CN1243017C

CN1243017C - 肿瘤抑制基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN1243017C
Application number: CN 03129412
Authority: CN
Inventors: 霍克克; 邸玉君
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2003-06-20
Filing date: 2003-06-20
Publication date: 2006-02-22
Anticipated expiration: 2023-06-20
Also published as: CN1566148A

Abstract

本发明公开了一种新的人和小鼠肿瘤抑制基因及其编码蛋白。该基因和编码蛋白质与细胞周期的调控有关，因此与肿瘤的发生有密切关系。该基因及其编码蛋白和它们的衍生物可以被用作与细胞周期控制失调引起的肿瘤等疾病的诊断、治疗和药物筛选。

Description

肿瘤抑制基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的肿瘤抑制基因及其编码蛋白，以及所述基因和编码蛋白的应用。

背景技术

前人的工作发现，NTKL蛋白(N-terminal kinase like protein，N-末端激酶样蛋白)及它的同源蛋白在果蝇、线虫、拟南芥、小鼠和人的组织中都有表达。

2000年，Liu等人克隆到小鼠的mNTKL的cDNA序列(GenBank accession No.AF276514)，还观察到它编码的105kd大小的蛋白在小鼠的不同组织中广泛表达，并用超速离心的方法分离3T3-L1脂肪细胞的不同部分，在胞浆和低密度的成分以及其他小的细胞器中都发现有这种蛋白的表达[Simon C.H.Liu，William S.Lane，Gustav E.LienhardCloning and preliminary characterization of a 105kDa protein with an N-terminalkinase-like domain Biochimca et Biophysica Acta，(2000)1517：148-152]。

人的hNTKL基因是在2002年被Kato等人克隆到，也被确定在不同的组织中广泛的表达，这个基因定位在人的11q13染色体区域，这一区域多次被发现在许多癌组织染色体中发生断裂，所以推测hNTK(human N-terminal kinase like protein，人N端激酶样蛋白)在癌症的发生中可能有功能的异常。人的hNTKL基因转录后经过可变剪接加工，产生带有不同的内含子的两个变体，所以有两种mRNA剪接本。hNTKL变体1被发现定位在胞浆中，而变体2则被发现在有丝分裂的过程中定位于着丝粒上。这种现象提示hNTKL变体2可能具有有丝分裂依赖的功能：如纺锤体的形成和染色体的分离[Masahiro K，Ken-ichi Y，Keiko MY，Hiroko S，Yoshio M.Identification andCharacterization of the Human protein kinase-like gene NTKL：mitosis-pecific centrosomallocalization of an alternatively spliced isoform Genomics(2002)79：760-767]。

NTKL在人和鼠中具有高度同源性，在氨基酸水平上的一致性达到约90％。这种蛋白自身可以形成同源聚体，在细胞中以三聚体的形式存在。在以前的研究中根据编码蛋白的序列和结构分析，推测mNTKL和hNTKL基因的功能可能是一种蛋白激酶或其它蛋白激酶的抑制因子。在这个蛋白的N-端有典型的激酶样结构(32-261Aa)。但同其他的激酶进行详细的序列比较，发现它缺少一个亚区。由于缺少的这个亚区被认为是激酶蛋白酶活性所必须的，所以认为它由于具有激酶相似的结构，可与需要被磷酸化的蛋白结合，因此有可能竞争性抑制这些蛋白的磷酸化[1]。

在细胞中与有丝分裂相关的蛋白涉及到很多方面。细胞的分裂是在纺锤体形成，固缩的染色体分离之后，从而保证所有的遗传物质完全转移到子细胞。因一些蛋白激酶是定位在着丝粒上的，表明蛋白的磷酸化对调控这种转移的过程非常重要。通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶可逆性调节蛋白磷酸化的过程在很多真核细胞的功能中起着非常重要的作用。这包括控制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)和细胞周期蛋白(cyclin)调节细胞周期的过程[SommiP，SavioM，StivalaLA，ScottiC，Mignosi P，Prosperi E，Vannini V，Solcia E.Helicobacter pylori releases a factor(s)inhibiting cell cycle progression ofhuman gastric cell lines by affecting cyclin E/cdk2 kinaseactivity and Rb protein phosphorylation through enhanced p27(KIP1)protein expressionExp Cell Re(2002)281：128-139；Fry DW，Bedford DC，Harvey PH，Fritsch A，KellerPR，Wu Z，Dobrusin E，Leopold WR，Fattaey A，Garrett MD.Cell cycle andbiochemical effects of PD 0l83812，A potent inhibitor of the cyclin D-dependent kinasesCDK4 and CDK6 J Biol Chem(2001)276：16617-16623]。一些与此相关的基因在人的恶性肿瘤中过量表达，表明在着丝粒上蛋白激酶的异常调节与肿瘤的发生和发展有关[Villerbu N，Gaben AM，Redeuilh G，Mester J.Cellular effects of purvalanol A：aspecific inhibitor of cyclin-dependent kinase activities Int J Cancer(2002)97：761-769；Frey RS，Li J，Singletary KW.Effects of genistein on cell proliferation and cell cyclearrest in nonneoplastic human mammary epithelial cells：involvement of Cdc2，p21(waf/cip1)，p27(kip1)，andCdc25C expression Biochem Pharmacol(2001)61：979-989]。

NTKL蛋白有可能就是这类蛋白激酶的一种，也有可能通过竞争底物位点而抑制激酶活性，从而通过调节一些分裂相关蛋白的磷酸化或去磷酸化在有丝分裂中起作用。着丝粒在有丝分裂过程中起到非常重要的作用：在间期细胞时，着丝粒锚定微管作为微管动力液泡和细胞器的运行轨道；在分裂期细胞时，着丝粒又成为合成纺锤体和组织双向纺锤体的主要结构。因此，着丝粒作为微管组成的中心，在染色体分离过程中起着关键的作用。在以前的研究中发现NTKL蛋白具有蛋白激酶的典型结构，并且发现它可以和自身相互作用，但没有证实这种相互作用是否是一种自身磷酸化的结合。因为用多种通用底物均未发现它的激酶活性，所以在本发明之前本领域还没有发现它的特异性底物及其在细胞内的功能。

此外，癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤，目前人们已越来越关注肿瘤相关基因。因此，本领域迫切需要开发新的肿瘤相关基因，如肿瘤抑制基因及其编码蛋白。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的肿瘤抑制基因及其编码蛋白。

本发明的另一目的是提供所述肿瘤抑制基因及其编码蛋白的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种肿瘤抑制多肽，它包括：

(a)含有SEQ ID NO：2或4所示的序列的蛋白，和

(b)所述(a)蛋白的片段，所述片段含有SEQ ID NO：2中1-169位氨基酸序列。

在另一优选例中，所述蛋白是含有SEQ ID NO：2或4所示的序列的蛋白。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码本发明的肿瘤抑制多肽。

较佳地，所述的多核苷酸的序列选自下组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：1中第87-585位。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有编码本发明的肿瘤抑制多肽的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它是选自下组的宿主细胞：

(a)用本发明上述的载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用本发明上述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第五方面，提供了本发明肿瘤抑制多肽的的制备方法，该方法包含：

(a)在表达条件下，培养本发明上述的遗传工程化的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出肿瘤抑制多肽。

在本发明的第六方面，提供了一种能与本发明所述的肿瘤抑制多肽特异性结合的抗体。

在本发明的第七方面，提供了一种抑制肿瘤细胞生长的组合物，它含有安全有效量的本发明所述肿瘤抑制多肽以及药学上可接受的载体。

在本发明的第八方面，提供了本发明所述肿瘤抑制多肽的用途，用于制备抑制肿瘤生长的药物。

附图说明

图1显示了小鼠mNTKL-BP1基因的DNA序列及其推测的蛋白质序列。图中斜体部分表示蛋白质的卷曲螺旋结构域，下划线部分表示蛋白质的核定位信号。这个基因序列在Genbank中的登录号为：(XM_129584)，但无任何生物功能信息。

图2显示了NTKL-BP蛋白氨基酸序列的同源比对结果。其中，(*)代表完全一致的序列，(：)代表保守序列，(.)代表半保守序列，(-)代表缺口部分。NTKL-BP蛋白氨基酸同源序列：Human(XP_044455)，Mouse(XP_129584)，Arabidopsisthaliana(EAA02935)，Anopheles gambiaestr.(EAA10459)，Drosophila melanogaster(AE00352_32)，Geobacter m et al lireducens(ZP_00081191)。

图3显示了人hNTKL-BP1基因的DNA序列及其推测的蛋白质序列。图中下划线部分为克隆本基因时的PCR反应引物序列位置，方框部分为蛋白质的卷曲螺旋结构域位置。这个基因序列在Genbank中的登录号为：(XM_044455)，但无任何生物功能信息。

图4显示了亚克隆确定小鼠mNTKL-BP1蛋白的作用区域。结果表明，小鼠NTKL-BP1蛋白的N端片断能代替NTKL-BP1完整蛋白与小鼠NTKL蛋白相互作用。

图5显示了小鼠mNTKL-BP1蛋白和人hNTKL-BP1蛋白在SMMC-7721，BEL-7402和SPCA1细胞株中的定位。

图5A.BEL-7402细胞，其中(a)为空载体pEGFP转染；(b)为pEGFP-mNTKL-BP1转染；(c)为pEGFP-hNTKL-BP1转染。

图5B.SMMC-7721细胞，其中(a)为空载体pEGFP转染；(b)为pEGFP-mNTKL-BP1转染；(c)为pEGFP-hNTKL-BP1转染。EGFP融合蛋白为绿色，核为青紫色。

图5C.SPCA1细胞，其中(a)为空载体pEGFP转染；(b)为pEGFP-mNTKL-BP1转染。(c)为pEGFP-hNTKL-BP1转染。EGFP融合蛋白为绿色，核为青紫色。

图5D.SMMC-7721细胞被pCMV-HA2-mNTKL-BP1转染后，(a)用鼠抗微管蛋白抗体染色(绿色)；(b)用兔抗HA抗体染色(红色)；(c)为两张照片的重叠，可以更明显地观察到小鼠HA-mNTKL-BP1位于靠近细胞核的位置。

图6显示了Western印迹检测BEL-7402转染细胞裂解提取液中的GFP-mNTKL-BP1和GFP-hNTKL-BP1蛋白。各泳道是：1：转染pEGFP空载体；2：转染pEGFP-mNTKL-BP1表达载体；3：转染pEGFP-mNTKL-BP1表达载体。右侧数字为蛋白质分子量(kd)。

图7显示了转染mNTKL-BP1和hNTKL-BP1的BEL-7402细胞集落形成实验。其中，分别用pEGFP-C1，pEGFP-C1-mNTKL-BP1和pEGFP-C1-hNTKL-BP1转染BEL-7402细胞株，在G418选择压力下生长2周后，细胞染色、观察抗性细胞集形成数。

图8显示了转染mNTKL-BP1和hNTKL-BP1的BEL-7402细胞在BABL/C裸鼠体内荷瘤实验。其中，分别用稳定转染了pEGFP-c1、pEGFP-c1-mNTKL-BP1和pEGFP-c1-hNTKL-BP1的肝癌细胞株BEL-7402接种BABL/C裸鼠。培养四周以后观察肿瘤在裸鼠体内生长情况，分离肿瘤组织称重。A裸鼠荷瘤的比较；B肿瘤大小的比较。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，在酵母双杂交筛选中发现，小鼠mNTKL蛋白不但可以同一种肝癌相关基因ALCI编码蛋白的N端片段相互作用，而且还能与与一个新的未知功能蛋白相互作用。编码该新蛋白的小鼠基因被命名为mNTKL-BP1，即mNTKL结合蛋白1(mNTKL binding protein 1)。同时，本发明人还克隆该蛋白在人中的同源蛋白hNTKL-BP1。研究表明，这两种蛋白或其活性片段都是具有肿瘤抑制活性。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“本发明的肿瘤抑制蛋白”、“肿瘤抑制多肽”、“NTKL-BP1”或“N-末端激酶样蛋白结合蛋白1”可互换使用，都指具有NTKL-BP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2或4)的蛋白或多肽。这些术语还包括SEQ ID NO：2或4所示蛋白的活性片段，如具有SEQ ID NO：2中第1-169位序列的片段。

在本发明中，术语“本发明的肿瘤抑制基因”指编码本发明肿瘤抑制多肽的DNA序列，例如SEQ ID NO：1或3所示的DNA分子。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的肿瘤抑制蛋白或多肽”是指肿瘤抑制多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化肿瘤抑制蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。肿瘤抑制蛋白的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括肿瘤抑制蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然肿瘤抑制蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ IDNO：2或4的蛋白质，但与SEQ ID NO：1或3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2或4所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码肿瘤抑制蛋白的多聚核苷酸。

本发明的人肿瘤抑制基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或肿瘤抑制蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的肿瘤抑制多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码肿瘤抑制蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，肿瘤抑制蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nahans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含肿瘤抑制蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold SpringHarbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可包被子细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的变性-复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的肿瘤抑制蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗肿瘤抑制蛋白功能低下或丧失所致的疾病，如各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。

本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。

可以将本发明的多肽与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。肿瘤抑制蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的肿瘤抑制蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

此外，肿瘤抑制蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于肿瘤抑制蛋白的无表达或异常/无活性的肿瘤抑制蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的肿瘤抑制蛋白，以抑制内源性的肿瘤抑制蛋白活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗肿瘤抑制蛋白表达或活性异常所致的疾病，如肿瘤。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将肿瘤抑制蛋白基因转移至细胞内。构建携带肿瘤抑制蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组肿瘤抑制蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还提供了针对NTKL-BP1抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。

多克隆抗体的生产可用NTKL-BP1或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

NTKL-BP1单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，81：6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.PatNo.4946778)也可用于生产抗NTKL-BP1的单链抗体。

能与NTKL-BP1结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对NTKL-BP1分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测NTKL-BP1水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的NTKL-BP1水平，可以用作解释NTKL-BP1在各种疾病中的重要性和用于诊断NTKL-BP1起作用的疾病。

NTKL-BP1的多聚核苷酸可用于NTKL-BP1相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，NTKL-BP1的多聚核苷酸可用于检测NTKL-BP1的表达与否或在疾病状态下NTKL-BP1的异常表达。如NTKL-BP1DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断NTKL-BP1的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用NTKL-BP1特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测NTKL-BP1的转录产物。

检测NTKL-BP1基因的突变也可用于诊断NTKL-BP1相关的疾病。NTKL-BP1突变的形式包括与正常野生型NTKL-BP1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的一个实施例中，本发明人利用PCR技术克隆到了小鼠mNTKL-BP1基因的全长cDNA序列(2537bp)。分析表明，小鼠mNTKL-BP1基因编码一个368氨基酸的蛋白质(图1)。数据库搜索的结果显示，在许多生物中都有mNTKL-BP1基因的同源序列，包括A.thaliana，D.melanogaster，P.falciparum，G.metallireducen，A.gambiaestr和人类(图2)。这表明NTKL-BP1基因在进化过程中具有很强的保守性，也提示它可能具有重要的生物学功能。

此外，mNTKL-BP1基因的组织表达谱表明，该基因在小鼠的多种正常组织中都有表达。

免疫共沉淀实验和免疫荧光亚细胞定位实验都确证了，mNTKL-BP1蛋白和mNTKL蛋白之间特异的相互作用，并且发现这两个蛋白都定位在细胞浆靠近细胞核的周围。

瞬时表达实验证实了，小鼠和人的NTKL-BP1蛋白都对细胞周期有明显影响，能使SMMC-7721细胞在G2-M期停留时间有所延长。

肿瘤细胞集落形成实验和裸鼠荷瘤实验证实了小鼠和人的NTKL-BP1对肿瘤有抑制作用。

由于本发明的肿瘤抑制基因及其编码蛋白与细胞周期的调控有关，因此与肿瘤的发生有密切关系。该基因及其编码蛋白和它们的衍生物可以被用作与细胞周期控制失调引起的肿瘤等疾病的诊断、治疗和药物筛选。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

mNTKL-BP1基因的获得

1.“诱饵”质粒pDB-Leu-mNTKL的构建

编码小鼠mNTKL蛋白的cDNA序列在以人ALC1基因N端为诱饵蛋白筛选小鼠的胚胎和胎脑cDNA文库时作为阳性克隆被得到，融合在pPC86载体(美国Invitrogen公司的ProQuest^TM酵母双杂交系统)的AD 3′端上，通过限制酶SalI/NotI酶切和连接，0.9kb和2.2kb两个片段，先将2.2kb片段与载体的双酶切回收片段连接，然后经SalI单酶切，去磷酸化处理，插入0.9kb片段，鉴定插入方向，完成将mNTKL的完整编码序列亚克隆到载体pDB-Leu(Invitrogen公司)的SalI-NotI克隆位点，从而构建成“诱饵”质粒pDB-Leu-mNTKL。

2.自主激活试验和酵母双杂交筛选

将pDB-Leu-mNTKL转入酵母双杂交宿主菌，经检测无自发激活报告基因的表达。再将要筛选的小鼠10.5天胚胎cDNA库转入该菌，进行库的筛选。其cDNA从小鼠10.5天胚胎的mRNA制备，以质粒pPC86为载体并插入在转录激活区的3′端。共获得的1×106个转化子，将这些转化子涂布于SC-HTL+3AT平板，以检测报告基因HIS3的表达。挑选那些在4天内形成的菌落，进一步检测另一个报告基因LacZ的表达。只选择那些两个报告基因都能够表达，依据半定量法测定LacZ基因的表达强弱共获得了5个作用很强的阳性克隆。

3.序列测定和数据库搜索

抽提那些通过了报告基因表达测定的阳性克隆的质粒DNA，再以从大肠杆菌抽提质粒为模板进行序列测定。搜索GenBank数据库后，发现有3个克隆表达同一种功能未知的蛋白质，将这一蛋白命名为mNTKL-BP1(mouse NTKL-banding protein 1，鼠N-末端激酶样蛋白结合蛋白1)。克隆到的mNTKL-BP1基因DNA序列长度为2537bp(SEQ ID NO：1)，其中蛋白质编码框序列为第87-1190位(即编码区)，编码一个368密码子的蛋白(图1和SEQ ID NO：2)。

此外，根据SEQ ID NO：1中5′和3′端的25bp的序列，合成引物(5′-GAT ATG GCTCAG GAT TGG GCG GGC T-3′(SEQ ID NO：7)和5′-CTGAAAAAAC ACTGGCCGCTCATGT-3′(SEQ ID NO：8))，通过常规RT-PCR获得mNTKL-BP1的cDNA。经测序验证，含有SEQ ID NO：1中第87-1190位的编码区。

实施例2

人hNTKL-BP1基因的获得

合成以下引物，

正向引物编号：HBF，

序列：5′-CGG ATG AGC TGG GCA GCA GTG TTG G-3′(SEQ ID NO：5)

反向引物编号：HBR，

序列：5′-ACC AGA ACT TCA TGT GGC CAA AGC A-3′(SEQ ID NO：6)

采用多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术，以人类胎脑组织的Marathon-ready cDNA文库(购自美国Clontech公司)为模板扩增，PCR反应用Advantage^TM 2 Polymerase酶，反应条件按照美国Clontech公司Marathon^TM cDNAAmplification试剂盒说明书操作。

对扩增产物进行测序，得到一个含完整开放读框区(open reading frame，ORF)未知功能的DNA序列(SEQ ID NO：3)。根据本发明人对这个基因编码蛋白功能的研究，给它命名为hNTKL-BP1基因。

实施例3

hNTKL-BP1基因序列分析

利用我们设计的引物，经PCR反应克隆到的人hNTKL-BP1基因DNA序列长度为1214bp(SEQ ID NO：3)。其中蛋白质编码框序列为第21-1202位，编码一个394密码子的蛋白(图3和SEQ ID NO：4)，包含两个卷曲螺旋结构域(coiled coil domain)。与GenBank中登录的同源DNA序列XM_044455相比较，XM_044455全长2576bp，编码一个含394个氨基酸的推测的开放阅读框(从21bp-1205bp)，其相应的蛋白质序列登录号为：XP_044455。

人hNTKL-BP1基因与小鼠mNTKL-BP1基因DNA序列同源一致度达到80％，蛋白质氨基酸序列的一致度达89％。但人的hNTKL-BP1蛋白N端较小鼠的要多编码22个氨基酸(图2)。

实施例4

酵母双杂交实验：

1).小鼠mNTKL-BP1蛋白钓取人hNTKL蛋白。

用Clontech公司的Matchmaker^TM酵母双杂交系统筛选与小鼠mNTKL-BP1作用的人蛋白。首先利用PCR反应(引物是同实施例1)，扩增小鼠mNTKL-BP1基因的编码区并克隆到pGBKT7载体(Clontech公司)，与载体上的酵母GAL4基因BD区形成融合翻译读框。经自激活检测合格后，用于筛选人胎盘cDNA文库。通过对得到的阳性克隆测序和分析，发现得到的蛋白序列与人hNTKL蛋白序列同源度达99％；对应于与人hNTKL可变剪接形式的第一种变体(2537bp，ORF：1-2427bp)的95-2509bp，融合在pACT2(Clontech公司)载体的AD区的3′端。

此结果证明：小鼠mNTKL-BP1基因编码蛋白能与人hNTKL基因编码蛋白相互作用。

2).亚克隆确定小鼠mNTKL-BP1蛋白作用区域。

为了确定蛋白相互作用的区域，本发明人将小鼠mNTKL-BP1基因的全长分为两个部分，各含有一个卷曲螺旋结构域。将N端(87bp-595bp)片断亚克隆到Proquest^TM酵母双杂交系统(美国Invitrogen公司)的BD的载体上，与带有小鼠mNTKL基因的AD载体共同转入酵母宿主菌。检测转化子中报告基因HIS3表达情况。把能在SC-TLH+3AT平板上生长的转化子转接到SC-TL平板上，再影印在SC-TLH+3AT上培养，同时以该系统提供的A，B，C，D，E菌株作为对照比较。

结果发现含有mNTKL-BP1-N和mNTKL共转化的菌中HIS3报告基因表达更强，表明小鼠mNTKL-BP1蛋白的N端(87bp-595bp)片断可以替代完整蛋白与mNTKL发生作用(图4)。

实施例5

亚细胞定位实验

根据比较分析鼠mNTKL-BP1和人hNTKL-BP1这两个同源基因的编码序列，可以发现它们主要表现在N端有明显不同。人hNTKL-BP1蛋白N端较小鼠的多22个氨基酸。从cDNA序列上看这段编码序列在小鼠基因中不存在，小鼠基因是否缺失了一个外显子的序列还有待进一步证明。由于N端通常是蛋白在细胞定位中很关键的因素，为了解小鼠和人的这两个蛋白在细胞中的具体定位，本发明人分别构建了这两个基因的EGFP融合表达载体：pEGFP-mNTKL-BP1和pEGFP-hNTKL-BP1。然后以空载体pEGFP(Clontech公司)作为对照，转染三种不同的肝癌细胞系(SMMC-7721，BEL-7402和SPCA1)，观察这两种蛋白的亚细胞定位。

结果显示，作为对照的EGFP蛋白均匀分布在全细胞，而鼠和人的蛋白主要集中分布在细胞核周围的细胞浆内。其中小鼠蛋白在核周呈连续分布，而人的蛋白在核周呈颗粒形点状分布。在上述三种不同的细胞系中均为这样的现象(图5)。亚细胞定位结果提示，这两种蛋白与细胞核的结构和功能有密切联系。

实施例6

流式细胞仪检测转染鼠和人NTKL-BP1基因后对细胞周期的影响

1).为了解小鼠和人NTKL-BP1蛋白对细胞周期的影响，分别构建这两个蛋白的表达载体pEGFP-C1-mNTKL-BP1与pEGFP-C1-hNTKL-BP1，分别转染肝癌细胞株SMMC-7721，使这两种基因在细胞内进行瞬时表达蛋白。在37℃二氧化碳培养箱中培养48小时后，收集细胞，用柠檬酸缓冲液悬浮固定，调整细胞数至1×106。然后利用流式细胞仪(FACS)检测被转染的细胞在细胞分裂各个时期时的分布情况。

结果显示，与只转染空载体pEGFP-C1的对照组相比，表达了小鼠和人这两种基因的SMMC-7721细胞株群体中，G0-G1的细胞数有所降低，而G2-M期细胞数增多，S期的细胞数减少。表明瞬时表达小鼠和人的NTKL-BP1蛋白都能使SMMC-7721细胞在G2-M期停留时间有所延长。(表1)。

表1 SMMC-7721细胞株瞬时表达不同基因对细胞分裂周期的影响

2).为排除瞬间转染的不稳定因素和转染时脂质体对细胞状态的影响，本发明人把人hNTKL-BP1基因克隆到带有药物(G418)抗性筛选标记的载体pcDNA3.1(-)HA(美国Invitrogen公司)，构建成pcDNA3.1(-)HA-mNTKL-BP1和pcDNA3.1(-)HA-hNTKL-BP1表达载体，并筛选得到稳定表达这两种蛋白的BEL-7402肝癌细胞株。然后用流式细胞仪测定细胞群体中出于不同分离周期细胞数的分布变化。以空载体pcDNA3.1(-)HA转染的BEL-7402细胞株作为对照。

结果显示人hNTKL-BP1蛋白在BEL-7402肝癌细胞株中比较稳定表达时G0-G1期细胞都明显减少，G2-M期的细胞数明显增多，S期细胞也有增多。表明稳定表达小鼠和人的NTKL-BP1蛋白都能使BEL-7402肝癌细胞株在G2-M期和S期的停留时间明显延长(表2)。

表2 BEL-7402细胞株稳定表达不同基因对细胞分裂周期的影响

实施例7

肿瘤细胞集落形成抑制实验

分别将带有药物(G418)筛选标记的表达载体pEGFP-mNTKL-BP1和pEGFP-hNTKL-BP1转染肝癌细胞株BEL-7402，以pEGFP空载体转染作为对照。经药物筛选后，得到具有抗药性且分别表达GFP-mNTKL-BP1、GFP-hNTKL-BP1和GFP蛋白的转染细胞株。培养48小时后弃去含G418的培养液，用PBS轻洗细胞两次。裂解细胞，离心弃去细胞碎片沉淀，收集蛋白上清液。用小鼠的抗GFP的抗体和Western Blot技术检测蛋白在细胞中的表达。

结果显示小鼠GFP-mNTKL-BP1蛋白和人的GFP-hNTKL-BP1蛋白在转染细胞中都得到表达(图6)。

培养至非转染的对照细胞全部死亡时，用Giemsa染色，计算克隆数，观察细胞的集落形成抑制效果。

结果显示，与对照相比，小鼠mNTKL-BP1和人hNTKL-BP1蛋白对BEL7402肝癌细胞系的集落形成抑制率分别为41.7％(P＝0.048)和52.7％(P＝0.014)。本实验结果表明，小鼠的mNTKL-BP1蛋白都对BEL7402肝癌细胞株的集落形成有显著的抑制作用(P值＜0.05)；人的hNTKL-BP1蛋白都对BEL-7402肝癌细胞株的集落形成有非常显著的抑制作用(P值接近＜0.01)(图7)。

实施例8

裸鼠荷瘤抑制实验

分别构建小鼠mNTKL-BP1基因和人hNTKL-BP1基因的稳定表达载体pEGFP-c1-mNTKL-BP1和pEGFP-c1-hNTKL-BP1，以空载体pEGFP-c1为对照，转染BEL-7402细胞株。把经药物(G418浓度为800ug/ml)筛选分别得到的稳定表达GFP、GFP-mNTKL-BP1和GFP-hNTKL-BP1的转染细胞株皮下接种6周龄BALB/c裸小鼠。接种量2×106细胞数/每只鼠。接种部位在小鼠前驱体侧皮下。四周后处死小鼠，取其肿瘤组织称量，比较组间差异。

结果显示，体内成瘤平均瘤重分别为：空载体对照组0.29±0.05g；稳定转染小鼠mNTKL-BP1的实验组为0.13±0.12g；稳定转染人hNTKL-BP1的实验组为0.06±0.06g。本实验结果表明，小鼠mNTKL-BP1蛋白的表达对肝癌细胞株BEL-7402在裸鼠体内生长成瘤有显著的抑制作用(P＜0.05)；人hNTKL-BP1蛋白的表达对肝癌细胞株BEL-7402在体内生长成瘤有非常显著的抑制作用(P＜0.01)。(图8，表3)

表3.裸鼠荷瘤实验的平均瘤重(克)比较

组别	鼠号
	鼠号								1	2	3	4	5	6	平均值	标准误
	A：pEGFP-C1	0.3	0.3	0.3	0.2	0.35	0.3	0.29	1	2	3	4	5	6	平均值	标准误	0.05
B：pEGFP-C1-mNTKL-BP1	A：pEGFP-C1	0.3	0.3	0.3	0.2	0.35	0.3	0.29	0.2	0.3	0.2	0.1	0	0	0.13	0.12	0.05
B：pEGFP-C1-mNTKL-BP1	C：pEGFP-C1-hNTKL-BP1	0.1	0.1	0.15	0	0	0	0.06	0.2	0.3	0.2	0.1	0	0	0.13	0.12	0.06

讨论

在本研究工作之前，GenBank中登录的小鼠cDNA序列XM_129584及其推测的编码蛋白序列XP_129584和人cDNA序列XM_044455及其推测的编码蛋白序列XP_044455都是没有任何生物功能信息线索的未知基因序列。

本发明人最先采用多方面的分子生物学实验研究技术首先发现了这两个未知序列的许多重要生物功能信息，并且把它们分别命名为小鼠的mNTKL-BP1基因及其编码的mNTKL-BP1蛋白和人的hNTKL-BP1基因及其编码的hNTKL-BP1蛋白。

1).本发明人最先采用酵母双杂交技术研究小鼠mNTKL-BP1基因编码mNTKL-BP1蛋白与人hNTKL基因编码hNTKL-BP1蛋白的相互作用，首先发现了这两个蛋白之间能发生相互作用，并且发现了仅小鼠mNTKL-BP1蛋白的N端(87bp-595bp)片断就可以替代其完整蛋白与mNTKL蛋白发生作用。

2).本发明人最先采用免疫荧光标记技术研究小鼠mNTKL-BP1蛋白和人hNTKL-BP1蛋白的亚细胞定位，并首先发现了发现了小鼠mNTKL-BP1蛋白在核周呈连续分布，人的hNTKL-BP1蛋白在核周呈颗粒形点状分布，表明这两种蛋白与细胞核的结构和功能有密切联系。

4).本发明人最先采用把小鼠和人的这两种基因瞬时转染SMMC-7721肝癌细胞株，并首先发现了被转染细胞群体中处在G0-G1的细胞数有所降低，G2-M期细胞数增多，S期的细胞数减少。表明瞬时表达小鼠和人的NTKL-BP1蛋白都对细胞周期有明显影响，能使SMMC-7721细胞在G2-M期停留时间有所延长。

5).本发明人最先采用把小鼠和人的这两种基因稳定转染的BEL-7402肝癌细胞株，并首先发现了被转染细胞群体中处在G2-M期和S期细胞数增多。表明稳定表达小鼠和人的NTKL-BP1蛋白都对细胞周期有明显影响，能使BEL-7402细胞在G2-M期和S期停留时间有所延长。

6).本发明人最先采用肿瘤细胞集落形成实验研究小鼠和人的这两种基因对BEL7402肝癌细胞株集落形成的影响，并首先发现了小鼠mNTKL-BP1基因的表达对BEL7402肝癌细胞株的集落形成有显著的抑制作用(P值＜0.05)，还首先发现了人的hNTKL-BP1基因的表达对BEL7402肝癌细胞株的集落形成有非常显著的抑制作用(P值接近＜0.01)。

8).本发明人最先采用裸鼠荷瘤实验研究小鼠和人的这两种基因对肝癌细胞株BEL-7402在裸鼠体内生长成瘤作用的影响，并首先发现了小鼠mNTKL-BP1蛋白的表达对肝癌细胞株BEL-7402在裸鼠体内生长成瘤有显著的抑制作用(P＜0.05)；人hNTKL-BP1蛋白的表达对肝癌细胞株BEL-7402在体内生长成瘤有非常显著的抑制作用(P＜0.01)

本发明的肿瘤抑制基因和蛋白的应用性主要表现在：

1.人和小鼠中NTKL-BP1基因DNA及其衍生物(包括基因探针、基因芯片等)可制成产品用于肿瘤等疾病的研究、诊断和药物筛选等方面的应用。

2.人和小鼠中NTKL-BP1基因表达的蛋白及其衍生物可制成产品(包括抗原、抗体、蛋白芯片等)用于肿瘤等疾病的研究、诊断和药物筛选等方面的应用。

3.人hNTKL-BP1基因及其衍生物可用于肿瘤等疾病的基因治疗和药物治疗，以及制造疾病诊断的相关产品。

4.人hNTKL-BP1蛋白及其衍生物(包括抗体)可用于制造诊断和治疗肿瘤等疾病的药物和相关产品。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>复旦大学

<120>肿瘤抑制基因及其编码蛋白和应用

<130>033333

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2537

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(87)..(1190)

<223>

<400>1

gaaggaaccc ggatgtgcct gtggagctgt gttggcagtc tgcgcgcgga gatttgggca 60

ctctttgggt gcccagggct aggcgg atg gct cag gat tgg gcg ggc ttc tct 113

Met Ala Gln Asp Trp Ala Gly Phe Ser

1 5

gag gaa gag ctg agg aga cta aag cag aat aaa gat cca ttt gaa cct 161

Glu Glu Glu Leu Arg Arg Leu Lys Gln Asn Lys Asp Pro Phe Glu Pro

10 15 20 25

cag cgt cga att cct gtg aag aaa act cga caa cag ctt cag cgt gaa 209

Gln Arg Arg Ile Pro Val Lys Lys Thr Arg Gln Gln Leu Gln Arg Glu

30 35 40

aaa gcc ctt cta gag cag agc caa aag ctt ggc ctc caa gat ggg tca 257

Lys Ala Leu Leu Glu Gln Ser Gln Lys Leu Gly Leu Gln Asp Gly Ser

45 50 55

gcc tca ttg ctt cca gag cag ctg ctc tct gca ccc aaa cag aga gct 305

Ala Ser Leu Leu Pro Glu Gln Leu Leu Ser Ala Pro Lys Gln Arg Ala

60 65 70

aac agt caa aag cca cgc tct cct tcc cct gtg gcc ccc agt ccc ctc 353

Asn Ser Gln Lys Pro Arg Ser Pro Ser Pro Val Ala Pro Ser Pro Leu

75 80 85

aca ccc acc tct tcc tct ggc gat gga aag cta cct ggt gtt gga agt 401

Thr Pro Thr Ser Ser Ser Gly Asp Gly Lys Leu Pro Gly Val Gly Ser

90 95 100 105

cag ccc caa gaa cca gga ctt gag aat tcc cac cat ggt cac aaa agt 449

Gln Pro Gln Glu Pro Gly Leu Glu Asn Ser His His Gly His Lys Ser

110 115 120

gcc gag gtt cga gct cca aag cca gat tgc aaa gtg gag aaa aag aaa 497

Ala Glu Val Arg Ala Pro Lys Pro Asp Cys Lys Val Glu Lys Lys Lys

125 130 135

atg gaa ttg caa gag aaa tct cgt tgg gaa gtc ctc caa caa gaa cag 545

Met Glu Leu Gln Glu Lys Ser Arg Trp Glu Val Leu Gln Gln Glu Gln

140 145 150

cga cta atg gaa gag aaa aat aaa cgt aag aaa gcc ctt ttg gct caa 593

Arg Leu Met Glu Glu Lys Asn Lys Arg Lys Lys Ala Leu Leu Ala Gln

155 160 165

gcc att gcg gaa aga tct aag aag acc caa gca gag acc ata aaa cta 641

Ala Ile Ala Glu Arg Ser Lys Lys Thr Gln Ala Glu Thr Ile Lys Leu

170 175 180 185

aag agg atc cag aag gag ttg cag gcc tta gac gac atg gtg tca gct 689

Lys Arg Ile Gln Lys Glu Leu Gln Ala Leu Asp Asp Met Val Ser Ala

190 195 200

gac att ggc atc ctc agg aac aga atc gac cag gcc agc ctg gag tat 737

Asp Ile Gly Ile Leu Arg Asn Arg Ile Asp Gln Ala Ser Leu Glu Tyr

205 210 215

tcc tac gca cgg aag cgc ttt gat aga gct gaa gct gag tac att aca 785

Ser Tyr Ala Arg Lys Arg Phe Asp Arg Ala Glu Ala Glu Tyr Ile Thr

220 225 230

gca aag ctg gat tta cag cgc aaa acc gag acg aaa gag cag ctc acc 833

Ala Lys Leu Asp Leu Gln Arg Lys Thr Glu Thr Lys Glu Gln Leu Thr

235 240 245

gaa cac ctc tgc acc atc atc cag cag aac gag ctc cga aag gcc aag 881

Glu His Leu Cys Thr Ile Ile Gln Gln Asn Glu Leu Arg Lys Ala Lys

250 255 260 265

aag ctg gag gag ctg atg cag cag ctg gac gtg cag gct gat gag gag 929

Lys Leu Glu Glu Leu Met Gln Gln Leu Asp Val Gln Ala Asp Glu Glu

270 275 280

gct ttg caa ctc gag gtg gag gtt gaa cag ttg ctt cgg gaa cag gaa 977

Ala Leu Gln Leu Glu Val Glu Val Glu Gln Leu Leu Arg Glu Gln Glu

285 290 295

gca gag gca gcc aaa caa atg gct tct gta gag agg ctg tgt ccg cct 1025

Ala Glu Ala Ala Lys Gln Met Ala Ser Val Glu Arg Leu Cys Pro Pro

300 305 310

gat ggc gag agt gtg tct tca gaa ctg gct gaa gag aac aat gag cct 1073

Asp Gly Glu Ser Val Ser Ser Glu Leu Ala Glu Glu Asn Asn Glu Pro

315 320 325

caa aag caa gct cct tcc cca gag aca gac aag cca ggc aaa tgt tgc 1121

Gln Lys Gln Ala Pro Ser Pro Glu Thr Asp Lys Pro Gly Lys Cys Cys

330 335 340 345

agt agc tct ccc cat aga cta gac tgc cca gat cca gga gcc aag aac 1169

Ser Ser Ser Pro His Arg Leu Asp Cys Pro Asp Pro Gly Ala Lys Asn

350 355 360

ttt tca gct gct gtg gcc aca tgagcggcca gtgttttttc agttaatatc 1220

Phe Ser Ala Ala Val Ala Thr

365

tctgcggtaa attatagctt gtctctgatc aaacttcttt caactcattt gtgtttgaat 1280

caatgcttag tgatagtatg ttagcatgtc agatcattcc aaagtcagaa gtagtgactg 1340

tttcctatcc agggagtgtt gacccctcga agttggggtt ccttcaagcc ttgtcactga 1400

gttagaatag gtgactcaca gggtgggagt gctcggggcc ctgggtttga ccttcaacac 1460

tacaagcaca gtggtagaag aaaaactaca tggcttctta gcccttggcc aaacttaact 1520

tgtgagagaa ctgggtttga ccttaaacac tacaaaccaa gcacagtggt agaagaaaaa 1580

ctacatgact tcttagtcct tggccaaact taacttgtga gagaacactg agactttgtg 1640

gccttctatg tagtcattaa aaagacaaca attcttatat acagagagaa ggagagaaaa 1700

aacgggttaa cttacctacc cggatgctac tagagtgagt agacacaagt tggaagacaa 1760

cctaagccaa cattattttc cctttacttt gtcagtaaat ggtttctcgt tcccacctga 1820

attgtggcta gttgatccac atccatagat aagctgtgaa tgtgtggctt tacctttact 1880

ttcttctgtt ttccttaatg agtggacagg gaaactttag acaatgaaaa tgtttctaaa 1940

gtgactctga gagtggcaag tctcattgat tatccaacaa tgatgtattc tctcgctgaa 2000

gctctgtaat gtggatattt atatgtcagg tattgcttct tctgtcatga agcattgaaa 2060

tcgttaaagc actcattttc taattgcttt catagtttgt caatcacctg ttcccaaaaa 2120

cttgactggt gcattgtgct agatttgaat gtgtataaat gtcttagttt tgccacaaat 2180

attaccttaa attatcgatt tctcagaaat cacaaaaaat gaaaaatgtg tttcattcat 2240

aaaaaaggag ctgtatttta aaggagataa agacagctgt ttccataata cattgtagaa 2300

acgttaggga tgtcctattt ttagactatt gtctaagaca tcttctgata gtaaggatgc 2360

tttgtatttt tttctatgat ctgagccaca agtataattg tccattactg atttctaaac 2420

acaagcattt atttccatag tgttgttttt atttatgaat gagacgcata caaatttaaa 2480

acttcattgc ccaatacagt cttatttttc taaggaataa acaagtctga taagttt 2537

<210>2

<211>368

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

Met Ala Gln Asp Trp Ala Gly Phe Ser Glu Glu Glu Leu Arg Arg Leu

1 5 10 15

Lys Gln Asn Lys Asp Pro Phe Glu Pro Gln Arg Arg Ile Pro Val Lys

20 25 30

Lys Thr Arg Gln Gln Leu Gln Arg Glu Lys Ala Leu Leu Glu Gln Ser

35 40 45

Gln Lys Leu Gly Leu Gln Asp Gly Ser Ala Ser Leu Leu Pro Glu Gln

50 55 60

Leu Leu Ser Ala Pro Lys Gln Arg Ala Asn Ser Gln Lys Pro Arg Ser

65 70 75 80

Pro Ser Pro Val Ala Pro Ser Pro Leu Thr Pro Thr Ser Ser Ser Gly

85 90 95

Asp Gly Lys Leu Pro Gly Val Gly Ser Gln Pro Gln Glu Pro Gly Leu

100 105 110

Glu Asn Ser His His Gly His Lys Ser Ala Glu Val Arg Ala Pro Lys

115 120 125

Pro Asp Cys Lys Val Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Gln Glu Lys Ser

130 135 140

Arg Trp Glu Val Leu Gln Gln Glu Gln Arg Leu Met Glu Glu Lys Asn

145 150 155 160

Lys Arg Lys Lys Ala Leu Leu Ala Gln Ala Ile Ala Glu Arg Ser Lys

165 170 175

Lys Thr Gln Ala Glu Thr Ile Lys Leu Lys Arg Ile Gln Lys Glu Leu

180 185 190

Gln Ala Leu Asp Asp Met Val Ser Ala Asp Ile Gly Ile Leu Arg Asn

195 200 205

Arg Ile Asp Gln Ala Ser Leu Glu Tyr Ser Tyr Ala Arg Lys Arg Phe

210 215 220

Asp Arg Ala Glu Ala Glu Tyr Ile Thr Ala Lys Leu Asp Leu Gln Arg

225 230 235 240

Lys Thr Glu Thr Lys Glu Gln Leu Thr Glu His Leu Cys Thr Ile Ile

245 250 255

Gln Gln Asn Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys Leu Glu Glu Leu Met Gln

260 265 270

Gln Leu Asp Val Gln Ala Asp Glu Glu Ala Leu Gln Leu Glu Val Glu

275 280 285

Val Glu Gln Leu Leu Arg Glu Gln Glu Ala Glu Ala Ala Lys Gln Met

290 295 300

Ala Ser Val Glu Arg Leu Cys Pro Pro Asp Gly Glu Ser Val Ser Ser

305 310 315 320

Glu Leu Ala Glu Glu Asn Asn Glu Pro Gln Lys Gln Ala Pro Ser Pro

325 330 335

Glu Thr Asp Lys Pro Gly Lys Cys Cys Ser Ser Ser Pro His Arg Leu

340 345 350

Asp Cys Pro Asp Pro Gly Ala Lys Asn Phe Ser Ala Ala Val Ala Thr

355 360 365<210>3

<211>1214

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(21)..(1202)

<223>

<400>3

gcggccgggg aaaaacccgg atg agc tgg gca gca gtg ttg gca gtc gcg gct 53

Met Ser Trp Ala Ala Val Leu Ala Val Ala Ala

1 5 10

gcg aga ttt ggg cac ttt tgg ggg tgc cgg tgg ccc ggg ccg atg gcg 101

Ala Arg Phe Gly His Phe Trp Gly Cys Arg Trp Pro Gly Pro Met Ala

15 20 25

caa ggt tgg gca ggc ttc tct gag gag gaa ctg agg aga cta aag cag 149

Gln Gly Trp Ala Gly Phe Ser Glu Glu Glu Leu Arg Arg Leu Lys Gln

30 35 40

act aaa gat cca ttt gaa cca cag cga cgt ctc ccc gcg aag aaa agt 197

Thr Lys Asp Pro Phe Glu Pro Gln Arg Arg Leu Pro Ala Lys Lys Ser

45 50 55

cga caa caa ctt cag cga gaa aaa gcc ctt gta gag caa agc caa aaa 245

Arg Gln Gln Leu Gln Arg Glu Lys Ala Leu Val Glu Gln Ser Gln Lys

60 65 70 75

ctt ggg ctt caa gat gga tca acc tca tta ctt cca gag cag ctg ctt 293

Leu Gly Leu Gln Asp Gly Ser Thr Ser Leu Leu Pro Glu Gin Leu Leu

80 85 90

tca gca cca aaa cag aga gtt aac gtt caa aaa cca cct ttt tct tcc 341

Ser Ala Pro Lys Gln Arg Val Asn Val Gln Lys Pro Pro Phe Ser Ser

95 100 105

cct act ctt ccg agt cat ttc act ctc acc tcc ccc gtt ggt gat gga 389

Pro Thr Leu Pro Ser His Phe Thr Leu Thr Ser Pro Val Gly Asp Gly

110 115 120

caa cca cag ggc att gaa agt cag cca aag gaa ctg gga ctt gag aat 437

Gln Pro Gln Gly Ile Glu Ser Gln Pro Lys Glu Leu Gly Leu Glu Asn

125 130 135

tcc cat gat ggt cac aac aat gtt gag att cta cct cca aag cca gat 485

Ser His Asp Gly His Asn Asn Val Glu Ile Leu Pro Pro Lys Pro Asp

140 145 150 155

tgc aaa ttg gag aaa aag aaa gtg gaa ttg caa gaa aaa tct cgt tgg 533

Cys Lys Leu Glu Lys Lys Lys Val Glu Leu Gln Glu Lys Ser Arg Trp

160 165 170

gaa gtc ctc caa caa gaa caa cgg cta atg gaa gag aaa aat aaa cgt 581

Glu Val Leu Gln Gln Glu Gln Arg Leu Met Glu Glu Lys Asn Lys Arg

175 180 185

aaa aaa gct ctt ttg gct aaa gct att gca gaa aga tcc aaa aga act 629

Lys Lys Ala Leu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Glu Arg Ser Lys Arg Thr

190 195 200

cag gca gag acc atg aaa cta aag cgg atc cag aag gag ttg cag gct 677

Gln Ala Glu Thr Met Lys Leu Lys Arg Ile Gln Lys Glu Leu Gln Ala

205 210 215

tta gat gac atg gtg tca gct gac act gga att ctc agg aac cgg att 725

Leu Asp Asp Met Val Ser Ala Asp Thr Gly Ile Leu Arg Asn Arg Ile

220 225 230 235

gat cag gcc agc cta gac tat tca tac gct cgg aag cgg ttt gac agg 773

Asp Gln Ala Ser Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Arg Lys Arg Phe Asp Arg

240 245 250

gct gaa gca gag tac att gca gca aag cta gat ata cag cgc aag act 821

Ala Glu Ala Glu Tyr Ile Ala Ala Lys Leu Asp Ile Gln Arg Lys Thr

255 260 265

gag ata aaa gag caa ctc act gaa cac ctt tgt acg atc ata cag caa 869

Glu Ile Lys Glu Gln Leu Thr Glu His Leu Cys Thr Ile Ile Gln Gln

270 275 280

aat gag ctc cga aag gcc aag aag ttg gag gag ttg atg caa caa cta 917

Asn Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys Leu Glu Glu Leu Met Gln Gln Leu

285 290 295

gat gta gaa gcc gat gaa gag act ttg gag ctt gag gtg gag gtc gag 965

Asp Val Glu Ala Asp Glu Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Glu Val Glu

300 305 310 315

gga ttg cta cac aaa caa gaa gta gaa tca agg aga cca gtg gtt cgt 1013

Gly Leu Leu His Lys Gln Glu Val Glu Ser Arg Arg Pro Val Val Arg

320 325 330

tta gag agg cca ttt cag cct gcg gag gag agt gtg aca tta gaa ttt 1061

Leu Glu Arg Pro Phe Gln Pro Ala Glu Glu Ser Val Thr Leu Glu Phe

335 340 345

gct aaa gag agc aga aag tgt caa gaa caa gct gtt tcc cca aag gta 1109

Ala Lys Glu Asn Arg Lys Cys Gln Glu Gln Ala Val Ser Pro Lys Val

350 355 360

gat gac cag tgt gga aat tcc agt agc atc ccc ttt ctt agt cca aac 1157

Asp Asp Gln Cys Gly Asn Ser Ser Ser Ile Pro Phe Leu Ser Pro Asn

365 370 375

tgc cca aat caa gaa ggt aat gac att tca gct gct ttg gcc aca 1202

Cys Pro Asn Gln Glu Gly Asn Asp Ile Ser Ala Ala Leu Ala Thr

380 385 390

tgaagttctg gt 1214

<210>4

<211>394

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

Met Ser Trp Ala Ala Val Leu Ala Val Ala Ala Ala Arg Phe Gly His

1 5 10 15

Phe Trp Gly Cys Arg Trp Pro Gly Pro Met Ala Gln Gly Trp Ala Gly

20 25 30

Phe Ser Glu Glu Glu Leu Arg Arg Leu Lys Gln Thr Lys Asp Pro Phe

35 40 45

Glu Pro Gln Arg Arg Leu Pro Ala Lys Lys Ser Arg Gln Gln Leu Gln

50 55 60

Arg Glu Lys Ala Leu Val Glu Gln Ser Gln Lys Leu Gly Leu Gln Asp

65 70 75 80

Gly Ser Thr Ser Leu Leu Pro Glu Gln Leu Leu Ser Ala Pro Lys Gln

85 90 95

Arg Val Asn Val Gln Lys Pro Pro Phe Ser Ser Pro Thr Leu Pro Ser

100 105 110

His Phe Thr Leu Thr Ser Pro Val Gly Asp Gly Gln Pro Gln Gly Ile

115 120 125

Glu Ser Gln Pro Lys Glu Leu Gly Leu Glu Asn Ser His Asp Gly His

130 135 140

Asn Asn Val Glu Ile Leu Pro Pro Lys Pro Asp Cys Lys Leu Glu Lys

145 150 155 160

Lys Lys Val Glu Leu Gln Glu Lys Ser Arg Trp Glu Val Leu Gln Gln

165 170 175

Glu Gln Arg Leu Met Glu Glu Lys Asn Lys Arg Lys Lys Ala Leu Leu

180 185 190

Ala Lys Ala Ile Ala Glu Arg Ser Lys Arg Thr Gln Ala Glu Thr Met

195 200 205

Lys Leu Lys Arg Ile Gln Lys Glu Leu Gln Ala Leu Asp Asp Met Val

210 215 220

Ser Ala Asp Thr Gly Ile Leu Arg Asn Arg Ile Asp Gln Ala Ser Leu

225 230 235 240

Asp Tyr Ser Tyr Ala Arg Lys Arg Phe Asp Arg Ala Glu Ala Glu Tyr

245 250 255

Ile Ala Ala Lys Leu Asp Ile Gln Arg Lys Thr Glu Ile Lys Glu Gln

260 265 270

Leu Thr Glu His Leu Cys Thr Ile Ile Gln Gln Asn Glu Leu Arg Lys

275 280 285

Ala Lys Lys Leu Glu Glu Leu Met Gln Gln Leu Asp Val Glu Ala Asp

290 295 300

Glu Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Glu Val Glu Gly Leu Leu His Lys

305 310 315 320

Gln Glu Val Glu Ser Arg Arg Pro Val Val Arg Leu Glu Arg Pro Phe

325 330 335

Gln Pro Ala Glu Glu Ser Val Thr Leu Glu Phe Ala Lys Glu Asn Arg

340 345 350

Lys Cys Gln Glu Gln Ala Val Ser Pro Lys Val Asp Asp Gln Cys Gly

355 360 365

Asn Ser Ser Ser Ile Pro Phe Leu Ser Pro Asn Cys Pro Asn Gln Glu

370 375 380

Gly Asn Asp Ile Ser Ala Ala Leu Ala Thr

385 390

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cggatgagct gggcagcagt gttgg 25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

accagaactt catgtggcca aagca 25

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>7

gatatggctc aggattgggc gggct 25

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>8

ctgaaaaaac actggccgct catgt 25

Claims

1.一种肿瘤抑制多肽的用途，所述的多肽具有SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列，其特征在于，所述的多肽用于制备抑制肿瘤生长的药物。

2.一种多核苷酸的用途，所述的多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列的多肽，其特征在于，所述的多核苷酸用于制备抑制肿瘤生长的组合物。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸的序列选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的组合物是药物组合物。