KR20010071033A - Ｓａｒｔ-1 유래의 ｈｌａ-ａ2 구속성 종양항원 펩티드 - Google Patents

Abstract

SART-1 유래의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드 및 그에 기능적으로 동등한 특성을 가지는 그 유도체; 종양 펩티드 항원 등을 이용한 종양의 치료제, 예방제, 또는 진단약; 종양 항원 펩티드에 관한 재조합 DNAs, 재조합 펩티드 및 항체 및 그의 용도; 종양 항원 펩티드를 제시하는 항원 제시세포 및 그의 용도; 및 종양 항원 펩티드에 특이성인 세포상해성 T 세포 및 그의 용도.

Description

ＳＡＲＴ-1 유래의 ＨＬＡ-Ａ2 구속성 종양항원 펩티드{HLA-A2 RESTRAINT TUMOR ANTIGEN PEPTIDE ORIGINATING IN SART-1}

생체에 의한 종양의 배제에는 면역계, 특히 T 세포가 중요한 역할을 하고 있음이 알려져 있다. 실제, 사람의 종양국소에는 종양세포에 대해 상해활성을 나타내는 림프구의 침윤이 관찰되고 (Arch. Surg., 126:200, 1990), 멜라노머로부터는 자신의 종양세포를 인식하는 세포상해성 T 세포 (CTL) 가 비교적 용이하게 분리되어 있다 (Immunol. Today, 8:385, 1987, J.Immunol., 138:989, 1987, Int.J.Cancer, 52:52, 1992 등). 또, 상기 CTL 의 이입에 의한 멜라노머치료의 임상결과로부터도 종양배제에서의 T 세포의 중요성이 시사되어 있다 (J. Natl. Cancer. Inst., 86:1159, 1994).

자신의 종양세포를 공격하는 CTL 이 표적으로 하는 분자에 대해서는 오랫 동안 불명확하였지만, 최근 면역학 또는 분자생물학의 진보에 의해 점차 명확해졌다.

즉, CTL 은 T 세포수용체 (TCR) 를 사용하여 종양항원 펩티드라고 불리우는 펩티드와 주요조직 적합 유전자복합체 클래스 Ⅰ 항원 (MHC 클래스 Ⅰ 항원, 사람의 경우는 HLA 항원이라 불리움) 의 복합체를 인식함으로써, 자신의 종양세포를 공격하고 있음이 명확해졌다.

종양항원 펩티드는 종양에 특유의 단백질, 즉 종양항원 단백질이 세포내에서 합성된 후, 프로테아솜에 의해 세포내에서 분해됨으로써 생성된다. 생성된 종양항원 펩티드는 소포체내에서 MHC 클래스 Ⅰ 항원 (HLA 항원) 과 결합하여 복합체를 형성하고, 세포표면으로 운반되어 항원 제시된다.

이 항원제시된 복합체를 종양특이적인 CTL 이 인식하고, 세포상해작용이나 림포카인의 생산을 통하여 항종양효과를 나타낸다. 이와 같은 일련의 작용의 해명에 따라, 종양항원 단백질 또는 종양항원 펩티드를 소위 암백신으로 이용함으로써, 종양환자의 체내의 종양특이적 CTL 을 증강시키는 치료법이 가능해졌다.

종양항원 단백질로서는, 1991 년에 T. Boon 등이 처음 MAGE 로 명명한 단백질을 사람멜라노머세포로부터 동정하였다 (Science, 254:1643, 1991). 그 후, 몇개의 종양항원 단백질이 주로 멜라노머 세포로부터 동정되어 있다. 멜라노머 항원으로서는, 멜라노사이트조직 특이적 단백질인 gp 100 (J. Exp. Med., 179:1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994), 티로시나아제 (J.Exp.Med., 178:489, 1993) 등의 멜라노솜 단백질, 멜라노머뿐만 아니라 각종 암세포와 정상 정단(精單)세포에 발현하는 MAGE 관련 단밸질군 (J. Exp. Med.,179:921, 1994), 종양특이적인 아미노산 변이를 지닌 β-카테닌 (J. Exp. Med., 183:1185, 1996), CDK4 (Science, 269:1281, 1995) 등이 동정되어 있다. 또, 멜라노머이외의 종양항원 단백질로서는, HER 2/neu (J. Exp. Med., 181:2109, 1995), p 53 (변이형) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14704, 1996) 등의 암유전자 산물, CEA (J. Natl. Cancer. Inst., 87:982, 1995), PSA (J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997) 등의 종양마커, HPV (J. Immunol., 154:5934, 1995), EBV (Int. Immunol., 7:653, 1995) 등의 바이러스 단백질 등이 동정되어 있다. 이들에 대해서는 총설 (Immunol. Today, 18:267, 1997, J. Exp. Med., 183:725, 1996, Curr. Opin. Immunol., 8:628, 1996 등) 의 기술에 자세하다.

종양항원 단밸질이나 종양항원 펩티드를 종양의 치료나 진단에 응용하기 위해서는, 멜라노머에 비해 발생빈도가 압도적으로 높은 편형상피암 (식도암, 폐암 등) 등에 폭넓게 적응 가능한 종양항원의 동정이 중요하다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 식도암 유래의 편평상피암세포에서 종양항원 단백질을 코드하는 유전자의 클로닝을 행한 결과, 멜라노머이외의 종양세포를 비롯하여, 신규인 종양항원 단백질 (SART-1) 을 코드하는 유전자의 클로닝에 성공하고, 상기 SART-1 로부터 HLA-A26 항원 또는 HLA-A24 항원에 결합하여 제시되는 몇가지 종양항원 펩티드부분을 동정하였다 (J. Exp. Med., 187:277, 1998, 국제공개 제 97/46676 호 팜플렛).

그러나, 상기 SART-1 이 HLA-A2 항원에 결합하여 제시되는 종양항원 펩티드부분을 가지는지의 여부, 즉 SART-1 유래의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드가 존재하고 있는지의 여부에 대해서는 분명하지 않다.

본 발명은 SART-1 유래의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은, SART-1 유래의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드 및 기능적으로 동등한 특성을 가지는 그 유도체, 이들의 종양항원 펩티드 및 그 유도체를 생체내 또는 생체외로 이용한 종양의 치료제, 예방제, 또는 진단약 등에 관한 것이다.

본 발명은 SART-1 유래의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉,본 발명은 SART-1 유래의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드 및 기능적으로 동등한 특성을 가지는 그 유도체, 또는 이들의 종양항원 펩티드 및 그 유도체를 생체내 또는 생체외로 이용한 종양의 치료제, 예방제 또는 진단약 등을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 SART-1 유래의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드는, 일본인 또는 백인의 약 40 % 가 보유하고 있는 HLA 항원인 HLA-A2 에 결합하여 제시되는 종양항원 펩티드이므로, 많은 환자에게 적용가능하며, 또한 사람의 암에서 가장 많이 관찰되는 편형상피암 등에 응용할 수있는 것이므로, 신규인 항종양제로서의 유용성이 기대된다. 이와 관련하여 편평상피암 중 식도암이나 폐암에서의 평편상피암은, 현재의 화학요법이나 방사선요법에 비교적 저항성을 나타냄이 알려져 있다. 그 점으로부터도, 본 발명의 종양항원 펩티드의 개발이 기대된다.

본 발명자들은, SART-1 분자 중에, HLA-A2 구속성의 종양항원 펩티드가 존재하고 있는지의 여부를 조사하기 위해, 이하의 시도를 행하였다.

우선, 본 발명자들은 조직형이 평현상피암으로 분류되는 식도암의 수술검체의 종양내 침윤림프구 (TIL) 에서 HLA-A2 구속성의 CTL 주를 수립(樹立)하고, 이것을 YK-EC (수탁번호 : FERM BP-6276) 이라 명명하였다. 이어서, SART-1 cDNA 의 재조합 플라스미드와 HLA-A0201 cDNA 의 재조합 플라스미드를 VA-13 세포에 이중감염시키고, 그 이중 감염체에 앞의 YK-EC 를 작용시키는 바, YK-EC 가 활성되어IFN-γ를 생산하는 것이 발견되었다. 이 결과에 의해, SART-1 에는 HLA-A2 구속성의 종양항원 펩티드가 존재하고 있음이 비로소 분명해졌다.

본 발명자들은 또 HLA-A2 에 결합하여 제시되는 SART-1 유래의 부분펩티드의 동정을 시도하여, 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 6 에 기재의 아미노산 배열로 나타내어지는 펩티드 등에 종양항원 펩티드로서의 활성이 있음을 밝혔다.

본 발명은 이상과 같은 견지에 기초하여 완성하기 이른 것이다.

즉, 본 발명은

(1) SART-1 유래의 부분펩티드이며, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 세포상해성 T 세포에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 가지는 그 유도체;

(2) 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는, 상기 (1) 기재의 종양항원 펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 가지는 그 유도체;

(3) 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 6 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는, 상기 (2) 기재의 종양항원 펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 가지는 그 유도체;

(4) 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 제 2 위 및/또는 C 말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산기로 치환된 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는, 상기 (2) 기재의 종양항원 펩티드 유도체;

(5) 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 6 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 제 2 위 및/또는 C 말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산잔기로 치환된 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는 상기 (4) 기재의 종양항원 펩티드 유도체;

(6) 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 제 2 위가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산 잔기가 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산잔기로 치환된 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는 상기 (4) 기재의 종양항원 펩티드 유도체;

(7) 배열번호 : 35 ∼ 배열번호 : 40 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는, 상기 (6) 기재의 종양항원 펩티드 유도체;

(8) 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 한 기재의 종양항원 펩티드 및 그 유도체에서 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제 또는 예방제;

(9) 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 한 기재의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체를 코드하는 DNA 의 적어도 1 종을 함유하는 재조합 DNA;

(10) 상기 (9) 기재의 재조합 DNA 를 발현시켜 얻어질 수 있는 폴리펩티드;

(11) 상기 (9) 기재의 재조합 DNA 또는 상기 (10) 기재의 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제 또는 예방제;

(12) 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 한 기재의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체 또는 상기 (10) 기재의 폴리펩티드를 함유하여 이루어지는 진단약;

(13) 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 한 기재의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체에 특이적으로 결합하는 항체;

(14) 종양환자 유래의 단리된 항원제시능을 가지는 세포의 표면에, HLA-A2 항원과 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 한 기재의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체의 복합체를 제시시켜 이루어지는 항원제시세포;

(15) 상기 (9) 기재의 재조합 DNA 또는 상기 (10) 기재의 폴리펩티드를, 종양환자 유래의 단리된 항원제시능을 가지는 세포에 넣어 얻어질 수 있는 상기 (14) 기재의 항원제시세포;

(16) 상기 (14) 또는 (15) 기재의 항원제시세포를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제;

(17) HLA-A2 항원과 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 한 기재의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체와의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포상해성 T 세포;

(18) 상기 (17) 기재의 세포상해성 T 세포를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제;

(19) 수탁번호가 FERM BP-6726 인 상기 (17) 기재의 세포상해성 T 세포 YK-EC; 및

(20) 상기 (19) 기재의 YK-EC 를 사용하는 것을 특징으로 하는 종양항원 단백질 또는 종양항원 펩티드의 동정방법

을 제공하는 것이다.

본 명세서 중, 본 발명에 관해 「종양항원 펩티드」란, 종양항원 단백질 SART-1 (J. Exp. Med., 187:277, 1998, 국제공개 제 97/46676 호 팜플렛) 유래의 부분펩티드이며, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 세포상해성 T 세포 (CTL) 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드를 가리킨다. 즉, 국제공개 제 97/46676 호 팜플렛의 배열번호 : 1 에 기재된 SART-1 의 아미노산 배열의 일부로 이루어진 펩티드이며, 또한 상기 펩티드와 HLA-A2 항원의 결합복합체가 CTL 에 의해 인식될 수 있는 펩티드이면, 해당 SART-1 의 아미노산배열 중의 어떤 위치에 있는 어떤 길이의 펩티드라도, 모두 본 발명의 종양항원 펩티드의 범주에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 종양항원 펩티드는 SART-1 의 일부로 이루어진 후보펩티드를 합성하고, 상기 펩티드와 HLA-A2 항원과의 복합체가 CTL 에 의해 인식되는지의 여부, 즉 후보펩티드가 종양항원 펩티드로서의 활성을 가지는지의 여부를 본 명세서에 기재된 방법 또는 당업자가 이용가능한 방법으로 분석함으로써 동정할 수 있다.

여기에서, 펩티드의 합성에 대해서는, 통상적인 펩티드화학에서 사용되는 방법에 준하여 행할 수 있다. 상기 공지방법으로서는 문헌 (펩타이드·신세시스 (Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966; 더·프로테인즈 (The Proteins), Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; 펩티드합성, 마루젠 (주), 1975; 펩티드합성의 기초와 실험, 마루젠 (주), 1985; 의약품의 개발 속 제 14 권·펩티드합성, 히로가와서점, 1991) 등에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서 「HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있다」 란, 본 발명의 종양항원 펩티드가 HLA-A2 항원과 결합하여 복합체를 형성하고, 이러한 복합체를 CTL 이 인식할 수 있는 것을 말한다.

상기 후보펩티드가 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는지의 여부, 즉 상기 펩티드가 HLA-A2 구속성의 종양항원 펩티드로서의 활성을 가지고 있는지의 여부는, 예컨대 J. Immunol., 154, p2257, 1995 에 기재된 측정방법에 의해 조사할 수 있다. 구체적으로는, HLA-A2 항원 양성의 사람으로부터 말소혈 림프구를 단리하고, 생체외로 펩티드를 첨가하여 자극한 경우에, 상기 후보펩티드를 펄스한 HLA-A2 양성세포를 특이적으로 인식하는 CTL 이 유도되는지의 여부에 따라 측정할 수 있다. 여기에서 CTL 의 유도(誘導)의 유무는 예컨대, 항원펩티드 제시세포에 반응하여 CTL 이 생산하는 다양한 사이토카인 (예컨대 IFN-γ) 의 양을 산소면역측정법 (ELISA) 등에 의해 측정함으로써 조사할 수 있다. 그 때의 항원펩티드 제시세포 (표적세포) 로서는, 예컨대 HLA-A2 양성이지만 내인성 펩티드 제시능이 결손되어 있는 T2 세포 (Immunogenetics, 21:235, 1985), 또는 HLA-A2 cDNA (Genbank Accession No. M84379) 발현플라즈마를 COS-7 세포 (ATCC No. CRL1651) 나 VA-13 세포 (리카가쿠연구소 세포은행) 에 도입한 세포 등에 대해 상기 펩티드를 펄스한 세포를 들 수 있다. 또,⁵¹Cr 로 표식한 항원펩티드 제시세포에 대한 CTL 의 상해성을 측정하는 방법 (⁵¹Cr 방출 분석법, Int. J. Cancer, 58:p317, 1994) 에 의해서 조사할 수도 있다.

또는, HLA-A2 양성이지만 내인성 펩티드 제시능이 결손되어 있는 T2 세포 (Immunogenetics, 21:235, 1985), 또는 HLA-A2 cDNA (Genbank Accession No. M84379) 발현플라즈마를 COS-7 세포 (ATCC No. CRL1651) 나 VA-13 세포 (리카가쿠 연구소 세포은행) 에 도입한 세포 등에 대해 상기 후보펩티드를 펄스하고, 이 세포에 대해, 본 발명에서 수립된 HLA-A2 구속성의 CTL 주(株)인 YK-EC (수탁번호 : FERM BP-6726) 나 상기에서 조제한 CTL 등을 반응시켜, 이들의 CTL 이 생산하는 다양한 사이토카인 (예컨대 IFN-γ) 의 양을 측정함으로써 조사할 수도 있다 (J. Exp. Med. 187:277, 1998)

이상과 같은 측정법을 이하 「종양항원 펩티드의 측정법」이라 칭하기도 한다.

HLA 항원에 결합하여 제시되는 항원펩티드의 배열에는 어떤 규칙성 (모티브) 가 존재하지만, HLA-A2 에 관해서는 이하의 표 1 에 나타낸 모티브가 알려져 있다 (Immunogenetics, 41:178, 1995, J. Immunol., 155:4749-4756, 1995)

표 1HLA-A2 구속성 항원펩티드의 모티브

HLA-A2 의 타입 N 말단에서 2 번째 아미노산 C 말단의 아미노산

HLA-A0201 L, M V, L

HLA-A0204 L L

HLA-A0205 V, L, I, M L

HLA-A0206 V, Q V, L

HLA-A0207 L L

(펩티드의 길이는 8 ∼ 11 아미노산)

따라서, SART-1 의 아미노산 배열상, 이러한 모티브구조를 가지는 펩티드부분을 상기 펩티드합성법에 의해 합성하고, 상기 펩티드를 상기 종양항원 펩티드의 측정법에 제공함으로써, 본 발명의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드를 선택할 수 있다.

즉, 본 발명의 종양항원 펩티드로서, SART-1 의 아미노산 배열상, 상기와 같은 모티브구조에 관한 펩티드이며, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드가 예시된다. 구체적으로는, 배열번호 : 1 ∼ 배열 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드를 들 수 있다. 펩티드의 길이로서는 HLA-A2 항원에 결합하여 제시된다는 관점에서 8 ∼ 11 아미노산 정도를 생각할 수 있다.

여기에서, 배열번호 : 1 ∼ 배열 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열에서 그 배열의 「전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드」란 이하의 것을 가리킨다.

1) 배열번호 : 1 ∼ 배열 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열로 이루어진 펩티드 또는 배열번호 : 1 ∼ 배열 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 연속된 일부분으로 이루어진 펩티드; 또는

2) 상기 1) 에 기재한 펩티드를 포함하는 펩티드

이며, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 펩티드를가리킨다.

여기에서, 상기 1) 및 2) 의 펩티드 길이로서는 8 ∼ 11 아미노산 정도인 것을 들 수 있다. 또, 상기 2) 의 펩티드의 예로서, 배열번호 : 1 ∼ 배열 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전장(全長)을 포함하고, 상기 아미노산 배열에서 N 말단방향 및/또는 C 말단방향으로 긴 펩티드, 배열번호 : 1 ∼ 배열 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 C 말단 또는 N 말단측의 아미노산이 결실(缺失)되여 얻어지는 아미노산 배열의 N 단말 및 / 또는 C 단말에 다른 아미노산이 부가되어 이루어지는 펩티드이며, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 펩티드를 들 수 있다.

상기 종양항원 펩티드 중 바람직한 것으로서는, 배열번호 : 1 ∼ 배열 : 20 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드를 들 수 있다. 여기에서 해당 아미노산 배열의 「전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드」란, 상기 1) 및 2) 의 펩티드와 동일한 펩티드를 가리킨다.

일예로서, 배열번호 : 1 ∼ 배열 : 6 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드를 들 수 있다. 여기에서 해당 아미노산 배열의 「전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드」란, 상기 1) 및 2) 의 펩티드와 동일한 펩티드를 가리킨다.

본 발명에서, 「종양항원 펩티드와 기능적으로 동등한 특성을 가지는 유도체」(이하, 종양항원 펩티드 유도체로 약칭하는 경우가 있음) 란, 본 발명의 종양항원 펩티드의 아미노산 배열의 1 ∼ 수개의 아미노산 잔기를 개변한 개변체이며, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있다는 종양항원 펩티드로서의 특성을 가지는 것을 말한다. 즉, 본 발명의 종양항원 펩티드의 아미노산 배열에 대해 1 또는 수개의 아미노산 잔기를 개변한 개변체이며, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있다는 종양항원 펩티드로서의 활성을 가지는 것은 모두 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체의 범주에 포함된다.

여기에서 아미노산 잔기의 「개변」이란, 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는/또는 부가 (펩티드의 N 단말, C 말단으로의 아미노산의 부가도 포함) 를 의미하고, 바람직하게는 아미노산 잔기의 치환을 들 수 있다. 아미노산 잔기의 치환에 관계하는 개변의 경우, 치환되는 아미노산 잔기의 수 및 위치는 종양항원 펩티드로서의 활성이 유지되는 한 임의이다. 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체의 길이로서는 상기 종양항원 펩티드와 동일한 8 ∼ 11 아미노산 정도가 바람직하다.

앞에 기재한 바와 같이, HLA 항원에 결합하여 제시되는 항원펩티드의 배열에는 규칙성 (모티브) 가 있고, HLA-A2 항원의 경우, 상기 표 1 에 나타낸 모티브가 알려져 있다 (Immunogenetics, 41:178, 1995, J. Immunol., 155:4749-4756, 1995). 또, 상기 모티브상 취할 수 있는 아미노산과 유사한 성질을 가지는 아미노산 잔기도 허용될 가능성이 있다. 따라서, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체의 예로서 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 34 (바람직하게는 배열번호 : 1 ∼ 배열 : 20) 중어느 한 기재의 아미노산 중, 상기 모티브에 비추어 아미노산의 치환이 가능한 위치, 즉 제 2 위 및 / 또는 C 단말의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양항원 펩티드 유도체를 들 수 있다. 바람직하게는 제 2 위 및 / 또는 C 단말의 아미노산 잔기를 상기 모티브상 치환이 가능한 아미노산 잔기로 치환한 것, 즉 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 34 (바람직하게는 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 20) 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 제 2 위를 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산 잔기를 발린 또는 류신으로 치환한 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양항원 펩티드 유도체를 들 수 있다. 펩티드 길이는 HLA-A2 항원에 결합하여 제시된다는 관점에서 8 ∼ 11 아미노산 정도가 바람직하다.

일예로서 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 6 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 제 2 위 및 / 또는 C 단말의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양항원 펩티드 유도체를 들 수 있고, 바람직하게는 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 6 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 제 2 위를 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민으로 치환하고, 및 / 또는 C 말단을 발린 또는 류신으로 치환한 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양항원 펩티드 유도체를 들 수 있다. 이들의 개변 펩티드의 예를 각각 배열번호 : 35 ∼ 배열번호 : 40 으로 나타낸다.

또, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체는 본 발명의 종양항원 펩티드와 동일하게, 후보가 되는 펩티드를 상기 펩티드합성법에 기초하여 합성하고, 이것을 상기종양항원 펩티드의 측정법에 제공함으로써, 종양항원 펩티드와 기능적으로 동등한 특성을 가지는지의 여부를 동정할 수 있다.

본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체는 1 종 또는 2 종 이상 조합함으로써, 종양의 치료제 또는 예방제로서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은 종양항원 펩티드 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 종양의 치료제 또는 예방제를 제공하는 것이다. 본 발명의 종양의 치료제 또는 예방제를 HLA-A2 양성 또는 SART-1 양성의 환자에게 투여하면, 항원제시세포의 HLA-A2 항원에 종양항원 펩티드 또는 그 유도체가 그대로 세포표면의 HLA-A2 분자와 결합하거나, 또는 항원제시세포내로 포함된 후, HLA 항원과 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 항원제시세포표면에 고밀도로 제시됨으로써, 제시된 HLA-A2 항원복합체 특이적 CTL 이 증식하여 종양세포를 파괴할 수 있고, 따라서 종양의 치료 또는 예방이 가능해진다.

SART-1 은 식도암, 폐암 등의 편평상피암 등에 광범위하게 발현되고 있기 때문에, 본 발명의 종양의 치료제 또는 예방제는 적용범위가 넓은 것이 유리하다. 또한, 상기 편평상피암은 화학요법이나 방사선요법에 저항성을 나타내는 경우가 많지만, 본 발명의 종양의 치료제를 병용함으로써, 치료효과를 높이는 것이 가능해진다.

본 발명의 종양의 치료제 또는 예방제는 세포성 면역이 효과적으로 성립하도록 보조제와 함께 투여하거나, 입자상의 제형으로 투여할 수 있다.

보조제로서는 문헌 (Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994) 에 기재된 것이 적용가능하다. 또, 리포솜제제, 직경수 (㎛) 의 비즈에 결합시킨 입자상의제제, 지질을 결합시킨 제제 등도 생각할 수 있다. 투여방법으로서는 피내투여, 피하투여, 정맥주사 등을 생각할 수 있다. 제제중의 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체의 투여량은 치료목적의 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적당하게 조정할 수 있지만, 통상 0.0001 ㎎ ∼ 1000 ㎎, 바람직하게는 0.001 ㎎ ∼ 100 ㎎, 보다 바람직하게는 0.01 ㎎ ∼ 10 ㎎ 이며, 이것을 수일 내지 수개월에 1 회 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 종양의 치료제 또는 예방제로서, 상기와 같은 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체는 유효성분으로 하는 경우 이외, 이하에 서술하는 바와 같이 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체를 코드하는 DNA 나 해당 DNA 의 발현산물인 폴리펩티드도, 본 발명의 종양의 치료제 또는 예방제의 유효성분으로 할 수 있다.

즉, 최근 복수의 CTL 에피토프를 결합시킨, 소위 「폴리토프」를 코드하는 DNA 를 DNA 백신에 이용하는 수법이 사용되고 있다 (예컨대, Journal of Immunology, 160, p 1717, 1998 등을 참조할 것). 따라서, 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체를 코드하는 DNA 를 적어도 1 종 또는 2 종 이상 결합시킴으로써, 또한 원하는 바에 따라 다른 종양항원 펩티드를 코드하는 DNA 도 결합시킴으로써 제작된 재조합 DNA 를, 적당한 발현벡터로 조합함으로써 종양의 치료제 또는 예방제의 유효성분으로 할 수 있다. 또, 상기의 재조합 DNA 를 치료제 또는 예방제로서 사용할 뿐만아니라, 해당 재조합 DNA 를 숙주세포내에서 발현시켜 얻어진 폴리펩티드도 종양의 치료제 또는 예방제의 유효성분으로 할 수 있다.

여기에서 「재조합 DNA」은, DNA 합성 및 통상적인 유전자 공학적 수법에 기초하여, 예컨대 (Molecular Cloning 2 nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) 등의 기본서에 따라 용이하게 제작할 수 있다. 또, 이 재조합 DNA 의 발현벡터로의 조합도 상기 기본서 등에 따라 행할 수 있다.

제작된 본 발명의 재조합 DNA 가, HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드를 발생시키는지의 여부는, 예컨대 이하의 방법에 의해 측정할 수 있다.

즉, 우선 COS-7 세포 (ATCC CRL1651) 나 VA-13 세포 (리카가쿠연구소 세포개발은행) 라는 세포에 대해, 후보로 되는 재조합 DNA 를 가지는 발현 플라스미드와, HLA-A2 항원을 코드하는 cDNA (Genbank Accession No. M84379) 를 가지는 발현 플라스미드를 이중감염시킨다. 감염은 예컨대 리포팩트아민 시약 (GIBCO BRL 사 제조) 을 사용한 리포팩틴법 등에 의해 행할 수 있다. 그 후, HLA-A2 에 구속성의 CTL (예컨대 YK-EC, FERM BP-6726) 를 첨가하여 작용시키고, 상기 CTL 이 반응하여 생산하는 다양한 사이토카인 (예컨대 IFN-γ) 의 양을 예컨대 ELISA 법 등으로 측정함으로써 후보 DNA 가 활성을 가지는지의 여부를 조사할 수 있다.

본 발명의 재조합 DNA 를 종양의 치료제 또는 예방제로서 적용할 때에는 이하의 방법을 사용할 수 있다.

즉, 본 발명의 재조합 DNA 를 세포내로 도입하는 방법으로서는, 바이러스 벡터에 의한 방법 및 그 외의 방법 (닛케이사이언스, 1994 년 4 월호, 20 - 45 페이지, 월간약사, 36 (1), 23 - 48 (1994), 실험의학증간, 12 (15), (1994) 및 이들의인용문헌 등) 의 어느 방법도 적용할 수 있다.

바이러스 벡터에 의한 방법으로서는, 예컨대 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노관련 바이러스, 헤르패스 바이러스, 백시니어 바이러스, 폭스 바이러스, 폴리오 바이러스, 심비스 바이러스 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 본 발명의 DNA 를 조합하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중에서, 레트로 바이러스, 아데노관련 바이러스, 백시니어 바이러스 등을 사용한 방법이 특히 바람직하다.

그 외의 방법으로서는, 발현 플라스미드를 직접 근육내로 투여하는 방법 (DNA 백신법), 리포솜법, 리포팩틴법, 마이크로주입법, 인산칼슘법, 전기천공법 등을 들 수 있고, 특히 DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.

본 발명의 재조합 DNA 를 실제로 의약으로서 작용시키기 위해, 해당 DNA 를 직접 체내로 도입하는 인비보 (in vivo) 법, 및 사람에게서 어떤 종류의 세포를 채집하여 체외에서 DNA 를 상기 세포로 도입하여 그 세포를 체내로 되돌리는 엑스비보 (ex vivo) 법이 있다 (닛케이사이언스, 1994 년 4 월호, 20 - 45 페이지, 월간약사, 36 (1), 23 - 48 (1994), 실험의학증간, 12 (15), (1994) 및 이들의 인용문헌 등). 인비보법이 보다 바람직하다.

인비보법에 따라 투여할 경우, 치료목적의 환자, 증상 등에 따른 적당한 투여경로에 따라 투여될 수 있다. 예컨대, 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육내 등으로 투여할 수 있다. 인비보법에 의해 투여할 경우는, 예컨대 액제 등의 제제형태를 취할 수 있지만, 일반적으로 유효성분인 본 발명의 재조합 DNA 를 함유하는주사제 등으로 되어, 필요에 따라 관용의 담체를 첨가해도 된다. 또, 본 발명의 재조합 DNA 를 함유하는 리포솜 또는 막융합 리포솜 (센다이 바이러스 (HVJ) - 리포솜 등) 에서는 현탁제, 동결제, 원심분리 농축동결제 등의 리포솜제제의 형태로 할 수 있다.

제제중의 본 발명의 재조합 DNA 의 함량은 치료목적의 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적당하게 조정할 수 있지만, 통상 0.0001 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 0.001 ㎎ ∼ 10 ㎎ 의 본 발명의 재조합 DNA 를 수일 내지 수개월에 1 회 투여하는 것이 바람직하다.

이상과 같은 본 발명의 재조합 DNA 의 종양환자로의 투여에 의해, 항원제시세포내에서 해당 재조합 DNA 에 대응하는 폴리펩티드가 고(高)발현된다. 그 후, 세포내 분해를 받아 생긴 개개의 종양항원 펩티드가 HLA 항원과 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 항원제시 세포표면에 고밀도로 제시되고, 이 복합체 특이적인 CTL 이 체내에서 효율적으로 증식하고 또한 종양세포를 파괴한다. 이상과 같이 하여, 종양의 치료 또는 예방이 달성된다.

또, 상기 재조합 DNA 를 발현시켜 얻어질 수 있는 「재조합 폴리펩티드 (또는 간단하게 폴리펩티드로 칭함)」은, 상기 재조합 DNA 을 적당한 발현벡터 (예컨대 pSV-SPORT1 등) 로 조합하여 제작된 발현 플라스미드를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 얻고, 이 형질전환체를 적당한 배지에서 배양함으로써 발현·생산할 수 있다. 여기에서 숙주세포로서는, 대장균 등의 원핵생물, 효모와 같은 단세포 진핵생물, 곤충, 동물 등의 다세포 진핵생물의 세포 등을 들 수 있다. 또, 숙주세포로의 유전자 도입법으로서는 인산칼슘법, DEAE-덱스트란법, 전기펄스법 등이 있다. 이상과 같이 하여 얻어진 폴리펩티드는 일반적인 생화학적방법에 의해 단리정제할 수 있다. 또, 해당 폴리펩티드가 HLA-A2 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드를 발생시키는지의 여부는 예컨대 마크로파지 등의 식세포에 본 발명의 폴리펩티드를 넣어 세포내에서 펩티드 단편(斷片)을 발생시키고, 그 후 상기 펩티드 단편과 HLA-A2 항원과의 복합체에 대해 YK-EC (FERM BP-6726) 등의 CTL 를 첨가하여 작용시켜, 상기 CTL 이 반응하여 생산하는 다양한 사이토카인 (예컨대 IFN-γ) 의 양을 측정함으로써 조사할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 종양의 치료제 또는 예방제로서 적용할 때에는 상기 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체와 동일한 투여형태, 투여방법 및 투여량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 종양환자에게 투여하면, 항원제시 세포내로 넣어지고, 그 후, 세포내 분해를 받아 생긴 개개의 종양항원 펩티드가 HLA 항원과 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 항원제시 세포표면에 고밀도로 제시되고, 이 복합체에 특이적인 CTL 이 체내에서 효율적으로 증식하고 또한 종양세포를 파괴한다. 이상과 같이 하여, 종양의 치료 또는 예방이 달성된다.

본 발명은, 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 예컨대, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D 등 편저, Cold Spring Harber Laboratory Press 출판 New York 1989 등에 기재된 방법에 의해 용이하게 제작된다. 즉, 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체를 사용하여 통상적인 방법에 의해 적당하게 동물을 면역함으로써, 종양항원 펩티드 또는 그 유도체를 인식하는 항체, 또 그 활성을 중화하는 항체를 용이하게 제작할 수 있다. 항체의 용도로서는, 친화 크로마토그래피, 면역학적 진단 등을 들 수 있다. 면역학적 진단은, 이뮤노블롯법, 방사 면역측정법 (RIA), 효소 면역측정법 (ELISA), 형광 또는 발광측정법 등에서 적당하게 선택할 수 있다.

본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체, 또는 본 발명의 재조합 DNA 또는 상기 재조합 DNA 를 발현시켜 얻어지는 폴리펩티드는, 종양환자의 치료에서 이하와 같이 생체외로 이용하는 것이 가능하다.

즉, 종양항원 펩티드 또는 그 유도체 등을 종양의 치료에 사용할 경우, 환자의 체내에서 효율성 있게 특이적인 CTL 를 유도하는 것이 가능한 투여법이 중요해진다. 그로 인한 수단의 하나로서, 본 발명은 종양환자 유래의 단리된 항원제시능을 가지는 세포의 표면에, HLA-A2 항원과 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체와의 복합체를 제시시킨 항원제시세포, 및 상기 항원제시세포를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제를 제공하는 것이다.

여기에서, 「항원제시능을 가지는 세포」란, 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체를 제시하는 것이 가능한 HLA-A2 항원을 세포표면에 발현하는 세포라면 특별히 한정되지 않지만, 특히 항원제시능이 높게 되는 수상(樹狀)세포가 바람직하다.

또, 상기 항원제시능을 가지는 세포로부터 본 발명의 항원제시세포를 조제하기 위해 첨가되는 물질로서는 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체뿐만 아니라 본 발명의 재조합 DNA 또는 폴리펩티드라도 된다.

본 발명의 항원제시세포는 종양환자로부터 항원제시능을 가지는 세포를 단리하고, 상기 세포에 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 체외에서 펄스하여 HLA-A2 항원과 상기 펩티드 또는 그 유도체와의 복합체를 제작함으로써 얻어진다 (Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998, J. Immunol., 158:p1796, 1997, Cancer Res., 59:p1184, 1999). 수상세포를 사용하는 경우는 예컨대, 종양환자의 말소혈로부터 피코올법에 의해 림프구를 분리하고, 그 후 비부착세포를 제외하고, 부착세포를 GM-CSF 및 IL-4 존재하에서 배양하여 수상세포를 유도하고, 해당 수상세포를 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 폴리펩티드와 함께 배양하여 펄스함으로써 본 발명의 항원제시세포를 조제할 수 있다.

또, 상기 항원제시능을 가지는 세포에 본 발명의 재조합 DNA 를 도입함으로써 본 발명의 항원제시세포를 조제할 경우는, Cancer Res., 56:p5672, 1996 또는 J. Immunol., 161:p5607, 1998 등을 참고로 하여 행할 수 있다. 또, DNA 뿐만 아니라 RNA 의 형태라도 동일하게 항원제시세포를 조제할 수 있지만, 이 경우는 J. Exp. Med., 184:p465, 1996 등을 참고로 하여 행할 수 있다.

상기 항원제시세포를 유효성분으로 함유하는 종양의 치료제는 항원제시세포를 안정하게 유지하기 위해, 생리식염수, 인산완충 생리식염수 (PBS), 배지 등을 포함하는 것이 바람직하다. 투여방법으로서, 정맥내투여, 피하투여, 피내투여를 들 수 있다. 이와 같은 항원제시세포를 유효성분으로 함유하여 이루어지는종양의 치료제를 환자의 체내로 되돌림으로써 HLA-A2 양성 또한 SART-1 양성의 환자의 체내에서 효율성있게 특이적인 CTL 이 유도되어 종양을 치료할 수 있다.

또, 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체의 생체외로의 이용법으로서, 이하의 양자(養子)면역요법에서의 이용을 들 수 있다.

즉, 멜라노머에서는 환자 본인의 종양내 침윤 T 세포를 체외에서 대량으로 배양하고, 이것을 환자에게 되돌리는 양자면역요법에 치료효과가 관찰되고 있다 (J. Natl. Cancer. Inst., 86:1159, 1994). 또, 마우스의 멜라노머에서는 비(脾)세포를 생체외로 종양항원 펩티드 TRP-2 로 자극하고, 종양항원 펩티드에 특이적인 CTL 을 증식시키고, 상기 CTL 을 멜라노머 이식 마우스에게 투여함으로써, 전이억제가 관찰되고 있다 (J. Exp. Med., 185:453, 1997). 이것은, 항원제시세포의 HLA 항원과 종양항원 펩티드와의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL 을 생체외로 증식시킨 결과에 기초한 것이다. 따라서, 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체, 또는 본 발명의 재조합 DNA 나 폴리펩티드를 사용하고, 생체외로 환자말소혈 림프구를 자극하여 종양특이적 CTL 을 증가시킨 후, 이 CTL 을 환자에게 되돌리는 치료법은 유용하다고 생각된다.

즉, 본 발명은 상기 HLA-A2 항원과 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체와의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL, 및 상기 CTL 을 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제도 제공하는 것이다. 이 치료제는 CTL 을 안정하게 유지하기 위해, 생리식염수, 인산완충 생리식염수 (PBS), 배지 등을 포함하는 것이 바람직하다. 투여방법으로서는 정맥내투여, 피하투여, 피내투여를 들 수 있다.이와 같은 CTL 을 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제를 환자의 체내로 되돌림으로써, HLA-A2 양성 또는 SART-1 양성의 환자의 체내에서의 CTL 에 의한 종양세포의 상해작용이 촉진되고, 종양세포를 파괴함으로써 종양을 치료할 수 있다.

또, 본 발명의 종양항원 펩티드 및 그 유도체, 또는 본 발명의 폴리펩티드는 종양을 진단하기 위한 진단약의 성분으로 할 수 있다. 즉, 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체 그 자체 등을 진단약으로 사용하여, 종양이 의심되는 환자에게서 얻은 시료 (예컨대 혈액, 조양조직 등) 중의 항체의 존재를 검출함으로써, 종양의 조기발견, 재발, 전이를 진단할 수 있다.

또, 본 발명의 종양항원 펩티드 등을 유효성분으로 하는 의약의 적응가능한 종양환자의 선택에도 이용할 수 있다. 구체적으로는, 이뮤노블롯법, RIA, ELISA, 형광 또는 발광측정법 등을 사용함으로써 해당 진단을 행할 수 있다.

최근, 항원펩티드와 HLA 항원과의 복합체를 사용하여 항원 특이적 CTL 을 검출하는 새로운 검출방법이 확립되었다 (Science, 274:p94, 1996). 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체와 HLA-A2 항원과의 복합체를 상기 검출방법에 제공하여 종양항원 특이적 CTL 를 검출함으로써, 종양의 조기발견, 재발, 전이를 진단할 수 있다. 또, 본 발명의 종양항원 펩티드 등을 유효성분으로 하는 의약의 적응가능한 종양환자의 선택이나, 해당 의약에 의한 치료효과의 판정 등에도 이용할 수 있다. 즉, 본 발명에서는 본 발명의 종양항원 펩티드 또는 그 유도체를 함유하는 종양의 진단약도 제공하는 것이다.

구체적으로는, 문헌 (Science, 274:p94, 1996) 에 기재된 방법에 따라 형광표식한 HLA-A2 항원과 종양항원 펩티드와의 복합체의 4 량체를 제작하고, 이것을 사용하여 종양이 의심되는 환자의 말소혈 림프구 중의 항원펩티드 특이적 CTL 을 플로오사이트미터에 의해 정량함으로써 상기 진단을 행할 수 잇다.

본 발명은 또 식도암 유래의 종양내 침윤 림프구에서 수립된 CTL 인, YK-EC (수탁번호 FERM BP-6726) 도 제공하는 것이다. 해당 YK-EC 는, HLA-A2 구속성의 CTL 주(株)임이 분명해지고, 본 발명의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드도, 해당 YK-EC 로의 반응성을 지표로하여 발견된 종양항원 펩티드이다. 따라서, YK-EC 를 이용함으로써, 새로운 종양항원 단백질 및 HLA-A2 구속성의 종양항원 펩티드를 발견할 수 있고, 그러한 방법도 본 발명의 대상이다. 이 방법은 예컨대 상기 「종양항원 펩티드의 측정법」의 기재에 기초하여 실시할 수 있고, 구체예는 후술하는 실시예 2 및 4 에 상세하게 기재되어 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 식도암 유래의 종양내 침윤 림프구 (TIL) 로부터의 세포상해성 T 세포 (CTL) 주의 수립

세키 등 저, Cell. Immunol. 175:101-110, 1997 의 기재에 따라, 조직형이 편형(扁形)상피암으로 분리되는 식도암의 수술검체의 TIL 에서 HLA-A2 구속성의 CTL 주를 수립하고, 이것을 YK-EC 로 명명하여 이하의 실험에 사용하였다. YK-EC 는 이바라기현 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반 3 고오, 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁되어 있다 (미생물의 표시: YK-EC ; 수령일 : 헤이세이 10 년 6 월 19 일 ; 수탁번호 FERM P-16855) (국제기탁으로의 변경일 : 헤이세이 11 년 5 월 20 일 ; 수탁번호 : FERM-BP-6726).

실시예 2 종양항원 단백질 SART-1 에 대한 YK-EC 의 반응성

SW620 세포 (ATCC 주 번호 CCL-227) 로부터 나카오 저, Cancer. Res., 55:4248-4252, 1995 의 기재에 따라, HLA-A0201 의 cDNA (Genbank Accession No. M84379) 를 발현벡터 pCR3 (INVITROGEN 사 제조) 로 조합하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.

이어서, J. Exp. Med., 187:277, 1998 의 기재에 따라, 리포팩틴법에 의해, 이하와 같이 VA-13 세포 (리카가쿠연구소 세포은행, Ann. Med. Exp. Biol. Fenn., 44:242, 1966) 에 대해 HLA-A0201 cDNA 의 재조합 플라스미드와 종양항원 단백질 SART-1 (국제공개 제 97/46676 호 팜플렛) 의 부분배열을 코드하는 cDNA 의 재조합 플라스미드 6DI 를 이중감염시켰다. 또, SART-1 의 cDNA 전장 (국제공개 제 97/46676 호 팜플렛의 배열번호 : 2 에 기재) 을 유지하는 E. coli JM109 (K3) 은 이바라기현 츠쿠바시 히가니 1 쵸메 1 반 3 고오, 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁되어 있고 (미생물의 표시 : E. coli JM109 (K3) ; 수령일 : 헤이세이 9 년 5 월 22 일 ; 수탁번호 FERM BP-5951), 상기 6DI 대신에 상기 FERM-BP-5951 에서 얻어지는 플라스미드 K3 를 사용할 수도 있다.

구체적으로는 VA-13 세포를 96 웰 플레이트의 웰 당 10⁴개 첨가하여 10 %FCS 를 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양 후, 리포팩틴 시약 (GIBCO BRL 사 제조) 을 사용하고, HLA-A0201 cDNA 의 재조합 플라스미드 100 ng 와 6DI 100 ng 를 계 30 ㎕ 의 액량으로 이중감염시켰다. 감염체를 2 점씩 준비하였다. 5 시간 후, 상기 감염체에 200 ㎕ 의 배양액을 첨가하여 다시 72 시간 배양한 후, 배양액을 제거하고, 2 ×10⁴개의 YK-EC 를 첨가하여 18 ∼ 24 시간 배양하였다. 배양액을 회수하여, IFN-γ양을 ELISA 로 측정하였다. 즉, 96 웰 플레이트에 고상화(固相化) 항체로서 항인간 IFN-γ마우스 단일클론성 항체를 흡착시키고, 소혈청 알부민으로 비특이적 결합을 블록한 후, 검체중의 IFN-γ을 항체에 결합시켰다. 이어서, 검출항체로서 항인간 IFN-γ토끼 다클론성 항체를 결착시키고, 또 알칼리포스파타제 표식한 항토끼 이뮤노 글로불린 염소항체 (아마샴사 제조) 를 결합한 후, 페르옥시다아제 발색 키트 T (스미토모백라이트사 제조) 를 사용하여 발색시킨 후, 흡광도 (405 ㎚) 를 측정하였다. 이것을 스탠다드의 IFN-γ로 얻어진 값과 비교함으로써 정량하였다. 또 대조로서, 감염시키지 않은 무처리군, 재조합 플라스미드 6DI 만을 감염시킨 군, HLA-A0201 cDNA 의 재조합 플라스미드만을 감염시킨 군을 설정하였다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다.

표 2YK-EC 가 생산한 IFN-γ양

표적세포 YK-EC 가 생산한 IFN-γ양 (pg/㎖)

VA-13 0

VA-13 + HLA-A0201 12.2

VA-13 + 6DI 22.1

VA-13 + HLA-A0201 + 6DI 94.1

종양항원 단백질 SART-1 의 부분배열을 코드하는 cDNA 의 재조합 플라스미드 6DI 와 HLA-A0201 cDNA 의 재조합 플라스미드를 이중감염시킨 경우, YK-EC 는 다른 군에 비하여 강하게 반응하여 IFN-γ을 생산하였다. 이로 인해, HLA-A0201 에 종양항원 단백질 SART-1 의 항원펩티드가 제시되고, 이것을 YK-EC 가 인식하는 것, 즉 SART-1 에는 HLA-A2 구속성의 종양항원 펩티드가 존재하고 있는 것이 명확해졌다.

실시예 3 종양항원 펩티드의 선태과 합성

HLA 분자에 결합하여 제시되는 항원펩티드의 배열에는 신규성 (모티브) 이 있음이 알려져 있고, HLA-A2 의 경우 표 3 에 나타낸 모티브가 알려져 있다 (Immunogenetics, 41:178, 1995, J. Immunol., 155:4749-4756, 1995)

표 3HLA-A2 구속성 항원펩티드의 모티브

HLA-A2 의 타입 N 말단에서 2 번째 아미노산 C 말단의 아미노산

HLA-A0201 L, M V, L

HLA-A0204 L L

HLA-A0205 V, L, I, M L

HLA-A0206 V, Q V, L

HLA-A0207 L L

(펩티드의 길이는 8 ∼ 11 아미노산)

종양항원 단백질 SART-1 의 아미노산 배열 (국제공개 제 97/46676 호 팜플렛에서 배열번호 : 1 로서 기재된 아미노산 배열) 중 상기 모티브를 가지는 9 ∼ 10 아미노산으로 이루어진 펩티드를 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 34 에 나타낸다. 이중, SART-1 의 아미노산 배열상 제 642 위 ∼ 제 650 위를 가지는 펩티드를 「642 - 650」(배열번호 : 1), 제 642 위 ∼ 제 651 위를 가지는 펩티드를 「642 - 651」(배열번호 : 2) , 제 650 위 ∼ 제 658 위를 가지는 펩티드를 「650 - 658」(배열번호 : 3), 제 660 위 ∼ 제 668 위를 가지는 펩티드를 「660 - 668」(배열번호 : 4), 제 712 위 ∼ 제 720 위를 가지는 펩티드를 「712 - 720」(배열번호 : 5), 제 778 위 ∼ 제 786 위를 가지는 펩티드를 「778 - 786」(배열번호 : 6) 로 명하고, 이하와 같이 고상법으로 합성하였다.

[1]SART-1 「642-650」Leu-Leu-Leu-Cys-Gln-Asn-Lys-Gly-Leu (배열번호 : 1) 의 합성

수지는 Fmoc-Leu-Alko Resin (0.57 mmol/g, 100-200 mesh, (와타나베카가쿠) 을 사용하였다. 이 수지 100 ㎎ 를 사용하여 후기 스케쥴 1 에 따라서 합성을 개시하고, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Cys (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH 를 순차적으로 커플링시켰다. 커플링 후, 하기 스케쥴 1 의 공정 3 까지 행하여 그 결과, 펩티드수지가 얻어졌다.

이 펩티드수지에 Reagent K (5 % 페놀, 5 % 티오아니솔, 5 % H₂O, 2.5 % 에탄디티올 / TFA 용액) 2 ㎖ 을 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 반응시켰다. 빙냉하 반응액에 디에틸에테르 10 ㎖ 를 첨가하여 10 분간 교반하고, 여과하여 10 ㎖ 로 세정하였다. 여과 상기물에 아세트산 10 ㎖ 을 첨가하여 30 분간 교반 후, 수지를 여과 분리하고, 아세트산 4 ㎖ 로 세정하였다. 여과 세정액을 동결건조 후, 얻어진 조(粗)펩티드를 아세트산에 용해하고, 미리 0.1 % TFA 수로 평균화시킨 역상계 충전제 YMC-PACK ODS-A 컬럼 (30 Φ× 250 ㎜) 에 주입하고, 컬럼을 0.1 % TFA 수로 세정 후, 아세트니트릴농도를 180 분동안 30 % 까지 증가시키고, 유속 7 ㎖/분 으로 용출하였다. 용출액을 A220 ㎚ 에서 모니터하고, 목적물을 포함하는 분획을 모으고 동결건조하고, Leu-Leu-Leu-Cys-Gln-Asn-Lys-Gly-Leu 46.3 ㎎ 를 얻었다.

얻어진 펩티드는 역상계 충전제 SUMIPACK ODS-A211 컬럼 (4.0 Φ×250 ㎜) 을 사용한 16 % 에서 46 % 까지의 0.1 % TFA 를 포함하는 아세트니트릴의 직선농도 구배(勾配) 용출법에 의한 분석에서 유지시간 21.0 분을 나타내고, 그 아미노산 분석치 (단, Cys 는 검출하지 않고) 및 질량분석치는 이론치와 일치하였다.

아미노산 분석

가수분해 : 1 % 페놀/6N 염산수용액, 110 ℃, 24 시간

분석법 : 닌히드린법

Asx : 0.9 (1)

Glx ; 1.0 (1)

Gly : 0.9 (1)

*Leu : 4.0 (4) *기준아미노산

Lys : 1.0 (1)

( ) 내이론치

질량분석 (FAB) [M + H]⁺: 1001.6

스케쥴 1

공정 시간 (분) ×처리회수

1. (세정) DMF 1.2 ㎖ 1 ×2

2. (탈보호) 50 % 피페리딘 / DMF 12 ×1

3. (세정) DMF 1.2 ㎖ 1 ×7

4. (커플링) 각 아미노기 보호 아미노산 (5 당량)

/ NMP 용액 0.9 ㎖, DIC (5 당량) / NMP

용액 0.3 ㎖ 30 ×1

5. (세정) DMF 1.2 ㎖ 1 ×2

6. (커플링) 각 아미노기 보호 아미노산 (5 당량)

/ NMP 용액 0.9 ㎖, DIC (5 당량) / NMP

용액 0.3 ㎖ 30 ×1

7. (세정) DMF 1.2 ㎖ 1 ×4

[2]SART-1 「642-651」Leu-Leu-Leu-Cys-Gln-Asn-Lys-Gly-Leu-Leu (배열번호 : 2) 의 합성

수지는 Fmoc-Leu-Alko Resin (0.57 mmol/g, 100-200 mesh) 을 사용하였다. 이 수지 100 ㎎ 를 사용하여 상기 [1] 과 동일하게 하여, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Cys (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH 를 순차적으로 커플링시켰다. 커플링 후, 하기 스케쥴 1 의 공정 3 까지 행하여 그 결과, 펩티드수지가 얻어졌다.

이 펩티드수지에 Reagent K (5 % 페놀, 5 % 티오아니솔, 5 % H₂O, 2.5 % 에탄디티올 / TFA 용액) 2 ㎖ 을 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 반응시켰다. 빙냉하 반응액에 디에틸에테르 10 ㎖ 를 첨가하여 10 분간 교반하고, 여과하여 10 ㎖ 로 세정하였다. 여과 상기물에 아세트산 10 ㎖ 을 첨가하여 30 분간 교반 후, 수지를 여과 분리하고, 아세트산 4 ㎖ 로 세정하였다. 여과 세정액을 동결건조 후, 얻어진 조(粗)펩티드를 아세트산에 용해하고, 미리 0.1 % TFA 수로 평균화시킨 역상계 충전제 YMC-PACK ODS-A 컬럼 (30 Φ× 250 ㎜) 에 주입하고, 컬럼을 0.1 % TFA 수로 세정 후, 아세트니트릴농도를 120 분동안 32 % 까지 증가시키고, 유속 7 ㎖/분 으로 용출하였다. 용출액을 A220 ㎚ 에서 모니터하고, 목적물을 포함하는 분획을 모으고 동결건조하고, Leu-Leu-Leu-Cys-Gln-Asn-Lys-Gly-Leu-Leu 27.1 ㎎ 를 얻었다.

얻어진 펩티드는 역상계 충전제 SUMIPACK ODS-A211 컬럼 (4.6 Φ×250 ㎜)을 사용한 18 % 에서 48 % 까지의 0.1 % TFA 를 포함하는 아세트니트릴의 직선농도 구배 용출법에 의한 분석에서 유지시간 22.8 분을 나타내고, 그 아미노산 분석치 (단, Cys 는 검출하지 않고) 및 질량분석치는 이론치와 일치하였다.

아미노산 분석

가수분해 : 1 % 페놀 / 6N 염산수용액, 110 ℃, 24 시간

분석법 : 닌히드린법

Asx : 1.0 (1)

Glx ; 1.0 (1)

Gly : 0.9 (1)

*Leu : 5.0 (5) *기준아미노산

Lys : 0.9 (1)

( ) 내이론치

질량분석 (FAB) [M + H]⁺: 1114.6

[3]SART-1 「650-658」Leu-Leu-Glu-Thr-Thr-Val-Gln-Lys-Val (배열번호 : 3) 의 합성

수지는 Fmoc-Val-Alko Resin (0.62 mmol/g, 100-200 mesh) 을 사용하였다. 이 수지 100 ㎎ 를 사용하여 상기 [1] 과 동일하게 하여, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH 를 순차적으로 커플링시켰다. 커플링후, 하기 스케쥴 1 의 공정 3 까지 행하여 그 결과, 펩티드수지가 얻어졌다.

이 펩티드수지에 Reagent K (5 % 페놀, 5 % 티오아니솔, 5 % H₂O, 2.5 % 에탄디티올 / TFA 용액) 2 ㎖ 을 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 반응시켰다. 빙냉하 반응액에 디에틸에테르 10 ㎖ 를 첨가하여 10 분간 교반하고, 여과하여 10 ㎖ 로 세정하였다. 여과 상기물에 아세트산 10 ㎖ 을 첨가하여 30 분간 교반 후, 수지를 여과 분리하고, 아세트산 4 ㎖ 로 세정하였다. 여과 세정액을 동결건조 후, 얻어진 조(粗)펩티드를 아세트산에 용해하고, 미리 0.1 % TFA 수로 평균화시킨 역상계 충전제 YMC-PACK ODS-A 컬럼 (30 Φ× 250 ㎜) 에 주입하고, 컬럼을 0.1 % TFA 수로 세정 후, 아세트니트릴농도를 180 분동안 30 % 까지 증가시키고, 유속 7 ㎖/분 으로 용출하였다. 용출액을 A220 ㎚ 에서 모니터하고, 목적물을 포함하는 분획을 모으고 동결건조하고, Leu-Leu-Glu-Thr-Thr-Val-Gln-Lys-Val 32.2 ㎎ 를 얻었다.

얻어진 펩티드는 역상계 충전제 SUMIPACK ODS-A211 컬럼 (4.6 Φ×250 ㎜) 을 사용한 11 % 에서 41 % 까지의 0.1 % TFA 를 포함하는 아세트니트릴의 직선농도 구배 용출법에 의한 분석에서 유지시간 20.2 분을 나타내고, 그 아미노산 분석치 (단, Cys 는 검출하지 않고) 및 질량분석치는 이론치와 일치하였다.

아미노산 분석

가수분해 : 1 % 페놀 / 6N 염산수용액, 110 ℃, 24 시간

분석법 : 닌히드린법

Thr : 1.6 (2)

Glx ; 1.9 (2)

Val : 1.8 (2)

*Leu : 2.0 (2) *기준아미노산

Lys : 0.9 (1)

( ) 내이론치

질량분석 (FAB) [M + H]⁺: 1030.6

[4]SART-1 「660-668」Arg-Val-Lys-Ala-Pro-Asn-Lys-Ser-Leu (배열번호 : 4) 의 합성

수지는 Fmoc-Leu-Alko Resin (0.57 mmol/g, 100-200 mesh) 을 사용하였다. 이 수지 100 ㎎ 를 사용하여 상기 [1] 과 동일하게 하여, Fmoc-Ser (tBu)-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg (Pmc) -OH 를 순차적으로 커플링시켰다. 커플링 후, 하기 스케쥴 1 의 공정 3 까지 행하여 그 결과, 펩티드수지가 얻어졌다.

이 펩티드수지에 Reagent K (5 % 페놀, 5 % 티오아니솔, 5 % H₂O, 2.5 % 에탄디티올 / TFA 용액) 2 ㎖ 을 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 반응시켰다. 빙냉하 반응액에 디에틸에테르 10 ㎖ 를 첨가하여 10 분간 교반하고, 여과하여 10 ㎖ 로 세정하였다. 여과 상기물에 아세트산 10 ㎖ 을 첨가하여 30 분간 교반 후,수지를 여과 분리하고, 아세트산 4 ㎖ 로 세정하였다. 여과 세정액을 동결건조 후, 얻어진 조(粗)펩티드를 아세트산에 용해하고, 미리 0.1 % TFA 수로 평균화시킨 역상계 충전제 YMC-PACK ODS-A 컬럼 (30 Φ× 250 ㎜) 에 주입하고, 컬럼을 0.1 % TFA 수로 세정 후, 아세트니트릴농도를 180 분동안 20 % 까지 증가시키고, 유속 7 ㎖/분 으로 용출하였다. 용출액을 A220 ㎚ 에서 모니터하고, 목적물을 포함하는 분획을 모으고 동결건조하고, Arg-Val-Lys-Ala-Pro-Asn-Lys-Ser-Leu 44.7 ㎎ 를 얻었다.

얻어진 펩티드는 역상계 충전제 SUMIPACK ODS-A211 컬럼 (4.6 Φ×250 ㎜) 을 사용한 6 % 에서 36 % 까지의 0.1 % TFA 를 포함하는 아세트니트릴의 직선농도 구배 용출법에 의한 분석에서 유지시간 20.2 분을 나타내고, 그 아미노산 분석치 (단, Cys 는 검출하지 않고) 및 질량분석치는 이론치와 일치하였다.

아미노산 분석

가수분해 : 1 % 페놀 / 6N 염산수용액, 110 ℃, 24 시간

분석법 : 닌히드린법

Asx : 0.9 (1)

Ser ; 0.7 (1)

Ala : 0.9 (1)

Val : 0.9 (1)

*Leu : 1.0 (1) *기준아미노산

Lys : 1.7 (2)

Arg : 0.8 (1)

Pro : 0.9 (1)

( ) 내이론치

질량분석 (FAB) [M + H]⁺: 1012.6

[5]SART-1 「712-720」Tyr-Val-Asp-Glu-Thr-Gly-Arg-Lys-Leu (배열번호 :5) 의 합성

수지는 Fmoc-Leu-Alko Resin (0.57 mmol/g, 100-200 mesh) 를 사용하였다. 이 수지 100 ㎎ 를 사용하여 상기 [1] 과 동일하게 하여, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Arg (Pmc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc-Asp (OtBu) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Tyr (tBu) -OH 를 순차적으로 커플링시켰다. 커플링 후, 하기 스케쥴 1 의 공정 3 까지 행하여 그 결과, 펩티드수지가 얻어졌다.

이 펩티드수지에 Reagent K (5 % 페놀, 5 % 티오아니솔, 5 % H₂O, 2.5 % 에탄디티올 / TFA 용액) 2 ㎖ 을 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 반응시켰다. 빙냉하 반응액에 디에틸에테르 10 ㎖ 를 첨가하여 10 분간 교반하고, 여과하여 10 ㎖ 로 세정하였다. 여과 상기물에 아세트산 10 ㎖ 을 첨가하여 30 분간 교반 후, 수지를 여과 분리하고, 아세트산 4 ㎖ 로 세정하였다. 여과 세정액을 동결건조 후, 얻어진 조(粗)펩티드를 아세트산에 용해하고, 미리 0.1 % TFA 수로 평균화시킨 역상계 충전제 YMC-PACK ODS-A 컬럼 (30 Φ× 250 ㎜) 에 주입하고, 컬럼을 0.1 %TFA 수로 세정 후, 아세트니트릴농도를 120 분동안 20 % 까지 증가시키고, 유속 7 ㎖/분 으로 용출하였다. 용출액을 A220 ㎚ 에서 모니터하고, 목적물을 포함하는 분획을 모으고 동결건조하고, Tyr-Val-Asp-Glu-Thr-Gly-Arg-Lys-Leu 42.3 ㎎ 를 얻었다.

얻어진 펩티드는 역상계 충전제 SUMIPACK ODS-A211 컬럼 (4.6 Φ×250 ㎜) 을 사용한 7 % 에서 37 % 까지의 0.1 % TFA 를 포함하는 아세트니트릴의 직선농도 구배 용출법에 의한 분석에서 유지시간 20.9 분을 나타내고, 그 아미노산 분석치 (단, Cys 는 검출하지 않고) 및 질량분석치는 이론치와 일치하였다.

아미노산 분석

가수분해 : 1 % 페놀 / 6N 염산수용액, 110 ℃, 24 시간

분석법 : 닌히드린법

Asx : 0.9 (1)

Thr ; 0.9 (1)

Glx : 1.0 (1)

Gly : 0.9 (1)

Val : 0.9 (1)

*Leu : 1.0 (1) *기준아미노산

Tyr : 1.0 (1)

Lys : 0.9 (1)

Arg : 0.9 (1)

( ) 내이론치

질량분석 (FAB) [M + H]⁺: 1080.5

[6]SART-1 「778-786」Ala-Gln-Lys-Thr-Pro-Tyr-Ile-Val-Leu (배열번호 :6) 의 합성

수지는 Fmoc-Leu-Alko Resin (0.57 mmol/g, 100-200 mesh) 을 사용하였다. 이 수지 100 ㎎ 를 사용하여 상기 [1] 과 동일하게 하여, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Ala-OH 를 순차적으로 커플링시켰다. 커플링 후, 하기 스케쥴 1 의 공정 3 까지 행하여 그 결과, 펩티드수지가 얻어졌다.

이 펩티드수지에 Reagent K (5 % 페놀, 5 % 티오아니솔, 5 % H₂O, 2.5 % 에탄디티올 / TFA 용액) 2 ㎖ 을 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 반응시켰다. 빙냉하 반응액에 디에틸에테르 10 ㎖ 를 첨가하여 10 분간 교반하고, 여과하여 10 ㎖ 로 세정하였다. 여과 상기물에 아세트산 10 ㎖ 을 첨가하여 30 분간 교반 후, 수지를 여과 분리하고, 아세트산 4 ㎖ 로 세정하였다. 여과 세정액을 동결건조 후, 얻어진 조(粗)펩티드를 아세트산에 용해하고, 미리 0.1 % TFA 수로 평균화시킨 역상계 충전제 YMC-PACK ODS-A 컬럼 (30 Φ× 250 ㎜) 에 주입하고, 컬럼을 0.1 % TFA 수로 세정 후, 아세트니트릴농도를 120 분동안 30 % 까지 증가시키고, 유속 7 ㎖/분 으로 용출하였다. 용출액을 A220 ㎚ 에서 모니터하고, 목적물을 포함하는 분획을 모으고 동결건조하고, Ala-Gln-Lys-Thr-Pro-Tyr-Ile-Val-Leu 29.3 ㎎ 를얻었다.

얻어진 펩티드는 역상계 충전제 SUMIPACK ODS-A211 컬럼 (4.6 Φ×250 ㎜) 을 사용한 15 % 에서 45 % 까지의 0.1 % TFA 를 포함하는 아세트니트릴의 직선농도 구배 용출법에 의한 분석에서 유지시간 22.6 분을 나타내고, 그 아미노산 분석치 (단, Cys 는 검출하지 않고) 및 질량분석치는 이론치와 일치하였다.

아미노산 분석

가수분해 : 1 % 페놀 / 6N 염산수용액, 110 ℃, 24 시간

분석법 : 닌히드린법

Thr : 0.8 (1)

Glx : 1.0 (1)

Ala : 1.1 (1)

Val : 0.8 (1)

Ile : 0.8 (1)

*Leu : 1.0 (1) *기준아미노산

Tyr : 0.9 (1)

Lys : 0.9 (1)

Pro : 0.9 (1)

( ) 내이론치

질량분석 (FAB) [M + H]⁺: 1032.5

실시예 4 종양항원 펩티드의 동정

HLA-A0201 양성이지만, 내인성펩티드 제시능이 결손되어 있는 T-B 하이브리드머 세포주의 T2 세포 (Immunogenetics, 21:235, 1985) 2 ×10⁴개에 대해 실시예 3 에서 제작한 6 종류의 펩티드를 각각 10 μM 으로 2 시간 첨가한 후, 1 ×10⁵개의 YK-EC 와 함께 18 시간 배양하고, YK-EC 가 생산한 배양 상청중(上淸中)의 IFN-γ양을 실시예 2 와 동일한 ELISA 법으로 측정하였다. 그 결과를 표 4 에 나타낸다.

표 4YK-EC 가 생산한 IFN-γ양

펄스산 펩티드 YK-EC 가 생산한 IFN-γ양 (pg/㎖)

「642-650」 109.1

「642-651」 112.4

「650-658」 118.1

「660-668」 71.1

「712-720」 86.1

「778-786」 105.4

펩티드없음 6.5

표 4 에서 이들 펩티드가 종양항원 펩티드로서 기능하는 것이 나타내었다.

또, 본 실험에서 사용한 T2 세포 대신에 HLA-A2 cDNA 발현 플라스미드를 COS-7 세포 (ATCC No. CRL1651) 나 VA-13 세포 (리카가쿠연구소 세포은행) 에 도입한 세포를 사용함으로써도 동일한 실험을 행할 수 있다.

(J. Exp. Med., 187:277, 1998)

또한, Fmoc 법으로 합성한 배열번호 : 7 ∼ 배열번호 : 20 에 기재된 펩티드를 상기와 동일한 종양항원 펩티드의 동정법에 제공한 결과, 이들 배열번호 : 7 ∼ 배열번호 : 20 에 기재된 펩티드에 대해서도 종양항원 펩티드로서의 활성을 가짐이 분명해졌다.

본 발명에 의해 SART-1 유래의 HLA-A2 구속성 종양항원 펩티드 및 기능적으로 동일한 특성을 가지는 그 유도체, 또는 이들의 종양항원 펩티드 및 그 유도체를 인·비보 또는 인·비트로로 이용한 종양의 치료제, 예방제 또는 진단약 등이 제공된다. 본 발명의 종양의 치료제 또는 예방제는 대부분의 환자에게 적용가능하며, 또한 발생빈도가 높은 편평상피암에 폭넓게 응용할 수 있는 것이기 때문에 항종양제로서의 유용성이 기대된다.

배열표 프리텍스트

배열번호 : 35 에 기재된 아미노산 배열의 제 2 번째의 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민이며, 제 9 번째의 아미노산은 발린 또는 류신이다.

배열번호 : 36 에 기재된 아미노산 배열의 제 2 번째의 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민이며, 제 10 번째의 아미노산은 발린 또는 류신이다.

배열번호 : 37 에 기재된 아미노산 배열의 제 2 번째의 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민이며, 제 9 번째의 아미노산은 발린 또는 류신이다.

배열번호 : 38 에 기재된 아미노산 배열의 제 2 번째의 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민이며, 제 9 번째의 아미노산은 발린 또는 류신이다.

배열번호 : 39 에 기재된 아미노산 배열의 제 2 번째의 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민이며, 제 9 번째의 아미노산은 발린 또는 류신이다.

배열번호 : 40 에 기재된 아미노산 배열의 제 2 번째의 아미노산은 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민이며, 제 9 번째의 아미노산은 발린 또는 류신이다.

Claims (20)

1. SART-1 유래의 부분펩티드이며, 또한 HLA-A2 항원과 결합하여 세포상해성 T 세포에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 가지는 그 유도체.
2. 제 1 항에 있어서, 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는 종양항원 펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 가지는 그 유도체.
3. 제 2 항에 있어서, 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 6 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는 종양항원 펩티드, 또는 기능적으로 동등한 특성을 가지는 그 유도체.
4. 제 3 항에 있어서, 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 제 2 위 및/또는 C 말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산기로 치환된 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는 종양항원 펩티드 유도체.
5. 제 4 항에 있어서, 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 6 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 제 2 위 및/또는 C 말단의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는 종양항원 펩티드 유도체.
6. 제 4 항에 있어서, 배열번호 : 1 ∼ 배열번호 : 34 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 제 2 위가 류신, 메티오닌, 발린, 이소류신 또는 글루타민으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산 잔기가 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는 종양항원 펩티드 유도체.
7. 제 6 항에 있어서, 배열번호 : 35 ∼ 배열번호 : 40 중 어느 한 기재의 아미노산 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 배열에서 선택되는 종양항원 펩티드 유도체.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 종양항원 펩티드 및 그 유도체에서 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제 또는 예방제.
9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 종양항원 펩티드 또는 그 유도체를 코드하는 1 종 이상의 DNA 를 함유하는 재조합 DNA.
10. 제 9 항에 따른 재조합 DNA 를 발현시켜 얻어질 수 있는 폴리펩티드.
11. 제 9 항에 따른 재조합 DNA 또는 제 10 항에 따른 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제 또는 예방제.
12. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 종양항원 펩티드 또는 그 유도체 또는 제 10 항 기재의 폴리펩티드를 함유하여 이루어지는 진단약.
13. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 종양항원 펩티드 또는 그 유도체에 특이적으로 결합하는 항체.
14. 종양환자 유래의 단리된 항원제시능을 가지는 세포의 표면에, HLA-A2 항원과 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 종양항원 펩티드 또는 그 유도체의 복합체를 제시시켜 이루어지는 항원제시세포.
15. 제 14 항에 있어서, 제 9 항에 따른 재조합 DNA 또는 제 10 항에 따른 폴리펩티드를, 종양환자 유래의 단리된 항원제시능을 가지는 세포에 넣어 얻어질 수 있는 항원제시세포.
16. 제 14 항 또는 제 15 항에 따른 항원제시세포를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제.
17. HLA-A2 항원과 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 종양항원 펩티드 또는 그 유도체와의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포상해성 T 세포.
18. 제 17 항에 따른 세포상해성 T 세포를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제.
19. 제 17 항에 있어서, 수탁번호가 FERM BP-6726 인 세포상해성 T 세포 YK-EC.
20. 제 19 항 기재의 YK-EC 를 사용하는 것을 특징으로 하는 종양항원 단백질 또는 종양항원 펩티드의 동정방법.