg    780
tggaccagct gcgcatgcag ggccagagcg tggaggccgc gctccgcatg gagcgccagg    840
ccgcctcgga ggagaagagg aagctggccc agttgcaggt ggcctatcac cagctcttcc    900
aagaatacga caaccacatc aagagcagcg tggtgggcag tgagcggaag cgaggaatgc    960
agctggaaga tctcaaacag cagctccagc aggccgagga ggccctggtg gccaaacagg    1020
aggtgatcga taagctgaag gaggaggccg agcagcacaa gattgtgatg gagaccgttc    1080
cggtgctgaa ggcccaggcg gatatctaca aggcggactt ccaggctgag aggcaggccc    1140
gggagaagct ggccgagaag aaggagctcc tgcaggagca gctggagcag ctgcagaggg    1200
agtacagcaa actgaaggcc agctgtcagg agtcggccag gatcgaggac atgaggaagc    1260
ggcatgtcga ggtctcccag gcccccttgc cccccgcccc tgcctacctc tcctctccCc    1320
tggccctgcc cagccagagg aggagccccc ccgaggagcc acctgacttc tgctgtccca    1380
agtgccagta tcaggcccct gatatggaca ccctgcagat acatgtcatg gagtgcattg    1440
agtagggccg gccagtgcaa ggccactgcc tgccgaggac gtgcccggga ccgtgcagtc    1500
tgcgctttcc tctcccgcct gcctagccca ggatgaaggg ctgggtggcc acaactggga    1560
tgccacctgg agccccaccc aggagctggc cgcggcacct tacgcttcag ctgttgatcc    1620
gctggtcccc tcttttgggg tagatgcggc cccgatcagg cctgactcgc tgctcttttt    1680
gttcccttct gtctgctcga accacttgcc tcgggctaat ccctccctct tcctccaccc    1740
ggcactgggg aagtcaagaa tggggcctgg ggctctcagg gagaactgct tcccctggca    1800
gagctgggtg gcagctcttc ctcccaccgg acaccgaccc gcccgctgct gtgccctggg    1860
agtgctgccc tcttaccatg cacacgggtg ctctcctttt gggctgcatg ctattccatt    1920
ttgcagccag accgatgtgt atttaaccag tcactattga tggacatttg ggttgtttcc    1980
catctttttg ttaccataaa taatggcata gtaaaaatcc ttgtgcatta aaaaa         2035
<210>18
<211>419
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>18
Met Asn Arg His Leu Trp Lys Ser Gln Leu Cys Glu Met Val Gln Pro
1               5                   10                  15
Ser Gly Gly Pro Ala Ala Asp Gln Asp Val Leu Gly Glu Glu Ser Pro
            20                  25                  30
Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu Gln Gly Ala Pro
        35                  40                  45
Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala
    50                  55                  60
Ile Arg Gln Ser Asn Gln Ile Leu Arg Glu Arg Cys Glu Glu Leu Leu
65                  70                  75                  80
His Phe Gln Ala Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe Leu Met Cys Lys
                85                  90                  95
Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Leu Glu Lys Leu
            100                 105                 110
Asp Leu Lys Arg Gln Lys Glu Gln Ala Leu Arg Glu Val Glu His Leu
        115                 120                 125
Lys Arg Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala Ser Val Lys Ala
    130                 135                 140
Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gln Ser Arg Leu
145                 150                 155                 160
Glu Ala Ala Thr Lys Glu Cys Gln Ala Leu Glu Gly Arg Ala Arg Ala
                165                 170                 175
Ala Ser Glu Gln Ala Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg Glu Ala Leu Gln
            180                 185                 190
Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met Gln Gly Gln Ser
        195                 200                 205
Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Glu Arg Gln Ala Ala Ser Glu Glu Lys
    210                 215                 220
Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Val Ala Tyr His Gln Leu Phe Gln Glu
225                 230                 235                 240
Tyr Asp Asn His Ile Lys Ser Ser Val Val Gly Ser Glu Arg Lys Arg
                245                 250                 255
Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Lys Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu
            260                 265                 270
Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala
        275                 280                 285
Glu Gln His Lys Ile Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln
    290                 295                 300
Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu
305                 310                 315                 320
Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu
                325                 330                 335
Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu Lys Ala Ser Cys Gln Glu Ser Ala Arg
            340                 345                 350
Ile Glu Asp Met Arg Lys Arg His Val Glu Val Ser Gln Ala Pro Leu
        355                 360                 365
Pro Pro Ala Pro Ala Tyr Leu Ser Ser Pro Leu Ala Leu Pro Ser Gln
    370                 375                 380
Arg Arg Ser Pro Pro Glu Glu Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys
385                 390                 395                 400
Gln Tyr Gln Ala Pro Asp Met Asp Thr Leu Gln Ile His Val Met Glu
                405                 410                 415
Cys Ile Glu
<210>19
<211>51
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>19
Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val
1               5                   10                  15
Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala
            20                  25                  30
Asp Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys
        35                  40                  45
Glu Tyr Leu
    50
<210>20
<211>51
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val
1               5                   10                  15
Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala
            20                  25                  30
Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys
        35                  40                  45
Glu Leu Leu
    50
<210>21
<211>51
<212>PRT
<213>Bos taurus
<400>21
Glu Val Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val
1               5                   10                  15
Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala
            20                  25                  30
Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys
        35                  40                  45
Glu Phe Leu
    50
<210>22
<211>55
<212>PRT
<213>Drosophila melanogaster
<400>22
Glu Leu Ile Lys Lys Met Gln Leu Asp Ile Asn Glu Leu Lys Ala Arg
1               5                   10                  15
Asp Ile Gln Lys Gln Glu Val Ile Lys Gly Leu Gln Ile Gln Asn Asp
            20                  25                  30
Ile Tyr Arg Arg Asp Phe Glu Met Glu Arg Ala Asp Arg Glu Lys Asn
        35                  40                  45
Ala Gly Glu Lys Asp Gln Tyr
    50                  55
<210>23
<211>51
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>23
Leu Gln Met Asp Glu Met Lys Gln Thr Leu Ala Lys Gln Glu Glu Asp
1               5                   10                  15
Leu Glu Thr Met Ala Val Leu Arg Ala Gln Met Glu Val Tyr Cys Ser
            20                  25                  30
Asp Phe His Ala Glu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Ile His Glu Glu Lys
        35                  40                  45
Glu Gln Leu
    50
<210>24
<211>51
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>24
Leu Gln Met Asp Glu Met Lys Gln Thr Ile Ala Lys Gln Glu Glu Asp
1               5                   10                  15
Leu Glu Thr Met Thr Ile Leu Arg Ala Gln Met Glu Val Tyr Cys Ser
            20                  25                  30
Asp Phe His Ala Glu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Ile His Glu Glu Lys
        35                  40                  45
Glu Gln Leu
    50
<210>25
<211>59
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>25
Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala Ala Phe Gly Ser Pro Glu Gly Val Gly
1               5                   10                  15
Gly His Leu Arg Lys Gln Glu Leu Val Thr Gln Asn Glu Leu Leu Lys
            20                  25                  30
Gln Gln Val Lys Ile Phe Glu Glu Asp Phe Gln Arg Glu Arg Ser Asp
        35                  40                  45
Arg Glu Arg Met Asn Glu Glu Lys Glu Glu Leu
    50                  55
<210>26
<211>59
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>26
Pro Pro Ser Ser Pro Pro Thr Ala Phe Gly Ser Pro Glu Gly Ala Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Leu Arg Lys Gln Glu Leu Val Thr Gln Asn Glu Leu Leu Lys
            20                  25                  30
Gln Gln Val Lys Ile Phe Glu Glu Asp Phe Gln Arg Glu Arg Ser Asp
        35                  40                  45
Arg Glu Arg Met Asn Glu Glu Lys Glu Glu Leu
    50                  55
<210>27
<211>51
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>27
Glu Ala Asn Gln Glu Leu Thr Ala Met Arg Met Ser Arg Asp Thr Ala
1               5                   10                  15
Leu Glu Arg Val Gln Met Leu Glu Gln Gln Ile Leu Ala Tyr Lys Asp
            20                  25                  30
Asp Phe Lys Ser Glu Arg Ala Asp Arg Glu Arg Ala His Ser Arg Ile
        35                  40                  45
Gln Glu Leu
    50
<210>28
<211>51
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>28
Glu Val Lys Gln Glu Leu Ala Ala Ser Arg Thr Ala Arg Asp Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Glu Arg Val Gln Met Leu Glu Gln Gln Ile Leu Ala Tyr Lys Asp
            20                  25                  30
Asp Phe Met Ser Glu Arg Ala Asp Arg Glu Arg Ala Gln Ser Arg Ile
        35                  40                  45
Gln Glu Leu
    50
<210>29
<211>54
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>29
Ser Phe Ser Glu Asp Cys Leu Arg Lys Ser Arg Val Glu Phe Cys His
1               5                   10                  15
Glu Glu Met Arg Thr Glu Met Glu Val Leu Lys Gln Gln Val Gln Ile
            20                  25                  30
Tyr Glu Glu Asp Phe Lys Lys Glu Arg Ser Asp Arg Glu Arg Leu Asn
        35                  40                  45
Gln Glu Lys Glu Glu Leu
    50
<210>30
<211>21
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>30
Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
His Ala Arg Glu Lys
            20
<210>31
<211>38
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>31
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu
            20                  25                  30
Arg His Ala Arg Glu Lys
        35
<210>32
<211>33
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>32
Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln
1               5                   10                  15
Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu
            20                  25                  30
Lys
<210>33
<211>29
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>33
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr
1               5                   10                  15
Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys
            20                  25
<210>34
<211>31
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic Peptide
<400>34
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys
            20                  25                  30
<210>35
<211>21
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>35
Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
Gln Ala Arg Glu Lys
            20
<210>36
<211>38
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>36
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1               5                   10                  15
Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu
            20                  25                  30
Arg Gln Ala Arg Glu Lys
35
<210>37
<211>33
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>37
Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln
1               5                   10                  15
Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Arg  Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu
            20                   25                  30
Lys
<210>38
<211>29
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>38
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr
1               5                   10                  15
Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys
            20                  25
<210>39
<211>31
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>39
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Lys Ala Gln Ala Asp
1               5                   10                  15
Ile Tyr Lys Ala Arg Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys
            20                  25                  30

Claims (45)

1.一种编码抑制NF-κB信号途径的多肽的纯化的多核苷酸，所述多核苷酸选自以下一组：
(a)一种编码一种包括选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、和SEQ ID NO：39组成的组中的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)一种与在(a)中定义的多核苷酸互补的纯化的多核苷酸；
(c)一种与在(a)中定义的多核苷酸具有至少70％相同性的纯化的多核苷酸；
(d)一种与在(a)中定义的多核苷酸具有至少80％相同性的纯化的多核苷酸；
(e)一种与在(a)中定义的多核苷酸具有至少90％相同性的纯化的多核苷酸；和
(f)一种在严格条件下能与在(a)中定义的多核苷酸杂交的纯化的多核苷酸，其中所述严格条件包括在从50℃到68℃的温度下在5XSSC中进行洗涤。
2.权利要求1的纯化的多核苷酸，其中所述多核苷酸抑制NF-κB途径。
3.权利要求2的纯化的多核苷酸，其中所述多核苷酸破坏NEMO寡聚化。
4.一种包括权利要求1的纯化的多核苷酸的载体。
5.一种包括权利要求1的纯化的多核苷酸的宿主细胞。
6.一种抑制NF-κB途径的纯化的多肽，其选自以下一组：
a)一种具有选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、和SEQ ID NO：39组成的组中的氨基酸序列的NEMO型多肽；
b)一种与在a)中定义的多肽具有至少70％相同性的纯化的多肽；
c)一种与在a)中定义的多肽具有至少80％相同性的纯化的多肽；
d)一种与在a)中定义的多肽具有至少90％相同性的纯化的多肽；
e)一种与在a)中定义的多肽具有至少95％相同性的纯化的多肽。
7.权利要求6的纯化的多肽，其中所述多肽抑制NF-κB途径。
8.权利要求7的纯化的多肽，其中所述多肽破坏NEMO寡聚化。
9.一种抑制NF-κB途径的多肽融合构建体，所述构建体包括选自以下一组的氨基酸序列：
a)一种包括选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、和SEQ ID NO：39组成的组中的氨基酸序列的多肽融合构建体，且所述氨基酸序列与一种具有高转导能力的多肽相连接；
b)一种包括与在a)中定义的氨基酸序列具有至少80％相同性的氨基酸序列的多肽融合构建体；
c)一种包括与在a)中定义的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列的多肽融合构建体；
d)一种包括与在a)中定义的氨基酸序列具有至少95％相同性的氨基酸序列的多肽融合构建体；
e)一种包括与选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、和SEQ ID NO：39组成的组中的氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽融合构建体，所述氨基酸序列与一种具有高转导能力的多肽相连接。
10.权利要求9的多肽，其中所述多肽融合构建体破坏NEMO寡聚化。
11.权利要求9的多肽，其中所述连接是通过一种长度为1到35个氨基酸范围内的氨基酸间隔序列。
12.权利要求11的多肽，其中所述氨基酸间隔序列选自由SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10组成的组。
13.权利要求9的多肽，其中所述具有高转导能力的多肽具有SEQID NO：1的氨基酸序列。
14.权利要求13的多肽，其中所述多肽融合构建体具有选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15组成的组中的氨基酸序列。
15.一种抑制NF-κB信号途径的方法，其包括在体外将一种真核细胞与权利要求9到14中任一项的多肽融合构建体接触。
16.一种破坏NEMO寡聚化的方法，其包括在体外将所述NEMO与权利要求9到14中任一项的多肽融合构建体接触。
17.一种有效量的包括权利要求9到14中任一项的多肽融合构建体和一种或多种可药用载体或赋形剂的组合物在制备用于调控或治疗有此需求的对象中的由NF-κB信号途径所调节的疾病的药物中的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述对象是人。
19.权利要求17或18的用途，其中所述的有效量的范围是从0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天。
20.权利要求17到19中任一项的用途，其中所述的由NF-κB信号途径调节的疾病选自由炎症应答、肿瘤形成、和病毒感染组成的组。
21.权利要求17到20中任一项的用途，其中所述组合物的施用方式选自口服、经直肠、经鼻、肠外、脑池内、阴道内、腹腔内、舌下、局部和口腔内施用。
22.权利要求17到21中任一项的用途，其中所述组合物优选地通过静脉内施用。
23.一种有效量的包括权利要求9到14中任一项的多肽融合构建体和一种或多种可药用载体或赋形剂的组合物在制备用于调节有此需求的对象中的细胞增殖或凋亡的药物中的用途。
24.权利要求23的用途，其中所述对象是人。
25.权利要求23或24的用途，其中所述的有效量的范围是从0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天。
26.权利要求23到25中任一项的用途，其中所述组合物的施用方式选自口服、经直肠、经鼻、肠外、脑池内、阴道内、腹腔内、舌下、局部和口腔内施用。
27.权利要求23到26中任一项的用途，其中所述组合物优选地通过静脉内施用。
28.一种有效量的包括权利要求9到14中任一项的多肽融合构建体和一种或多种可药用载体或赋形剂的组合物在制备用于调节有此需求的对象中的抗原刺激的B或T淋巴细胞的药物中的用途。
29.权利要求28的用途，其中所述对象是人。
30.权利要求28或29的用途，其中所述的有效量的范围是从0.1mg/Kg/天到30mg/Kg/天。
31.权利要求28到30中任一项的用途，其中所述组合物的施用方式选自口服、经直肠、经鼻、肠外、脑池内、阴道内、腹腔内、舌下、局部和口腔内施用。
32.权利要求28到31中任一项的用途，其中所述组合物优选地通过静脉内施用。
33.一种鉴定调控NEMO寡聚化的多肽的方法，其包括：
a)鉴定出侯选多肽序列；
b)通过一种间隔序列连接所述侯选多肽序列与一种具有高转导能力的多肽，由此生成一种多肽融合构建体；
c)将细胞培养物与多肽融合构建体接触；和
d)监测NF-κB信号途径的活性；
e)将存在所述多肽融合构建体时的NF-κB信号途径的活性与没有所述多肽融合构建体时的NF-κB信号途径的活性进行比较，以确定所述多肽融合构建体造成的相对抑制；和
f)将所述多肽融合构建体造成的相对抑制与NEMO寡聚化相关联。
34.权利要求33的方法，其中所述侯选多肽序列具有卷曲螺旋或螺旋结构。
35.权利要求33或权利要求34的方法，其中所述侯选多肽序列具有20到60个氨基酸。
36.权利要求33到35中任一项的方法，其中所述侯选多肽序列衍生自NEMO。
37.权利要求33到36中任一项的方法，其中所述间隔序列的长度范围是从1到35个氨基酸。
38.权利要求37的方法，其中所述间隔序列选自由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10组成的组。
39.权利要求33的方法，其中所述具有高转导能力的多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。
40.权利要求33的方法，其中所述细胞培养物包括已经被NF-κB依赖性β-半乳糖糖苷酶报道基因所转染的前B 70Z/3淋巴细胞，其在2003年4月1日保藏于法国微生物保藏中心(CNCM，28 rue du DocteurRoux，75724 PARIS Cedex 15，法国)，保藏号为I-3004。
41.权利要求33的方法，其中所述多肽融合构建体还包括N末端的半胱氨酸残基。
42.权利要求39的方法，其还包括：
b-1)标记所述多肽融合构建体；和
c-1)监测标记的多肽融合构建体的细胞摄取。
43.权利要求42的方法，其中所述标记包括半胱氨酸残基与荧光团发生化学反应。
44.权利要求43的方法，其中所述荧光团是BODIPY。
45.权利要求42的方法，其中通过FACS监测所述的细胞摄取。
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