CN1334873A - 新型肿瘤抗原蛋白art－1及其肿瘤抗原肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型肿瘤抗原蛋白、其基因、衍生自所述肿瘤抗原蛋白的肿瘤抗原肽、这些物质的衍生物、在体内或体外应用这些物质治疗、预防或诊断肿瘤。

Description

新型肿瘤抗原蛋白ART-1及其肿瘤抗原肽
技术领域
本发明涉及新型肿瘤抗原蛋白及其肿瘤抗原肽。更具体地讲，本发明涉及新型肿瘤抗原蛋白及其基因、衍生自所述肿瘤抗原蛋白的肿瘤抗原肽以及这些物质的衍生物，还涉及用于肿瘤的药物、预防剂或诊断剂，其中在体内或体外应用这样的肿瘤抗原蛋白、基因、肿瘤抗原肽或其衍生物。
技术背景
已知免疫系统尤其是T细胞在活的机体对肿瘤消除方面起着重要的作用。实际上在人肿瘤病灶中已经观察到对肿瘤细胞表现出细胞毒性效应的淋巴细胞的浸润(Arch.Surg.，126：200，1990)，而且已经比较容易地从黑素瘤分离到识别自身肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(例如，Immunol.Today，8：385，1987；J.Immunol.，138：989，1987；和Int.J.Cancer，52：52，1992)。此外，通过转移这样的CTL的黑素瘤的临床试验结果也表明T细胞在肿瘤消除中的重要性(J.Natl.Cancer.Inst.，86：1159，1994)。
虽然长期以来不了解CTL攻击自身肿瘤细胞的靶分子，但是免疫学和分子生物学的最新进展已经逐渐开始阐明这类靶分子。准确地说，已经发现CTL利用T细胞受体(TCR)识别称为肿瘤抗原肽的肽和主要组织相容性复合体I类抗原(MHCI类抗原，在人类称为HLA抗原)之间的复合体，由此攻击自身肿瘤细胞。
通过用在胞内合成蛋白的蛋白酶体在细胞中对肿瘤特异性蛋白即肿瘤抗原蛋白进行加工，产生肿瘤抗原肽。由此产生的肿瘤抗原肽在内质网中与MHCI类抗原(HLA抗原)结合而形成复合体，所述复合体被转运到细胞表面，作为抗原呈递。肿瘤特异性CTL识别作为抗原呈递的该复合物，并通过其细胞毒性作用或产生淋巴因子呈现抗肿瘤效应。因为这一系列作用的阐明，已经成为可能的是，通过在肿瘤患者体内应用作为所谓的癌症疫苗的肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽以增强肿瘤特异性CTL，来治疗肿瘤。
作为肿瘤抗原蛋白，T.Boon等于1991年首次鉴定了来自人黑素瘤细胞的命名为MAGE的蛋白(Science，254：1643，1991)。此后已经主要从黑素瘤细胞鉴定了数个另外的肿瘤抗原蛋白。已经鉴定的黑素瘤抗原的实例是黑素瘤蛋白，例如黑素细胞组织特异性蛋白gp100(J.Exp.Med.，179：1005，1994)、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：3515，1994)和酪氨酸酶(J.Exp.Med.，178：489，1993)；不仅在黑素瘤上表达、而且也在各种癌细胞和正常睾丸细胞上表达的MEGE相关蛋白(J.Exp.Med.，179：921，1994)；具有肿瘤特异性氨基酸突变的β-连环蛋白(J.Exp.Med，183：1185，1996)；和CDK4(Science，269：1281，1995)。也已经鉴定了非来自黑素瘤的肿瘤抗原蛋白，包括癌基因产物，例如HER2/neu(J.Exp.Med，181：2109，1995)和p53(变异体)(proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：14704，1996)；肿瘤标记，例如CEA(J.Natl.Cancer Inst.，87：982，1995)和PSA(J.Natl.CancerInst.，89：293，1997)；和病毒蛋白，例如HPV(J.Immunol.，154：5934，1995)和EBV(Int Immunol.，7：653，1995)。在发表的综述(例如Immunol.Today，18：267，1997；J.Exp.Med.，183：725，1996；和Curr.Opin.Immunol.，8：628，1996)中可找到关于这些物质的相似描述。
在应用肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽治疗或诊断肿瘤方面，重要的是鉴定出可以广泛应用于发生率比黑素瘤高得多的鳞状细胞癌如食管癌和肺癌的肿瘤抗原。在该方面，本发明人进行了从得自食管癌的鳞状细胞癌细胞克隆肿瘤抗原蛋白编码基因，并且首次从非黑素瘤的肿瘤细胞中鉴定出几种与HLA型为HLA-A24或HLA-A26的HLA抗原结合并且在其上呈递的肿瘤抗原肽(J.Exp.Med. 187：277，1998；国际专利公布号WO 97/46676)。
当这些肿瘤抗原肽在临床上实际应用时，必需利用与单个患者匹配的肿瘤抗原肽，可能理想的是应用两种或更多种不同肿瘤抗原肽，而非仅应用一种肽。也就是说，考虑到以下事实：所有癌细胞不是共同表达一种相同的肿瘤抗原，并且在单个癌细胞上呈递两种或更多种不同的肿瘤抗原肽，因此认为用两种或更多种不同的肿瘤抗原肽进行治疗更为有效。实际上，就黑素瘤而言，已经尝试了包含两种或更多种肽的混合制剂(cocktail fomulation)的开发，因为衍生自一种肿瘤抗原的一种肽不能表现出适当的效应(Int.J.Cancer，66：162，1996；和Int.J.Cancer，67：54，1996)。在这样的情况下，需要鉴定可以广泛应用于以更高发生率出现的表皮癌例如肺癌的新型肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽。
本发明的公开内容
本发明的目的是提供新型肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽。特别是，本发明的目的是提供新型肿瘤抗原蛋白及其基因、衍生自所述肿瘤抗原蛋白的肿瘤抗原肽和这些物质的衍生物、以及用于肿瘤的药物、预防剂或诊断剂，其中在体内或体外应用这样的肿瘤抗原蛋白、基因、肿瘤抗原肽或它们的衍生物。本发明的肿瘤抗原肽包括与HLA-A24结合并在其上呈递的肿瘤抗原肽，HLA-A24是由广泛的人受治疗者(例如约60％的日本人)携带的HLA抗原，并且因此它可以应用于许多患者。此外，可以应用所述肿瘤抗原肽治疗或预防各种各样的肿瘤，如表皮癌，例如肺癌、膀胱癌和骨肉瘤以及白血病，预期所述肿瘤抗原肽具有作为新型抗肿瘤药的用途。
为了获得新型肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽，本申请的发明人作了以下尝试。
首先，本发明人由得自肺癌患者的淋巴细胞建立了识别HLA-A24阳性或HLA-A2阳性的膀胱癌、肺癌、骨肉瘤或白血病细胞系的CTL系，将其命名为KG-CTL(保藏号为：FERM BP-6725)。
随后，本发明人由对上述KG-CTL有强反应的膀胱癌细胞系HT-1376，制备了一个cDNA文库，并且用一种来自所述文库的重组质粒和一种含HLA-A2402(一种类型的HLA-A24)cDNA的重组质粒双转染COS-7细胞。所产生的转染子用如上所述的KG-CTL处理，并且测量所产生的IFN-γ的量，以确定KG-CTL是否被活化。作为重复进行这种筛选的结果，本发明人最后成功地克隆了一种编码肿瘤抗原蛋白的基因。对该基因的测序揭示，编码所述肿瘤抗原蛋白的所述基因是一种新基因。本发明人将由所述基因编码的肿瘤抗原蛋白命名为“ART-1”(由T细胞-1识别的腺癌抗原(Adenocarcinoma antigenRecognized by T cells-1))。
此外，本发明人鉴定了存在于ART-1氨基酸序列中的与HLA-A24结合并在HLA-A24上呈递的肿瘤抗原肽部分，并且证明这种肽具有作为肿瘤抗原肽的活性。
在上述发现的基础上，完成了本发明。
因此，本发明涉及：
(1)编码蛋白或蛋白变异体的DNA，所述蛋白由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成，所述蛋白变异体由含有SEQ ID NO：1的一个或更多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列组成，前提是所述蛋白和蛋白变异体通过其胞内加工，产生能够与HLA抗原结合并且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽；
(2)由SEQ ID NO：2中所示碱基序列组成的DNA、在大肠杆菌JM109(3D9)(保藏号为FERMBP-6929)中携带的外源DNA、或在严格条件下与所述DNA杂交的DNA变异体，前提是由所述DNA或所述DNA变异体产生并且表达的蛋白通过其胞内加工，产生能够与HLA抗原结合并且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽；
(3)含有上述(1)或(2)的DNA的表达质粒；
(4)用上述(3)的表达质粒转化的转化子；
(5)产生重组蛋白的方法，所述方法包括培养上述(4)的转化子，并且回收所表达的重组蛋白；
(6)由上述(1)或(2)的DNA编码或通过上述(5)的方法产生的肿瘤抗原蛋白；
(7)包含作为有效成分的上述(1)或(2)的DNA或上述(6)的蛋白的药用组合物；
(8)用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的上述(1)或(2)的DNA或上述(6)的蛋白；
(9)一种肿瘤抗原肽或具有功能等同特性的其衍生物，所述肿瘤抗原肽是衍生自上述(6)的蛋白的部分肽，并且能够与HLA抗原结合且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽；
(10)上述(9)的肿瘤抗原肽或具有功能等同特性的其衍生物，其中所述HLA抗原是HLA-A24；
(11)上述(10)的肿瘤抗原肽或具有功能等同特性的其衍生物，所述肿瘤抗原肽包含选自SEQ ID NO：3-18的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列；
(12)上述(11)的肿瘤抗原肽或具有功能等同特性的其衍生物，所述肿瘤抗原肽包含选自SEQ ID NO：3-5的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列；
(13)上述(11)的肿瘤抗原肽衍生物，其包含选自SEQ ID NO：3-18的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列，其中位于位置2的氨基酸残基和/或C末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代；
(14)上述(13)的肿瘤抗原肽衍生物，其包含选自SEQ ID NO：3-5的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列，其中位于位置2的氨基酸残基和/或C末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代；
(15)上述(13)的肿瘤抗原肽衍生物，其包含选自SEQ ID NO：3-18的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列，其中位于位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端的氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代；
(16)权利要求14的肿瘤抗原肽衍生物，其包含选自SEQ ID NO：19-21的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列；
(17)用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的至少一种选自按照上述(9)-(16)中任一项的肿瘤抗原肽及其衍生物的物质；
(18)一种重组DNA，其包含至少一种编码按照上述(9)-(16)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA；
(19)通过表达上述(18)的重组DNA可获得的重组多肽；
(20)用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的上述(18)的重组DNA或上述(19)的重组多肽；
(21)与上述(6)的蛋白、以及按照上述(9)-(16)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物中的任一种特异性地结合的一种抗体；
(22)一种抗原呈递细胞，其中HLA抗原和按照上述(9)-(16)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体在从肿瘤患者中分离的具有抗原呈递能力的细胞表面上呈递；
(23)一种抗原呈递细胞，在所述抗原呈递细胞上呈递一种HLA抗原和一种肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体，通过让分离自肿瘤患者的具有抗原呈递能力的细胞掺入上述(1)或(2)的DNA、上述(6)的肿瘤抗原蛋白、上述(18)的重组DNA或上述(19)的重组多肽，可获得所述抗原呈递细胞；
(24)用于治疗肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的上述(22)或(23)的抗原呈递细胞；
(25)一种细胞毒性T淋巴细胞，其特异性地识别一种HLA抗原和按照上述(9)-(16)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体；
(26)一种细胞毒性T淋巴细胞，其特异性地识别一种HLA抗原和一种肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体，所述复合体在上述(22)或(23)的抗原呈递细胞上呈递；
(27)用于治疗肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的上述(25)或(26)的细胞毒性T淋巴细胞；
(28)肿瘤的诊断试剂，其包含按照上述(9)-(16)中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物、按照上述(6)的蛋白或上述(19)的重组多肽。
本发明的DNA编码新型肿瘤抗原蛋白，并且包括：编码由SEQ IDNO：1中所示氨基酸序列组成的蛋白、或由含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的一个或更多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列组成的蛋白变异体的DNA，前提是所述蛋白和蛋白变异体通过其胞内加工，产生能够与HLA抗原结合并且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽；或由SEQ ID NO：2中所示碱基序列组成的DNA、在大肠杆菌JM109(3D9)中携带的外源DNA、或在严格条件下与这些DNA杂交的DNA变异体，前提是由所述DNA和所述DNA变异体产生并且表达的蛋白通过其胞内加工，产生能够与HLA抗原结合并且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽。在下文，按照上述确立的顺序，进一步描述本发明的DNA。1)编码ART-1的DNA
在上述DNA中，“编码由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的蛋白的DNA”和“由SEQ ID NO：2中所示的碱基序列组成的DNA”是指编码本发明的来自人类的肿瘤抗原蛋白ART-1的DNA。所述DNA可以按照下文的实施例中描述的方法克隆。此外，通过用SEQ IDNO：2中所示碱基序列的合适部分作为杂交探针或PCR引物，筛选衍生自细胞系例如膀胱癌细胞系HT-1376(ATCC No.CRL1472)的cDNA文库，也可以克隆所述DNA。本领域技术人员例如按照Molecular Cloning第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，已经能够完成这样的克隆。
包含掺入作为外源DNA的上述ART-1 DNA的质粒的大肠杆菌JM109(3D9)，已经保藏于国立生命科学和人体技术研究所(1-1-3Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)(保藏号：FERM BP-6929，保藏日：1998年11月25日)(转为国际保藏的日期：1999年11月4日，保藏号：FERM BP-6929)。2)编码ART-1的修饰蛋白或其等位基因变异体的DNA
在上述DNA中，“编码由含有SEQID NO：1中所示氨基酸序列的一个或更多个氨基酸残基取代、缺失和/或添加的氨基酸序列组成的蛋白变异体的DNA”是指编码所谓修饰蛋白的DNA，所述修饰蛋白是人工制备的，或是例如存在于活体内的等位基因变异体的蛋白。待取代、缺失和/或添加的氨基酸残基数应该在能够按照众所周知的方法例如下文的定点诱变进行取代、缺失和/或添加的范围内。最好是1个至数打的氨基酸残基被取代、缺失和/或添加，更优选是1个至数个氨基酸残基被取代、缺失和/或添加。最好以不影响活性的保守氨基酸(其侧链具有相似特性)进行取代。
通过各种各样的方法，例如描述于Molecular Cloning：ALaboratory Manual第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述的定点诱变和PCR技术，可以制备编码这种蛋白变异体的DNA。3)在严格条件下与ART-1DNA杂交的DNA
在上述DNA中，“严格条件下与由SEQ ID NO：2中所示碱基序列组成的DNA或在大肠杆菌JM109(3D9)中携带的外源DNA杂交的DNA变异体”是指在严格条件下与如上所述的人ART-1cDNA、包括来自所有脊椎动物(例如大鼠和小鼠)的ART-1DNA杂交的DNA。此外，那些变异体包括与如上所述人ART-1 DNA的同一性为60％或以上、70％或以上、80％或以上或90％或以上、并且在严格条件下与人ART-1DNA杂交的DNA。
在该方面，术语“严格条件”是指这样的条件，所述条件使得杂交于42℃在含有6xSSC(20xSSC代表333mM柠檬酸钠、333mMNaCl)、0.5％SDS和50％甲酰胺的溶液中进行，然后杂交的产物在0.1xSSC、0.5％SDS的溶液中于68℃下洗涤；或者是指在Nakayama等，Bio-Jikken-Illustrated，第2卷，“Idenshi-kaiseki-No-Kiso(A Basis forGene Analysis)”，第148-151页，Shujunsha，1995中描述的条件。
通过各种方法，例如与SEQ ID NO：2中所示DNA杂交，克隆所述DNA变异体。用于所述方法的具体步骤例如产生cDNA文库、杂交、选择阳性菌落和测定碱基序列是众所周知，并且可以如上所述查阅Molecular Cloning来进行。可用于杂交的探针包括包含SEQ ID NO：2中所述碱基序列的DNA或在大肠杆菌JM109(3D9)中携带的外源DNA。
在上述1)-3)中描述的DNA中，有能力产生能够与HLA抗原结合并且被CTL识别、并且衍生自通过所述DNA表达而产生并且经过胞内加工的蛋白的肿瘤抗原肽的DNA，构成了编码本发明的肿瘤抗原肽的DNA，即本发明的DNA。特别是，本发明的DNA是产生诸如这样的肽片段的DNA：通过所述DNA表达而产生的蛋白的氨基酸序列的一部分组成的部分肽，所述肽能够与HLA抗原结合，并且当与所述HLA抗原结合以在所述细胞表面上呈递时，能够诱导来自对所述肽和所述HLA抗原之间的复合体特异性的CTL细胞毒性作用和细胞因子的产生。
在该方面，可以例如通过以下方法，达到确定候选DNA是否是编码肿瘤抗原蛋白的DNA。
首先，将含有候选DNA的一种表达质粒和含有编码HLA抗原的DNA的一种表达质粒双转染到得自非洲绿猴肾COS-7(ATCC CRL1651)或成纤维细胞VA-13(RJKEN CELL BANK，The Institute ofPhysical and Chemical Research)中。转染可以通过例如利用Lipofectamine试剂(GIBCO BRL)的脂质转染法来完成。随后，加入被限制于所用的特定HLA抗原的肿瘤反应性CTL，以作用于所述转染子，然后可以例如通过ELISA以确定所述候选DNA是否是本发明的DNA，测定所述CTL对所述转染子应答所产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量。由于ART-1含有HLA-A24限制的肿瘤抗原肽部分，因此HLA-A24cDNA(Cancer Res.，55：4248-4252(1995)；Genbank登录号M64740)可以用作上述编码所述HLA抗原的DNA，而由人外周血淋巴细胞制备的那些CTL以及HLA-A24限制的CTL例如KG-CTL(FERM-6725)可以用作上述CTL。
测定如上所述活性的具体实例进一步描述于下文的实施例2中。
如上所述的本发明的DNA可以用作药物或药用组合物中的有效成分。根据包含本发明的DNA作为有效成分的“药用组合物”，将本发明的DNA给予肿瘤患者，使得治疗肿瘤或预防肿瘤成为可能。
通过按照下述方法将掺入表达载体中的本发明的DNA给予肿瘤患者，所述肿瘤抗原蛋白在抗原呈递细胞上高表达。随后通过胞内加工产生的肿瘤抗原肽与HLA抗原结合，形成复合体，并且所述复合体被密集地呈递在抗原呈递细胞表面上。因此，对所述复合体特异性的CTL有效地在机体内增殖，并且破坏肿瘤细胞。这样，达到肿瘤的治疗或肿瘤增生和转移的预防。
将本发明的DNA给予和引入细胞中，可以利用病毒载体或按照任何一种其它方法(Nikkei-Science，1994年4月，第20-45页；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994和其中引用的参考文献)来完成。
利用病毒载体的方法的实例包括这样的方法，其中将本发明的DNA掺入DNA或RNA病毒中，所述病毒例如为反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒或新培斯病毒，并且将所述病毒引入细胞中。在这些方法中，尤其优选利用反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒或痘苗病毒的那些方法。
其它方法包括其中直接肌内注射表达质粒的那些方法、脂质体法、脂质转染法、微注射、磷酸钙法和电穿孔，尤其优选DNA接种和脂质体法。
为了在实践中让本发明的DNA作为药物起作用，使用其中将DNA直接引入机体内的体内法和其中将DNA体外引入已经从人体取出的某些细胞中、并且将所述细胞再导入所述机体中的离体方法(Nikkei-Science，1994年4月，第20-45页；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikkenn-Igaku-Zokan，12(15)，1994和其中引用的参考文献)。更优选体内法。
就体内法而言，可以根据待治疗的疾病和症状以及其它因素，通过任何合适的途径给予所述DNA。例如，可以通过静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌内途径或类似的途径给予所述DNA。就体内法而言，可以以不同的剂型例如溶液给予所述组合物，通常将所述组合物配制为例如含有本发明的DNA作为有效成分的注射液形式，必要时所述制剂可以含有常规载体。如果本发明的DNA包括在脂质体或膜融合脂质体(例如仙台病毒(HVJ)-脂质体)中，则所述组合物可以为脂质体制剂，例如悬浮剂、冷冻药物、离心浓缩的冷冻药物等形式。
虽然在这类制剂中本发明DNA的量可以随待治疗的疾病、患者年龄和体重等而变化，但通常每几天至每几个月给予0.0001mg-100mg、优选0.001mg-10mg本发明的DNA。
在本发明中，术语“蛋白”是指由上述本发明的各种各样的DNA编码的蛋白，所述蛋白有能力作为肿瘤抗原蛋白，以通过胞内加工产生能够与HLA抗原结合并且被CTL识别的肿瘤抗原肽。所述蛋白的具体实例包括由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的ART-1。采用如上所述的本发明的DNA，可以大规模地产生本发明的蛋白。
可以按照许多出版物和例如上述“Molecular Cloning”的参考文献，完成通过表达本发明的DNA产生肿瘤抗原蛋白。特别是，通过将本发明的DNA插入合适的表达载体(例如pSV-SPORT1，pCR3)中，构建一种表达质粒。随后，将所述表达质粒导入合适的宿主细胞中，以获得转化子。宿主细胞的实例包括原核细胞例如大肠杆菌、单细胞真核生物例如酵母和多细胞真核生物例如昆虫或动物的细胞。将表达质粒转移至宿主细胞中可以通过常规方法来完成，所述常规方法例如磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电脉冲法、脂质转染法等。通过按照常规方法在合适的培养基中培养所述转化子，产生所需的蛋白。由此获得的肿瘤抗原蛋白可以按照标准的生物化学方法进行分离和纯化。
如上所述，通过在细胞中表达本发明的DNA以产生本发明的蛋白，并且确定通过胞内加工所述蛋白所产生的肽片段是否具有作为肿瘤抗原肽的活性，可以证明如上所述制备的本发明的肿瘤抗原蛋白是否具有某一活性。在利用所述肿瘤抗原蛋白本身的情况下，可以通过让所述蛋白加入到吞噬细胞例如巨噬细胞中，以在细胞中产生肽片段，然后使CTL与所述肽片段和所述HLA抗原之间的复合体接触，继之以测量由所述CRL对所述复合体应答而产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量，可以完成所述活性的测定。
如上所述的本发明的蛋白也可以用作药物或药用组合物中的有效成分。根据包含本发明的蛋白作为有效成分的“药用组合物”，给予本发明的蛋白使得例如治疗或预防肿瘤成为可能。当给予肿瘤患者时，将本发明的蛋白引入抗原呈递细胞中。随后通过胞内加工产生的肿瘤抗原肽与HLA抗原结合而形成复合体，并且所述复合体呈递在所述细胞表面上。对所述复合体特异性的CTL在机体内有效的增殖，并且破坏肿瘤细胞。这样，完成肿瘤的治疗或对肿瘤增生和转移的预防。
包含本发明的肿瘤抗原蛋白的药用组合物可以与佐剂一起给予，以便有效地建立细胞免疫，或可以以特定剂型给予。对于这种目的，可应用文献中(Clin.Microbil.Rev，7：277-289，1994)中描述的那些佐剂。另外，脂质体制剂、其中将所述组分结合于直径为几个μm的珠粒的颗粒状制剂、或其中将所述组分连接于脂质的制剂也是可以接受的。可以通过例如皮内、皮下或通过静脉注射完成给予。虽然在这类制剂中本发明肿瘤抗原蛋白的量可以随待治疗的疾病、患者年龄和体重等而适当地变化，但通常每几天至每几个月给予0.0001mg-1000mg、优选0.001mg-100mg、更优选0.01mg-10mg本发明的肿瘤抗原蛋白。
在本发明中，术语“肿瘤抗原肽”是指由本发明的肿瘤抗原蛋白的一部分组成并且能够与HLA抗原结合且被CTL识别的部分肽。因此，任何肽无论其长度或在本发明的氨基酸序列中的位置如何，只要所述肽由本发明的氨基酸序列的一部分组成、并且所述肽和HLA抗原之间的复合体能够被CTL识别，则所有都属于本发明肿瘤抗原肽的范围。通过合成由本发明的肿瘤抗原蛋白的一部分组成的候选肽，并且进行测定以确定所述候选肽和HLA抗原之间的复合体是否被CTL识别，换句话说，确定所述候选肽是否具有作为肿瘤抗原肽的活性，可以鉴定本发明的这种肿瘤抗原肽。
在该方面，可以按照肽化学中常用的方法，进行肽的合成。这类已知方法的实例是描述于包括以下的文献中的方法：“PeptideSynthesis”，Interscience，New York，1966；“The Proteins”，第2卷，Academic Press Inc.，New York，1976；“Pepuchido-Gosei”，MaruzenCo.Ltd.，1975；“Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn”，Mamzen Co.Ltd.，1985；和“Iyakuhin-no-Kaihatu，Zoku，第14卷，Peputido-Gosei”，Hirokawa Shoten，1991。
接下来，下面进一步描述用于鉴定本发明的肿瘤抗原肽的方法。
已经知道与以下HLA类型结合并且在该类型上呈递的抗原肽的相应序列规律(基序)：HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602(参见例如Immunogenetics，41：178，1995)。例如关于HLA-A24的基序，已知在由8-11个氨基酸组成的肽序列中，位置2的氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，而C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸(J.Immunol.，152：3913，1994；Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4307，1994)。同样，示于以下表1中的基序已知是HLA-A2的基序(Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4749，1995)。表1
            从N末端起第2位的
HLA-A2的类型    氨基酸    C末端的氨基酸
HLA-A0201        L，M        V，L
HLA-A0204        L              L
HLA-A0205        V，L，I，M     L
HLA-A0206        V，Q        V，L
HLA-A0207        L              L(所述肽的长度为8-11个氨基酸)
最近，均可以用NIH BIMAS的软件进一步在互联网(http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)上检索到预期能够与HLA抗原结合的任何肽序列。
通过分析与不同HLA分子结合的抗原肽，已经表明所述肽的长度通常长约8个至约14个氨基酸，虽然对于HLA-DR、-DP和-DQ也观察到长度为14个或更多个氨基酸的抗原肽(Immunogenetics，41：178，1995)。
根据本发明蛋白的氨基酸序列，容易选择参与这种基序的肽部分。通过检查肿瘤抗原蛋白ART-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，可以容易地选择参与上述基序结构的这种肽部分。此外，通过如上所述在互联网上检索，可以容易地选择预期能够与HLA抗原结合的任何序列。通过合成按照上述方法如此选择的候选肽。并且进行测定以确定所述候选肽和HLA抗原之间的复合体是否被CTL识别，换句话说，确定候选肽是否具有作为肿瘤抗原肽的活性，可以鉴定本发明的肿瘤抗原肽。
用于鉴定本发明的肿瘤抗原肽的方法的一个具体实例是描述于J.Immunol.，154：2257，1995中的方法。具体地说，从预期呈递所述候选肽的HLA抗原类型阳性的人分离外周血淋巴细胞，并且在体外通过加入所述候选肽进行刺激。如果所述候选物诱导特异性地识别用所述候选肽脉冲处理的HLA-抗原呈递细胞的CTL，则表明所述特定候选肽可以作为肿瘤抗原肽起作用。在该方面，例如可以通过用例如ELISA法测量由CTL对所述抗原呈递肽细胞应答而产生的不同细胞因子(例如IFN-γ)的量，可以检测CTL诱导是否存在。另一方面，其中测量CTL对用51Cr标记的抗原肽呈递细胞的细胞毒性的方法(51Cr释放测定，Int.J.Cancer，58：317，1994)，也可以用于这种检测。
此外，可以如下完成所述检测。将预期呈递所述候选肽的表达HLA抗原类型的cDNA的表达质粒，掺入例如COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)或VA-13细胞(RIKEN CELL BANK，TheInstitute ofPhysicaland Chemical Research)，用所述候选肽脉冲处理所得到的细胞。然后，使所述细胞与限制于预期呈递上述所述候选肽的HLA抗原类型的CTL反应，并且测定由所述CTL产生的不同细胞因子(例如IFN-γ)的量(J.Exp.Med，187：277，1998)。
在下文的实施例8和实施例9中进一步描述所述检测的具体实例。
ART-1含有HLA-A24限制的肿瘤抗原肽部分。在HLA-A24限制的肿瘤抗原肽的情况下，肿瘤抗原肽的检测可以通过采用HLA-A24cDNA(CancerRes.，55：4248-4252，1995，Genbank登录号M64740)作为编码上述HLA抗原的cDNA，和采用例如KG-CTL(FERMBP-6725)的CTL和通过如上述所述CTL一样的肽刺激人外周血淋巴细胞而制备的CTL，可以完成对肿瘤抗原肽的检测。
在如HLA-A26的其中未阐明相关肽基序情况下，用于鉴定的方法不同于其中已经阐明了所述序列规律(基序)的上述情况。在这种情况下，本发明的肿瘤抗原肽可以例如按照WO 97/46676中描述的方法进行鉴定，前提是可得到识别HLA-A26和一种肿瘤抗原肽之间的复合体的CTL系。
用于鉴定上述肿瘤抗原肽的方法在下文可以统称为“肿瘤抗原肽的测定方法”。
如上所述，已知与HLA-A24结合并在其上呈递的肿瘤抗原肽的序列服从一定的规律(基序)，特别是，所述基序是：在由8-11个氨基酸组成的肽序列中，位置2的氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，而C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸(J.Immunol.，152：3913，1994；Immunogenetics，41：第178页，1995；J.Immunol.，155：第4307页，1994)。如上所述，可以用NIHBIMAS软件(http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)进一步在互联网上检索预期能够与HLA抗原结合的序列。
因此，本发明的HLA-A24限制的肿瘤抗原肽的实例为部分肽参与在SEQ ID NO：1中所示的ART-1氨基酸序列中这种基序结构或预期能够与所示HLA结合的结构、并且能够与HLA-A24抗原结合且被CTL识别的那些肿瘤抗原肽。
上述HLA-A24限制的肿瘤抗原肽的具体实例包括包含SEQ IDNO：3-18的任一个中所示的全部或部分氨基酸序列、并且能够与HLA-A24抗原结合且被CTL识别的那些肿瘤抗原肽。具体地说，实例是：1)由SEQ ID NO：3-18的任一个中所示氨基酸序列组成的肽，和2)包含SEQ ID NO：3-18的任一个中所示氨基酸序列的全长或一个连续部分、并且与所述氨基酸序列相比在N末端方向和/或C末端方向延伸的肽、或由SEQ ID NO：3-18的任一个中所示氨基酸序列的一个连续部分组成的肽，所述肽能够与所述HLA-A24抗原结合并且被CTL识别。鉴于上述2)中的肽与所述HLA-A24抗原结合并由其呈递的事实，上述2)中的肽的长度可以约为8-11个氨基酸。“一个连续的部分”包括与所述HLA抗原结合的部分，因此最好是不影响所述基序的一个结构。
本发明的HLA-A24限制的肿瘤抗原肽的合适实例包括包含SEQID NO：3-5的任一个中所示的全部或部分氨基酸序列、并且能够与HLA-A24抗原结合且被CTL识别的那些肿瘤抗原肽。具体地说，实例是：1)由SEQ ID NO：3-5的任一个中所示氨基酸序列组成的肽，和2)包含SEQ ID NO：3-5的任一个中所示氨基酸序列的全长或一个连续部分、并且与所述氨基酸序列相比在N末端方向和/或C末端方向延伸的肽、或由SEQ ID NO：3-5的任一个中所示氨基酸序列的一个连续部分组成的肽，所述肽能够与所述HLA-A24抗原结合并且被CTL识别。
在本发明中，术语“具有与肿瘤抗原肽功能等同的特性的衍生物”(下文简称为肿瘤抗原肽衍生物)是指改变的肽，其氨基酸序列含有本发明的肿瘤抗原肽的氨基酸序列的一个或更多个、最好是一个至数个氨基酸残基的改变，并且所述改变的肽具有作为肿瘤抗原肽的特性，即能够与HLA抗原结合并且被CTL识别。因此，所有肿瘤抗原肽衍生物只要它们含有本发明的肿瘤抗原肽氨基酸序列的一个或更多个氨基酸残基的改变，并且具有作为肿瘤抗原肽的特性，即能够与HLA抗原结合并且被CTL识别，则都属于本发明的肿瘤抗原肽范围。
在该方面，氨基酸残基的“改变”是指氨基酸残基的取代、缺失和/或添加(包括将氨基酸添加至所肽的N末端和/或C末端)，最好是氨基酸残基的取代。对于涉及氨基酸残基取代的改变，虽然只要保留作为肿瘤抗原肽的活性，待取代的氨基酸残基的数目和位置可以任意确定，但鉴于如上所述肿瘤抗原肽的长度通常约为8个至约14个氨基酸的事实，最好是一个至数个残基被取代。
本发明的肿瘤抗原肽衍生物的优选长度为约8个至约14个氨基酸，与上述肿瘤抗原肽类似，虽然对于HLA-DR、-DP和-DQ而言长14个或更多个氨基酸的衍生物是可以接受的。
通过按照上述肽的制备法，合成含有本发明肿瘤抗原肽的一部分改变的改变的肽，并且进行上述用于肿瘤抗原肽的测定，可以鉴定本发明的这种肿瘤抗原肽衍生物。
如上所述，已经阐明了与HLA类型结合并在其呈递的肽的序列规律(基序)，所述HLA类型例如为HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602。如上所述，可以进一步在互联网(http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)上检索到预期能够与HLA抗原结合的肽序列。因此，可以在这类基序的基础上，制备在本发明的肿瘤抗原肽中含有氨基酸改变的肿瘤抗原肽衍生物。
例如，关于与HLA-A24结合并在其上呈递的抗原肽的基序，如上所述已知在由8-11个氨基酸组成的肽序列中，位置2的氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，而C末端的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸(J.Immunol.，152：3913，1994；Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4307，1994)。同样，以上表1中所示的基序已知是HLA-A2的基序。另外，在互联网(http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)上公开了预期能够与HLA抗原结合的肽序列，其特性类似于按照所述基序的氨基酸的特性的氨基酸残基也是可以接受的。因此，本发明的肿瘤抗原肽衍生物的实例包括那些肽衍生物，所述肽衍生物包含本发明的肿瘤抗原肽的全部或部分氨基酸序列，其中在按照所述基序(对于HLA-A24和HLA-A2，为位置2和C末端)允许取代的任何位置的一个或更多个氨基酸残基被其它氨基酸(最好是，所述氨基酸是如上所述根据互联网预期能够与所述抗原结合的那些氨基酸)取代，并且所述衍生物具有与HLA抗原结合且被CTL识别的活性。优选的实例是那些肿瘤抗原肽衍生物，所述肿瘤抗原肽衍生物包含其中在上述位置从根据上述基序的氨基酸残基的选择的氨基酸残基被取代的氨基酸序列的全部或部分，并且所述衍生物具有上述活性。氨基酸序列的“全部或部分”的优选长度为约8个至约14个包括改变残基的氨基酸，虽然对于HLA-DR、-DP和-DQ而言，长度可以是14个或更多个氨基酸。“部分”包括将与所述HLA抗原结合的部分。
HLA-A24限制的肿瘤抗原肽衍生物的实例包括那些肽衍生物，所述肽衍生物包含衍生自ART-1氨基酸序列、并且具有HLA-A24的结合基序的肽的氨基酸序列的全部或部分，其中按照上述基序允许取代的位置上(具体地说是位置2和/或C末端)的一个或更多个氨基酸残基被其它氨基酸残基(最好是，所述氨基酸是如上所述根据互联网预期能够与所述抗原结合的氨基酸)取代，并且所述衍生物具有上述活性。优选的实例是包含其中位置2和/或C末端氨基酸残基被按照上述基序所涉及的氨基酸残基取代的氨基酸序列的全部或部分、并且具有上述活性的那些肿瘤抗原肽衍生物。这类HLA-A24限制的肿瘤抗原肽衍生物的“全部或部分”的优选长度为约8个至约11个包含所述改变残基的氨基酸。
特别是，实例是包含SEQ ID NO：3-18的任一个中所示氨基酸序列的全部或部分的那些肿瘤抗原肽衍生物，其中位置2和/或C末端的氨基酸残基被其它氨基酸残基(最好是，所述氨基酸是如上所述根据互联网预期能够与所述抗原结合的氨基酸)取代，并且所述衍生物具有上述活性。优选的实例是包含SEQ ID NO：3-18的任一个中所示氨基酸序列的全部或部分的那些肿瘤抗原肽衍生物，其中位置2和/或C末端的氨基酸残基被根据上述基序所涉及的氨基酸残基取代，并且所述衍生物具有上述活性。具体地说，HLA-A24限制的肿瘤抗原肽衍生物的实例是包含SEQ ID NO：3-18的任一个中所示氨基酸序列的全部或部分的那些肿瘤抗原肽衍生物，其中位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代，并且所述衍生物具有上述活性。更特别的实例包括由SEQ ID NO：3-18的任一个中所示氨基酸序列组成的那些肿瘤抗原肽衍生物，其中位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代，并且所述衍生物具有上述活性。
本发明的HLA-A24限制的肿瘤抗原肽衍生物的合适的实例是包含SEQ ID NO：3-5的任一个中所示氨基酸序列的全部或部分的那些肿瘤抗原肽衍生物，其中位置2和/或C末端的氨基酸残基被其它氨基酸残基(最好是，所述氨基酸是如上所述根据互联网预期能够与所述抗原结合的氨基酸)取代，并且所述衍生物具有上述活性。更优选的实例是包含SEQ ID NO：3-5的任一个中所示氨基酸序列的全部或部分的那些肿瘤抗原肽衍生物，其中位置2的氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代，并且所述衍生物具有上述活性。这样的肿瘤抗原肽衍生物的合适的实例示于SEQ ID NO：19-21。
本发明的一种肿瘤抗原肽或其衍生物可以单独地或与其它一种或更多种本发明肿瘤抗原肽或其衍生物一起，用作治疗或预防肿瘤的药用组合物。
对于肿瘤治疗或预防的目的，具体地说，将至少一种本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物或者两种或更多种本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的组合、必要时与其它肿瘤抗原肽一起，给予患者。当将包含作为一种有效成分的本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的用于治疗或预防肿瘤的药用组合物给予ART-1阳性患者时，所述肿瘤抗原肽或其衍生物与一种HLA抗原一起在抗原呈递细胞上呈递，对所呈递的HLA抗原复合体特异性的CTL增殖，并且破坏所述肿瘤细胞。作为结果，所述药用组合物使得能够治疗患者的肿瘤，或预防肿瘤的增生或转移。ART-1广泛地在表皮癌例如肺癌上表达，因此，按照本发明的用于治疗或预防肿瘤的药用组合物在广泛应用性方面是有利的。包含作为一种有效成分的本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物、用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，也可以通过与常规化疗或放疗应用结合，达到增加的治疗效果。
包含作为一种有效成分的本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物、用于治疗或预防肿瘤的组合物，可以与一种佐剂一起给予，以便有效地建立细胞免疫，或可以以特定的剂型给予。对于这样的目的，可应用文献(Clin.Microbiol.Rev.，7：277-289，1994)中描述的那些佐剂。另外，脂质体制剂、其中将所述组分结合于直径为几个μm的珠粒的颗粒状制剂、或其中将所述组分连接于脂质的制剂也是可以接受的。可以通过例如皮内、皮下或通过静脉注射完成给予。虽然在所述制剂中本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的给予量可以根据例如待治疗的疾病、特定患者年龄和体重适当地进行调节，但通常每几天至每几个月给予0.0001mg-1000mg、优选0.001mg-100mg、更优选0.01mg-10mg本发明的肿瘤抗原蛋白。
此外，含有至少一种编码本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA的重组DNA、或含有至少一种编码通过所述重组DNA的表达获得的重组多肽的重组DNA，也可以作为有效成分包含按照在本发明的用于治疗或预防肿瘤的药用组合物中，以下提供其详细描述。
在该方面，术语“重组DNA”是指编码部分多肽、由本发明的肿瘤抗原蛋白一部分组成的部分肽、其衍生物、其中组合这样的肽的异地同型(polytope)等的DNA。所有的DNA只要它们含有至少一种编码本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA，则属于本发明的重组DNA范围内。这样的重组DNA可以掺入合适的表达载体中，以使得在用于治疗或预防肿瘤的药用组合物中包含一种有效成分。
术语“异地同型”是指许多CTL表位的混合肽，最近已经将编码这样的异地同型的DNA用于DNA疫苗接种。参见例如J.ofImmunology，160，第1717页，1998。通过将一种或更多种编码本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA相互连接，如有需要，将其与编码其它肿瘤抗原肽的DNA连接，可以制备编码本发明的异地同型的DNA。
按照典型的DNA合成法或基因工程方法，例如按照标准的教科书，例如“Molecular Cloning”，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)的描述，可以容易地制备本发明的重组DNA。也可以按照上述标准教科书等，将这种重组DNA掺入表达载体中。
按照例如上述用于测定本发明的DNA的活性的方法，可以完成确定如上制备的本发明的重组DNA是否可以产生能够与HLA抗原结合并且被CTL识别的肿瘤抗原肽。同样，使用本发明的重组DNA作为药物或预防剂的方法，可以按照用于本发明的DNA的方法。
如上所述，通过本发明的重组DNA的表达可获得的“重组多肽”也可以用于治疗或预防肿瘤的药用组合物。
可以以类似于上述的本发明的蛋白的方式，制备本发明的重组多肽。同样，可以按照类似于用于本发明的蛋白的方式，可以完成关于如上制备的本发明的重组多肽是否具有某一活性的确定。此外，使用本发明的重组多肽作为药物或预防剂的方法，可以按照用于本发明的蛋白或肽的上述方法。
本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白、其DNA、或本发明的重组DNA或重组多肽可以如下在体外用于治疗肿瘤患者。
关于肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白、或其DNA在治疗肿瘤中的应用，重要的是建立可以有效地诱导患者体内的特异性CTL的给药方法。作为一种手段，本发明提供一种抗原呈递细胞，其中一种HLA抗原和一种本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体在分离自肿瘤患者的具有抗原呈递能力的细胞表面上呈递，也提供一种用于治疗肿瘤的药用组合物，所述药用组合物包含所述抗原呈递细胞作为有效成分。
在该方面，“具有抗原呈递能力的细胞”不限于特定的细胞，只要它是在其细胞表面上表达一种允许呈递本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的HLA抗原，最好是据报道尤其具有高抗原呈递能力的树突细胞。
要加入以由上述具有抗原呈递能力的细胞制备本发明的抗原呈递细胞的物质，可以是本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物、以及本发明的DNA、蛋白、重组DNA或重组多肽。当以蛋白或DNA形式使用时，必需将其掺入细胞中。
为了制备本发明的抗原呈递细胞，从肿瘤患者分离出具有抗原呈递能力的细胞，并且用本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或重组多肽进行离体脉冲处理，以呈递一种HLA抗原和所述肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体(Cancer Immunol.Immunother，46：82，1998；J.Immunol.158：第1796页，1997；CancerRes.，59：1184，1999)。当使用树突细胞时，例如通过用Ficoll法从肿瘤患者分离出来外周血的淋巴细胞，然后除去非贴壁细胞，并在GM-CSF和IL-4存在下温育贴壁细胞，以诱导树突细胞，并且与一种本发明的肿瘤抗原肽或肿瘤抗原蛋白一起温育并脉冲处理所述树突细胞，可以制备本发明的抗原呈递细胞。
当通过将本发明的DNA或重组DNA引入上述具有抗原呈递能力的细胞中，制备本发明的抗原呈递细胞时，所述基因可以是DNA或RNA形式。特别是，可以查询例如Cancer Res.，56：5672，1996或J.Immunol.，161：第5607页，1998来使用DNA，可以查询例如J.Exp.Med.，184：第465页，1996来使用RNA。
包含上述抗原呈递细胞作为有效成分的用于治疗肿瘤的药用组合物，最好含有生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、培养基或类似物质，以稳定地保持所抗原呈递细胞。它可以例如通过静脉内、皮下或皮内给予。通过将这种包含抗原呈递细胞作为有效成分的用于治疗肿瘤的组合物再引入所述患者体内，在所述ART-1日性患者中有效诱导特异性CTL，以便达到治疗肿瘤。所述HLA类型需要在所述患者和所用的肽之间匹配，使得HLA-A24限制的肿瘤抗原肽或其衍生物必需用于HLA-A24阳性肿瘤患者，这应该是确然无疑的。
另外，按照本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白、其DNA、重组DNA或重组多肽在以下继承性免疫疗法中的体外应用，可以作为其用途的另一实施例提供。
已经观察到，继承性免疫疗法达到了黑素瘤的治疗效果，其中大量离体培养取自所述患者自身的肿瘤浸润T细胞，然后将其回输给所述患者(J.Natl.Cancer.Inst.86：1159，1994)。同样，通过用肿瘤抗原肽TRP-2在体外刺激脾细胞，由此使对所述肿瘤抗原肽特异性的CTL增殖，然后将所述CTL给予到移植黑素瘤的小鼠体内，已经在小鼠黑素瘤中观察到对转移的抑制(J.Exp.Med.，185：453，1997)。这是特异性地识别抗原呈递细胞的一种HLA抗原和所肿瘤抗原肽之间的复合体的CTL体外增殖的结果。因此，认为用于治疗肿瘤的方法是有用的，所述方法包括用按照本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或其DNA在体外刺激来自患者的外周血淋巴细胞，以使肿瘤特异性CTL增殖，随后将所述CTL回输到所述患者体内。
因此，本发明提供特异性地识别所述HLA抗原和所述肿瘤抗原肽或其衍生物之间复合体的CTL，也提供包含所述CTL作为有效成分的用于治疗肿瘤的药用组合物。这样的组合物最好含有生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、培养基等，以稳定地维持CTL。它可以例如通过静脉内、皮下或皮内给予。通过将包含CTL作为有效成分的用于治疗肿瘤的所述组合物回输到所述患者体内，针对所述肿瘤细胞的CTL的毒性效应在ART-1阳性患者中得到增强，并且因此破坏所述肿瘤细胞，以达到所述肿瘤的治疗。
本发明也提供与本发明的蛋白、本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物特异性地结合的抗体。例如按照“Antibodies：A Laboratory Manual”，Lane，H.D.等编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989中描述的方法，可容易地制备这样的抗体。具体地说，通过用所述肿瘤抗原肽或其衍生物以通常的方式适当地免疫动物，可以容易地制备识别本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体以及中和它们的活性的其它抗体。这样的抗体可以用于亲和色谱、免疫诊断等。
为了进行如上所述的免疫诊断，如有必要首先将以上制备的抗体适当地标记，测定在取自疑有肿瘤的患者的样品(例如血液或肿瘤组织)中抗原的存在，因此达到诊断肿瘤是否存在。通过免疫印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光测定或发光测定等，可以进行特异性的诊断。
按照本发明的肿瘤抗原肽、其衍生物、肿瘤抗原蛋白或其重组多肽也可以用作诊断肿瘤的诊断试剂的一种有效成分。具体地说，通过用按照本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物本身作为诊断试剂，以检测得自疑有肿瘤的患者的样品(例如血液或肿瘤组织)中抗体的存在，对于肿瘤的早期检测以及肿瘤复发和转移的诊断是可以做到的。同样的方法也可以用于选择可以用包含例如本发明的肿瘤抗原肽作为有效成分的药物治疗的肿瘤患者。特别是，可以用免疫印迹法、RIA、ELISA、荧光测定或发光测定等，可以进行这样的诊断。
此外，最近几年，已经建立了一种新的检测方法，用于采用所述抗原肽和一种HLA抗原之间的复合体检测抗原特异性CTL(Science，274：94，1996)。通过在上述检测方法中，用按照本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物和HLA抗原之间的复合体，由此检测肿瘤抗原特异性CTL，可能做到肿瘤的早期检测以及复发或转移的诊断。同样的方法也可以用来选择可以用包含例如本发明的肿瘤抗原肽作为有效成分的药物治疗的肿瘤患者，或用来测定所述药物的治疗效应。因此，本发明也提供肿瘤的诊断试剂，所述诊断试剂包含一种按照本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物。
特别是，通过制备按照文献中描述的方法(Science，274：94，1996)荧光标记的HLA抗原和肿瘤抗原肽之间复合体的四聚体，并且利用流式细胞仪用其定量测定疑有肿瘤的患者的外周血淋巴细胞中所述抗原特异性的CTL，可以进行这样的诊断。
按照本发明的编码肿瘤抗原肽的DNA、肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原肽或其衍生物、呈递所述肿瘤抗原肽或其衍生物的抗原呈递细胞、识别所述肿瘤抗原肽或其衍生物和HLA抗原之间的复合体的CTL等，也可以用作在本领域的研究方面有用的试剂。
实施本发明的最佳模式
通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明完全不受这些实施例的限制。
实施例1来自源于肺癌的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的建立
将取自肺癌患者的手术样品切成小块，然后在含胶原蛋白酶和DNA酶的培养液中搅拌以悬浮细胞。用Ficoll Conray溶液将细胞悬浮液离心以分离淋巴细胞。在24孔板在补充100 U/ml白介素-2和0.1mM NEAA(GIBCO BRL)、由45％RPMI-1640、45％AIM-V(GIBCOBRL)和10％FCS组成的培养基(下文称为淋巴细胞培养基)中培养所述淋巴细胞。在培养的前2天中，将抗CD3抗体NU-T3(NichireiCorporation)以1μg/ml加入培养基中。培养继续进行超过30天，建立了与某些种类的HLA-A24或HLA-A2阳性癌细胞系反应的CTL系。所建立的CTL系命名为KG-CTL，用于随后的步骤中。通过将所述癌细胞系以1×104接种到96孔板中，在第2天加入1×105/孔的KG-CTL，将所述CTL再培养18小时，然后测定在回收的培养基中由KG-CTL产生的干扰素-γ(IFN-γ)的量，来检测KG-CTL对每种癌细胞系的反应性。通过酶免疫测定(ELISA)进行IFN-γ的测定。具体地说，将抗人IFN-γ小鼠单克隆抗体吸附至96孔板上，作为固相抗体，在用牛血清白蛋白封闭非特异性结合后，让所述抗体与上述样品中的IFN-γ结合。然后让作为检测抗体的抗人IFN-γ兔多克隆抗体结合，在与用碱性磷酸酶(Amersham)标记的抗兔免疫球蛋白山羊抗体结合后，用过氧化物酶发色试剂盒T(Sumitomo Bakelite)使所述发色团显色，然后于405nm下测量吸光度。将所述吸光度与用标准IFN-γ获得的吸光度进行比较，以确定该样品中IFN-γ的量。表2代表KG-CTL与不同腺癌细胞系的反应性，而表3代表KG-CTL与淋巴样细胞系的反应性。表2
                     KG-CTL产生的癌细胞系                IFN-γ的量(pg/ml)    HLA-A型HT-1376(膀胱癌细胞系)        4608           2402/24021-87(肺癌细胞系)              194           0207/110111-18(肺癌细胞系)            4632           0201/2402PC-9(肺癌细胞系)             1102           0206/2402LC-1(肺癌细胞系)              129           3101/3302YT-803(肺癌细胞系)            285           3101/3302143B(骨肉瘤细胞系)           1547           0211/0211无(仅KG-CTL)                  100               -表3
                     KG-CTL产生的细胞系                IFN-γ的量(pg/ml)      HLA-A型SSB(B细胞系1))              5769           2402/2402Ban-B1(B细胞系1))             78           3101/3302HPB-MLT(白血病细胞系)         189           0101/0201MOLT-16(白血病细胞系)          13           2301/3002MT-2(白血病细胞系)           3495           2402/2402无(仅KG-CTL)                   0                -1)B细胞系得自用EB病毒转化的健康的受治疗者。
表2表明，KG-CTL与HLA-A2402阳性癌细胞(HT-1376、11-18、PC-9)强反应，产生IFN-γ，也与HLA-A2阳性癌细胞(143B)反应，产生IFN-γ。表3表明，KG-CTL与用EB病毒转化的HLA-A2402阳性B细胞以及与白血病细胞(SSB、MT-2)强反应，也与HLA-A2阳性白血病细胞(HPB-MLT)反应。
建立的KC-CTL保藏于工业技术院国立生命科学和人体技术研究所(1-1-3 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)(微生物命名：KG-CTL；保藏日：1998年6月19日；保藏号：FERM P-16854；于1999年5月20日转为国际保藏，保藏号：FERM BP-6725)。KG-CTL的HLA分子的分型(由Shionogi Co.Ltd.按照Nakao等，Cancer Res.，55：4248-4252(1995)的描述进行)表明，其A基因座是A0206和A2402。
实施例2肿瘤抗原蛋白的鉴定
按照以下步骤，由如实施例1所述与KG-CTL强反应的膀胱癌细胞系HT-1376(ATCC No.CRL1472)，制备cDNA文库。
首先，通过分离总RNA部分，并且用mRNA纯化系统(PharmaciaBiotech)按照生产商的方案，在Oligo(dT)柱上进行纯化，由HT-1376制备Poly(A)+mRNA。用SuperScript质粒系统(GIBCO BRL)，按照生产商的方案，由所述mRNA制备在每个末端连接有NotI和ScaI连接物的cDNA，然后将其连接到表达载体-质粒pSV-SPORT1(GIBCOBRL)的限制位点NotI和SalI中，产生重组质粒。在Gene Pulser(Bio-Rad)中，用电脉冲将所述重组质粒引入大肠杆菌ElectroMAXDH10BTM细胞(GIBCO BRL)中，在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基(1％细菌培养用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl，pH7.3)中选择其中已经引入所述重组质粒的转化子。
如下从约100个转化子的库(pool)中回收重组质粒DNA。将100个转化子引入96孔U形底的微量培养板的含有LB培养基加上氨苄青霉素(50μg/ml)的各孔中，并在其中培养。然后将部分培养物转移至每孔含有0.25ml TYGPN培养基(F.M.Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.)的另一96孔U形底微量培养板中，并于37℃培养48小时。将所述微量培养板上LB培养基中的剩余培养物冻藏。通过碱裂解法(F.M.Ausubel等，Current Protocolsin Molecuar Biology，John Wiley&Sons，Inc.)，在所述微量培养板中完成从在TYGPN培养基中培养转化子制备重组质粒DNA。将通过异丙醇沉淀回收的重组质粒DNA悬浮于含有20ng/ml RNA酶的50μl10mM Tris、1mM EDTA，pH7.4中。
另一方面，按照Nakao等，Cancer Res.，55：4248-4252(1995)的描述，由保藏于工业技术院国立生命科学和人体技术研究所(1-1-3Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)(保藏日：1997年5月23日；保藏号：FERM BP-5955)的食管癌细胞系KE-4，制备其中将HLA-A2402的cDNA掺入表达载体pCR3(INVITROGEN)的重组质粒。
随后，采用如下的脂质转染法，将HT-1376cDNA的重组质粒和HLA-A2402cDNA的重组质粒双转染到衍生自非洲绿猴肾的细胞系COS-7A(ATCC No.CRL1651)中。将8000个COS-7细胞置于96孔平底微量培养板的各孔中，在含有10％FCS的100μl RPMI1640培养基中培养1天。用Lipofectamine试剂(GIBCO BRL)，将由相当于约100个转化子的25μl HT-1376 cDNA的重组质粒、10μl(200 ng)HLA-A2402cDNA的重组质粒和35μl约50倍稀释的脂质转染试剂组成的混合物(70μl)的30μl部分，加入COS-7细胞中，使得对其进行双转染。转染子以一式两份制备。5小时后，将所述转染子与含有10％FCS的200μl培养基一起加入，再于37℃温育48小时。除去培养基后，将1.5×105 KG-CTL细胞加入每孔中，于37℃在含有10％FCS和25U/mlIL-2的100μl培养基中培养24小时。然后回收培养基，并且如实施例1中所述通过ELISA测量培养物中IFN-γ的量。
如下筛选对应于观察到高产IFN-γ的组的冻藏库的约100个含有HT-1376cDNA重组质粒的转化子。将所述转化子库平板接种到含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基上，以获得菌落。如上所述每组培养400个菌落，使得在每孔中包括单一种类的转化子，由此制备HT-1376cDNA的重组质粒DNA。按照相似的方式，用HT-1376cDNA的重组质粒和HLA-A2402cDNA的重组质粒双转染COS-7细胞，然后与KG-CTL共培养，并且定量测定由于KG-CTL反应而产生的IFN-γ，以便选择阳性质粒。在该方式，选择出一个HT-1376cDNA重组质粒克隆，将其命名为3D9。此外，用3D9重复一次相似的步骤，以测定由KG-CTL产生的IFN-γ的量。结果示于表4中。表4
                   由KG-CTL产生的细胞                   IFN-γ的量(pg/ml)COS-7+HLA-A2402             2152COS-7+HLA-A2402+3D9         2379
当与仅用HLA-A2402转染的COS-7相比时，KG-CTL与用HLA-A2402和3D9双转染的COS-7反应更强，产生更多的IFN-γ。该结果表明，由3D9编码的蛋白是一种肿瘤抗原蛋白。
实施例3肿瘤抗原蛋白基因的碱基序列的测定
用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)，测定如实施例2中获得的编码肿瘤抗原蛋白的质粒克隆3D9的碱基序列。如此测定的碱基序列(1171个碱基对)示于SEQ ID NO：2中，由该碱基序列编码的氨基酸序列(414个氨基酸)示于SEQ ID NO：1中。用WWW Entrez数据库将所述碱基序列和所述氨基酸序列与已知序列进行比较，表明质粒克隆3D9是一种新基因。由按照本发明的3D9编码的新型肿瘤抗原蛋白命名为ART-1(由T细胞-1识别的腺癌抗原)。
在测序后，制备大肠杆菌JM109(3D9)，这是包含新型肿瘤抗原蛋白ART-1的cDNA的用于贮藏的转化子。大肠杆菌JM109(3D9)已经保藏于国立生命科学和人体技术研究所(1-1-3 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)(微生物命名：大肠杆菌JM109(3D9)，保藏日：1998年11月25日；保藏号：FERM BP-6929)；将其转为国际保藏(转为国际保藏的日期：1999年11月4日，保藏号：FERM BP-6929)。
实施例4候选肽的选择
在应该由HLA抗原结合并呈递的抗原肽序列中有某些规律(基序)。关于HLA-A24的基序，已知在由8-11个氨基酸组成的肽序列中，位置2的氨基酸是酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，而C末端氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸(Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，152：3913，1994；J.Immunol.，155：4307，1994)。
根据所述基序，根据本发明的肿瘤抗原蛋白ART-1的氨基酸序列，选择由具有HLA-A24结合基序的8-11个肽组成的16种肽部分。那些16种选定的肽示于SEQ ID NO：3-18中。这些肽用以下所示的Fmoc法合成。
如下进行所述肽是否是肿瘤抗原肽的确定。按照文献(J.Exp.Med.，187：277，1998)，通过脂质转染法，用HLA-A2402cDNA的重组质粒转染1×104 COS-7细胞，以表达HLA-A2402。为了脉冲处理所述细胞，向这些细胞中，在2小时内，加上各为10μM的先前已经合成的具有HLA-A24结合基序的不同的肽。然后将所述细胞与2×104KG-CTL一起培养18小时，通过ELISA法测定在培养上清液中由KG-CTL产生的IFN-γ的量，由此鉴定肿瘤抗原肽。
在以下实施例中描述具有HLA-A24结合基序的肽的合成以及肿瘤抗原肽测定的具体实施例，这些实施例在三种肽上进行，即所述肽是在SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列中：包含位置170至位置179的序列(SEQ ID NO：3，下文可以将其称为“170-179”)的肽、包含位置188至位置196的序列(SEQ ID NO：4，下文可以将其称为“188-196”)的肽以及包含位置158至位置165的序列(SEQ ID NO：5，下文可以将其称为“158-165”)的肽。
实施例5Gly-Phe-Asp-Cys-Ala-Asn-Glu-Ser-Val-Leu(“170-179”，SEQ ID NO：3)的合成
用Fmoc-Leu-Alko树脂(0.57mmol/g，100-200目)作为树脂。用50mg该树脂，按照下述的方案1(表5)开始，顺序偶联以下残基：Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Gly-OH，开始所述合成。偶联后，将所述程序进行至方案1的步骤3，获得肽树脂。
向该肽树脂中，加入1ml试剂K(TFA中的5％苯酚、5％苯硫基甲烷、5％水和2.5％乙二硫醇的溶液)，让混合物于室温下反应2.5小时。用冰冷却后，向反应物中加入10ml乙醚，将混合物搅拌10分钟，过滤，用10ml乙醚洗涤。向滤饼中加入10ml乙酸水溶液，并且将混合物搅拌30分钟。然后将树脂过滤，用4ml乙酸水溶液洗涤。将滤液和洗涤液冻干后，将所获得的粗制肽溶于乙酸水溶液中，注射到已经用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填充材料YMC-PACK ODS-ASH-363-5柱(30φ×250mm)中。该柱用0.1％TFA水溶液洗涤，然后以7ml/min的流速进行洗脱，同时将乙腈的浓度在240分钟内增加最高至40％。以A220nm监测洗出液。将含有所需产物的流分混合在一起，将其冻干，获得15.4mg Gly-Phe-Asp-Cys-Ala-Asn-Glu-Ser-Val-Leu。
在采用以含有0.1％TFA、乙腈浓度为0-60％的线性梯度洗脱的反相填充材料YMC-PACK ODS-AM AM-303柱(4.6φ×250mm)的分析中，所获得的肽Gly-Phe-Asp-Cys-Ala-Asn-Glu-Ser-Val-Leu的保留时间为19.9分钟，所述产物的氨基酸分析结果(未检测到Cys)和质谱结果与理论值一致。
                    氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，24小时；
分析方法：茚三酮法；
*参比氨基酸；理论值示于括号内：
Asx：1.98(2)
Ser：0.78(1)
Glx：1.01(1)
Gly：0.99(1)
Ala：1.00(1)
*Val：1.00(1)
Leu：1.06(1)
Phe：1.01(1)
                     质谱(FAB)
      [M+H]+：1054
                     方案1表5步骤                          持续时间(min)×处理次数1.(洗涤)DMF 1.2ml                       1×22.(去保护)50％哌啶/DMF                  12×13.(洗涤)DMF 1.2ml                       1×74.(偶联)每个氨基受保护的氨基酸(5相当量(equivalent))/NMP溶液0.9ml，DIC(5相当量)/NMP溶液0.3ml                    30×15.(洗涤)DMF 1.2ml                       1×26.(偶联)每个氨基受保护的氨基酸(5相当量)/NMP溶液0.9ml，DIC(5相当量)/NMP溶液0.3ml                        30×17.(洗涤)DMF 1.2ml                       1×4
实施例6Glu-Tyr-Cys-Leu-Lys-Phe-Thr-Lys-Leu(“188-196”，SEQ ID NO：4)的合成
按照实施例5中所述方法的相似方式，用50mg Fmoc-Leu-Alko树脂(0.57mmol/g，100-200目)，顺序偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH，然后将产物去保护。将所获得的粗制肽溶于乙酸水溶液中。将所述溶液分为两个部分，每个部分用Sep-pak Vac(C18)纯化。具体地说，将每个部分注射到已经用0.1％TFA水溶液预平衡的柱体中。柱体用10ml 0.1％TFA水溶液洗涤3次，用10ml 0.1％TFA水溶液-乙腈(1∶1)洗脱3次。收集洗出液并将其冻干，获得37.5mg Glu-Tyr-Cys-Leu-Lys-Phe-Thr-Lys-Leu。
在采用以含有0.1％TFA、乙腈浓度为0-60％的线性梯度洗脱的反相填充材料YMC-PACK ODS-AM-303柱(4.6φ×250mm)的分析中，所获得的肽Glu-Tyr-Cys-Leu-Lys-Phe-Thr-Lys-Leu的保留时间为20.8分钟，所述产物的氨基酸分析结果(未检测到Cys)和质谱结果与理论值一致。
                   氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，24小时；
分析方法：茚三酮法；
*参比氨基酸；理论值示于括号内：
Thr：0.93(1)
Glx：0.96(1)
*Leu：2.00(2)
Tyr：0.83(1)
Phe：0.97(1)
Lys：1.88(2)
                      质谱(FAB)：
      [M+H]+：1144
实施例7Leu-Tyr-Gln-Ala-Val-Ala-Thr-Ile(“158-165”，SEQ ID NO：5)的合成
按照实施例5中所述方法的相似方式，用50mg Fmoc-Ile-Alko树脂(0.62mmol/g，100-200目)，顺序偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Leu-OH，然后将产物去保护。将所获得的粗制肽溶于乙酸水溶液中，并按照与实施例6所述方法相似方式用Sep-pakVac(C18)纯化，获得12.4mg Leu-Tyr-Gln-Ala-Val-Ala-Thr-Ile。
在采用以含有0.1％TFA、乙腈浓度为0-60％的线性梯度洗脱的反相填充材料YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)的分析中，所
获得的肽Leu-Tyr-Gln-Ala-Val-Ala-Thr-Ile的保留时间为19.2分钟，所述产物的氨基酸分析结果和质谱结果与理论值一致。
                  氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，24小时；
分析方法：茚三酮法；
*参比氨基酸；理论值示于括号内：
Thr：0.91(1)
Glx：1.03(1)
Ala：2.07(2)
*Val：1.00(1)
Ile：0.99(1)
Leu：1.02(1)
Tyr：0.98(1)
                     质谱(FAB)：
     [M+H]+：878
实施例8肿瘤抗原蛋白的鉴定
关于在实施例5、6和7中合成的三种肽的测定结果示于表6中。
表6
                在所述反应中KG-CTL
脉冲处理的肽    产生的IFN-γ的量(pg/ml)
“158-165”             289
“170-179”             458
“188-196”             399
    无          117
与不用肽脉冲处理的细胞相比，其中转染HLA-A2402cDNA的重组质粒的KG-CTL与用肽“158-165”、“170-179”和“188-196”脉冲处理的COS-7细胞的反应更强。该结果表明，“158-165”、“170-179”和“188-196”三种肽作为HLA-A24限制的肿瘤抗原肽起作用。
实施例9用肿瘤抗原肽从外周血淋巴细胞进行CTL诱导
研究在实施例5-7中合成的三种肽从外周血淋巴细胞诱导抗原特异性CTL的能力。
用Ficoll法，从HLA-A基因座中A24杂合的健康供体的外周血中分离出淋巴细胞。将所述淋巴细胞以2×106细胞/ml置于24孔板的各孔中，并且在所述淋巴细胞培养基中培养。将上述肿瘤抗原肽以10μM加入至所述培养基，以刺激外周血淋巴细胞。1周后，加入上述肿瘤抗原肽以达到10μM以及约2×105细胞的X-辐射(50Gy)外周血淋巴细胞，进行第二次刺激。再过1周后，以相似的方式进行第三次刺激。第三次刺激后1周，收获培养的淋巴细胞。MT-2是一种表达所述肿瘤抗原肽的HLA-A2402阳性白血病细胞系，用作为靶细胞的(1×104细胞)MT-2，按照ELISA法，测量上述淋巴细胞(8×104细胞)对所靶细胞反应而在培养基中产生的IFN-γ的量。结果示于表7中。
表7
 抗原肽      上清液中的IFN-γ(pg/ml)“158-165”          330“170-179”          237“188-196”          147
  无           3
用“158-165”、“170-179”和“188-196”三种肽刺激的外周血淋巴细胞对所述靶细胞反应而产生IFN-γ，但未刺激的外周血淋巴细胞未对所述靶细胞反应产生IFN-γ，表明诱导了对肿瘤抗原肽特异性的HLA-A24限制的CTL。
同样，用其中已经引入HLA-A24cDNA的表达质粒并且用上述肽脉冲处理过的COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)或VA-13细胞(RIKEN CELL BANK，The Institute of Physical and Chemical Research)代替用于本实验中的MT-2进行相似的实验(J.Exp.Med，187：277，1998)。序列表独立文本
在SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列中，第2个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，而第10个氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
在SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列中，第2个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，而第9个氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
在SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列中，第2个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，而第8个氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
工业应用性
按照本发明，可以提供一种新型肿瘤抗原蛋白及其基因、衍生自所述肿瘤抗原蛋白的肿瘤抗原肽、及其衍生物、以及在体内或体外应用这样的肿瘤抗原蛋白、基因、肿瘤抗原肽、或其衍生物的用于肿瘤的药物、预防剂或诊断剂。
                     序列表<110>ITOH，Kyogo；Sumitomo Pharmaceuticals Company，Limited<120>新型肿瘤抗原ART-1及其肿瘤抗原肽<130>661644<150>日本：98-341253<151>01.12.98<160>21<210>1<211>414<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Asn Leu Gln Arg Tyr Trp Gly Glu Ile Pro Ile Ser Ser Ser Gln
              5                  10                  15Thr Asn Arg Ser Ser Phe Asp Leu Leu Pro Arg Glu Phe Arg Leu Val
         20                  25                  30Glu Val His Asp Pro Pro Leu His Gln Pro Ser Ala Asn Lys Pro Lys
     35                  40                  45Pro Pro Thr Met Leu Asp Ile Pro Ser Glu Pro Cys Ser Leu Thr Ile
 50                  55                  60His Thr Ile Gln Leu Ile Gln His Asn Arg Arg Leu Arg Asn Leu Ile65                  70                  75                  80Ala Thr Ala Gln Ala Gln Asn Gln Gln Gln Thr Glu Gly Val Lys Thr
             85                  90                  95Glu Glu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Cys Pro Gly Ser Pro Pro Leu Pro
        100                 105                 110Asp Asp Leu Leu Pro Leu Asp Cys Lys Asn Pro Asn Ala Pro Phe Gln
    115                 120                 125Ile Arg His Ser Asp Pro Glu Ser Asp Phe Tyr Arg Gly Lys Gly Glu
130                 135                 140Pro Val Thr Glu Leu Ser Trp His Ser Cys Arg Gln Leu Leu Tyr Gln145                 150                 155                 160Ala Val Ala Thr Ile Leu Ala His Ala Gly Phe Asp Cys Ala Asn Glu
            165                 170                 175Ser Val Leu Glu Thr Leu Thr Asp Val Ala His Glu Tyr Cys Leu Lys
        180                 185                 190Phe Thr Lys Leu Leu Arg Phe Ala Val Asp Arg Glu Ala Arg Leu Gly
    195                 200                 205Gln Thr Pro Phe Pro Asp Val Met Glu Gln Val Phe His Glu Val Gly
210                 215                 220Ile Gly Ser Val Leu Ser Leu Gln Lys Phe Trp Gln His Arg Ile Lys225                 230                 235                 240Asp Tyr His Ser Tyr Met Leu Gln Ile Ser Lys Gln Leu Ser Glu Glu
            245                 250                 255Tyr Glu Arg Ile Val Asn Pro Glu Lys Ala Thr Glu Asp Ala Lys Pro
        260                 265                 270Val Lys Ile Lys Glu Glu Pro Val Ser Asp Ile Thr Phe Pro Val Ser
    275                 280                 285Glu Glu Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ser Gly Asp Gln Ser Leu Pro Met
290                 295                 300Gly Val Leu Gly Ala Gln Ser Glu Arg Phe Pro Ser Asn Leu Glu Val305                 310                 315                 320Glu Ala Ser Pro Gln Ala Ser Ser Ala Glu ValAsn Ala Ser Pro Leu
            325                 330                335Trp Asn Leu Ala His Val Lys Met Glu Pro Gln Glu Ser Glu Glu Gly
        340                 345                 350Asn Val Ser Gly His Gly Val Leu Gly Ser Asp Val Phe Glu Glu Pro
    355                 360                 365Met Ser Gly Met Ser Glu Ala Gly Ile Pro Gln Ser Pro Asp Asp Ser
370                 375                 380Asp Ser Ser Tyr Gly Ser His Ser Thr Asp Ser Leu Met Gly Ser Ser385                 390                 395                 400Pro Val Phe Asn Gln Arg Cys Lys Lys Arg Met Arg Lys Ile
            405                 410<210>2<211>1711<212>DNA<213>智人<400>2acgcgatcct tgcctcaggc ctctcgaggt ccagacagcc gcccagcccg ctctgcgacg     60cagcagtgaa tagtgtggta cctccttgtc tcggttcagg tccagacctc cccgtcttcc    120ggctgccctg aacgtcaggc gacctcagga ccctgtgatt ggcgcctgcg ccggcggacc    180gtgaccgagg aaacccctgg agggacttgg gcattccttg ggctccgtgc ctgttcttcg    240tgctcctttc gggcaaggat ctcacattat cagtctttga ccgacacaga atgcctggca    300tttgataaat gtttgttgaa cttgaagaga catatggaca atg aat ctg caa aga      355
                                        Met Asn Leu Gln Arg
                                                          5tac tgg gga gag ata cca ata tca tca agc cag acc aac aga agt tcc      403Tyr Trp Gly Glu Ile Pro Ile Ser Ser Ser Gln Thr Asn Arg Ser Ser
             10                  15                  20ttc gat ttg ctc cca cgg gag ttc cgt ctg gtg gaa gtc cat gac cca      451Phe Asp Leu Leu Pro Arg Glu Phe Arg Leu Val Glu Val His Asp Pro
         25                  30                  35ccc ctg cac caa ccc tca gcc aac aag ccg aag ccc ccc act atg ctg      499Pro Leu His Gln Pro Ser Ala Asn Lys Pro Lys Pro Pro Thr Met Leu
     40                  45                  50gac atc ccc tca gag cca tgt agt ctc acc atc cat acg att cag ttg      547Asp Ile Pro Ser Glu Pro Cys Ser Leu Thr Ile His Thr Ile Gln Leu
 55                  60                  65att cag cac aac cga cgt ctt cgc aac ctt att gcc aca gct cag gcc      595Ile Gln His Asn Arg Arg Leu Arg Asn Leu Ile Ala Thr Ala Gln Ala70                  75                  80                  85cag aat cag cag cag aca gaa ggt gta aaa act gaa gag agt gaa cct      643Gln Asn Gln Gln Gln Thr Glu Gly Val Lys Thr Glu Glu Ser Glu Pro
             90                  95                 100ctt ccc tcg tgc cct ggg tca cct cct ctc cct gat gac ctc ctg cct      691Leu Pro Ser Cys Pro Gly Ser Pro Pro Leu Pro Asp Asp Leu Leu Pro
        105                 110                 115tta gat tgt aag aat ccc aat gca cca ttc cag atc cgg cac agt gac      739Leu Asp Cys Lys Asn Pro Asn Ala Pro Phe Gln Ile Arg His Ser Asp
    120                 125                 130cca gag agt gac ttt tat cgt ggg aaa ggg gaa cct gtg act gaa ctc      787Pro Glu Ser Asp Phe Tyr Arg Gly Lys Gly Glu Pro Val Thr Glu Leu
135                 140                145agc tgg cac tcc tgt cgg cag ctc ctc tac cag gca gtg gcc aca atc      835Ser Trp His Ser Cys Arg Gln Leu Leu Tyr Gln Ala Val Ala Thr Ile150                 155                 160                 165ctg gcc cac gcg ggc ttt gac tgt gct aat gag agt gtc ctg gag acc      883Leu Ala His Ala Gly Phe Asp Cys Ala Asn Glu Ser Val Leu Glu Thr
            170                 175                 180cta act gat gtg gca cat gag tat tgc ctt aag ttt acc aag ttg ctg      931Leu Thr Asp Val Ala His Glu Tyr Cys Leu Lys Phe Thr Lys Leu Leu
        185                 190                 195cgt ttt gct gtg gac cgg gag gcc cgg ctg gga cag act cct ttt cct      979Arg Phe Ala Val Asp Arg Glu Ala Arg Leu Gly Gln Thr Pro Phe Pro
    200                 205                 210gat gtg atg gag cag gta ttc cat gaa gtg ggt att ggc agt gtg ctc     1027Asp Val Met Glu Gln Val Phe His Glu Val Gly Ile Gly Ser Val Leu
215                 220                 225tcc ctc cag aag ttc tgg cag cac cgc atc aag gac tat cac agt tac     1075Ser Leu Gln Lys Phe Trp Gln His Arg Ile Lys Asp Tyr His Ser Tyr230                 235                 240                 245atg cta cag att agt aag caa ctc tct gaa gaa tat gaa agg att gtc     1123Met Leu Gln Ile Ser Lys Gln Leu Ser Glu Glu Tyr Glu Arg Ile Val
            250                 255                 260aat cct gag aag gcc aca gag gac gct aaa cct gtg aag atc aag gag     1171Asn Pro Glu Lys Ala Thr Glu Asp Ala Lys Pro Val Lys Ile Lys Glu
        265                 270                 275gaa cct gtg agc gac atc act ttt cct gtc agt gag gag ctg gag gct     1219Glu Pro Val Ser Asp Ile Thr Phe Pro Val Ser Glu Glu Leu Glu Ala
    280                 285                 290gac ctt gct tct gga gac cag tca ctg cct atg gga gtg ctt ggg gct     1267Asp Leu Ala Ser Gly Asp Gln Ser Leu Pro Met Gly Val Leu Gly Ala
295                 300                 305cag agc gaa cgc ttc cca tct aac ctg gag gtt gaa gct tca cca cag     1315Gln Ser Glu Arg Phe Pro Ser Asn Leu Glu Val Glu Ala Ser Pro Gln310                 315                 320                 325gct tca agt gca gag gta aat gct tct cct ctt tgg aat ctg gcc cat     1363Ala Ser Ser Ala Glu Val Asn Ala Ser Pro Leu Trp Asn Leu Ala His
            330                 335                 340gtg aaa atg gag cct caa gaa agt gaa gaa ggc aat gtc tct ggg cat     1411Val Lys Met Glu Pro Gln Glu Ser Glu Glu Gly Asn Val Ser Gly His
        345                 350                 355ggt gtg ctg ggc agt gat gtc ttc gag gag cct atg tca ggc atg agt     1459Gly Val Leu Gly Ser Asp Val Phe Glu Glu Pro Met Ser Gly Met Ser
    360                 365                 370gaa gct ggg att cct cag agc cct gat gac tca gat agc agc tat ggt     1507Glu Ala Gly Ile Pro Gln Ser Pro Asp Asp Ser Asp Ser Ser Tyr Gly
375                 380                 385tcc cac tcc act gac agc ctc atg ggg tcc tcc cct gtt ttc aac cag     1555Ser His Ser Thr Asp Ser Leu Met Gly Ser Ser Pro Val Phe Asn Gln390                 395                 400                 405cgc tgc aag aag agg atg agg aaa ata taaaaggaaa agagggagat           1602Arg Cys Lys Lys Arg Met Arg Lys Ile
            410gttttgtcca gacctactag acccaacaga aaaggttttt gtattagaat ctgtttcctt   1662aaaaattgat ttgactcctg ttcttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa               1711<210> 3<211> 10<212> PRT<213>智人<400>3Gly Phe Asp Cys Ala Asn Glu Ser Val Leu
              5                  10<210>4<211>9<212>PRT<213>智人<400>4Glu Tyr Cys Leu Lys Phe Thr Lys Leu
              5<210>5<211>8<212>PRT<213>智人<400>5Leu Tyr Gln Ala Val Ala Thr Ile
              5<210>6<211>9<212>PRT<213>智人<400>6Ser Phe Asp Leu Leu Pro Arg Glu Phe
              5<210>7<211>11<212>PRT<213>智人<400>7Ser Phe Asp Leu Leu Pro Arg G1u Phe Arg Leu
              5                  10<210>8<211>9<212>PRT<213>智人<400>8Leu Tyr Gln Ala Val Ala Thr Ile Leu
              5<210>9<211>10<212>PRT<213>智人<400>9Glu Tyr Cys Leu Lys Phe Thr Lys Leu Leu
              5                  10<210>10<211>10<212>PRT<213>智人<400>10Arg Phe Ala Val Asp Met Glu Gln Val Phe
              5                  10<210>11<211>10<212>PRT<213>智人<400>11Pro Phe Pro Asp Val Met Glu Gln Val Phe
              5                  10<210>12<211>11<212>PRT<213>智人<400>12Val Phe His Glu Val Gly Ile Gly Ser Val Leu
              5                  10<210>13<211>9<212>PRT<213>智人<400>13Asp Tyr His Ser Tyr Met Leu Gln Ile
              5<210>14<211>10<212>PRT<213>智人<400>14Ser Tyr Met Leu Gln Ile Ser Lys Gln Leu
              5                  10<210>15<211>10<212>PRT<213>智人<400>15Ser Tyr Gly Ser His Ser Thr Asp Ser Leu
              5                  10<210>16<211>8<212>PRT<213>智人<400>16Arg Tyr Trp Gly Glu Ile Pro Ile
              5<210>17<211>8<212>PRT<213>智人<400>17Lys Phe Thr Lys Leu Leu Arg Phe
              5<210>18<211>8<212>PRT<213>智人<400>18Thr Phe Pro Val Ser Glu Glu Leu
              5<210>19<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>变异体<222>10<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>19Gly Xaa Asp Cys Ala Asn Glu Ser Val Xaa
              5                  10<210>20<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>变异体<222>9<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>20Glu Xaa Cys Leu Lys Phe Thr Lys Xaa
              5<210>21<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><221>变异体<222>2<223>Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。<220><221>变异体<222>8<223>Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。<400>21Leu Xaa Gln Ala Val Ala Thr Xaa
              5

Claims (28)

1.编码蛋白或蛋白变异体的DNA，所述蛋白由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成，所述蛋白变异体由含有SEQ ID NO：1的一个或更多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列组成，前提是所述蛋白和所述蛋白变异体通过其胞内加工，产生能够与HLA抗原结合并且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽。
2.由SEQ ID NO：2中所示碱基序列组成的DNA、在大肠杆菌JM109(3D9)(保藏号为FERM BP-6929)中携带的外源DNA、或在严格条件下与所述DNA杂交的DNA变异体，前提是由所述DNA或所述DNA变异体产生并且表达的蛋白通过其胞内加工，产生能够与HLA抗原结合并且被细胞毒性T淋巴细胞识别的肿瘤抗原肽。
3.含有权利要求1或2的DNA的表达质粒。
4.用权利要求3的表达质粒转化的转化子。
5.产生重组蛋白的方法，所述方法包括培养权利要求4的转化子，并且回收所表达的重组蛋白。
6.由权利要求1或2的DNA编码或通过权利要求5的方法产生的肿瘤抗原蛋白。
7.包含作为有效成分的权利要求1或2的DNA或权利要求6的蛋白的药用组合物。
8.用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的权利要求1或2的DNA或权利要求6的蛋白。
9.一种肿瘤抗原肽或具有功能等同特性的其衍生物，所述肿瘤抗原肽是衍生自权利要求6的蛋白的部分肽，并且能够与HLA抗原结合且被细胞毒性T淋巴细胞识别。
10.权利要求9的肿瘤抗原肽或具有功能等同特性的其衍生物，其中所述HLA抗原是HLA-A24。
11.权利要求10的肿瘤抗原肽或具有功能等同特性的其衍生物，所述肿瘤抗原肽包含一段选自SEQ ID NO：3-18的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列。
12.权利要求11的肿瘤抗原肽或具有功能等同特性的其衍生物，所述肿瘤抗原肽包含一段选自SEQ ID NO：3-5的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列。
13.权利要求11的肿瘤抗原肽衍生物，其包含一段选自SEQ IDNO：3-18的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列，其中位于位置2的氨基酸残基和/或C末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代。
14.权利要求13的肿瘤抗原肽衍生物，其包含一段选自SEQ IDNO：3-5的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列，其中位于位置2的所述氨基酸残基和/或所述C末端的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代。
15.权利要求13的肿瘤抗原肽衍生物，其包含一段选自SEQ IDNO：3-18的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列，其中位于位置2的所述氨基酸残基被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或所述C末端的氨基酸残基被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代。
16.权利要求14的肿瘤抗原肽衍生物，其包含一段选自SEQ IDNO：19-21的任一个中所示的全部氨基酸序列或部分氨基酸序列的序列。
17.用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的至少一种选自按照权利要求9-16中任一项的肿瘤抗原肽及其衍生物的物质。
18.一种重组DNA，其包含至少一种编码按照权利要求9-16中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA。
19.通过表达权利要求18的重组DNA可获得的重组多肽。
20.用于治疗或预防肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的权利要求18的重组DNA或权利要求19的重组多肽。
21.与权利要求6的蛋白、以及按照权利要求9-16中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物中的任一种特异性地结合的一种抗体。
22.一种抗原呈递细胞，其中一种HLA抗原和按照权利要求9-16中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体在从肿瘤患者中分离的具有抗原呈递能力的细胞表面上呈递。
23.其上呈递一种HLA抗原和一种肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体的一种抗原呈递细胞，通过让分离自肿瘤患者的具有抗原呈递能力的细胞掺有权利要求1或2的DNA、权利要求6的肿瘤抗原蛋白、权利要求18的重组DNA或权利要求19的重组多肽，可获得所述抗原呈递细胞。
24.用于治疗肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的权利要求22或23的抗原呈递细胞。
25.一种细胞毒性T淋巴细胞，其特异性地识别一种HLA抗原和按照权利要求9-16中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体。
26.一种细胞毒性T淋巴细胞，其特异性地识别一种HLA抗原和一种肿瘤抗原肽或其衍生物之间的复合体，而所述复合体在 22或23的抗原呈递细胞上呈递。
27.用于治疗肿瘤的药用组合物，其包含作为有效成分的权利要求25或26的细胞毒性T淋巴细胞。
28.肿瘤的诊断试剂，其包含按照权利要求9-16中任一项的肿瘤抗原肽或其衍生物、权利要求6的蛋白或权利要求19的重组多肽。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060035291A1 (en) * 2001-09-18 2006-02-16 Kyogo Itoh Method of detecting cellular immunity and application thereof to drugs
ATE441713T1 (de) * 2002-09-27 2009-09-15 Dainippon Sumitomo Pharma Co Tumorantigenprotein und dessen verwendung
JPWO2005011723A1 (ja) * 2003-08-05 2007-10-04 株式会社グリーンペプタイド 造血器腫瘍の予防および／または治療剤
US20080254445A1 (en) * 2003-09-22 2008-10-16 Kyogo Itoh Prognosis in Cancer Patients Vaccinated with a Cancer Antigen Peptide-Associated Agent
JP5151349B2 (ja) * 2006-09-26 2013-02-27 東レ株式会社 免疫誘導剤及びその用途
CN102257138B (zh) 2008-10-20 2013-06-19 大日本住友制药株式会社 肿瘤抗原肽及其用途
US20130177979A1 (en) * 2010-06-22 2013-07-11 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for cell permeable stat3 inhibitor

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1203177C (zh) 1996-06-07 2005-05-25 伊东恭悟 肿瘤抗原蛋白质及其基因和肿瘤抗原肽
EP1055684A4 (en) 1997-12-05 2002-12-04 Kyogo Itoh TUMORANTIGENS IN THE FORM OF PEPTIDE DERIVATIVES
CN1284996A (zh) * 1997-12-25 2001-02-21 伊东恭悟 肿瘤抗原蛋白及其基因和用途
JP2002507397A (ja) * 1998-03-13 2002-03-12 エピミューン，インコーポレイティド Ｈｌａ結合ペプチド及びその使用
DE19817948A1 (de) * 1998-04-17 1999-10-21 Metagen Gesellschaft Fuer Genomforschung Mbh Menschliche Nukleinsäuresequenzen aus Endometrium-Tumor

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