CN1765925A - 肝癌中上调表达的两种新的人蛋白及其编码序列和另外二十种人蛋白在肝癌诊断中的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两种新的在肝癌组织中上调表达的人蛋白，编码此多肽的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于诊断和治疗癌症等疾病如肝癌的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其用于疾病诊断和治疗等多种用途。本发明还公开了编码这两种新的在肝癌组织中上调表达的人蛋白的多核苷酸的用途。本发明还公开了另外二十种在肝癌组织中上调表达的入蛋白及其编码序列在诊断肝癌方面的新用途(以前没有人报道过其在肝癌诊断方面的用途)。

Description

肝癌中上调表达的两种新的人蛋白及其编码序列和另外二十种 人蛋白在肝癌诊断中的新用途

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及两种新的编码在肝癌组织中上调表达的人蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。本发明还涉及在肝癌组织中上调表达的另外二十种人蛋白及其编码序列在诊断肝癌方面的新用途(以前没有人报道过其在肝癌诊断方面的用途)。

背景技术：

人基因组学研究目前是国际上的热点，除人染色体DNA大规模测序，表达序列测序(EST)的方法外，还缺少从功能开始的筛选具有功能基因组的高通量的方法。

癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤，目前人们已越来越关注肿瘤的治疗和检测。因此，本领域迫切需要开发研究在肝癌组织中具有表达差异的人蛋白及其激动物/抑制剂。

发明内容：

本实验将cDNA芯片等方法应用于肝癌表达谱的研究。在特定病人群体中基因表达呈现出高度一致性规律的一组基因往往反映了疾病起源和所处阶段的不同，往往预示着患病个体不同的预后效果。肝细胞肝癌(HCC)是全球最常发生的癌症之一，肝癌的发生和发展与许多已知的和未知的基因相关，用基因芯片的方法寻找一些在肝癌组织中特异性表达差异的基因，对肝癌的研究、诊断、防治将起积极的指导作用。本实验计划通过对肝癌基因表达谱的分析以及对其和正常肝组织的比较，发现差异表达基因，通过聚类分析将这些差异表达基因分成特定的基因簇，发现它们功能上的相关性，并对新基因进行了功能推测。这样的研究不仅可以推动肝癌发生的分子机理研究，还可以为进一步改进肝癌诊断和治疗预后方法提供新的标记基因。

实验结果表明，本发明的基因都是在至少50％以上的肝癌样本中发生显著上调表达的基因，其中包括两种新的人蛋白基因及另外二十种在诊断肝癌方面有新用途的人蛋白基因，这些基因及其编码的蛋白多肽可以用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物等用途，见下表所示：

分类	Symbol	Name	GeneBank号	Unigene号	Ratio值
						新基因(2个)
		PP0174B04			2.961
								PP1277E03			2.978
在诊断肝癌方面有新用途的基因(20个)

	FLJ12806	hypothetical proteinFLJ12806	NM_022831	Hs.512696	4.695
							C7orf28B	chromosome 7 openreading frame 28B	NM_198097	Hs.289112	2.868
	MGC54289	hypothetical proteinMGC54289	NM_178454	Hs.245537	2.852
							C9orf10	chromosome 9 openreading frame 10	NM_014612	Hs.446534	2.83
膜相关，信号转导，转移	ANXA2	annexin A2	NM_004039	Hs.462864	15.616
						膜相关，信号转导	CAP2	CAP，adenylatecyclase-associatedprotein，2	NM_006366	Hs.296341	4.5
激酶，信号转导	ADRBK2	adrenergic，beta，receptor kinase 2	NM_005160	Hs.445563	3.848
						细胞周期，有丝分裂	NUSAP1	nucleolar and spindleassociated protein l	NM_016359	Hs.279905	3.5
原癌基因，翻译起始因子，细胞生长维持	EIF3S6	eukaryotictranslationinitiation factor 3，subunit 6 48kDa	NM_001568	Hs.405590	3.385
						促凋亡	DAP3	death associatedprotein 3	NM_033657	Hs.270920	3.176
原癌基因，转录调节，细胞生长维持	BMI1	murine leukemia viral(bmi-1)oncogenehomolog	NM_005180	Hs.380403	2.748
						血小板.白细胞C激酶底物	PLEKHB2	Pleckstrin homologydomain containing，family B(evectins)member 2	NM_017958	Hs.307033	3.524
核酸结合，蛋白结合	ZBTB11	zinc finger and BTBdomain containing 11	NM_014415	Hs.301956	3.174

受体，信号转导	GABBR1	gamma-aminobutyricacid(GABA)Breceptor，1	NM_001470	Hs.167017	14.461
						膜相关，信号转导，转移	ANXA5	annexin A5	NM_001154	Hs.145741	7.353
膜相关，信号转导，转移	TM4SF1	Transmembrane 4superfamily member 1	NM_014220	Hs.351316	7.425
						酶，解毒，抗氧化	PON2	paraoxonase 2	NM_000305	Hs.165598	3.124
细胞粘连，转移	THBS2	thrombospondin 2	NM_003247	Hs.458354	2.908
						细胞周期	TPX2	microtubule-associated protein homolog(Xenopus laevis)	NM_012112	Hs.9329	6.5
受体，信号转导，端粒酶结合蛋白	TEBP	unactiveprogesteronereceptor，23kD	NM_006601	Hs.355693	2.904

本发明的一个目的是提供一类在肝癌组织中上调表达的人蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

本发明的另一个目的是提供含有编码这些多肽的多核苷酸的重组载体。

本发明的另一个目的是提供含有编码这些多肽的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供针对本发明的这些多肽的抗体。

本发明的另一个目的是提供了针对本发明的这些多肽的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。

本发明的另一个目的是提供诊断治疗与这些多肽异常相关的疾病的方法。

本发明的另一个目的是提供在肝癌组织中上调表达的另外二十种人蛋白及其编码序列在诊断肝癌方面的新用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的肝癌组织中上调表达的蛋白多肽，它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4；或其保守性变异多肽、或其生物活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组中的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码上述的在肝癌组织中上调表达的蛋白多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3的编码区序列或全长序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，特别是表达载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

本发明的第四方面，提供了制备在肝癌组织中上调表达的蛋白多肽的制备方法，该方法包括(a)在适合表达在肝癌组织中上调表达的蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出在肝癌组织中上调表达的蛋白多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的在肝癌组织中上调表达的蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的针对本发明的在肝癌组织中上调表达的蛋白多肽的抗体以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。

在本发明的第七方面，提供了一种筛选的模拟、激活、拮抗或抑制在肝癌组织中上调表达的蛋白活性的化合物的方法，其包括利用本发明的多肽。本发明还涉及用该方法获得的化合物。

在本发明的第八方面，提供了一种体外检测与在肝癌组织中上调表达的蛋白异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，包括检测生物样品中所述多肽或其编码多核苷酸序列中的突变，或者检测生物样品中本发明多肽的量或生物活性。

在本发明的第九方面，提供了本发明的多肽和/或多核苷酸在制备用于治疗癌症、发育性疾病或免疫性疾病或其它由于在肝癌组织中上调表达的蛋白表达异常所引起疾病的药物的用途。

在本发明的第十方面，提供了在肝癌组织中上调表达的另外二十种人蛋白及其编码序列用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物等的新用途(以前没有人报道过其在肝癌诊断方面的用途)。

本发明的其它方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：

“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。

蛋白质或多核苷酸“变异体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变异体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变异体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。

“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。

“生物活性”是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质。类似地，术语“免疫学活性”是指天然的、重组的或合成蛋白质及其片段在合适的动物或细胞中诱导特定免疫反应以及与特异性抗体结合的能力。

“激动剂”是指当与在肝癌组织中上调表达的蛋白结合时，一种可引起该蛋白质改变从而调节该蛋白质活性的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合在肝癌组织中上调表达的蛋白的分子。

“拮抗剂”或“抑制物”是指当与在肝癌组织中上调表达的蛋白结合时，一种可封闭或调节在肝癌组织中上调表达的蛋白的生物学活性或免疫学活性的分子。拮抗剂和抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合在肝癌组织中上调表达的蛋白的分子。

“调节”是指在肝癌组织中上调表达的蛋白的功能发生改变，包括蛋白质活性的升高或降低、结合特性的改变及在肝癌组织中上调表达的蛋白的任何其它生物学性质、功能或免疫性质的改变。

“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。

“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。

“相同性百分率”是指在两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同或相似的百分率。可用电子方法测定相同性百分率，如通过MEGALIGN程序(Lasergene softwarepackage，DNASTAR，Inc.，Madison Wis.)。MEGALIGN程序可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列(Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73：237-244)。Cluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇。然后将各簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率通过下式计算：

也可以通过Cluster法或用本领域周知的方法如Jotun Hein测定核酸序列之间的相同性百分率(Hein J.，(1990)Methods in emzumology 183：625-645)。

“相似性”是指氨基酸序列之间排列对比时相应位置氨基酸残基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的头部基团有相似亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。

“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。

“衍生物”是指HFP或编码其的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子。核酸衍生物可编码保留天然分子的主要生物学特性的多肽。

“抗体”是指完整的抗体分子及其片段，如Fa、F(ab’)₂及Fv，其能特异性结合在肝癌组织中具有表达差异的蛋白的抗原决定簇。

“人源化抗体”是指非抗原结合区域的氨基酸序列被替换变得与人抗体更为相似，但仍保留原始结合活性的抗体。

如本文所用，“分离的”是指物质从原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的在肝癌组织中具有表达差异的蛋白或多肽”是指在肝癌组织中上调表达的蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化在肝癌组织中上调表达的蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙稀酰胺凝胶上能产生单一的主带。在肝癌组织中上调表达的蛋白多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或是有重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括在肝癌组织中上调表达的人蛋白的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然在肝癌组织中上调表达的人蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(I)有一个或多个保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(II)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或者(III)成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或者(IV)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。通过本文的阐述，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。以PP0174B04蛋白(在本申请中，蛋白质的命名采用其克隆编号)为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽，但与SEQ IDNO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。以PP1277E03蛋白(在本申请中，蛋白质的命名采用其克隆编号)为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：4的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与以上述的序列杂交且两序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码在肝癌组织中上调表达的蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。

编码在肝癌组织中上调表达的蛋白的特异DNA片段序列也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。

上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时，DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时，DNA序列的直接化学合成是不可能的，选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。

可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定在肝癌组织中上调表达的蛋白的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。

在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2kb之内，较佳的为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

在第(4)种方法中，检测在肝癌组织中上调表达的蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)测定。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明蛋白的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的在肝癌组织中上调表达的蛋白多肽(Science，1984；224：1431)。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码在肝癌组织中上调表达的人蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码在肝癌组织中上调表达的人蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬茵体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

本领域的技术人员熟知的方法，能用于构建含在肝癌组织中上调表达的人蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使其转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子、选择性标记基因和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的基因都是在至少50％以上的肝癌样本中发生显著上调表达的基因，其中包括两种新的人蛋白基因及另外二十种在诊断肝癌方面有新用途的人蛋白基因，这些基因及其编码的蛋白多肽可以用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物等用途。

重组的在肝癌组织中上调表达的人蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物和用于筛选针对在肝癌组织中上调表达的蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。由于本发明的两种新的在肝癌组织中上调表达的人蛋白即PP0174B04，PP1277E03蛋白，以及另外二十种在肝癌组织中上调表达的人蛋白，在肝癌组织中的表达远高于其正常肝组织中的表达，因此本发明蛋白可作为肝癌检测中待检测对象。以PP0174B04蛋白为例，当抗PP0174B04的抗体检测样品时，如果发现PP0174B04蛋白的表达量高于阴性对照(正常肝组织样品)，那麽就表明受检测的样品中存在癌变。

本发明还提供了一种检测肝组织样品是否发生癌变的方法，它包括步骤：(1)用抗本发明蛋白(两种新的在肝癌组织中上调表达的人蛋白即PP0174B04，PP1277E03蛋白，以及另外二十种在肝癌组织中上调表达的人蛋白)的抗体与待检测样品接触，以形成抗原-抗体复合物；(2)检测该抗原-抗体复合物的存在与否，该复合物的存在表示该受检测的肝组织发生了癌变。将本发明方法与其他检测肝癌的方法相结合，可以更准确地检测肝癌。

本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)在肝癌组织中上调表达的人蛋白的药剂的方法。激动剂提高在肝癌组织中上调表达的人蛋白刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达在肝癌组织中上调表达的人蛋白的膜制剂与标记的在肝癌组织中上调表达的人蛋白一起培养，然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。

在肝癌组织中上调表达的人蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。在肝癌组织中上调表达的人蛋白的拮抗剂可以与在肝癌组织中上调表达的人蛋白结合并消除其功能，或是抑制在肝癌组织中上调表达的人蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。在肝癌组织中上调表达的人蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。

在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将在肝癌组织中上调表达的蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响在肝癌组织中上调表达的蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤和细胞异常增殖等。

本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射免疫动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。

可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物如TNF等结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。针对本发明蛋白的拮抗剂以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的有效成分的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

编码在肝癌组织中上调表达的人蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于在肝癌组织中上调表达的蛋白的无表达或异常/无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计用于表达变异的在肝癌组织中上调表达的蛋白，以抑制内源性的在肝癌组织中上调表达的蛋白活性。例如，一种变异的在肝癌组织中上调表达的蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的在肝癌组织中上调表达的蛋白，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗在肝癌组织中上调表达的蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将编码在肝癌组织中上调表达的蛋白基因转移至细胞内。构建携带所需蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组的本发明蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。

抑制在肝癌组织中上调表达的人蛋白mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。

本发明还提供了针对在肝癌组织中上调表达的人蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。

多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

制备单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison etal，PNAS，1985，81：6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗在肝癌组织中上调表达的人蛋白的单链抗体。

抗在肝癌组织中上调表达的入蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的在肝癌组织中上调表达的人蛋白。

与在肝癌组织中上调表达的人蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

抗体还可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如在肝癌组织中上调表达的人蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭在肝癌组织中上调表达的人蛋白阳性的细胞(如肝癌细胞)。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与在肝癌组织中上调表达的人蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断在肝癌组织中上调表达的人蛋白的产生或活性。

能与在肝癌组织中上调表达的人蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，一般应对在肝癌组织中上调表达的人蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测在肝癌组织中上调表达的人蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的在肝癌组织中上调表达的人蛋白水平，可以用作解释在肝癌组织中上调表达的人蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断在肝癌组织中上调表达的人蛋白起作用的疾病。

编码在肝癌组织中上调表达的蛋白的多聚核苷酸可用于与在肝癌组织中上调表达的蛋白相关疾病如肝癌的诊断和治疗。在诊断方面，编码在肝癌组织中上调表达的蛋白的多聚核苷酸可用于检测在肝癌组织中上调表达的蛋白的表达与否或在疾病状态下在肝癌组织中上调表达的蛋白的异常表达。如编码在肝癌组织中上调表达的蛋白的DNA序列可用于对活检标本进行杂交以判断在肝癌组织中上调表达的蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用在肝癌组织中上调表达的蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测在肝癌组织中上调表达的蛋白的转录产物。

检测在肝癌组织中上调表达的蛋白基因的突变也可用于诊断在肝癌组织中上调表达的蛋白相关的疾病。在肝癌组织中上调表达的蛋白突变的形式包括与正常野生型相比在肝癌组织中上调表达的蛋白DNA序列的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。

简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。

将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomes：a Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。

本发明的在肝癌组织中上调表达的蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得相关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出得片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了相关的序列，就可以用重组法来大批量地获得相关序列。这通常是将其克隆如载体，再转入细胞，然后通过常规方法从扩增后地宿主细胞中分离得到相关序列。

此外，还可用人工合成地方法来合成相关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长地片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)地DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

此外，由于本发明的在肝癌组织中上调表达的蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：在肝癌组织中上调表达的人蛋白的克隆

用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiagene公司产品)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBSK(+)载体(Clontech公司产品)的多克隆位点上，转化DH5α，细菌形成cDNA文库。用Dye terminate cycle reaction sequencingkit(Perkin-Elmer公司产品)和ABI 377自动测序仪(Perkin-Elmer公司)测定所有克隆的5′和3′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库(Genebank)进行比较，结果发现其中两个克隆PP0174B04，PP1277E03的cDNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入cDNA片段进行双向测定。结果表明，PP0174B04克隆所含的全长cDNA为2309bp(如Seq ID NO：1所示)，从第57bp至545bp有一个488bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个新的蛋白质(如Seq ID NO：2所示)，我们将此克隆命名为PP0174B04，编码的蛋白质命名为PP0174B04蛋白；PP1277E03克隆所含的全长cDNA为1396bp(如Seq ID NO：3所示)，从第140bp至514bp有一个374bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个新的蛋白质(如Seq ID NO：4所示)，我们将此克隆命名为PP1277E03，编码的蛋白质命名为PP1277E03蛋白。

实施例2：cDNA克隆的同源检索

将本发明的在肝癌组织中上调表达的两种新的人蛋白及其编码序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215：403-10]，在Genbank、Swissport等数据库进行同源检索。其蛋白质同源结果如下所示：

1.PP0174B04蛋白

  Blastp

Query＝PP0174B04(162个氨基酸)

＞gi|34532417|dbj|BAC86421.1|unnamed protein product[Homo sapiens]

  gi|46409598|ref|NP_997369.1|FLJ44076 protein[Homo sapiens]

           长度＝181

分值＝53.5bits(127)，预计值＝2e-06

相同性＝31/72(43％)，相似性＝34/72(47％)，缺口＝1/72(1％)

Query：65  TFHCKHLLATPAVAQAGPGVAHDTILEVTNCKLWWHLHGTNSAGTQNVRTVETCLPSPRP 124

           T  C   +  PAVAQ GPG A  T  E  N K WW  H     G Q+ R VE   P P

Sbjct：111 TAPCIPAILAPAVAQRGPGTAWATASEGANHKPWWFPHAVKPVGMQSAR-VEAWEPPPGF 169

Query：125 QRKAWTAWVPRQ 136

           QR    AW+ RQ

Sbjct：170 QRMCGKAWMSRQ 181

＞gi|1169123|sp|P42679|MATK_HUMAN Megakaryocyte-associated tyrosine-protein

kinase(Tyrosine-protein kinase CTK)(Protein kinase HYL)(Hematopoietic consensustyrosine-lacking kinase)

      长度＝507

分值＝31.2bits(69)，预计值＝1.1

相同性＝18/57(31％)，相似性＝24/57(42％)，缺口＝3/57(5％)

Query：98  WWHLHGTNSAGTQ---NVRTVETCLPSPRPQRKAWTAWVPRQRCITRVEPLRGSPGQ 151

           W   HG +SA      + R +    P P   R     W P  +CIT+ E  R  PG+

Sbjct：10  WRAFHGCDSAEELPRVSPRFLRAWHPPPVSARMPTRRWAPGTQCITKCEHTRPKPGE 66

2.PP1277E03蛋白

  Blastp

Query＝PP1277E03(124个氨基酸)

＞gi|29247279|gb|EAA38847.1|GLP_577_38920_45159[Giardia lamblia ATCC 50803]

          长度＝2079

分值＝33.1bits(74)，预计值＝1.9

相同性＝15/31(48％)，相似性＝20/31(64％)

Que ry：48  VYCRVLHKVRKLFFLYGSLPSSGVTLDVLKL 78

            +Y R+     +L +LY S  SSGVT DVL+L

Sbjct：1790 IYVRITTNTERLRYLYSSARSSGVTTDVLRL 1820

＞gi|46396887|sp|Q89AM9|SSRP_BUCBP SsrA-binding protein

            长度＝158

分值＝27.3bits(59)，预计值＝8.5

相同性＝18/59(30％)，相似性＝31/59(52％)，缺口＝1/59(1％)

Query：20  KNTQMYLPSFPQIDAFVVAFNVRYFECFVYCRVLHKVRKLFFLYGSLPSSGVTLDVLKL 78

           KN +MYL +  Q D    +     +EC    ++L + R++ +LY  L  S +T+ VL +

Sbjct：57  KNGEMYLVN-SQFDPISKSNLYITYECNRIKKILLRKREITYLYSKLYKSHLTIIVLSI 114

实施例3：用cDNA芯片进行肝细胞癌(HCC)表达谱研究

基因芯片或基因微矩阵(DNA Microarray)是目前许多国家实验室和大制药公司都在着手研制和开发的新技术，它是指将大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等载体上，然后用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。本发明的多核苷酸可作为靶DNA用于基因芯片技术用于高通量研究新基因功能；寻找和筛选组织特异性新基因特别是肿瘤等疾病相关新基因；疾病的诊断，如遗传性疾病。其具体方法步骤在文献中已有多种报道，如可参阅文献DeRisi，J.L.，Lyer，V.&Brown，P.O.(1997)Science 278：680-686.

及文献Helle，R.A.，Schema，M.，Chai，A.，Shalom，D.(1997)PNAS 94：2150-2155.

本实验将cDNA芯片应用于肝癌表达谱的研究，检测分析了70例肝癌和正常肝组织的差异表达。发现表达有差异的基因涉及细胞周期，解毒，凋亡，细胞骨架，代谢等多种功能的基因。我们的结果对肝癌的发生发展机制提供了大量的信息。其中，本发明的两种新的在肝癌组织中上调表达的人蛋白及其编码序列以及另外二十种在肝癌组织中上调表达的人蛋白及其编码序列在诊断肝癌方面有新用途，可以作为药物治疗的靶点和临床检测的重要标志。

(一)cDNA芯片制备

我们利用了博星公司提供的12800个点的cDNA芯片检测分析了70例肝癌和正常肝组织的差异表达。也就是说各种不同的cDNA共计12800条多核苷酸序列作为靶DNA，其中包括本发明的多核苷酸。所有基因克隆于pBluescript II质粒，用通用引物进行PCR扩增，纯化所得扩增产物后将其浓度调到500ng/ul左右，用Cartesian 7500点样仪(购自美国Cartesian公司)点于玻璃介质上，点与点之间的距离为280μm。将点样后的玻片进行玻片经水合(2h)、室温干燥(0.5h)、置于紫外交联仪中交联，洗脱后干燥使DNA固定在玻璃片上制备成芯片。其具体方法步骤在文献中已有多种报道，本实施例的点样后处理步骤是：

1.潮湿环境中水合4小时；

2.0.2％SDS洗涤1分钟；

3.ddH₂O洗涤两次，每次1分钟；

4.NaBH₄封闭5分钟；

5.95℃水中2分钟；

6.0.2％SDS洗涤1分钟；

7.ddH₂O冲洗两次；

8.凉干，25℃储存于暗处备用。

(二)探针制备

用一步法分别从正常肝与肝癌中抽提总mRNA，并用Oligotex mRNA Midi Kit(购自Qiagene公司)纯化mRNA，通过反转录分别将荧光试剂Cy3-dUTP(5-Amino-propargyl-2-deoxyuridine 5-triphate coupled to Cy3 fluorescentdye，购自Amersham Phamacia Biotech公司)标记正常肝组织的mRNA，用荧光试剂Cy5-dUTP(5-Amino-propargyl-2-deoxyuridine 5-triphate coupled to Cy5 fluorescentdye，购自Amersham Phamacia Biotech公司)标记肝癌组织mRNA，经纯化后制备出探针。

具体步骤参照及方法见：

Schena，M.，Shalon，D.，Heller，R.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：10614-10619.

及文献Schena，M.，Shalon，Dari.，Dayis，R.W.(1995)Science.270.(20)：467-480.

(三)杂交及洗涤

分别将来自以上两种组织的探针与芯片一起在UniHyb^TM Hybridization Solution(购自TeleChem公司)杂交液中进行杂交16小时，室温用洗涤液(1×SSC，0.2％SDS)洗涤。

a)预杂交：将含有0.5mg/ml鱼精DNA的杂交液在95℃水浴锅内变性2min，已点样的芯片也放入95℃水浴锅内变性30sec，然后将已变性的杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入在杂交箱内42℃预杂交6h。

b)杂交：将预杂交的玻片取出，置于95℃水浴中变性30sec。将加有杂交液的靶序列在95℃水浴中变性5min，取出后迅速置于冰上，然后加在芯片的点样区域上，用盖玻片Parafilm密封，置于杂交舱中，放入42℃杂交箱内杂交16～18h。

c)洗片：准备两个染色缸，分别装有0.1×SSC+0.2％SDS和0.1×SSC+0.2％TWEEN20，放入50℃水浴锅中。将杂交后的芯片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10min，用0.1×SSC冲洗玻片，室温晾干。

(四)芯片扫描及数据分析

芯片洗涤后用ScanArray 4000扫描仪(购自美国General Scanning公司)在相应波长进行扫描，扫描的图象用Genepix3.01软件分析荧光信号强度，进行数据分析处理，算出每个点的Ratio值，也就是Cy5/Cy3比值，该比值小于0.5大于2的点被认为是表达有差异的基因。Ratio值大于2的基因就是上调表达的基因，而Ratio值小于0.5的基因就是下调表达的基因。

结果表明，本发明的基因都是在至少50％以上的肝癌样本中发生显著上调表达的基因，其中包括两种新的人蛋白基因及另外二十种在诊断肝癌方面有新用途的人蛋白基因，这些基因及其编码的蛋白多肽可以用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物等用途，见下表所示：

分类	Symbol	Name	Ratio值
				新基因(2个)
		PP0174B04	2.961
						PP1277E03	2.978
在诊断肝癌方面有新用途的基因(20个)
					FLJ12806	hypothetical protein FLJ12806	4.695
	C7orf28B	chromosome 7 open reading frame 28B	2.868
					MGC54289	hypothetical protein MGC54289	2.852
	C9orf10	chromosome 9 open reading frame 10	2.83
					ANXA2	annexin A2	15.616

	CAP2	CAP，adenylate cyclase-associated protein，2	4.5
					ADRBK2	adrenergic，beta，receptor kinase 2	3.848
	NUSAP1	nucleolar and spindle associated protein 1	3.5
					EIF3S6	eukaryotic translation initiation factor 3，subunit 6 48kDa	3.385
	DAP3	death associated protein 3	3.176
					BMI1	murine leukemia viral (bmi-1)oncogene homolog	2.748
	PLEKHB2	Pleckstrin homology domain containing，family B(evectins)member 2	3.524
					ZBTB11	zinc finger and BTB domain containing 11	3.174
	GABBR1	gamma-aminobutyric acid(GABA)B receptor，1	14.461
					ANXA5	annexin A5	7.353
	TM4SF1	Transmembrane 4 superfamily member 1	7.425
					PON2	paraoxonase 2	3.124
	THBS2	thrombospondin 2	2.908
					TPX2	microtubule-associated protein homolog(Xenopus laevis)	6.5
	TEBP	unactive progesterone receptor，23kD	2.904

说

实施例4：用RT-PCR方法分析编码在肝癌组织中上调表达的人蛋白的基因的表达

用一步法分别从肝癌组织与正常肝组织中抽提总mRNA，用总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，具体方法是用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL)，反转录酶在42℃进行反转录反应，获得cDNA，用Qiagene的试剂盒纯化后，用本发明的在肝癌组织中上调表达的人蛋白基因的相应引物进行PCR扩增。

以本发明的两种新的在肝癌组织中上调表达的人蛋白基因为例，进行PCR扩增的引物如下表所示：

克隆名称	特异引物1(5’→3’)	特异引物2(5’→3’)
			PP0174B04	GGAAAACTTTGGGAGAGATTACTA(SEQ ID NO：5)	GATTTAAGCATTTATTAATACCAG(SEQ ID NO：6)
PP1277E03	GTAGAGATGGGGTTTCACCGTGTT(SEQ ID NO：7)	AACATAGGCCGAGCGGCCCGACAT(SEQ ID NO：8)

特异引物1分别为位于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的5’端的第1bp开始的正向序列；

特异引物2分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的中的3’端反向序列。

扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个循环：94℃30sec；55℃30sec；72℃2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用Qiagene公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3所示的序列完全相同。

结果表明，与cDNA芯片的实验结果一致，与正常肝组织相比较，本发明的两种新的人蛋白基因及另外二十种在诊断肝癌方面有新用途的人蛋白基因在肝癌组织中都发生了上调表达，这些基因及其编码的蛋白多肽可以用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物等用途。

实施例5：Northern印迹法分析在肝癌组织中上调表达的人蛋白基因的表达

用一步法提取总RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用α-³²P dATP通过随机引物法制备³²P-标记的DNA探针。所用的DNA探针分别为PCR扩增的在肝癌组织中上调表达的人蛋白编码区序列(PP0174B04为第57bp至545bp，PP1277E03为第140bp至514bp)。将³²P--标记的探针(约2×10⁶cpm/ml)与转移了RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH₂PO₄(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager进行分析和定量。

结果表明，与cDNA芯片和RT-PCR的实验结果一致，与正常肝组织相比较，本发明的两种新的人蛋白基因及另外二十种在诊断肝癌方面有新用途的人蛋白基因在肝癌组织中都发生了上调表达，这些基因及其编码的蛋白多肽可以用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物等用途。

实施例6：重组在肝癌组织中上调表达的人蛋白的体外表达、分离和纯化

分别根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的编码区序列，各设计出一对特异性扩增引物，序列如下表所示：

克隆名称	特异引物3(5’→3’)	特异引物4(5’→3’)
			PP0174B04	CCCCATATGACTGCTATAAGGGAGCCAG(SEQ ID NO：9)	GTCCCTTAAGTTCCAGGATCTTAG(SEQ ID NO：10)
PP1277E03	TCCCCATATGAAATCTACTTTAAAAATACTG(SEQ ID NO：11)	CCCGAATTCCCATAGTTATCCCACAAGAAC(SEQ ID NO：12)

此两段引物的5’端分别含有NdeI和EcoRI酶切位点，其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，NdeI和EcoRI酶切位点相应于表达载体质粒pET-28b(+)(Novagen公司产品，Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。分别以含有全长目的基因的pBS-PP0174B04和pBS-PP1277E03质粒为模板，进行PCR反应。PCR反应条件为：总体积50μl中含pBS-PP0174B04和pBS-PP1277E03质粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分别为10pmol、Advantage polymeraseMix(Clontech公司产品)1μl。循环参数：94℃20s，60℃30s，68℃2min，共25个循环。用NdeI和EcoRI分别对扩增产物和质粒pET-28(+)进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pET-0063g07)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌BL21(pET-0063g07)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind QuickCartridge(Novagen公司产品)进行层析，得到了纯化的目的蛋白在肝癌组织中上调表达的人蛋白。经SDS-PAGE电泳，分别在17820Da和13640Da处得到一单一的条带。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与SEQ ID NO：2和SEQID NO：4所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。

实施例7：抗在肝癌组织中上调表达的人蛋白抗体的产生

用多肽合成仪(PE公司产品)分别合成下述在肝癌组织中上调表达的人蛋白特异性的多肽：

PP0174B04蛋白多肽：

NH2-Met-Thr-Ala-Ile-Arg-Glu-Pro-Asp-Ile-His-Gln-Asp-His-Gly-Gly-COOH(SEQ ID NO：13)

PP1277E03蛋白多肽：

NH2-Met-Lys-Ser-Thr-Leu-Lys-Ile-Leu-Cys-Ile-Ile-Ile-Ile-Ile-His-COOH(SEQ ID NO：14)

将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，方法参见：Avrameas，et al.Immunochemistry，1969；6：43。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与在肝癌组织中上调表达的人蛋白结合。

实施例8：免疫组化

免疫组化试剂盒购自博士德生物工程有限公司，标本均经3.33mol/L(10％)中性福尔马林固定，石蜡包埋。连续组织切片厚4μm，分别进行免疫组化染色。免疫组化步骤：脱蜡至水后加枸橼酸缓冲液10mmol/L(pH6.0)95℃10min，正常羊血清封闭15min，加入一抗(浓度均为1∶100)，室温孵育4h，加生物素-SP标记二抗，室温孵育30min。DAB显色，苏木素复染封片。上述各步骤间均用PBS洗涤3次，每次5min。用已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。结果判断采用双盲法判读，阳性反应为细胞内出现棕黄色颗粒。统计学计数资料用x²检验，计量资料用t检验。

结果表明，与正常肝组织相比较，本发明的两种新的人蛋白及另外二十种在诊断肝癌方面有新用途的人蛋白在肝癌组织中都发生了上调表达，这些蛋白及其编码序列可以用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物等用途。

实施例9：组织芯片

组织芯片又称组织微阵列(tissuemicroarray，TMA)，系将大量组织高密度地固定于载玻片上，然后用其进行免疫组化、原位杂交或其它分子病理检测技术操作，以研究、比较靶标成分(如待测基因或其表达产物，或其它病理学改变)在不同标本之间的差异情况，它可在一张切片上高通量获取组织学、基因和蛋白的表达信息。其制备步骤如下：将目标蜡块放在39～42℃水浴中软化3min，然后从组织块选定部位逐个取出0.6mm组织柱，随即推入空白阵列模块中，排布成组织芯片；最后将制成的组织芯片面向下放在玻片上，37℃放置30min。取出轻压玻片，使组织柱在模块中排平。一般一张TMA可排列600个0.6mm组织柱，切片厚度2～3μm，一般可切片50～100张。同大体组织标本一样，TMA可应用于HE染色、免疫组化、原位杂交，甚至组织显微切割分析。由于具有高通量及规则排列易于自动化分析等特点，同一套TMA可迅速对上百种生物分子标记物(抗原、DNA、RNA等)进行分析。因此TMA在分子标记物预后价值的判断及分子蛋白信息向临床应用转换研究中具有重大意义。

TMA和DNA芯片联合应用，组织芯片与基因芯片联合使用在寻找和确定致病基因方面有很好的互补作用。基因芯片可对成千上万的基因进行高通量检测，但无法将已筛选出的相关基因中的原发和继发改变基因区分开来。因此，基因芯片筛选的候补肿瘤基因必须通过大量的实际病例来检验，而这正是组织芯片的优势所在。首先，将基因芯片筛选的基因做成探针，用探针与组织芯片中众多肿瘤组织进行荧光原位杂交，然后找出与肿瘤相关的基因。

我们的实验方法是采集同一肝癌患者的肝脏病理组织，按照肝癌肿瘤组织/正常肝组织的顺序排列成两个一组，70例患者共140个组织标本依点阵方式制成组织芯片，其详细制作方法见上面所述。用于检测在肝癌组织中上调表达的人蛋白的免疫组织化学技术为链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合物(SP)法，单克隆抗体工作浓度为1∶10，抗原修复方法为高压蒸汽法(121℃、1.2个大气压10min)，SP试剂盒为DAKO公司产品。以已知在肝癌组织中上调表达的人蛋白阳性切片作为阳性对照，以PBS液、小鼠阴性血清代替一抗作为空白及阴性对照。结果判定在肝癌组织中上调表达的人蛋白阳性染色呈棕黄色，每个组织点位随机选择5个高倍视野(×400)观测组织细胞蛋白表达，细胞中出现棕黄色物质判为阳性，未见阳性着色细胞为阴性，阳性着色细胞数＜30％为(+)，30％～60％为(++)，弥漫着色为(+++)。统计学处理SPSS(Ver10.0)统计软件包，x2检验。

结果表明，与正常肝组织相比较，本发明的两种新的人蛋白及另外二十种在诊断肝癌方面有新用途的人蛋白在肝癌组织中都发生了上调表达，这些蛋白及其编码序列可以用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物等用途。

                    SEQUENCE LISTING

<110>上海博星基因芯片有限责任公司

<120>肝癌中上调表达的两种新的人蛋白及其编码序列和另外二十种人蛋白在肝癌诊断中的新用途

<130>1

<160>14

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2309

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

ggaaaacttt gggagagatt actaagcgtg tgggccaagt gctgtttgct aaagagatga      60

ctgctataag ggagccagat attcatcaag atcatggggg aaaagactca aaggtatttc     120

agagatcttt gaggcttccc cttctaccac agtcccagag ctctaggagg gaaggatgtt     180

tctggaggca gacctgggac atcttccaca ggctcactct tcagagctgc cttgggcccc     240

tgctccccac atttcattgc aagcacctct tggccacccc agctgtggct caagcaggcc     300

caggtgtggc tcatgatacc attctggagg ttacaaactg taaactttgg tggcatctac     360

atggtactaa ttctgcaggt acacagaatg taagaactgt ggagacatgt cttccttcac     420

caagacctca aaggaaggca tggacagcct gggtgcccag gcagagatgt atcaccaggg     480

tggagccact cagaggctca ccagggcagt gcctagtgga gctgtggaag tggggccacc     540

cctaagatcc tggaacttta gggacaccag tctgcaactc cagcccaaga gaactgaagc     600

atggactgag ccctgcaaag ccataggaac agacctgccc aaggttttgg gggcccaacc     660

cctcaccccc aacaagttat aagctgtgtc cagcatacag gacatggagt caaaggagat     720

tattctctgg ttttaagatt taatgctgtt tttactgttg agttttgaac ttaggaccag     780

ttaccccttt ctttttgctt atatctctat tttggaatgg gaatgtctat cctgtgtctg     840

tcccactatt gtgttttgga agtagataac ttgttttgat ttcacaaact tagagctgga     900

gggagtttgc cccaggtgaa tcaggccttg agtctcaacc atatctgatt tagatgagac     960

ttcagacttt tgagttgatg ctggaacaag ttaagactct gaggctattg ggatgtaatc    1020

actgtatttt acattgtgaa gacataaatt ttgggggttg gggaaaaatg ctacagtttg    1080

tatgtatgcc ccagaagttc atatgttgaa aacaattaat cttcgatgta acagtattag    1140

gaatggggct tttaagaggt gattaagaca tgagggctct tcccttatga atggatgaat    1200

gcttttatca tggaagtggg ttagttacag tgagagtgtg caaaatacat tgaaatacat    1260

tgagcatttc acaggagagt aaatatacac agccaaaaaa ctgaaggaac aagtgaagag    1320

gtgttcaaca ttgttagtga ttagggaaat gcaaagcaag accacaatga tactttatgt    1380

ccattagatt ggtaaaaata aaaatcaaat gttaaagaag atgtaggtct actggatttt    1440

taatgttaat aggaatgtag attgatggaa tcattttgaa aaatagtttg atattatctc    1500

caaaacttca agtctagcag ttttacacct aaacatatac acaatagtaa ttgatgcata    1560

catacaactg gggacataca caagaatgtt tattgtagca ccattcacaa tagcaaaatc    1620

ttgaaacaac cataatgccc accaacaaga tgaataaatt atgatatatt tacataatga    1680

aatattcagc agtcaaaatt aatgaactac atcaatatac agtactatgg gtgactccca    1740

ttaataaaag tgaaaaaagt tacatcctaa aaggttacaa atagcatacc atttttgtaa    1800

tttgttttaa acataaaatt tttcaggact ataagtacaa aaagaggatg aacatgggat    1860

ttcaaatgat ggttatttgg ggtggatgaa aatgcataaa tttcattgca gaaatattaa    1920

tttatttgat tactaatata tgtattatgt attaatgtat ttttattaga cacccactga    1980

gcatgtaatg tattatatgt attgcctact aaactccaaa atattactaa tttcaaacta    2040

catctggata cagtggtttc agttaagagc ttgtgaatct gtagaggcct ggaatgaaag    2100

gcagaaatgg agatatattt tgaagataaa atggaggaga cttgcagata aacttgattt    2160

gggggtgaag aagagggaag gatcgaggat gactgctagg ttagctgggc taaaggtagt    2220

gtcctttctt gaaatgggga atgggaatgt ggactacata ggtttgggag ggtaatcaca    2280

ttgatctggt attaataaat gcttaaatc                                      2309

<210>2

<211>162

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Thr Ala Ile Arg Glu Pro Asp Ile His Gln Asp His Gly Gly Lys

1               5                   10                  15

Asp Ser Lys Val Phe Gln Arg Ser Leu Arg Leu Pro Leu Leu Pro Gln

            20                  25                  30

Ser Gln Ser Ser Arg Arg Glu Gly Cys Phe Trp Arg Gln Thr Trp Asp

        35                  40                  45

Ile Phe His Arg Leu Thr Leu Gln Ser Cys Leu Gly Pro Leu Leu Pro

    50                  55                  60

Thr Phe His Cys Lys His Leu Leu Ala Thr Pro Ala Val Ala Gln Ala

65                  70                  75                  80

Gly Pro Gly Val Ala His Asp Thr Ile Leu Glu Val Thr Asn Cys Lys

                85                  90                  95

Leu Trp Trp His Leu His Gly Thr Asn Ser Ala Gly Thr Gln Asn Val

            100                 105                 110

Arg Thr Val Glu Thr Cys Leu Pro Ser Pro Arg Pro Gln Arg Lys Ala

        115                 120                 125

Trp Thr Ala Trp Val Pro Arg Gln Arg Cys Ile Thr Arg Val Glu Pro

    130                 135                 140

Leu Arg Gly Ser Pro Gly Gln Cys Leu Val Glu Leu Trp Lys Trp Gly

145                 150                 155                 160

His pro

<210>3

<211>1396

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

gtagagatgg ggtttcaccg tgttggccag gctggtctcg aactcctgac ctcgtgatcc      60

acctgcctcg gcctcctaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccactgtg cctggcttaa     120

atctgaaact tttctaaaca tgaaatctac tttaaaaata ctgtgcatca tcatcatcat     180

ccacttgctg tggtctaaaa atactcagat gtatctacct tctttccccc aaatcgatgc     240

ctttgttgtt gctttcaatg tacgttattt tgaatgcttt gtatactgta gagtgctcca     300

caaagtcagg aagctctttt tcttgtatgg ctcactgccc tcttcaggtg ttacgctgga     360

tgttctcaag ttatctctgg tcttgtcagg ctttactcct ccttcctgtc ctgaggcaca     420

ggcttgcact ccctctttct ctacctctgt gtttgctcac actcttgctc tctatcctgc     480

tgctctacct tctctttctg ttcttgtggg ataactatgg gaataaaatt cagatttatt     540

ttcctaattc tcttctgaaa attttgaact ggggaatatt gatgtcttct atttctatct     600

tctaacttta caaaataagg atattctcca gattcacaag gaatgtgtat gagcactaag     660

agaatgcatt tggaaccctt taggcaatgg aagaggaagg accagaaatt cagcaaaatc     720

aatagctgag ttcttacaga gaaagagagg cagggaacat tatgtctcta tctatgatga     780

gaggcatgtt tttctactct ctaggaaatg acttcctgca aatgatggcc agataaatca     840

gaggtcatgg tccgtggaat tgctattttt ctcagttgac aatgtgtaga cgacagggtt     900

tataaccagt actacttctc atgccatttg ctctgatttt ataacagcga cttcagctcc     960

aattgtggac ctgattgcaa gatagtctta aattctcaaa aggagctaga accctggaat    1020

gtatgtaaat tttttaaatt tatttttaaa acctgaatgc caaaaagtat ttgaatgaaa    1080

gagtcaatca gtccaaaaac aattgcgtac ctctctggaa ggtctagtga aagggaaagg    1140

gaagagagaa ggaagaaagg agaatgggga aaaaaaactt ttcttccttt tacatatcca    1200

gctgtaatga gttcagaatg caatattgtg ccagtgggtt acagtgtgtt tcataaaagg    1260

ccttcaattc atgttagttg agtgaataaa taaagagata cattgaaaac aattttaagg    1320

tcttttgtag gagtgattag caaacattta taaatacaaa aaaaaaaaaa acatgtcggg    1380

ccgctcggcc tatgtt                                                    1396

<210>4

<211>124

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Met Lys Ser Thr Leu Lys Ile Leu Cys Ile Ile Ile Ile Ile His Leu

1               5                   10                  15

Leu Trp Ser Lys Asn Thr Gln Met Tyr Leu Pro Ser Phe Pro Gln Ile

            20                  25                  30

Asp Ala Phe Val Val Ala Phe Asn Val Arg Tyr Phe Glu Cys Phe Val

        35                  40                  45

Tyr Cys Arg Val Leu His Lys Val Arg Lys Leu Phe Phe Leu Tyr Gly

    50                  55                  60

Ser Leu Pro Ser Ser Gly Val Thr Leu Asp Val Leu Lys Leu Ser Leu

65                  70                  75                  80

Val Leu Ser Gly Phe Thr Pro Pro Ser Cys Pro Glu Ala Gln Ala Cys

                85                  90                  95

Thr Pro Ser Phe Ser Thr Ser Val Phe Ala His Thr Leu Ala Leu Tyr

            100                 105                 110

Pro Ala Ala Leu Pro Ser Leu Ser Val Leu Val Gly

        115                 120

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>5

ggaaaacttt gggagagatt acta                                             24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>6

gatttaagca tttattaata ccag                                             24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sAPiens

<400>7

gtagagatgg ggtttcaccg tgtt                                             24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>8

aacataggcc gagcggcccg acat                                             24

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>9

ccccatatga ctgctataag ggagccag                                         28

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>10

gtcccttaag ttccaggatc ttag                                             24

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>11

tccccatatg aaatctactt taaaaatact g                                     31

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>12

cccgaattcc catagttatc ccacaagaac                                       30

<210>13

<211>15

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>13

Met Thr Ala Ile Arg Glu Pro Asp Ile His Gln Asp His Gly Gly

1               5                   10                  15

<210>14

<211>15

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>14

Met Lys Ser Thr Leu Lys Ile Leu Cys Ile Ile Ile Ile Ile His

1               5                   10                  15

Claims (13)

1、一种分离的在肝癌组织中上调表达的人蛋白，其特征在于，它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

2、如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4。

3、一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组中的一种核苷酸序列有至少85％相同性：

(a)编码如权利要求1和2所述的多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4、如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4。

5、如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组：SEQID NO：1、SEQ ID NO：3的编码区序列或全长序列，也就是SEQ ID NO：1中57-545位的序列或1-2309位的序列，以及SEQ ID NO：3中140-514位的序列或1-1396位的序列。

6、一种含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于，它是由权利要求3-5中的任一权利要求所述多核苷酸与质粒、病毒或运载体表达载体构建而成的重组载体。

7、一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，其特征在于，它是选自于下列一种宿主细胞：

(a)用权利要求6所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用权利要求3-5中的任一权利要求所述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

8、一种在肝癌组织中上调表达的人蛋白多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达在肝癌组织中上调表达的人蛋白的条件下，培养权利要求7所述的工程化宿主细胞；

(b)从培养物中分离出在肝癌组织中上调表达的人蛋白多肽。

9、一种能与权利要求1所述的在肝癌组织中上调表达的人蛋白特异性结合的抗体。

10、一种核酸分子，它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。

11、如权利要求1-2中的任一权利要求所述多肽的应用，其特征在于，它应用于筛选在肝癌组织中上调表达的人蛋白的模拟物、激动剂，拮抗剂或抑制剂；或者用于肽指纹图谱鉴定；或者用于作为肝癌诊断的肿瘤标志物。

12、如权利要求3-5中的任一权利要求所述的核酸分子的应用，其特征在于，它作为引物用于核酸扩增反应，或者用于制造基因芯片或微阵列；或者用于作为肝癌诊断的肿瘤标志物。

13、在肝癌组织中上调表达的另外二十种人蛋白及其编码序列在诊断肝癌方面的新用途，其特征在于，它用于肝癌的检测，作为肝癌诊断的肿瘤标志物。