CN1262562C

CN1262562C - 来源于sart－1的hla－a2限制性肿瘤抗原肽

Info

Publication number: CN1262562C
Application number: CNB998090409A
Authority: CN
Inventors: 伊东恭悟; 小林照忠
Original assignee: Kurume University
Current assignee: Kurume University
Priority date: 1998-07-28
Filing date: 1999-07-27
Publication date: 2006-07-05
Anticipated expiration: 2019-07-27
Also published as: EP1103561A1; AU765733B2; NZ509585A; AU4801699A; WO2000006595A1; KR20010071033A; US6664232B1; EP1103561A4; DE69930942D1; ATE323719T1; CN1310723A; CA2336486A1; ID27162A; EP1103561B1; HK1039946A1

Abstract

来源于SART-1的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽及其功能上具有同等特性的衍生物；应用肿瘤抗原肽等的肿瘤预防剂或诊断剂；与肿瘤抗原肽相关的重组DNA，重组肽和抗体及其应用；提呈肿瘤抗原肽的抗原提呈细胞及其应用；肿瘤抗原肽特异的细胞毒性T细胞及其应用。

Description

来源于SART-1的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽

技术领域

本发明涉及来源于SART-1的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽。更具体而言，本发明涉及来源于SART-1的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽及其功能上具有同等特性的衍生物，应用这些肿瘤抗原肽及其衍生物的体内、体外肿瘤治疗剂、预防剂或诊断药等。

背景技术

已知生物体在排除肿瘤的过程中免疫系统尤其是T细胞发挥着重要作用。实际上在肿瘤局部可看到对肿瘤细胞有伤害作用的淋巴细胞浸润(Arch.Surg.，126：200，1990)；从黑色素瘤上可比较容易地分离出识别自身肿瘤细胞的细胞杀伤性T细胞(CTL)(Immunol.Today，8：385，1987；J.Immunol.，138：989，1987；Int.J.Cancer，52：52，1992等)。另外从输入该CTL治疗黑色素瘤的临床效果来看，它提示了T细胞在肿瘤排除中的重要性(J.Natl.Cancer.Inst.，86：1159，1994)。

长期以来CTL攻击自身肿瘤细胞的靶分子不明确，但随着最近免疫学和分子生物学的发展逐步得到阐明。即，CTL应用T细胞受体(TCR)，通过识别叫做肿瘤抗原肽的肽与主要细胞相容性复合体I类抗原(MHCI类抗原，人的叫做HLA抗原)形成的复合体而攻击自身的肿瘤细胞。

肿瘤抗原肽是肿瘤所特有的蛋白质，是肿瘤抗原蛋白质在细胞内合成后，经蛋白水解酶在细胞内分解而形成的。生成的肿瘤抗原肽在内质网内与MHC I类抗原(HLA抗原)相结合而形成复合体，运输到细胞表面以提呈抗原。肿瘤特异的CTL识别这种以抗原提呈的复合体，通过细胞杀伤作用和淋巴因子的产生而发挥抗肿瘤作用。伴随着这一系列作用的阐明，通过利用肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原肽的所谓肿瘤疫苗可产生增强肿瘤患者体内肿瘤特异性CTL的治疗方法。

肿瘤抗原蛋白质是1991年T.Boon等首次从人黑色素瘤细胞中鉴定出的名为MAGE的蛋白质(Science，254：1643，1991)。其后主要从黑色素瘤细胞中鉴定出几种肿瘤抗原蛋白质。鉴定出的黑色素瘤抗原有黑素细胞组织特异的蛋白质gp 100(J.Exp.Med.，179：1005，1994)，MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：3515，1994)，酪氨酸酶(J.Exp.Med.，178：489，1993)等黑素体蛋白质，不只在黑素瘤表达的、在各种癌细胞和正常睾丸细胞中表达的MAGE相关蛋白质群(J.Exp.Med.，179：921，1994)，具有肿瘤特异的氨基酸变异的β-カテニン(J.Exp.Med.，183：1185，1996)、CDK4(Science，269：1281，1995)等。另外，鉴定出的黑素瘤以外的肿瘤抗原蛋白质有HER2/neu(J.Exp.Med.，181：2109，1995)，p53(突变型)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：14704，1996)等癌基因产物，CEA(J.Natl.Cancer.Inst.，87：982，1995)、PSA(J.Natl.Cancer.Inst.，89：293，1997)等肿瘤标志，HPV(J.Immunol.，154：5934，1995)、EBV(Int.Immunol.，7：653，1995)等病毒蛋白质等。在下列综述中对它们有详细论述-Immunol.Today，18：267，1997；J.Exp.Med.，183：725，1996；Curr.Opin.Immunol.，8：628，1996等。

为了应用肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽进行肿瘤的治疗和诊断，有必要鉴定出广泛适应于扁平上皮癌(食道癌、肺癌等)的肿瘤抗原，因为这种癌的发生率远远高于黑色素瘤。由此本发明者们对编码来源于食道癌扁平上皮癌细胞的肿瘤抗原蛋白质进行了克隆，结果从黑色素瘤以外的肿瘤细胞中首次成功地充隆出编码新型肿瘤抗原蛋白质(SART-1)的基因，通过该SART-1鉴定出几种与HLA-A26抗原或HLA-A24抗原结合而提呈的肿瘤抗原肽部分(J.Exp.Med.，187：277，1998，国际公开第97/46676号)。

但是该SART-1是否有与HLA-A2抗原结合而提呈的肿瘤抗原肽部分，即是否存在由SART-1来源的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽尚未明了。

发明公开

本发明以提供SART-1来源的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽为目的。也说是说本发明的目的是提供来源于SART-1的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽及其具有同等功能特异的衍生物，或者提供体内、体外应用该肿瘤抗原肽及其衍生物的肿瘤治疗剂、预防剂或诊断药。本发明的来源于SART-1的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽是与40％日本人或白人所拥有的HLA抗原-HLA-A2结合而被提呈的抗原肽，所以它适用于多数患者，再者，由于它可应用于人癌中最多见的扁平上皮癌，所以有望成为新型的抗肿瘤药。顺便提一下，已知扁平上皮癌中的食道癌、肺癌等扁平上皮癌对现代的化疗、放疗有相当的抵抗性。由此，期待本发明的肿瘤抗原肽的开发。

本发明者们为了检测SART-1分子中是否存在HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽进行了以下试验。

首先，本发明者们从组织学分型上属于扁平上皮癌的食道癌手术标本中的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中建立了HLA-A2限制性的CTL细胞株，将之命名为YK-EC(保藏号FERM BP-6726)。接着，用SART-1cDNA的重组质粒和HLA-A 0201 cDNA的重组质粒共转染VA-13细胞，将其转染。作用于先前的YK-EC后，发现YK-EC活化产生IFN-γ。由该结果可初步表明SART-1中存在HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽。

本发明者们又尝试鉴定与HLA-A2结合而被提呈的SART-1来源的部分肽，结果表明序列号1～序列号6氨基酸序列所示的肽存在肿瘤抗原肽活性。

本发明是在上述基础上来完成的。

即，本发明提供：

(1)来源于SART-1的部分肽、且与HLA-A2抗原结合而被细胞毒性T细胞所识别的肿瘤抗原肽，或者其功能上具有同等特性的衍生物；

(2)上述(1)的肿瘤抗原肽或其功能上具有同等特性的衍生物，其选自包含序列号1～34任一氨基酸序列全部或其部分的序列；

(3)上述(2)的肿瘤抗原肽或其具有同等功能特性的衍生物，它选自包含序列号1～6任一氨基酸序列的全部或其部分的序列；

(4)上述(2)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包括序列号1～34任一氨基酸序列中第2位和/或C末端的氨基酸残基被其它氨基酸残基置换了的序列的全部或其部分的序列；

(5)上述(4)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包含序列号1～6任一氨基酸序列中第2位和/或C末端的氨基酸残基被其它的氨基酸所置换了的氨基酸序列的全部或其部分的序列；

(6)上述(4)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包含序列号1～34任一氨基酸序列中第2位被亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酸所替代的和/或C末端的氨基酸残基被缬氨酸或亮氨酸所替代的序列的全部或一部分的序列；

(7)上述(6)的肿瘤抗原肽衍生物，它选自包含序列号35～40中任一氨基酸序列的全部或其部分的序列；

(8)肿瘤治疗剂或预防剂，它至少有1种有效成分选自上述(1)～(7)任一项中的肿瘤抗原肽及其衍生物；

(9)重组DNA，它是至少包含一种编码上述(1)～(7)任一项中肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA；

(10)使上述(9)中的重组DNA表达而得到的多肽；

(11)肿瘤治疗剂或预防剂，它以上述(9)的重组DNA或上述(10)的多肽作有效成分；

(12)肿瘤诊断药，它含有上述(1)～(7)任一项中的肿瘤抗原肽或其衍生物，或包含上述(10)的多肽；

(13)与上述(1)～(7)任一项中的肿瘤抗原肽或其衍生物特异性结合的抗体；

(14)抗原提呈细胞，它能将HLA-A2抗原与上述(1)～(7)任一项中的抗原肽或其衍生物的复合体提呈到来源于肿瘤患者的具有独立的抗原提呈能力的细胞表面；

(15)上述(14)的抗原提呈细胞，它是将上述(9)的重组DNA或上述(10)的多肽摄取到肿瘤患者来源的具有独立抗原提呈能力的细胞中而得到的；

(16)肿瘤治疗剂，它以上述(14)或(15)的抗原提呈细胞为有效成分；

(17)细胞毒性T细胞，它能特异性识别HLA-A2抗原与上述(1)～(7)任一项中的肿瘤抗原肽或其衍生物形成的复合体；

(18)肿瘤治疗剂，它以上述(17)的细胞毒性T细胞作有效成分；

(19)上述(17)的细胞毒性T细胞YK-EC，其保藏号为FERMBP-6726；以及

(20)肿瘤抗原肽或肿瘤抗原蛋白质的鉴定方法，其特征是应用(19)的YK-EC。

实施发明的最佳方案

本说明书中与本发明相关的“肿瘤抗原肽”是指来源于肿瘤抗原蛋白质SART-1(J.Exp.Med.，187：277，1998，国际公开第97/46676号)的部分肽，并且它与HLA-A2抗原结合能被细胞毒性T细胞(CTL)所识别。也就是说，若它是由国际公开第97/46676号的序列号1中记载的SART-1氨基酸序列的一部分构成的肽，且该肽与HLA-A2抗原结合而形成的复合体能被CTL所识别，那么该SART-1氨基酸序列中任何位置存在的任何长度的肽均属于本发明的肿瘤抗原肽的范畴。本发明的肿瘤抗原肽是合成的由SART-1的一部分所构成的候补肽，该肽与HLA-A2抗原的复合体是否被CTL所识别，也就是说候补肽是否具有肿瘤抗原肽的活性，可以按本说明书的方法或用该领域的人可利用的方法来分析，鉴定。

这里的肽合成可按照通常肽化学中应用的方法进行。该公开的方法可按下列文献中记载的方法：肽合成(Peptide Synthesis)，Interscience，New York，1996；蛋白质(The Proteins)，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；肽合成，丸善(株)，1975；肽合成的基础和实验，丸善(株)，1985；医药品的开发、続，第14卷。肽合成，广川书店，1991等。

本发明中所讲的“与HLA-A2抗原结合被CTL所识别”是指本发明的肿瘤抗原肽与HLA-A2抗原结合形成复合体，该复合体能被CTL识别。

上述候补肽与HLA-A2抗原结合能否被CTL所识别，即该肽是否具有HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽活性可用J.Immunol.，154，p2257，1995中记载的活性进行检测。具体而言，从HLA-A2抗原阳性的人分离末梢血淋巴球，体外添加肽进行刺激时，测定刺激该候补肽的HLA-A2阳性细胞能否被CTL特异性识别。这里有无诱导CTL的检测是用酶联免疫测定法(ELISA)测定对抗原肽提呈细胞产生反应了的CTL产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量来进行。此时抗原肽提呈细胞(靶细胞)可以是，如HLA-A2阳性但缺乏内源性肽提呈能力的T2细胞(Immunogenetics，21：235，1983)，或者用上述肽刺激导入了HLA-A2cDNA(Genbank登录号No.M84379)表达质粒的COS-7细胞(ATCC No.CRL 1651)和VA-13细胞(理化学研究所细胞银行)等。另外也可通过测定CTL对⁵¹Cr标记的抗原肽提呈细胞的杀伤性进行检测(⁵¹Cr释放测定，Int.J.Cancer，58：p317，1994)。

或者，用上述候补肽刺激HLA-A2阳性但缺乏内源性肽提呈能力的T2细胞(Immunogenetics，21：235，1985)、或刺激导入了HLA-A2c DNA(Genbank登录号M84379)表达质粒的COS-7细胞(ATCCNo.CRL 1651)和VA-13细胞(理化学研究所细胞银行)，让该细胞与本发明中建立的HLA-A2限制性CTL株YK-EC(保藏号：FERMBP-6726)和上面制备的CTL等进行反应，测定这些CTL产生的各种细胞因子(如IFN-γ)的量(J.Exp.Med.，187：277，1998)。

以上的测定方法以下叫做“肿瘤抗原肽的测定方法”。

与HLA抗原结合而被提呈的抗原肽的序列中存在某种规则(基元序列)，下面表1中显示了已知的与HLA-A2相关的基元序列(Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4749-4756，1995)。

表1HLA-A2限制性抗原肽的基元序列

HLA-A2型	从N末端开始第2个氨基酸	C末端氨基酸
HLA-A2型	从N末端开始第2个氨基酸	C末端氨基酸	HLA-A0201HLA-A0204HLA-A0205HLA-A0206HLA-A0207	L，MLV，L，I，MV，QL	V，LLLV，LL

(肽的长度为：8～11个氨基酸)

因此，按照前述的肽合成法合成SART-1的氨基酸序列中具有这样基元构造的肽部分，通过提供的肿瘤抗原肽的测定法可选择出本发明的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽。

也就是说，本发明的肿瘤抗原肽是SART-1氨基酸序列上与上述基元构造相关的肽，且是与HLA-A2抗原结合而被CTL所识别的肿瘤抗原肽。具体而言，它是含有序列号1～34中任一氨基酸序列的部分或全部，且与HLA-A2抗原结合能被CTL所识别的肿瘤抗原肽。从与HLA-A2抗原结合被提呈的角度出发，肽的长度为8～11个氨基酸左右。

这里序列号1～34任一氨基酸序列中，所说的“包含其序列的全部或一部分，且与HLA-A2抗原结合被CTL识别的肿瘤抗原肽”是指以下的肽。

1)由序列号1～34中任一氨基酸序列构成的肽或者由序列号1～34中任一氨基酸序列的连续部分所构成的肽；或

2)包含上面(1)中所讲肽的肽，且与HLA-A2抗原结合而被CTL所识别的肽。

这里，上述(1)和(2)中肽的长度是8～11个氨基酸左右。前面(2)的肽的例子包括：包含序列号1～34中任一氨基酸序列的全长，从该氨基酸序列向N末端和/或C末端方向伸长的肽，序列号1～34中任一氨基酸序列的C末端或N末端的氨基酸缺失而添加了其它氨基酸的肽，且是与HLA-A2结合而被CTL所识别的肽。

上述肿瘤抗原肽中适宜的是包含序列号1～20中任一氨基酸序列的全部或部分，且与HLA-A2抗原结合能被CTL所识别的肿瘤抗原肽。这里，当该氨基酸序列“包含全部或部分，且与HLA-A2抗原结合被CTL所识别的抗原肽”是指与上面(1)和(2)的肽同样的肽。

例如，包含序列号1～6任一项中氨基酸序列的全部或部分，且与HLA-A2抗原结合而被CTL所识别的肿瘤抗原肽。这里所讲的当该氨基酸序列的“包含全部或部分，且与HLA-A2抗原结合能被CTL识别的肿瘤抗原肽”，是与上面(1)和(2)中的肽同样的肽。

本发明中所讲的“与肿瘤抗原肽功能上具有同等特异的衍生物”(以下有时略作肿瘤抗原肽衍生物)是本发明的肿瘤抗原肽的氨基酸序列中1～数个氨基酸残基发生改变了的改变体，且具有与HLA-A2抗原结合被CTL识别这一肿瘤抗原肽的特性。也就是说，本发明的肿瘤抗原肽的氨基酸序列中，或数个氨基酸残基发生改变了的改变体，且有与HLA-A2抗原结合能被CTL所识别这种肿瘤抗原肽活性的物质均包含在本发明的肿瘤抗原肽衍生物的范畴。

这里所讲的氨基酸残基的“改变”是指氨基酸残基的置换、缺失和/或添加(也包括肽的N端、C末端的氨基酸添加)，优选氨基酸残基的置换。涉及氨基酸残基发生置换这一改变时，置换发生的位置及数目没有特殊限制，只要能维持肿瘤抗原肽的活性即可。本发明的肿瘤抗原肽的长度，与前面的肿瘤抗原肽同样优选8～11个氨基酸。

如前所述，与HLA抗原结合而被提呈的抗原肽的序列中有一定的规律性(基元序列)，已知与HLA-A2抗原结合时有前面表1所示的基元序列(Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.155：4749-4756，1995)。另外，该基元序列上也可是具有类似性质的氨基酸残基。因此本发明的肿瘤抗原肽衍生物的例子有：包含序列号1～34(优选序列号1～20)任一氨基酸序列中，按照前面的基元序列中氨基酸发生置换的可能位置，即第2位和/或C末端的氨基酸残基置换成其它的氨基酸残基的氨基酸序列的全部或其部分的肿瘤抗原肽衍生物。优选第2位和/或C末端的氨基酸残基置换成在前面基元序列上可能发生置换的氨基酸残基，即序列号1～34(优选1～20)任一氨基酸序列中的第2位置换成亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酸，和/或C末端的氨基酸残基替换为缬氨酸或亮氨酸，优选包含这样氨基酸序列全部或部分的肿瘤抗原肽衍生物。从与HLA-A2抗原结合的观点出发，肽的长度优选8～11个氨基酸左右。

肿瘤抗原肽衍生物的例子有：包含序列表1～6任一氨基酸序列中第2位和/或C末端的氨基酸残基替换成其它氨基酸残基的序列的全部或其部分的抗原肽衍生物，优选包含序列号1～6任一氨基酸序列中第2位变为亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酸，及/或C末端置换为缬氨酸或亮氨酸的氨基酸序列的全部或其部分的肿瘤抗原肽衍生物。这些改变肽的例子分别在序列号35～40中显示。

与本发明的肿瘤抗原肽同样，按前面讲的肽合成法合成候补肽，按前面提供的肿瘤抗原肽的测定法检测本发明的肿瘤抗原肽衍生物是否具有肿瘤抗原肽功能上的同等性。

本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物作为肿瘤治疗剂或预防剂使用时，至少是1种或2种以上组合应用。也就是说，本发明提供含有以肿瘤抗原肽或其衍生物为有效成分的肿瘤治疗剂或预防剂。将本发明的肿瘤治疗剂或预防剂施用给HLA-A2阳性且SART-1阳性的患者时，肿瘤抗原肽或其衍生物以其原状态与抗原提呈细胞表面的HLA-A2分子结合，或者被抗原提呈细胞摄取后与HLA抗原结合，形成复合体，该复合体被高密度提呈到抗原提呈细胞表面，被提呈的HLA-A2抗原复合体特异的CTL增殖，破坏肿瘤细胞，因此可预防或治疗肿瘤。

由于SART-1广泛表达于食道癌、肺癌等扁平上皮癌等，所以本发明的肿瘤治疗剂或预防剂的有利之处是适用范围广。再者，如前所述，扁平上皮癌大多对化疗和放疗有抵抗性，与本发明的肿瘤治疗剂合用可提高其治疗效果。

为了有效建立细胞性免疫，本发明的肿瘤治疗剂或预防剂可与佐剂一起施用，也可以粒状剂型施用。作为佐剂，可应用文献(Clin.Microbiol.Rev.，7：277-289，1994)中记载的佐剂。另外可考虑脂质体制剂、与直径数μm的珠结合的粒状制剂、结合类脂化合物的制剂。作为施用方法可采用皮内、皮下、静脉注射等。制剂中本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的施用量可根据治疗的疾病、患者的年龄、体重等进行适当调整，但通常为0.0001mg～1000mg，优选0.001mg～100mg，更优选0.01mg～10mg，数日～数月施用1次。

此外，本发明的肿瘤治疗剂或预防剂除以前述的本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物为有效成分外，还可如下所述，以编码本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA以及该DNA的表达产物-多肽作为本发明肿瘤治疗剂或预防剂的有效成分。

也就是说，近年有一种连结多个CTL表位，将编码所谓“多表位”的DNA用于DNA疫苗的手法(例如参照J.Immunology，160，p1717，1998等)。因此，连接至少1种或2种以上编码本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA，再与所希望的编码其它肿瘤抗原肽的DNA相连接，制成重组DNA，整合到适当的表达载体中，而成为肿瘤治疗剂或预防剂的有效成分。另外，不仅可应用上述的重组DNA作为治疗剂或预防剂，让该重组DNA在宿主细胞内表达而得到的多肽也可用作肿瘤治疗剂或预防剂的有效成分。

这里所讲的“重组DNA”可按DNA合成及常用的基因工程学方法制作，如按照Molecular Cloning 2nd Edt.，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等书的方法进行。另外将该重组DNA整合到表达载体时也按照上面的书中进行。

所制作的本发明的重组DNA能否产生与HLA-A2抗原结合被CTL所识别的肿瘤抗原肽，可应用以下方法进行测定。

即，首先将具有候补重组DNA的表达质粒与有编码HLA-A2抗原的cDNA(Genbank登录号：M 84379)的表达质粒共转染COS-7细胞(ATCC CRL 1651)和VA-13细胞(理化学研究所开发银行)。转染的方法可应用脂转染氨络合物试剂(GIBCO BRL)进行脂质体转染法。其后，加入HLA-A2限制性的CTL(例如YK-EC，FERM BP-6726)，测定该CTL产生反应时各种细胞因子(例如IFN-γ)的量，如用ELISA方法等，依此来检测候补的DNA是否有活性。

本发明的重组DNA用作肿瘤治疗剂或预防剂时，可使用以下方法。

即，作为将本发明的重组DNA导入细胞内的方法，可应用病毒载体的方法以及其它方法(日经サイエンス，1994年4月号，20-45页；月刊药事，36(1)，23-48(1994)；实验医学增刊，12(15)，(1994)以及它们的引用文献)中的任一方法。

作为病毒载体适用的方法，有将本发明的DNA整合到逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、Sindbis病毒等DNA病毒或RNA病毒的导入方法。其中特别优选应用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒等的方法。

其它的方法有将表达载体直接施用肌肉内的方法(DNA疫苗)、脂质体法、脂质体转染法、显微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，但特别优选DNA疫苗法和脂质体法。

本发明的重组DNA作为实际药品应用时，可应用将该DNA直接导入体内的in vivo法，以及从人体采集某种细胞，在体外将该DNA导入该细胞内，然后将该细胞回输到体内的ex vivo法(日经サイエンス，1994年4月，20-45页；月刊药事，36(1)，23-48(1994)；实验医学增刊，12(15)，(1994)以及它们的引用文献等)。较优选in vivo法。

通过in vivo法施用时，要根据治疗的目的疾病、状态等通过适当的施与途径施用。例如，可采用静脉、动脉、皮下、皮内、肌肉内施用等。通过in vivo法施用时，例如液态制剂等剂型形式时一般采用含有本发明的重组DNA作有效成分的注射剂，必要时可加入常用的载体。另外含有本发明的重组DNA的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)常采用悬浮剂、冻结剂、离心浓缩冻结剂等脂质体制剂形式。

制剂中本发明的重组DNA的含量可根据治疗的目的疾病、患者的年龄、体重等进行适当的调整，但通常是0.0001mg～100mg，优选0.001mg～10mg，数日～数月施用1次。

象上回这样将本发明的重组DNA施用给肿瘤患者时，与重组DNA相对应的多肽在抗原提呈细胞内高表达。其后经细胞内水解而产生的每个肿瘤抗原肽与HLA抗原结合形成复合体，该复合体被高密度提呈到抗原提呈细胞表面，该复合体特异的CTL在体内高效增殖，再破坏肿瘤细胞。如上所述达到肿瘤的治疗或预防。

另外，使前面所述的重组DNA表达而得到的“重组多肽(或单叫做多肽)”是这样产生的：将前述的重组DNA整合到适当的表达载体(例如pSV-SPORT1等)中，将制成的表达质粒导入宿主细胞而得到转化体，在适当的培养基中培养该转化体使之表达、生产该多肽。这里的宿主细胞可以是大肠杆菌等原核生物、酵母样的单细胞真核生物，昆虫、动物等多细胞真核生物的细胞等。另外将基因导入宿主细胞的方法有磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电脉冲法等。如上方法而得到的多肽用一般的全化学方法进行分离、纯化。另外，当该多肽与HLA-A2抗原结合是否产生被CTL识别的肿瘤抗原肽的检测可以是：例如让巨噬细胞等吞噬细胞摄取本发明的多肽，在细胞内产生肽片段，然后针对该片段与HLA-A2抗原的复合体加入YK-EC(FERM BP-6726)等CTL，让它们作用，然后测定CTL反应时产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量。

本发明的多肽作为肿瘤治疗剂或预防剂使用时，可接着与前面所述的肿瘤抗原肽或其衍生物同样的施用状态、施用方法及施用剂量来施用。将本发明的多肽施用给肿瘤患者时，它被摄取到抗原提呈细胞内，然后在细胞内分解产生的每个肿瘤抗原肽与HLA抗原结合形成复合体，该复合体被高密度提呈到抗原提呈细胞表面，该复合体特异的CTL在体内有效增殖，然后破坏肿瘤细胞。如上达到肿瘤的治疗或预防。

本发明提供与本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物特异性结合的抗体。该抗体可按照Antibodies；A Laboratory Manual，Lane，H，D.等编，Cold Spring Harber Laboratory Press出版，New York 1989等记载的方法容易地制备。即，应用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物按常规的方法免疫适宜的动物，由此产生识别肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体，然后就能很容易地制备中和其活性的抗体。抗体的用途有亲和层析、免疫学诊断等。进行免疫学诊断时可适当选择免疫印迹法、放免测定法(RIA)、酶免疫测定法(ELISA)、荧光或发光测定法等。

本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物、或者本发明的重组DNA或该重组DNA表达所得的多肽在肿瘤患者的治疗中，可如下在体外应用。

即肿瘤抗原肽或其衍生物用于肿瘤治疗时，能在患者体内诱导良好特异性CTL的施用方法很重要。其手段之一是提供抗原提呈细胞，该细胞能将HLA-A2抗原与本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物形成的复合体提呈到从肿瘤患者分离出的有抗原提呈能力的细胞表面，并且提供含有该抗原提呈细胞作有效成分的肿瘤治疗剂。

这里所讲的“有抗原提呈能力的细胞”是没有特殊限制的，只要它是细胞表面表达HLA-A2抗原、能提呈本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的细胞即可，但特别优选抗原提呈能力高的树突状细胞。

为了制备本发明的抗原提呈细胞而向有上述抗原提呈能力的细胞内添加的物质不仅有本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物，还有本发明的重组DNA或多肽。

本发明的抗原提呈细胞的制备是：从肿瘤患者分离出具有抗原提呈能力的细胞，用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物、或者本发明的多肽体外脉冲处理该细胞，HLA-A2抗原与上述肽或其衍生物形成复合体(Cancer Immunol.Immunother.，46：82，1998；J.Immunol.，158：p1796，1997；Cancer Res.，59：p1184，1999)。应用树突细胞时是，例如用Ficoll法从肿瘤患者的末梢血中分离出淋巴细胞，然后去除非粘附细胞，在GM-CSF及IL-4存在的条件下培养粘附细胞，以诱导树突细胞，然后该树突细胞与本发明的肿瘤抗原肽或其多肽共培养，通过脉冲处理而制备成本发明的抗原提呈细胞。

另外也可参照Cancer Res.，56：p5672，1996和J.Immunol.，161：p5607，1998等的方法，通过将本发明的重组DNA导入上述具有抗原提呈能力的细胞而制备本发明的抗原提呈细胞。此外，不仅DNA，用RNA也可同样制备抗原提呈细胞，可参照J.Exp.Med.，184：p465，1996等进行。

为了维持抗原提呈细胞的稳定性，优选含有以该抗原提呈细胞作有效成分的肿瘤治疗剂中含有生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。施用方法有静脉内施用、皮下、皮内施用等。通过将以该抗原提呈细胞作有效成分的肿瘤治疗剂回用给患者，在HLA-A2阳性且SART-1阳性患者体内诱导良好特异性的CTL而达到治疗肿瘤的目的。

本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物在体外利用时，推荐以下过继免疫法。

即，在黑色素瘤中，体外大量培养患者本人的肿瘤浸润性T细胞，将它回输给患者的过继免疫疗法有一定治疗效果(J.Natl.Cancer.Inst.，86：1159，1994)。另外，在小鼠的黑色素瘤中观察看到：用肿瘤抗原肽TRP-2体外刺激脾细胞，使肿瘤抗原肽特异的CTL增殖，将该CTL施予黑色素瘤荷瘤小鼠时可观察到转移受到抑制(J.Exp.Med.，185：453，1997)。这是在体外使特异性识别抗原提呈细胞的HLA抗原与肿瘤抗原肽的复合体的CTL增殖的结果。因此，用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物、或者本发明的重组DNA和多肽体外刺激患者末梢血淋巴细胞使肿瘤特异的CTL增殖后，将该CTL用给患者的治疗方法是有用的。

也就是说本发明提供特异性识别上述HLA-A2抗原与本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物形成的复合体的CTL以及以该CTL为有效成分的肿瘤治疗剂。为了维持CTL的稳定性，优选该治疗剂包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。施用方法有静脉内施用、皮下、皮内施用等。将以CTL为有效成分的肿瘤治疗剂回输到患者体内时，在HLA-A2阳性且SART-1阳性患者体内促进CTL对肿瘤细胞的杀伤作用，通过破坏肿瘤细胞而治疗肿瘤。

另外，本发明的肿瘤抗原肽及其衍生物或者本发明的多肽可用作肿瘤诊断的诊断药成分。也就是说，应用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物等作为诊断药，通过检测疑为肿瘤患者的样品(如血液、肿瘤组织等)中抗体的存在，可诊断肿瘤的早期发现、再发、转移等。另外，以本发明的肿瘤抗原肽为有效成分的医药可用于选择其适用的肿瘤患者。具体地讲，可通过免疫印迹、RIA、ELISA、荧光或发光测定法等进行该诊断。

近年确立了一种新的用抗原肽与HLA抗原的复合体检测抗原特异性CTL的检测方法(Science，274：p94，1996)。将本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物与HLA-A2抗原形成的复合体用于上述检测方法，通过检测肿瘤抗原特异的CTL而进行肿瘤早期发现、再发、转移的诊断。另外以本发明的肿瘤抗原肽为有效成分的医药可用于其适用肿瘤患者的选择和诊断药治疗效果的判断等。即，本发明提供含有本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的肿瘤诊断药。

具体地讲，按文献(Science，274：p94，1996)中的方法制备荧光标记的HLA-A2抗原与肿瘤抗原肽的复合体的4倍体，应用它通过流式细胞仪对疑为肿瘤患者的末梢血淋巴细胞中的抗原肽特异的CTL进行定量，进行上述诊断。

另外，本发明提供从食道癌患者肿瘤浸润性淋巴细胞建立的CTL、YK-EC(保藏号FERM BP-6726)。当知道YK-EC为HLA-A2限制性的CTL株后，本发明的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽也是以与该YK-EC的反应性为指标而发现的肿瘤抗原肽。因此利用YK-EC可发现新的肿瘤抗原蛋白质及HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽，这样的方法也是本发明的内容。该方法是以上述“肿瘤抗原肽的测定法”为基础而实施的，具体例是在后述的2及4中详细论述。

以下通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1由食道癌来源的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)建立细胞毒性 T细胞(CTL)

按关等Cell.Immunol.175：101-110，1997中记载的方法，从组织分型属于扁平上皮癌的食道癌手术标本中的TIL建立了HLA-A2限制性CTL株，将之命名为YK-EC，用于以下实验。YK-EC保藏于茨域县筑波市东1丁目1番3号、工业技术院生命工学工业技术研究所(微生物表示：YK-EC；保藏日期：平成10年6月19日；保藏号FERM P-16855)(国际保藏的变更日：平成11年5月20日；保藏号FERM-BP-6726)。

实施例2YK-EC对肿瘤抗原蛋白质SART-1的反应性

按中尾等Cancer.Res.，55：4248-4252，1995中记载的方法，将SW 620细胞(ATCC株号CCL-227)的HLA-A0201的cDNA(Genbank登录号：M84379)整合到表达载体pCR3(INVITROGEN)中制成重组质粒。

然后，按J.Exp.Med.，187：277，1998中记载的，用脂质体转染法，将HLA-A0201cDNA的重组质粒与编码肿瘤抗原蛋白质SART-1(国际公开第97/46676号)部分序列的cDNA的重组质粒6DI共转染VA-13细胞(理化学研究所银行，Ann.Med.Exp.Biol.Fenn.，44：242，1966)。保持SART-1cDNA全长(国际公开第97/46676号)的E.coli JM 109(K3)保藏于茨城县筑波市东1丁目1番3号、工业技术院生命工学工业技术研究所(微生物的表示：E.coli JM 109(K3)；保藏日：平成9年5月22日；保藏号FERM BP-5951)。使用由该FERM BP-5951而得到的质粒K3替代前述的6DI。

具体地讲，将VA-13细胞加到96孔板中，每孔10⁴个细胞，在含有10％FCS的RPMI 1640培养基中培养，然后应用脂质体转染试剂(GIBCO BRL)，用HLA-A0201cDNA的重组质粒100ng和6DI100ng共30μl进行共转染。转染子每准备2份。5小时后，向该转染子中加入200μl培养液，再培养72小时后，除去培养液，加入2×10⁴个YK-EC，培养18～24小时。回收培养液，用ELISA测定IFN-γ量。也就是说，作为固相化抗体将抗人IFN-γ小鼠单充隆抗体吸附到96孔板上，用牛血清白蛋白阻断非特异性结合后，让检测样品中的IFN-γ与抗体结合。然后与检测抗体-抗人IFN-γ兔多克隆抗体结合，再与碱性磷酸酶标记的抗兔免疫球蛋白羊抗体(Pharmacia)结合后，用过氧化酶显色试剂盒T(住友ベ一クライト)发色后，测定吸光度(405nm)。将之与标准的IFN-γ的值进行比较从而定量。对照的设定是未转染的未处理组、只转染了质粒6DI的、只转染了HLA-A0201cDNA的重组质粒的。结果如表2所示。

表2 YK-EC产生的IFN-γ量

靶细胞	YK-EC产生的IFN-γ量
靶细胞	YK-EC产生的IFN-γ量	VA-13VA-13+HLA-A0201VA-13+6DIVA-13+HLA-A0201+6DI	012.222.194.1

与其它组相比，共转染编码肿瘤抗原蛋白质SART-1部分序列的cDNA的重组质粒6DI和HLA-A0201 cDNA的重组质粒时，YK-EC的反应强，产生IFN-γ。由此表明肿瘤抗原蛋白质SART-1的抗原肽被提呈给HLA-A0201，YK-EC识别它，也就是说SART-1中存在HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽。

实施例3肿瘤抗原肽的选择与合成

已知与HLA分子结合而被提呈的抗原肽的序列有规律性(基元序列)，与HLA-A2结合时，已知有表3中所示的基元序列(Immunogenetics，41：178，1995；J.Immunol.，155：4749-4756，1995)。

表3HLA-A2限制性抗原肽的基元序列

HLA-A2型	从N末端开始的第2个氨基酸	C末端的氨基酸
HLA-A2型	从N末端开始的第2个氨基酸	C末端的氨基酸	HLA-A0201HLA-A0204HLA-A0205HLA-A0206HLA-A0207	L，MLV，L，I，MV，QL	V，LLLV，LL

(肽的长度为8～11个氨基酸)

肿瘤抗原蛋白SART-1的氨基酸序列(国际公开第97/46676号中序列号1所记载的氨基酸序列)中有上序基元序列的9～10个氨基酸构成的肽显示于序列号1～34中。其中有SART-1氨基酸序列上第642位～650位的肽命名为“642～650”(序列号1)，有第642位～651位的肽命名为“642～651”(序列号2)，有第650位～第658位的肽命名为“650～658”(序列号3)，有第660位～668位的肽命名为“660～668”(序列号4)，有第712位～第720位的肽命名为“712～720”(序列号5)，有第778位～第786位的肽为“778～786”(序列号6)，按如下固相法进行合成。

[1]SART-1“642-650”Leu-Leu-Leu-Cys-Gln-Asn-Lys- Gly-Leu(序列号1)的合成

应用树脂Fmoc-Leu-Alko Resin(0.57mmol/g，100-200mesh，(渡边化学))。应用该树脂100mg，按后面表1开始合成，将Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH顺次偶联。偶联后进行到下面表1的工程3，结果，得到肽树脂。

向该肽树脂中加入Reagent K(5％酚、5％茴香硫醚、5％H2O、2.5％乙二硫醇/TFA溶液)2ml，室温反应2.5小时。冰浴下，向反应液中加入10ml乙醚，搅拌10分钟，过滤，用10ml乙醚洗涤。向上层物质中加入10ml醋酸水溶液，搅拌30分钟后滤除树脂，用4ml醋酸水洗涤。将滤液冻干后，将所得粗肽溶解到醋酸水中，加到预先用0.1％TFA水平衡过的逆相填充剂YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)上，用0.1％TFA水洗涤柱子，在180分钟内将乙腈的浓度增加到30％，以7ml/min的流速洗脱。在A220nm处监测洗脱液，收集含目的物的级分，冻干，得到46.3mg Leu-Leu-Leu-Cys-Gln-Asn-Lys-Gly-Leu。

应用逆相系统填充剂SUMIPACK ODS-A211柱(4.6φ×250mm)，用16％～46％含0.1％TFA的乙腈线性浓度梯度洗脱法进行分析时发现所得肽的保留时间为21.0分，其氨基酸的分析值(只是未检出Cys)及质量分析值与理论值一致。

氨基酸分析

水解：1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时

分析法：茚三酮法

Asx：0.9 (1)

Glx：1.0 (1)

Gly：0.9 (1)

^*Leu：4.0 (4)^*基准氨基酸

Lys：1.0 (1)

()内为理论值

质量分析(FAB)[M+H]⁺：1001.6

表1

程序	时间(分)×处理次数
程序	时间(分)×处理次数	1.(洗涤)DMF 1.2ml2.(脱保护)50％哌啶/DMF3.(洗涤)DMF 1.2ml4.(偶联)各氨基的保护氨基酸(5当量)/NMP溶液0.3ml5.(洗涤)DMF 1.2ml6.(偶联)各氨基的保护氨基酸(5当量)/NMP溶液0.9ml，DIC(5当量)/NMP溶液0.3ml7.(洗涤)DMF 1.2ml	1×212×11×730×11×230×11×4

[2]SART-1“642-651”Leu-Leu-Leu-Cys-Gln-Asn-Lys- Gly-Leu-Leu(序列号2)的合成

应用Fmoc-Leu-Alko Resin(0.57mmol/g，100-200目)树脂。应用100mg该树脂，与上述(1)同样，顺次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH。偶联后，进行上述表1中的程序3，结果获得肽树脂。

向该肽树脂中加入2ml Reagent K(5％酚、5％茴香硫醚、5％H₂O、2.5％乙二硫醇/TFA溶液)，室温反应2.5小时。冰浴下向反应液中加入10ml乙醚搅拌10分钟，过滤，用乙醚10ml洗涤。向上层物中加入10ml醋酸水，搅拌30分钟后，滤去树脂，用4ml醋酸水洗涤。将滤液冻干后，用醋酸水溶解所得粗多肽，上到预先用0.1％TFA水平衡过的逆相系统填充剂YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)，用0.1％TFA水洗柱后，在120分钟内将乙腈浓度增加到32％，以7ml/min的流速洗脱。在A220nm处监测洗脱液，收集含目的物的级分，冻干后，获得Leu-Leu-Leu-Cys-Gln-Asn-Lys-Gly-Leu-Leu27.1mg。

应用逆相系统填充剂SUMIPACK ODS-A211柱(4.6φ×250mm )，用18％～48％含0.1％TFA的乙腈直线浓度梯度洗脱法分析时发现所得肽的保留时间为22.8分钟，其氨基酸分析数值(但未检测出Cys)及质量分析值与理论值一致。

氨基酸分析

水解：1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时

分析法：茚三酮法

Asx：1.0 (1)

Glx：1.0 (1)

Gly：0.9 (1)

^*Leu：5.0 (5)^*基准氨基酸

Lys：0.9 (1)

()内为理论值

质量分析(FAB)[M+H]⁺：1114.6

[3]SART-1“650-658”Leu-Leu-Glu-Thr-Thr-Val-Gln- Lys-Val(序列号3)的合成

应用树脂Fmoc-Val-Alko Resin(0.62mmol/g，100-200目)。应用该树脂100mg，与上面(1)同样顺次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH。偶联后进行前面表1中的程序3，结果得到肽树脂。

向该肽树脂中加入2ml Reagent K(5％酚、5％茴香硫醚、5％H₂O、2.5％乙二硫醇/TFA溶液)，室温反应2.5小时。冰浴下向反应液中加入10ml乙醚，搅拌10分钟后，过滤，用乙醚10ml洗涤。向上层物中加入10ml醋酸水，搅拌30分钟后，滤去树脂，用4ml醋酸水洗涤。将滤液冻干后，将所得粗肽溶解到醋酸水中，上到预先用0.1％TFA平衡过的逆相系填充剂YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)，用0.1％TFA水洗柱，然后在180分钟内将乙腈浓度增加到30％，以7ml/min的速度洗脱。在A220nm处监测洗脱液，收集含目的物的级分，冻干，获得32.2mg Leu-Leu-Glu-Thr-Thr-Val-Gln-Lys-Val。

用逆相系填充剂SUMIPACK ODS-A211柱(4.6φ×250mm)，用11％～41％含0.1％TFA溶液的乙腈直线性浓度梯度洗脱法进行分析时发现，所得肽的保留时间为20.2分，其氨基酸分析值及质量分析值与理论值一致。

氨基酸分析

水解：1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时

分析法：茚三酮法

Thr：1.6 (2)

Glx：1.9 (2)

Val：1.8 (2)

^*Leu：2.0 (2)^*基准氨基酸

Lys：0.9 (1)

()内为理论值

质量分析(FAB)[M+H]⁺：1030.6

[4]SART-1“660-668”Arg-Val-Lys-Ala-Pro-Asn-Lys- Ser-Leu(序列号4)的合成

应用树脂Fmoc-Leu-Alko Resin(0.57mmol/g，100-200目)。应用该树脂100mg，与上面(1)同样顺次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH。偶联后进行前面表1中的程序3，结果获得肽树脂。

向该肽树脂中加入2ml Reagent K(5％酚、5％茴香硫醚、5％H₂O、2.5％乙二硫醇/TFA溶液)，室温反应2.5小时。冰浴下向反应液中加入10ml乙醚，搅拌10分钟，过滤，用10ml乙醚洗涤。将上层物中加入10ml醋酸水，搅拌30分钟后滤除树脂，用4ml醋酸水洗涤，将滤液冻干后，将所得粗肽溶解到醋酸中，上预先用0.1％TFA溶液平衡过的逆相系填充剂YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)，用0.1％TFA水洗涤柱子后，在180分钟内将乙腈的浓度增加到20％，以7ml/min的流速洗脱。在A220nm处监测洗脱液，收集含目的物的级分，冻干，获得Arg-Val-Lys-Ala-Pro-Asn-Lys-Ser-Leu44.7mg。

用逆相系填充剂SUMIPACK ODS-A211柱(4.6φ×250mm)，应用6％～36％含0.1％TFA的乙腈线性浓度梯度洗脱法进行分析，发现所得肽的保留时间为20.2分钟，其氨基酸分析值及质量分析值与理论值一致。

氨基酸分析

水解：1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时

分析法：茚三酮法

Asx：0.9 (1)

Ser：0.7 (1)

Ala：0.9 (1)

Val：0.9 (1)

^*Leu：1.0 (1)^*基准氨基酸

Lys：1.7 (2)

Arg：0.8 (1)

Pro：0.9 (1)

()内为理论值

质量分析(FAB)[M+H]⁺：1012.6

[5]SART-1“712-720”Tyr-Val-Asp-Glu-Thr-Gly-Arg- Lys-Leu(序列号5)的合成

应用树脂Fmoc-Leu-Alko Resin(0.57mmol/g，100-200目)。应用该树脂100mg，与上面(1)同样顺次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。偶联后，进行上面表1中的程序3，结果获得肽树脂。

向该肽树脂中加入2ml Reagent K(5％酚、5％茴香硫醚、5％H₂O、2.5％乙二硫醇/TFA溶液)，室温反应2.5小时。冰浴下向反应液中加入10ml乙醚，搅拌10分钟，过滤，用乙醚10ml洗涤。向上层物中加入10ml醋酸水，搅拌30分钟后，滤除树脂，用4ml醋酸洗涤。将滤洗液冻干后，获得粗肽。将其溶解到醋酸水中，上到预先用0.1％TFA水平衡过的逆相系填充剂YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)，用0.1％TFA水洗柱后，在120分钟内将乙腈浓度增加到20％，以7ml/min流速洗脱。在A220nm处监测洗脱液，收集含目的物的级分，冻干，获得42.3mg Tyr-Val-Asp-Glu-Thr-Gly-Arg-Lys-Leu。

应用逆相系填充剂SUMIPACK ODS-A211柱(4.6φ×250mm)，通过7％～37％含0.1％TFA的乙腈直线浓度梯度洗脱法分析发现，所得肽的保留时间为20.9分，其氨基酸分析值及质量分析值与理论值一致。

氨基酸分析

水解：1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时

分析法：茚三酮法

Asx：0.9 (1)

Thr：0.9 (1)

Glx：1.0 (1)

Gly：0.9 (1)

Val：0.9 (1)

^*Leu：1.0 (1)^*基准氨基酸

Tyr：1.0 (1)

Lys：0.9 (1)

Arg：0.9 (1)

()内为理论值

质量分析(FAB)[M+H]⁺：1080.5

[6]SART-1“778-786”Ala-Gln-Lys-Thr-Pro-Tyr-Ile-Val -Leu(序列号6)的合成

应用树脂Fmoc-Leu-Alko Resin(0.57mmol/g，100-200目)。应用100mg该树脂，与上面(1)同样顺次偶联Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-OH、FmocAla-OH。偶联后进行上面表1中的程序3，结果获得肽树脂。

向该树脂中加入2ml Reagent K(5％酚、5％茴香硫醚、5％H₂O、2.5％乙二硫醇/TFA溶液)，室温反应2.5小时。冰浴下向反应液中加入10ml乙醚，搅拌10分钟后过滤，用乙醚10ml洗涤。向上层物中加入10ml醋酸水，搅拌30分钟后，滤除树脂，用4ml醋酸水洗涤。将滤洗液冻干，获得粗肽。将其溶解于醋酸水中，过预先用0.1％TFA水平衡过的逆相系填充剂YMC-PACK ODS-A柱(30φ×250mm)，用0.1％TFA水洗涤后，在120分钟内将乙腈的浓度提高到30％，以7ml/min的流速洗脱。在A220nm处监测洗脱液，收集含目的物的级分，冻干，获得29.3mg Ala-Gln-Lys-Thr-Pro-Tyr-Ile-Val-Leu。

应用逆相系填充剂SUMIPACK ODS-A211柱(4.6φ×250mm)，通过15％～45％含0.1％TFA的乙腈直线浓度梯度洗脱法进行分析时发现，所得肽的保留时间为22.6分钟，其氨基酸分析值及质量分析值与理论值一致。

氨基酸分析

水解：1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时

分析法：茚三酮法

Thr：0.8 (1)

Glx：1.0 (1)

Ala：1.1 (1)

Val：0.8 (1)

Ile：0.8 (1)

^*Leu：1.0 (1)^*基准氨基酸

Tyr：0.9 (1)

Lys：0.9 (1)

Pro：0.9 (1)

()内为理论值

质量分析(FAB)[M+H]⁺：1032.5

实施例4肿瘤抗原肽的鉴定

将实施例3中制备的6种肽分别取10μM加入到2×10⁴个HLA-A0201阳性但缺乏内源性肽提呈能力的T-B杂交瘤细胞株T2细胞(Immunogenetics，21：235，1985)中，然后与1×10⁵个YK-EC共培养18个小时，用与实施例2同样的ELISA法测定YK-EC产生的培养上清中的IFN-γ量。其结果如表4所示。

表4 YK-EC产生的IFN-γ量

冲击的肽	YK-EC产生的IFN-γ量(pg/ml)
冲击的肽	YK-EC产生的IFN-γ量(pg/ml)	“642-650”“642-651”“650-658”“660-668”“712-720”“778-786”没有肽	109.1112.4118.171.186.1105.46.5

表4表明这些肽具有肿瘤抗原肽的功能。

替代本实验中所用的T2细胞，应用导入了HLA-A2cDNA表达质粒COS-7细胞(ATCC No.CRL 1651)和VA-13细胞(理化学研究所细胞银行)也可进行同样的实验(J.Exp.Med.，187：277，1998)。

用与前面同样的肿瘤抗原肽鉴定法检测用Fmoc法合成的序列号7～20中的肽时，结果表明序列号7～20中的肽具有肿瘤抗原肽活性。

产业上的利用性

本发明提供来源于SART-1的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽及其功能上具有同等特性的衍生物，或提供体内、体外应用这些肿瘤抗原肽及其衍生物的肿瘤治疗剂、预防剂或诊断药等。本发明的肿瘤治疗剂或预防剂适用于多数患者，并且由于它广泛适用于高发的扁平上皮癌，所以期待它作为抗肿瘤剂的有益性。

序列表说明

序列号35的氨基酸序列中第2位的氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酸，第9位的氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。

序列号36的氨基酸序列中第2位的氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酸，第10位的氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。

序列号37的氨基酸序列中第2位的氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酸，第9位的氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。

序列号38的氨基酸序列中第2位的氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酸，第9位的氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。

序列号39的氨基酸序列中第2位的氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酸，第9位的氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。

序列号40的氨基酸序列中第2位的氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酸，第9位的氨基酸为缬氨酸或亮氨酸。

序列表

<110>ITOH，Kyogo；Sumitomo Pharmaceuticals Co.，Ltd.

<120>SART-1由来的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽

<130>661431

<150>JP H10-212940

<151>1998-7-28

<160>40

<210>1

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>1

Leu Leu Leu Cys Gln Asn Lys Gly Leu

5

<210>2

<211>10

<212>蛋白质

<213>人

<400>2

Leu Leu Leu Cys Gln Asn Lys Gly Leu Leu

5 10

<210>3

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>3

Leu Leu Glu Thr Thr Val Gln Lys Val

5

<210>4

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>4

Arg Val Lys Ala Pro Asn Lys Ser Leu

5

<210>5

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>5

Tyr Val Asp Glu Thr Gly Arg Lys Leu

5

<210>6

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>6

Ala Gln Lys Thr Pro Tyr Ile Val Leu

5

<210>7

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>7

Ile Leu Thr Leu Lys Asp Lys Gly Val

5

<210>8

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>8

Val Leu Gln Glu Glu Glu Asp Val Leu

5

<210>9

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>9

Leu Gln Glu Glu Glu Asp Val Leu Val

5

<210>10

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>10

Ile Leu Ser Lys Tyr Asp Glu Glu Leu

5

<210>11

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>11

Glu Gln Gly Gly Thr Ala Asp Gly Leu

5

<210>12

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>12

Lys Leu Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu

5

<210>13

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>13

Leu Gln Ala Gln Ser Leu Ser Thr Val

5

<210>14

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>14

Ser Leu Ser Thr Val Gly Pro Arg Leu

5

<210>15

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>15

Val Val Val Arg Ala Asp Asp Leu Leu

5

<210>16

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>16

Pro Leu Pro Ser Asp Asp Thr Arg Val

5

<210>17

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>17

Val Leu Glu Glu Asp Glu Ala Glu Leu

5

<210>18

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>18

Lys Gln Leu Glu Lys Gly Arg Arg Leu

5

<210>19

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>19

Arg Gln Leu Gln Gln Leu Gln Gln Leu

5

<210>20

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>20

Gln Leu Arg Asp Ser Gly Glu Lys Val

5

<211>21

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>21

Lys Leu Gly Leu Lys Pro Leu Glu Val

5

<210>22

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>22

Thr Leu Gly Glu Asp Asp Pro Trp Leu

5

<210>23

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>23

Arg Gln Leu Gln Lys Glu Lys Asp Leu

5

<210>24

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>24

Asp Leu Ala Glu Lys Arg Ala Lys Leu

5

<210>25

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>25

Asp Gln Glu Phe Gly Val Ser Thr Leu

5

<210>26

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>26

Gly Val Leu Gln Glu Glu Glu Asp Val

5

<210>27

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>27

Asp Val Leu Val Asn Val Asn Leu Val

5

<210>28

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>28

Ala Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ile Leu

5

<210>29

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>29

Glu Leu Glu Glu Ile Arg Ala Lys Leu

5

<210>30

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>30

Glu Val Val Val Arg Ala Asp Asp Leu

5

<210>31

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>31

Glu Val Glu Glu Glu Lys Glu Pro Val

5

<210>32

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>32

Lys Val Val Glu Ile Val Lys Lys Leu

5

<210>33

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>33

Asn Ile Gly Trp Ser Thr Val Asn Leu

5

<210>34

<211>9

<212>蛋白质

<213>人

<400>34

Lys Met Ser Ser Ser Asp Thr Pro Leu

5

<210>35

<211>9

<212>蛋白质

<213>人工序列

<220>

<221>变体

<222>2

<223>Xaa is Leu，Met，Val，Ile or Gln.

<220>

<221>变体

<222>9

<223>Xaa is Val or Leu.

<400>35

Leu Xaa Leu Cys Gln Asn Lys Gly Xaa

5

<210>36

<211>10

<212>蛋白质

<213>人工序列

<220>

<221>变体

<222>2

<223>Xaa is Leu，Met，Val，Ile or Gln.

<220>

<221>变体

<222>10

<223>Xaa is Val or Leu.

<400>36

Leu Xaa Leu Cys Gln Asn Lys Gly Leu Xaa

5 10

<210>37

<211>9

<212>蛋白质

<213>人工序列

<220>

<221>变体

<222>2

<223>Xaa is Leu，Met，Val，Ile or Gln.

<220>

<221>变体

<222>9

<223>Xaa is Val or Leu.

<400>37

Leu Xaa Glu Thr Thr Val Gln Lys Xaa

5

<210>38

<211>9

<212>蛋白质

<213>人工序列

<220>

<221>变体

<222>2

<223>Xaa is Leu，Met，Val，Ile or Gln.

<220>

<221>变体

<222>9

<223>Xaa is Val or Leu.

<400>38

Arg Xaa Lys Ala Pro Asn Lys Ser Xaa

5

<210>39

<211>9

<212>蛋白质

<213>人工序列

<220>

<221>变体

<222>2

<223>Xaa is Leu，Met，Val，Ile or Gln.

<220>

<221>变体

<222>9

<223>Xaa is Val or Leu.

<400>39

Tyr Xaa Asp Glu Thr Gly Arg Lys Xaa

5

<210>40

<211>9

<212>蛋白质

<213>人工序列

<220>

<221>变体

<222>2

<223>Xaa is Leu，Met，Val，Ile or Gln.

<220>

<221>变体

<222>9

<223>Xaa is Val or Leu.

<400>40

Ala Xaa Lys Thr Pro Tyr Ile Val Xaa

5

Claims

1.肿瘤抗原肽是来源于SART-1的肽，且能与HLA-A2抗原结合，并被细胞毒性T细胞所识别；以及

它具有选自包含序列号1～6中任一氨基酸序列的序列。

2.一种肿瘤抗原肽，它具有选自包含序列号35～40中任一氨基酸序列的序列。

3.肿瘤治疗剂或预防剂，它含有作为有效成分的至少一种选自权利要求1或2中的肿瘤抗原肽。

4.重组DNA，它含有至少一种编码权利要求1或2中的肿瘤抗原肽的DNA。

5.由权利要求4中的重组DNA表达而得到的多肽。

6.肿瘤治疗剂或预防剂，它含有作为有效成分的权利要求4中的重组DNA或权利要求5中的多肽。

7.肿瘤诊断药，它含有权利要求1或2中的肿瘤抗原肽，或权利要求5中的多肽。

8.能与权利要求1或2中的肿瘤抗原肽结合的抗体。

9.一种分离的抗原提呈细胞，其将HLA-A2抗原与权利要求1或2中的肿瘤抗原肽形成的复合体提呈到从肿瘤患者分离出的细胞表面。

10.权利要求9的抗原提呈细胞，它是通过使从肿瘤患者分离出的具有抗原提呈能力的细胞摄取权利要求4中的重组DNA或权利要求5中的多肽而得到的。

11.肿瘤治疗剂，它含有作为有效成分的权利要求9或10中的抗原提呈细胞。

12.细胞毒性T细胞，它特异性识别HLA-A2抗原与权利要求1或2中的肿瘤抗原肽形成的复合体，它是通过在体外用所述肿瘤抗原肽刺激淋巴细胞而得到的。

13.肿瘤治疗剂，它含作为有效成分权利要求12中的细胞毒性T细胞。

14.权利要求12中的细胞毒性T细胞，其为YK-EC，其保藏号为FERM BP-6726。

15.肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原肽的鉴定方法，其特征是它应用权利要求14中的YK-EC。