CN1842603A - 选择适于wt1疫苗患者的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种选择对WT1疫苗高应答患者的方法和包括所述选择方法的用于治疗癌症的治疗方法，该选择对WT1疫苗高应答患者的方法包括：(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；(b)测定(a)中生物学样品的WT1－特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和(c)判断(b)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性。
Description
技术领域
本发明涉及一种选择对WT1疫苗高应答患者的方法以及包括所述选择方法的用于治疗癌症的治疗方法。更具体地，本发明涉及一种在作为指标的WT1-特异性CTL前体频度等基础上选择对WT1疫苗高应答患者的方法。
背景技术
业已鉴定WT1基因(Wilms肿瘤基因1)是Wilms肿瘤即小儿肾肿瘤的致病基因之一(Cell 60：509，1990，Nature 343：774，1990)。WT1基因编码转录因子WT1，WT1在诸如细胞增殖、分化、凋亡以及组织发育的众多过程中起重要作用(Int.Rev.Cytol.181：151，1998)。最初WT1基因被解释是一种肿瘤抑制基因。然而，后续研究揭示WT1基因在白血病和包括肺癌和乳腺癌的多种实体瘤中高表达，因而，表明WT1基因更确切地发挥着促进肿瘤生长的致癌功能。另外，证实用WT1-衍生的肽体外刺激对HLA-A*0201或HLA*-A0202阳性的外周血单核细胞诱导了肽-特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，并且CTLs杀死了内源性表达WT1的白血病和实体瘤细胞。这些结果证实WT1是癌症免疫治疗有希望的靶分子(Int.J.Hematol 76：127，2002)。
已知体外测定抗原肽-特异性CTLs的方法，包括HLA单体方法、HLA二聚体方法和HLA四聚体方法(Science 274：94，1996)、HLA五聚体方法和ELISPOT方法(J.Immunol.Methods 110：29，1988)、实时RT-PCR技术(J.Immunol.Methods 210：195，1997)、有限稀释方法(Br.J.Cancer 77：1907，1998)等等。通过生物素酰化复合物(HLA单体)制备HLA-四聚体，该复合物通过连接肽与HLAα-链和β2-微球蛋白形成，并使其单体与荧光标记的抗生物素蛋白结合以用于四聚化。CTLs频度可通过用HLA四聚体染色肽-特异性CTLs并用流式细胞仪分析而得到测定。通过HLA单体方法、HLA二聚体方法和HLA五聚体方法对CTL频度的测定都可根据相同的原理进行。
未被疫苗刺激的CTLs称为“CTL前体细胞”。认为对给定癌抗原特异的CTL前体细胞存在的频度越高，则诱导特异性CTLs的效率也越高，当所述抗原作为癌疫苗施用时，更易获得癌疫苗治疗的临床应答。换句话说，如果在疫苗接种前选择出表现高频度存在对所选择的给定癌抗原特异的CTLs前体细胞的患者，则使用所述癌抗原治疗可能更有效。
使用HLA四聚体和黑素瘤患者的外周血单核细胞(PBMC)以及在几篇文章中所报道的测定了CTL前体细胞频度，然而，它们显示了对癌抗原肽特异的CTL前体细胞的频度低(J.Immunother.24：66，2001、Hum.Gene.Ther.13：569，2002)。从这些结果可以看出对抗原特异的CTL前体细胞的存在频度通常很低，因此以CTL前体细胞频度作为指标，难以选择适于癌症疫苗的患者。
发明内容
本发明的目的是提供一种在作为指标的WT1-特异性CTL前体细胞频度等基础上选择对WT1疫苗高应答患者的方法。
本发明人使用来自WT1的癌抗原肽制备了HLA四聚体，并在造血恶性肿瘤或肺癌患者中，在疫苗施用前CTL前体细胞频度的测定中使用所产生的四聚体。令人吃惊的是，较迄今为止已知的健康个体，发现CTL前体细胞(WT1-特异性CTL前体细胞)以高频度存在。该结果揭示了，只要与癌抗原相关，以WT1-特异性CTL前体细胞频度为指标即有可能选择对WT1疫苗高应答患者或鉴定WT1疫苗靶分子。同样地，既然患多种癌症的患者显示了高频度的WT1-特异性CTL前体细胞，那么很清楚癌症的诊断可基于作为指标的WT1特异性CTL前体细胞频度。
本发明人接着根据相关的功能对WT1-特异性CTL前体细胞进一步分类，并发现，特别是效应物型CTL前体细胞(此后，可简称为“效应细胞”)在CTL前体细胞中以高比例存在。该结果表明对WT1疫苗高应答患者的选择或癌症的诊断也可在作为指标的效应物型WT1特异性CTL前体细胞的频度基础上进行。
另外，本发明人测定了经历来自WT1癌抗原肽(“WT1肽”)治疗的患者中WT1-特异性CTLs的频度，并发现相对于给药之前所获得的结果，治疗效果与给药后CTL频度的增加相关，。
在上述发现的基础上完成了本发明。
因而，本发明提供了下列各项：
(1)一种选择对WT1疫苗高应答的患者的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(c)判断(b)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性。
(2)如上述(1)的选择方法，其中通过HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种进行WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量的测定。
(3)如上述(2)的选择方法，其中通过HLA四聚体方法进行测定。
(4)如上述(3)的选择方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚体接触；
(c)测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性。
(5)如上述(4)的选择方法，其中通过测定在CD8-阳性或CD8/CD3-阳性CTL前体细胞中HLA四聚体结合细胞的比例进行(4)中步骤(c)。
(6)如上述(4)或(5)的选择方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(7)如上述(4)-(6)中任一项的选择方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
(8)如上述(1)-(7)中任一项的选择方法，其使用流式细胞仪进行。
(9)如上述(1)-(8)中任一项的选择方法，其中使用与健康受试者相比为1.5倍或更高的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量作为指标评价对WT1疫苗的应答性。
(10)如上述(1)的选择方法，其中CTL前体细胞是效应物型CTL前体细胞。
(11)如上述(10)的选择方法，其使用HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种测定效应物型的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量。
(12)如上述(11)的选择方法，其使用HLA四聚体方法。
(13)如上述(12)的选择方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的癌抗原肽、抗-CD8抗体、抗-CD45RA抗体和抗-CD27抗体的HLA四聚体接触；
(c)测定对CD8或CD8/CD3阳性并与HLA四聚体结合的CTL前体细胞中CD45RA-阳性和CD27-阴性的效应物型CTL前体细胞的比例；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性。
(14)如上述(13)的选择方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(15)如上述(13)或(14)的选择方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
(16)如上述(10)-(15)中任一项的选择方法，其使用流式细胞仪进行。
(17)一种诊断癌症的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(c)判断(b)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价测试受试者是否患癌症。
(18)如上述(17)的诊断方法，其中通过HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种进行WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量的测定。
(19)如上述(18)的诊断方法，其中通过HLA四聚体方法进行测定。
(20)如上述(19)的诊断方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚体接触；
(c)测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价测试受试者是否患癌症。
(21)如上述(20)的诊断方法，其中通过测定CD8-阳性或CD8/CD3-阳性CTL前体细胞中HLA四聚体结合细胞的比例进行(20)中步骤(c)。
(22)如上述(20)或(21)的诊断方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(23)如上述(20)-(22)中任一项的诊断方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
(24)如上述(17)-(23)中任一项的诊断方法，其使用流式细胞仪进行。
(25)如上述(17)-(24)中任一项的诊断方法，其中使用与健康受试者相比为1.5倍或更高的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量作为指标诊断癌症。
(26)如上述(17)的诊断方法，其中CTL前体细胞是效应物型CTL前体细胞。
(27)如上述(26)的诊断方法，其使用HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种测定WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量。
(28)如上述(27)的诊断方法，其使用HLA四聚体方法。
(29)如上述(28)的诊断方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的癌抗原肽、抗-CD8抗体、抗-CD45RA抗体和抗-CD27抗体的HLA四聚体接触；
(c)测定对CD8或CD8/CD3阳性并与HLA四聚体结合的CTL前体细胞中CD45RA-阳性和CD27-阴性的效应物型CTL前体细胞的比例；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价测试受试者是否患癌症。
(30)如上述(29)的诊断方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(31)如上述(29)或(30)的诊断方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
(32)如上述(26)-(31)中任一项的诊断方法，其使用流式细胞仪进行。
(33)一种鉴定WT1疫苗的靶分子的方法，所述分子对于患者是特有的，包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将WT1疫苗的多个靶分子分别应用于(a)的生物学样品；
(c)分别测定(b)的生物学样品中的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量，并相互比较结果；和
(d)在(c)中获得结果的基础上鉴定对测试患者有效的WT1疫苗的靶分子。
(34)如上述(33)的鉴定方法，其中使用HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种进行WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量的测定。
(35)如上述(34)的鉴定方法，其中使用HLA四聚体方法进行测定。
(36)如上述(35)的鉴定方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将含有不同WT1-衍生的癌抗原肽的多个HLA四聚体分别与(a)的生物学样品接触；
(c)分别测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量，并相互比较结果；和
(d)在(c)中获得结果的基础上鉴定对测试患者有效的WT1-衍生的癌抗原肽。
(37)如上述(36)的鉴定方法，其中通过测定CD8-阳性或CD8/CD3-阳性CTL前体细胞中与HLA四聚体结合的细胞的比例进行(36)中步骤(c)。
(38)如上述(36)或(37)中的鉴定方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(39)如上述(36)-(38)中任一项的鉴定方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
(40)如上述(33)-(39)中任一项的鉴定方法，其使用流式细胞仪进行。
(41)一种用于选择对WT1疫苗高应答患者的临床诊断试剂，其包含作为成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
(42)如上述(41)的临床诊断试剂，其中作为HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(43)如上述(41)或(42)的临床诊断试剂，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
(44)一种包含如上述(41)-(43)中任一项的临床诊断试剂的试剂盒。
(45)一种用于在给定患者中治疗癌症的药物组合物，其包括如上述(33)-(40)中任一项的WT1疫苗的靶分子的鉴定方法鉴定的靶分子，所述靶分子是患者特有的。
(46)一种用于癌症的诊断试剂，其包含作为成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
(47)如上述(46)的诊断试剂，其中作为HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(48)如上述(46)或(47)的诊断试剂，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
(49)一种试剂盒，其包含如上述(46)-(48)中任一项的诊断试剂。
(50)一种确定患者对WT1疫苗适合性的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)从接受了WT1疫苗的测试受试者中分离含有CTL的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的WT1-特异性CTLs的存在频度或数量；和
(c)判断(b)的测定值相对于WT1疫苗施用前所获得的生物学样品是否高，并评价患者是否适于WT1疫苗治疗。
(51)如上述(50)的确定方法，其中使用HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种进行WT1-特异性CTLs的存在频度或数量的测定。
(52)如上述(51)的确定方法，其中使用HLA四聚体方法进行测定。
(53)如上述(52)的确定方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从接受了WT1疫苗的测试受试者中分离含有CTLs的生物学样品；
(b)将含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚体与(a)的生物学样品接触；
(c)测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTLs的存在频度或数量；和
(d)判断(c)的测定值相对于WT1疫苗施用前所获得的生物学样品是否高，并评价患者是否适于WT1疫苗治疗。
(54)如上述(53)的确定方法，其中通过测定CD8-阳性或CD8/CD3-阳性CTLs中与HLA四聚体结合的细胞的比例进行(53)中步骤(c)。
(55)如上述(53)或(54)中的确定方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(56)如上述(53)-(55)中任一项的鉴定方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
(57)如上述(50)-(56)中任一项的确定方法，其使用流式细胞仪进行。
(58)如上述(50)-(57)中任一项的确定方法，其中使用与给药之前所获得的样品相比为1.5倍或更高的WT1-特异性CTLs的存在频度或数量作为指标评价对WT1疫苗治疗的适合性。
(59)一种用于确定对WT1疫苗适合性的临床诊断试剂，其包含作为成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
(60)如上述(59)的临床诊断试剂，其中作为HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
(61)如上述(59)或(60)的临床诊断试剂，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
(62)一种包含如上述(59)-(61)中任一项的临床诊断试剂的试剂盒。
本发明进一步涉及下列各项：
(63)一种与上述提及的实施方案(1)有关的治疗患者癌症的方法，其包括：
通过下列(a)、(b)和(c)步骤选择对WT1疫苗高应答的患者：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(c)判断(b)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性；和
用WT1或WT1-衍生的癌抗原肽治疗所选择的患者；和
一种治疗患者癌症的方法，其中所述患者通过如上述(2)-(16)中任一项的方法进行选择。
(64)一种与上述提及的实施方案(33)有关的治疗给定患者癌症的方法，其包括施用WT1疫苗的靶分子，所述分子是患者特有的，并通过包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤的方法得到鉴定：
(a)从测试患者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将多个WT1疫苗的靶分子分别应用于(a)的生物学样品；
(c)分别测定(b)的生物学样品的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量，并相互比较结果；和
(d)在(c)中获得结果的基础上鉴定对测试患者有效的WT1疫苗的靶分子；和
一种治疗给定患者癌症的方法，其包括施用WT1疫苗的靶分子，所述分子对于患者是特有的，并通过(34)-(40)中任一项的方法得到鉴定。
(65)一种与上述提及的实施方案(50)有关的治疗癌症的方法，其包括用WT1或WT1-衍生的癌抗原肽治疗患者，所述患者业已通过确定患者对WT1疫苗适合性的方法评价为适合的，包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)在WT1疫苗施用后从患者中分离含有CTLs的生物学样品；
(b)测定(a)的生物学样品中WT1-特异性CTLs的存在频度或数量；
(c)判断(b)的测定值相对于WT1疫苗施用前所获得的生物学样品是否高，并评价患者是否适于WT1疫苗治疗；和
一种治疗患者癌症的方法，所述患者通过上述(51)-(58)中任一项方法的评价是适合的。
附图简述
图1显示了癌症患者和健康个体中WT1-特异性CTL前体的存在频度。纵轴表示CTL前体(前体细胞)的频度。“血癌”表示从HLA-A2402-阳性的造血恶性肿瘤患者中获得的结果。术语“肺癌”表示从HLA-A2402-阳性的肺癌患者中获得的结果，以及术语“健康”表示从HLA-A2402-阳性的健康个体中获得的结果。
发明的最佳实施方式
本发明提供一种选择对WT1疫苗高应答患者的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(c)判断(b)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性，和一种治疗由所述方法选择的患者癌症的方法。
本发明人发现患者在疫苗施用前体内的CTL前体细胞(WT1-特异性CTL前体细胞)频度交较今所知道的都要高。因此，在WT1-特异性CTL前体细胞的数量或频度作为指标的基础上选择对WT1疫苗高应答的患者。
步骤(a)中的测试受试者指被怀疑或诊断患有癌症的人，具体地说，是被怀疑或诊断患有包括血癌如白血病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤和实体瘤如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、和卵巢癌的癌症的人。优选的实施例是被怀疑或诊断患有白血病、骨髓增生异常综合症和肺癌的人。
至于从步骤(a)的测试受试者中分离的生物学样品并没有限制，只要其含有CTL前体细胞即可。具体的例子包括血液、淋巴液或其培养物、分离自血液的外周血单核细胞(PBMCs)、或T细胞浸润的组织等等。生物学样品可直接使用，或稀释或浓缩后使用。优选的例子是PBMC，可通过诸如Ficoll-Hypaque密度梯度离心的常规方法进行分离。
可使用本领域任何已知可以测定CTL的存在频度或数量的方法进行步骤(b)中WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量的测定方法。具体的例子包括HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术、有限稀释方法等等。
在此所用的，HLA四聚体方法是一种其中使用通过生物素酰化HLA单体(通过用目标抗原肽将HLA抗原α链与β2微球蛋白连接形成所述单体)，并使其与用于四聚化的荧光素标记的抗生物素蛋白结合制备的HLA四聚体检测抗原肽-特异性CTL的方法。具体地说，CTL数量可通过用所述HLA四聚体染色抗原肽-特异性CTL并用流式细胞仪分析得到测定。HLA四聚体的制备和CTLs的检测均使用已知的方法，可根据例如文献(Science 274：94，1996)中描述的方法进行。
HLA单体方法是一种其中使用在HLA四聚体制备中使用的HLA单体检测抗原肽-特异性CTL的方法，该单体通过用抗原肽连接HLA抗原α链和β2微球蛋白，接着生物素酰化而形成。
HLA二聚体方法是一种其中使用通过将HLA抗原α链和Ig(免疫球蛋白，例如，IgG1)融合，并使所产生的融合与β2微球蛋白、抗原肽结合制备的HLA二聚体检测抗原肽-特异性CTL的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6671-6675(1993))。可通过例如允许标记的抗-IgG1抗体与IgG1结合来检测抗原肽-特异性CTLs与HLA二聚体的结合。
HLA五聚体方法是一种最近才开发的方法，其中使用五聚体检测抗原肽-特异性CTL，五聚体中HLA抗原和抗原肽的五个复合分子通过卷曲螺旋结构域聚合。因为HLA抗原-抗原肽复合体可用荧光或类似物标记，因此可使用流式细胞仪或类似仪器进行分析，如在HLA五聚体方法中所使用的(见：
http://www.proimmune.co.uk/)。
上述提及的HLA-单体、二聚体、四聚体或五聚体都可以通过制造商如ProImmune或BD Biosciences定制生产而获得。
ELISPOT方法是一种其中通过将细胞因子如IFN-γ或GM-CAF的抗体固定在平板上，加入预定抗原或抗原肽刺激的生物学样品，用针对生物学样品中激活的CTL分泌的细胞因子的抗-细胞因子抗体以与上述固定的抗体结合的斑点的形式检测生物学样品中的CTL的方法。使用ELISPOT方法测定CTL的方法是已知的，可以根据文献(例如，J.Immunol.Methods 110：29，1988)中描述的方法进行。
实时RT-PCR方法是一种其中通过RT-PCR的方式测定编码通过激活CTL产生的诸如IFN-γ、GM-CA或类似物的细胞因子的基因来间接测定与目标抗原或抗原肽反应的CTL的频度的方法。通过实时RT-PCR方法测定CTL的方法是已知的，可以根据文献(例如，J.Immunol.Methods 210：195，1997)中描述的方法进行。
有限稀释方法是一种其中通过将含有CTLs的生物学样品根据不同的细胞密度平铺在孔中，在目标抗原或抗原肽刺激的同时培育平板，测定激活的CTLs产生的细胞因子的量或细胞毒性，以阳性孔数目为基础确定CTL频度的方法。通过有限稀释方法测定CTL的方法是已知的，可以根据文献(例如，Br.J.Cancer77：1907，1998)中描述的方法进行。
可以根据用于确定上述提及的CTL的已知方法测定WT1-特异性CTL前体细胞的数量或频度。
步骤(c)中对WT1疫苗应答性的评价可通过比较步骤(b)中所获得的测试受试者中WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量(此后，称作“测试受试者值”)和健康受试者中的(此后，称作“健康受试者值”)，并判断两者之间的差异来进行。在该情况下，就需要从健康受试者中分离并制备生物学样品(血液、淋巴液、PBMC等)，其可通过从不患癌症的受试者中收集生物学样品而获得。在此所使用的“健康受试者”是指诊断不患癌症的人。
测试受试者值和健康受试者值之间的比较可通过平行测定测试受试者的生物学样品和健康受试者的生物学样品进行。当无法进行平行比较时，也可以使用在不变条件下通过测定多个(至少两个，优选三个或更多个，更优选五个或更多个)健康受试者的生物学样品获得的健康受试者值的平均值或统计中间值进行比较。
进行测试受试者是否对WT1疫苗高应答评价可使用一种指标，即与健康受试者值相比测试受试者值为1.5倍或更高，优选为2倍或更高。也就是说，当测试受试者数值与健康受试者数值相比为1.5倍或更高，优选的为2倍或更高时，对WT1疫苗的应答被评价为高的。当患者对WT1疫苗应答高时，则其适于WT1疫苗，换句话说，有可能优选使用WT1疫苗对患者进行治疗。
在上述提及的测定CTL的方法中，从易用性和准确度角度考虑HLA四聚体方法是最优选的。因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种选择并治疗对WT1疫苗高应答患者的方法，其特征在使用了HLA四聚体方法。正如上述提及的，HLA单体方法、HLA二聚体方法和HLA五聚体方法与HLA四聚体方法的原理是一样的，都是用于测定CTL的优选方法。然而，本发明在此描述的是使用HLA四聚体方法作为例子。
该选择并治疗对WT1疫苗高应答患者的方法使用了HLA四聚体方法，具体地说，包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚体接触；
(c)测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性。
在这点上，步骤(a)中的“生物学样品”和“测试受试者”与上述定义相同。
步骤(b)中使用的“HLA四聚体”指的是通过生物素酰化复合体(HLA单体)，并使其结合至用于四聚化的抗生物素蛋白而制备的四聚体，所述复合体通过用一种肽(抗原肽)连接HLA抗原α链和β2微球蛋白而获得(Science 279：2103-2106(1998)；和Science 274：94-96(1996))。HLA四聚体优选标记有荧光以便CTL前体细胞可以容易地通过已知的方式例如流式细胞仪、荧光显微镜等等检出或检测。具体的例子包括用藻红蛋白(PE)、荧光素异硫氰酸盐(FITC)、多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)、异藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白-德克萨斯红(也叫ECD)和藻红蛋白-青色素5.1(也叫PC5)，或类似物标记的HLA四聚体。
用作为上述HLA四聚体组分的WT1-衍生的癌抗原肽源自人WT1(Cell，60：509，1990，NCBI数据库登记号：XP_034418，SEQ ID NO：1)，并能与HLA抗原形成复合体，因此起HLA-限制性细胞毒性T细胞(CTL)诱导活性(免疫原性)。
已知HLA分子具有许多亚型，HLA分子结合的癌抗原肽的氨基酸序列遵循一定的规则(结合基序)(Immunogenetics，41，p178，1995；J.Immunol.，155：p4749，1995)。例如，HLA-A24的结合基序是已知的，即由8-11个氨基酸残基组成的肽，第2位的氨基酸是酪氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)或色氨酸(Trp)，C末端的氨基酸是苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)或甲硫氨酸(Met)(J.Immunol.，152，p3913，1994，Immunogenetics，41，p178，1995，J.Immunol.，155，p4307，1994)。
关于HLA-A2的基序，下表1列出的基序是已知的(Immunogenetics，41，p178，1995；J.Immunol.，155，p4749，1994)。
表1
| HLA-A2类型 | N-末端的第2个氨基酸 | C末端的氨基酸 |
| HLA-A0201HLA-A0204HLA-A0205HLA-A0206HLA-A0207 | L，MLV，L，I，MV，QL | V，LLLV，LL |
肽长度＝8-11个氨基酸
近来，可以使用BIMAS软件；NIH(
http://bimas.drct.nih.gov/molbio/hla bind/)在因特网中搜索预计能与HLA抗原结合的肽序列。也可以使用BIMAS HLA肽结合的预期分析(J.Immunol.，152，163，1994)进行检索。WT1-衍生肽的具体例子是以列于WO2000/18795的表II-表XLVI的那些的这样一种方式已进行搜索和鉴定的。
上述WT1-衍生肽可以通过替换、缺失和/或添加氨基酸残基包括在肽N-和/或C-末端添加而部分改变，优选地，是通过替换氨基酸残基。替换优选地考虑用上述提及基序中能获得的氨基酸进行。
可通过用已知用于癌抗原肽的分析方法筛选WT1-衍生肽(包括变体)获得WT1-衍生的癌抗原肽，例如，WO02/47474或Int.J.Cancer：100，565-570(2002)中所描述的方法。
WT1-衍生的癌抗原肽的具体例子包括下列肽。
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO：2)
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO：3)
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO：4)
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (SEQ ID NO：5)
Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO：6)
Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO：7)
Abu Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO：8)
Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO：9)
Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO：10)
Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO：11)
Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (SEQ ID NO：12)
Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (SEQ ID NO：13)
Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (SEQ ID NO：14)
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (SEQ ID NO：15)
Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe (SEQ ID NO：16)
Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe (SEQ ID NO：17)
Arg Tyr Pro Ser Abu Gln Lys Lys Phe (SEQ ID NO：18)
上述“Alu”指的是“α-氨基乙酸”。
其中，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的肽是HLA-A24抗原-和HLA-A2抗原结合肽，SEQ ID NO：3、5、6-18所示的肽是HLA-A24抗原结合肽。
优选的癌抗原肽可选自上述SEQ ID NO：2、3、4和5所示的肽。
HLA四聚体可含有上述肽中的两种或更多种。
可使用肽化学领域中常用的方法进行肽的合成。这样的方法可在下述文献中找到，包括Peptide Synthesis，Interscience，New york，1966；The Proteins，第2卷，Academic Press Inc.，New York，1976；PeptideSynthesis，Maruzen，Inc.，1975；Peptide-Gosei no Kiso to Jikken，Maruzen，Inc.，1985；和Iyakuhin no Kaihatsu(Zoku)，第14卷，PeptideSynthesis，Hirokawa-syoten，1991。
同样地，本发明包括其中上述肽的N-末端氨基酸的氨基或C-末端氨基酸的羧基被修饰的肽。这样修饰得到的肽也包括在本发明的范围内。
用于修饰N-末端氨基酸氨基的基团例子包括1-3个基团，所述基团选自：C1-C6烷基、苯基、环烷基和酰基，特殊地，C1-C6烷酰基、苯基取代的C1-C6烷酰基、C5-C7环烷基取代的羰基、C1-C6烷基磺酰基、苯磺酰基、C2-C6烷氧羰基、苯基取代的烷氧羰基、C5-C7环烷氧基取代的羰基、苯氧基羰基等等。
用于修饰C-末端氨基酸羧基的基团例子包括酯基和酰胺基。酯基具体地包括C1-C6烷基酯基团、苯基取代的C0-C6烷基酯基团和C5-C7环烷基酯基团等等。酰胺基具体地包括酰胺基、通过一个或两个C1-C6烷基取代的酰胺基、通过一个或两个苯基取代的C0-C6烷基取代的酰胺基以及形成包括含酰胺基的氮原子的5-至7-元氮杂环烷的酰胺基等等。
至于作为HLA四聚体组分的HLA抗原(HLA抗原的α-链)，可以使用任何亚型的HLA抗原，然而，在诊断或选择受试者中必须使用相同亚型的HLA抗原。HLA抗原的例子包括HLA-A24抗原例如HLA-A*2402，等等；HLA-A2抗原例如HLA-A*0201、-A*0204、-A*0205、-A*0206等等，HLA-A26抗原例如HLA-A*2601，等等；和HLA-A*3101、HLA-A*3103、HLA-A*1101等等。具体的例子包括HLA-A24抗原、HLA-A2抗原和HLA-A26抗原。这些HLA抗原的核苷酸和氨基酸的序列是已知的。例如，HLA-A24抗原的序列公开在Cancer Res.，55：4248-4252(1995)和Genbank登记号：M64740；HLA-A2抗原在Genbank登记号：M84379；和HLA-A26抗原的在Genbank登记号：D14350。因此，在与这些已知碱基序列信息相关的基础上用诸如PCR的常规方法很容易克隆得到HLA的α-链。
所述HLA的α-链优选是可溶形式片段，以便容易地进行CTL的结合和选择。进一步优选的是所述HLAα-链的C-末端，其具有易于生物素酰化的结构，以便通过生物素结合而四聚化，也就是说，具有添加的生物素结合部分。
具体地说，就HLA-A2402(一种HLA-A24)而言，通过PCR反应制备的重组可溶HLA-A*2402α-链的cDNA，其被设计以使得C-末端标记中的特定赖氨酸残基能够通过BirA酶生物素酰化，PCR反应中使用的模板是HLA-A*2402(GenBank登记号.M64740)表达质粒，正向引物：
5’-CCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTCTACCTCCGT-3’(SEQ ID NO：19)；
反向引物：
5’-GGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGGCAGACCCTC-3’
(SEQ ID NO：20)。
至于作为HLA四聚体组分的β2-微球蛋白，优选的是人β2微球蛋白。可通过PCR反应制备所述人β2微球蛋白的cDNA，使用的模板是人β2微球蛋白(GenBank登记号.ABO21288)表达质粒，正向引物：
5’-CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG-3’(SEQ ID NO：21)；
反向引物：
5’-GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTTAAC-3’(SEQ ID NO：22)
至于作为HLA四聚体组分的抗生物素蛋白，可以使用迄今所知的任何抗生物素蛋白。然而，所述抗生物素蛋白优选带有荧光标记，有助于通过流式细胞仪或荧光显微镜等等进行检测。任何已知的荧光色素都可以不受限制地使用，例如，藻红蛋白(PE)、荧光素异硫氰酸盐(FITC)、多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)、异藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白-德克萨斯红(也叫ECD)和藻红蛋白-青色素5.1(也叫PC5)，或类似物。
制备包括已知的那些HLA四聚体组分的HLA四聚体的过程众所周知，如在Science 279：2103-2106(1998)，Science 274：94-96(1996)等文献中描述的。以下将简要描述该制备过程。
首先，用HLAα-链的表达载体和β2微球蛋白表达载体转化诸如E.coli的合适的宿主细胞，或能够表达蛋白质的哺乳动物细胞，并使其表达。在此优选使用E.coli(例如，BL21)。然后将所产生的单体HLA复合体和抗原肽(WT1-衍生的癌抗原肽)混合形成可溶的HLA-肽复合体。用BirA酶将所产生的HLA-肽复合体的HLAα-链C-末端序列生物素酰化。当生物素酰化的HLA-肽复合体和荧光标记的抗生物素蛋白以4∶1的摩尔比率混合时，形成了HLA四聚体。在上述每一个步骤中优选通过凝胶过滤或类似方法纯化所产生的蛋白。
通过将如上述制备的HLA四聚体与分离自测试受试者的生物学样品接触(所述的生物学样品中含有CTL前体细胞)进行上述步骤(b)。接触优选在37℃下进行。此外，接触优选地在常规的生物缓冲液例如含有血清的磷酸缓冲液(PBS)中进行。
优选的阴性对照是通过在平行进行的相同过程中使用荧光标记的链霉抗生物素蛋白取代HLA四聚体得到制备的。
在步骤(b)后的步骤(c)中，测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量。可使用任何迄今已知的方法进行测定。当HLA四聚体用荧光标记时，与HLA四聚体结合的CTL前体细胞也被荧光素标记了。因此通过流式细胞仪或荧光显微镜就可检测或分离标记的CTLs。
可通过，例如测定CD8-阳性细胞(CD8-阳性CTL前体细胞)或CD8/CD3-阳性细胞(CD8/CD3-阳性CTL前体细胞)中与HLA四聚体结合的细胞的比例(频度)从而获得与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度。
可使用，例如荧光标记的鼠抗-人CD8单克隆抗体标记并检测CD8-阳性细胞。可使用，例如荧光标记的鼠抗-人CD3单克隆抗体标记并检测CD3-阳性细胞。
在此所用的荧光色素必须与HLA四聚体中所用的不同。也就是说，必须使用相互截然不同的荧光色素，例如，当使用PE-标记的HLA四聚体时，可使用FITC-标记的鼠抗-人CD8单克隆抗体及PerCP-标记的鼠抗-人CD3单克隆抗体。
具体过程包括，当测定HLA四聚体结合细胞对CD8-阳性细胞比例(频度)时，例如，将PE-标记的HLA四聚体与生物学样品接触，加入FITC-标记的鼠抗-人CD8-单克隆抗体，使混合物发生反应，并利用流式细胞仪或荧光显微镜分析染色的细胞。选择CD8-阳性细胞(CD8+)。WT1抗原肽特异性CTL前体细胞的比例(频度)可通过在所选择的CD8+细胞中四聚体阳性细胞(CD8+四聚体+)比例减去作为阴性对照的抗生物素蛋白阳性细胞(CD8+抗生物素蛋白+)的比例而计算得到，如下：
WT1抗原肽-特异性CTL前体细胞(％)＝100×{[(CD8+四聚体+细胞)/(CD8+细胞)]-[(CD8+抗生物素蛋白+细胞)/(CD8+细胞)]}
当测定HLA四聚体结合细胞对CD8-和CD3-阳性细胞比例(频度)时，例如，将PE-标记的HLA四聚体与生物学样品接触，加入FITC-标记的鼠抗-人CD8-单克隆抗体和PerCP-标记的鼠抗-人CD3单克隆抗体，允许混合物发生反应，并利用流式细胞仪或荧光显微镜分析染色的细胞。选择CD3-和CD8-阳性细胞(CD3+CD8+)。WT1抗原肽-特异性CTL前体细胞的比例(频度)可通过在所选择的CD3+CD8+细胞中四聚体阳性细胞(CD3+CD8+四聚体+)比例减去作为阴性对照的抗生物素蛋白阳性细胞(CD3+CD8+抗生物素蛋白+)的比例而计算得到，如下：
WT1抗原肽-特异性CTL前体细胞(％)＝100×{[(CD3+CD8+四聚体+细胞)/(CD3+CD8+细胞)]-[(CD3+CD8+抗生物素蛋白+细胞)/(CD3+CD8+细胞)]}
在上述测定所获得的结果基础上评价对WT1疫苗的应答性。具体地说，可通过比较步骤(b)中获得的测试受试者与健康受试者中WT-1特异性CTL前体细胞的存在频度或数量(此后，分别称为“测试受试者值”和“健康受试者值”)，并判断两者的差异来进行。在这样情况下，就需要从健康受试者中分离并制备生物学样品(血液、淋巴液、PBMC等)，其可通过从不患癌症的受试者中收集生物学样品而获得。这里所使用的“健康受试者”是指诊断不患癌症的人。
测试受试者值和健康受试者值的比较可通过平行测定测试受试者的生物学样品和健康受试者的生物学样品进行。当无法进行平行比较时，也可以使用在不变条件下通过测定多个(至少两个，优选三个或更多个，更优选五个或更多个)健康受试者的生物学样品获得的健康受试者值的平均值或统计中间值进行比较。
进行测试受试者是否对WT1疫苗高应答评价可使用一种指标，即与健康受试者值相比测试受试者值为1.5倍或更高，优选为2倍或更高。也就是说，当测试受试者数值与健康受试者数值相比为1.5倍或更高，优选的为2倍或更高时，对WT1疫苗的应答被评价为高的。当患者对WT1疫苗应答高时，则其适于WT1疫苗，换句话说，有可能优选使用WT1疫苗对患者进行治疗。
如上所述的本发明选择患者的方法不仅可以用于在疫苗施用之前评价患者也可用于诊断或确定疫苗施用后的效果。
本发明也提供一种选择对WT1疫苗高应答患者的方法，其包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的效应物型WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(c)判断(b)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性，和一种治疗用所述方法选择的患者癌症的方法。
本发明人根据相关的功能对WT1-特异性CTL前体细胞进一步分类，并发现，特别是与健康个体相比，效应物型CTL前体细胞以较高比例存在。因此，可在作为指标的效应细胞中WT1-特异性CTL前体细胞的数量或频度基础上选择对WT1疫苗高应答的患者。当使用CTL前体细胞的存在频度或数量作为指标通过选择方法测定的测试受试者值与健康受试者值之间没有/几乎没有差别时，可使用效应物型CTL前体细胞作为指标的选择方法进行更详细的分析。
选择方法的具体例子包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的癌抗原肽、抗-CD8抗体、抗-CD45RA抗体和抗-CD27抗体的HLA四聚体接触；
(c)测定对CD8或CD8/CD3阳性并对HLA四聚体结合阳性的CTL前体细胞中CD45RA-阳性和CD27-阴性效应物型的CTL前体细胞比例；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性，和一种治疗用所述方法选择的患者癌症的方法。
在此所用的“效应细胞”指的是CD45RA-阳性和CD27-阴性的CTL前体细胞。通过测定CD45RA-阳性和CD27-阴性的CTL前体细胞在CTL前体细胞中的比例获得所述效应细胞的频度。具体地说，可通过将测试样品与HLA四聚体、抗-CD8抗体、抗-CD45RA抗体和抗-CD27抗体接触，测定CD45RA-阳性和CD27-阴性的细胞在对CD8或CD8/CD3阳性并对HLA四聚体结合阳性的CTL前体细胞(WT1-特异性CTL前体细胞)中的比例。
可使用，例如荧光标记的鼠抗-人CD45RA单克隆抗体标记并测定CD45RA-阳性细胞。可使用，例如荧光标记的鼠抗-人CD27单克隆抗体标记并测定CD27-阳性细胞。在此所用的荧光色素必须与HLA四聚体、抗-CD8抗体或抗-CD3抗体中所用的不同。也就是说，必须使用相互截然不同的荧光色素，例如，当使用PE-标记的HLA四聚体时，可使用FITC-标记的抗-CD8单克隆抗体和Per-标记的抗-CD3单克隆抗体，ECD-标记的鼠抗-人CD45RA单克隆抗体和PC5-标记的鼠抗-人CD27单克隆抗体。这些标记的抗体可从Beckman Coulter等处买到。
测定前体细胞或类似物的具体过程可通过与上述的选择方法相似的方式进行，其中CTL前体细胞的存在频度或数量作为指标。
上述选择对WT1疫苗高应答患者的方法也可以用于诊断癌症。也就是说，本发明人发现造血恶性肿瘤或肺癌患者与健康个体相比体内的WT1-特异性CTL前体细胞频度更高。因此，使用WT1特异性CTL前体细胞或效应物型WT1特异性CTL前体细胞的频度作为指标就有可能诊断癌症。可以诊断的癌症包括血癌例如白血病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤和实体瘤例如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、子宫颈癌、和卵巢癌。优选的例子是白血病、骨髓增生异常综合症和肺癌。
本发明也提供了一种鉴定WT1疫苗的靶分子的方法，所述分子是患者特有的，包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试患者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将WT1疫苗的多个靶分子分别应用于(a)的生物学样品；
(c)分别测定(b)的生物学样品的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量，并相互比较结果；和
(d)在(c)中获得结果的基础上鉴定对测试患者有效的WT1疫苗的靶分子。
本发明人发现患者在疫苗施用前体内的WT1-特异性CTL前体细胞频度比迄今所知的都要高。因此，在WT1-特异性CTL前体细胞的数量或频度作为指标的基础上鉴定WT1疫苗的靶分子(治疗用途的靶分子)，所述分子是患者特有的。
也就是说，上述鉴定方法可有效的用于鉴定对于治疗患者最适合的靶分子(抗原肽)，所述患者业已评价为对WT1疫苗高应答。
具体地说，鉴定可以类似于选择对WT1疫苗高应答患者的方法进行，通过测定WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量，其中使用了HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术或有限稀释方法。优选为HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法或HLA五聚体方法。下文中将HLA四聚体方法作为例子具体描述鉴定方法。
涉及HLA四聚体方法的方法包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试患者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将含有不同WT1衍生的癌抗原肽的多个HLA四聚体分别与(a)的生物学样品接触；
(c)分别测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量，并相互比较结果；和
(d)在(c)中获得结果的基础上鉴定对测试患者有效的WT1-衍生的癌抗原肽。
具体地说，制备了多个HLA四聚体，其中每一个都含有作为候选物的WT1-衍生的癌抗原肽。每一个HLA四聚体都与分离自测试患者的生物学样品接触，测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量。对HLA四聚体分别获得的数值进行比较，显示最高数值的就是包含于HLA四聚体的癌抗原肽，其是最易被CTLs识别的癌抗原肽，被鉴定为患者的WT1疫苗治疗的靶分子，即，该靶分子是患者特有的。
只要是衍生自WT1的任何癌抗原肽就可使用，例子包括SEQ IDNOs：2-18所列的癌抗原肽。优选的癌抗原肽是SEQ ID NOs：2-5中所列的任何一种。
每一步骤的具体过程和每个组分的制备方法都可以在上面关于选择对WT1疫苗高应答患者的部分内容中找到。
根据鉴定WT1疫苗的靶分子的现有方法，可以鉴定能够治疗患者癌症的靶分子。因此，在不同的实施方案中，本发明提供了一种用于治疗给定患者癌症的药物组合物，其包括通过所述患者特有的WT1疫苗的靶分子的鉴定方法鉴定的靶分子；和一种治疗患者癌症的方法，其包括施用患者由该鉴定方法所鉴定的靶分子。本发明的药物组合物包含肿瘤疫苗并可包含本领域已知的佐剂等。
本发明进一步提供了一种可用于选择对WT1疫苗高应答患者的临床诊断试剂，其包含作为成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。下文中将HLA四聚体方法作为例子描述的本发明临床诊断试剂。
作为本发明临床诊断试剂成分的“HLA四聚体”指的是，如上提及的，通过生物素酰化用WT1-衍生的癌抗原肽连接HLA抗原α链和β2微球蛋白获得的复合体(HLA单体)，并使其与用于四聚化的抗生物素蛋白结合而制备的四聚体(Science 279：2103-2106(1998)；和Science274：94-96(1996))。
只要是衍生自WT1的任何癌抗原肽就可使用，例子包括SEQ IDNOs：2-18所列的癌抗原肽。优选的癌抗原肽是SEQ ID NOs：2-5中所列的任何一种。
每一步骤的具体过程和每个组分的制备方法都可以在上面关于选择对WT1疫苗高应答患者的部分内容中找到。
本发明的临床诊断试剂可作为选择对WT1疫苗高应答患者的试剂盒的组分。该试剂盒可以只包含本发明的临床诊断试剂，也可以包含本发明的临床诊断试剂和其他成分。该试剂盒其他成分的例子包括荧光抗生物素蛋白、荧光标记的鼠抗-人CD8单克隆抗体、荧光标记的鼠抗-人CD3单克隆抗体、和类似物。在检测效应细胞时，该试剂盒可包含荧光标记的鼠抗-人CD45RA单克隆抗体，荧光标记的鼠抗-人CD27单克隆抗体。
荧光色素的例子包括藻红蛋白(PE)、荧光素异硫氰酸盐(FITC)、多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)、异藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白-德克萨斯红(也叫ECD)和藻红蛋白-青色素5.1(也叫PC5)，等等。
本发明的临床诊断和试剂盒不仅都可以用于选择对WT1疫苗高应答的患者，也可以用于选择WT1疫苗的靶分子(用于治疗的靶分子)。另外，可用作癌症临床诊断试剂的试剂无需改变其组分。
本发明也提供了一种确定患者对WT1疫苗的适合性的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)在施用WT1疫苗后，从患者中分离含有CTLs的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的WT1-特异性CTLs的存在频度或数量；
(c)判断(b)的测定值相对于WT1疫苗施用前所获得的生物学样品是否高，并评价患者是否适于WT1疫苗治疗，和
一种治疗患者癌症的方法，其包括治疗用WT1或WT1-衍生的癌抗原肽确定方法评价适合的患者。
如以下实施例中所描述的，本发明人测定了经WT1-衍生的癌抗原肽(“WT1疫苗”)治疗的患者中WT1-特异性CTLs的频度，发现相对于施用肽之前所获得的CTL频度，治疗效果与施用肽以后的CTL频度的增加相关。也就是说，施用肽以后WT1-特异性CTLs的存在频度是施用肽之前获得样品的1.5倍或更高被定义为“阳性免疫应答”，并研究了免疫应答和治疗效果之间的关系。结果，在免疫应答和治疗效果之间具有正相关。该结果揭示了在上述提及的免疫应答性(CTLs的频度或数量增加)作为指标的基础上，有可能评价用WT1疫苗治疗是否适合于被试患者。
因而，本发明的确定方法可有效地评价进行WT1疫苗治疗的患者的适合性，例如连续施用肽治疗的适合性。
所述确定方法的步骤(a)和(b)的具体过程可以在上面关于“选择对WT1疫苗高应答患者方法”的部分中找到。具体地说，其可通过HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术、有限稀释方法或类似方法测定WT1-特异性CTLs的存在频度或数量来进行。
步骤(c)中评价患者是否适于WT1疫苗治疗的是通过比较施用患者WT1疫苗以后和施用WT1疫苗之前获得的WT1-特异性CTLs的存在频度或数量(在下文中，分别称作“施用后值”和“施用前数值”)，并判断两个值之间的差异来进行。
在此所用的“施用后值”指的是一次或多次施用WT1疫苗后的任何时间(时间选择)的值。然而，在两周间隔的肽剂量给药方案中，优选的时间(时间选择)是第一到第五次施用WT1疫苗后的时间，优选地，在第一到第三次施用WT1疫苗后。
可使用指标进行是否用WT1疫苗治疗合适的评价，该指标是与施用前值相比，施用后值为其1.5倍或更高。也就是说当施用后值是施用前值的1.5倍或更高时，适于WT1疫苗治疗。以这些发现为基础，本发明也提供了一种治疗患者癌症的方法，其包括治疗已经用本发明的确定患者对具有WT1或WT1-衍生的癌抗原肽的本发明的WT1疫苗适合性的方法评价过的适合的患者。
在上述提及的测定CTL的方法中，从易用性和准确度角度考虑，主要优选的是HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法和HLA五聚体方法。HLA四聚体方法将在下文中作为例子用于描述上述确定方法。
涉及HLA四聚体方法的该方法包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)在施用WT1疫苗后，从患者中分离含有CTLs的生物学样品；
(b)将含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚体与(a)的生物学样品接触；
(c)测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTLs的存在频度或数量；和
(d)判断(c)的测定值相对于WT1疫苗施用前所获得的生物学样品是否高，并评价患者是否适于WT1疫苗治疗。
在此使用的作为HLA四聚体组分的HLA抗原包括HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
作为HLA四聚体组分的癌抗原肽包括：Cys Met Thr Trp Asn GlnMet Asn Leu(SEQ ID NO：2)，Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met AsnLeu(SEQ ID NO：3)，Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ IDNO：4)和Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。如SEQID NO：2-5所示的所有肽都是能与HLA-A24结合的肽，用在上述本发明确定方法中的HLA四聚体的例子包括含有如SEQ ID NO：2-5所示的所有肽中任一种和HLA-A24的HLA四聚体。另外，如SEQ IDNO：2和4所示的肽能与HLA-A2抗原结合。也包括含有SEQ ID NO：2或4所示的肽和HLA-A2抗原的HLA四聚体。
在本发明确定或治疗方法中，优选使用HLA四聚体，其含有在该治疗中所用的相同肽，或与CTLs显示交叉反应的肽，而所述的CTLs已被治疗中所用肽诱导。例如，当SEQ ID NO：3所示的肽用于患者治疗时，包含SEQ ID NO：2或3所示肽和HLA-A24抗原的HLA四聚体是使用有效的。
本发明确定或治疗方法的步骤(a)到(c)的具体过程可以在上面关于“选择对WT1疫苗高应答患者方法”的部分中找到。此外，步骤(d)中评价是以上述施用前值和施用后值比较为基础进行的。
本发明确定或治疗方法的具体例子将在下文中描述。
首先，在施用WT1-衍生的癌抗原肽前从患者中收集血液，从中分离PBMC(施用前样品)。然后，在施用肽治疗后收集患者的血液并从中分离PBMC(施用后样品)。分别在施用前和施用后样品中加入HLA四聚体，测定肽-特异性CTLs的频度，并根据上述关于“选择对WT1疫苗高应答患者的方法”部分和实施例3描述的分析方法计算。当施用后样品中CTL频度是施用前样品的1.5倍或更高时，适于WT1疫苗治疗(也就是说，WT1疫苗预计有疗效)。
本发明也提供了一种用于确定WT1疫苗适合性的临床诊断试剂，其中包括作为成分的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体，它们分别含有WT1-衍生的癌抗原肽，以及一种含有所述临床诊断试剂的试剂盒。所述临床诊断试剂和试剂盒的成分如上文关于“用于选择对WT1疫苗高应答的患者的临床诊断试剂”部分定义的。
实施例
本发明进一步通过下述实施例举例说明，但在任何方面都并不受限于这些实施例。
实施例1
外周血单核细胞的制备
在征得同意后，收集HLA-A*2402阳性癌症患者和HLA-A*2402阳性健康个体的血液。在这些患者中，患有造血恶性肿瘤的患者有18位，其中包括急性髓细胞性白血病(AML)(n＝11)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)(n＝2)、慢性髓细胞性白血病(CML)(n＝1)和骨髓增生异常综合征(MDS)(n＝4)，患有肺癌有7位。有10位HLA-A*2402阳性健康个体。
就患有造血恶性肿瘤患者而言，一次或多次诊断时或治疗过程中在骨髓瘤和外周血样品中证实了WT1基因显著的高表达。就患肺癌的患者而言，活组织检查或抽提的样品中证实了WT1基因显著的高表达。
通过密度梯度离心的方法(Ficoll-Hypaque)从收集的血液中分离外周血单核细胞(PBMCs)，并在液氮中冷冻储存。
实施例2
制备HLA四聚体
使用9-氨基酸肽(SEQ ID NO：2)制备含有荧光色素(藻红蛋白；PE)标记的HLA-A*2402的四聚体，该肽包括根据Int.J.Cancer：100，565-570，2002中描述的方法的WT1蛋白质的235-243位置的氨基酸序列。
首先，通过PCR扩增编码重组HLA-A2402的cDNA，该PCR使用HLA-A*2402表达质粒(GenBank登记号.M64740)作为模板，正向引物：
5’-CCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTCTACCTCCGT-3’(SEQ ID NO：
19)；
反向引物：
5’-GGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGGCAGACCCTC-3’
(SEQ ID NO：20)。
反向引物编码BirA识别位点以便阅读框架在C-末端一致。用限制性酶NcoI和BamH1酶切扩增片段，并克隆到载体pET11d(Novagen)中。
然后使用人β2微球蛋白表达质粒(GenBank登记号.ABO21288)作为模板扩增编码重组可溶性人β2微球蛋白的cDNA，正向引物：
5’-CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG-3’(SEQ ID NO：21)；
反向引物：
5’-GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTTAAC-3’(SEQ ID NO：22)
用限制性酶NdeI和BamH1酶切扩增片段，并克隆到载体pET11a(Novagen)中。
让所产生的两个载体在E.coli.BL21中表达，并以不溶性包涵体的形式回收。分别将包涵体溶解在8M尿素溶液中并用重折叠(refolding)缓冲液稀释。将肽(SEQ ID NO：2)加入到稀释液中形成可溶的HLA-肽复合体。用BirA酶生物素酰化HLA-肽复合体C-末端序列，通过凝胶过滤技术纯化所产生的生物素酰化HLA-肽复合体。生物素酰化HLA-肽复合体和PE标记的抗生物素蛋白(分子探针)以4∶1的摩尔比率混合制备HLA四聚体。
实施例3
用HLA四聚体分析WT1-特异性CTL前体细胞
解冻实施例1中获得的冷冻PBMCs，立即在含有0.5％小牛血清(FCS)磷酸盐缓冲液(PBS)中重新悬浮至细胞密度为1×106细胞/毫升。悬浮液中加入实施例2中制备的四聚体溶液(500μg/μl，2μl)。悬浮液在37℃下温育30分钟。除PE-标记的抗生物素蛋白链霉素(Becton Dickinson)取代四聚体添加之外，通过类似的方式制备阴性对照样品。在冰冷的水中淬灭后，加入FITC-标记的鼠抗-人CD8单克隆抗体(15μl，BD Pharmigen)和PerCP-标记的鼠抗-人CD3抗体(15μl，BD Pharmigen)，混合物在4℃下温育30分钟。用含有0.5％FCS(2X)缓冲液PBS离心冲洗着色的细胞，并用流式细胞仪FACSort(BectonDickinson)分析。选择CD3-和CD8-阳性细胞(CD3+CD8+)。从所选择的CD3+CD8+细胞中四聚体阳性细胞(CD3+CD8+四聚体+)比例减去作为阴性对照的PE标记的抗生物素蛋白阳性细胞(CD3+CD8+抗生物素蛋白+)的比例计算得到WT1-抗原肽特异性CTL前体细胞的比例，如下：
WT1抗原肽-特异性CTL前体细胞(％)＝100×{[(CD3+CD8+四聚体+细胞)/(CD3+CD8+细胞)]-[(CD3+CD8+抗生物素蛋白+细胞)/(CD3+CD8+细胞)]}
癌症患者和健康个体的PBMCs的分析结果列在表2中。结果对相应疾病进行绘图，如附图1所示。这些结果显示：CD3/CD8-阳性细胞中WT1抗原肽-特异性CTL前体细胞的比例，对于健康个体是0.47-1.30％(平均为0.82％)，对于恶性造血肿瘤患者是1.04-29.45％(平均为5.24％)，以及对于肺癌患者是0.33-5.97％(平均为2.44％)。统计分析显示与健康个体相比恶性造血肿瘤或肺癌患者，其比例显著增加(p＜0.05)。
表2
| 样品，患者编号 | CTL前体的频度(％) |
| AML，患者NO.1 | 8.26 |
| AML，患者NO.2 | 8.01 |
| AML，患者NO.3 | 5.12 |
| AML，患者NO.4 | 3.84 |
| AML，患者NO.5 | 4.51 |
| AML，患者NO.6 | 3.27 |
| AML，患者NO.7 | 2.68 |
| AML，患者NO.8 | 2.60 |
| AML，患者NO.9 | 1.77 |
| AML，患者NO.10 | 1.04 |
| AML，患者NO.11 | 1.49 |
| ALL，患者NO.1 | 7.32 |
| ALL，患者NO.2 | 1.78 |
| CML，患者1 | 2.46 |
| MDS，患者1 | 29.45 |
| MDS，患者2 | 2.99 |
| MDS，患者3 | 2.81 |
| MDS，患者4 | 2.08 |
| 肺癌，患者1 | 5.97 |
| 肺癌，患者2 | 3.83 |
| 肺癌，患者3 | 2.63 |
| 肺癌，患者4 | 1.89 |
| 肺癌，患者5 | 1.69 |
| 肺癌，患者6 | 0.72 |
| 肺癌，患者7 | 0.33 |
| 健康个体1 | 1.30 |
| 健康个体2 | 1.05 |
| 健康个体3 | 1.08 |
| 健康个体4 | 0.85 |
| 健康个体5 | 0.81 |
| 健康个体6 | 0.79 |
| 健康个体7 | 0.61 |
| 健康个体8 | 0.64 |
| 健康个体9 | 0.57 |
| 健康个体10 | 0.47 |
AML：急性髓细胞性白血病
ALL：急性淋巴细胞性白血病
CML：慢性髓细胞性白血病
MDS：骨髓增生异常综合征
实施例4
施用肽之后WT1-特异性CTLs频度的分析
下述试验是在获得大阪大学道德委员会、医学院同意并征得癌症患者同意之后进行的。
将包含WT1的第235-243位的氨基酸序列的肽或包含SEQ IDNO：3的其变异体，其中SEQ ID NO：2中第2位的甲硫氨酸被酪氨酸取代，按每个个体0.3mg、1mg或3mg的量施用癌症患者。用Montanide ISA51(SEPPIC)乳化肽，最终的乳剂以2周间隔进行一次或多次皮内注射。被试患者患有HLA-A*2402-阳性和WT1-阳性的肺癌、乳腺癌或白血病。
以与实施例3相似的HLA四聚体方法测定的CTL频度为基础进行施用肽以后的免疫反应的评价。与肽施用前获得的相比，在肽施用后任何时段，肽-特异性CTLs频度增加1.5倍或更高，则评价为“阳性免疫应答”。此外，在肿瘤标记物值，肿瘤细胞的数量或肿瘤的体积缩小时，则评价为“治疗有效”。可通过癌症患者(n＝19)中的卡方试验评价免疫应答和治疗效果之间的关系，所述患者都已对免疫应答和肽施用后有治疗效果进行了评价。结果，治疗效果阳性的11个患者中有8个(73％)显示阳性免疫应答，而治疗效果阴性的8个患者中只有2个(25％)显示阳性免疫应答，表明治疗效果和免疫应答是正相关的(P＝0.0397)。这些结果表明施用肽后CTLs特异性的诱导是治疗效果的一个重要因素。另外，上述的免疫应答可作为用于证明肽施用治疗的有利进程的指标，或决定肽施用的治疗是否应该继续。
实施例5
WT1-特异性CTLs功能的分析
已经报道对HLA四聚体染色和CD8阳性的抗原-肽特异性CTLs可进一步可通过抗-CD45RA抗体和抗-CD27抗体(J.Exp.Med.，186，p1407，1997)染色而进行再分类。CD45RA-阳性和CD27阳性细胞归为原初实验型(naive type)；CD45RA-阴性和CD27-阳性细胞，CD45RA-阴性和CD27-阴性归为记忆型；CD45RA-阳性和CD27-阴性细胞归为效应物型。效应物型细胞代表了最强CTL活性的细胞种群。
在征得同意后，从HLA-A*2402-阳性健康个体和肽施用之前的HLA-A*2402-阳性癌症患者(n＝24；14个血癌，10个实体瘤)中收集PBMCs，所述患者经过实施例4中临床研究的试验。PBMCs用于分析WT1-肽特异性CTL前体的功能，所述WT1-肽特异性CTL前体对HLA四聚体染色和CD8阳性。对于流式细胞仪分析，细胞按实施例3相似的方式，用HLA四聚体、抗-CD8抗体、抗-CD45RA抗体和抗-CD27抗体染色。计算属于CD45RA-阳性/CD27-阴性的原初实验型，CD45RA-阴性的记忆型或CD45RA-阳性/CD27-阴性的效应物型的细胞在HLA四聚体-阳性和CD8-阳性细胞类群中的比例。对于癌症患者，原初实验型、记忆型和效应物型的比例分别为23.7％、45.5％和30.8％。对于健康个体的比例为35.9％，53.8％和8.9％。对癌症患者和健康个体的比较显示了效应物型细胞的8比例在癌症患者中明显为高(P＜0.05)，而原初实验型和记忆型细胞的比例在癌症患者和健康个体之间则没有显著差异。在实施例3中，癌症患者显示了WT1-特异性CTL前体细胞的增加，并且在此，癌症患者显示了在CTLs中具有效应物型功能的CTLs比例的增加。这些结果证实癌症患者可以在效应物型CTL前体细胞存在频度基础上得到诊断。
工业实用性
根据本发明，提供了一种在作为指标的WT1-特异性CTL前体细胞基础上选择对WT1疫苗高应答患者的方法，一种利用相同方式治疗癌症的方法，和用于所述选择的临床诊断试剂等等。根据本发明的选择方法，可选择预期对WT1疫苗应答的患者，使其能更适于治疗癌症。
序列表
<110>Haruo，Sugiyama
<120>选择适于WT1疫苗患者的方法
<130>664590
<140>PCT/JP2004/009378
<141>2004-06-25
<150>JP 2003-184436
<151>2003-06-27
<150>JP 2004-070497
<151>2004-03-12
<160>22
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>449
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
435 440 445
Leu
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>2
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>3
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>4
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>5
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe
1 5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>6
Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>7
Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<223>Xaa位于Abu链的位置1
<400>8
Xaa Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>9
Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>10
Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>11
Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>12
Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>13
Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>14
Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
1 5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>15
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>16
Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe
1 5
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>17
Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe
1 5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<223>Xaa位于Abu链的位置5
<400>18
Arg Tyr Pro Ser Xaa Gln Lys Lys Phe
1 5
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>19
ccatgggcag ccattctatg cgctattttt ctacctccgt 40
<210>20
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>20
ggatcctggc tcccatctca gggtgagggg cttgggcaga ccctc 45
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>21
catatgatcc agcgtacccc gaaaattcag 30
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物
<400>22
ggatccttac atgtctcgat cccacttaac 30
Claims (62)
1.一种选择对WT1疫苗高应答的患者的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(c)判断(b)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性。
2.根据权利要求1的选择方法，其中通过HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种进行WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量的测定。
3.根据权利要求2的选择方法，其中通过HLA四聚体方法进行测定。
4.根据权利要求3的选择方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚体接触；
(c)测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性。
5.根据权利要求4的选择方法，其中通过测定在CD8-阳性或CD8/CD3-阳性CTL前体细胞中HLA四聚体结合细胞的比例进行权利要求4中步骤(c)。
6.根据权利要求4或5的选择方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
7.根据权利要求4-6中任一项的选择方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
8.根据权利要求1-7中任一项的选择方法，其使用流式细胞仪进行。
9.根据权利要求1-8中任一项的选择方法，其中使用与健康受试者相比为1.5倍或更高的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量作为指标评价对WT1疫苗的应答性。
10.根据权利要求1的选择方法，其中CTL前体细胞是效应物型CT L前体细胞。
11.根据权利要求10的选择方法，其使用HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种测定效应物型的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量。
12.根据权利要求11的选择方法，其使用HLA四聚体方法。
13.根据权利要求12的选择方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的癌抗原肽、抗CD8-抗体、抗-CD45RA抗体和抗-CD27抗体的HLA四聚体接触；
(c)测定对CD8或CD8/CD3阳性并与HLA四聚体结合的CTL前体细胞中CD45RA-阳性和CD27-阴性的效应物型CTL前体细胞的比例；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价对WT1疫苗的应答性。
14.根据权利要求13的选择方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
15.根据权利要求13或14的选择方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
16.根据权利要求10-15中任一项的选择方法，其使用流式细胞仪进行。
17.一种诊断癌症的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(c)判断(b)的测定数值相对于健康受试者是否高，并评价测试受试者是否患癌症。
18.根据权利要求17的诊断方法，其中通过HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种进行WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量的测定。
19.根据权利要求18的诊断方法，其中通过HLA四聚体方法进行测定。
20.根据权利要求19的诊断方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚体接触；
(c)测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价测试受试者是否患癌症。
21.根据权利要求20的诊断方法，其中通过测定CD8-阳性或CD8/CD3-阳性CTL前体细胞中HLA四聚体结合细胞的比例进行权利要求20中步骤(c)。
22.根据权利要求20或21的诊断方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
23.根据权利要求20-22中任一项的诊断方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
24.根据权利要求17-23中任一项的诊断方法，其使用流式细胞仪进行。
25.根据权利要求17-24中任一项的诊断方法，其中使用与健康受试者相比为1.5倍或更高的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量作为指标诊断癌症。
26.根据权利要求17的诊断方法，其中CTL前体细胞是效应物型CTL前体细胞。
27.根据权利要求26的诊断方法，其使用HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种测定WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量。
28.根据权利要求27的诊断方法，其使用HLA四聚体方法进行测定。
29.根据权利要求28的诊断方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将(a)中生物学样品与含有WT1-衍生的肿瘤性抗原肽、抗-CD8抗体、抗-CD45RA抗体和抗-CD27抗体的HLA四聚体接触；
(c)测定对CD8或CD8/CD3阳性并与HLA四聚体结合的CTL前体细胞中CD45RA-阳性和CD27-阴性的效应物型CTL前体细胞的比例；和
(d)判断(c)的测定值相对于健康受试者是否高，并评价测试受试者是否患癌症。
30.根据权利要求29的诊断方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
31.根据权利要求29或30的诊断方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
32.根据权利要求26-31中任一项的诊断方法，其使用流式细胞仪进行。
33.一种鉴定WT1疫苗的靶分子的方法，所述分子对于患者是特有的，包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将WT1疫苗的多个靶分子分别应用于(a)的生物学样品；
(c)分别测定(b)的生物学样品中的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量，并相互比较结果；和
(d)在(c)中获得结果的基础上鉴定对测试患者有效的WT1疫苗的靶分子。
34.根据权利要求33的鉴定方法，其中使用HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种进行WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量的测定。
35.根据权利要求34的鉴定方法，其中使用HLA四聚体方法进行测定。
36.根据权利要求35的鉴定方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从测试受试者中分离含有CTL前体细胞的生物学样品；
(b)将含有不同WT1-衍生的癌抗原肽的多个HLA四聚体分别与(a)的生物学样品接触；
(c)分别测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTL前体细胞的存在频度或数量，并相互比较结果；和
(d)在(c)中获得结果的基础上鉴定对测试患者有效的WT1-衍生的癌抗原肽。
37.根据权利要求36的鉴定方法，其中通过测定CD8-阳性或CD8/CD3-阳性CTL前体细胞中与HLA四聚体结合的细胞的比例进行权利要求36中步骤(c)。
38.根据权利要求36或37的鉴定方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
39.根据权利要求36-38中任一项的鉴定方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
40.根据权利要求33-39中任一项的鉴定方法，其使用流式细胞仪进行。
41.一种用于选择对WT1疫苗高应答患者的临床诊断试剂，其包含作为成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
42.根据权利要求41的临床诊断试剂，其中作为HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
43.根据权利要求41或42的临床诊断试剂，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
44.一种包含根据权利要求41-43中任一项的临床诊断试剂的试剂盒。
45.一种用于在给定患者中治疗癌症的药物组合物，其包括根据权利要求33-40中任一项的WT1疫苗的靶分子的鉴定方法鉴定的靶分子，所述靶分子是患者特有的。
46.一种用于癌症的诊断试剂，其包含作为成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
47.根据权利要求46的诊断试剂，其中作为HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体的组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
48.根据权利要求46或47的诊断试剂，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
49.一种试剂盒，其包含根据权利要求46-48中任一项的诊断试剂。
50.一种确定患者对WT1疫苗适合性的方法，包括下列(a)、(b)和(c)步骤：
(a)从接受了WT1疫苗后的测试受试者中分离含有CTL的生物学样品；
(b)测定(a)中生物学样品的WT1-特异性CTLs的存在频度或数量；和
(c)判断(b)的测定值相对于WT1疫苗施用前所获得的生物学样品是否高，并评价患者是否适于WT1疫苗治疗。
51.根据权利要求50的确定方法，其中使用HLA单体方法、HLA二聚体方法、HLA四聚体方法、HLA五聚体方法、ELISPOT方法、实时RT-PCR技术和有限稀释方法的任一种进行WT1-特异性CTLs的存在频度或数量的测定。
52.根据权利要求51的确定方法，其中使用HLA四聚体方法进行测定。
53.根据权利要求52的确定方法，其包括下列(a)、(b)、(c)和(d)步骤：
(a)从接受了WT1疫苗后测试受试者中分离含有CTLs的生物学样品；
(b)将含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA四聚体与(a)的生物学样品接触；
(c)测定与HLA四聚体结合的WT1-特异性CTLs的存在频度或数量；和
(d)判断(c)的测定值相对于WT1疫苗施用前所获得的生物学样品是否高，并评价患者是否适于WT1疫苗治疗。
54.根据权利要求53的确定方法，其中通过测定CD8-阳性或CD8/CD3-阳性CTLs中与HLA四聚体结合的细胞的比例进行权利要求53中步骤(c)。
55.根据权利要求53或54的确定方法，其中作为HLA四聚体组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
56.根据权利要求53-55中任一项的鉴定方法，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
57.根据权利要求50-56中任一项的确定方法，其使用流式细胞仪进行。
58.根据权利要求50-57中任一项的确定方法，其中使用与给药之前所获得的样品相比为1.5倍或更高的WT1-特异性CTLs的存在频度或数量作为指标评价对WT1疫苗治疗的适合性。
59.一种用于确定对WT1疫苗适合性的临床诊断试剂，其包含作为成分的、含有WT1-衍生的癌抗原肽的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
60.根据权利要求59的临床诊断试剂，其中作为HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体的组分的HLA抗原是HLA-A24抗原或HLA-A2抗原。
61.根据权利要求59或60的临床诊断试剂，其中WT1-衍生的癌抗原肽选自下列肽：
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：2)，
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO：3)，
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO：4)和
Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe(SEQ ID NO：5)。
62.一种包含根据权利要求59-61中任一项的临床诊断试剂的试剂盒。
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