CN1926154A

CN1926154A - Ec sod和细胞转导性ec sod及它们的用途

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Publication number: CN1926154A
Application number: CNA2004800322673A
Authority: CN
Inventors: 金泰润; 郑寶妍
Original assignee: Bio Clue and Solution Co Ltd
Current assignee: Kim Tae-yoon
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2004-10-29
Publication date: 2007-03-07
Anticipated expiration: 2024-10-29
Also published as: WO2005042583A1; CN100537602C; JP2007536903A; JP4891083B2; EP1692187B1; KR100676502B1; EP1692187A4; KR20050042205A; EP1692187A1; US20080069808A1; US7740839B2

Abstract

本发明涉及EC SOD(胞外超氧化物歧化酶)、细胞转导性EC SOD及它们的用途。更具体地，本发明涉及EC SOD、细胞转导能力得到提高的EC SOD融合蛋白及它们用于预防或治疗皮肤病的用途。

Description

EC SOD和细胞转导性EC SOD及它们的用途

技术领域

本发明涉及胞外超氧化物歧化酶(EC SOD)、细胞转导性EC SOD及其用途。更具体地，本发明涉及EC SOD、细胞转导能力得到改善的ECSOD融合蛋白及它们用于预防或治疗皮肤病的用途。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化酶的一个家族，该家族具有从细胞环境清除有破坏性的活性氧物质并保护细胞的功能。SOD具有将两个超氧化物自由基岐化为过氧化氢和氧的功能。SOD分为含有铜和锌原子的Cu/Zn SOD、含有锰原子的Mn SOD和位于细胞表面或胞外液中的胞外超氧化物歧化酶(EC SOD)。其中，EC SOD和Cu/Zn SOD一样含有铜和锌原子，但其特征在于在C末端中存在肝素结合域。由于EC SOD具有肝素结合域，据推测EC SOD具有通过结合到细胞膜而保护细胞膜的功能。根据文献，已知EC SOD在血浆和胞外基质中的身体防御机制中发挥作用(Marklund等，Biochem.J.266，213-219，1990；Su等，Am J RespirCell Mol Biol.，Feb 16(2)，162-170，1997；Luoma等，Thromb.Vasc.Bio.18，157-167，1998)。据其它文献报道，用EC SOD进行的基因治疗改善了兔子的动脉再狭窄并减轻了小鼠中胶原诱导的关节炎(Laukkanen MO等，Circulation，106，1999-2003，2002；Iyama S等，Arthritis & Rheumatism，44，9，2160-2167，2001)。最近，据报道EC SOD可以抑制人类成纤维细胞中的端粒缩短等细胞老化现象，延长人类成纤维细胞的复制寿命(Serra V等，J.Biol.Chem.，278，9，6824-6830，2003)。而且，据报道，EC SOD的肝素结合域起到核定位信号的作用，使其定位在胸腺和睾丸细胞的核内以防止基因组DNA受到氧化应激，调节对氧化还原反应敏感的DNA转录(Ookawara T等，BBRC，296，54-61，2002)。然而，不管是EC SOD在皮肤中的分布模式还是EC SOD对皮肤病的作用都还未知。

同时，随着发现某些蛋白可以有效地通过细胞膜进入细胞的事实，目前正非常活跃地进行使用所述蛋白作为将有用物质转导(transduce)至细胞的运输手段的研究。所述蛋白的典型例子包括HIV Tat蛋白、ANTP、VP22蛋白、PEP-1肽等(Lindgren等，TIPS 21：99，2001；Green等，Cell，55，1179-1188，1988))。已知所述蛋白的细胞转导能力是由蛋白转导域(PTD)的性质造成的，所述蛋白转导域具有能够穿过细胞膜磷脂双层的活性(Fankel A.D.等，Cell，55，1189-1193，1988；Green M.等，Cell，55.1179-1188，1988)。

因此，由于在多数情况中用作治疗剂的药物或蛋白不能自发地穿过细胞膜，因而现在正在进行使用上述蛋白转导域来将有用蛋白转导入细胞的研究。

发明内容

与此相应，在对EC SOD的活性进行研究的过程中，本发明人发现了新的事实，即，身体皮肤的真皮层中比表皮层中存在更多的EC SOD，同时EC SOD清除皮肤细胞中的活性氧物质，并抑制表皮细胞的过度生长、基质金属蛋白酶(MMP)的表达和肥大细胞的脱颗粒。因此，本发明人发现可以使用EC SOD来预防和治疗皮肤病，而且，本发明人通过将蛋白转导域融合到EC SOD上，制备了具有细胞转导能力的EC SOD融合蛋白。在所述发现和制备的基础上，完善了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供用于预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含分离的EC SOD蛋白或包含含有编码该蛋白的多核苷酸的表达载体作为活性成分。

本发明的另一目的是提供用于预防或改善皮肤病的化妆组合物，该化妆组合物包含分离的EC SOD蛋白。

本发明还有一个目的是提供用于预防或治疗皮肤病的方法，该方法包括向需要的对象施用有效量的分离的EC SOD蛋白或含有编码该蛋白的多核苷酸的表达载体。

本发明的另一个目的是提供分离的EC SOD蛋白或含有编码该蛋白的多核苷酸的表达载体在制备用于预防或治疗皮肤病的药物组合物中的用途。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含EC SOD蛋白上融合有蛋白转导域的细胞转导性ECSOD融合蛋白或者包含编码该蛋白的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供用于预防或改善皮肤病的化妆组合物，该化妆组合物包含EC SOD蛋白上融合有蛋白转导域的分离的细胞转导性EC SOD融合蛋白。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗皮肤病的方法，该方法包括向需要的对象施用有效量的EC SOD蛋白上融合有蛋白转导域的分离的细胞转导性EC SOD融合蛋白或含有编码该融合蛋白的多核苷酸的表达载体。

本发明的另一个目的是提供EC SOD蛋白上融合有蛋白转导域的分离的细胞转导性EC SOD融合蛋白或含有编码该融合蛋白的多核苷酸的表达载体在制备用于预防或治疗皮肤病的药物组合物中的用途。

本发明的另一个目的是提供细胞转导性EC SOD融合蛋白，在该蛋白中蛋白转导域被融合到EC SOD的氨基末端。

本发明的另一个目的是提供编码所述融合蛋白的多核苷酸。

为了实现上述目的，本发明提供用于预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含分离的EC SOD蛋白或含有编码该融合蛋白的多核苷酸的表达载体作为活性成分。

另外，本发明提供用于预防或改善皮肤病的化妆组合物，该化妆组合物包含分离的EC SOD蛋白。

另外，本发明提供用于预防或治疗皮肤病的方法，该方法包括向需要的对象施用有效量的分离的EC SOD蛋白或含有编码该蛋白的多核苷酸的表达载体。

另外，本发明提供分离的EC SOD蛋白或含有编码该蛋白的多核苷酸的表达载体在制备用于预防或治疗皮肤病的药物组合物中的用途。

另外，本发明提供用于预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含EC SOD蛋白上融合有蛋白转导域的细胞转导性EC SOD融合蛋白或者包含含有编码该蛋白的多核苷酸的表达载体。

另外，本发明提供用于预防或改善皮肤病的化妆组合物，该化妆组合物包含EC SOD蛋白上融合有蛋白转导域的分离的细胞转导性ECSOD融合蛋白。

另外，本发明提供用于预防或治疗皮肤病的方法，该方法包括向需要的对象施用有效量的EC SOD蛋白上融合有蛋白转导域的分离的细胞转导性EC SOD融合蛋白或含有编码该融合蛋白的多核苷酸的表达载体。

另外，本发明提供EC SOD蛋白上融合有蛋白转导域的分离的细胞转导性EC SOD融合蛋白或含有编码该融合蛋白的多核苷酸的表达载体在制备用于预防或治疗皮肤病的药物组合物中的用途。

另外，本发明提供细胞转导性EC SOD融合蛋白，在该蛋白中蛋白转导域被融合到EC SOD的氨基末端。

另外，本发明提供编码所述融合蛋白的多核苷酸。

下文将对本发明进行详细描述。

在本发明的一个实施例中，通过免疫组织化学染色检测了EC SOD在小鼠皮肤中的分布模式(见实施例1-1)。该检测结果提示，EC SOD分布在整个小鼠皮肤中，尤其在真皮层的结缔组织中比在表皮层中存在更多的EC SOD(见图1)。同时，在本发明的另一个实施例中，检测了EC SODmRNA在皮肤的真皮层和表皮层中的表达模式(见实施例1-2)，结果可以发现在真皮层中以比在表皮层中高得多的水平表达EC SOD这样的新事实(见图2)。根据上述实验结果，推断EC SOD应该行使保护皮肤的作用，同时它应该存在于皮肤组织尤其是真皮层中。

因此，为了直接检测EC SOD在皮肤中的作用，在本发明的个实施例中，用各种UV光(UVA、UVB和PUVA)辐射小鼠皮肤，并在辐射后分析EC SOD的经时表达模式(见实施例1-3至实施例1-5)。结果可表明，EC SOD在皮肤中的表达随着UV辐射的有无而变化(见实施例3～5)。

根据以上实验结果，本发明人发现了一个新的事实，即EC SOD分布在整个皮肤组织中，特别是分布在整个真皮层中，而其表达随着UV辐射强度和时间流逝而变化。

同时，本发明人通过制备小鼠EC SOD过表达的细胞系，用UV辐射该细胞，然后测定该细胞中活性氧的量，检测了EC SOD的过表达对UV诱导的胞内活性氧的量的影响(见实施例2)。该结果可提示，小鼠ECSOD的过表达有效地减少了胞内活性氧(见图6和7)。

而且，本发明人通过制备人EC SOD过表达的细胞系，用UV辐射该细胞，然后测定细胞死亡，检测了人EC SOD的过表达对UV诱导的细胞死亡的影响(见实施例3)。该结果可提示，人EC SOD的过表达有效地减少了UV诱导的细胞死亡(见图9)。

鉴于此，为了促进EC SOD对皮肤组织的保护作用，本发明人通过制备EC SOD融合蛋白而赋予EC SOD以细胞转导能力，在所述EC SOD融合蛋白中选自HIV-1Tat转导域(氨基酸残基49～57)、由5～12个精氨酸残基组成的寡肽、由5～12个赖氨酸残基组成的寡肽和PEP-1肽等的蛋白转导域已经结合到EC SOD上(见实施例4)。

另外，本发明人更具体地检测了EC SOD和细胞转导性EC SOD在TPA(12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯)所致皮肤病模型中的治疗效果。

TPA在小鼠皮肤细胞中诱导淋巴细胞和嗜中性粒细胞所致的真皮浸润性炎症以及毛囊内表皮增生，因而导致诸如皮炎和牛皮癣等皮肤病(Segal等，Cancer Res，35：2154-2159，1975；Sawa等，J Med Chem，45：930-936，2002)。而且，TPA处理可以通过激活MMP酶(基质金属蛋白酶)而促进老化过程，所述MMP酶分解从角化细胞释放的结缔组织。因此，本发明人检测了在皮肤中过表达有EC SOD的小鼠的TPA处理皮肤组织中的EC SOD表达模式以及皮肤组织的厚度的变化。同时，还检测了在EC SOD蛋白过表达的角化细胞中或在以EC SOD蛋白或以细胞转导性EC SOD融合蛋白处理的人类成纤维细胞中MMP的表达(见实施例5)。结果可提示，EC SOD和细胞转导性EC SOD融合蛋白抑制表皮细胞的过度表达(见图20和21)、并抑制MMP酶(基质金属蛋白酶)的活性(见图22和23)。因此，可以看出，这些蛋白具有防止和抑制诸如皮炎、牛皮癣样皮肤增生和老化等皮肤病的发展的效果。

另外，本发明人用本发明的EC SOD蛋白检测了EC SOD蛋白是否抑制肥大细胞的脱颗粒(见实施例6)。已知如果肥大细胞脱颗粒，化学物质将从肥大细胞中释放出来，因而导致诸如遗传性过敏症、接触性过敏和荨麻疹等过敏性皮肤病。测试结果表明，本发明的EC SOD蛋白可以抑制肥大细胞的脱颗粒，从而有效地预防和治疗上述过敏性皮肤病(见表3)。

根据上述测试结果，本发明人发现了新的事实，即EC SOD和细胞转导性EC SOD通过清除胞内活性氧物质，抑制表皮细胞的过度生长、MMP(基质金属蛋白酶)的表达和肥大细胞的脱颗粒，而具有有效地预防或治疗皮肤病的活性。

因此，本发明人提供用于预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含EC SOD蛋白或细胞转导性EC SOD融合蛋白作为活性成分。

在本发明中可以使用的EC SOD蛋白包括天然的或重组的EC SOD蛋白或具有与EC SOD蛋白基本相同的生理活性的蛋白。所述具有基本等同的生理活性的蛋白包括天然的/重组的EC SOD蛋白的功能性等同物和功能性衍生物。EC SOD蛋白可以通过遗传工程方法利用已知的核苷酸序列来制备，用于制备所述蛋白的方法的说明在本发明的实施例中有叙述。

本文使用的术语“功能性等同物”是指表现出与天然EC SOD蛋白基本等同的生理活性的蛋白，并且该蛋白与天然EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少90％序列同源性。功能性等同物包括例如具有天然蛋白的某些氨基酸或所有氨基酸的取代、或天然蛋白的某些氨基酸的缺失或添加的氨基酸序列变体。氨基酸的取代优选为保守取代。天然存在的氨基酸的保守取代的例子包括：脂肪族氨基酸(Gly、Ala、Pro)、疏水性氨基酸(Ile、Leu、Val)、芳香族氨基酸(Phe，Tyr、Trp)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、碱性氨基酸(His、Lys、Arg、Gln、Asn)和含硫氨基酸(Cys、Met)。氨基酸的缺失优选位于不直接影响ECSOD蛋白的生理活性的部分。

本文使用的术语“功能性衍生物”是指具有物理和化学修饰以提高或降低EC SOD蛋白的物理和化学性质的蛋白。带有为改变EC SOD蛋白的温度稳定性、贮存稳定性、溶解度和pH稳定性进行的修饰的衍生物包括在本发明的范围之内。EC SOD蛋白的功能性衍生物由本领域已知的方法制备。

本发明的EC SOD蛋白的氨基酸序列在本领域中是已知的，并且衍生于哺乳动物。优选地，所述哺乳动物包括人类。更优选地，本发明的EC SOD蛋白被定义为包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的蛋白。此外，EC SOD蛋白可以是肝素转导域(氨基酸残基210～222)缺失的蛋白。

根据本发明，细胞转导性EC SOD融合蛋白的特征在于，蛋白转导域被融合到分离的EC SOD蛋白的氨基酸末端、或被融合到表现出与ECSOD蛋白基本等同的生理活性并且与EC SOD蛋白的氨基酸序列至少具有60％序列同源性的蛋白的氨基酸末端。蛋白转导域是指由几个氨基酸残基组成的寡肽，该寡肽不仅能够将自己本身而且还能将其它类型的诸如寡核苷酸、肽、蛋白和寡糖等高分子有机化合物导入细胞中，这种导入不另外需要受体或能量。可在本发明中使用的蛋白转导域的例子包括但不具体限于：HIV-1Tat转导域、由5～12个精氨酸残基组成的寡肽、由5～12个赖氨酸残基组成的寡肽、PEP-1肽、ANTP蛋白和VP22蛋白等(Morris等，Nat Biotechnol，19：1173-1175，2001；Schwarze等，TrendsCell Biol，10：290-295，2000；Vives等，J Biol Chem 272：16010-16017，1997)。优选地，可以使用选自与HIV-1 Tat的氨基酸49-57相对应的9个氨基酸残基(RKKRRQRRR)的转导域、9个精氨酸残基的寡肽、10个赖氨酸残基的寡肽和PEP-1肽(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)的序列作为蛋白转导域。

HIV-1 Tat转导域的特征在于，具有打开由EC SOD转导的细胞脂质屏障的信号。PEP-1肽的疏水域结合到将被转导的蛋白的疏水部分，然后发挥提高将蛋白定位于细胞膜上的效率的作用，而亲水域发挥促进蛋白移动到细胞质中的作用。

同时，在本发明中使用的缩略词定义如下：R(丙氨酸)；Q(谷氨酰胺)；E(谷氨酸)；K(赖氨酸)；P(脯氨酸)；S(丝氨酸)；T(苏氨酸)；W(色氨酸)；V(缬氨酸)。

根据本发明，最优选的细胞转导性EC SOD融合蛋白可以选自TAT-EC SOD融合蛋白、TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白、K10-EC SOD融合蛋白、R9-EC SOD融合蛋白、PEP1-EC SOD融合蛋白和PEP1-ΔHD/ECSOD融合蛋白，所述融合蛋白分别具有SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

本发明的EC SOD蛋白可以应用的皮肤病包括所有由活性氧物质、表皮细胞的过度生长、MMP(基质金属蛋白酶)的表达或肥大细胞的脱颗粒造成的皮肤病。皮肤病的例子可以包括但不限于皮肤癌、色素沉着病、光老化、色老化、皮炎、遗传性过敏症、接触性过敏症、表皮增生和荨麻疹。

本发明的药物组合物可以含有药学可接受的载体和EC SOD蛋白或细胞转导性EC SOD融合蛋白。本文使用的术语“药学可接受的载体”是指生理可接受的并且当施用于人时通常不引起诸如胃肠紊乱和晕眩等过敏反应或与此类似的反应的物质。

药学可接受的载体可以包括例如用于口服施用或肠胃外施用的载体。用于口服施用的载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁和硬脂酸等。同时，用于肠胃外施用的载体可以包括水、适当的油、盐水溶液、含水葡萄糖和乙二醇等。本发明的组合物可以进一步包含稳定剂和防腐剂。适当的稳定剂包括抗氧化剂，如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。适当的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。对于其它可接受的载体，可以参考以下文献：Remington′s Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995。

可以将包含在本发明组合物中的EC SOD蛋白或细胞转导性ECSOD融合蛋白与上述药学可接受的载体制成各种肠胃外剂型或口服剂型。肠胃外施用的制剂优选包括等渗水溶液或悬浮液制剂等注射制剂，以及软膏制剂。注射制剂可以根据本领域已知方法利用适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂来制备。例如，将各成分溶解在盐水或缓冲液中，然后可制成用于注射的剂型。用于口服施用的制剂的例子包括但不限于粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂和胶囊剂，并且这些制剂除了活性成分以外还可以包含稀释剂(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或对羟苯基甘氨酸)和润滑剂(例如，二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐或钙盐、和/或聚乙二醇)。片剂可以包含粘合剂，如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，并且如果需要，其还可以进一步包含诸如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐等崩解剂，或包含共沸混合物和/或吸收剂、着色剂、调味剂和甜味剂。这些制剂可以通过常规混合、造粒或包衣方法加以制备。

本发明的药学组合物的施用途径包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、鞘内、心脏内、经皮、表皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠道、局部、舌下和直肠途径。

优选根据本发明的药物组合物可以通过皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑液囊内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射和输注技术进行肠胃外施用。例如，为注射而制备的本发明的药学组合物可以通过messotherapy施用，所述messotherapy是通过4～6mm的细针以给定量注射入皮肤或者用30-规格(gage)的注射针头浅刺皮肤的方法。另外，为施用于皮肤，还可以在经皮或表皮施用中将本发明的药物组合物制成例如软管制备物。本文使用的术语“经皮或表皮施用”是指将药物组合物局部施用到皮肤中，从而药物组合物中所含有的有效量的活性成分输送导皮肤中。特别地，包含本发明的细胞转导性EC SOD融合蛋白作为活性成分的药物组合物优选通过经皮或表皮(epicutaneous)施用技术直接施用于皮肤。另外，本发明的药物组合物可以通过与蛋白质转导方法有关的生物工程技术施用。

将包含在根据本发明的药物组合物中的EC SOD蛋白或细胞转导性EC SOD融合蛋白可以以表现出预防或治疗效果的量施用于患者。通常，所述EC SOD蛋白可以以日剂量为约0.0001～100mg/kg，更优选约0.01～1mg/kg施用。本发明的药物组合物可以以所述优选日剂量范围内的量每天施用一次或数次。然而，本发明的药物组合物的剂量可以根据施用途径、施用对象、施用对象的年龄、性别、体重、特征和疾病状态进行适当的选择。

另一方面，本发明提供用于预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的表达载体，该表达载体包含编码EC SOD蛋白的多核苷酸或编码细胞转导性EC SOD融合蛋白的多核苷酸。

编码EC SOD蛋白的多核苷酸可以优选为编码SEQ IN NO：11的氨基酸序列的多核苷酸。

编码细胞转导性EC SOD融合蛋白的多核苷酸的特征在于编码蛋白转导域的DNA序列结合到EC SOD cDNA的5’-末端。编码蛋白转导域的DNA序列可以是但不限于编码选自HIV-1Fat转导域、由5～12个精氨酸残基组成的寡肽、由5～12个赖氨酸残基组成的寡肽、PEP-1肽、ANTP蛋白或VP22蛋白的DNA序列。另外，本发明的多核苷酸可以是其中融合有EC SOD蛋白的蛋白转导域的5’-末端结合到编码6个组氨酸残基的DNA序列的多核苷酸。优选编码本发明的融合蛋白的多核苷酸可以是SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的多核苷酸。

包含所述多核苷酸的表达载体可以含有表达控制序列，并含有编码EC SOD蛋白的多核苷酸或编码细胞转导性EC SOD融合蛋白的多核苷酸。本文使用的术语“表达控制序列”是指在特定宿主细胞中对可操作地连接的编码序列进行表达所需的DNA序列。表达控制序列包括用于进行转录的启动子、用于控制转录的选择性操纵子序列、编码适当mRNA核糖体结合位点的序列以及转录和翻译终止调节序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、操纵子序列和编码核糖体结合位点的序列。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

包含在本发明的药物组合物中的表达载体可以是质粒或病毒载体，并且指可以通过本领域已知的任何方法如转染或转导而以被表达状态导入到靶细胞中的载体。

质粒表达载体是通过经FDA批准用于人类的基因转移方法将质粒DNA直接转移到人类细胞中的手段(Nabel EG等，Science，249：1285-1288，1990)。可以在本发明中使用的质粒表达载体包括本领域已知的哺乳动物表达质粒。典型的例子包括但不限于pRK5(欧洲专利No.307,247)、pSV16B(PCT公开No.91/08291)和pVL1392(PharMingen)。

可以通过本领域已知的任意方法将质粒表达载体导入到靶细胞中，所述方法如用于将DNA导入细胞中的瞬时转染、微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、基因枪和其它方法(Wu等，J Biol Chem，267：963-967，1992；Wu和Wu，J Biol Chem，263：14621-14624，1988)。

另外，根据本发明的病毒表达载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和禽痘病毒。

病毒载体可以通过本领域已知的方法施用。例如，其可以通过局部、肠胃外、口服、鼻内、静脉内、肌肉内和皮下途径或任意其它适当途径施用。特别地，所述载体可以以有效量直接注射到靶细胞中。

另一方面，本发明提供用于预防或治疗皮肤病的方法，该方法包括向需要的对象施用有效量的EC SOD蛋白、细胞转导性EC SOD融合蛋白或编码各所述蛋白的多核苷酸。

本文使用的术语“有效量”是指表现出预防或治疗皮肤病的效果的量。

本文使用的术语“对象”是指包括哺乳动物尤其是人类在内的动物。所述对象可以是需要治疗的患者。

另一方面，本发明提供EC SOD蛋白、细胞转导性EC SOD融合蛋白或编码各所述蛋白的多核苷酸在制备用于预防或治疗皮肤病的药物组合物中的用途。

另一方面，本发明提供化妆组合物，该化妆组合物包含本发明的分离的EC SOD蛋白或分离的细胞转导性EC SOD融合蛋白。本发明的化妆组合物可以非常有效地用来抗老化或诸如脱色或黑斑病等色素沉着病、皮炎、牛皮癣、遗传性过敏症、荨麻疹和过敏症等。所述老化病包括所有自然老化和光老化。自然老化是指随着年龄自然发生的老化，而光老化是指因暴露于人工的或自然的UV等而发生的老化。另外，本发明的化妆组合物有效地预防和改善由于老化所造成的皱纹。

根据本发明的功能性化妆组合物可以通过常规方法制备。以化妆组合物的干重计，所包含的本发明的EC SOD蛋白可以为0.001重量％～50重量％，优选为0.1重量％～20重量％。

本发明的化妆组合物可以和皮肤学上可接受的载体一起用于基础化妆组合物(例如，化妆水、乳膏、精华素、洁肤沫、卸妆水、面膜和润体油)、彩妆组合物(例如，粉底、唇膏、染睫毛油和粉底霜)等中。所述载体可以包括皮肤软化剂、透皮促进剂、着色剂、芳香剂、乳化剂、增稠剂和溶剂。

另一方面，本发明提供EC SOD蛋白融合有蛋白转导域的细胞转导性EC SOD融合蛋白。所述细胞转导性EC SOD融合蛋白可以转导到皮肤细胞中，因而提高EC SOD蛋白对皮肤病的治疗效果。

另一方面，本发明提供编码所述EC SOD融合蛋白的多核苷酸序列。

所述细胞转导性EC SOD融合蛋白可以通过以下步骤制备：(a)用包含编码细胞转导性EC SOD融合蛋白的多核苷酸序列的重组表达载体转化宿主微生物；(b)在用于所述多核苷酸序列的表达的适当的培养基和条件中，培养在步骤(a)中制备的经转化的微生物；和(c)从步骤(b)的培养液中收集基本上纯的由所述多核苷酸序列编码的融合蛋白。

作为所述宿主微生物，如果它们能够表达本发明的细胞转导性ECSOD融合蛋白，则任意的微生物都可以使用而没有具体限定。所述宿主微生物的例子包括细菌，如大肠杆菌(E.coli.)、杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属；真核和原核宿主细胞如真菌和酵母；诸如Spodoptera frugiperida(SF9)的昆虫细胞、诸如CHO和小鼠细胞的动物细胞，以及组织培养的人类和植物细胞。优选微生物包括大肠杆菌和枯草杆菌(bacillus subtilis)。根据用途，可以使用经证明在人体内是安全的用于食物的微生物，如乳酸菌。

附图说明

图1是显示EC SOD在小鼠皮肤组织中的分布模式的免疫组织化学检测结果的照片。

左：显示用兔抗鼠EC SOD抗体进行的免疫染色结果的照片。

右：显示用预免疫兔血清作为阴性对照组进行的免疫染色结果的照片。

图2显示EC SOD在小鼠皮肤的表皮层和真皮层中的表达模式的Northern印迹分析的结果。使用GAPDH作为上样对照。

^**：p＜0.05的显著差异。

图3显示UVA辐射后在不同时间点，EC SOD在小鼠中的表达模式的Northern印迹分析的结果。使用GAPDH作为上样对照。

A：5kJ/m²的辐射

B：25kJ/m²的辐射

图4显示UVB辐射后在不同时间点，EC SOD在小鼠中的表达的Northern印迹分析的结果。使用GAPDH作为上样对照。

A：2kJ/m²的辐射

B：8kJ/m²的辐射

C：15kJ/m²的辐射

图5显示用8-MOP对小鼠进行处理，1小时后进行UVA辐射，辐射后在不同时间点EC SOD在小鼠中的表达的Northern印迹分析的结果。

A：5kJ/m²的辐射

B：25kJ/m²的辐射

图6显示在从Tet off-MEF/3T3诱导基因表达系统中除去四环素(TETOFF)以诱导EC SOD的过表达的试验中，在不同时间点EC SOD的表达模式的Northern印迹分析的结果(A)以及EC SOD的活性(B)。

TET ON：在存在四环素的情况中

TET OFF：在除去四环素的情况中

图7A是显示用10J/cm²的UVA辐射后，在小鼠EC SOD过表达细胞系中的胞内活性氧物质的量经时变化的图，该量为相对于对照组的值。

TET ON：在存在四环素的情况中

TET OFF：在除去四环素的情况中

图7B是显示用20mJ/cm²的UVB辐射后，在小鼠EC SOD过表达细胞系中的胞内活性氧物质的量经时变化的图，该量为相对于对照组的值。

TET ON：在存在四环素的情况中

TET OFF：在除去四环素的情况中

图7C是显示用0.1％的8-MOP对小鼠EC SOD过表达细胞系进行处理，在30分钟后用2J/cm²的UVA辐射，在该细胞系中的胞内活性氧的量经时变化的图，该量为相对于对照组的值。

TET ON：在存在四环素的情况中

TET OFF：在除去四环素的情况中

图8显示根据本发明的人EC SOD过表达载体的限制图谱。

图9显示在EC SOD过表达的HaCaT细胞中表达的EC SOD的Western印迹分析的结果。

图10显示通过对EC SOD过表达的HaCaT细胞进行UV辐射所造成的细胞死亡的比率的流式细胞测定分析的结果。

图11显示根据本发明的TAT-EC SOD融合蛋白或TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白表达载体的限制图谱。

图12是显示纯化的TAT-EC SOD融合蛋白和TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白的电泳分析结果的照片。

图13是显示纯化的TAT-EC SOD融合蛋白、K10-EC SOD融合蛋白和R9-EC SOD融合蛋白的电泳结果的照片。

图14是显示免疫细胞化学观测结果的照片，该照片显示本发明的TAT-EC SOD融合蛋白和TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白转导到人HaCaT细胞中，因而显示其定位在细胞核内。

图15是显示本发明的TAT-EC SOD融合蛋白和TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白的细胞转导效率的Western印迹分析结果的照片。

图16显示本发明的PEP1-EC SOD融合蛋白或PEP1-ΔHD/EC SOD融合蛋白表达载体的限制图谱。

图17显示免疫细胞化学观测结果的照片，该照片显示本发明的PEP1-EC SOD融合蛋白转导到海拉细胞中，因而显示其定位在细胞核内。

A：EC SOD蛋白处理组(阴性对照组)；和

B：PEP-1-EC SOD融合蛋白处理组(试验组)。

图18是用于制备EC SOD过表达小鼠的小鼠EC SOD过表达载体的示意图。

图19显示在TPA处理的野生型小鼠和EC SOD过表达的小鼠的皮肤组织中EC SOD表达模式的免疫组织化学分析结果。

A：野生型小鼠的皮肤组织；

B：EC SOD过表达小鼠的皮肤组织；

e：表皮层；d：真皮层；箭头：毛囊细胞；

尺寸短线：100μm；和放大倍数：100×

图20显示TPA处理的野生型小鼠和EC SOD过表达的小鼠的皮肤组织的显微观测结果。

A，E：丙酮处理的野生型小鼠的皮肤组织；

B，F：TPA处理的野生型小鼠的皮肤组织；

C，G：丙酮处理的EC SOD过表达小鼠的皮肤组织；

D，H：TPA处理的EC SOD过表达小鼠的皮肤组织；

e：表皮层；d：真皮层；

尺寸短线：100μm；放大倍数：A～D为100×，E～H为400×。

图21A是显示TPA处理的野生型小鼠和EC SOD过表达小鼠的表皮厚度和真皮厚度的总和的图。

图21B是显示TPA处理的野生型小鼠和EC SOD过表达小鼠的表皮厚度的图。

图22显示在TPA处理的角化细胞HaCaT细胞和EC SOD过表达的HaCaT细胞中，MMP1和MMP2的表达的分析结果。

图23显示在经过细胞转导性EC SOD融合蛋白处理的人类成纤维细胞中MMP1和MMP2表达的分析结果。

图23B显示在经过EC SOD蛋白处理的人类成纤维细胞中MMP1和MMP2表达的分析结果。

具体实施方式

下文将通过以下实施例对本发明进行详细描述。但是，应该理解给出这些实施例的目的只是为了说明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1：EC SOD在小鼠皮肤中的分布模式的检测

1-1)使用免疫组织化学染色检测EC SOD在小鼠皮肤中的分布模式

为了检测EC SOD在皮肤组织中的分布，进行了免疫组织化学染色。通过已知方法，将取自BALB/C小鼠(8～10周龄，雌性，从由带电生命科学研究所，韩国获得)的皮肤组织固定在4％的多聚甲醛中并制成石蜡块。用二甲苯处理石蜡块以去除石蜡，并用醇处理进行脱水。为了提高免疫应答，接着在柠檬酸缓冲液中于121℃对组织样品热处理10分钟。接着，用3％过氧化氢(H₂O₂)处理组织样品以抑制过氧化物酶。并与1∶500稀释的兔抗鼠EC SOD抗体(一抗)反应60分钟。兔抗鼠EC SOD抗体是通过将小鼠EC SOD作为免疫原注射到兔子以免疫兔子而获得。用0.1M PBS洗涤与抗体反应的组织样品，并与200μl的生物素偶联的羊抗兔的含IgG抗体(Universal LSAB 2 kit，Dako，Glostrup，Denmark)反应15分钟。同时，使用预免疫兔血清作为阴性对照组。反应结束后，用PBS洗涤组织样品，与过氧化物酶偶联的抗生蛋白链菌素反应，并用3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC，chromogen，Utah，USA)(底物溶液)显色。通过常规方法将经显色的组织样品制成测试样品并在显微镜下以400×的放大倍数进行观察。

测试结果表明，EC SOD分布在整个皮肤中。观察到EC SOD广泛分布在真皮层的结缔组织中，特别是在真皮层的毛囊和血管周围染色尤为强烈。另外，EC SOD在表皮层的细胞中也强烈染色。因此，推断这些区域的皮肤的EC SOD具有与对活性氧物质的清除作用相关的活性(见图1)。

1-2)采用Northern印迹分析检测EC SDO在小鼠皮肤中的表达模式

用手术剪刀割下实施例1-1)中的BALB/C小鼠的耳朵皮肤组织并用没有Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸盐缓冲的盐水(pH 7.4)冲洗。在37℃，将皮肤组织浮在胰蛋白酶(Gibco，Invitrogen Corporation，California，U.S.A)/PBS中50分钟，同时使真皮层朝下。然后，将真皮层与表皮层分并。

从各分开的表皮层和真皮层中分离总RNA。20μg的提取RNA在含有甲醛的1.2％的琼脂糖凝胶中电泳，并将凝胶上的mRNA转移到尼龙膜上，然后用UV对附着在尼龙膜上的RNA进行交联。用³²P标记的ECSOD的cDNA探针与所述膜于65℃杂交。采用含有小鼠皮肤EC SODcDNA的pCRII TOPO载体(由翰林大医科大学的Suh JG教授提供)(SuhJG等，Mol Cells.30；7(2)，204-207，1997)作为模板，使用以下引物，通过PCR扩增来制备EC SOD的cDNA。PCR扩增反应由以下组成：94℃，一个循环；94℃30秒，55℃30秒和72.5℃45秒，30个循环；72.5℃5分钟，一个循环。

正向引物(SFQ ID NO：1)：

5′-ATG TTG GCC TTC TTG TTC-3′

反向引物(SEQ ID NO：2)：

5′-TTA AGT GGT CTT GCA CTC-3′

杂交结束后，对膜进行洗涤并对胶片进行曝光。对经曝光的胶片进行显色以证实mRNA，并用分子成像仪(Image Master-VDS，PhamaciaBiotech)分析。经Student’s t检验分析，测试组之间存在显著差异。

结果显示，EC SOD mRNA在真皮层中的表达比在表皮层的表达强约7倍(见图2)。根据检验结果，可以推断EC SOD在真皮层的成纤维细胞和上皮细胞中强烈表达。这一结果表明，EC SOD应该会对皮肤进行保护，特别是它应该具有防止真皮结缔组织免受活性氧物质侵害的高活性。

1-3)用UVA辐射后检测EC SOD在小鼠皮肤中的表达模式

为了直接检测EC SOD在体外皮肤中的作用，用UVA辐射小鼠的背部皮肤，在UVA辐射后的不同时间点，从小鼠的背部皮肤中分离总RNA，并进行Northern印迹分析，以研究UVA辐射对EC SOD的表达模式的影响。

对BALB/C小鼠按每组3只动物进行分组。剃光它们的背部并在24小时后用不同强度的UVA进行辐射。通过发射9.7mW/cm²的6个UVA灯(F24T12/BL/HO，National Biological corporation USA)分另以5kJ/m²和25kJ/m²的强度对小鼠进行辐射。对照组不用UVA进行辐射。

在所示的时间点，从经UVA辐射的小鼠获取皮肤组织。由分开的皮肤组织中分离总RNA，然后以与实施例1-2)相同的方式进行Northern印迹分析，以研究EC SOD mRNA的表达模式。用分子成像仪对表达的mRNA的量进行量化分析。使用GAPDH作为上样对照。

结果表示为平均值±标准偏差，各测试组的表达水平显示为相对于以100％表示的对照组的表达水平的值。另外，用Stutent’s t检验评估对照组和测试组之间的显著差异。

结果，EC SOD的表达没有受到5kJ/m²UVA辐射的影响。但是，当用25kJ/m²UVA辐射小鼠时，EC SOD的表达在初期下降，但UV辐射6小时后，达到338±7.2％的最大点(p＜0.05)，然后，UV辐射96小时后，出现下降的趋势(见图3)。因此，可以看出，EC SOD的表达受到UVA强度和UVA辐射后的消逝时间的控制。根据这些结果推断，EC SOD应该具有防止皮肤组织免受UVA辐射后过量产生的活性氧物质的侵害以及因此发生的变化。

1-4)用UVB辐射后检测EC SOD在小鼠皮肤中的表达模式

用UVB辐射小鼠的背部皮肤，然后在不同时间点，从经辐射的皮肤中提取RNA，并进行Northern印迹分析，以研究UVB辐射对EC SOD的表达模式的影响。根据如实施例1-3)所述的相同方法，对BALB/C小鼠按每组3只动物进行分组，然后通过发射0.6mW/cm²的6个UVB灯(FS24T12/UVB/HO，National Biological corporation，USA)分别以2kJ/m²、8kJ/m²和15kJ/m²对小鼠进行辐射。UV辐射后，采用与实施例1-2)相同的方式对mRNA的表达模式进行检测。

结果，当用2kJ/m²的UVB对小鼠进行辐射时，EC SOD mRNA的表达在初期降到73±3％(p＜0.05)，但是24小时之后，又回复到对照组的水平。当用8kJ/m²的UVB对小鼠进行辐射时，EC SOD的表达在48小时后上升到212±11％(p＜0.05)。在辐射强度为15kJ/m²的情况中，EC SOD的表达水平在48小时后上升到322±15％(p＜0.05)，这是最大值(见图4)。因此，可以看出，EC SOD的表达受到UVB和UV辐射后的消逝时间的影响。

1-5)用PUVA处理后检测EC SOD在小鼠皮肤中的表达模式

用临床治疗中广泛使用的PUVA处理小鼠，然后在不同时间点，从处理小鼠中分离RNA，并进行Northern印迹分析，以研究PUVA处理对EC SOD的表达模式的影响。

根据如实施例1-3)所述的相同方法，将100μl的8-MOP(0.2％(w/v)8-methoxy psolaren，ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，USA)施用于各包括3只BALB/C小鼠的两个测试组的背部皮肤，并且一个小时之后，用与实施例1-3)相同的UV灯，分别以强度为5kJ/m²和25kJ/m²的UVA进行辐射。此时，对照组只用0.2％(w/v)的8-MOP处理。UV辐射后，采用与实施例1-2)相同的方式对EC SOD mRNA的表达模式进行检测。

结果，在只用8-MOP处理的对照组的情况中和用8-MOP处理后用5kJ/m²的UVA进行辐射的测试组的情况中，EC SOD mRNA的表达水平没有变化。在用25kJ/m²的UVA进行辐射的测试组的情况中，EC SODmRNA的表达水平在UV辐射后缓慢上升，并在48小时后达到264±4.5％(p＜0.05)，表明EC SOD的表达水平显著上升。

从以上结果可以看出，EC SOD的表达模式受到UV的强度和UV辐射后的消逝时间的影响。因此推测EC SOD应该具有保护皮肤免受经受UV辐射后所产生的、或由UV造成的炎症反应中所产生的具有毒性的活性氧物质的侵害。

实施例2：UV辐射使小鼠EC SOD过表达的细胞系中的活性氧发生的变化

采用Tet off-MEF/3T3诱导基因表达体系(Clontech)(一种已知的表达体系)使EC SOD在小鼠胚胎成纤维细胞中过表达，然后用UV对细胞进行辐射，并检测胞内活性氧。

2-1)小鼠EC SOD过表达细胞系的构建

将小鼠EC SOD cDNA插入TRE2载体(Clontech)(TET OFF系统的调节质粒)的Sal I位点。小鼠EC SOD cDNA通过PCR扩增制备，所述PCR扩增使用含有小鼠EC SOD cDNA的pCRII TOPO载体(由翰林大医科大学的Suh JG教授提供)作为模板，使用以下引物进行。PCR扩增反应由以下组成：94℃，一个循环；94℃30秒，55℃30秒和72.5℃45秒，30个循环；72.5℃5分钟，一个循环。

正向引物(SEQ ID NO：3)：

5′-AGT CTC GAG ATG TTG GCC TTC TTG TTC TAC GGC-3′

反向引物(SEQ ID NO：4)：

5′-GATC CTC GAG TGG TCT TGC ACT CGC TCT-3′

使用阳离子脂质素(lipofectin，Invitrogen)，将所制备的载体和包含潮霉素抗性序列的pTG76质粒(University of Geneva Medical School，Geneva，瑞士)导入到小鼠胚胎成纤维细胞(Clontech)(MEF3T3/TET OFF细胞系)中。然后，将该细胞培养在含有100μg/mL潮霉素的培养基中，并只选择抗性克隆。在所述克隆中，因除去四环素而过表达EC SOD的细胞系得到构建。即，将所述克隆培养在DMEM培养基中，该培养基含有10％无TET的FBS(Clontech)、L-谷氨酰胺、5000UI/L青霉素链霉素、100μg/mL G418、100μg/mL潮霉素和2ng/mL四环素，然后除去四环素以过表达EC SOD。通过将细胞培养在没有四环素的新鲜培养基中而将四环素予以去除。细胞在新鲜培养基中培养48小时，以诱导EC SOD的过表达，并测定EC SOD的表达水平和活性。EC SOD的表达水平以与实施例1-2)相同的方式通过Northern印迹分析进行测定。而EC SOD的活性则通过向3ml的50mM碳酸钠缓冲液(含有0.1mM的细胞色素C和0.5mM的黄嘌呤，pH 10.0)添加20μL的培养基样品和10μL的黄嘌呤氧化酶(SIGMA)然后测定550nm吸收值进行分析。

在结果中，当除去四环素时，EC SOD mRNA的表达和活性随着时间的流逝而呈现上升的趋势。于是可以构建过表达小鼠EC SOD的细胞系。

2-2)UV辐射后小鼠EC SOD过表达细胞系中的活性氧的测定

用UV对实施例2-1)中构建的小鼠EC SOD过表达细胞系进行辐射，然后测定活性氧的量。在UV辐射前，去除培养基，并用PBS(pH 7.4)对小鼠EC SOD过表达细胞洗涤两次，并在PBS存在的情况下用UV进行辐射。通过以下方式进行UV辐射：用发射27mW/cm²的UVA灯以10J/m²的UVA对所述细胞系进行辐射，和用发射1.15mW/cm²的3个UVB灯以20mJ/cm²的UVB对所述细胞系进行辐射。PUVA处理：通过用0.1％8-MOP处理所述细胞系，并在30分钟之后，用PBS对经处理的细胞系洗涤两次，并以2J/cm²的UVA进行辐射。

如上所述用UV对细胞进行辐射后，在不同的时间点对细胞进行采样，并在37℃与10μM HE(dihydroethyidium)反应20分钟。用含有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)NaN₃的PBS洗涤所得样品，用流式细胞仪分析。用流式细胞仪检测的值表示为相对于记为1的对照组的活性氧物质量的值。使用未经UV辐射的细胞系作为对照。

结果显示，当用10J/cm²的UVA对小鼠EC SOD过表达细胞系进行辐射时，UV辐射后活性氧物质的量持续下降6小时(见图7A)。另外，当用20mJ/cm²的UVB对EC SOD过表达细胞系进行辐射时，相对于对照细胞系，UV辐射后1小时活性氧物质的浓度下降约60％(见图7B)。另外，当用PUVA处理EC SOD过表达细胞系时，相对于EC SOD非过表达细胞系，胞内活性氧的量显著下降(见图7C)。

从以上结果可以看出，EC SOD不仅在血清和胞外基质中起作用，而且还具有有效地降低细胞中的活性氧物质的浓度的活性。

实施例3：UV辐射对人EC SOD过表达细胞系中的细胞死亡的影响

3-1)人EC SOD过表达细胞系的构建

为了检测UV辐射对人EC SOD过表达细胞系中活性氧变化的作用，构建了人EC SOD过表达细胞系。为此目的，首先将人EC SOD cDNA插入到pcDNA 3.1/myc-His(A)(Invitrogen)的XbaI和EcoRI位点。通过PCR扩增制备人EC SOD cDNA，所述PCR采用含有人EC SOD cDNA的pUC18-hEC SOD载体(由Clinical chemistry，Sweden的Marklund教授提供)(Karin Hjalmarsson，Proc Natl Acad Sci USA，第84卷，6340-6344，1987)作为模板并使用以下引物进行。PCR扩增反应由如下组成：98℃4分钟，一个循环；98℃30秒，55℃30秒和72℃45秒，30个循环；和72℃5分钟，一个循环。

正向引物(SEQ ID NO：5)：

5′-ATC TCT AGA ATG CTG GCG CTA CTG TGT-3′

反向引物(SEQ ID NO：6)：

5′-ATC GAA TCC TCA GGC GGC CTT GCA CTC GCT CTC-3′

所得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，用XbaI和EcoRI酶处理，并将所得产物插入pcDNA 3.1/myc-His(A)载体(见图8)。采用阳离子脂质素(Invitrogen)将所得质粒转化到HaCaT细胞(人类角化细胞系)(由TheUniversity of Heidelberg，德国的N.E.Fusenig教授提供)中。然后，将转化的细胞培养在含有500μg/ml新霉素(Gibco)的培养基中，并且只选择抗性克隆，由此构建了EC SOD过表达细胞系。

为了证实细胞中EC SOD的过表达，进行了Western印迹分析。将EC SOD过表达细胞系与含有1％NP-40、0.1％SDS和蛋白酶抑制剂的PBS反应，然后离心，并收集上清液，由此从EC SOD过表达细胞系中提取蛋白。用提取的蛋白进行15％的SDS-PAGE，并将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉/TBS-0.1％Tween 20溶液封闭1小时。然后，将所得蛋白与200∶1稀释的HIS抗体(Santa Cruz)反应1小时，用TBS-0.1％Tween 20溶液洗涤3次。接着，将反应物质与过氧化物酶偶联的抗兔IgG反应1小时，并洗涤3次，然后用ECL试剂盒(Amersham Bioscience)检测EC SOD的表达。另外，使用非转化HaCaT细胞系作为阴性对照。

结果表明，在阴性对照HaCaT细胞系中，没有检测到组氨酸结合的EC SOD，但是在用含EC SOD cDNA的质粒转化的细胞系中，检测到了组氨酸结合的EC SOD，因此表明，EC SOD在转化细胞系中过表达(见图9)。

3-2)检测UV辐射后人EC SOD过表达细胞系中的细胞死亡

对实施例3-1)中构建的人EC SOD过表达细胞系进行UV辐射，然后检测活性氧物质的量。在UV辐射之前，去除培养基，并用PBS(pH 7.4)对人EC SOD过表达细胞系洗涤两次，并在PBS存在的情况下用UVB进行辐射。进行UV辐射：用发射1.15mW/cm²的3个UVB灯以10mJ/cm²、20mJ/cm²和30mJ/cm²的UVB对所述细胞系进行辐射。24小时之后，对细胞进行采样，用PBS(pH 7.4)洗涤，并固定在80％的乙醇中。细胞经离心沉淀并用PBS(pH 7.4)洗涤，悬浮在1ml PBS(pH 7.4)中，并与4ml渗透液(0.5％Tripton X-100、200μg/ml RNase A、10μg/ml碘化丙啶)反应15分钟。用流式细胞术进行细胞周期分析，以百分比表示凋亡(apoptototic)细胞(Sub G1)。同时，使用未经转化的HaCaT细胞系作为阴性对照组。

结果，在以10mJ/cm²的强度进行UVB辐射时，对照组细胞系和ECSOD过表达细胞系中的凋亡细胞的百分比与没有表现出大的差异。然而，在以20mJ/cm²和30mJ/cm²的强度进行UVB辐射时，EC SOD过表达细胞系中的凋亡细胞的百分比显著低于对照组中的凋亡细胞的百分比(图10)。

从以上结果可以看出，EC SOD的过表达可以降低人类角化细胞系中因UV所造成的细胞死亡。这提示了EC SOD的过表达可以防止皮肤免受UV的损伤。

实施例4：细胞转导性人EC SOD融合蛋白的制备

4-1)TAT-EC SOD融合蛋白、R9-EC SOD融合蛋白和K10-EC SOD融合蛋白表达载体的制备

制备人EC SOD蛋白分别与蛋白转导域HIV-1 Tat(RKKRRQRRR)、由9个精氨酸残基组成的寡肽和由10赖氨酸残基组成的寡肽相融合的融合蛋白。另外，还制备了其中EC SOD缺失了肝素域的ΔHD/EC SOD蛋白与HIV-1 Tt相融合的融合蛋白。

为此目的，首先制备人EC SOD cDNA和人ΔHD/EC SOD cDNA。通过PCR扩增制备人EC SOD cDNA，所述PCR采用含有人EC SODcDNA的pUC18-hEC SOD载体(由Clinical chemistry，Sweden的Marklund教授提供)作为模板并使用以下引物(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)进行。PCR扩增反应由以下组成：98℃4分钟，一个循环；98℃30秒，55℃30秒和72℃45秒，30个循环；72℃5分钟，一个循环。

正向引物(SEQ ID No：7)：

5′-GAT CCT CGA GTG GAC GGG CGA GGA CTC GGC-3′

反向引物(SEQ ID NO：8)：

5′-GAT CCT CGA GTC AGG CGG CCT TGC ACT CGC T-3′

在EC SOD缺失了肝素域的ΔHD/EC SOD的情况中，在上述相同的条件下进行PCR扩增，不同的是使用了以下引物(SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10)。

正向引物(SEQ ID NO：9)：

5′-GAT CCT CGA GTG GAC GGG CGA GGA CTC GGC-3′

反向引物(SEQ ID NO：10)：

5′-AAT GCT CGA GTC ACT CTG AGT GCT CCC GCG C-3′

所得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，用XhoI酶处理。将经酶处理的成熟EC SOD cDNA和成熟ΔHD/EC SOD cDNA分别插入含有HIV-1 Tat基础域(氨基酸残基49-57：RKKRRQRRR)的pET15(b)-TAT载体(由翰林大学遗传工程系的Choi SY教授提供)(Park等，J Gen Virol，83：1173-1181，2002)的XhoI位点，于是制备了相应的表达载体。同时，将经酶处理的成熟EC SOD cDNA分别插入到包含由9个精氨酸残基组成的寡肽的pET15(b)-R9载体(由翰林大学遗传工程系的Choi SY教授提供)(Ryu等，Mol Cells，16：385-391，2003)和包含由10赖氨酸残基组成的寡肽的pET15(b)-K10载体(由翰林大学遗传工程系的Choi SY教授提供)的XhoI位点，制得相应的表达载体(见图11)。

4-2)大肠杆菌的转化和融合蛋白的表达

采用热激法以实施例4-1)中制备的各表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)。然后，将经转化的大肠杆菌菌株接种到250ml含氨苄青霉素的LB培养基中，并在200rpm搅拌的同时于37℃培养到A₆₀₀为0.8。向培养液中加入IPTG(1mM)并进步培养，以诱导EC SOD融合蛋白的过表达。

4-3)融合蛋白的纯化

实施例4-2)中所制备的细胞经离心收集，悬浮在结合缓冲液(5mM咪唑、0.5M NaCI、20mM Tris-HCl、6M尿素，pH 7.9)中，并通过超声破碎。由于各融合蛋白均在N末端含有6个组氨酸，因此可以通过固定的金属螯合亲和层析以约90％的极高程度纯化。鉴于此，对细胞破碎溶液进行离心，并将所收集的上清液立即装载2.5ml Ni²⁺-次氮基三乙酸琼脂糖柱中，并用10倍体积的结合缓冲液和6倍体积的洗涤缓冲液(30mM咪唑、5M NaCl、20mM Tris-HCl，pH 7.9))洗涤，然后用洗脱缓冲液(1M咪唑、0.5M NaCl、20mM Tris-HCl，(pH7.9))洗脱融合蛋白。接着，收集含有各融合蛋白的组分，并通过Sephadex G-25柱(PD 10柱，AmershamBiotech)层析进行脱盐。经纯化的TAT-EC SOD融合蛋白、TAT-ΔHD/ECSOD融合蛋白、K10-EC SOD融合蛋白和R9-EC SOD融合蛋白通过电泳进行鉴定(见图12和13)。TAT-EC SOD融合蛋白、TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白、K10-EC SOD融合蛋白和R9-EC SOD融合蛋白的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：19所示。

4-4)融合蛋白的细胞转导能力的检测

使用人类角化细胞系检测本发明的TAT-EC SOD融合蛋白、TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白、K10-EC SOD融合蛋白和R9-EC SOD融合蛋白的细胞转导能力。即，将HaCaT细胞接种到玻片小室培养瓶中，24小时之后，用根据本发明制备的EC SOD融合蛋白处理，所述融合蛋白的浓度分别为0μM、1μM、2μM和4μM。3小时后，将所得物质在3.7％的甲醛/PBS(pH 7.4)中固定10分钟，并与0.1％triton X-100/PBS一起温育10分钟，以使它们具有渗透性。然后在环境温度用2％(v/v)FCS/PBS封闭1小时，与100∶1稀释的HIS抗体/2％FCS/PBS/PBS(Santacruz，USA)反应1小时，并用2％FBS/PBS洗涤3次。将所得物质与50∶1稀释的FITC偶联的IgG(Serotec)反应1小时。使该反应物质与1μg/ml PI反应15分钟，并用2％FBP/PBS洗涤3次。然后，经封同并用共聚焦显微镜进行观测。使用没有与蛋白转导域融合的EC SOD蛋白作为阴性对照组。

同时，从用TAT-EC SOD融合蛋白或TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白处理的HaCaT细胞中提取蛋白，并用HIS抗体进行Western印迹分析。对分析条带的强度进行量化，并表示为相对于没有融合转导域的对照组ECSOD蛋白的百分比。此外，通过Western印迹分析法对K10-EC SOD融合蛋白和R9-EC SOD融合蛋白的细胞渗透效率进行分析，并表示为相对于TAT-EC SOD融合蛋白的细胞转导效率的百分比。

结果表明，阴性对照组没有渗透到细胞中，而TAT-EC SOD融合蛋白有效地转导到细胞中，从而其定位在细胞质中。另外，TAT-ΔHD/ECSOD融合蛋白也转导到细胞中，从而定位在细胞质中(见图14)。

而且，细胞渗透比例的计算结果显示TAT-EC SOD融合蛋白和TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白的细胞转导效率以浓度依赖方式随融合蛋白的升高而升高，并且相对于TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白，TAT-EC SOD融合蛋白的细胞转导效率较高(见图15)。

同时，其中由9个精氨酸残基组成的寡肽与EC SOD相融合而成的R9-hEC SOD融合蛋白表现出最高的转导效率。细胞转导效率从高向低排列紧随着R9-EC SOD融合蛋白的是具有由10个赖氨酸残基组成的寡肽与hEC SOD融合而成的K10-hEC SOD融合蛋白和TAT-EC SOD融合蛋白(见表1)。

表1：EC SOD融合蛋白的细胞转导效率

EC SOD融合蛋白	转导效率(％)
EC SOD融合蛋白	转导效率(％)	TAT-hEC SOD	100
R9-hEC SOD	160	TAT-hEC SOD	100
R9-hEC SOD	160	K10-hEC SOD	150

4-5)PEP-1-EC SOD融合蛋白的制备

制备人EC SOD蛋白与蛋白转导域PEP-1肽(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)相融合的融合蛋白。同时，制备了其中EC SOD中肝素域缺失的ΔHD/EC SOD与PEP-1肽相融合的融合蛋白。

为此目的，用NdeI-XhoI限制酶切割在实施例4-1)中制备的TAT-ECSOD表达载体或TAT-ΔHD/EC SOD表达载体，然后将PEP-1肽插入到所述载体中，于是制备了PEP-1-EC SOD表达载体和PEP-1-ΔHD/EC SOD表达载体。将已由以下引物对经人工制得的双链寡聚核苷酸连接到各表达载体中(见图16)。

正向引物(SEQ ID NO：20)：

5′-TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTG C-3′

反向引物(SEQ ID NO：21)：

5′-TCGABCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGAGACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC-3′

表达所制备的表达载体并以实施例4-2)和4-3)中相同的方式纯化。PEP-1-EC SOD融合蛋白和PEP-1-ΔHD/EC SOD融合蛋白的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：22至SEQ ID NO：25所示。

4-6)PEP-1-EC SOD融合蛋白的细胞转导能力的检测

采用海拉细胞系(人类乳癌细胞系)(由翰林大学遗传工程系的SooYoung Choi教授提供)检测实施例4-5)中纯化的本发明的PEP-1-EC SOD融合蛋白的细胞转导能力。即，将海拉细胞接种到玻片小室中，24小时之后，用各为1μM的本发明的PEP-1-EC SOD融合蛋白和作为阴性对照组的EC SOD蛋白进行处理。1小时之后，于室温将细胞在3.7％的甲醛/PBS(pH 7.4)中固定10分钟，并与0.1％Triton X-100/PBS反应10分钟，以使它们具有渗透性。然后在室温用2％(v/v)FCS/PBS封闭1小时，并与400∶1稀释的HIS抗体/2％FCS/PBS/PBS(Santacruz，USA)反应1小时，接着用2％FBS/PBS洗涤3次。然后，将用100∶1稀释的Cy3偶联的兔IgG(Molecular Probe Co)处理细胞1小时，接着用2％FBP/PBS洗涤3次。该反应物质经封固并用荧光显微镜进行观测。使用没有融合有蛋白转导域的EC SOD蛋白作为阴性对照组。

结果表明，阴性对照组没有转导到细胞中(见图17的A)，而PEP-1-EC SOD融合蛋白转导到细胞中，从而定位在细胞质中(见图17的B)。

实施例5：EC SOD和细胞转导性EC SOD融合蛋白在TPA所致的皮肤病模型中的治疗效果

5-1)检测EC SOD在TPA处理的野生型小鼠和EC SOD过表达的小鼠中的表达

用TPA处理野生型和EC SOD过表达的小鼠，并通过免疫组织化学染色检测EC SOD在小鼠的皮肤组织中的表达模式

为此目的，构建了EC SOD过表达的转基因小鼠。作为试验动物，使用从韩国KRIBB(韩国生命科学研究所)购买的杂种小鼠((C57BL/6XCBA)F1)。为了诱导超数排卵，以48小时的时间间隔，将5IU的PMSG(怀孕母马的血清促性腺激素)和5IU的hCG(人类绒毛膜促性腺激素)注射到雌性小鼠的腹腔中，然后将其与同一家系的雄性小鼠按1∶1进行交配。次日早晨，观测阴道塞的有无，杀死带有阴道塞的个体，并从中取其输卵管。从输卵管壶腹收集胚胎。作为培养基，使用含0.4％BSA的M16培养基。

为了制备皮肤组织中EC SOD的过表达得到诱导的小鼠，用限制酶切割含实施例2-1)所述的小鼠EC SOD cDNA的pCRII TOPO载体中的小鼠EC SOD cDNA，并将其插入含人类角蛋白K14启动子的pBS KS载体中。同时，用鸡卵清蛋白poly(A)插入该载体中，以诱导有效的体外表达。为了将DNA插入到胚胎中，用限制酶Hind和XhoI对表达载体进行酶切(图18)。将经限制酶切割的DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，通过透析回收，并用酚-氯仿进行分离纯化。在10mM Tris(pH 7.4)/0.2mM EDTA中透析使终浓度为4ng/μl。将含外源基因的DNA溶液注射到单细胞阶段胚胎的前核中。将注射外源基因的胚胎培养到双细胞阶段，选择经培养的健康胚胎。将发情的雌性ICR小鼠与雄性小鼠交配，并在次日观测阴道塞的有无，使用带有阴道塞的小鼠作为代孕母鼠。选择约15至20个良好生长到双细胞阶段的胚胎并将其移植到代孕母鼠的输卵管壶腹中，接着将肌肉层和表皮层相互缝合。移植后，使出生的小鼠生长约3周。接着，割下约1cm的所述小鼠的尾巴，在55℃用裂解缓冲液处理，并用酚提取基因组DNA。用以下引物对对所述基因组DNA进行PCR扩增，从而检测其是否已被转化。PCR扩增反应由以下组成：94℃，一个循环；94℃30秒，51℃30秒和72.5℃45秒，30个循环；72.5℃5分钟，个循环。

正向引物(SEQ ID NO：26)：

5′-TTG TCT CTA ATA GAG GGT C-3′

反向引物(SEQ ID NO：27)：

5′-TCA AGC CTG TCT ATC TTC T-3′

通过已知方法(双TPA处理)用TPA处理上述转基因小鼠和野生型小鼠(Zhaorigetu等，Oncology Rep 10：537-534，2003)。TPA处理前两天，用动物用剃刀剃掉10周龄雌性小鼠背部的毛。然后，以24小时为时间间隔，用8.1nmol的TPA(Sigma Co.USA)溶于200μl丙酮中的溶液处理剃过的皮肤组织连续两天。作为对照组，同时只用200μl丙酮处理皮肤组织。在最后一次TPA处理之后1小时分离小鼠的皮肤组织并固定在4％多聚甲醛中，用乙醇脱水，并埋入石蜡。在用显微切片机以5μm间隔切割皮肤组织后，使皮肤组织样品附着到玻片上。用二甲苯处理所述组织样品，以去掉石蜡，用乙醇脱水，用0.3％Triton X-100处理以提供溶液的渗透性，并用3％H₂O₂处理以抑制包含在细胞中的过氧化物酶。然后，加10％羊血清以封闭反应并用1∶50稀释的EC SOD多克隆抗体处理。反应结束后，用DAKO LSAB试剂盒(peroxidase universal，DAKO Co.)通过DAB(二氨基联苯胺)反应对组织进行显色。通过常规方法将经显色的组织样品制成样品并在显微镜下以100×的放大倍数观测。

从结果可以看出，当用TPA对野生型小鼠进行处理时，EC SOD在处理小鼠的整个皮肤组织中表达。转基因小鼠也是一样，EC SOD在整个皮肤组织中表达。特别是在转基因小鼠的情况中，观察到EC SOD在表皮组织和毛囊组织中强烈表达，表明与野生型小鼠比较，EC SOD在转基因小鼠的皮肤组织中过表达(图19)。

5-2)对TPA处理的野生型小鼠和EC SOD过表达小鼠的皮肤组织所进行的观察和厚度测定

根据如实施例5-1)所述的相同方法，用TPA处理野生型小鼠和ECSOD过表达小鼠，并在1小时之后对小鼠皮肤组织进行分离、固定、乙醇脱水和石蜡包埋。然后，用显微切片机以5μm的间隔进行切割，使该组织样品附着到玻片上。用二甲苯处理该组织样品以除去石蜡、经乙醇脱水、用苏木精和曙红染色、封固、并用显微镜观测。

同时，用影像获取系统对用TPA处理的野生型小鼠和EC SOD过表达小鼠以及用丙酮处理的对照组小鼠各种随机选择的区域进行成像。然后用量尺测量表皮层和真皮层的总厚度和仅表皮层的厚度。

结果显示，用TPA处理的野生型小鼠的表皮层厚度和真皮层厚度大于只用丙酮处理而未用TPA处理的对照组野生型小鼠的相应厚度。同时，在用TPA处理的转基因小鼠中，观察到相对于仅用丙酮处理的对照组转基因小鼠其表皮出现不正常的过度生长，但是非常微不足道(图20)。

可以看出，在用TPA处理的野生型小鼠中，表皮和真皮的总厚度和仅表皮的厚度分别比用丙酮处理的对照组小鼠的相应厚度大2.1倍和1.4倍，表明野生型小鼠和对照组小鼠存在明显的差异(图21A)。另一方面，在用TPA处理的EC SOD过表达小鼠中的表皮厚度和真皮厚度的总和和仅表皮的厚度比用丙酮处理的对照组小鼠的相应厚度大1.1倍，表明野生型小鼠和对照组小鼠稍有差异(图21B)。

从以上结果可以看出，因TPA引起的皮肤组织厚度的变化可以被ECSOD所抑制。因此，EC SOD可以用来治疗特征为表皮生长特别是表皮增生的慢性炎症皮肤病。

5-3)在用TPA处理的EC SOD表达细胞中的MMP表达的变化

用TPA处理其中已经导入人EC SOD过表达载体的人类角化细胞HaCaT细胞，通过RT-PCR分析MMP在该细胞中的表达。

为此目的，用100nM TPA处理其中已经导入实施例3-1)的人ECSOD过表达载体的HaCaT细胞。TPA处理后，在37℃对该细胞培养1小时，用trizol液(GibcoBRL)提取所培养的细胞的总RNA。以10μg的总RNA作为模板，用反转录系统(Promega Co.)进行反转录，从而获得cDNA。用下表2所示的引物对PCR扩增所述cDNA，将扩增的DNA在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶(含0.002％溴化乙锭)上展开15分钟。在UV下观察DNA的扩增，然后检测扩增的DNA条带的强度。使用GAPDH作为内部对照组，DNA条带的检测强度表示为相对于记为1.0的GAPDH的强度的值。

表2：在用于MMP表达分析的RT-PCR中使用的引物

引物	序列	SEQ IN NO
引物	序列	SEQ IN NO	人MMP1正向引物	5′-ATCTACAGCTCCTTTGGTCTT-3′	28
人MMP1反向引物	5′-ATCTACAGCTCCTTTGGCTT-3′	29	人MMP1正向引物	5′-ATCTACAGCTCCTTTGGTCTT-3′	28
人MMP1反向引物	5′-ATCTACAGCTCCTTTGGCTT-3′	29	人MMP2正向引物	5′-AACCCTCAGAGCCACCCCTA-3′	30
人MMP2反向引物	5′-GTGCATACAAAGCAAACTGC-3′	31	人MMP2正向引物	5′-AACCCTCAGAGCCACCCCTA-3′	30
人MMP2反向引物	5′-GTGCATACAAAGCAAACTGC-3′	31	GAPDH正向引物	5′-CATCTTCCAGGAGCGAGACC-3′	32
GAPDH反向引物	5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′	33	GAPDH正向引物	5′-CATCTTCCAGGAGCGAGACC-3′	32

结果表明，与野生型HaCaT细胞相比，未经TPA处理的EC SOD过表达HaCaT细胞中的MMP1的表达下降了。同时，经过TPA处理后1小时的野生型细胞中的MMP1的表达显著上升，但是EC SOD过表达细胞中的MMP1的表达与未经TPA处理的水平相同。

在未经TPA处理的组中，MMP2在EC SOD过表达细胞中的表达稍低于在野生型细胞中的表达。TPA处理后，MMP2在野生型细胞中的表达显著上升，但在EC SOD过表达细胞中其与TPA处理前相类似(图22)。

以上结果提示，EC SOD可以抑制因TPA引起的MMP的表达，因此抑制皮肤老化。

5-4)EC SOD蛋白和细胞转导性EC SOD融合蛋白处理使人类成纤维细胞中的MMP的表达所发生的变化

已知控制组织中胞外基质的变化的MMP主要在人类成纤维细胞中表达。为此，用EC SOD蛋白和细胞转导性EC SOD融合蛋白各自处理人类成纤维细胞，并检测由于处理而使MMP的表达发生的变化。

用1μM的人EC SOD蛋白和实施例4-3)中制备的经纯化的TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白各自处理人类成纤维细胞，然后用100nMTPA处理，并在37℃培养1小时。收集细胞，以实施例5-3)相同的方式通过RT-PCR检测MMP1和MMP2的表达水平。对照组不经过TPA处理。用TPA处理的各测试组的DNA条带的强度表示为相对于记为1.0的对照组的DNA条带强度的值。

通过以实施例3-1)中制备的人EC SOD表达载体转化大肠杆菌，并用与实施例4-2)和实施例4-3)相同的方式对大肠杆菌中的载体进行表达和纯化，而制备了人EC SOD蛋白。

结果表明，当用TPA处理人类成纤维细胞时，MMP1和MMP2的表达得到增强。另方面，当用TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白或EC SOD蛋白处理然后用TPA处理人类成纤维细胞时，MMP1和MMP2的表达受到抑制(图23A和23B)。

从以上结果可以看出，TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白或EC SOD蛋白具有抑制由TPA诱导的MMP酶表达的活性，并且通过赋于EC SOD蛋白以细胞转导能力可以进一步提高所述活性。

实施例6：EC SOD蛋白处理对肥大细胞的脱颗粒的抑制

用本发明的EC SOD蛋白处理肥大细胞，并检测肥大细胞的脱颗粒因所述蛋白处理而受到的抑制。为此目的，将从BALB/C小鼠中收集的骨髓细胞培养在50％的营养培养基(含有100单位/毫升氨苄青霉素、100mg/ml链霉素、10mg/ml庆大霉素、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、10％牛胎血清的RPMI 1640)和50％WEHI-3细胞保存培养基中至少3周，以获得均质性(homogeneous)超过95％的BMMC(衍生于骨髓的肥大细胞)。将1μg/ml或10μg/ml人EC SOD蛋白加入到1×10⁶个细胞/毫升的BMMC中并培养30分钟。将培养液与KL/LPS/IL-1β反应30分钟，并收集培养上清液和细胞裂解物。将25μl的培养上清液和细胞裂解物各与作为底物的对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-二氧-b-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma Co.USA)反应。将0.2M甘氨酸-NaOH(pH 10.7)加到反应物质中以终止反应，并用分光光度计于410nm检测酶活性，以检测β-己糖酰胺酶(hexosamidase)的释放的抑制。另外，用PBS处理对照组。将酶活性的抑制(％)表示为相对于记为100％的PBS处理的对照组中的β-己糖酰胺酶的释放的百分比。

酶活性的抑制(％)＝(EC SOD处理的测试组中的β-己糖酰胺酶的释放/PBS处理的对照组中的β-己糖酰胺酶的释放)×100

结果，用1μg/ml或10μg/ml的EC SOD处理的BMMC测试组相对于对照组表现出的酶活性抑制分别为9.87％和11.97％(表3)。因此，可以看出，EC SOD具有抑制肥大细胞的脱颗粒的作用，因此它可以治疗诸如遗传性过敏症等过敏性皮肤病。

表3：EC SOD蛋白处理对肥大细胞的脱颗粒的抑制

		A₄₀₅ ^a)	β-己糖酰胺酶的释放	酶活性抑制(％)
		A₄₀₅ ^a)	β-己糖酰胺酶的释放	酶活性抑制(％)	对照组(用PBS处理)		0.111±0.010	18.38	100
EC SOD	10μg/ml	0.100±0.008	16.57	9.87	对照组(用PBS处理)		0.111±0.010	18.38	100
	10μg/ml	0.100±0.008	16.57	9.87	1μg/ml	0.098±0.009	16.18	11.97
	总β-己糖酰胺酶活性		0.606±0.077	100	1μg/ml	0.098±0.009	16.18	11.97	-

a：n＝3，平均值±标准偏差

工业实用性

如上所述，根据本发明的EC SOD蛋白分布在整个皮肤组织中，同时它具有清除皮肤细胞中的活性氧物质以及抑制表皮细胞的过生长、MMP的表达和肥大细胞的脱颗粒的作用。因此，本发明的EC SOD蛋白对于预防和治疗皮肤病是有用的。另外，通过将蛋白转导域融合到ECSOD而制备的细胞转导性EC SOD融合蛋白具有优异的细胞转导能力，因此它对于预防和治疗皮肤病是有用的。

序列表

<110>金泰润

生物线索及溶液有限公司

<120>EC SOD和细胞转导性EC SOD及它们的用途

<150>KR10-2003-0076629

<151>2003-10-31

<160>33

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

atgttggcct tcttgttc 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

ttaagtggtc ttgcactc 18

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

agtctcgaga tgttggcctt cttgttctac ggc 33

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gatcctcgag tggtcttgca ctcgctct 28

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

atctctagaa tgctggcgct actgtgt 27

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

atcgaatcct caggcggcct tgcactcgct ctct 34

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

gatcctcgag tggacgggcg aggactcggc 30

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

gatcctcgag tcaggcggcc ttgcactcgc t 31

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

gatcctcgag tggacgggcg aggactcggc 30

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

aatgctcgag tcactctgag tgctcccgcg c 31

<210>11

<211>240

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>肽(PEPTIDE)

<222>(1)..(240)

<223>人EC SOD

<400>11

Met Leu Ala Leu Leu Cys Ser Cys Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ala Ser

1 5 10 15

Asp Ala Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala

20 25 30

Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu

35 40 45

Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Thr Leu His Ala Ala Cys Gln

50 55 60

Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly

65 70 75 80

Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe

85 90 95

Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala

100 105 110

Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr

115 120 125

Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly

130 135 140

Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg

145 150 155 160

Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg

165 170 175

Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn

180 185 190

Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys

195 200 205

Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu

210 215 220

His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala

225 230 235 240

<210>12

<211>231

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TAT-EC SOD融合蛋白

<400>12

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala

1 5 10 15

Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys

20 25 30

Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly

35 40 45

Thr Leu His Ala Ala Cys Gln Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala

50 55 60

Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro

65 70 75 80

Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu

85 90 95

Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu

100 105 110

Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val

115 120 125

Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp

130 135 140

Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly

145 150 155 160

Pro His Ser Ile Val Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp

165 170 175

Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala

180 185 190

Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu

195 200 205

Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg

210 215 220

Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala

225 230

<210>13

<211>218

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白

<400>13

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala

1 5 10 15

Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys

20 25 30

Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly

35 40 45

Thr Leu His Ala Ala Cys Gln Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala

50 55 60

Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro

65 70 75 80

Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu

85 90 95

Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu

100 105 110

Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val

115 120 125

Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp

130 135 140

Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly

145 150 155 160

Pro His Ser Ile Val Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp

165 170 175

Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala

180 185 190

Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu

195 200 205

Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu His Ser Glu

210 215

<210>14

<211>231

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>R9-EC SOD融合蛋白

<400>14

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala

1 5 10 15

Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys

20 25 30

Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly

35 40 45

Thr Leu His Ala Ala Cys Gln Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala

50 55 60

Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro

65 70 75 80

Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu

85 90 95

Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu

100 105 110

Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val

115 120 125

Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp

130 135 140

Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly

145 150 155 160

Pro His Ser Ile Val Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp

165 170 175

Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala

180 185 190

Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu

195 200 205

Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg

210 215 220

Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala

225 230

<210>15

<211>232

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>K10-EC SOD融合蛋白

<400>15

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Trp Thr Gly Glu Asp Ser

1 5 10 15

Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala

20 25 30

Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp

35 40 45

Gly Thr Leu His Ala Ala Cys Gln Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp

50 55 60

Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala

65 70 75 80

Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr

85 90 95

Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala Ile His Val His Gln Phe Gly Asp

100 105 110

Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Val Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg

130 135 140

Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala

145 150 155 160

Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Gly Glu

165 170 175

Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn

180 185 190

Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly

195 200 205

Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg

210 215 220

Arg Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala

225 230

<210>16

<211>696

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码TAT-EC SOD融合蛋白的核苷酸序列

<400>16

aggaagaagc ggagacagcg acgaagatgg acgggcgagg actcggcgga gcccaactct 60

gactcggcgg agtggatccg agacatgtac gccaaggtca cggagatctg gcaggaggtc 120

atgcagcggc gggacgacga cggcacgctc cacgccgcct gccaggtgca gccgtcggcc 180

acgctggacg ccgcgcagcc ccgggtgacc ggcgtcgtcc tcttccggca gcttgcgccc 240

cgcgccaagc tcgacgcctt cttcgccctg gagggcttcc cgaccgagcc gaacagctcc 300

agccgcgcca tccacgtgca ccagttcggg gacctgagcc agggctgcga gtccaccggg 360

ccccactaca acccgctggc cgtgccgcac ccgcagcacc cgggcgactt cggcaacttc 420

gcggtccgcg acggcagcct ctggaggtac cgcgccggcc tggccgcctc gctcgcgggc 480

ccgcactcca tcgtgggccg ggccgtggtc gtccacgctg gcgaggacga cctgggccgc 540

ggcggcaacc aggccagcgt ggagaacggg aacgcgggcc ggcggctggc ctgctgcgtg 600

gtgggcgtgt gcgggcccgg gctctgggag cgccaggcgc gggagcactc agagcgcaag 660

aagcggcggc gcgagagcga gtgcaaggcc gcctga 696

<210>17

<211>657

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码TAT-ΔHD/EC SOD融合蛋白的核苷酸序列

<400>17

aggaagaagc ggagacagcg acgaagatgg acgggcgagg actcggcgga gcccaactct 60

gactcggcgg agtggatccg agacatgtac gccaaggtca cggagatctg gcaggaggtc 120

atgcagcggc gggacgacga cggcacgctc cacgccgcct gccaggtgca gccgtcggcc 180

acgctggacg ccgcgcagcc ccgggtgacc ggcgtcgtcc tcttccggca gcttgcgccc 240

cgcgccaagc tcgacgcctt cttcgccctg gagggcttcc cgaccgagcc gaacagctcc 300

agccgcgcca tccacgtgca ccagttcggg gacctgagcc agggctgcga gtccaccggg 360

ccccactaca acccgctggc cgtgccgcac ccgcagcacc cgggcgactt cggcaacttc 420

gcggtccgcg acggcagcct ctggaggtac cgcgccggcc tggccgcctc gctcgcgggc 480

ccgcactcca tcgtgggccg ggccgtggtc gtccacgctg gcgaggacga cctgggccgc 540

ggcggcaacc aggccagcgt ggagaacggg aacgcgggcc ggcggctggc ctgctgcgtg 600

gtgggcgtgt gcgggcccgg gctctgggag cgccaggcgc gggagcactc agagtga 657

<210>18

<211>696

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码R9-EC SOD融合蛋白的核苷酸序列

<400>18

cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggtgg acgggcgagg actcggcgga gcccaactct 60

gactcggcgg agtggatccg agacatgtac gccaaggtca cggagatctg gcaggaggtc 120

atgcagcggc gggacgacga cggcacgctc cacgccgcct gccaggtgca gccgtcggcc 180

acgctggacg ccgcgcagcc ccgggtgacc ggcgtcgtcc tcttccggca gcttgcgccc 240

cgcgccaagc tcgacgcctt cttcgccctg gagggcttcc cgaccgagcc gaacagctcc 300

agccgcgcca tccacgtgca ccagttcggg gacctgagcc agggctgcga gtccaccggg 360

ccccactaca acccgctggc cgtgccgcac ccgcagcacc cgggcgactt cggcaacttc 420

gcggtccgcg acggcagcct ctggaggtac cgcgccggcc tggccgcctc gctcgcgggc 480

ccgcactcca tcgtgggccg ggccgtggtc gtccacgctg gcgaggacga cctgggccgc 540

ggcggcaacc aggccagcgt ggagaacggg aacgcgggcc ggcggctggc ctgctgcgtg 600

gtgggcgtgt gcgggcccgg gctctgggag cgccaggcgc gggagcactc agagcgcaag 660

aagcggcggc gcgagagcga gtgcaaggcc gcctga 696

<210>19

<211>699

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码R9-EC SOD融合蛋白的核苷酸序列

<400>19

aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag tggacgggcg aggactcggc ggagcccaac 60

tctgactcgg cggagtggat ccgagacatg tacgccaagg tcacggagat ctggcaggag 120

gtcatgcagc ggcgggacga cgacggcacg ctccacgccg cctgccaggt gcagccgtcg 180

gccacgctgg acgccgcgca gccccgggtg accggcgtcg tcctcttccg gcagcttgcg 240

ccccgcgcca agctcgacgc cttcttcgcc ctggagggct tcccgaccga gccgaacagc 300

tccagccgcg ccatccacgt gcaccagttc ggggacctga gccagggctg cgagtccacc 360

gggccccact acaacccgct ggccgtgccg cacccgcagc acccgggcga cttcggcaac 420

ttcgcggtcc gcgacggcag cctctggagg taccgcgccg gcctggccgc ctcgctcgcg 480

ggcccgcact ccatcgtggg ccgggccgtg gtcgtccacg ctggcgagga cgacctgggc 540

cgcggcggca accaggccag cgtggagaac gggaacgcgg gccggcggct ggcctgctgc 600

gtggtgggcg tgtgcgggcc cgggctctgg gagcgccagg cgcgggagca ctcagagcgc 660

aagaagcggc ggcgcgagag cgagtgcaag gccgcctga 699

<210>20

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60

taaagtgc 68

<210>21

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

tcgabcactt tacgtttttt tttcggctga gaccattcgg tccaccaggt ttcccaccag 60

gtttctttcc 70

<210>22

<211>243

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PEP1-EC SOD

<400>22

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

122 126 131 136

Lys Lys Arg Lys Val Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser

141 146 151

Asp Ser Ala Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile

156 161 166

Trp Gln Glu Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Thr Leu His Ala

171 176 181

Ala Cys Gln Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg

186 191 196 201

Val Thr Gly Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu

206 211 216

Asp Ala Phe Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser

221 226 231

Ser Arg Ala Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys

236 241 246

Glu Ser Thr Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln

251 256 261

His Pro Gly Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp

266 271 276 281

Arg Tyr Arg Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile

286 291 296

Val Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg

301 306 311

Gly Gly Asn Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu

316 321 326

Ala Cys Cys Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln

331 336 341

Ala Arg Glu His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Glu Cys

346 351 356 361

Lys Ala Ala

<210>23

<211>230

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PEP1-ΔHD/EC SOD

<400>23

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

123 127 132 137

Lys Lys Arg Lys Val Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser

142 147 152

Asp Ser Ala Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile

157 162 167

Trp Gln Glu Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Thr Leu His Ala

172 177 182

Ala Cys Gln Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg

187 192 197 202

Val Thr Gly Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu

207 212 217

Asp Ala Phe Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser

222 227 232

Ser Arg Ala Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys

237 242 247

Glu Ser Thr Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln

252 257 262

His Pro Gly Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp

267 272 277 282

Arg Tyr Arg Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile

287 292 297

Val Gly Arg Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg

302 307 312

Gly Gly Asn Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu

317 322 327

Ala Cys Cys Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln

332 337 342

Ala Arg Glu His Ser Glu

347 352

<210>24

<211>737

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码PEP1-EC SOD融合蛋白的核苷酸序列

<400>24

tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60

taaactgctg gacgggcgag gactcggcgg agcccaactc tgactcggcg gagtggatcc 120

gagacatgta cgccaaggtc acggagatct ggcaggaggt catgcagcgg cgggacgacg 180

acggcacgct ccacgccgcc tgccaggtgc agccgtcggc cacgctggac gccgcgcagc 240

cccgggtgac cggcgtcgtc ctcttccggc agcttgcgcc ccgcgccaag ctcgacgcct 300

tcttcgccct ggagggcttc ccgaccgagc cgaacagctc cagccgcgcc atccacgtgc 360

accagttcgg ggacctgagc cagggctgcg agtccaccgg gccccactac aacccgctgg 420

ccgtgccgca cccgcagcac ccgggcgact tcggcaactt cgcggtccgc gacggcagcc 480

tctggaggta ccgcgccggc ctggccgcct cgctcgcggg cccgcactcc atcgtgggcc 540

gggccgtggt cgtccacgct ggcgaggacg acctgggccg cggcggcaac caggccagcg 600

tggagaacgg gaacgcgggc cggcggctgg cctgctgcgt ggtgggcgtg tgcgggcccg 660

ggctctggga gcgccaggcg cgggagcact cagagcgcaa gaagcggcgg cgcgagagcg 720

agtgcaaggc cgcctga 737

<210>25

<211>695

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码PEP1-ΔHD/EC SOD融合蛋白的核苷酸序列

<400>25

tatgaaagaa acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg 60

taaactgctg gacgggcgag gactcggcgg agcccaactc tgactcggcg gagtggatcc 120

gagacatgta cgccaaggtc acggagatct ggcaggaggt catgcagcgg cgggacgacg 180

acggcacgct ccacgccgcc tgccaggtgc agccgtcggc cacgctggac gccgcgcagc 240

cccgggtgac cggcgtcgtc ctcttccggc agcttgcgcc ccgcgccaag ctcgacgcct 300

tcttcgccct ggagggcttc ccgaccgagc cgaacagctc cagccgcgcc atccacgtgc 360

accagttcgg ggacctgagc cagggctgcg agtccaccgg gccccactac aacccgctgg 420

ccgtgccgca cccgcagcac ccgggcgact tcggcaactt cgcggtccgc gacggcagcc 480

tctggaggta ccgcgccggc ctggccgcct cgctcgcggg cccgcactcc atcgtgggcc 540

gggccgtggt cgtccacgct ggcgaggacg acctgggccg cggcggcaac caggccagcg 600

tggagaacgg gaacgcgggc cggcggctgg cctgctgcgt ggtgggcgtg tgcgggcccg 660

ggctctggga gcgccaggcg cgggagcact cagag 695

<210>26

211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

ttgtctctaa tagagggtc 19

<210>27

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

tcaagcctgt ctatcttct 19

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

atctacagct cctttggtct t 21

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

atctacagct cctttggctt 20

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

aaccctcaga gccaccccta 20

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

gtgcatacaa agcaaactgc 20

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

catcttccag gagcgagacc 20

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims

1.预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含分离的ECSOD蛋白或与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白作为活性成分。

2.预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的表达载体，该表达载体包含编码分离的EC SOD蛋白或与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白的多核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述EC SOD蛋白源自哺乳动物。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述EC SOD蛋白包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

5.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述的皮肤病选自皮肤癌、色素沉着病、光老化、皮炎、表皮增生、遗传性过敏症、荨麻疹和过敏症。

6.预防或改善皮肤病的化妆组合物，该化妆组合物包含分离的ECSOD蛋白或与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白。

7.预防或治疗皮肤病的方法，该方法包括向需要的对象施用有效量的选自以下组的一种物质，所述组由分离的EC SOD蛋白、与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白、以及包含编码各所述蛋白的多核苷酸的表达载体组成。

8.选自以下组的一种物质在制备用于预防或治疗皮肤病的药物组合物中的用途，所述组由分离的EC SOD蛋白、与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白、以及包含编码各所述蛋白的多核苷酸的表达载体组成。

9.预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的细胞转导性EC SOD融合蛋白，在该细胞转导性EC SOD融合蛋白中，蛋白转导域被融合到分离的EC SOD蛋白上或被融合到与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白上。

10.预防或治疗皮肤病的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的表达载体，该表达载体包含编码细胞转导性EC SOD融合蛋白的多核苷酸序列，在所述细胞转导性EC SOD融合蛋白中，蛋白转导域被融合到分离的EC SOD蛋白上或被融合到与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白上。

11.如权利要求9或10所述的药物组合物，其中所述蛋白转导域选自HIV-1Tat转导域、由5～12个精氨酸残基组成的寡肽、由5～12个赖氨酸残基组成的寡肽、PEP-1肽、ANTP蛋白和VP22蛋白。

12.如权利要求9或10所述的药物组合物，其中所述的皮肤病选自皮肤癌、色素沉着病、光老化、皮炎、表皮增生、遗传性过敏症、荨麻疹和过敏症。

13.预防或改善皮肤病的化妆组合物，该化妆组合物包含作为活性成分的细胞转导性EC SOD融合蛋白，在该细胞转导性EC SOD中，蛋白转导域被融合到分离的EC SOD蛋白上或被融合到与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白上。

14.预防或治疗皮肤病的方法，该方法包括向需要的对象施用有效量的选自以下组的一种物质，所述组由细胞转导性EC SOD融合蛋白以及包含编码所述蛋白的多核苷酸的表达载体组成，在所述细胞转导性ECSOD融合蛋白中，蛋白转导域被融合到分离的EC SOD蛋白上或被融合到与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白上。

15.选自以下组的一种物质在制备用于预防或治疗皮肤病的药物组合物中的用途，所述组由细胞转导性EC SOD融合蛋白以及包含编码所述蛋白的多核苷酸的表达载体组成，在所述细胞转导性EC SOD融合蛋白中，蛋白转导域被融合到分离的EC SOD蛋白上，或被融合到与ECSOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白上。

16.细胞转导性EC SOD融合蛋白，其中选自HIV-1tat转导域(RKKRRQRRR)、由5～12个精氨酸残基残基组成的寡肽、由5～12个赖氨酸残基组成的寡肽和PEP-1肽(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)的蛋白转导域被融合到下述蛋白的氨基末端，所述蛋白为EC SOD蛋白或与EC SOD蛋白表现出基本等同的生理活性并与EC SOD蛋白的氨基酸序列具有至少60％序列同源性的蛋白。

17.如权利要求16所述的蛋白，其中所述的细胞转导性EC SOD融合蛋白包含选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

18.编码权利要求17所述融合蛋白的分离的多核苷酸。

19.如权利要求18所述的多核苷酸，该多核苷酸选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25。