CN1170848C

CN1170848C - 新的人肝癌相关蛋白及其编码序列

Info

Publication number: CN1170848C
Application number: CNB018065716A
Authority: CN
Inventors: 赵新泰; 万大方; 顾健人
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Shanghai Cancer Institute
Priority date: 2000-04-17
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2004-10-13
Anticipated expiration: 2021-04-17
Also published as: WO2001085775A1; AU6201301A; US7112419B2; CN1418223A; US20030148331A1

Abstract

本发明公开了一种新的与肝癌相关的人蛋白，编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于诊断和治疗诸如癌症等疾病的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这种与肝癌相关的人蛋白的多核苷酸的用途。

Description

新的人肝癌相关蛋白及其编码序列

发明领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码人肝癌相关蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。本发明的肝癌相关蛋白是一种肝细胞癌抑制因子。

发明背景

恶性肿瘤的死亡率仅次于心脑血管疾病；其中肝癌在我国是高发性肿瘤之一。肝癌的发生是多基因多步骤的复杂过程，是多种癌基因激活和抑癌基因失活的结果，其中抑癌基因更为关键。因此，寻找抑癌基因是目前研究热点之一。如果某种肿瘤在染色体的某一区段存在较高频率的杂合性缺失，则预示着这一区段存在于该种肿瘤发生相关的抑癌基因。

染色体17p13.3区在多种肿瘤中存在较高的杂合性缺失。因此，国际上有多家实验室均在寻找位于染色体17p13.3区的抑癌基因。至目前为止，已发现了三个可能的抑癌基因(Hic-I，OVCA1和OVCA2)，Hic-I在肿瘤组织中高度甲基化，表达降低。OVCA1和OVCA2在卵巢癌或细胞株中表达减少或不表达。这三个基因均位于染色体的YNZ22位点附近。

由于癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤(如肝癌)，目前人们已越来越关注肿瘤的早期诊断和基因治疗。因此，本领域迫切需要开发研究新的癌症相关的和/或具有抑癌功能的人蛋白及其激动剂/抑制剂。

发明目的

本发明的目的是提供一种新的肝癌相关蛋白-人c63R蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

发明概述

在本发明的第一方面，提供了一种分离的人c63R蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该该多肽是具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码本发明所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；更佳地，该多核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1中所示的编码区序列或全长序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备肝癌相关的c63R蛋白活性的多肽的制备方法，该方法包含：(a)在适合表达蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有肝癌相关c63R蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的肝癌相关c63R蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的肝癌相关c63R蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。

在本发明的第七方面，提供了一种检测肝细胞是否发生癌变或存在癌变易感性的方法，它包括步骤：检测肝细胞样品中c63R转录本与正常的c63R转录本相比是否有变化，有变化就表示该肝细胞发生癌变或存在癌变易感性；或者检测肝细胞样品中c63R蛋白的活性与正常的c63R蛋白相比是否有变化，有变化就表示该肝细胞发生癌变或存在癌变易感性。较佳地，所述的变化是核苷酸的缺失、插入置换突变。更佳地，所述的变化选自下组：SEQID NO：1中核苷酸395-481缺失、SEQ ID NO：1中核苷酸328-1511缺失、SEQ ID NO：1中核苷酸1143-1231缺失、SEQ ID NO：1中核苷酸1325-1419缺失、SEQ ID NO：1中核苷酸1106由C突变为T、SEQ ID NO：1中核苷酸1048缺失。

在本发明的第八方面，提供了一种检测肝癌的试剂盒，它包括：(1)特异性扩增人c63R基因的引物对，(2)检测扩增产物与正常的c63R基因相比是否存在变化所需的试剂。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

图1.覆盖HCCS1的基因组克隆毗连群和HCCS1的基因结构。

用于基因组克隆筛选和毗连群结构的标记示于上方；覆盖HCCS1的基因组克隆毗连群示于中间；HCCS1基因的外显子示于下方。

图2显示了HCCS1的细胞定位。图2a，用pEGF-HCCS1转染NIH3T3细胞的荧光照片；图2b，对图2a中细胞用抗线粒体抗体进行免疫荧光染色的照片；图2c，照片2a和2b的重迭表明HCCS1位于线粒体。

图3对人肝癌细胞和周围非癌细胞的免疫组化染色结果。HCC：肝癌细胞；HCC：肝细胞。

图4显示了HCCS1表达对细胞生长的影响。图4A，用载体pcDNA3.1/V5-His转染的SMMC-7721细胞的集落形成；图4B，用含HCCS1的载体转染的SMMC-7721细胞的集落形成；图4C，集落形成的比较图。其中数据重复3次，与空载体相比p＜0.01。

图5显示了HCCS1对裸鼠中肿瘤形成的影响。与GFP载体组(对照)相比，P＜0.01。

发明详述

本发明人在肝癌的研究中发现染色体17p13.3区的杂合性缺失范围位于YNZ22位点至近端粒的D17S34位点。最小热点缺失范围为D17S1574位点至D17S849位点。本发明人在这个区域中进行了基因克隆，获得了位于D17S849位点的c63R基因，并发现c63R基因在肝癌组织中存在缺失和译码等变化，从而确认了c63R基因为肝癌相关基因。进一步的实验表明，c63R基因是一种肝细胞癌抑制因子，故c63R也被称为HCCS1(Hepatocellular Carcinoma suppressor 1)。研究表明，HCCS1定位于线粒体。此外，HCCS1在肝癌细胞中表达呈阴性，而在正常肝细胞中呈阳性。将HCCS1转入肝癌细胞和裸鼠，都可抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤形成。

在本发明中，术语“c63R蛋白”、“c63R多肽”或“肝癌相关蛋白c63R”和“HCCS1蛋白”、“HCCS1多肽”或“肝细胞癌抑制因子HCCS1”可互换使用，都指具有人肝癌相关蛋白c63R氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。该术语还包括含有或不含起始甲硫氨酸的肝癌相关蛋白c63R。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的肝癌相关c63R蛋白或多肽”，“分离的c63R蛋白或多肽”是指肝癌相关c63R蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化c63R蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。c63R蛋白多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括肝癌相关的人c63R蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然肝癌相关人c63R蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码c63R蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。

编码c63R蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。

上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时，DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时，DNA序列的直接化学合成是不可能的，选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定c63R蛋白的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。

在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2kb之内，较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

在第(4)种方法中，检测c63R蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或c63R蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的c63R蛋白多肽(Science，1984；224：1431)。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码肝癌相关人c63R蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，肝癌相关的人c63R蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al. Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含c63R蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明人研究已表明，在发生癌变的肝细胞中，c63R基因几乎都存在突变，这些突变包括c63R编码序列和非编码序列的缺失、插入和置换突变。这些变化可能导致在肝细胞中的c63R蛋白没有活性或活性过低，并最终直接或间接地导致肝癌。

因此，本发明重组的肝癌相关人c63R蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗c63R蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如肝癌)，和用于筛选促进或对抗c63R蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制c63R蛋白的功能。用表达的重组c63R蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激c63R蛋白功能的多肽分子。

本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)c63R蛋白的药剂的方法。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达c63R蛋白的膜制剂与标记的c63R蛋白一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。

c63R蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。c63R蛋白的拮抗剂可以与c63R蛋白结合并消除其功能，或是抑制c63R蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。c63R蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。

在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将c63R蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响c63R蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤和细胞异常增殖等，尤其是用于肝癌的治疗。

本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。

可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。c63R蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的c63R蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

c63R蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于c63R蛋白的无表达或异常/无活性的c63R蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的c63R蛋白，以抑制内源性的c63R蛋白活性。例如，一种变异的c63R蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的c63R蛋白，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗c63R蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将c63R蛋白基因转移至细胞内。构建携带c63R蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组c63R蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。

抑制c63R蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析。

本发明还提供了针对c63R蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。

抗c63R蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的c63R蛋白。

与c63R蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与c63R蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断c63R蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如c63R蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭c63R蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用c63R蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

c63R蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison etal，PNAS，1985，81：6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗c63R蛋白的单链抗体。

能与c63R蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对c63R蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测c63R蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的c63R蛋白水平，可以用作解释c63R蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断c63R蛋白起作用的疾病。

c63R蛋白的多聚核苷酸可用于c63R蛋白相关疾病(尤其肝癌)的诊断和治疗。在诊断方面，c63R蛋白的多聚核苷酸可用于检测c63R蛋白的表达与否，或检测在疾病状态下c63R蛋白的异常表达。而c63R蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断c63R蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用c63R蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测c63R蛋白的转录产物。

检测c63R蛋白基因的突变也可用于诊断c63R蛋白相关的疾病(尤其是肝癌)。c63R蛋白突变的形式包括与正常野生型c63R蛋白DNA序列(如SEQ ID NO：1所示的正常序列)相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的c63R蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

此外，由于本发明的c63R蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.染色体17p13.3区在肝癌中杂合性缺失范围的确定：

在该实施例中，通过选取染色体17p13.3区的多态性标记(marker)，进行肝癌组织的杂合性缺失分析，从而确定缺失范围和最小热点缺失范围。

1.肝癌及癌旁标本：

54例原发性肝癌及癌旁组织来自启东肝癌研究所，手术中切除的组织速冻后，保存于-80℃冰箱中。

2.组织DNA的提取：

从低温冰箱中取出组织，置组织碾磨器中碾碎，按SDS/蛋白酶K-酚/氯仿抽提方法[3]提取组织DNA。

3.杂合性缺失(LOH)分析：

对VNTR(variable number of tandem repeat)和RFLP探针通过Southern印迹分析检测LOH。10ug的肝癌及癌旁组织DNA经适当限制性内切酶酶切后，25V电泳13小时，转移至hybond-N膜(Amersham公司)。YNZ22探针由上海医科大学胡英赠送，144D6、YNH37.3探针购自American Type Culture Collection(ATCC)。cCI17-708、cCI17-680由Dr.Nakamura赠给。探针用[α-³²P]dATP按随机引物法标记。探针的位点名称，用于酶切的限制性内切酶列于表1中，YNZ22.1、144D6和YNH37.3探针用含50％甲酰胺的常规杂交液于42℃杂交过夜。cCI17-708和cCI17-680探针杂交时，预杂交液为50％甲酰胺，5×SSC，0.5％SDS，10×Denhardt′s液，250ug/ml人胎盘DNA，于42℃预杂交24小时，杂交液除用10％硫酸葡聚糖代替10×Denhardt′s液外，其余成分同预杂交液，于42℃杂交过夜。

微卫星标志的分析在12.5ul反应体积中进行，反应中含1uM PCR引物，25ng组织DNA，200uM dNTP，50mM KCI，10mM Tris(pH9.0)，1.5mM MgCl₂ 0.625U Taq DNA聚合酶(Promega)。微卫星标志的位点名称、退火温度列于表1中。PCR反应按97℃变性4分钟，94℃1′、适当退火温度1′、72℃1′，30个循环，72℃延伸10′程序进行。产物经2％琼脂糖凝胶电泳检查。[r-³²P]ATP标记其中一条引物。在5ul PCR反应体积中，含标记的1pmol引物，1ul上述PCR产物，0.25U Taq DNA聚合酶，除PCR反应进行4个循环外，其余成份和反应条件同上。PCR产物变性后，于6％变性聚丙烯酰胺凝胶上分离、压片，观察LOH结果。

共检测了染色体17p13.3区的16个多态性标志的杂合性缺失情况。这些位点的LOH频率列于表1中，每个样品在每个位点的LOH情况总结于表2中。首先检测了22份样品在YNZ22位点的LOH，发现在19份杂合子中有12份呈LOH，频率为63％。接着又检测了21份样品在接近端粒的D17S34位点的LOH，在12份杂合子中8份呈LOH，频率为67％，而且特别引人注意的是所有YNZ22位点呈LOH的样品在D17S34位点都有LOH(纯合子除外)，是否可能在肝癌样品中17p13.3的缺失范围至少为从YNZ22位点至近端粒的D17S34位点。基于此种考虑，又选用了围绕两位点间的14个标志进一步检测各个标志在肝癌样品中的LOH。结果位于D17S34至D17S5位点间的8个标志在肝癌样品中均有较高LOH，而位于D17S5近着丝粒方向的3个标志有较低或无LOH。这证实了我们的推测，即肝癌样品在染色体17p13.3区的缺失范围为从D17S34至D17S5位点。其中D17S926标志检测了22份样品，10份杂合子均呈LOH，频率为100％。YNZ22位点呈LOH的样品在这个位点也呈LOH(纯合子除外)。D17S1866，D17S849，D17S643，D17S1840，D17S654和D17S1574标志在YNZ22位点呈LOH的样品中均有LOH(纯合子除外)，频率为68-86％。YNH37.3探针(D17S28)只检测了9例在YNZ22位点有LOH的样品，当用Taq I酶切时，所有9份样品均为纯合子。无法确定此位点的LOH情况。值得注意的是NO.16肝癌样品和NO.34肝癌样品，在近着丝粒方向的YNZ22位点和D17S1574位点均无LOH，NO.16肝癌样品在近端粒方向的D17S34和D17S1866位点均无LOH，NO.34肝癌样品也在近端粒方向的D17S34，D17S1866和D17S849位点无LOH。但这两份肝癌样品在D17S849位点和D17S1574位点间的所有位点上均有LOH纯合子。因此，肝癌样品在染色体17p13.3区的最小热点缺失范围为从D17S849位点至D17S1574位点。

在分析染色体17p13.3区各位点LOH的同时，也进行了位于染色体17p13.1区的p53基因中TP53位点的LOH分析。结果发现，该位点在肝癌中只有31％的LOH，远远低于染色体17p13.3区D17S34至D17S5位点间各位点的LOH频率(表1和表2)。

表1 探针及LOH情况

探针	位点名称	限制性内切酶	PCR退火温度	检测的肝癌样品数	LOH/杂合子数目百分比(％)
探针	位点名称	限制性内切酶	PCR退火温度	检测的肝癌样品数	LOH/杂合子数目百分比(％)		144D6	D17S34	Rsa I		21	8/12	67
	D17S1866^*		55℃	22	13/19	68	144D6	D17S34	Rsa I		21	8/12	67
	D17S1866^*		55℃	22	13/19	68		D17S849^*		55℃	22	9/11	82
	D17S926^*		58℃	22	10/10	100		D17S849^*		55℃	22	9/11	82
	D17S926^*		58℃	22	10/10	100		D17S695^*		60℃	21	14/18	78
	D17S1840^*		55℃	22	6/7	86		D17S695^*		60℃	21	14/18	78
	D17S1840^*		55℃	22	6/7	86		D17S1529^*		60℃	33	14/17	82
	D17S643^*		60℃	22	12/16	75		D17S1529^*		60℃	33	14/17	82
	D17S643^*		60℃	22	12/16	75		D17S831^*		60℃	31	18/24	75
	D17S654^*		65℃	22	10/13	77		D17S831^*		60℃	31	18/24	75
	D17S654^*		65℃	22	10/13	77		D17S1574^*		57℃	21	9/13	69
YNH37.3	D17S28	Taq I		9	0/0	0		D17S1574^*		57℃	21	9/13	69
YNH37.3	D17S28	Taq I		9	0/0	0	YNZ22	D17S5	BamH I		22	12/19	63
	D17S525^*		59℃	12	1/4	25	YNZ22	D17S5	BamH I		22	12/19	63
	D17S525^*		59℃	12	1/4	25	cCI17-680	D17S1587	Taq I		6	0/6	0
cCI17-708	D17S878	Msp I		6	0/6	0	cCI17-680	D17S1587	Taq I		6	0/6	0
cCI17-708	D17S878	Msp I		6	0/6	0		TP53^*		60℃	22	4/13	31

*微卫星重复序列标志

Tel

端粒表2.染色体17P13.3区LOH分析

Cen ●loss of heterozygosity ○retention of both alleles non-informative ⊙loss of homozygosity @rearrangement space：not analyzed

着丝粒杂合子丢失无杂合子丢失纯合子纯合子丢失重排空格：未分析

实施例2. c63R的cDNA克隆：

1、染色体17p13.3区D17s926基因组PAC克隆的筛选：

从Genbank中获得D17s926的引物序列，

926-1：GCA GTG GGC CAT CAT CA(SEQ ID NO：3)

926-2：CCG CAG AAG GCT GTT GT(SEQ ID NO：4)

将其送至Genome systems Inc由他们筛选PAC人基因组库，获得阳性克隆P579。

2、从含有P579(Genome System公司提供)菌的平板上挑一个PAC单菌，接种在5ml LB中(含25ug/ml卡那霉素)37℃3000rpm振摇过夜，在75ml LB中加入2.5ml过夜培养物振摇1.5小时，加入IPTG至终浓度0.5mM诱导继续生长5小时后收获细菌离心10,000g10分钟，细菌沉淀按″分子克隆″(美J.Sambrook，E.F.F.ritsch，T.Maniatis.金冬雁，梨孟枫等译.1992年第二版，科学出版社)书中抽提质粒DNA的方法制备PAC DNA，约获得10ug p579DNA。

取P579 DNA，用Not I酶切37℃2-3小时，插入片段约100Kb，用低熔点胶回收DNA片段做为探针。

取200-300ng上面纯化的DNA片段，用³²P-αdATP或³²P-αdCTP)采用随机引物进行标记，操作步骤按试剂盒说明书进行(Megaprime DNA labelling system.Amersham公司)。

将cDNA文库的噬菌体溶液按每块平皿50,000pfu铺制30块平皿(直径150mm)，41℃培养3-5小时，至噬斑直径为0.5mm且相邻噬斑未联合时，从培养箱取出平皿放4℃至少1小时。从冰箱取出平皿放室温轻轻的将硝酸纤维素滤膜(Hybond-C Amersham LIFEScience)铺于平板上，用注射器以碳素墨水作4个点以定方向，取下滤膜碱变性5分钟(0.5mol NaOH-1.5mol NaCl)，中和5分钟(1mol Tris-HCl pH7.4，1.5mol NaCl)转移至6xSSC中稍作浸泡，置3MM滤纸上干燥，然后80℃烘膜2小时。

膜片在预杂交液中65-68℃杂交6-8小时。预杂交液含有如下成分：6xSSC，5xDenhart′s，0.5％SDS，变性的鱼精DNA200ug/ml，变性的胎盘DNA100ug/ml和混合DNA(γDNA5.8，γDNA 7.3和PBR质粒DNA，各为30ug/ml)。

已标记的300ul探针溶液加入Cot-1 DNA 1mg混合DNA各50ug 20xSSC 250ul，100℃煮沸15分钟冰上放置10分钟，60-65℃水浴封闭杂交20分钟，冰上放置20分钟，加入到有膜片的预杂交液中，65-68℃杂交16-24小时。杂交完成后弃取杂交液，用42℃预温的2xSSC-0.1％SDS溶液漂洗膜片2次，每次10分钟，一面洗一面用同位素检测仪检测，调整洗膜片的时间和温度，洗涤后进行放射自显影。用同样的方法进行第二，第三轮筛选，最后得到阳性单克隆，挑取单个的阳性噬菌体斑(phage)放在1mlSM缓冲液中加1滴氯仿，放在室温或4℃作为阳性单克隆的储存液(phage stock)。通过筛选得到阳性噬菌体克隆c63R。

实施例3 c63R重组质粒的构建：

取20ul噬菌体储存液100ul Y1090菌(过夜生长用10mM MgSO₄处理过)37℃温育20分钟，加3.5ml，50℃保温的0.7％的LB琼脂糖，铺在含有1％琼脂胶的平皿上(直径90mm)37℃温育过夜，取出平皿，每块加3ml SM溶液，4℃过夜，收集含有噬菌体的溶液。

取150ul板扩的噬菌体加1ml 10mM MgSO₄处理过的Y1090菌37℃温育15分钟，加40ml LB(含1/100 0.5M CaCl₂)37℃，强烈振摇直至液体由混浊变清(3小时左右)加1ml氯仿37℃振摇20分钟，4000rpm离心10分钟，上清液加入50ul RNase A/DNase溶解液37℃温育1小时，4℃过夜，然后离心1000rpm x10分钟，上清液进行超离心，27000rpmx70分钟。取沉淀加0.5ml SM溶解转移到1.5ml的离心管中加入5ul蛋白酶K和1/5体积的0.5MSTE 50℃温育30分钟，酚/氯仿抽提最后酒精沉淀得phage DNA用EcoRI酶切，用胶回收DNA片段(胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司)。表达载体PBK-CMV(Stratagene公司)DNA同样用EcoR I酶切，并用CIAP酶处理。DNA插入片段和载体PBK-CMV DNA以克分子3∶1的量用T4 DNA连接酶在12℃连接过夜，转化感受态细胞X_LI-blue.挑取白色阳性克隆制备质粒DNA，酶切证明了亚克隆的正确性。

实施例4. c63R核酸序列测定及分析：

对c63R克隆采用双脱氧终止法，在ABI 337 DNA自动测序仪上测定其两端序列，依据所得序列设计引物再次进行测序，直到获得全长序列，共2132bp。进一步分析发现5’端的54Bp为载体上的序列，因此全长序列共2078bp如SEQ ID NO：1所示，其中编码阅读框位于56-2077位。所编码的c63R蛋白全长为673个氨基酸，序列如SEQ ID NO：2所示。核酸序列和氨基酸序列的组合排列示于SEQ ID NO：1。

实施例5. 从人肝cDNA中用PCR法获得基因克隆：

取人肝组织，用Trizol试剂(GIBCO.BRL公司)按其说明书提取总RNA，用mRNA纯化试剂盒(pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL公司)反转录在42进行反转录反应，获得胎盘cDNA。合成如下的基因编码读框的特异引物c63R-1：atgatggaggaggaggaa(SEQ ID NO：5)；c63R-2：gttgtcacggatgatggg(SEQ ID NO：6)。按90℃3分钟1个循环；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟。1个循环进行扩增，获得含有完整开放阅读框序列的蛋白基因的扩增产物。扩增产物经测序验证，与实施例4测得的序列相符。

实施例6. c63R基因在各种组织中的表达

从c63R重组质粒中酶切分离c63R片段，用α³²P-dATP按试剂盒(Megaprime DNALabelling System，Amersham公司)，按说明书进行探针标记。与多组织mRNA膜片(Biochain公司)进行杂交，结果显示有三条杂交带，在多组织中均有表达。

实施例7 C63R基因在肝癌组织中的变化：

获得染色体17p13.3区C63R基因，进一步检测其在肝癌组织中的变化。从肝癌组织和癌旁组织抽提总RNA，反转录为cDNA。

合成如下的C63R基因特异的引物：

C63R-a-PF：CGGGTGGCGGAATGATG(SEQ ID NO：7)

C63R-a-PR：CTCCACCCCCATCTACCA(SEQ ID NO：8)

C63R-b-PF：GGTGGCGGAATGATGGA(SEQ ID NO：9)

C63R-b-PR：CAAAACGCTTCTCCGGC(SEQ ID NO：10)

C63R-c-PF：TGCATGGCTGAGAGGATTG(SEQ ID NO：11)

C63R-c-PR：ACAACCCCGTGGCTTCC(SEQ ID NO：12)

C63R-d-PF：TGCGTACCAGAGCGAAGG(SEQ ID NO：13)

C63R-d-PR：CAAGCAGAACGTCCCCAT(SEQ ID NO：14)

C63R-a-SR：AGGATGGACGGCAAGCG(SEQ ID NO：15)

C63R-b-SR：GGAGGACCCAGCAATGTT(SEQ ID NO：16)

C63R-c-SR：CCAAGACAAGAACCTCGGA(SEQ ID NO：17)

C63R-d-SR：AACATCCTGAGCACGGCA(SEQ ID NO：18)

用C63R-a-PF和C63R-a-PR，C63R-c-PF和C63R-c-PR分别为引物，cDNA为模板，按94℃变性3分钟，一个循环；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟的程序进行首次PCR。再用C63R-b-PF和C63R-b-PR，C63R-d-PF和C63R-d-PR分别为引物，按同上程序进行第二次巢式PCR，获得PCR产物。

对以C63R-b-PF和C63R-b-PR为引物的PCR产物，用C63R-b-PF，C63R-a-SR，C63R-b-SR，和C63R-b-PR为引物进行序列测定。对以C63R-d-PF和C63R-d-PR为引物的PCR产物，用C63R-d-PF，C63R-c-SR，C63R-d-SR和C63R-d-PR为引物进行序列测定。

分析结果发现，肝癌样品3，12，25，28，33和G11在nt341-427有缺失，而相应的癌旁组织无缺失。肝癌样品28在nt1274-1457有缺失。相应的癌旁组织无缺失。肝癌样品31在nt1090-1177有缺失。相应的癌旁组织无缺失。肝癌样品x31在nt1271-1365有缺失。相应的癌旁组织无缺失。肝癌样品G11在nt1052位C突变为T，使相应的氨基酸从Arg突变为Cys。肝癌样品G4在nt994位的T缺失，造成了移码突变。肝癌样品GT7缺失nt743-887位和nt1221-1529，造成了移码突变。肝癌样品GT12缺失nt1612-1769，造成了移码突变。

这些结果表明，c63R基因是一种肝癌相关基因，c63R基因的缺失、插入、置换等类型的突变与肝癌相关。这些变化可能导致在肝细胞中的c63R蛋白没有活性或活性过低，并最终直接或间接地导致肝癌。

实施例8 HCCS1的基因组结构和细胞定位

将HCCS1的cDNA序列与基因组序列进行比较，确定了HCCS1基因的内含子/外显子结构。HCCS1共有18个外显子，横跨的基因组序列约200kb(图1)。

为了确定HCCS1蛋白产物的细胞定位，将HCCS1-GFP融合基因克隆入pEGFP-N1载体，然后将HCCS1-GFP质粒(pEGF-HCCS1)DNA转入人SMMC7721细胞系和小鼠NIH3T3成纤维细胞中，免疫荧光分析显示，两种细胞类型的细胞质中有点状分布区，并且这些分布区与线粒体单克隆抗体113-1(NeoMarkers，Fremont，CA)的染色区相重迭，这表明，HCCS1融合蛋白位于线粒体中(图3)。

实施例9 免疫组化分析

HCC和非癌组织被固定在10％福尔马林的10mM磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)中。将石蜡切片(4μm)安在涂有聚L-赖氨酸的载玻片上，在50℃干燥过夜。小鼠抗-HCCS1抗体在含5％正常羊血清的PBS中作1∶200稀释，然后在室温下保温30分子。在用PBS漂洗3次(每次5分钟)后，在室温下对切片涂覆DAKO EnVision^TM+System，HRP(DAB)，Mouse，Ready-to-use检测体系(DAKO Corp.，Carpinteria，CA，USA)30分钟。切片在Substrate-Chromogen Solution(DAB)中显影，用Mayer’s苏木精复染色，然后观察。

结果如图3所示，在肝癌细胞(HCC)中为阴性，肝细胞(HC)中为阳性。

实施例10 HCCS1对细胞生长的影响

将HCCS1 cDNA插入pcDNA3.1/V5-His载体(Invitrogen)。安装厂商的说明，通过LipofectAMINE试剂将该构建物转染入SMMC-7721人肝癌细胞(3×10⁴)(重复3次)。将空载体作为对照。在用G418(800mg/ml)选择14天后，对克隆进行染色和计数。

结果如图4所示，表明HCCS1可抑制肿瘤细胞的生长。

实施例11 HCCS1对裸鼠中肿瘤形成的影响

收集携带HCCS1 cDNA或空载体的细胞，并再悬浮于PBS中。将200微升细胞(3.7×10⁶)皮下接种于5-6周龄的雄性BALB/c裸鼠的右侧。试验组和对照组各有6只小鼠。在5周后，杀死小鼠，切下肿瘤进行称重。

结果如图5所示，表明HCCS1可抑制裸鼠中肿瘤细胞的形成。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市肿瘤研究所

<120>新的人肝癌相关蛋白及其编码序列

<130>001465pcwo

<150>CN 00115401.X

<151>2000-04-17

<160>18

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>2078

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(56)..(2077)

<400>1

cggggaggcc tgagttgggc tcgcggcggg ggtcggcagg gggccgggtg gcgga atg 58

Met

1

atg gag gag gag gaa ctg gag ttc gtg gag gag ctg gaa gcc gtg ctg 106

Met Glu Glu Glu Glu Leu Glu Phe Val Glu Glu Leu Glu Ala Val Leu

5 10 15

cag ctc acg ccc gag gtg cag ctg gcc atc gag cag gtg ttt cca agc 154

Gln Leu Thr Pro Glu Val Gln Leu Ala Ile Glu Gln Val Phe Pro Ser

20 25 30

cag gac cct cta gat cga gca gat ttc aat gct gtt gag tat atc aat 202

Gln Asp Pro Leu Asp Arg Ala Asp Phe Ash Ala Val Glu Tyr Ile Asn

35 40 45

acc ctg ttc cca acc gag caa tct ctg gcg aac ata gac gaa gtc gtg 250

Thr Leu Phe Pro Thr Glu Gln Ser Leu Ala Asn Ile Asp Glu Val Val

50 55 60 65

aac aaa att agg ctg aaa ata agg aga ctg gat gac aat att cga act 298

Asn Lys Ile Arg Leu Lys Ile Arg Arg Leu Asp Asp Asn Ile Arg Thr

70 75 80

gtt gta aga ggt cag acg aac gtg ggg cag gat gga cgg caa gcg ctt 346

Val Val Arg Gly Gln Thr Asn Val Gly Gln Asp Gly Arg Gln Ala Leu

85 90 95

gaa gag gct cag aaa gct atc caa caa ctc ttt ggc aaa atc aaa gat 394

Glu Glu Ala Gln Lys Ala Ile Gln Gln Leu Phe Gly Lys Ile Lys Asp

100 105 110

atc aaa gac aaa gct gaa aaa tca gag caa atg gtg aaa gaa atc acc 442

Ile Lys Asp Lys Ala Glu Lys Ser Glu Gln Met Val Lys Glu Ile Thr

115 120 125

cgt gat att aag caa tta gat cac gcc aaa cgc cac ctg acc acc tca 490

Arg Asp Ile Lys Gln Leu Asp His Ala Lys Arg His Leu Thr Thr Ser

130 135 140 145

atc acc aca ctg aac cac ctg cac atg ctg gca gga ggt gtc gac tcc 538

Ile Thr Thr Leu Asn His Leu His Met Leu Ala Gly Gly Val Asp Ser

150 155 160

ctc gaa gcc atg acc agg cga aga caa tac gga gaa gtt gct aat ctc 586

Leu Glu Ala Met Thr Arg Arg Arg Gln Tyr Gly Glu Val Ala Asn Leu

165 170 175

ctt cag ggt gtg atg aat gtc ctg gag cac ttc cac aag tat atg ggg 634

Leu Gln Gly Val Met Asn Val Leu Glu His Phe His Lys Tyr Met Gly

180 185 190

att ccg cag atc cgg cag ctt tcc gaa aga gtg aag gct gca cag act 682

Ile Pro Gln Ile Arg Gln Leu Ser Glu Arg Val Lys Ala Ala Gln Thr

195 200 205

gag tta gga cag caa atc ctg gca gat ttt gaa gaa gcg ttt cct tcc 730

Glu Leu Gly Gln Gln Ile Leu Ala Asp Phe Glu Glu Ala Phe Pro Ser

210 215 220 225

cag ggc acc aag aga cca gga gga ccc agc aat gtt cta cga gat gca 778

Gln Gly Thr Lys Arg Pro Gly Gly Pro Ser Asn Val Leu Arg Asp Ala

230 235 240

tgt ctg gtt gct aat att cta gat ccc agg atc aaa cag gaa atc atc 826

Cys Leu Val Ala Asn Ile Leu Asp Pro Arg Ile Lys Gln Glu Ile Ile

245 250 255

aaa aag ttt att aaa cag cat ctg tca gag tat ctg gta ctt ttt caa 874

Lys Lys Phe Ile Lys Gln His Leu Ser Glu Tyr Leu Val Leu Phe Gln

260 265 270

gaa aac caa gat gtt gcc tgg ctg gac aaa atc gac aga cgc tat gcc 922

Glu Asn Gln Asp Val Ala Trp Leu Asp Lys Ile Asp Arg Arg Tyr Ala

275 280 285

tgg ata aaa cgc cag ctt gtg gac tat gag gag aaa tac ggc cgc atg 970

Trp Ile Lys Arg Gln Leu Val Asp Tyr Glu Glu Lys Tyr Gly Arg Met

290 295 300 305

ttt cca cgt gag tgg tgc atg gct gag agg att gcg gtg gaa ttt tgc 1018

Phe Pro Arg Glu Trp Cys Met Ala Glu Arg Ile Ala Val Glu Phe Cys

310 315 320

cat gtg aca agg gca gaa ctt gcc aag att atg cgt acc age gcg aag 1066

His Val Thr Arg Ala Glu Leu Ala Lys Ile Met Arg Thr Arg Ala Lys

325 330 335

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Glu Ile Glu Val Lys Leu Leu Leu Phe Ala Ile Gln Arg Thr Thr Asn

340 345 350

ttt gag ggg ttt ctt gca aaa cgc ttc tcc ggc tgc acc ctg acc gat 1162

Phe Glu Gly Phe Leu Ala Lys Arg Phe Ser Gly Cys Thr Leu Thr Asp

355 360 365

ggg acc ctg aaa aag ctt gag tct cca ccc cca tct acc aat ccc ttc 1210

Gly Thr Leu Lys Lys Leu Glu Ser Pro Pro Pro Ser Thr Asn Pro Phe

370 375 380 385

ctg gaa gat gag cca aca cca gag atg gag gaa ctg gca acg gag aaa 1258

Leu Glu Asp Glu Pro Thr Pro Glu Met Glu Glu Leu Ala Thr Glu Lys

390 395 400

gga gat tta gat caa cca aag aag cct aaa gcc cca gac aat cca ttt 1306

Gly Asp Leu Asp Gln Pro Lys Lys Pro Lys Ala Pro Asp Asn Pro Phe

405 410 415

cat ggc att gtt tcc aag tgt ttt gag cct cat ctc tac gtg tat atc 1354

His Gly Ile Val Ser Lys Cys Phe Glu Pro His Leu Tyr Val Tyr Ile

420 425 430

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Glu Ser Gln Asp Lys Asn Leu Gly Glu Leu Ile Asp Arg Phe Val Ala

435 440 445

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Asp Phe Lys Ala Gln Gly Pro Pro Lys Pro Asn Thr Asp Glu Gly Gly

450 455 460 465

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Thr Val Leu Pro Ser Cys Ala Asp Leu Phe Val Tyr Tyr Lys Lys Cys

470 475 480

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Met Val Gln Cys Ser Gln Leu Ser Thr Gly Glu Pro Met Ile Ala Leu

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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Ser Ser Leu Leu Lys Glu Lys Glu Gly Ser Glu Val Ala Lys Phe Thr

530 535 540 545

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Leu Glu Glu Leu Cys Leu Ile Cys Asn Ile Leu Ser Thr Ala Glu Tyr

550 555 560

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Cys Leu Ala Thr Thr Gln Gln Leu Glu Glu Lys Leu Lys Glu Lys Val

565 570 575

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Asp Val Ser Leu Ile Glu Arg Ile Asn Leu Thr Gly Glu Met Asp Thr

580 585 590

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Phe Ser Thr Val Ile Ser Ser Ser Ile Gln Leu Leu Val Gln Asp Leu

595 600 605

gat gct gcc tgt gat cct gcc ctg act gcc atg agc aag atg cag tgg 1930

Asp Ala Ala Cys Asp Pro Ala Leu Thr Ala Met Ser Lys Met Gln Trp

610 615 620 625

cag aac gtg gag cac gtt ggt gac cag agc ccc tac gtc acc tct gtc 1978

Gln Asn Val Glu His Val Gly Asp Gln Ser Pro Tyr Val Thr Ser Val

630 635 640

att ctg cac atc aag cag aac gtc ccc atc atc cgt gac aac ccc gtg 2026

Ile Leu His Ile Lys Gln Asn Val Pro Ile Ile Arg Asp Asn Pro Val

645 650 655

gct tcc aca cgc aag tac ttc act cag tta tgc gtt aaa ttt gca aag 2074

Ala Ser Thr Arg Lys Tyr Phe Thr Gln Leu Cys Val Lys Phe Ala Lys

660 665 670

taa a 2078

<210>2

<211>673

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Met Glu Glu Glu Glu Leu Glu Phe Val Glu Glu Leu Glu Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Leu Thr Pro Glu Val Gln Leu Ala Ile Glu Gln Val Phe Pro

20 25 30

Ser Gln Asp Pro Leu Asp Arg Ala Asp Phe Asn Ala Val Glu Tyr Ile

35 40 45

Asn Thr Leu Phe Pro Thr Glu Gln Ser Leu Ala Asn Ile Asp Glu Val

50 55 60

Val Asn Lys Ile Arg Leu Lys Ile Arg Arg Leu Asp Asp Asn Ile Arg

65 70 75 80

Thr Val Val Arg Gly Gln Thr Asn Val Gly Gln Asp Gly Arg Gln Ala

85 90 95

Leu Glu Glu Ala Gln Lys Ala Ile Gln Gln Leu Phe Gly Lys Ile Lys

100 105 110

Asp Ile Lys Asp Lys Ala Glu Lys Ser Glu Gln Met Val Lys Glu Ile

115 120 125

Thr Arg Asp Ile Lys Gln Leu Asp His Ala Lys Arg His Leu Thr Thr

130 135 140

Ser Ile Thr Thr Leu Asn His Leu His Met Leu Ala Gly Gly Val Asp

145 150 155 160

Ser Leu Glu Ala Met Thr Arg Arg Arg Gln Tyr Gly Glu Val Ala Asn

165 170 175

Leu Leu Gln Gly Val Met Asn Val Leu Glu His Phe His Lys Tyr Met

180 185 190

Gly Ile Pro Gln Ile Arg Gln Leu Ser Glu Arg Val Lys Ala Ala Gln

195 200 205

Thr Glu Leu Gly Gln Gln Ile Leu Ala Asp Phe Glu Glu Ala Phe Pro

210 215 220

Ser Gln Gly Thr Lys Arg Pro Gly Gly Pro Ser Asn Val Leu Arg Asp

225 230 235 240

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245 250 255

Ile Lys Lys Phe Ile Lys Gln His Leu Ser Glu Tyr Leu Val Leu Phe

260 265 270

Gln Glu Asn Gln Asp Val Ala Trp Leu Asp Lys Ile Asp Arg Arg Tyr

275 280 285

Ala Trp Ile Lys Arg Gln Leu Val Asp Tyr Glu Glu Lys Tyr Gly Arg

290 295 300

Met Phe Pro Arg Glu Trp Cys Met Ala Glu Arg Ile Ala Val Glu Phe

305 310 315 320

Cys His Val Thr Arg Ala Glu Leu Ala Lys Ile Met Arg Thr Arg Ala

325 330 335

Lys Glu Ile Glu Val Lys Leu Leu Leu Phe Ala Ile Gln Arg Thr Thr

340 345 350

Asn Phe Glu Gly Phe Leu Ala Lys Arg Phe Ser Gly Cys Thr Leu Thr

355 360 365

Asp Gly Thr Leu Lys Lys Leu Glu Ser Pro Pro Pro Ser Thr Asn Pro

370 375 380

Phe Leu Glu Asp Glu Pro Thr Pro Glu Met Glu Glu Leu Ala Thr Glu

385 390 395 400

Lys Gly Asp Leu Asp Gln Pro Lys Lys Pro Lys Ala Pro Asp Asn Pro

405 410 415

Phe His Gly Ile Val Ser Lys Cys Phe Glu Pro His Leu Tyr Val Tyr

420 425 430

Ile Glu Ser Gln Asp Lys Asn Leu Gly Glu Leu Ile Asp Arg Phe Val

435 440 445

Ala Asp Phe Lys Ala Gln Gly Pro Pro Lys Pro Asn Thr Asp Glu Gly

450 455 460

Gly Thr Val Leu Pro Ser Cys Ala Asp Leu Phe Val Tyr Tyr Lys Lys

465 470 475 480

Cys Met Val Gln Cys Ser Gln Leu Ser Thr Gly Glu Pro Met Ile Ala

485 490 495

Leu Thr Thr Ile Phe Gln Lys Tyr Leu Arg Glu Tyr Ala Trp Lys Ile

500 505 510

Leu Ser Gly Asn Leu Pro Lys Pro Thr Thr Ser Ser Glu Gly Leu Thr

515 520 525

Ile Ser Ser Leu Leu Lys Glu Lys Glu Gly Ser Glu Val Ala Lys Phe

530 535 540

Thr Leu Glu Glu Leu Cys Leu Ile Cys Asn Ile Leu Ser Thr Ala Glu

545 550 555 560

Tyr Cys Leu Ala Thr Thr Gln Gln Leu Glu Glu Lys Leu Lys Glu Lys

565 570 575

Val Asp Val Ser Leu Ile Glu Arg Ile Asn Leu Thr Gly Glu Met Asp

580 585 590

Thr Phe Ser Thr Val Ile Ser Ser Ser Ile Gln Leu Leu VaI Gln Asp

595 600 605

Leu Asp Ala Ala Cys Asp Pro Ala Leu Thr Ala Met Ser Lys Met Gln

610 615 620

Trp Gln Asn Val Glu His Val Gly Asp Gln Ser Pro Tyr Val Thr Ser

625 630 635 640

Val Ile Leu His Ile Lys Gln Asn Val Pro Ile Ile Arg Asp Asn Pro

645 650 655

Val Ala Ser Thr Arg Lys Tyr Phe Thr Gln Leu Cys Val Lys Phe Ala

660 665 670

Lys

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>3

gcagtgggcc atcatca 17

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>4

ccgcagaagg ctgttgt 17

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>5

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<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>6

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<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>7

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<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>8

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<210>9

<211>17

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>9

ggtggcggaa tgatgga 17

<210>10

<211>17

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>10

caaaacgctt ctccggc 17

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>11

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<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>12

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<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>13

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<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>14

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<210>15

<211>17

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>15

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<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>16

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<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>17

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<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>18

aacatcctga gcacggca 18

Claims

1.一种分离的人c63R蛋白多肽，其特征在于，它含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽的序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码的多肽具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1中所示的编码区序列或全长序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞：

(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

8.一种制备具有人蛋白c63R活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有人蛋白c63R活性的多肽。

9.一种能与权利要求1所述的人c63R蛋白特异性结合的抗体。

10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。

11.一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它包括：

(1)特异性扩增人c63R基因的引物对，

(2)检测扩增产物与正常的c63R基因相比是否存在变化所需的试剂。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的变化包括：核苷酸的缺失、插入、和置换突变。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述的变化选自下组：SEQ ID NO：1中核苷酸341-427缺失、SEQ ID NO：1中核苷酸1274-1457缺失、SEQ ID NO：1中核苷酸1090-1177缺失、SEQ ID NO：1中核苷酸1271-1365缺失、SEQ ID NO：1中核苷酸1052由C突变为T、SEQ ID NO：1中核苷酸994缺失，SEQ ID NO：1中核苷酸743-887缺失，SEQ ID NO：1中核苷酸1221-1529缺失，SEQ ID NO：1中核苷酸1612-1769缺失。