CN1241941C

CN1241941C - 一种促进神经分化和抗细胞凋亡的蛋白质及其编码基因

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Publication number: CN1241941C
Application number: CNB200310108795XA
Authority: CN
Inventors: 周嘉伟; 李志华; 王冰薇
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2006-02-15
Anticipated expiration: 2023-11-21
Also published as: CN1544465A

Abstract

本发明提供了一种新的促神经分化和抗细胞凋亡的蛋白质-GRAL蛋白以及编码GRAL蛋白的多核苷酸。本发明还公开了GRAL蛋白及其多核苷酸的制法和用途。本发明还公开了此GRAL蛋白用于治疗神经退行性疾病的方法。本发明还提供了含GRAL蛋白的药物组合物。

Description

一种促进神经分化和抗细胞凋亡的蛋白质及其编码基因

技术领域

本发明涉及生物工程和医学领域。更具体地，本发明涉及神经营养因子——GRAL基因的两种剪接异构体A、B及其编码序列和它们的应用。

背景技术

在神经系统发育过程中，神经元的存活和分化在一定程度上依赖于靶细胞的存在，通过其轴突与对应的靶细胞之间形成突触联系获得多种神经营养因子的支持，如果没有突触后靶细胞的存在，发育神经元的轴突和树突将萎缩，神经元也将死亡。神经元和其靶细胞的这种依存关系称为神经营养作用。从20世纪初就开始的长期研究不断证明了神经元对其靶细胞的这种依赖作用。20世纪50年代初美国华盛顿大学的Levi-Montalcini和Hamburger发现了第一个具有神经营养作用的蛋白质-神经生长因子(nerve growth factor，NGF)。从那时开始，特别是在最近十几年，相当数量的神经营养因子被发现，它们分属于不同的蛋白家族，有着不同的作用机制和功效，而且来源也不限于神经突起指向的靶细胞。更重要的是，这些神经营养因子具有一定的特异性，即只对一种或几种类型的神经元群体起保护作用，因此对神经系统疾病特别是神经退行性疾病的治疗有很大的临床应用潜力。

胶质细胞源性的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是近年发现的一种重要的神经营养因子(Lin，L.-F.H.，Doherty，D.H.，Lile，J.D.，Bektesh，S.，Collins，F.GDNF：a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.1993Science 260：1130-1132)。目前该家族包括4个成员，即GDNF，Neurturin，Persephin和Artemin。它们对胚胎中脑的多巴胺能神经元有明显的促存活作用，增加胞体体积和突起长度，提高神经元对多巴胺的重摄取率，并且能促进神经毒素损伤后的恢复。在6-羟基多巴胺或者1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)损伤的大鼠模型中，损伤后注射GDNF能显著减少黑质多巴胺能神经元的死亡(Hou，J.G.，Lin，L.F.，Mytilineou，C.，Glial cell line-derived neurotrophicfactor exerts neurotrophic effects on dopaminergic neurons in vitro and promotes their survival andregrowth after damage by 1-methyl-4-phenylpyridinium.1996，J.Neurochem.66：74-82)。已知帕金森病的特异损伤脑区是腹侧中脑黑质致密部的多巴胺能神经元，不论在培养的胚胎腹侧中脑细胞中还是在帕金森氏病动物模型上，GDNF都显示了对该脑区多巴胺能神经元的保护作用，但对其它中枢神经元则几乎没有保护作用，因此这种保护作用具有相对较高的特异性，这些结果提示了GDNF对帕金森病临床治疗中的良好应用前景。目前，在美国GDNF已进入临床前期试验阶段。此外，GDNF对运动神经元的促存活作用也提示它在脊髓侧束硬化症和肌营养不良等神经疾病的临床应用价值(Henderson，C.E.，Phillips，H.S.，Pollock，R.A.，Davies，A.M.，Lemeulle，C.，Armanini，M.，Simpson，L.C.，Moffet，B.，Vandlen，R.A.，Koliatsos，V.E.，Rosenthal，A.，GDNF：a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle，1994Science 266：1062-1064)。神经营养因子的这些特性和作用进一步激发了人们研究和开发治疗中枢神经系统退行性疾病神经营养因子类药物的兴趣。

目前已知神经(生长)营养因子(如GDNF)一般通过与相应受体的结合来激活相关的细胞内信号转导通路，从而发挥促进细胞存活的功能。现有的研究表明，GDNF家族的信号传导通路是通过酪氨酸激酶受体Ret来传导信号的。GDNF家族的神经营养因子首先与一种特殊的蛋白GDNF receptorα(GFRα)结合，然后再与Ret结合激活下游通路。GFRα在胞外通过GPI锚定在细胞膜上，当GDNF家族的配体与之结合以后形成的复合物就能与跨膜的Ret结合(Jing，S.，Wen，D.，Yu，Y.，Holst，P.L.，Luo，Y.，Fang，M.，Tamir，R.，Antonio，L.，Hu，Z.，Cupples，R.，Louis，J.C.，Hu，S.，Altrock，B.W.，Fox，G.M.GDNF-induced activation of the Retprotein tyrosine kinase is mediated by GDNFR-alpha，a novel receptor for GDNF.1996，Cell 85：1113-1124)。现在已经发现了四种不同GFRα，它们分别与GDNF家族的四个配体结合，即GDNF-GFRα1，neurturin-GFRα2，artemin-GFRα3，persephin-GFRα4。当然，它们也并非绝对的一对一的关系，例如GDNF能与GFRα2结合，neurturin和artemin也可与GFRα1结合(Airaksinen，M.S.，Saarma，M.，The GDNF family：signaling，biological functions and therapeuticvalue.2002，Nature Rev.Neurosci.3：383-394)。但目前没有资料表明，已经发现的这四种不同GFRα受体能独立行使促进神经细胞生长的作用。

对各种神经退行性疾病现在还没有很好的治疗方法，现在采用的一些治疗手段，多为对症治疗或替代疗法，如给帕金森病患者服用左旋多巴等，但不能从根本上扭转黑质多巴胺神经元丢失，长期使用还会导致比较显著的副作用。而神经营养因子由于对特定的神经元有保护作用，已成为下一代治疗神经退行性疾病重要候选药物的一部分。越来越多的神经营养因子逐渐进入临床前试验，在帕金森病、脊髓侧束硬化症等疾病的治疗中显示了良好的应用前景。

如前所述，神经营养因子的作用依赖于靶细胞受体的存在和状态，但在神经退行性疾病的状况下，已遭损害或部分损害的神经细胞(即靶细胞，如多巴胺能神经元)状态低下，它们所表达的神经营养因子受体也不可避免地在数量上和对配体的反应性(如结合能力等)等方面受到负面影响，因此，神经营养因子本身的有效性可能会显著下降，而通过适当的方法(如基因治疗)使这些靶细胞表达具有自激活特性的跨膜蛋白基因(或使其表达水平提高)，自主而持续地激活与细胞分化、抗凋亡相关的细胞内信号转导通路，将有助于摆脱对外源性神经营养因子的依赖，从而达到持久的神经保护的目的，这将会为发展神经退行性疾病的治疗方法提供全新的思路和途径。

因此，本领域迫切需要开发新的神经营养因子及其编码序列。

发明内容

本发明的目的是提供促进靶细胞和/或神经细胞存活的多核苷酸和蛋白。

本发明的另一目的是用这些蛋白和多核苷酸筛选调节这些蛋白或多核苷酸表达或功能的化合物。

本发明进一步的目的是用这些化合物调节或与所述的蛋白及多核苷酸相互作用，以治疗神经系统疾病，尤其是神经退行性疾病。

本发明的进一步目的是提供治疗神经系统疾病，尤其是神经退行性疾病的药物组合物。

本发明的第一方面，提供了一种分离的GRAL蛋白，所述GRAL蛋白含有选自下述的氨基酸序列：

(a)含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4氨基酸序列；

(b)蛋白(a)的保守性变异蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物；

(c)将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有自激活特性的由(a)衍生的蛋白；

(d)具有促进神经细胞分化和/或存活的功能，与蛋白(a)的序列具有50％，70％，80％，90％或95％同源性的氨基酸序列。

优选的，所述GRAL蛋白具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1、2或3所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

较佳的，所述多核苷酸编码含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白。

更佳的，所述多核苷酸的序列选自下组：

(a)含有SEQ ID NO：1中239-1420位的序列；

(b)含有SEQ ID NO：1中1-2123位的序列；

(c)含有SEQ ID NO：3中239-955位的序列；

(d)含有SEQ ID NO：3中1-1872位的序列。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有上述多核苷酸。

本发明的第四方面，提供了一种，所述宿主细胞含有上述多核苷酸。较佳的，所述哺乳动物细胞。更佳的，所述宿主细胞为小鼠、大鼠或人的细胞。

本发明的第五方面，提供了一种具有GRAL蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达GRAL蛋白的条件下，培养上述宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有GRAL蛋白活性的多肽。

本发明的第六方面，提供了一种能与上述GRAL蛋白特异性结合的抗体。

本发明的第七方面，提供了一种组合物，所述组合物含有安全有效量的上述GRAL蛋白、或上述多核苷酸，以及药学上可接受的载体。

本发明的第八方面，提供了一种保健品，所述保健品含有上述GRAL蛋白、或上述多核苷酸。

本发明的第九方面，提供了一种筛选促进或抑制神经细胞分化和/或存活的化合物的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)将GRAL基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备表达GRAL蛋白的细胞株；

(b)向步骤(a)中的表达GRAL蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测GRAL蛋白表达量的变化；促进GRAL蛋白表达量增加的化合物就是促进神经细胞分化和/或存活的化合物，抑制GRAL蛋白表达量增加的化合物就是抑制神经细胞分化和/或存活的化合物。

本发明的第十方面，提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括上述GRAL蛋白、或上述多核苷酸。所述检测试剂盒用于检测神经系统疾病，如神经退行性疾病。

本发明的第十一方面，提供了上述组合物在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

本发明的第十二方面，提供了上述GRAL蛋白、或上述多核苷酸在抗细胞凋亡中的应用。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1：小鼠GRAL的cDNA及氨基酸序列：

A：GRAL剪接异构体A的cDNA序列；

B：GRAL剪接异构体A的氨基酸序列；

C：GRAL剪接异构体B的cDNA序列；

D：GRAL剪接异构体B的氨基酸序列。

图2：小鼠GRAL基因与已知小鼠GDNF receptor α受体的氨基酸序列比较：

m1～m4：小鼠GDNF receptor α1～α4。

ma&mb：小鼠GRAL基因剪接异构体A&B。

黑色方框表示在所有基因中都保守的氨基酸残基，灰色方框表示在其中5个基因中保守的氨基酸残基。GRAL基因与已知的小鼠GDNFα1，α2，α3，α4在氨基酸水平的同源性分别为37％，39％，40％和35％。

图3：用RT-PCR方法检测GRAL基因在成年小鼠各器官和组织中的分布：

A：GRAL基因主要在中枢神经系统中表达，但在主要的外周器官和组织中缺如。

B：GRAL基因在中枢神经系统不同区域的丰度也不同。β-肌动蛋白为内参照，表明各受试组织的模板量近似均等。

图4：小鼠GRAL基因定位在细胞膜上：

A：带FLAG抗原表位的GRAL基因表达质粒(FLAG-GRAL)被转染于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)后，用抗FLAG抗体作免疫荧光染色，经激光共聚焦显微镜扫描后，可观察到荧光信号(即Flag-GRAL基因表达产物主要集中在细胞膜上)；

B：利用上述同样方法，将FLAG-GRAL基因转染PC12细胞，以抗FLAG抗体作免疫荧光染色。荧光信号也同样集中在细胞膜上；

C：FLAG-GRAL转染CHO细胞后用抗FLAG抗体作免疫印迹，在约45kDa处显示该基因产物的条带。泳道1：转染空载体作为对照。泳道2：转染FLAG-GRAL。

图5：稳定转染小鼠GRAL基因的PC12细胞表现出自发分化现象：

A：转染空载体的PC12细胞。

B、C、D：稳定表达GRAL基因的PC12细胞10号克隆、11号克隆、18号克隆。图中箭头示意部分较长的突起。

E：显示转染空载体的PC12细胞和10号、11号、18号细胞克隆中，拥有不少于一倍胞体长的突起的细胞占总细胞数的比例。

图6：PC12细胞转染GRAL基因两周后的形态学变化：

A：转染了GRAL基因的PC12细胞。

B：转染空载体即pcDNA3.1的PC12细胞。

C：以拥有一倍胞体长的突起为分化指标，以上两种细胞分化比例的统计图示。

图7：加入GDNF家族配体后，稳定转染GRAL基因的PC12细胞分化比例无明显改变：

纵坐标为拥有一倍胞体长的细胞在总细胞中的百分比。C表示未加任何配体刺激，GDNF、NTN(neurturin)、PSP(persephin)、ART(artemin)为四种已知的GDNF家族配体，加入的配体浓度均为100纳克/毫升。

图8：过表达GRAL基因增强细胞抗凋亡的作用：

稳定转染GRAL基因的PC12细胞(18号克隆)比对照PC12细胞更能抵抗血清饥饿。从培养基中撤除胎牛血清两天或四天后，分别用台盼蓝染色法和荧光素二乙酸酯染色法对PC12细胞进行染色，计数存活细胞占总细胞数的百分比。

具体实施方式

发明人克隆了一个与GFRα有一定同源性的新基因，发明人命名为glial cell line-derivedneurotrophic factor receptor α-like gene(简称GRAL基因)，其氨基酸序列与胶质细胞源性神经营养因子α受体有一定相似性。该基因有两种剪接形式，剪接异构体A(GRAL A，为全长基因，SEQ NO：1)编码一种跨膜蛋白(GRALA蛋白或GRAL蛋白，SEQ NO：2，本发明中通常用GRAL基因表示它的编码序列)，而剪接异构体B(GRAL B，SEQ NO：3)则编码一种分泌蛋白(GRALB蛋白，SEQ NO：4)。

如本文所用，术语“GRAL蛋白”和“GRAL多肽”可互换使用，指在哺乳动物的中枢神经系统中特异性表达的、氨基酸序列与人、大鼠或小鼠的GRAL氨基酸序列有50％以上，或者60％以上，较佳地70％-80％以上，更佳地90％，最佳地95％以上同源性的多肽。此外，GRAL的活性片段、保守性多肽、或活性衍生物也可用于本发明。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的GRAL蛋白或多肽”是指GRAL多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GRAL蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的条带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人GRAL蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然小鼠GRAL蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“GRAL多肽”指具有小鼠GRAL蛋白活性的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4序列的多肽。该术语还包括具有与GRAL蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-60个，较佳地1-50个，更佳地1-30个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GRAL蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与GRAL基因杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GRAL多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GRAL多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GRAL多肽的可溶性片段(如具有SEQ NO：4序列的GRAL B具有较高的可溶性)。通常，该片段具有GRAL多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供GRAL蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然GRAL多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

一类特殊的GRAL类似物是，在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中GRAL多肽的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据本发明公开的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“GRAL蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相比，有至多50个，或40个，或30个，较佳地至多20个，更佳地至多10个，最佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO：2或SEQ ID NO：4的蛋白质，但与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列：成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性，最佳的90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GRAL蛋白的多聚核苷酸。

GRAL核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的小鼠GRAL的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GRAL蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的GRAL多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码GRAL多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

具体而言，本发明的GRAL蛋白可通过将相应的编码序列引入宿主细胞(直接引入或通过引入含GRAL编码序列的载体)，并在合适的条件下培养转化的宿主细胞以表达GRAL蛋白，然后分离和纯化出GRAL蛋白。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

具体而言，本发明的GRAL蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：促进神经和/或靶细胞存活，和用于筛选促进GRAL蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组GRAL蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能促进或刺激GRAL蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对GRAL DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于GRAL基因产物或片段。较佳地，指那些能与GRAL基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的GRAL基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达GRAL蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用GRAL基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与GRAL基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗GRAL蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的GRAL蛋白。

多克隆抗体的生产可用GRAL蛋白或多肽免疫动物，如家兔，羊等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与GRAL蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。在筛选时，可以将GRAL蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响GRAL蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。此外，还可将测试化合物与GRAL蛋白一起施用于实验动物，与对照相比存在不同的神经和/或靶细胞的存活数就表明，该化合物是GRAL蛋白的激动剂或拮抗剂。

此外，还可将GRAL基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备高表达GRAL蛋白的细胞株：并以此细胞株中的GRAL蛋白为靶位点，筛选对GRAL蛋白有激活或抑制作用的药物。并向所述的表达GRAL蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测GRAL蛋白表达量的变化。促进GRAL蛋白表达的就是促进神经细胞和/或靶细胞存活的化合物。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、口服、或局部给药。

正常的GRAL多肽可直接用于疾病治疗，例如，在疗治神经系统疾病，如神经退行性疾病等场合，用于促进神经再生，保护靶细胞。在使用本发明GRAL基因时，也可以促进神经再生，保护靶细胞。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明GRAL蛋白、其编码核酸、和/或反义核酸，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.01微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的GRAL蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.01微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

GRAL蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于GRAL蛋白的无表达或异常/无活性的GRAL蛋白的表达所致的神经退变。构建携带GRAL基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组GRAL基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还涉及定量和定位检测GRAL蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的GRAL蛋白水平，可以用作解释GRAL蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断GRAL蛋白起作用的疾病。

一种检测样品中是否存在GRAL蛋白的方法是利用GRAL蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与GRAL蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在GRAL蛋白。

GRAL蛋白的多聚核苷酸可用于GRAL蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，GRAL蛋白的多聚核苷酸可用于检测GRAL蛋白的表达与否或在疾病状态下GRAL蛋白的异常表达。如GRAL DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断GRAL蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用GRAL蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GRAL基因的转录产物。

检测GRAL基因的突变也可用于诊断GRAL蛋白相关的疾病。GRAL蛋白突变的形式包括与正常野生型GRAL DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的GRAL蛋白不仅可用于治疗，也可用于促进神经营养因子的作用。因此，本发明还提供了一种保健品，它含有哺乳动物的GRAL蛋白或其编码序列。本发明保健品，可通过保健品领域常规的方法，通过将哺乳动物的GRAL蛋白或其编码序列，与合适的稀释剂、食品等混合在一起而制备。优选的保健品是片剂、颗粒剂、口服剂形式。

GRAL基因在外周器官如心、肝、脾、肺中缺如，但在中枢神经系统中特异表达。在没有GDNF家族的四个配体存在的情况下，过表达GRAL的PC12细胞(一种常用的来源于大鼠嗜铬细胞瘤的细胞株)，与对照相比表现出一定程度的自分化现象，并且还更能抵抗血清饥饿。这些实验结果提示，发明人克隆到的GRAL基因的编码产物具有一定的促进神经细胞分化和存活的神经营养作用。剪接异构体B经软件分析，具有较高的可溶性，GRAL B蛋白与GRAL A蛋白具有很高的同源性，因此GRAL B蛋白也有类似的神经营养作用。因此，本基因的克隆和功能的阐述为人们研制治疗神经退行性疾病重要候选药物增加了新的选择。

神经营养因子的作用依赖于靶细胞受体的存在和状态，但在神经退行性疾病的状况下，已遭损害或部分损害的神经细胞(即靶细胞，如多巴胺能神经元)状态底下，它们所表达的神经营养因子受体也不可避免地在数量和对配体的反应性(如结合能力等)等方面受到负面影响，因此，神经营养因子本身的有效性可能会显著下降，而通过适当的方法(如基因治疗)使这些靶细胞表达具有自激活特性的跨膜蛋白基因(或使其表达水平提高)，自主而持续地激活与细胞分化、抗凋亡相关的细胞内信号转导通路，将有助于摆脱对外源性神经营养因子的依赖，从而达到持久的神经保护的目的，这将会为发展神经退行性疾病的治疗方法提供全新的思路和途径。发明人新近克隆的GRAL基因正具有这一特性，因而具有开发为新的促神经分化和抗凋亡药物的前景。

多序列比对结果表明，该基因与已知的GDNF receptorα有一定的同源性(见图2)。结果显示，GRAL基因与已知的小鼠GDNFα1，α2，α3，α4在氨基酸水平的同源性分别为37％，39％，40％和35％。对该基因在多器官和组织的分布检测表明，该基因的两个剪接异构体主要在中枢神经系统(大脑和脊髓)中表达，并且在海马、丘脑、黑质等部位表达水平较高(见图3)。免疫荧光细胞化学实验证明，GRAL基因的剪接异构体A定位在细胞膜上(见图4)。稳定转染了GRAL的PC12细胞，在不加外来因子刺激的情况下，表现出一定的分化状态，有接近百分之六十的细胞长出了达一倍胞体长的神经突起，而没有转染的PC12细胞和转染空载体的PC12细胞则基本保持在未分化状态(见图5)。由于稳定转染GRAL基因的PC12细胞是由单克隆衍生而来的，为了鉴别发明人所看到的分化现象是由转染GRAL基因造成的。还是由于克隆之间初始分化状态不同造成的，发明人筛选了非单克隆来源的PC12稳定表达株，即用G418筛选两周后即停止进一步筛选的细胞株。这种细胞也有部分表现出分化现象，虽然分化比例比单克隆来源的稳定表达株低，但与对照相比还是有明显差异(见图6)，这说明PC12细胞的分化确实是由于转染GRAL基因造成的。发明人又将已知的四种GDNF家族的配体作用于稳定转染GRAL基因的PC12细胞，发现分化比例和神经突起的长度都没有明显改变，这说明已知的四种GDNF家族的配体并不能激活发明人转染的GRAL基因(图7)。因此，本发明在制备治疗神经退行性疾病的药物组合物和促进神经存活和分化方面与已知的神经营养因子，如GDNF相比，具有极大的优越性：另外，本发明的蛋白和多核苷酸还可用于抗细胞凋亡。

除了促神经分化作用以外，我们还观察到稳定转染的PC12细胞比对照更能抵抗血清饥饿。撤除血清两天以后，稳定转染GRAL的PC12细胞与转染空载体的PC12细胞相比，有更多的细胞存活(见图8)。这些结果提示，GRAL基因编码的蛋白具有类似神经营养因子的作用，在体外能促进PC12细胞的分化和存活，而且其营养作用并不依赖于已知的GDNF家族配体，因此是一种潜在的以跨膜形式存在的神经营养因子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

部分实验材料：

抗Flag抗体，FITC标记的羊抗鼠IgG．辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，荧光素二乙酸酯等，均购自美国Sigma公司(Sigma，St.Louis，MO)：GDNF，neurturin，persephin，artemin均购自英国PeproTech公司(London，UK)；TOTALLY RNA纯化试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)，DMEM/F12(GIBCO，Invitrogen，USA)；胎牛血清(GIBCO，Invitrogen，USA)；小鼠脑mRNA和SMART RACE试剂盒购自Clontech公司(Clontech，CA，USA)，

实施例1小鼠GRAL基因的克隆

用已知的小鼠GDNF receprorα的保守序列利用BLAST程序对小鼠基因组草图数据库( http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov)进行搜索，在小鼠6号染色体上找到了一个同源片段。以该同源片段序列为基础，分别设计了5’端引物(P1)和3’端引物(P2)。小鼠脑mRNA经过反转录成cDNA。以反转录所得cDNA为模板，采用扩增未知cDNA末端的方法RACE(RapidAmplification of cDNA Ends)，利用SMART RACE试剂盒，我们克隆到了小鼠全长基因。序列分析表明，该基因是一个全新的基因，其序列与已知的小鼠GDNF receptor α有一定的同源性(与四种GDNF receptorα的同源性介于35％到40％之间)，但是并不符合GDNF receptorα的全部序列特征。根据其序列特点，结合下面的功能实验，我们将该基因命名为胶质细胞源性神经营养因子α受体样基因(glial cell line-derived neurotrophic factor receptorα-like gene，GRAL)。小鼠GRAL基因有两个剪接异构体，其序列见图1。

5’端引物(P1，SEQ NO：5)为：5’-CAT GGC TTG CTG TGA AGA GTT TCT TTG G-3’；

3’端引物(P2，SEQ NO：6)为：5’-CAC TGC CAA GCA GCC ATA CGG TTC-3’。

实施例2小鼠GRAL蛋白的表达和Western blot分析

首先将全长小鼠GRAL基因(SEQ NO：1)插入载体pcDNA3.1(Invitrogen)，转化入大肠杆菌DH5α(GIBCO BRL)后大量抽提质粒，然后将质粒转染入细胞，在细胞中表达得到小鼠GRAL-Flag的融合蛋白，两天后收集细胞。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，加入裂解缓冲液(1x PBS，1％Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail)，用细胞刮将细胞刮下，冰上放置30分钟，然后用细注射器抽吸裂解液，冰上放置30分钟。4℃10,000g离心10分钟。取上清。加入上样缓冲液，95℃水浴5分钟。经SDS-PAGE电泳，然后电转至硝酸纤维素膜，用TBST(1x TBS，0.05％Tween 20)漂洗，然后用含有5％脱脂奶粉的TBST孵育45分钟，再在小鼠抗Flag抗体(IgG)中孵育45分钟，TBST漂洗后再在辣根过氧化物酶耦联的羊抗小鼠IgG中孵育45分钟，漂洗后按照SuperSignal_West Pico ECLsystem操作曝光，显影。Western blot分析表明，转染pcDNA3.1-GRAL的CHO细胞裂解液有小鼠GRAL-Flag蛋白的表达，该产物分子量约为45kDa，与推算的理论值(44kDa)相符(图4)。

实施例3免疫荧光标记

经Flag-GRAL基因转染后的细胞用常规方法固定，用PBST(PBS含0.01％tritonX-100)漂洗后在4％羊血清中孵育30分钟，再用含1％羊血清的Flag抗体在4℃孵育48小时，再用PBST漂洗，然后与荧光素标记的二抗孵育，漂洗。用荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察，照相(图4)。实验结果显示，Flag-GRAL主要定位在细胞膜上，与基因结构分析的结果相符。

第一抗体蛋白英文名称	对应使用的第二抗体	第一抗体的用途
第一抗体蛋白英文名称	对应使用的第二抗体	第一抗体的用途	Flag	抗小鼠IgG	识别表达Flag与特定基因的融合蛋白的细胞

实施例4半定量RT-PCR

将成年小鼠处死并迅速分离所需各组织，在冰上匀浆并用Trizol试剂抽提总RNA。取1微克总RNA合成单链cDNA，反应体系为20微升，其中含有50mM随机引物，50mM Tris-HCL，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl₂，50mM DTT，0.75U RNasin，0.2mM dNTP，200U MMLV反转录酶。反应在37℃进行了一小时，然后于95℃加热5分钟终止反应。特异于GRAL的引物能扩增出1270和1018碱基长的DNA片段，分别对应于剪接异构体A和B。正向引物(P2，SEQ NO：6)为：5’-CACTGCCAAGCAGCCATACGGTTC-3’，反向引物(P3，SEQ NO：7)为：5’-TGGAGTAACCATTGACTTTTCTCAAACCAA-3’。

以水作模板的阴性PCR没有扩出条带，说明反应过程中没有交叉污染。

PCR反应在Mastercycler Gradient PCR仪(德国Eppendorf)里进行，反应体系为20微升，含有1-3微升模板，25pmol引物，1.25U Taq聚合酶，和1xPCR反应缓冲液(0.2mM dNTP，1.5mM MgCl₂)。在PCR反应之前每个模板的GAPDH被调节成均一浓度。取20微升PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用柯达数码相机拍照。所有PCR产物用自动PCR测序仪测序。结果表明，GRAL基因的两个剪接异构体在中枢神经系统(脑和脊髓)表达，而在多种外周器官如心、肝、脾、肺、肾、胎盘、骨骼肌、小肠中缺如；在中枢神经系统，GRAL基因在海马、黑质、丘脑、脊髓中丰度相对较高，而在皮层、纹状体、小脑、嗅球中丰度较低(见图3)。

实施例5GRAL基因对PC12细胞分化作用的观察

利用脂质体转染法将Flag-GRAL-pcDNA3.1转入体外培养的PC12细胞，通过G418(200-800微克/毫升)的筛选去除那些未被转染的细胞，从而获得稳定表达该基因的PC12细胞克隆。这样的细胞克隆有三个，分别是10号，11号和18号。在不加外来因子刺激的情况下，它们均表现出一定的分化状态，即有接近百分之六十的细胞长出了达一倍胞体长的神经突起，而没有转染的PC12细胞和转染空载体的PC12细胞则基本保持在未分化状态(图5)。在光学显微镜下，对拥有一倍胞体长神经突起的细胞进行计数，计算它们在总细胞数中所占比例(图5)。在部分实验中，还筛选了非单克隆来源的PC12稳定表达株，细胞计数的方法相同。

实施例6GRAL基因对PC12细胞抗凋亡作用的观察

利用从体外培养实施例5中获得的PC12细胞克隆18号进行该基因抗细胞凋亡的实验。将培养基中所含的胎牛血清撤除以诱导细胞凋亡，两天后将这些细胞用台盼兰或荧光素二乙酸酯染色，然后在光学显微镜下计数活细胞(即未被台盼兰染色的细胞或被荧光素二乙酸酯染色的细胞，这两种方法相互独立)，计算它们各自在总细胞数中所占比例(图8)。我们观察到稳定转染的PC12细胞比对照更能抵抗血清饥饿。撤除血清两天以后，稳定转染GRAL的PC12细胞与转染空载体的PC12细胞相比，有更多的细胞存活(见图8)，这一效应在血清撤除后4天更明显。这表明，GRAL基因能明显增强PC12细胞的抗凋亡能力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种促进神经分化和抗细胞凋亡的蛋白质及其编码基因

<130>031118

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2123

<212>DNA

<213>小鼠(mouse)

<220>

<221>CDS

<222>(239)..(1420)

<223>

<400>1

actctcctga aaggataata tcctgggttc gcaagctgag gagaacaatt gaatttgaat 60

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1 5 10 15

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20 25 30

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390

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<210>2

<211>393

<212>PRT

<213>小鼠(mouse)

<400>2

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1 5 10 15

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20 25 30

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145 150 155 160

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165 170 175

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195 200 205

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Glu Ile Ala Gly Gly Val Ile Ile Gln

385 390

<210>3

<211>1872

<212>DNA

<213>小鼠(mouse)

<220>

<221>CDS

<222>(239)..(955)

<223>

<400>3

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acaattagga aagttcacag ctcaaaacaa actggtgagg aacagctgac accagaagct 120

gactctaatt ggctggctct taggaagcaa aacctttaca cagaaacttc agttgggatg 180

ttggttggtg tcagctcatc cgcctttctc ccagggagac catcttgagt tgtccaac 238

atg cta gtg ttc att ttc ctg gct gtt acg tta agc tca gaa aat gaa 286

Met Leu Val Phe Ile Phe Leu Ala Val Thr Leu Ser Ser Glu Asn Glu

1 5 l0 15

tcc tct tcc cca aca aat gat tgt gca cat tta ata cag aaa tgc ttg 334

Ser Ser Ser Pro Thr Asn Asp Cys Ala His Leu Ile Gln Lys Cys Leu

20 25 30

att gat gca aat ggc tgt gag cag tca tgg aga tca atg gaa gac acc 382

Ile Asp Ala Asn Gly Cys Glu Gln Ser Trp Arg Ser Met Glu Asp Thr

35 40 45

tgc ctt act cca ggt gac tcc tgc aag ata aat aat tca cta cat tgt 430

Cys Leu Thr Pro Gly Asp Ser Cys Lys Ile Asn Asn Ser Leu His Cys

50 55 60

aac ctg agt atc cag gct ttg gtg gaa aaa aat ttc caa ttt aaa gag 478

Asn Leu Ser Ile Gln Ala Leu Val Glu Lys Asn Phe Gln Phe Lys Glu

65 70 75 80

tgt ctt tgt atg gat gac ctc cac tgt aca gta aac aaa ctt ttt gga 526

Cys Leu Cys Met Asp Asp Leu His Cys Thr Val Asn Lys Leu Phe Gly

85 90 95

aaa aag tgc acc aat aag aca gat aac atg gaa aag gac aat aaa gat 574

Lys Lys Cys Thr Asn Lys Thr Asp Asn Met Glu Lys Asp Asn Lys Asp

100 105 110

aaa tgg aat cta act act act cct ttc tat cat gga ttc aaa cag atg 622

Lys Trp Asn Leu Thr Thr Thr Pro Phe Tyr His Gly Phe Lys Gln Met

115 120 125

cag tct tgt ttg gag gtg aca gag gcg tgt gta ggg gat gtg gtt tgt 670

Gln Ser Cys Leu Glu Val Thr Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys

130 135 140

aat gca cag ttg gcc ctt tac ctt aaa gca tgc tca gca aat gga aat 718

Asn Ala Gln Leu Ala Leu Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn

145 150 155 160

ctg tgt gat gtg aaa cac tgc caa gca gcc ata cgg ttc ttc tat caa 766

Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln

165 170 175

aat atg cct ttt aac act gcc cag atg ttg gct ttt tgt gac tgt gct 814

Asn Met Pro Phe Asn Thr Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala

180 185 190

caa tct gat ata ccc tgt cag caa tcc aaa gaa act ctt cac agc aag 862

Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Thr Leu His Ser Lys

195 200 205

cca tgt gca ctg aat ata gtt cca ccc ccc act tgc ctc agt gta att 910

Pro Cys Ala Leu Asn Ile Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile

210 215 220

cac act tgc cga aat gat gaa tta tgc aga tta ccc aac tcc 952

His Thr Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Leu Pro Asn Ser

225 230 235

taatgtcaaa gacatttcct catatgaaaa aaagaattca aaagaaatta ctctgactgg 1012

attcaattct ttcttcaatg gagaactact ctatgttgtt gtatgcatgg cagttacctg 1072

tggaattctt ttcttggtga tgctcaagtt aaggatacaa agtgaaaaaa gagatccctc 1132

atccatcgaa atagctggag gtgtcatcat tcagtgagct gcagatcact taccaaccac 1192

atgtctgtgt gactaaccaa tggaaaatta catttgccaa taacgcaatt taagatggat 1252

ttgacaatat ttagtcatta tatgtaacag tgactggtac agtaatatac cacaatgatc 1312

acagatctgt ttttgttttt gtttttaatg tttgagtaaa tacttgttgt ggtgtcataa 1372

ctagttgata acattttctt taaagacaac aggtgtcatg taaaatgtga caaatttgct 1432

ggaagactat caatccacat atcaacttct atcttatgga actaatcata attagtgtgt 1492

gcagttttct gaacaaggtt atagttttcc attaagttgg taaaattaaa atgctaagta 1552

gaatattgag tatacttgtt atttatatat tcttacttag tgtccaatca ttaaacaaat 1612

tggtaacatt gaacatattt agttagatga ctgcttatga aaataagaac tgacatctta 1672

caaattttat aatttaaata gtattgaatt ttacttttta tttggtatgt taagattcat 1732

aatatataaa gcagctacat tggttgagaa aagtcaatgg ttactccagt aatgatatac 1792

tttgtgaatt tatttatttt tgctaattaa tgatcctgaa tgtaatcatg atgaaataaa 1852

aaagacatac ttaaattgct 1872

<210>4

<211>238

<212>PRT

<213>小鼠(mouse)

<400>4

Met Leu Val Phe Ile Phe Leu Ala Val Thr Leu Ser Ser Glu Asn Glu

1 5 10 15

Ser Ser Ser Pro Thr Asn Asp Cys Ala His Leu Ile Gln Lys Cys Leu

20 25 30

Ile Asp Ala Asn Gly Cys Glu Gln Ser Trp Arg Ser Met Glu Asp Thr

35 40 45

Cys Leu Thr Pro Gly Asp Ser Cys Lys Ile Asn Asn Ser Leu His Cys

50 55 60

Asn Leu Ser Ile Gln Ala Leu Val Glu Lys Asn Phe Gln Phe Lys Glu

65 70 75 80

Cys Leu Cys Met Asp Asp Leu His Cys Thr Val Asn Lys Leu Phe Gly

85 90 95

Lys Lys Cys Thr Asn Lys Thr Asp Asn Met Glu Lys Asp Asn Lys Asp

100 105 110

Lys Trp Asn Leu Thr Thr Thr Pro Phe Tyr His Gly Phe Lys Gln Met

115 120 125

Gln Ser Cys Leu Glu Val Thr Glu Ala Cys Val Gly Asp Val Val Cys

130 135 140

Asn Ala Gln Leu Ala Leu Tyr Leu Lys Ala Cys Ser Ala Asn Gly Asn

145 150 155 160

Leu Cys Asp Val Lys His Cys Gln Ala Ala Ile Arg Phe Phe Tyr Gln

165 170 175

Asn Met Pro Phe Asn Thr Ala Gln Met Leu Ala Phe Cys Asp Cys Ala

180 185 190

Gln Ser Asp Ile Pro Cys Gln Gln Ser Lys Glu Thr Leu His Ser Lys

195 200 205

Pro Cys Ala Leu Asn Ile Val Pro Pro Pro Thr Cys Leu Ser Val Ile

210 215 220

His Thr Cys Arg Asn Asp Glu Leu Cys Arg Leu Pro Asn Ser

225 230 235

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物P1

<400>5

catggcttgc tgtgaagagt ttctttgg 28

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物P2

<400>6

cactgccaag cagccatacg gttc 24

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物P3

<400>7

tggagtaacc attgactttt ctcaaaccaa 30

Claims

1.一种分离的GRAL蛋白，其特征在于，具有选自下述的氨基酸序列：

(a)具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

(b)将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进神经细胞分化和/或存活功能的由(a)衍生的蛋白。

2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，它具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该核苷酸序列编码如权利要求1或2所述多肽的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：1中239-1420位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-2123位的序列；

(c)具有SEQ ID NO：3中239-955位的序列；

(d)具有SEQ ID NO：3中1-1872位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3、4或5所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种具有GRAL蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达GRAL蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有GRAL蛋白活性的多肽。

9.一种能与权利要求1或2所述的GRAL蛋白特异性结合的抗体。

10.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的GRAL蛋白、或权利要求3所述的多核苷酸，以及药学上可接受的载体。

11 一种筛选促进或抑制神经细胞分化和/或存活的化合物的方法，其特征在于，它包括步骤：

12.一种检测试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的GRAL蛋白、或权利要求3所述的多核苷酸。

13.权利要求10所述组合物在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。