CN1203177C

CN1203177C - 肿瘤抗原蛋白质及其基因和肿瘤抗原肽

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Publication number: CN1203177C
Application number: CNB97197098XA
Authority: CN
Inventors: 伊东恭悟; 七条茂树; 今井康久
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: AU714548B2; EP0911397A4; EP0911397A1; US6815531B1; WO1997046676A1; CN1227602A; CA2257531A1; AU3047997A; US20050020817A1; NZ333203A

Abstract

编码含有序列号1中氨基酸序列的蛋白质的DNA，或者编码其氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基发生替换，缺失或添加等变异的蛋白质的DNA，但是通过细胞内分解，该蛋白质和变异的蛋白质能产生与主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原相结合的肽片段，在其结合状态能被T细胞所识别的肽片段。含有以该DNA作有效成分的医药，表达该DNA的质粒，用该表达质粒进行转化所形成的转化体，通过该DNA的表达而产生的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽。

Description

肿瘤抗原蛋白质及其基因和肿瘤抗原肽

发明的技术领域

本发明涉及用于活化抗肿瘤免疫的医药、治疗自身免疫性疾患的医药，以及肿瘤或自身免疫性疾病的诊断。更为具体地讲，本发明涉及新型肿瘤抗原蛋白质、其新型基因、新型的肿瘤抗原肽等。

先有技术

已知生物体内的免疫系统，特别是T细胞对肿瘤的排除起着重要作用。实际上，在人的肿瘤集中的部位可以观察到对肿瘤细胞有杀伤活性的淋巴细胞浸润(Arch.Surg.， 126：200-205，1990)，从黑色素瘤中可以较容易地分离出识别自身肿瘤细胞的细胞毒性T细胞(CTL)(今日免疫， 8：385，1987，免疫学杂志， 138：989，1987，国际癌症杂志， 52：52-59，1992等)。此外，通过引入T细胞来治疗黑色素瘤的临床结果也暗示了T细胞在排除肿瘤中的重要性(国家癌症研究所杂志， 86：1159，1994)。

尽管很长一段时间里人们不知道攻击自身肿瘤细胞的CTL的靶分子是什么，但由于最近免疫学和分子生物学的进步，得以逐步阐明其分子机制。即，CTL通过应用T细胞受体(TCR)，识别肿瘤抗原肽与主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原相结合形成的复合体，从而攻击自身的肿瘤细胞。

该肿瘤抗原肽是肿瘤抗原蛋白质在细胞内合成后，由蛋白酶在胞质内分解成肽而形成的。另一方面，在内质网中形成的MHC I类抗原与上述肿瘤抗原肽相结合，通过高尔基体凸面移到高尔基体凹面即成熟面，表达在细胞表面(临床免疫， 27(9)：1034-1042，1995)。

作为该肿瘤抗原蛋白质，是1991年由T.Boon等首次从人黑色素瘤细胞中鉴定出的命名为MAGE的蛋白质(Science， 254：1643-1647，1991)，其后，又从黑色素瘤细胞中鉴定出几种肿瘤抗原蛋白质。

正如T.Boon等在综述(实验医学杂志， 183，725-729，1996)中所说述的，到目前为止所鉴定出的肿瘤抗原蛋白质可分为以下四类：

第一类中所包含的肿瘤抗原蛋白质是这样一组蛋白质，在正常组织中，仅在睾丸中表达，在肿瘤组织中，可看到在黑色素瘤，头颈部癌，非小细胞性肺癌、膀胱癌等中表达。作为该类的肿瘤抗原蛋白质，有上述的MAGE，形成12种以上的成员家族的类似蛋白质(实验医学， 178：489-495，1993)，BAGE(免疫性， 2：167-175，1995)和GAGE(实验医学， 182：689-698，1995)，每一种蛋白质均从黑色素瘤细胞鉴定出。

虽然该类的肿瘤抗原蛋白质在黑色素瘤中高表达，但在其它肿瘤患者中仅10-30％表达，所以不能广泛用于各种肿瘤的治疗和诊断。

第二类肿瘤抗原蛋白质中包含这样的一组蛋白质，在正常组织中只在黑色素细胞、视网膜中表达，在肿瘤组织中只观察到在黑色素瘤中表达。由于这些组织特异的蛋白质在黑色素瘤这一肿瘤细胞中高表达，所以它们起到对黑色素瘤特异的肿瘤抗原蛋白质的作用。作为这类肿瘤抗原蛋白质，有酪氨酸酶(实验医学杂志， 178：489-495，1993)、MART-1(美国国家科学院院刊， 91：3515，1994)、gp 100(实验医学杂志， 179：1005-1009，1994)、gp 75(实验医学杂志，181：799-804，1995)，这些基因均从黑色素瘤克隆而来，另外，各别地分离出Melan-A(实验医学杂志， 180：35，1994)，与MART-1是同一分子。

但是，因为该类肿瘤抗原蛋白质在黑色素瘤以外的肿瘤中不表达，所以不能广泛用于肿瘤的治疗和诊断。

第三类肿瘤抗原蛋白质是这样一组蛋白质，是通过肿瘤特异性突变而产生的能被CTL新识别的肿瘤抗原肽。作为该类肿瘤抗原蛋白质，有突变的CDK4(Science， 269：1281-1284，1995)，β-连环蛋白(实验医学杂志， 183：1185-1192，1996)，MUM-1(美国国家科学院院刊， 92：7976-7980，1995)。CDK4、β-连环蛋白中有一个氨基酸发生变异，由此增加了肽的MHC-1类抗原的亲和性，从而被T细胞识别。MUM-1是通过突变，通常不被翻译的内含子部位被翻译后所形成的肽被T细胞所识别。但是由于这些突变的频率很低，不能广泛用于肿瘤的诊断和治疗。

第四类中所包含的肿瘤抗原蛋白质是在正常组织中广泛表达，能被CTL所识别的蛋白质P15(免疫学杂志， 154：5944-5955，1995)，它是从黑色素瘤细胞鉴定出的。

到目前为止已知的鉴定肿瘤抗原蛋白质或者肿瘤抗原肽的方法如下。

进行鉴定的时候，首先要准备一套肿瘤细胞和攻击该细胞的CTL(通常从同一肿瘤患者的淋巴细胞建立)。然后用这一对细胞直接鉴定肿瘤抗原伏，或者测定编码肿瘤抗原蛋白质的基因，再鉴定与之相对应的肿瘤抗原肽。

也说是说，作为肿瘤抗原肽的直接鉴定方法是在酸性条件下提取与肿瘤细胞MHC-1类抗原结合的肿瘤抗原肽，通过高效液相色谱分离成各种肽，联到表达MHC-1类抗原而不表达肿瘤抗原蛋白质的细胞(如同一患者的B细胞等)，通过检测CTL反应来鉴定肿瘤抗原肽，由通过质谱等来测定其序列。通过这一方法从Pme 117鉴定出与黑色素瘤细胞gp 100同一分子的肿瘤抗原肽(Science， 264：716-719，1994)。

为了能确定出编码肿瘤抗原蛋白质的基因，由鉴定出相应的肿瘤抗原肽，可用分子生物学方法将编码肿瘤抗原蛋白质的基因进行克隆。从肿瘤细胞制备cDNA，将该cDNA与MHC-1抗原基因一并转染不表达肿瘤抗原蛋白质的细胞(如COS细胞等)，进行瞬时表达，根据其对CTL的反应性进行筛选，分离出编码肿瘤抗原蛋白质的基因。通过这种方法，克隆了上述的MAGE、酪氨酸酶、MART-1、gp 100、gp 75的基团。

为了从肿瘤抗原基因的信息推断、鉴定实际上与MHC-1类抗原结合的呈递肿瘤抗原肽，可用下面的方法。首先，用PCR，核酸外切酶，限制性酶等制备出各种大小的，编码肿瘤抗原蛋白质的基因片段，与MHC-I类抗原基因一起转染到不表达肿瘤抗原蛋白质的细胞(例如COS细胞等)中进行瞬时表达，根据CTL的反应性来限定含肿瘤抗原肽的区域。然后合成肽，表达MHC-I类抗原而不表达肿瘤抗原蛋白质的细胞中，通过检测CTL的反应性来鉴定肿瘤抗原肽(实验医学杂志，176：1453，1992，实验医学杂志， 179：24，759，1994)。已断明HLA-A1，-A0201，-A0205，-A11，-A31，-A6801，-B7，-B8，-B2705，-B37，-Cw0401-Cw0602等MHC型所结合、呈递的肽序列的规律序(基元序列)(免疫遗传学， 41：178-228，1995)，参照它们可以设计出候补肿瘤抗原肽，合成该肽，可用上述同样的方法进行鉴定(欧洲免疫学杂志， 24：759，1994，实验医学杂志， 180：347，1994)。

此外也考虑到，在肿瘤中高表达的肿瘤抗原蛋白质，在正常组织中也表达，有可能因对肿瘤抗原蛋白质产生的过度免疫反应而引起自身免疫性疾病。例如，联合应用化疗药物和IL-2治疗黑色素瘤的时候，可发现白斑症状的出现(临床肿瘤学杂志， 10：1338-1343，1992)。这是由于诱导产生了针对黑色素瘤表达的肿瘤抗原蛋白质片段(肽片段)和MHC-I类抗原复合体的CTL或抗体，对正常的皮肤组织产生作用，而产生属自身免疫性疾病症状的白斑症。

发明预解决的问题

如上所述，已知的肿瘤抗原蛋白质或只在有限的肿瘤中表达，或虽在多类肿瘤中表达而只在少数肿瘤患者中表达，因此它们可能广泛用于各种肿瘤的治疗和诊断。

由于本发明预解决的目标是提供肿瘤抗原蛋白质或者其肿瘤抗原肽，它不同于用已知的肿瘤抗原蛋白质或其片段(以下称作肽片段或肿瘤抗原肽)所进行的肿瘤的治疗和诊断，它能广泛用于包括扁平上皮癌在内的肿瘤，或者虽然仅能应用于限定的肿瘤，但能在大多数该类肿瘤患者中应用，或者它能作为肿瘤治疗和诊断中的辅助品用于各种肿瘤。

扁平上皮癌是人癌中最普遍的癌之一。尤其是，已知食道癌和肺癌中的扁平上皮癌对化疗和放疗有相对的抵抗性。从这一点上讲，人们期待能用肿瘤抗原蛋白质或其相应的肿瘤抗原肽开发特异性免疫疗法。

此外，对于因肿瘤抗原蛋白质引起的过度特异性免疫反应而造成的自身免疫性疾病发生这一情况，人们期待用阻碍编码肿瘤抗原蛋白质的基因表达的反义DNA或RNA和肿瘤抗原肽的拮抗剂等来特异性封闭免疫反应。

解决问题的手段

为了获得能广泛应用于各种肿瘤，特别是扁平上皮癌等治疗和诊断的肿瘤抗原蛋白质或其相应的肿瘤抗原肽，本发明人尝试着从黑色素瘤以外的肿瘤鉴定肿瘤抗原蛋白质。

即，本发明人建立食道癌来源的扁平上皮癌细胞株KE-4(以下称作食道癌细胞株，或简称为KE-4)，还建立识别KE-4中表达的MHC-I类抗原HLA-A2601限制性的肿瘤抗原肽的CTL(以下称作KE-4CTL)(癌症研究， 55：4248-4253，1995)。

接着，将由KE-4制备的cDNA文库重组质粒与HLA-A2601cDNA的重组质粒同时转染约维母细胞株VA-13，用KE-4CTL处理转化体，通过测定活化KE-4CTL产生的IFN-γ含量来进行筛选。结果首次从黑色素瘤以外的肿瘤细胞成功地克隆了编码本发明的肿瘤抗原蛋白质的新基因。

即，本发明的要点为：

(1)DNA，它编码有序列号1中氨基酸序列的蛋白质，或者它编码该氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基发生置换，缺失或增添的变异蛋白质(但该蛋白质和变异蛋白质通过在细胞内分解能产生与MHC-I类抗原相结合，在结合状态能被T细胞所识别的肽片段)，

(2)由序列号2中的碱基序列组成的DNA，或者在严格条件下与该DNA杂交所形成的变异DNA(但该DNA及DNA变异体表达所产生的蛋白质通过细胞内分解，能产生与MHC-I类抗原相结合的、在结合状态下能被T细胞所识别的肽片段)，

(3)含有以上面(1)或(2)中DNA作有效成分的医药，

(4)含有上述(1)或(2)中DNA的表达质粒，

(5)用上述(4)的表达质粒进行转化所形成的转化体，

(6)表达上述(1)或(2)的DNA所产生的肿瘤抗原蛋白质，

(7)由上述(6)中蛋白质的一部分而来的肽，与MHC-I类抗原结合能被T细胞所识别的肿瘤抗原肽，或者有同等功能的衍生物，

(8)有序列号1中氨基酸序列的第749位～第757位，第736位～第744位，第785位～第793位，或第690位～第698位氨基酸序列的全部或一部分的、上述(7)中的肿瘤抗原肽或者功能性有同等特性的衍生物，

(9)含有以上述(6)中的肿瘤抗原蛋白质、(7)或(8)中的肿瘤抗原肽，或者功能上有相同特性的衍生物为有效成分的医药，

(10)与上述(6)中的肿瘤抗原蛋白质、或上述(7)或(8)中的肿瘤抗原肽进行特异性结合的抗体，

(11)由8个以上碱基所组成的，具有与序列号2中碱基序列所组成DNA的编码序列或者与非编码序列中DNA片段互补序列的DNA，或其相应的RNA或其化学修饰体。

发明的实施方式

本发明的DNA是编码新型肿瘤抗原蛋白质的DNA，它编码具有序列号1中氨基酸序列的蛋白质，或编码该氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基发生替换、缺失或添加了的变异蛋白质(但该蛋白质或变异蛋白质通过细胞内分解可产生与MHC-I类抗原相结合的、在结合状态下能被T细胞所识别的肽片段)，或者它是由序列号2中碱基序列所组成的DNA，或是在严格条件下能与该DNA进行杂交的变异DNA(但是该DNA及DNA变异体所表达的蛋白质可通过细胞内分解而产生与MHC-I类抗原相结合的、在结合状态下能被T细胞所识别的肽片段)。

本说明书中所讲“氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基发生置换、缺失或添加而形成的变异蛋白质”是指人工制备的、或编码变异蛋白质、蛋白质的DNA经过自然发生的多形性、变异及修饰反应等而得到的功能性具有同等特性的蛋白质，可根据Molecular Cloning：A LaboratoryManual第二版第1-3卷Sambrook J等著，Cold Spring HarberLaboratory Press出版，New York 1989年中的方法，例如诱发定点突变和PCR法制备编码变异蛋白质的DNA。这里所讲的置换、缺失或添加的氨基酸数是指用上述诱发定点突变等众所周知的方法所允许的置换、缺失或添加的数目。

本说明书中所讲“在严格条件下与DNA杂交的DNA变异体”可根据前述Molecular Cloning中的方法获得。这里的“严格条件”是指在含6×SSC(20×SSC表示333mM柠檬酸钠，333nM NaCl)、0.5％SDS及50％甲酰胺的溶液中42℃杂交后，在0.1×SSC、0.5％SDS溶液中68℃洗净这样的条件，或者，参照中山等著生物实验详解，卷2，基因分析基础，p.148-151，秀润社，1995年所描述的条件。本说明书中由该杂交DNA表达所产生的蛋白质包括能与MHC-I类抗原结合、被T细胞所识别的、构成该蛋白质的一部分肽片段。

本说明书中所讲“通过细胞内分解，能产生与MHC-I类抗原相结合的、在结合状态下能被T细胞所识别的肽片段的蛋白质及变异蛋白质”(以下有时称这些蛋白质为肿瘤抗原蛋白质)是指，由该蛋白质或变异蛋白质的一部分氨基酸序列所组成的部分肽可与MHC-I类抗原结合，当与MHC-I类抗原结合并呈递到细胞表面的时候，该肽片段与MHC-I类抗原的复合体被能与之特异性结合的T细胞所识别，将信号传递给T细胞，包含这样肽部分的蛋白质或变异蛋白质即为所指。这里所指的结合指非共价结合。

确定肽片段与MHC-I类抗原结合被T细胞所识别的方法有，如可通过在适当的细胞内内源性表达或通过外源性加入(脉冲)使肽片段结合MHC-I类抗原，呈递到细胞表面，然后将肿瘤抗原蛋白质特异的T细胞作用于肽呈递细胞，测定T细胞所产生的细胞因子。另外，作为测定T细胞对肽呈递细胞杀伤活性的方法，可用⁵¹Cr标记肽呈递细胞的方法(国际癌症学杂志， 58：317(1994))。这里作为识别的T细胞，优选CTL。

本发明的DNA可作为医药的有效成分使用。即给肿瘤患者施用含以本发明的DNA作有效成分的医药，如施用本发明的DNA来治疗或预防肿瘤。施用本发明的DNA时，细胞内的肿瘤抗原蛋白质高表达，肿瘤抗原肽与MHC-I类抗原结合，高密度地呈递在细胞表面，这使得肿瘤特异性CTL在体内高效率增殖，由此可达到治疗或预防肿瘤的目的。施用本发明的DNA导入细胞内的方法，可用病毒载体来实现或用其它方法(日经科学1994年4月号，20-45页，月刊药事， 36(1)，23-48(1994)，实验医学增刊， 12(15)，(1994)，和这里引用的文献等)，每一种方法均可适用。

应用病毒载体的方法可例举将本发明的DNA整合、导入到逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、肝炎病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、仙台病毒等DNA病毒或RNA病毒的方法。其中特别优选应用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或牛痘病毒的方法。

作为其它方法可例举将表达质粒直接注射到肌肉内的方法(DNA疫苗)、脂质体法，脂转染法、微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，特别优选DNA疫苗法、脂质体法。

为了使本发明的DNA实际上起到医药作用，可用体内法，将DNA直接导入体内，或用体外方法，从人体收集某种细胞，体外将DNA导入该细胞，将该细胞重输入体内(日经科学，1994年4月号，20-45页，月刊药事， 36(1)，23-48(1994)，实验医学增刊， 12(15)，(1994)，和这里引用的文献等)。优选体内法。

用体内方法施与的时候，要根据治疗的疾病、症状等选择适宜的施用路径。例如可通过静脉、动脉、皮下、皮内、肌内施用。当体内法施用的时候，如可用溶液等剂型，但一般选用包含有效成分本发明DNA的注射剂，必要时，可加常用的载体。另外，当本发明的DNA包含在脂质体或膜融合的脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)中时，可用悬浮剂、冻结剂、离心浓缩的冻结剂等脂质体剂型。

制剂中本发明DNA的含量要根据治疗的疾病类型、患者的年龄、体重等作适宜的调整，通常为0.0001mg～100mg，优选0.001mg～10mg，优选数日-数月施用本发明的DNA1次。

此外应用本发明的DNA，利用重组DNA技术可大量制备肿瘤抗原蛋白质。

可参照前述Molecular Cloning等多种出版物和文献的方法，通过表达本发明的DNA产生肿瘤抗原蛋白质。将控制转录的启动子序列(如trp、lac、T7、SV 40早期启动子)等控制基因加到所表达DNA的上游，插入到适当的载体(如pSV-SPORT 1等)中，就能制备出能在宿主细胞内复制、发挥功能的表达质粒。然后，将表达质粒导入适当的宿主细胞中获得转化体。作为宿主细胞可例举大肠杆菌等原核生物，酵母样的单细胞真核生物，昆虫、动物等多细胞真核生物的细胞等。另外作为向宿主细胞内导入基因的方法可有磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电脉冲法等。在适宜的培养基上培养转化体可产生目的蛋白质。可用一般的生化学方法来分离、纯化如上所得到的肿瘤抗原蛋白质。

本说明书中所讲，本发明的肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解所产生的“与MHC-I类抗原结合的、在结合位点能被T细胞所识别的肽片段”即“肿瘤抗原肽”可如下进行确定。

首先，利用PCR、核酸外切酶、限制性酶等制备出各种大小的编码肿瘤抗原蛋白质的DNA片段，之后插入到上述的表达载体中，与包含编码呈递肿瘤抗原的MHC-I类抗原的基因的质粒一起转染不表达肿瘤抗原蛋白质的细胞(例如COS等细胞)中进行瞬时表达，根据CTL的反应性来限定包含肿瘤抗原肽的区域。其后，合成该区域内的各种肽，导入到表达呈递肿瘤抗原的MHC-I类抗原但不表达肿瘤抗原蛋白质的细胞中，通过检测CTL的反应性来鉴定肿瘤抗原肽(实验医学杂志， 176：1453，1992，实验医学杂志， 179(24)759，1994)。

另外，已断明与HLA-A1，-A0201，-A0205，-A11，-A24，-A31，-A6801，-B7，-B8，-B2705，-B37，-Cw 0401，-Cw 0602等MHC型结合的呈递抗原肽序列的规律性(基元序列)，参照它们可从编码肿瘤抗原蛋白质的DNA可筛选候选的肿瘤抗原肽，可用与上面相同的方法合成，确认该肽(欧洲免疫学杂志， 24：759，1994；实验医学杂志， 180：347，1994)。

但是，已知MHC除存在I类抗原外还存在II类抗原，MHC-II类抗原与由巨噬细胞等抗原呈递细胞摄取、分解肿瘤抗原蛋白质所生成的特定的肿瘤抗原肽形成的复合体能活化肿瘤特异的辅助性T细胞(免疫学杂志， 146：1708-1714，1991)。

与本发明的新型肿瘤抗原蛋白质基因的克隆成功相伴，本发明还可确定与上述MHC-II类抗原相结合的肿瘤抗原肽。具体而言，与MHC-I类抗原的情况相同，可用根据与T细胞反应性进行的抗原肽确定法，或根据与抗原肽的基元序列相关的已知信息来进行确定。

这样所确定的肿瘤抗原肽可用肽化学中所讲的常用的已知方法进行制备。如可用“肽合成”，Interscience，New York，1966；“蛋白质”，Vol.2，Academic Press Inc.，New York，1976；“肽合成”丸善(株)，1975；“肽合成”的基础实验“丸善(株)，1985年所记述的方法。即，可根据C末端的结构选择液相法或固相法进行合成，而优选液相法。也就是说肽的制备是这样的，用适当的保护基对氨基酸中的官能团进行适宜的保护和脱保护，用一个残基或数个残基连结氨基酸。前述的肽化学中记载的书籍中描述了氨基酸官能团的保护基。

本说明书中肿瘤抗原肽可定义为由含有序列号1中所示氨基酸序列的蛋白质，或者由已定义了的其变异蛋白质中任何一种而得到的肽片段。虽然以下对由序列号1中氨基酸序列所示的蛋白质而来的肿瘤抗原肽和其衍生物进行了具体地说明，但应理解为该说明亦适用于由变异蛋白质而来的肿瘤抗原肽。

虽然对序列号1中所示蛋白质的细胞内分解所得的肿瘤抗原肽没有特定的限制，但可例举含有序列号1中氨基酸序列第749位～第757位、第736位～第744位、第785位～第793位，第690位～第698位氨基酸序列的全部或一部分的肿瘤抗原肽。优选由9个氨基酸残基所形成的肽，例如尤其优选由序列号1中的第749位～第757位，第736位～第744位，第785位～第793位，第690位～第698位的氨基酸序列所组成的肽。本说明书中表示肿瘤抗原肽的时候，如表示由序列号1中的第749位～第757位的氨基酸序列所组成的肽时，可简单地略作“749～757”。

本说明书中“肿瘤抗原肽的衍生物”是指与前述的肿瘤抗原肽功能上有同等特性、该肽中的一部分氨基酸残基发生置换、缺失或添加了的衍生物，以及该肽或该肽的一部分氨基酸残基发生置换、缺失或添加了的衍生物的氨基酸或羟基经过修饰了的衍生物。具体而言，这样衍生物的实例为含有序列号1中氨基酸序列的第749位～第757位，第736位～第744位，第785位～第793位或第690位～第698位氨基酸序列的全部或一部分的本发明的肿瘤抗原肽中，第749位～第757位，第736位～第744位，第785位～第793位或第690位～第698位的氨基酸序列中的一部分氨基酸残基发生置换、缺失、而增加了其它的氨基酸残基。

该肽中一部分氨基酸残基发生置换、缺失、添加所形成的衍生物中，优选肿瘤抗原肽仍保留与CTL结合相关的表位区，而与MHC-I类抗原结合相关的氨基酸残基发生置换、缺失或添加了的衍生物，更优选其衍生物中只有一个氨基酸残基发生置换的(免疫学， 84：298-303，1995)。有这样的报道，黑色素瘤肿瘤抗原蛋白质中的gp100抗原肽，其与MHC-I类抗原结合部位的氨基酸发生置换，结果形成与MHC-I类抗原更强的结合力，且体外刺激黑色素瘤患者的末梢血淋巴球时，能更强地诱导抗原肽特异的CTL(免疫学杂志， 157：2539～2548，1996)。

用市售的肽合成仪可容易地合成衍生物，合成的衍生物与MHC-I类抗原结合的亲和性，可利用该衍生物与放射性同位素标记的标准肽与MHC-I类抗原结合的竞争性抑制方法，在无细胞系中容易地测定(RT.Kubo等，免疫学杂志， 152：3913，1994)。因此，将制备的各种肽衍生物提供给这种方法，就很容易地筛选出具有CTL诱导活性的肽衍生物。由于这种所筛选出的肽衍生物继续维持与CTL的结合性，与MHC-I类抗原有较强的结合力，所以更适宜作为有用的肿瘤抗原肽。

作为氨基的修饰基团可例举酰基，具体地讲可例举1-6个碳原子的链烷酰基，由苯基取代了的1-6个碳原子的链烷酰基，由5-7个碳原子的环烷基取代了的羰基，1-6个碳原子的烷基磺酰基，苯基磺酰基等。

作为羧基的修饰基可例举酯基和酰胺基，酯基的具体例为1-6个碳原子的烷酯基，由苯基所取代的0-6个碳原子的烷酯基，5-7个碳原子的环烷酯基，酰胺基的具体例为被1-6个碳原子的一个或两个烷基所取代的酰胺基，苯基取代了的碳原子数为0-6的1个或2个烷基取代了的氨基，形成5-7元环包括以酰胺氮作环的成员的氮杂环链烷。

本说明书中的“抗体”可用Antibodies；A Laboratory Manual，Lane，H.D.等编，Cold Spring Harber Laboratory Press出版NewYork 1989中描述的方法容易地制备。即，用常规方法，用肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原肽免疫适宜的动物，由此可容易地制备识别肿瘤抗原蛋白质、肿瘤抗原肽的抗体、甚至中和其活性的抗体。这些抗体可用于亲和层析、cDNA文库的筛选、免疫学诊断或医药的制备。免疫学诊断方法可从免疫印迹法、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELSA)、荧光或发光测定法等中进行适当的选择。

本说明书中“具有与序列号2中碱基序列组成的DNA的编码序列或5′非编码序列中的片段DNA互补的碱基序列、由8个以上的碱基所组成的DNA或与其相对应的RNA”是指双链DNA的反义链的DNA或与反义链DNA和对应的RNA，包括8个以上的碱基(以下称作反义寡核苷酸)。

该反义寡核苷酸，可以以编码本发明肿瘤抗原蛋白质基因的碱基序列为基础来制备DNA，或沿反义走向将该DNA导入表达质粒而制备RNA。

该反义寡核苷酸可以是与本发明基因中序列号2的碱基序列所组成的DNA的编码序列、5′非编码序列中任一部分的DNA片段互补的序列，但优选与转录起始部位、翻译起始部位、5′非翻译区、外显子和内含子的边界区或5′CAP区互补的序列。

上述“ DNA或该DNA相对应的RNA”的“化学修饰体”(以下称作反义寡核苷酸的化学修饰体)表示能使DNA或RNA向细胞内移行或在细胞内的稳定性增高的化学修饰体，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基磷酸三酯，烷基磷酸盐，或烷基磷酰胺的衍生物(“反义RNA和DNA”WILEY-LISS刊1992，P.1-50)。可参照同一文献中的方法来制备这些化学修饰体。

应用本发明的反义寡核苷酸或者其化学修饰体，可控制编码肿瘤抗原蛋白质的基因表达。当肿瘤抗原蛋白质的过量表达成为自身免疫性疾病的病因时，可用这种方法来减低肿瘤抗原蛋白质的生产量，由此可减轻CTL造成的伤害。并抑制CTL的增殖，这样就可用于自身免疫性疾病的治疗或预防。

当原样施用反义寡核苷酸或其化学修饰体的时候，该反义寡核苷酸的优选长度为8-200个碱基，更优选的为10-20个碱基，最优选12-25个碱基。

此外，将反义寡核苷酸插入表达质粒中时，其优选的长度为100个碱基以上，优选300-1000个碱基，更优选500-1000个碱基。

将反义寡核苷酸插入表达质粒后导入细胞的方法，可用实验医学，12卷，1994年中所述的方法，也可用利用脂质体和重组病毒的方法。用常规的表达载体，在启动子之后反向插入本发明的基因，以使本发明的基因从3′-5′转录，这样就可简单地制备反义寡核苷酸的表达质粒。

当施用反义寡核苷酸或其化学修饰体的时候，与稳定剂、缓冲液、溶剂等混合形成制剂后，可与抗生素、抗炎剂、麻醉药等同时施用。这里所制备的制剂可以各种方法施用。施用时优选每日或每隔数天或数周施用。此外，为了避免这样频繁使用，可制备缓释的小丸，埋在患处附近。或者用渗透泵在患处连续缓缓施用。通常将施用量调制成作用部位的浓度为0.1nM-10μM。

本发明的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽以及功能上具有同等特性的衍生物，可以单独应用或2种以上联合应用，为了有效地建立细胞免疫，含有以它们作有效成分的医药或与佐剂一起或以颗粒状剂型施用。即，当在生物体内施用肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽时，肿瘤抗原肽多密度呈递在抗原呈递细胞的MHC-I类抗原，肿瘤特异性的CTL有效地增殖。作为佐剂可应用文献(临床微生物学，综述， 7：277-289，1994)所描述的佐剂。此外，只要外源性抗原肽能很好地呈递给MHC-I类抗原，剂型可采用脂质体制剂、与直径为数个μm的珠子结合的粒状制剂，与脂类结合的制剂等。此外，还可考虑施用导入了肿瘤抗原肽的树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞和导入了编码肿瘤抗原蛋白质的DNA的细胞。制剂中本发明的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽的施与量可根据治疗的疾病、患者的年龄、体重等做适宜的调整，通常为0.0001mg～1000mg，优选0.001mg～1000mg，优选数日～数月施用1次。

用本发明的肿瘤抗原肽体外从末梢血淋巴球诱导CTL的方法如下。

体外培养从有上述扁平上皮癌的食道癌患者而来的末梢血淋巴细胞，向培养液中加入本发明的肿瘤抗原肽，如加入10μg/ml的有“736～744”、“749～757”、“785～793”、“690～698”的序列的肽，刺激末梢血淋巴球。1周的间隔中刺激3次。第3次刺激1周后，收集末梢血淋巴细胞，参照D.D.Kharkevitch等在国际癌症学杂志， 58：317(1994)中所记述的方法，通过测定细胞的杀伤活性来找出本发明的肿瘤抗原肽的CTL诱导活性。

本发明的肿瘤或自身免疫性疾病的诊断方法，可用与肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原肽特异性结合的抗体进行。如，从肿瘤组织标本中检测肿瘤抗原蛋白质的方法，从血液或组织中检测抗肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原蛋白质抗体存在的方法等。检测方法可以从免疫组化法、免疫印迹法、放免测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光或发光测定法中做适当选择。此外，用抗体来检测肿瘤抗原蛋白质可以使肿瘤早期发现或发现其复发，或者可以筛选适宜用肿瘤抗原蛋白质、肿瘤抗原肽或编码它们的DNA进行治疗的肿瘤患者。

附图简述

图1是表示实施例2中Northern印迹杂交和电泳图片。

图1a)中KE-4、KE-3、TE-8和TE-9表示食道癌细胞株，Kuma-1为头颈部癌细胞株、HSC-4为口腔癌细胞株，Bec-1为B细胞株，KMG-A为胆囊癌细胞株、R-27为乳癌细胞株，KIM-1、KYN-1及HAK-3为肝癌细胞株、M36及M37为黑色素瘤细胞株。

实施例

以下用本发明的某一特定实施例来对本发明进行更详细的说明，但本发明并不仅限于这些实施例。

参考例1

对食道癌细胞株的细胞毒性T细胞(CTL)株的建立

参照中尾等，癌症研究， 55：4248-4252(1995)所记录的方法，从患者的末梢血单核细胞建立针对按组织型分类属于扁平上皮癌的食道癌细胞株KE-4的CTL，命名为KE-4 CTL，在实验中使用。食道癌细胞株KE-4及KE-4 CTL存放于茨城县筑波市东1丁目1番3号，工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号分别为FERM BP-5955及FERM BP-5954(保藏日期，均为1997年5月23日)。此外，依照前面中尾等报道的方法，对KE-4的HLA-I类分子型进行了鉴定，结果为HLA-A2402、-A2601、-B54、-B60、-Cw1、-Cw3。

参考例2

HLA-A2601 cDNA及HLA-A2402 cDNA的制备

参照中尾等，癌症研究， 55：4248-4252(1995)中记载的方法，用KE-4，将HLA-A2601的cDNA参入到表达载体-pCR3(INVITROGEN)中制备重组质粒。另外用同样的方法制备HLA-A2402的重组质粒。

参考例3

制备KE-4来源的cDNA文库

用mRNA纯化系统(Pharmacia Biotech)，参照内附的实施方案，从KE-4分离总RNA，用oligo(dT)柱制备poly(A)⁺mRNA。用Superscript^TM Plasmid System(GIBCO)参照内附的实施方案，从mRNA制备两端联结了Not I衔接头和Sah I衔接头的cDNA，将该cDNA联结到表达载体质粒pSV-SPORT1(GIBCO BRL)的限制性酶NotI及SalI的酶切部位，获得重组质粒。用Gene Pulser(Bio-Rad)，在25μF，2.5kV的条件下，通过电脉冲将该重组质粒导入大肠杆菌Electro MAX DH10B/p3^TM细胞(GIBCO BRL)，用含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基(1％细菌用胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，pH7.3)筛选导入了重组质粒的转化体。

参考例4

IFN-γ的定量

用酶免疫测定法(ELISA)进行IFN-γ的定量。抗人IFN-γ小鼠单克隆抗体作为固相抗体吸附于96孔微量板，用牛血清白蛋白封闭非特合特异性结合后，让检测品中的IFN-γ与抗体结合。然后与作为检测抗体的抗人IFN-γ兔多克隆抗体结合，再与碱性磷酸酶标记了的抗兔免疫球蛋白羊抗体结合后，以对硝基苯磷酸盐为显色底物进行反应，加入等量的1N NaOH终止反应后，测定吸光度(405nm)。将吸收值与标准IFN-γ所得的值进行比较从而进行定量。

实施例1

新型肿瘤抗原蛋白质基因的筛选

从参考例3所示的约100个转化体库中回收重组质粒DNA的方法如下。即向加入了含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基的96孔U形底微量板的每孔中加入100个转化体，培养后，部分培养物转移到另一个每孔加入了0.25ml TYGPN培养基(F.M.Ausubel等编，CURRENTPROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，Inc.)的96孔U形底微量板中，37℃培养48小时，冻存剩留在微量板中的LB培养基。用碱裂解法(F.M.Ausubel等编，CURRENTPROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，Inc.)在微量板中，由TYGPN培养基中培养的转化体制备重组质粒DNA。将用异丙醇沉淀回收的重组质粒DNA悬于含50μl 20ng/mlRNase的10mM Tris，1mM EDTA，pH7.4溶液中。

如下用脂转染法将KE-4cDNA的重组质粒和HLA-A 2601cDNA的重组质粒双重转染到丝维母细胞株VA.-13(理化学研究所细胞开发银行，Ann.Med.Exp.Biol.Fenn， 44：242-254，1996)。即，将VA-13细胞加入到96孔平底微量板中，每孔7000个，在100μl含10％FCS的RPMI 1600培养液中培养2天。用脂转染试剂(GIBCOBRL)，将大约100个转化体的KE-4cDNA重组质粒25μl与参考例2中所示的HLA-A 2601 cDNA的重组质粒10μl(20ng)和约稀释了35倍的脂转染试剂35μl的混合液70μl中的30μl加入VA-13细胞，进行双重转染。转染每准备2份。5小时后向转化体中加入200μl含10％FCS的培养液，再在37℃培养72小时，之后去除培养液，每孔加入10000个KE-4CTL，在含有10％FCS和25U/ml IL-2的100μl培养液中37℃培养24小时。回收培养液，用ELISA检测IFN-γ。

观测到4组产生大量IFN-γ，应用相应的冻存的形式KE-4 cDNA重组质粒的转化体约100个库进行如下筛选。即，将转化体铺到含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基上，获得集落每群的集落，共800个集落，按与上述同样的方法进行培养，以使每一个孔中有一种转化体，由此制备KE-4 cDNA的重组质粒DNA。再按上述同样的方法将KE-4cDNA的重组质粒与HLA-A 2601 cDNA的重组质粒双重转染给VA-13细胞，接着与KE-4 CTL一起混合培养，对KE-4 CTL反应所产生的培养液中的IFN-γ进行定量，筛选阳性质粒。通过这样操作筛选出KE-4cDNA重组质粒克隆，命名为6DI。对6DI由重复进行同样的步骤，用参考例4中的方法对KE-4 CTL产生的IFN-γ量进行定量。结果如下面表1中所示。

表1

KE-4 CTL产生的

靶细胞 IFN-γ量(pg/ml)

VA-13细胞 0

VA-13细胞+HLA-A2601 1.8

VA-13细胞+6DI 4.3

VA-13细胞+HLA-A2601+6DI 24.0

VA-13细胞+HLA-A0201¹⁾ 0.9

VA-13细胞+HLA-A0201+6DI¹⁾ 3.0

1)为了比较，转染也了同型HLA时的情况

(转染的DNA量，HLA-A2601，HLA-A0201为200ng，6DI为100ng时的数据)。

实施例2

用Northm杂交来分析肿瘤抗原蛋白质基因的表达

用RNAzol B(TEL-TEST，IM)从各种细胞株制备RNA。在甲酰胺、甲醛存在的条件下将5μg DNA变性，进行琼脂糖电泳后转到Hybond-N⁺尼龙膜(Amersham)上，固定。正常组织的RNA用市售的固定了mRNA的膜(CLONTECH)。用Multi Prime DNA标记系统(Amershsm)，用³²P标记实施例1中克隆的重组质粒6DI的插入序列部分，以制作DNA探针，按照众所周知的方法(中山等，生物实验详解卷2，基因分析的基础，p.148-151，秀润社，1995)与膜上的RNA进行杂交，之后进行放射自显影，检测出本发明肿瘤抗原蛋白质基因的mRNA。然后，将检测出该基因mRNA所用的膜在0.5％SDS溶液中煮沸，去掉探针后，用在细胞内恒定表达的β-肌动蛋白作探针，用同样的方法进行Northern杂交，检测出的mRNA作内部标准。结果如图1所示。从这一结果可以看出，本发明的肿瘤抗原蛋白质基因的mRNA在各种癌细胞及正常组织中广泛表达，全长约2.5kb(图1)。

实施例3

编码肿瘤抗原蛋白质的全长cDNA克隆的克隆和碱基序列的测定

将参考例3中所示KE-4由来的cDNA文库铺到含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基板中，获得集落后，接着厂家的说明将集落转移、固定到Hybond-N⁺尼龙膜(Amersham)上。使用实施例2中应用的相同6DI探针，在与实施例2相同的条件下进行杂交、放射自显影，筛选这样的集落。它含有参入了肿瘤抗原蛋白质基因cDNA的重组质粒的转化体。再从筛选出的多个集落中回收重组质粒，用限制性酶Not I和SalI处理后，通过琼脂电泳来确认插入的cDNA的长度。筛选出插入了约2.5kb cDNA的重组质粒，命名为K3。用DyeDeoxy TerminatorCycle Sequencing试剂盒(Perkin-Elmer 112)来测定质粒K3 cDNA部分的碱基序列。所测定出的碱基序列如序列表中序列号2所示。该cDNA的全长有2527个碱基对。由序列号2中的碱基序列所编码的氨基酸序列(800氨基酸)如序列号1所示。

分析的结果为，序列号2中的碱基序列与来源于黑色素瘤的已知肿瘤抗原蛋白质的基因无相同性，是不同的基因。使用WWW Entrez数据库，对序列号2中所记载的碱基序列进行了检索。结果表明本发明的碱基序列的一部分与由WashU-Merck EST Project解码、与登记在GENBANK的3种功能不详的基因序列Accession No.R89163、R62890、R00027有高达90％以上的相同性。No.R89163相当于序列1893-2267，R62890相当于序列2018-2389，R00027相当于2024-2510。但是由于这些序列从本发明碱基序列的起始密码子到3′碱基序列，所以不能测定其氨基酸序列。

确定了上述碱基序列后，将质粒K3导入大肠杆菌JM109，以制备含有本发明新型肿瘤抗原蛋白质cDNA的保藏用转化体大肠杆菌JM109(K3)。大肠杆菌JM 109(K3)存放于茨城县筑波市东1丁目1番3号，工业技术院生命工学工业技术研究所(保藏日：1997年5月22日；保藏号：FERM BP-5951)。

再对正常人组织(末梢血淋巴细胞)的cDNA文库(GIBCO BRL)进行与上述同样的筛选，筛选出插入了大约2.5kb cDNA重组质粒，测定该cDNA的碱基序列，发现除序列号2的碱基序列中的第812位(正常人组织中第812位为T)不同以外，其余均相同。由此提示含有编码本发明肿瘤抗原蛋白质基因的全长基因，在癌细胞和正常人组织中几乎表达同一基因。

然后，用与实施例1中相同的方法，将插入了新型肿瘤抗原蛋白质基因cDNA的重组质粒K3与插入了HLA-A2601 cDNA的重组质粒双重转染VA-13细胞，以该细胞作靶细胞，用参考例4中的方法对KE-4 CTL反应所产生的IPN-γ进行定量。结果如表2所示。

表2

KE-4 CTL产生的

靶细胞 IFN-γ量¹⁾(pg/ml)

VA-13细胞+HLA-A2601+K3 1439

VA-13细胞+HLA-A0201²⁾+K3 10

1)：数值为KE-4 CTL对转染了各型HLA的VA-13细胞产生反应所产生的IFN-γ量(背景)

2)：为了对比，转染不同型HLA的时候

(转染的DNA量：HLA-A2610)，，HLA-A0201为200mg，K3为100ng时的数据)。

实施例4

肿瘤抗原肽的鉴定

用Kilo-Sequence用的检测试剂盒(宝酒造)，按照厂家的说明，从实施例1中克隆的插入了新型肿瘤抗原蛋白质基因部分cDNA的重组质粒6DI制备各种长度肿瘤抗原蛋白质基因cDNA的质粒。将这些质粒导入大肠杆菌ElectroMAX DH10B/P3^TM细胞(GIBCO BRL)中，在琼脂培养基的平皿上培养，随机选择50个集落。从该集落中制备质粒DNA，通过电泳筛选出5个含有适当长度质粒的克隆。

按实施例1中的方法，将HLA-A2601 cDNA与上述的质粒DNA双重转染VA-13细胞，接着将该转化体与KE-4 CTL混合培养，参照参考例4中所讲的方法测定培养液中IFN-γ的含量。结果发现用缺失了序列号2中碱基序列第2253以后的质粒转染的转化体不能诱导KE-4CTL的IFN-γ诱导活性。由此预测具有序列号1中氨基酸序列约第739位以后的肽具有诱导KE-4CTL产生IFN-γ的活性。

从序列号1的氨基酸序列第730号以后每隔3个氨基酸合成21种连续10个氨基酸残基的肽。除将这些肽脉冲到转染了HLA-A2601cDNA的VA-13细胞，使抗原呈递以外，用与前面同样的方法测定培养液中IFN-γ的含量。结果表明，具有序列号1中“736-745”、“748-757”、“784-793”氨基酸序列的肽具有IFN-γ诱导活性。

为了从这3种肽中鉴定出有较强IFN-γ诱导活性的肽，合成N末端或C末端缺1个氨基酸的含9个氨基酸残基的肽，同样测定IFN-γ诱导活性，结果发现含有序列号1中“736-744”、“749-757”、“785～793”氨基酸序列的肽有较强的IFN-γ诱导活性。结果如表3所示。

表3

KE-4 CTL细胞产生

脉冲后的细胞肽的IFN-γ量(pg/m1)

VA-13/A2601¹⁾ “736～744” 203

VA-13/A0201²⁾ “736～744” 44

VA-13/A2601 “749～757” 183

VA-13/A0201 “749～757” 89

VA-13/A2601 “785～793” 394

VA-13/A0201 “785～793” 102

1)用HLA-A2601 cDNA转染VA-13细胞时

2)作为对照，用不同HLA-A0201 cDNA转染VA-13细胞

从表3可以看出这些肽起到肿瘤抗原肽的作用。

此外，已知由HLA分子结合、呈递的抗原肽序列有规律性(基元序列)。对于HLA-A24，已知由9个氨基酸残基所形成的肿瘤抗原肽的序列中有这样的基元序列，第2位为酪氨酸，第9位为异亮氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸(免疫遗传学， 41：178-228，1995)。

于是就可合成含有与上述基元序列相对应的序列号1中“690-698”的氨基酸序列的肽。然后用肽脉冲转染了HLA-A2402 cDNA的VA-13细胞，用与前面相同的方法检测KE-4 CTL的IFN-γ诱导活性。结果如表4所示。

表4

KE-4 CTL细胞产生

脉冲中后的细胞肽的IFN-γ量(pg/ml)

VA-13 “690～698” 153

VA-13/A2402¹⁾ “690～698” 269

VA-13/A0201²⁾ “690～698” 166

1)用HLA-A2402 cDNA转染VA-13细胞时

2)作为对照，用不同的HLA-A0201 cDNA转染VA-13细胞时。

从表4可以看出“690-698”的肽起到肿瘤抗原肽的功能。

实施例5

用肿瘤抗原肽从末梢血淋巴细胞诱导CTL

用实施例3中所示的肿瘤抗原肽体外刺激分离出KE-4的癌症患者的末梢血淋巴细胞，检测是否诱导抗原特异的CTL。使用的肿瘤抗原肽是前面在实施例3中所得到的有“736～744”、“749～757”、“690～698”序列的肽。用Ficoll法从上述癌症患者的末梢血分离淋巴细胞，将这样得到的冻存的末梢血淋巴细胞复苏，以大约每孔2×10⁶细胞移入24孔板中，在含有10％FCS和IL-2(100U/ml)的RPMI1640培养基中培养。向培养液中加入10μg/ml前面的肿瘤抗原肽刺激末梢血淋巴球。1周后，与强X线照射(50Gy)的约1×10⁵个末梢血淋巴细胞一起加入前面的肿瘤抗原肽10μg/ml，进行第2次刺激。再过1周后，重复进行第3次刺激。

对有“736-744”、“749-757”序列的肽进行第3次刺激1周后回收末梢血淋巴细胞，按照D.D.Kharkevitch等，国际癌症杂志，58：317(1994)所记载的方法检测细胞杀伤活性，其中以⁵¹Cr标记的KE-4以及HLA-A基因座为A2402和A2的食道癌细胞株KE-3作靶细胞。结果如表5所示。

表5

效应细胞靶细胞杀伤活性(％)

“736～744”刺激的末梢 KE-4 22.1

血淋巴细胞 KE-3 3.7

“749～757”刺激的末梢 KE-4 35.9

血淋巴细胞 KE-3 24.2

用有“736～744”序列的肽进行刺激时，KE-4被较强的杀伤，而阴性对照KE-3没有被杀伤，这表明KE-4能诱导特异的CTL。另外，用有“749～757”序列的肽进行刺激的时候，虽可以看到对KE-3有非特异性细胞杀伤活性，但对KE-4有更强的细胞杀伤活性，由此提示诱导了KE-4特异的CTL。

第3次刺激有“690～698”序列的肽以后，回收末梢血淋巴细胞，继续在含有10％FCS、50％AIM-V(GIBCO BRL)、IL-2(100U/ml)的RPMI 1640培养基中培养。其后，用与前面相同的方法，以⁵¹Cr标记的KE-4及VA-13细胞作靶细胞，测定细胞杀伤活性。另外从HLA-A基因型为A24纯分子的健康人末梢血分离淋巴细胞，用同样的方法，以⁵¹Cr标记的KE-4、及HLA-A基因型为A2601纯分子的肺癌细胞株QG-56细胞作靶细胞，测定细胞杀伤活性。结果如表6所示。

表6

效应细胞靶细胞杀伤活性(％)

用“690～698”刺激的癌症 KE-4 24.7

患者末梢血淋巴细胞 VA-13 13.8

用“690～698”刺激的健康 KE-4 17.7

人末梢血淋巴细胞 QG-56 11.5

用有“690-698”序列的肽刺激癌症患者末梢血淋巴细胞及健康人末梢血淋巴细胞、虽可看到对阴性对照VA 13细胞、QG 56细胞有非特异性细胞杀伤活性，但对KE-4有强的细胞杀伤活性。从以上结果提示可诱导KE-4特异的CTL。

发明的效果

应用本发明的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽可以提供活化抗肿瘤免疫的医药、治疗自身免疫性疾病的医药及含有编码肿瘤抗原蛋白质DNA的医药，可提供肿瘤或自身免疫性疾病的诊断方法。

序列表

序列号：1

序列长度：800

序列类型：氨基酸

拓扑学：线性

序列种类：肽

来源：

生物名：人(Homo sapiens)

组织种类：食道癌组织

序列特征：

特征的记号：肽

存在位置：1..800

特征鉴定方法：P

序列

Met Gly Ser Ser Lys Lys His Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ala Gly Thr

5 10 15

Thr Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Glu Gln Pro Pro Arg His

20 25 30

Arg Glu His Lys Lys His Lys His Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Glu Arg Arg Lys Arg Ser Arg Glu Arg Gly Gly Glu Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Arg Arg Gly Ala Glu Ala Glu Ala Arg Ser Ser Thr His Gly

65 70 75 80

Arg Glu Arg Ser Gln Ala Glu Pro Ser Glu Arg Arg Val Lys Arg Glu

85 90 95

Lys Arg Asp Asp Gly Tyr Glu Ala Ala Ala Ser Ser Lys Thr Ser Ser

100 105 110

Gly Asp Ala Ser Ser Leu Ser Ile Glu Glu Thr Asn Lys Leu Arg Ala

115 120 125

Lys Leu Gly Leu Lys Pro Leu GIu Val Asn Ala Ile Lys Lys Glu Ala

130 135 140

Gly Thr Lys Glu Glu Pro Val Thr Ala Asp Val Ile Asn Pro Met Ala

145 150 155 160

Leu Arg Gln Arg Glu Glu Leu Arg Glu Lys Leu Ala Ala Ala Lys Glu

165 170 175

Lys Arg Leu Leu Asn Gln Lys Leu Gly Lys Ile Lys Thr Leu Gly Glu

180 185 190

Asp Asp Pro Trp Leu Asp Asp Thr Ala Ala Trp Ile Glu Arg Ser Arg

195 200 205

Gln Leu Gln Lys Glu Lys Asp Leu Ala Glu Lys Arg Ala Lys Leu Leu

210 215 220

Glu Glu Met Asp Gln Glu Phe Gly Val Ser Thr Leu Val Glu Glu Glu

225 230 235 240

Phe Gly Gln Arg Arg Gln Asp Leu Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Gly

245 250 255

Leu Thr Val Glu His Ala Ile Asp Ser Phe Arg Glu Gly Glu Thr Met

260 265 270

Ile Leu Thr Leu Lys Asp Lys Gly Val Leu Gln Glu Glu Glu Asp Val

275 280 285

Leu Val Asn Val Asn Leu Val Asp Lys Glu Arg Ala Glu Lys Asn Val

290 295 300

Glu Leu Arg Lys Lys Lys Pro Asp Tyr Leu Pro Tyr Ala Glu Asp Glu

305 310 315 320

Ser Val Asp Asp Leu Ala Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ile Leu Ser Lys

325 330 335

Tyr Asp Glu Glu Leu Glu Gly Glu Arg Pro His Ser Phe Arg Leu Glu

340 345 350

Gln Gly Gly Thr Ala Asp Gly Leu Arg Glu Arg Glu Leu Glu Glu Ile

355 360 365

Arg Ala Lys Leu Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Ser Thr Val Gly Pro

370 375 380

Arg Leu Ala Ser Glu Tyr Leu Thr Pro Glu Glu Met Val Thr Phe Lys

385 390 395 400

Lys Thr Lys Arg Arg Val Lys Lys Ile Arg Lys Lys Glu Lys Glu Val

405 410 415

Val Val Arg Ala Asp Asp Leu Leu Pro Leu Gly Asp Gln Thr Gln Asp

420 425 430

Gly Asp Phe Gly Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gly Arg Arg Arg Val Ser

435 440 445

Glu Val Glu Glu Glu Lys Glu Pro Val Pro Gln Pro Leu Pro Ser Asp

450 455 460

Asp Thr Arg Val Glu Asn Met Asp Ile Ser Asp Glu Glu Glu Gly Gly

465 470 475 480

Ala Pro Pro Pro Gly Ser Pro Gln Val Leu Glu Glu Asp Glu Ala Glu

485 490 495

Leu Glu Leu Gln Lys Gln Leu Glu Lys Gly Arg Arg Leu Arg Gln Leu

500 505 510

Gln Gln Leu Gln Gln Leu Arg Asp Ser Gly Glu Lys Val Val Glu Ile

515 520 525

Val Lys Lys Leu Glu Ser Arg Gln Arg Gly Trp Glu Glu Asp Glu Asp

530 535 540

Pro Glu Arg Lys Gly Ala Ile Val Phe Asn Ala Thr Ser Glu Phe Cys

545 550 555 560

Arg Thr Leu Gly Glu Ile Pro Thr Tyr Gly Leu Ala Gly Asn Arg Glu

565 570 575

Glu Gln Glu Glu Leu Met Asp Phe Glu Arg Asp Glu Glu Arg Ser Ala

580 585 590

Asn Gly Gly Ser Glu Ser Asp Gly Glu Glu Asn Ile Gly Trp Ser Thr

595 600 605

Val Asn Leu Asp Glu Glu Lys Gln Gln Gln Asp Phe Ser Ala Ser Ser

610 615 620

Thr Thr Ile Leu Asp Glu Glu Pro Ile Val Asn Arg Gly Leu Ala Ala

625 630 635 640

Ala Leu Leu Leu Cys Gln Asn Lys Gly Leu Leu Glu Thr Thr Val Gln

645 650 655

Lys Val Ala Arg Val Lys Ala Pro Ash Lys Ser Leu Pro Ser Ala Val

660 665 670

Tyr Cys Ile Glu Asp Lys Met Ala Ile Asp Asp Lys Tyr Ser Arg Arg

675 680 685

Glu Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gln Asp Phe Lys Glu Lys Asp Gly Tyr

690 695 700

Lys Pro Asp Val Lys Ile Glu Tyr Val Asp Glu Thr Gly Arg Lys Leu

705 710 715 720

Thr Pro Lys Glu Ala Phe Arg Gln Leu Ser His Arg Phe His Gly Lys

725 730 735

Gly Ser Gly Lys Met Lys Thr Glu Arg Arg Met Lys Lys Leu Asp Glu

740 745 750

Glu Ala Leu Leu Lys Lys Met Ser Ser Ser Asp Thr Pro Leu Gly Thr

755 760 765

Val Ala Leu Leu Gln Glu Lys Gln Lys Ala Gln Lys Thr Pro Tyr Ile

770 775 780

Val Leu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Met Asn Ala Asn Thr Ile Thr Lys

785 790 795 800

序列号：2

序列的长度：2527

序列类型：核酸

链型：双链

拓扑学：线性

序列种类：cDNA至mRNA

假设序列：无

反义：无

起源

生物名：人(Homo sapiens)

组织的种类：食道癌组织

序列特征：

特征的表示记号：5′UTR

存在位置：1..38

特征鉴定方法：E

特征的表示记号：CDS

存在位置：39..2438

特征鉴定方法：E

特征的表示记号：3′UTR

存在位置：2439.2506

特征鉴定方法：E

特征的表示记号：polyA位点

存在位置：2507..2527

特征鉴定方法：E

序列

GGTTCGGCGG CAGCCGGGCT CGGAGTGGAC GTGCCACTAT GGGGTCGTCC AAGAAGCATC 60

GCGGAGAGAA GGAGGCGGCC GGGACGACGG CGGCGGCCGG CACCGGGGGT GCCACCGAGC 120

AGCCGCCGCG GCACCGGGAA CACAAAAAAC ACAAGCACCG GAGTGGCGGC AGTGGCGGTA 180

GCGGTGGCGA ACGACGGAAG CGGAGCCGGG AACGTGGGGG CGAGCGCGGG AGCGGGCGGC 240

GCGGGGCCGA AGCTGAGGCC CGGAGCAGCA CGCACGGGCG GGAGCGCAGC CAGGCAGAGC 300

CCTCCGAGCG GCGCGTGAAG CGGGAGAAGC GCGATGACGG CTACGAGGCC GCTGCCAGCT 360

CCAAAACTAG CTCAGGCGAT GCCTCCTCAC TCAGCATCGA GGAGACTAAC AAACTCCGGG 420

CAAAGTTGGG GCTGAAACCC TTGGAGGTTA ATGCCATCAA GAAGGAGGCG GGCACCAAGG 480

AGGAGCCCGT GACAGCTGAT GTCATCAACC CTATGGCCTT GCGACAGCGA GAGGAGCTGC 540

GGGAGAAGCT GGCGGCTGCC AAGGAGAAGC GCCTGCTGAA CCAAAAGCTG GGGAAGATAA 600

AGACCCTAGG AGAGGATGAC CCCTGGCTGG ACGACACTGC AGCCTGGATC GAGAGGAGCC 660

GGCAGCTGCA GAAGGAGAAG GACCTGGCAG AGAAGAGGGC CAAGTTACTG GAGGAGATGG 720

ACCAAGAGTT TGGTGTCAGC ACTCTGGTGG AGGAGGAGTT CGGGCAGAGG CGGCAGGACC 780

TGTACAGTGC CCGGGACCTG CAGGGCCTCA CCGTGGAGCA TGCCATTGAT TCCTTCCGAG 840

AAGGGGAGAC AATGATTCTT ACCCTCAAGG ACAAAGGCGT GCTGCAGGAG GAGGAGGACG 900

TGCTGGTGAA CGTGAACCTG GTGGATAAGG AGCGGGCAGA GAAAAATGTG GAGCTGCGGA 960

AGAAGAAGCC TGACTACCTG CCCTATGCCG AGGACGAGAG CGTGGACGAC CTGGCGCAGC 1020

AAAAACCTCG CTCTATCCTG TCCAAGTATG ACGAAGAGCT TGAAGGGGAG CGGCCACATT 1080

CCTTCCGCTT GGAGCAGGGC GGCACGGCTG ATGGCCTGCG GGAGCGGGAG CTGGAGGAGA 1140

TCCGGGCCAA GCTGCGGCTG CAGGCTCAGT CCCTGAGCAC AGTGGGGCCC CGGCTGGCCT 1200

CCGAATACCT CACGCCTGAG GAGATGGTGA CCTTTAAAAA GACCAAGCGG AGGGTGAAGA 1260

AAATCCGCAA GAAGGAGAAG GAGGTAGTAG TGCGGGCAGA TGACTTGCTG CCTCTCGGGG 1320

ACCAGACTCA GGATGGGGAC TTTGGTTCCA GACTGCGGGG ACGGGGTCGC CGCCGAGTGT 1380

CCGAAGTGGA GGAGGAGAAG GAGCCTGTGC CTCAGCCCCT GCCGTCGGAC GACACCCGAG 1440

TGGAGAACAT GGACATCAGT GATGAGGAGG AAGGTGGAGC TCCACCGCCG GGGTCCCCGC 1500

AGGTGCTGGA GGAGGACGAG GCGGAGCTGG AGCTGCAGAA GCAGCTGGAG AAGGGACGCC 1560

GGCTGCGACA GTTACAGCAG CTACAGCAGC TGCGAGACAG TGGCGAGAAG GTGGTGGAGA 1620

TTGTGAAGAA GCTGGAGTCT CGCCAGCGGG GCTGGGAGGA GGATGAGGAT CCCGAGCGGA 1680

AGGGGGCCAT CGTGTTCAAC GCCACGTCCG AGTTCTGCCG CACCTTGGGG GAGATCCCCA 1740

CCTACGGGCT GGCTGGCAAT CGCGAGGAGC AGGAGGAGCT CATGGACTTT GAACGGGATG 1800

AGGAGCGCTC AGCCAACGGT GGCTCCGAAT CTGACGGGGA GGAGAACATC GGCTGGAGCA 1860

CGGTGAACCT GGACGAGGAG AAGCAGCAGC AGGATTTCTC TGCTTCCTCC ACCACCATCC 1920

TGGACGAGGA ACCGATCGTG AATAGGGGGC TGGCAGCTGC CCTGCTCCTG TGTCAGAACA 1980

AAGGGCTGCT GGAGACCACA GTGCAGAAGG TGGCCCGGGT GAAGGCCCCC AACAAGTCGC 2040

TGCCCTCAGC CGTGTACTGC ATCGAGGATA AGATGGCCAT CGATGACAAG TACAGCCGGA 2100

GGGAGGAATA CCGAGGCTTC ACACAGGACT TCAAGGAGAA GGACGGCTAC AAACCCGACG 2160

TTAAGATCGA ATACGTGGAT GAGACGGGCC GGAAACTCAC ACCCAAGGAG GCTTTCCGGC 2220

AGCTGTCGCA CCGCTTCCAT GGCAAGGGCT CAGGCAAGAT GAAGACAGAG CGGCGGATGA 2280

AGAAGCTGGA CGAGGAGGCG CTCCTGAAGA AGATGAGCTC CAGCGACACG CCCCTGGGCA 2340

CCGTGGCCCT GCTCCAGGAG AAGCAGAAGG CTCAGAAGAC CCCCTACATC GTGCTCAGCG 2400

GCAGCGGCAA GAGCATGAAC GCGAACACCA TCACCAAGTG ACAGCGCCCT CCCGTAGTCG 2460

GCCCTGCCTC AACCTTCATA TTAAATAAAG CTCCCTCCTT ATTTTTAAAA AAAAAAAAAA 2520

AAAAAAA 2527

Claims

1.一种DNA，它编码具有序列号1中氨基酸序列的蛋白质。

2.包括序列号2中的碱基序列的DNA或在严格条件下与该DNA进行杂交的DNA变异体，而且该DNA及DNA变异体表达所产生的蛋白质，通过细胞内分解能产生与主要组织相容性复合体I类抗原相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段。

3.含有以权利要求1或2中DNA为有效成分的医药。

4.含有权利要求1或2中DNA的表达质粒。

5.用权利要求4的表达质粒转化所形成的转化体。

6.表达权利要求1或2中的DNA所产生的肿瘤抗原蛋白质。

7.含有以权利要求6中的肿瘤抗原蛋白质为有效成分的医药。

8.与权利要求6中的肿瘤抗原蛋白质特异性结合的抗体。

9.包括权利要求6的蛋白质的一部分的肿瘤抗原肽，该肿瘤抗原肽能与主要组织相容性复合体I类抗原结合而被T细胞所识别，其中该肿瘤抗原肽包括序列号1中氨基酸序列的第749位～第757位、第736位～第744位、第785位～第793位、或第690位～第698的氨基酸。

10.含有以权利要求9中的肿瘤抗原肽为有效成分的医药。

11.与权利要求9中的肿瘤抗原肽特异性结合的抗体。