CN1646910A - 白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的判定方法以及诊断药 - Google Patents

白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的判定方法以及诊断药 Download PDF

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Abstract

本发明涉及以对造血干细胞生长因子(SCGF)进行定量为特征的对白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行判定的方法、对白血病与前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行区别的方法、对再生障碍性贫血和骨髓发育异常综合征进行区别的方法、对造血干细胞移植后的造血干细胞的存活的状态进行判定的方法、或对移植物抗宿主病进行判定的方法。还涉及作为有效成分含有与造血干细胞生长因子(SCGF)反应的抗体的白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的诊断药、造血干细胞移植后的造血干细胞的存活延迟或移植物抗宿主病(GVHD)的诊断药。

Description

白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的 判定方法以及诊断药
技术领域
本发明涉及以测定造血干细胞生长因子(SCGF)为特征的对白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行判定的方法、对白血病与前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行区别的方法、对再生障碍性贫血与骨髓发育异常综合征进行区别的方法、对造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态进行判定的方法、或对移植物抗宿主病进行判定的方法。另外，还涉及含有以与造血干细胞生长因子(SCGF)反应的抗体为有效成分的白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病、造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态或移植物抗宿主病的诊断药以及诊断试剂盒。
背景技术
白血病、前白血病和非白血病性恶性血液疾病的诊断、或白血病、前白血病和非白血病性恶性血液疾病治疗后的诊断对于决定对白血病、前白血病和非白血病性恶性血液疾病进行治疗的方针是很重要的。
作为白血病初发的诊断，有测定患者末梢血中的白细胞数，计测值超过正常值时，怀疑白血病发生的方法。然而，即使是感冒等白血病以外的疾病，由于体内免疫反应的亢进，白细胞数也会增大，所以仅凭白细胞数的测定，存在假阳性的可能性。另外，末梢血中白细胞数的正常值为4,000～8,000个/μL，范围很宽，也存在假阴性的可能性。因此，需要准确度更高的白血病的诊断方法。
作为白血病复发的诊断方法有通过WT-1基因的RT-PCR进行的检测[(日本)临床病理 48，155(2000)；Blood， 84，3071(1994)；日本专利第3122771号]。然而该诊断方法不仅操作烦杂，而且需要特殊的装置。
而作为上述的白血病、前白血病以及非白血病性恶性血液疾病、先天性代谢疾病、实体瘤等的治疗方法之一，有造血干细胞移植疗法。有关造血干细胞移植疗法的问题方面，如由于供者的造血干细胞与患者的造血干细胞的HLA配型不相合、患者一方的身体条件或感染症等，出现移植的造血干细胞不能存活的造血干细胞的存活延迟的移植物抗宿主病(以下称为GVHD)等，有时不能充分获得造血干细胞移植治疗的效果，最坏的时候还会出现死亡的危象。
对于造血干细胞的存活延迟，可以通过向机体内给予G-CSF，促进造血干细胞的存活。另外对于GVHD，可以通过向机体内给予免疫抑制剂，抑制对提供的造血干细胞的排斥反应。然而，无论哪一种药剂过量给予时，都有副作用的危险。因此，对造血干细胞的存活状态、出现的GVHD症状进行诊断或预知对于治疗方针的决定是重要的。
作为确认造血干细胞移植后的造血干细胞存活的方法，可以测定末梢血中的白细胞数或血小板数，如果这些测定值上升，可以诊断为造血干细胞存活。然而，由于造血干细胞的存活需要从移植后10日至1个月以上时间，通过测定末梢血中的白细胞数或血小板数不能在早期对造血干细胞的存活进行判断。
作为GVHD发病的判定方法，有观察在造血干细胞移植后的恢复期出现的皮疹等。然而，简便、而且准确度高的GVHD发病的判定方法还没有。另外在GVHD发病以前预知GVHD发病的方法也没有。
人造血干细胞生长因子(Stem Cell Growth Factor；以下、简记为SCGF)是具有序列1或序列2的氨基酸序列的蛋白质[WO98/08859；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，7577(1997)；Biochem.Biophys.Res.Comm.， 249，124(1998)]。
作为识别SCGF的抗体，已知有可以通过使用基因重组法得到的SCGF、以及以从SCGF的N末端开始的第6位残基到第25位残基的部分肽作为免疫原制备的多克隆抗体以及从细胞培养上清进行部分纯化的SCGF或以通过基因重组法得到的SCGF作为免疫原制备的单克隆抗体[WO98/08859]。据报道该单克隆抗体具有中和活性，以通过基因重组法得到的SCGF作为免疫原制备的多克隆抗体在ELISA中可以与通过基因重组法得到的SCGF反应，通过使用以从SCGF的N末端开始的第6位残基至第25位残基的部分肽作为免疫原制备的多克隆抗体的Western印迹(blotting)可以检测通过基因重组法得到的SCGF。
另外，以从SCGF的N末端开始的第6位残基至第25位残基的部分肽作为免疫原的抗SCGF单克隆抗体KM2142已有报道[TheHematology Journal， 2，307(2001)]。
据报道对人正常组织进行Northern印迹(blotting)，结果发现SCGF基因的表达在肾脏多，而在心脏少，而在脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、胰脏中没有表达[Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 94，7577(1997)]，在脾脏、胸腺、盲肠、骨髓、胎儿肝中表达多，而在末梢血表达少[Biochem.Biophys.Res.Comm.， 249，124(1998)]。另外据报道对正常新生小鼠进行原位杂交，结果发现SCGF在骨髓、增殖软骨、骨膜附近表达[The Hematology Journal， 2，307(2001)]。
另外，据报道在骨髓细胞株(HT60、KPB-M15)、单核细胞株(THP-1、U-937)、成红细胞株(HEL)、成纤维细胞株(NHF)中发现了SCGF基因的表达，但在B细胞株(U266B1、IM-9)、T细胞株(MOLT-4)、成红细胞株(K562)、上皮系癌细胞株(HeLaS3、A431)、黑色素瘤细胞株(Bowes)、腺病毒转化胚胎性肾脏细胞株(293)、成纤维细胞株(CCD-8Lu)中没有发现SCGF基因的表达[Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 94，7577(1997)]。
然而、有关正常的和血液疾病的、或接受造血干细胞移植的包括人在内的动物的末梢血、骨髓中的血细胞的SCGF的mRNA量的差异还没有报道。
组织或细胞的mRNA与编码的蛋白质的量的相关性低(相关系数＝0.48)[Electrophoresis，18，533(1997)]，所以由SCGF的mRNA量推定SCGF蛋白质量是困难的。
如上所述，有关包括人在内的动物的血清、血浆等体液和组织中的SCGF蛋白质的存在、功能、与疾病的关系还没有被阐明。
本发明的目的在于提供白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的判定、白血病与前白血病或非白血病性恶性血液疾病的区别、再生障碍性贫血与骨髓发育异常综合征的区别、造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态以及GVHD的判定的方法、以及白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病、造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态和GVHD的诊断药以及诊断试剂盒。
发明内容
本发明涉及以下(1)～(20)内容。
(1)以测定机体样品中造血干细胞生长因子(SCGF)为特征的对白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行判定的方法。
(2)以测定机体样品中造血干细胞生长因子(SCGF)为特征的对白血病和、前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行区别的方法。
(3)以测定机体样品中造血干细胞生长因子(SCGF)为特征的对再生障碍性贫血和骨髓发育异常综合征进行区别的方法。
(4)以测定机体样品中造血干细胞生长因子(SCGF)为特征的对造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态进行判定的方法。
(5)以对机体样品中造血干细胞生长因子(SCGF)进行定量为特征的对移植物抗宿主病进行判定的方法。
(6)上述(1)～(5)任一项所述的方法，其中判定或区别方法是免疫学的测定方法。
(7)上述(6)所述的方法，其中免疫学的测定方法是夹层法(三明治法)。
(8)上述(7)所述的方法，其特征是：夹层法使用与造血干细胞生长因子(SCGF)的不同抗原表位反应的2种抗体。
(9)上述(8)所述的方法，其中抗体是从多克隆抗体和单克隆抗体选出来的抗体。
(10)上述(9)所述的方法，其中单克隆抗体是从可识别以序列1的6～28位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体、识别以29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体以及60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体选出来的单克隆抗体。
(11)含有以与造血干细胞生长因子(SCGF)反应的抗体作为有效成分的白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的诊断药。
(12)含有以与造血干细胞生长因子(SCGF)反应的抗体作为有效成分的造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态的诊断药。
(13)含有以与造血干细胞生长因子(SCGF)反应的抗体作为有效成分的移植物抗宿主病的诊断药。
(14)上述(11)～(13)任一项中所述的诊断药，其中抗体是从多克隆抗体和单克隆抗体选出来的抗体。
(15)上述(14)所述的诊断药，其中单克隆抗体是从可识别以序列1的6～28位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体、识别以29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体以及识别以60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体选出来的单克隆抗体。
(16)含有与造血干细胞生长因子(SCGF)反应的抗体的白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病、造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态或移植物抗宿主病的诊断用试剂盒。
(17)含有造血干细胞生长因子(SCGF)的上述(16)所述的诊断用试剂盒。
(18)识别以序列1的29～59位氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体。
(19)识别以序列1所述的60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体。
(20)生产上述(18)或(19)所述单克隆抗体的杂交瘤。
附图的简单说明
图1是表示单克隆抗体对人SCGF部分肽(化合物1)反应性的图(结合ELISA)。
图2表示纯化人SCGF蛋白质的SDS-PAGE和Western印迹结果。带1和2分别表示分子量标记物和纯化人SCGF蛋白质的SDS-PAGE图。带3、4、5分别表示使用KM2142、KM2804、KM2945的纯化人SCGF蛋白质的Western印迹结果的图。
1：分子量标记物的带
2：对纯化SCGF进行解析，银染色的带
3：使用抗SCGF抗体KM2142进行了Western印迹的带
4：使用抗SCGF抗体KM2804进行了Western印迹的带
5：使用抗SCGF抗体KM2945进行了Western印迹的带
A：表示SCGF蛋白质的分子量。
B：表示缺失N末端28个残基的SCGF蛋白质Δ28体的分子量。
C：表示缺失N末端59个残基的SCGF蛋白质Δ59体的分子量。
图3是表示单克隆抗体对CHO细胞表达人SCGF蛋白反应性的图(结合ELISA)。
图4是表示单克隆抗体对SDS变性人SCGF蛋白(CHO细胞表达)反应性的图(结合ELISA)。
图5表示单克隆抗体对人以及小鼠SCGF蛋白(CHO细胞表达)的反应性的图。(结合ELISA)
图6是表示通过使用单克隆抗体的夹层ELISA对人SCGF蛋白进行定量的定量曲线的图。
图7表示各种血液疾病患者血清中SCGF浓度。横实线表示各种血液疾病组的中央值，横点线表示由健康人组求得的临界值(18.2ng/mL)。
*：与Normal(健康人组)或AA(再生障碍性贫血组)的显著性差异p＜0.05、
#：与NHL(非霍奇金淋巴瘤)的显著性差异P＜0.05、
$：与MM(多发性骨髓瘤)的显著性差异p＜0.05
图8是表示由于造血干细胞移植患者血清中SCGF浓度不同引起的GVHD发病和非发病的差别的图。横实线表示备组的中央值。
*：与GVHD非发病例的显著性差异p＜0.05、
#：与预处理期的显著性差异p＜0.05、
$：与再生障碍期的显著性差异p＜0.05、
&：与恢复期的显著性差异p＜0.05
图9是表示造血干细胞移植患者血清中SCGF浓度与GVHD发病患者的检测灵敏度、非发病患者的特异度的关系的图。●：灵敏度、○：特异度、纵点线表示假定的临界值。
图10是表示由于造血干细胞移植患者血清中SCGF浓度引起的存活延迟以及非延迟的差别的图。横实线表示各组的中央值。
#：与预处理期的显著性差异p＜0.05、
$：与再生障碍期的显著性差异p＜0.05、
&：与恢复期的显著性差异p＜0.05
图11是表示造血干细胞移植患者血清中SCGF浓度与造血干细胞存活延迟例的检测灵敏度、非延迟例的特异度的关系的图。●：灵敏度、○：特异度、纵点线表示假定的临界值。
具体实施方式
本发明涉及对白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行判定的方法。
作为白血病只要是造血系统细胞中造血细胞等未成熟的细胞被肿瘤化的无论哪一种都包括在内，如急性淋巴性白血病(以下称为ALL)、急性骨髓性白血病(以下称为AML)、慢性骨髓性白血病(以下称为CML)等。
作为前白血病只要是造血系统细胞中淋巴细胞等成熟的细胞被肿瘤化的无论哪一种都包括在内，如骨髓发育异常综合征(以下称为MDS)等。
作为非白血病性恶性血液疾病如淋巴瘤或骨髓瘤等。
作为淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(以下称为NHL)等。
作为骨髓瘤如多发性骨髓瘤(以下称为MM)等。
在白血病、前白血病和非白血病性恶性血液疾病患者的机体样品中含有的SCGF浓度比健康人的机体样品中含有的SCGF浓度显著上升。因此、对SCGF浓度设置临界值，对采取的机体样品中的SCGF进行定量，当SCGF浓度比临界值高时，可以判定是白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病。
所谓临界值指的是针对某一物质，在对作为目的的疾病组与非疾病组进行判定时所定下的值。在对作为目的的疾病组与非疾病组进行判定时，临界值以下作为阴性、临界值以上作为阳性，或者临界值以下为阳性、临界值以上作为阴性，可以对疾病进行判定(金井正光编、临床检查法提要金原出版株式会社)。
作为以对临界值的临床的有用性进行评价为目的使用的指标，有灵敏度和特异度。
用临界值对某一总体进行判定，当疾病患者中，判定为阳性的表示为a(真阳性)、虽为疾病患者，但判定为阴性的表示为b(假阴性)、尽管不是疾病患者但判定为阳性的表示为c(假阳性)、不是疾病患者而判定为阴性的表示为d(真阴性)时，可以将用a/(a+b)表示的值表示为灵敏度(真阳性率)、用d/(c+d)表示的值表示为特异度(真阴性率)。
作为目的的疾病组与非疾病组的测定值的分布通常有一部分重复。因此，通过使临界值升降，可以使灵敏度与特异度发生变化。通过降低临界值虽然可以提高灵敏度，但特异度降低，通过提高临界值，灵敏度降低，可是特异度上升。作为判定方法，灵敏度和特异度两者的值都越高越好。而灵敏度和特异度的值不超过50％的判定方法被认为没用。
作为设定临界值的方法，如将从包含非疾病组的分布的95％的中央开始的两端中任一端的值设定为临界值的方法，非疾病组的分布表现为正态分布时，将平均值+2倍的标准偏差(SD)或平均值-2SD设定为临界值的方法等。
当判定是否是白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病时，对于将临界值设定为15.0ng/mL时，可以以灵敏度89.5％、特异度70％进行判定，对于将临界值设定为13.0ng/mL时，可以以灵敏度100％、特异度60％进行判定。如果将来自健康人的SCGF浓度的临界值设定为平均值+2SD的18.2ng/mL，可以以灵敏度89.5％、特异度100％进行判定。而在该临界值，可以以灵敏度95％、特异度100％判定是否是白血病，以灵敏度76.9％、特异度100％判定是否是非白血病性恶性血液疾病，另外可以以灵敏度100％、特异度100％判定是否是前白血病。
作为机体样品可以是血液、尿、髓液、穿刺液等任一种，最好是血液。作为血液如全血、血浆、血清、血细胞溶血液、血细胞内液等，最好是血清或血浆。
本发明涉及白血病与前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行区别的方法。
白血病患者的机体样品中含有的SCGF浓度比前白血病或非白血病性恶性血液患者的机体样品中含有的SCGF浓度显著上升。因此、用上述方法判定为白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病后，设置判定为白血病的临界值，当采取的机体样品中的SCGF浓度比该临界值还高时，可以判断为白血病，比临界值低时判断为前白血病或非白血病性恶性血液疾病。
对白血病与前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行区别时，在将临界值设定为23.8ng/mL时，可以以灵敏度85％、特异度69.2％进行区别。另外将临界值设定为非白血病性恶性血液疾病患者的平均值+2SD的32.8ng/mL时，可以以灵敏度80％、特异度100％进行区别。
本发明涉及对再生障碍性贫血与骨髓发育异常综合征进行区别的方法。
再生障碍性贫血和骨髓发育异常综合征是以在骨髓以及末梢血中白细胞的数目或形态发生异常为特征的病态，两种疾病的区别一直很难。
骨髓发育异常综合征患者的SCGF浓度比健康人血液中含有的SCGF浓度显著上升，但再生障碍性贫血患者血液中SCGF浓度与健常人一样没有变化。骨髓发育异常综合征患者血中SCGF浓度比再生障碍性贫血患者的血中SCGF浓度显著高，通过测定两者血中SCGF浓度，可以区别是再生障碍性贫血还是骨髓发育异常综合征。
因此，对白细胞表现异常的患者中再生障碍性贫血患者和骨髓发育异常综合征患者进行区别时，由再生障碍性贫血患者的SCGF浓度设定临界值(平均值+2SD＝16.6ng/mL)，如果通过该临界值进行判断，可以以灵敏度100％、特异度100％对再生障碍性贫血患者和骨髓发育异常综合征患者进行区别。再将基准值设定为15.6ng/mL～18.6ng/mL，可以以灵敏度100％、特异度100％对再生障碍性贫血患者和骨髓发育异常综合征患者进行区别。
另外本发明涉及对造血干细胞移植后的造血干细胞的存活延迟进行判定的方法。
作为造血干细胞移植，只要是移植造血干细胞的方法无论哪一种都可以，如骨髓移植、脐带血移植、末梢血干细胞移植等。
从造血干细胞移植开始一直到造血干细胞存活为止的期间，以患者末梢血的血细胞数作为基准，可以分为以下给出的4个时期。即、在移植前的处于大量投给抗癌剂等状态的预处理期、处于移植后血细胞数减少状态的再生障碍期、处于移植后血细胞数恢复状态的恢复期、以及移植后造血干细胞存活的稳定期。
在进行造血干细胞移植的患者的预处理期以及再生障碍期的机体样品中含有的SCGF浓度，其中造血干细胞存活延迟患者的机体样品中含有的SCGF浓度比造血干细胞存活没有延迟的患者的机体样品中含有的SCGF浓度高。因此，测定各个时期的SCGF浓度，将被判断为担心存在造血干细胞存活延迟的SCGF浓度定为临界值，如果SCGF浓度比临界值低时，判定为没有出现存活的延迟，对于SCGF浓度比临界值高时，可以判定为发生了存活的延迟。
为了判定造血干细胞的存活延迟，在预处理期时，例如可以通过将临界值定为9.5ng/mL，以灵敏度75％、特异度67％进行判定，而在再生障碍期时，可以通过将临界值定为12ng/mL，以灵敏度75％、特异度63％进行判定。
另外本发明还涉及对GVHD的发病进行判定的方法。
进行造血干细胞移植的患者处于再生障碍期以及恢复期的机体样品中含有的SCGF浓度，GVHD发病的患者比GVHD不发病的患者高。因此，测定各个时期的SCGF浓度，定下判定在各个时期担心GVHD发病的临界值，SCGF浓度比临界值低时，不用担心GVHD发病，而当SCGF浓度比临界值高时，可以判断为GVHD有发病危险。
为了对造血干细胞移植后的GVHD的发病进行判定，可以通过在预处理期将临界值定为例如5ng/mL，以灵敏度87％、特异度57％，在再生障碍期将临界值定为例如10ng/mL，以灵敏度87％、特异度63％，在恢复期通过将临界值定为例如15ng/mL，以灵敏度87％、特异度63％对GVHD发病患者与非发病患者进行判定。
作为测定机体样品中造血干细胞生长因子(以下称为SCGF)的方法，免疫学的测定法、分子生物学的测定法等哪一种方法都可以，优选有免疫学的测定法。
作为免疫学的测定法只要是免疫测定法、免疫印迹法、凝集反应、补体结合反应、溶血反应、沉降反应、胶体金法、色谱法、免疫染色法等利用抗原抗体反应的方法，无论哪一种都包括在内，优选有免疫测定法。
作为分子生物学的测定法如RT-PCR法、Northern印迹(blotting)法、原位杂交法等。
免疫测定法是使用实施了各种标记的抗原或抗体，对抗体或抗原进行检测或定量的方法，根据抗原或抗体的标记方法不同有放射免疫检测法(RIA)、酶免疫检测法(EIA或ELISA)、荧光免疫检测法(FIA)、发光免疫检测法(luminescent immunoassay)、物理化学检测法(TIA，LAPIA，PCIA)、流式细胞测量法等，优选酶免疫检测法。
作为在放射免疫检测法中使用的放射性标记体，可以使用任意的众所周知(石川荣次等人编、《酵素免疫測定法》、医学书院)的放射性同位元素。例如可以使用32P、125I、131I等。
作为酶免疫检测法中使用的酶标记体可以使用任意众所周知(石川荣次等人编、《酵素免疫測定法》、医学书院)的酶。例如、可以使用碱性磷酸酶、过氧化物酶、虫荧光素酶等。
另外酶免疫测定法通过测定由于酶的作用生成的物质进行测定·检测，可以采取对在紫外区或可见区具有极大吸收的物质的吸光度进行测定的方法、测定生成的荧光物质的荧光强度的方法、测定生成的物质的发光强度的方法等各式各样的测定方法。例如作为酶标记体使用碱性磷酸酶时，作为由于碱性磷酸酶作用生成在紫外区或可见区具有极大吸收那样物质的碱性磷酸酶的底物，例如4-硝基苯基磷酸等。4-硝基苯磷酸由于碱性磷酸酶作用变换为4-硝基苯酚。作为通过碱性磷酸酶作用生成发光那样的碱性磷酸酶的底物，例如3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基(オキシン))苯基-1，2-二氧杂环丁烷·二钠盐(AMPPD)、2-氯-5-{4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2’-(5’-氯)三环[3.3.13，7]癸烷]-4-基}苯基磷酸酯·二钠盐(CDP-StarTM)、3-{4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2’-(5’-氯)三环[3.3.13，7]癸烷]-4-基}苯基磷酸酯·二钠盐(CSPDTM)、[10-甲基-9(10H)-吖啶叉基(アクリジニルイデン)]苯氧基甲基磷酸·二钠盐(LumigenTM APS-5)等。另外，作为通过碱性磷酸酶的作用生成色素的试剂，如作为碱性磷酸酶的底物的含有NADPH的酶循环反应试剂AmpliQ(DAKO公司生产)。
作为发光免疫检测法中使用的发光标记体，可以使用任意的众所周知[今井一洋编、生物发光和化学发光、广川书店；临床检查42(1998)]的发光体。例如可以使用吖啶鎓酯、洛粉碱(2，4，5-三苯基咪唑)等。
作为在荧光免疫检测法中使用的荧光标记体，可以使用任意的众所周知(川生明著、荧光抗体法、软科学(ソフトサイエンス)公司生产)的荧光。例如可以使用FITC、RITC等。
作为免疫测定法中的测定方法，如竞争法、夹层法[免疫学解说(イラストレイテツド)第5版(南光堂)]等，优选夹层法。
夹层法是使第二抗体(二次抗体)同时或分别与在抗原抗体反应中结合的样品中的目的物质和第一抗体反应，对样品中的目的物质用同一或各自的抗体进行检测或定量的方法。多数情况下，在测定操作中包括对样品中的没有反应的样品成分或测定系成分进行清洗的工序。例如，将第一抗体(一次抗体)固定于固相后、使希望测定的样品与第一样品接触。对样品中的没有反应的样品成分进行清洗，从反应系除去后，再使第二抗体(二次抗体)与在抗原抗体反应中结合的样品中的目的物质和第一抗体的复合体反应，将测定体系中与反应无关的第二次抗体等成分洗净除去后，对反应系中存在的样品中的目的物质进行检测或定量的方法。
作为夹层法中使用的固相，如聚氯乙烯制微量滴定板、聚苯乙烯制微量滴定板等。
作为夹层法中使用的抗体，可以使用多克隆抗体、单克隆抗体中的任一种，也可以使用Fab、Fab′、F(ab)2的抗体片段。
作为在夹层法使用的一次抗体和二次抗体的组合，只要是识别不同抗原表位的抗体的组合，无论哪一种都可以，但至少有一个是单克隆抗体最好。
作为在本发明的夹层法中使用的单克隆抗体，如识别序列1记载的6～28位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体、识别序列1记载的29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体以及识别序列1记载的60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体等。
作为识别序列1记载的6～28位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体，如杂交瘤KM2142[The Hematology Journal， 2，307(2001)]生产的单克隆抗体KM2142。作为识别序列1记载的29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体，如杂交瘤KM2804(FERM BP-7923)生产的单克隆抗体KM2804。作为识别用序列1记载的60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体，如杂交瘤KM2945生产的单克隆抗体KM2945。
生产单克隆抗体KM2142的杂交瘤KM2142、生产单克隆抗体KM2804的杂交瘤KM2804、生产单克隆抗体KM2945的杂交瘤KM2945已于平成14年2月26日分别以FERM BP-7922、FERMBP-7923和FERM BP-7924保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
由于上述的单克隆抗体识别SCGF的部位各不相同，将这些单克隆抗体组合可以实施夹层法。作为优选的单克隆抗体的组合，如识别用序列1的6～28位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体、具体的如杂交瘤KM2142[The Hematology Journal， 2，307(2001)]生产的单克隆抗体KM2142和识别用序列1记载的29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体、具体的如杂交瘤KM2804(FERM BP-7923)生产的单克隆抗体KM2804的组合。
以下给出了通过本发明的夹层法对SCGF进行检测或定量的方法的具体例子。
首先将上述抗SCGF抗体(一次抗体)吸附固定于适当的固定载体的表面。一次抗体的固定可以通过例如将该抗体在适当的缓冲液、例如磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液等稀释后、使稀释后溶液与固定载体的表面接触，然后于4～37℃下反应30分钟以上来进行。
接下来对固定载体表面的蛋白质结合能力进行封闭。例如，使固定载体表面上的游离结合基与封闭缓冲液接触。
作为封闭缓冲液，例如含有1～10％的牛血清白蛋白、10～30％ブロツクエ一ス(雪印乳业公司生产)的缓冲液、例如磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液等。
封闭处理可以通过在4～37℃下反应30分钟以上进行。
然后使一次抗体与机体样品接触。机体样品根据需要，也可以用含有例如0.01～1％的牛血清白蛋白等蛋白质的缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液等进行稀释。
一次抗体和机体样品的接触通过在4～37℃下反应30分钟以上进行。
接触后，根据需要，用含有Tween20等表面活性剂的缓冲液、例如磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液等洗几次。
此时、机体样品中存在的SCGF通过与预先固定的抗SCGF抗体进行特异结合，通过抗SCGF抗体被固定在固定载体。
然后使固定了SCGF的上述载体与含有二次抗体的溶液接触。
作为二次抗体，只要是与一次抗体抗原表位不同的抗SCGF抗体，可以使用任一种。另外，二次抗体根据需要，可以用上述的标记体进行预先标记。
为了除去未吸附的二次抗体，根据需要，可以使用含有Tween20等表面活性剂的缓冲液、例如磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液等，对载体进行多次清洗。通过这样操作，该二次抗体借助于预先结合的一次抗体和SCGF，与固定载体结合，二次抗体的结合量应当反映出机体样品中的SCGF量。
象上述那样被固定的二次抗体可以根据二次抗体的标记体进行测定。另外使用对二次抗体特异的三次抗体，通过各种方法预先对该三次抗体进行标记，也可以对三次抗体的标记进行检测或测定。
象上述那样，测定结合的二次抗体的量，使用标准物质做成标准曲线，可以测定机体样品中的SCGF量。
标准曲线可以通过准备对含有作为标准物质浓度已知的人SCGF蛋白质的溶液进行数点梯度稀释的样品，与机体样品一起实施上述夹层法来制作。
作为本发明的白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的诊断药、造血干细胞移植后造血干细胞的存活延迟的诊断药、以及GVHD发病的诊断药中含有的针对SCGF的抗体，只要是与SCGF反应的抗体，可以使用多克隆抗体、单克隆抗体或抗体片段等任一种，最好使用单克隆抗体。
作为单克隆抗体，如识别用序列1记载的6～28位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体、识别用序列1记载的29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体以及识别用序列1记载的60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体。
作为识别用序列1记载的6～28位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体，如杂交瘤KM2142(FERM BP-7922)生产的单克隆抗体KM2142。作为识别用序列1记载的29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体，如杂交瘤KM2804(FERM BP-7923)生产的单克隆抗体KM2804。作为识别用序列1记载的60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体，如杂交瘤KM2945(FERM BP-7924)生产的单克隆抗体KM2945。
作为本发明的试剂盒，可以由仪器或试剂的组合构成，只要是含有与以下所述的各构成要素本质上同一、或与其一部分本质上同一的物质，即使构成或形态不同，也包括在本发明的试剂盒内。
作为试剂，包括与SCGF反应的抗体，另外根据需要，也可含有机体样品的稀释液、抗体固定化固相、反应缓冲液、洗净液、标记了的二次抗体或其抗体片段、标记体的检测用试剂、SCGF等的标准物质等。
作为机体样品的稀释液如在表面活性剂、缓冲剂等中含有BSA或酪蛋白等蛋白质的水溶液等。
作为抗体固定化固相可以使用在进行整形使得各种高分子素材符合用途的那样原材料上进行了本发明的抗体或抗体片段固相化的抗体固定化固相。作为形状如管、珠、板、胶乳等微粒子、棒等，作为原材料如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、明胶、琼脂糖、纤维素、聚对苯二甲酸乙二醇酯等高分子原材料、玻璃、陶瓷或金属等。可以通过作为抗体固相化方法的物理方法和化学方法或这些方法并用等众所周知的方法制备。例如、在聚苯乙烯制96孔的免疫测定用微量滴定板对抗体等进行疏水固相化的抗体固相化固相。
反应缓冲液只要是提供抗体固定化固相的抗体和机体样品中的抗原进行结合反应时的溶剂环境的缓冲液无论哪一种都可以，如表面活性剂、缓冲剂、BSA或酪蛋白等蛋白质、防腐剂、稳定剂、反应促进剂等。
作为洗涤液，在磷酸或Tris(三羟甲基氨基甲烷)、HEPES或MOPS等Good缓冲液类等的缓冲剂等至少含有一种Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、TritonTMX-705等表面活性剂、NaCl、KCl或硫酸铵等盐、BSA或酪蛋白等蛋白质、叠氮钠等防腐剂、盐酸胍、尿素或十二烷基硫酸钠等变性剂、聚乙二醇、羧甲基纤维素、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素等安定化剂的溶液。具体来说，如由0.15mol/L氯化钠、0.05％Tween20和pH7.4的10mmol/L磷酸缓冲液构成的TweenPBS；由0.15mol/L氯化钠、0.05％Tween20和pH7.4的10mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)构成的TweenTBS等。
作为被标记的二次抗体或其抗体片段，可以使用混合有对本发明的抗体或抗体片段用辣根过氧化物酶(HRP)、牛小肠碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等标记用酶进行了标记的产物、缓冲剂、BSA或酪蛋白等蛋白质、防腐剂等的标记抗体混合物。
作为标记体的检测用试剂根据上述的标记用酶，例如如果是辣根过氧化物酶，可以是四甲基联苯胺或正苯二胺等吸光测定用底物、羟苯羟苯基丙酸或羟苯乙酸等荧光底物、氨基苯二酰肼等发光底物，如果是碱性磷酸酶可以使用如4-硝基苯磷酸盐等吸光度测定用底物、4-甲基伞形酸基磷酸盐等荧光底物等。
作为标准物质如通过WO98/08869记载的方法可以制备的SCGF、试剂盒中使用的含有2种抗体的抗原表位的肽等。
另外本发明涉及识别用序列1记载的29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体以及识别用序列1记载的60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体。
识别用序列1记载的29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体，如杂交瘤KM2804(FERM BP-7923)生产的单克隆抗体KM2804。识别用序列1记载的60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体，如杂交瘤KM2945(FERM BP-7924)生产的单克隆抗体KM2945。
作为本发明中使用的单克隆抗体的制造方法可以使用众所周知的单克隆抗体的制造方法制造。
以下对本发明中使用的单克隆抗体的制造方法进行详细说明。
(1)抗原的制备
作为抗原如可以将含有编码人SCGF的cDNA的表达载体导入到大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等得到的人SCGF蛋白质、通过肽合成得到的含有人SCGF部分序列的合成肽等。
作为抗原用部分肽可以选择5～30个残基左右的蛋白质部分序列。为了获得识别没有变性的具有天然构造状态的该蛋白质的抗体，需要选择在立体结构上存在于蛋白质表面的部分序列作为抗原肽。通过Kyte和Doolittle的方法(Journal of Molecular Biology，157，105-132(1982))等对亲水性高的部分序列进行预测，可以推测在立体构造上存在于蛋白质表面的部分。即，一般来说，亲水性低的部分往往在立体构造上存在于蛋白质的内部，而亲水性高的部分大多存在于蛋白质表面。另外，蛋白质的N末端、C末端往往存在于蛋白质表面。还可以参考蛋白质的二级结构信息。通过Chou-Fasman的方法[Advances in Enzymology，47，45-147(1978)]等，在由氨基酸序列预测蛋白质二级结构中，也可以考虑将含有回转构造或无规卷曲构造的部分作为抗原用肽使用。然而、这样选择的部分肽不一定能成为确立目的抗体的抗原。
在部分肽中为了与蛋白质交联可以在末端附加半胱氨酸。当选择蛋白质的内部序列时，根据需要，肽的N末端可以进行乙酰化、C末端进行酰胺化。
部分肽可以通过一般的液相、固相肽合成法以及将他们适当组合的方法、或源于这些方法的方法进行合成[International Journal ofPeptide Protein Research， 35，161-214(1990)、Solid-Phase PeptideSynthesis，Methods in Enzymology，vol 289，Gregg B.Fields编，Academic Press，(1997)、Peptide Synthesis Protocols，Methods inMolecular Biology，vol.35，Michael W.Pennington，Ben M.Dunn编，Humana Press，(1994)]。
另外也可以使用自动肽合成仪。通过肽合成仪进行肽的合成可以在岛津制作所生产的肽合成仪、Advanced ChemTech Inc.，USA(以后简称为ACT公司)制造的肽合成仪等市售的肽合成仪上，使用对侧链进行适当保护的Nα-Fmoc-氨基酸或Nα-Boc-氨基酸等，按照各个仪器的合成程序实施。作为原料的保护氨基酸和载体树脂可以从ABI公司、岛津制作所、国产化学(株)、NovaBiochem、渡边化学(株)、ACT公司、AnaSpec Inc.、或肽研究所(株)等获得。
(2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备
用(1)中制备的抗原对3～20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠进行免疫，采取该动物的脾、淋巴节、末梢血中的抗体产生细胞。
通过将抗原与适当的佐剂[例如、弗氏完全佐剂(completefreund′s adjuvant)或氢氧化铝凝胶和百日咳菌疫苗等]注射到动物的皮下或静脉内或腹腔内进行免疫。抗原为部分肽时，制作与BSA(牛血清白蛋白)或KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体蛋白质的缀合物，将他们作为免疫原使用。
抗原的投给，第1次投给后，每隔1～2周期间进行一次，进行3～10次。每次投给后第3～7天从眼底静脉丛进行采血，通过酶免疫测定法[Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988]等研究该血清与抗原的反应。将该血清对免疫使用的抗原表现出充分抗体效价的小鼠、大鼠或仓鼠作为抗体产生细胞的供给源。
当要进行抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的融合时，在抗原物质最终投给后第3～7天内，从免疫的小鼠、大鼠或仓鼠摘出脾脏，采取脾细胞。将脾脏于MEM培养基(日水制药公司生产)中切成薄片，用镊子拨开，进行离心分离(1,200rpm、5分钟)后、弃去上清，用Tris-氯化铵缓冲液(pH7.65)处理1～2分钟，除去红细胞，用MEM培养基洗3次后，用作融合用脾细胞。
(3)骨髓瘤细胞的制备
作为骨髓瘤细胞，使用从小鼠获得的株化细胞。例如，使用8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(BALB/c由来)骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology，18：1-7(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology，6：511-519(1976)]、SP2/O-Ag14(SP-2)[Nature，276：269-270(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology，123：1548-1550(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature，256：495-497(1975)]等。这些细胞株用8-氮杂鸟嘌呤培养基[向RPM I-1640培养基中加有谷氨酰胺(1.5mmol/L)、2-巯基乙醇(5×10-5mol/L)、庆大霉素(10μg/mL)以及胎牛血清(FCS)的培养基(以下称为正常培养基。)中再加入8-氮杂鸟嘌呤(15μg/mL)的培养基]可以进行传代，但要在细胞融合的3～4天前于正常培养基中进行传代，确保在融合当日有2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合
用MEM培养基或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、食盐7.65g、蒸馏水1升、pH7.2)充分清洗在(2)中免疫的抗体产生细胞和(3)中得到的骨髓瘤细胞，然后混合使抗体产生细胞细胞数∶骨髓瘤细胞细胞数＝5～10∶1，离心分离(1,200rpm、5分钟)后、弃去上清，将沉淀的细胞组充分拨开后，一边搅拌，一边于37℃下加聚乙二醇-1,000(PEG-1,000)2g、MEM 2mL和二甲基亚砜0.7mL的混合液0.2～1mL/108抗体产生细胞，每1～2分钟加几次MEM培养基1～2mL后、加MEM培养基使得全量达到50mL。离心分离(900rpm、5分钟)后、弃去上清，慢慢地将细胞拨开后、通过刻度吸管吸入、吹出那样将细胞悬浮于HAT培养基[正常培养基中加了次黄嘌呤(10-4mol/L)、胸腺嘧啶脱氧核苷(1.5×10-5mol/L)和氨基蝶呤(4×10-7mol/L)的培养基]100mL中。将该悬浮液注入到96孔培养用板中，每孔100μL，在5％CO2培养箱中、于37℃下培养7～14天。
培养后、取培养上清的一部分，通过下述的酶免疫测定法等，选择与人SCGF反应，而与不含有人SCGF的抗原不反应的上清的细胞。然后通过有限稀释法反复进行2次克隆[第1次使用HT培养基(从HAT培养基中除去氨基蝶呤的培养基)、第2次使用正常培养基]，选择稳定、而且确认强抗体效价的细胞作为抗人SCGF单克隆抗体产生杂交瘤株。
酶免疫测定法
将抗原或表达抗原的细胞等铺在96孔板中，使作为第一抗体的杂交瘤培养上清或通过上述方法的纯化抗体反应。
第一抗体反应后、将板洗净后添加第二抗体。
所谓第二抗体是可以识别第一抗体免疫球蛋白的抗体经生物素、酶、化学发光物质或放射线化合物等标记的抗体。具体来说，在杂交瘤制作时如果使用小鼠，作为第二抗体使用能够识别小鼠免疫球蛋白的抗体。
反应后、选择进行对应于标记第二抗体的物质的反应，生产与抗原进行特异反应的单克隆抗体的杂交瘤。
(5)单克隆抗体的制备
向降植烷处理[腹腔内注射2，6，10，14-四甲基十五烷(Pristane)0.5mL，饲养2周]的8～10周龄小鼠或裸鼠腹腔内注射(4)得到的抗人SCGF单克隆抗体产生杂交瘤细胞2×106～5×107细胞/只。经10～21日，杂交瘤进行癌性腹水化。从该小鼠采取腹水，离心分离(3,000rpm、5分钟)后，除去固体成分后，用40～50％硫酸铵盐析后，通过辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A-柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM级分，作为纯化单克隆抗体。
使用亚类分型试剂盒利用酶免疫测定法决定抗体亚类。蛋白量的定量通过Lowry法和280nm的吸光度算出。
[实施例]
实施例1.用人SCGF部分肽制作抗人SCGF单克隆抗体
(1)人SCGF部分肽的合成
对人SCGF蛋白序列进行解析，从亲水性高的部分、N末端、C末端、含有二级结构上旋转结构、无规卷曲结构的部分中，选择作为抗原认为合适的部分序列，化合物1(SCGF-1)。
(关于简写)
有关本发明中使用的氨基酸以及其保护基的简写来自于参与生物化学命名的IUPAC-IUB委员会(IUPAC-IUB Joint Commission onBiochemical Nomenclature)的推荐[European Journal ofBiochemistry，138卷，9頁(1984年)]。
以下的简写只要没有特别说明，都是表示对应的下述氨基酸。
Ala：L-丙氨酸
Arg：L-精氨酸
Cys：L-半胱氨酸
Gln：L-谷氨酰胺
Glu：L-谷氨酰胺酸
Glx：L-谷氨酰胺酸
Gly：甘氨酸
Leu：L-亮氨酸
Trp：L-色氨酸
以下简写表示对应的下述氨基酸的保护基和侧链保护氨基酸。
Fmoc：9-笏甲氧羰基
tBu：叔丁基
Trt：三苯甲基
Boc：叔丁氧羰基
Pmc：2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基
Fmoc-Arg(Pmc)-OH：Nα-9-笏甲氧羰基-Ng-2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基-L-精氨酸、
Fmoc-Gln(Trt)-OH：Nα-9-笏甲氧羰基-Nε-三苯甲基-L-谷氨酰胺
Fmoc-Glu(OtBu)-OH：Nα-9-笏甲氧羰基-L-谷氨酰胺酸-γ-t-丁酯
Fmoc-Trp(Boc)-OH：Nα-9-笏甲氧羰基-Nind-t-丁氧羰基-L-色氨酸
以下简写表示对应的下述的反应溶剂、反应试剂等。
PyBOP：苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鎓六氟磷酸盐
HOBt：N-羟基苯并三唑
NMM：N-甲基吗啉
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
TFA：三氟乙酸
在以下实施例中，化合物的理化性质通过如下方法测定。
用日本电子JMS-HX110A通过FAB-MS法，或用Bruker公司生产的质量分析装置REFLEX通过MALDI-TOFMS法进行质谱分析。根据Cohen，S.A.等人的方法[Analytical Biochemistry，222，19(1994)]进行氨基酸分析。在盐酸蒸气中于110℃下水解20小时，水解物的氨基酸组成用Waters AccQ-Tag氨基酸分析仪(Waters公司生产)进行分析。
①化合物1(SCGF-1)(序列4)(Ac-Arg-Glu-Trp-Glu-Gly-Gly-Trp-Gly-Gly-Ala-Gln-Glu-Glu-Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Ala-Leu-Cys-OH)的合成
将结合了Fmoc-Cys(Trt)14.1μmol的载体树脂(H-Cys(Trt)-2-Cl Trt resin树脂、ノバビオケム公司生产)30mg加到自动合成仪(岛津制作所)反应容器中，然后加600μL的DMF，搅拌3分钟，排出溶液后，按照岛津制作所的合成程序进行以下操作。
(a)加30％哌啶-DMF溶液900μL，将混合物搅拌4分钟，排出该溶液，再重复进行一次该操作。
(b)用900μL的DMF将载体树脂洗1分钟，排出该溶液，将该操作重复5次。
(c)将Fmoc-Leu-OH(141μmol)、PyBOP(141μmol)、HOBt1水合物(141μmol)和NMM(212μmol)在DMF(494μL)中搅拌3分钟，将得到的溶液加到树脂中，将混合物搅拌30分钟，排出溶液。
(d)用900μL的DMF将载体树脂清洗1分钟后，排出溶液，将该操作重复5次。
经这样操作，在载体上合成了Fmoc-Leu-Cys(Trt)。
接下来，在(a)(b)工序后的(c)工序中，用Fmoc-Ala-OH进行缩合反应，经(d)的清洗工序，在载体上合成了Fmoc-Ala-Leu-Cys(Trt)。
以下、在工序(c)中，依次使用Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH，反复进行(a)～(d)后、经(a)(b)的脱保护、清洗工序，用甲醇、丁醚依次进行清洗，减压下干燥12小时，得到N末端无保护，侧链被保护的结合肽的载体树脂。然后对得到的载体树脂进行如下的(e)～(g)操作。
(e)用800μL的DMF将载体树脂清洗1分钟，排出该溶液，将该操作重复进行3回。
(f)将乙酸酐(282μmol)和DMF(500μL)加到树脂中，将混合物搅拌2小时，排出溶液。
(g)用800μL的DMF将载体树脂清洗1分钟，排出该溶液，将该操作重复进行3回。
然后，用甲醇、丁醚依次进行清洗，于减压下干燥12小时，得到了结合了N末端乙酰化的侧链保护肽的载体树脂。然后向载体树脂中加入5mg/mL浓度的由含有2-甲基吲哚的TFA(82.5％)、茴香硫醚(5％)、水(5％)、乙基甲基硫醚(3％)、1，2-乙二硫醇(2.5％)和苯硫酚(2％)构成的混合溶液1mL，于室温下放置6小时，在除去侧链保护基的同时将肽从树脂上切下。将树脂过滤后，向得到的溶液中加入醚约10mL，通过离心分离和滗析回收生成的沉淀，得到作为粗肽的样品44.6mg。将该粗生成物全量溶解于由二硫苏糖醇和DMF构成的混合溶液，通过使用反相柱(资生堂生产、CAPCELL PAK C1830mmI.D.X 250mm)的HPLC进行纯化。通过将含有TFA 0.1％的90％乙腈水溶液加向0.1％TFA水溶液的直线浓度梯度法进行洗脱，在220nm下进行检测，得到含有化合物1的级分。将该级分冷冻干燥后得到1.6mg化合物1。
质谱分析[TOFMS]；m/z＝2520.7(M+H+)
氨基酸分析；Glx 76(8)，Gly 4.0(4)，Arg 2.9(3)，Ala 2.2(2)，Leu 1.2(1)，Cys 1.7(1)
(2)免疫原的制备
实施例1(1)得到的人SCGF部分肽以提高免疫原性为目的通过以下方法制作与KLH(Calbiochem公司生产)的缀合物，作为免疫原。即、将KLH溶解于PBS中，调整到10mg/mL，滴下1/10容量的25mg/mL MBS(Nacalai Tesque公司生产)，进行30分钟搅拌反应。与通过预先用PBS平衡的Sephadex G-25柱等凝胶过滤柱除去游离的MBS得到的KLH-MB 2.5mg溶解于0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)的肽1mg进行混合，于室温下进行3小时搅拌反应。反应后、用PBS进行透析。
(3)动物的免疫和抗体产生细胞的制备
将实施例1(2)制备的肽-KLH缀合物100μg与铝凝胶2mg以及百日咳疫苗(千叶县血清研究所生产)1×109细胞一起注入到5周龄雌性大鼠(SD)体内，2周以后，每隔1周注入100μg的缀合物，共计注入4次。由眼底静脉丛采血，通过以下(4)所示的酶免疫测定法研究该血清抗体效价，在最终免疫3天后从表现出充分抗体效价的大鼠摘出脾脏。
将脾脏于MEM培养基(日水制药公司生产)中切成薄片，用镊子拨开，进行离心分离(1,200rpm、5分钟)后、弃去上清，用Tris-氯化铵缓冲液(pH7.65)处理1～2分钟，除去红细胞，用MEM培养基洗3次后，用于细胞融合。
(4)酶免疫测定法(结合ELISA)
对于分析用的抗原使用实施例1(1)得到的人SCGF部分肽与甲状腺球蛋白(以下、略称为THY)的缀合物。制作方法如实施例1(2)所述，但对于交联剂，使用SMCC(Sigma公司生产)代替MBS。向96孔EIA用板(Greiner公司生产)按照10μg/mL，50μL/孔分别注入象上述那样制备的缀合物，于4℃下放置过夜，使其吸附。洗净后、按照100μL/孔加1％BSA-PBS，于室温下反应1小时，对残余的活性基进行封闭。倒掉1％BSA-PBS，按照50μL/孔分别注入被免疫小鼠的抗血清、抗人SCGF单克隆抗体的培养上清或纯化单克隆抗体，反应2小时。用Tween-PBS洗后，按照50μL/孔加过氧化物酶标记兔抗大鼠免疫球蛋白(DAKO公司生产)，于室温、反应1小时，用Tween-PBS洗净后，用ABTS底物液[2.2-连氮二(3-乙基苄基噻唑-6-磺酸)铵]，使其发色，通过酶标板比色仪(E-max；Molecular Devices公司生产)测定OD415nm的吸光度。
(5)小鼠骨髓瘤细胞的制备
用正常培养基培养8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤细胞株P3-U1，在细胞融合时确保2×107以上的细胞，作为亲本细胞株供细胞融合用。
(6)杂交瘤的制作
将实施例1(3)得到的大鼠脾细胞和(5)中得到的骨髓瘤细胞按照10∶1进行混合，离心分离(1,200rpm、5分钟)后、弃去上清，将沉淀的细胞组充分拨开后，边搅拌，边于37℃下加聚乙二醇-1,000(PEG-1,000)2g、MEM培养基2mL和二甲基亚砜0.7mL的混合液0.2～1mL/108大鼠脾细胞，每1～2分钟加几次MEM培养基1～2mL后、加MEM培养基使得全量变成50mL。离心分离(900rpm、5分钟)后、弃去上清，慢慢将细胞拨开后，通过刻度吸管吸入、吐出，将细胞温和地悬浮于HAT培养基100mL中。
按照100μL/孔，将该悬浮液分注于96孔培养用板，在5％CO2培养箱中、于37℃培养10～14日。用实施例1(4)所述的酶免疫测定法研究该培养上清，选择与人SCGF部分肽(化合物1)反应，而与其它的SCGF部分肽的序列1的140～156位氨基酸序列构成的肽不反应的孔，再换成HT培养基和正常培养基，重复进行2次克隆，确立了抗人SCGF单克隆抗体产生杂交瘤KM2141、KM2142、KM2143、KM2144、KM2145。
(7)单克隆抗体的纯化
按照5～20×106细胞/只将实施例1(6)中得到的杂交瘤株分别注射到降植烷处理的8周龄裸雌小鼠(Balb/c)腹腔内。于10～21日后，杂交瘤进行癌性腹水化。从积存腹水的小鼠采取腹水(1～8mL/只)，离心分离(3,000rpm、5分钟)后除去固体成分。单克隆抗体为IgM时，用50％硫酸铵进行盐析，用添加了氯化钠0.SM的PBS透析后、以流速15mL/时通过Cellulofine GSL2000(生化学工业公司生产)(柱体积750mL)柱，收集IgM级分，作为纯化单克隆抗体。单克隆抗体为IgG时，通过辛酸沉淀法[Antibodies-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]进行纯化，作为纯化单克隆抗体。
抗体的亚类使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法决定(表1)。(表1)
抗体名 抗体类型
KM2141 G2a
KM2142 G2a
KM2143 G2a
KM2144 G2a
KM2145 G1
(8)与人SCGF部分肽的反应性(酶免疫测定法)
通过(4)所示的酶免疫测定法研究实施例1(6)中选择的抗人SCGF单克隆抗体与人SCGF部分肽(化合物1)的反应性。作为对照肽使用与化合物1不同的SCGF部分肽-由序列1的140～156位的氨基酸序列构成的肽。就象图1所表示的那样，抗人SCGF单克隆抗体(KM2141～2145)与化合物1特异反应，而与对照肽不反应。
实施例2.利用动物细胞的人SCGF的表达和纯化
(1)人SCGF表达用质粒pAGE-SCGFα的构建和人SCGF在动物细胞中的表达
通过将动物细胞用表达载体pAGE210(WO96/34016)的HindIII/KpnI处理片段与编码SCGF蛋白质的DNA[Mio et.al.，BBRC  249，124-130(1998)]连接，构建人SCGF表达载体pAGE-SCGFα。
质粒向动物细胞的导入按照宫地等人方法通过电穿孔法[Miyajiet al.，Cytotechnology， 3，133-140(1990)]进行。将4μg的pAGE-SCGF-a导入到4×106个的dhfr基因缺损的CHO细胞株[Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 77，4216-4220(1980)]。将该细胞悬浮于10mL的MEMa2000-dFCS(5)培养基[含有5％dFCS、1/40量的7.5％NaHCO3、3％的200mL谷氨酰胺溶液(GIBCO/BRL公司生产)、0.5％青霉素·链霉素溶液(GIBCO/BRL公司生产、含有5,000单位/mL青霉素和5,000mg/mL链霉素)的MEM a2000培养基(GIBCO/BRL公司生产)]中，加入到10cm板(IWAKI公司生产)中，在37℃的CO2培养箱中培养24小时。按照终浓度0.3mg/mL添加潮霉素(GIBCO/BRL公司生产)，再培养1～2周。转化细胞达到铺满时回收，悬浮于含有0.3mg/mL潮霉素、50nmol/L methotrexate(MTX)的MEMa2000-dFCS(5)培养基，使得细胞数为1～2×106细胞/mL，然后将2mL分注到F75烧瓶(Greiner公司生产)。培养1～2周后、按照1～2×105细胞/mL将50nmol/L MTX抗性的细胞悬浮于含有0.3mg/mL潮霉素、200nmol/L MTX的MEMa2000-dFCS(5)培养基，然后将2mL分注到F75烧瓶(Greiner公司生产)。培养1～2周后、得到200nmol/L MTX抗性的细胞。使用下面给出的培养基1)和培养基2)用2L的摇瓶(Greiner公司生产)于37℃、80转/分下对该200nmol/L MTX抗性细胞进行培养。
培养基1)无血清Ex-cell 301培养基(JRH Biosciences公司生产)
培养基2)含有10mg/L的aprotinin(Sigma公司生产)的无血清Ex-cell301培养基
培养约5日后，对细胞进行离心分离，得到培养上清样品。
(2)通过使用单克隆抗体KM2142的Western印迹确认培养上清中的SCGF蛋白质的存在
通过使用实施例1得到的抗人SCGF单克隆抗体KM2142的Western印迹，利用以下方法确认上述(1)得到的培养上清中SCGF蛋白质的存在。
通过SDS-PAGE对下面叙述的(3)和(4)的SCGF蛋白质的经层析纯化的各纯化级分进行分离后，按照P.Matsudaira的方法[J.B.C.262，10035-10038(1987)]电转移到PVDF膜(Immobilon TransferMembranes，Millipore公司生产)。转印膜于封闭溶液[含有1％BSA的PBS缓冲液(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，9.6mmol/LNa2HPO4/KH2PO4(pH7.2))]中振荡30分钟后，在含有用封闭溶液稀释到1mg/mL的抗SCGF单克隆抗体的溶液中于室温振荡60分钟。该转印膜再用含有0.05％Tween20的PBS缓冲液清洗2次(每次5分钟)，用PBS缓冲液实施1次5分钟清洗后，在用PBS将过氧化物酶标记的抗大鼠IgG抗体(anti-rat immunoglobulin 1.3g/L，DAKO公司生产)稀释到1/1,000的溶液中，于室温振荡60分钟。用含有0.05％Tween20的PBS缓冲液清洗2次(每次5分钟)，用PBS缓冲液实施1次5分钟清洗后，通过发光法(ECL Western blotting detectionreagents，Amersham Pharmacia Biotech公司生产)进行检测。
(3)从CHO细胞培养上清纯化人SCGF蛋白质
为了制作实施例3所述的抗人SCGF单克隆抗体，通过以下2阶段的层析从上述(1)的培养基1)的培养条件下得到的CHO细胞培养上清取得纯化人SCGF蛋白质。
第1阶段：锌螯合层析
将用Zn2+离子饱和的Chelating Sepharose Fast Flow载体(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)充填到2.5cmφ×20cm柱(BioRad公司生产)，直至11cm的高度，用含有0.5mol/L氯化钠的20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.1)平衡。然后将上述(1)得到的CHO细胞培养上清2.4L添加到平衡后的柱子上，用同一缓冲液充分清洗后，用0～100mmol/L组氨酸直线浓度梯度进行洗脱。用洗脱级分的一部分进行SDS-PAGE，回收含有通过利用上述(2)所示的单克隆抗体KM2142的Western印迹交叉的约45kDa带的级分。
第2阶段：MonoO阴离子交换层析
向上述锌螯合层析粗纯化级分添加终浓度达到65％的硫酸铵，搅拌后、于4℃下放置2小时。将经18,800×g、30分钟离心分离得到的沉淀溶解于10mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH7.0)中，添加到用同一Tris盐酸缓冲液平衡的MonoQ HR 5/5柱(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)上。用同一缓冲液充分清洗后，用0～1mol/L氯化钠直线浓度梯度进行洗脱。用洗脱级分的一部分进行SDS-PAGE，回收通过利用上述(2)所示的单克隆抗体KM2142的Western blotting交叉的约45kDa带的级分(图2的带2)。
(4)从CHO培养上清进行人SCGF蛋白质的高纯度纯化
通过以下3个阶段的层析由上述(1)的培养基2)培养条件下得到的CHO细胞培养上清纯化，取得在实施例6所述的人SCGF定量体系中使用的人SCGF蛋白质标准品。
第1阶段：锌螯合层析
将被Zn2+离子饱和的Chelating Sepharose Fast Flow载体(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)充填到5.0cmφ×20cm柱(BioRad公司生产)，直至达到14.5cm的高度，用含有0.5mol/L氯化钠的20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.1)平衡。将上述(1)得到的CHO细胞培养上清12L添加到柱上，用同一缓冲液充分清洗后、用0～100mmol/L组氨酸直线浓度梯度进行洗脱。用洗脱级分的一部分进行SDS-PAGE，回收通过利用上述(2)所示的KM2142的Western印迹交叉的约45kDa带级分。
第2阶段：MonoQ阴离子交换层析
向上述锌螯合层析粗纯化级分添加使终浓度达到65％的硫酸铵，搅拌后、于4℃下放置2小时。将经18,800×g、30分钟离心分离得到的沉淀溶解于10mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH7.0)中，添加到用同一Tris盐酸缓冲液平衡的MonoQ HR 10/10柱(AmershamPharmacia Biotech公司生产)上。用同一缓冲液充分清洗后，用0～1mol/L氯化钠直线浓度梯度进行洗脱。用洗脱级分的一部分进行SDS-PAGE，回收通过利用上述(2)所示的单克隆抗体KM2142的Western blotting交叉的约45kDa带的级分。
第3阶段：S-400凝胶过滤层析
将Sephacryl S-400 HR载体(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)充填到XK50/60柱(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)，充填高度达到51.5cm的柱和充填达到XK50/100柱(AmershamPharmacia Biotech公司生产)，充填高度达到93cm的柱串联连结，用PBS缓冲液充分平衡。将上述MonoQ阴离子交换层析纯化级分28mL添加到串联柱，以6mL/分的流速通过PBS缓冲液进行洗脱。用洗脱级分的一部分进行SDS-PAGE，回收通过利用上述(2)所示单克隆抗体KM2142的Western blotting交叉的约45kDa的带的级分。
(5)人SCGF蛋白质的N末端氨基酸序列解析
实施例2(3)得到的纯化人SCGF蛋白质的N末端氨基酸序列可以根据蛋白质化学的常规方法决定。将含有纯化人SCGF蛋白质的级分进行SDS-PAGE后、通过银染色(图2带2)或P.Matsudaira的方法电转印到PVDF膜(ProBlott、Applied Biosystems公司生产)。转印的膜进行考马斯亮篮染色，切下看到的分子量为45kDa(图2带2、带A)、41kDa(图2带2、带B)、34kDa(图2带2、带C)的各个带，用气相蛋白测序仪(PPSQ-10、岛津制作所)通过制造商推荐的方法确定氨基酸序列。得到的氨基酸序列就象序列5、6、7所记载的那样，分别与从序列1记载的SCGF的氨基酸序列的N末端起第1个氨基酸残基、第29个氨基酸残基、第个60氨基酸残基开始的氨基酸序列一致。以下、将图2带2所示的看到的分子量约41kDa的N末端28残基缺失SCGF蛋白质称为Δ28体、约34kDa的N末端59残基缺失SCGF蛋白质称为Δ59体。
实施例3.使用CHO细胞表达人SCGF蛋白质制作抗人SCGF单克隆抗体
(1)动物的免疫和抗体产生细胞的制备
将实施例2(3)得到的CHO细胞表达人SCGF蛋白质(SCGF、Δ28体、Δ59体的SCGF混合物)100μg与铝凝胶2mg以及百日咳疫苗(千叶县血清研究所生产)1×109细胞一起注入到6周龄雌小鼠(Balb/c)体内，2周以后，每隔1周注入100μg的人SCGF蛋白，共计注入3次。由眼底静脉丛采血，通过实施例1(4)所示的酶免疫测定法(但对于分析用的抗原使用CHO细胞表达人SCGF蛋白质、作为对照抗原使用1％BSA-PBS。)以及以下给出的夹层ELISA法研究该血清抗体效价，在最终免疫3天后从表现出充分抗体效价的小鼠摘出脾脏。
抗体产生细胞的制备与实施例1(3)同样进行。
(2)夹层ELISA法
将实施例1得到的抗人SCGF单克隆抗体KM214296(10μg/mL)按照50μL/孔分注于96孔EIA板(Greiner公司生产)，于4℃下放置过夜，使其吸附。洗净后，按照100μL/孔加1％BSA-PBS，于室温下反应1小时，对残余的活性基进行封闭。弃去1％BSA-PBS，按照50μL/孔分注用1％BSA-PBS稀释的CHO细胞表达人SCGF蛋白质(5μg/mL)，于室温下反应2小时。作为对照按照50μL/孔分注1％BSA-PBS，同样使其反应。用Tween-PBS洗净后，按照50μL/孔分注上述(1)得到的被免疫小鼠抗血清的培养上清，反应2小时。用Tween-PBS洗净后、按照50μL/孔加注过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白(大鼠血清蛋白吸收过；CALTAG公司生产)，于室温下反应1小时。用Tween-PBS洗净后、用ABTS底物液[2.2-连氮二(3-乙基苄基噻唑-6-磺酸)铵]使其发色，通过酶标板比色仪(Emax；MolecularDevices公司生产)测定OD415nm的吸光度。
(3)小鼠骨髓瘤细胞的制备
象实施例1(5)那样进行制备。
(4)杂交瘤的制作
与实施例1(6)同样进行实施例3(1)得到的小鼠脾细胞和(3)得到的骨髓瘤细胞的细胞融合。
按照100μL/孔将得到的细胞悬浊液分注到96孔培养用板，在5％CO2培养箱中、于37℃下培养10～14日。通过实施例3(2)所述的夹层ELISA法研究该培养上清，选择与人SCGF蛋白质反应，而与作为对照的1％BSA-PBS不反应的孔，再换成HT培养基和正常培养基，重复2次克隆，确立抗人SCGF单克隆抗体产生杂交瘤KM2801、KM2802、KM2803和KM2804。
(5)单克隆抗体的纯化
与实施例1(7)同样，将实施例3(4)得到的杂交瘤株注射到裸雌小鼠腹腔内，从得到的腹水取得纯化单克隆抗体。
抗体的亚类使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法决定。表2给出了该结果。
(表2)
抗体名 抗体种类
KM2801 G1
KM2802 G1
KM2803 G1
KM2804 G1
(6)与CHO细胞表达人SCGF蛋白质的反应性(酶免疫测定法)
通过实施例1(4)给出的酶免疫测定法研究实施例3(4)得到的抗人SCGF单克隆抗体与CHO细胞表达人SCGF蛋白质的反应性。就象图3所示的那样，抗人SCGF单克隆抗体(KM2801、KM2802、KM2803和KM2804)与CHO细胞表达人SCGF蛋白质特异反应，而与对照1％BSA-PBS不反应。
实施例4.使用SDS变性人SCGF蛋白质(CHO细胞表达)制作抗人SCGF单克隆抗体。
使用实施例3记载的未变性人SCGF蛋白质作为免疫原时，不能得到与Δ59体反应的单克隆抗体。因此为了制作与Δ59体反应的单克隆抗体，尝试用SDS变性SCGF作为免疫原制作杂交瘤。
(1)免疫原的制备
制作加SDS(十二烷基硫酸钠；Nacalai Tesque公司生产)使实施例2(3)得到的CHO细胞表达人SCGF蛋白质变性的人SCGF蛋白质，作为免疫原。即制备5％SDS-PBS，向CHO细胞表达人SCGF蛋白质中加入其9分之一量，将于100℃下煮沸5分钟后的变性蛋白作为SDS变性人SCGF蛋白质。
(2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备
将实施例4(1)得到的SDS变性的人SCGF蛋白质100μg与铝凝胶2mg以及百日咳疫苗(千叶县血清研究所生产)1×109细胞一起注入到6周龄雌小鼠(Balb/c)体内，2周以后，每隔1周注入100μg的SDS变性的人SCGF蛋白，共计注入3次。由眼底静脉丛采血，通过实施例1(4)所示的酶免疫测定法(应予说明，对于分析用的抗原使用SDS变性的人SCGF蛋白质、作为对照抗原使用1％BSA-PBS)研究该血清抗体效价，在最终免疫3天后从表现出充分抗体效价的小鼠摘出脾脏。
抗体产生细胞的制备与实施例1(3)同样进行。
(3)小鼠骨髓瘤细胞的制备
用与实施例1(5)记载方法同样的方法进行制备。
(4)杂交瘤的制作
与实施例1(6)同样进行实施例4(2)得到的小鼠脾细胞和(3)得到的骨髓瘤细胞的细胞融合。
按照100μL/孔将得到的细胞悬浊液分注到96孔培养用板，在5％CO2培养箱中、于37℃下培养10～14日。通过实施例1(4)所述的夹层ELISA法研究该培养上清，选择与SDS变性的人SCGF蛋白质反应，而与作为对照的1％BSA-PBS不反应的孔，再换成HT培养基和正常培养基，重复2次克隆，确立抗人SCGF单克隆抗体产生杂交瘤KM2941、KM2942、KM2943、KM2944和KM2945。
(5)单克隆抗体的纯化
与实施例1(7)同样将实施例4(4)中得到的杂交瘤株注入到裸雌小鼠的腹腔内，从得到的腹水中取得纯化单克隆抗体。
抗体的亚类用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法决定。该结果表示在表3中。
(表3)
抗体名 抗体类型
KM2941 G1
KM2942 G1
KM2943 G1
KM2944 G1
KM2945 G1
(6)与SDS变性人SCGF蛋白质的反应性(酶免疫测定法)
通过实施例1(4)给出的酶免疫测定法研究实施例4(4)得到的抗人SCGF单克隆抗体与SDS变性人SCGF蛋白质的反应性。就象图4所示的那样，抗人SCGF单克隆抗体(KM2941、KM2942、KM2943、KM2944和KM2945)与SDS变性人SCGF蛋白质特异反应，而与作为对照的1％BSA-PBS不反应。
实施例5.抗人SCGF单克隆抗体的反应性的研究
(1)对人和小鼠SCGF蛋白质的反应性
用酶免疫测定法(结合ELISA)研究实施例1、3和4制作的抗人SCGF单克隆抗体对人和小鼠SCGF蛋白质的反应性。小鼠SCGF蛋白质参照实施例2记载的方法制作。
作为分析用的抗原使用CHO细胞表达的人和小鼠SCGF蛋白质，按照实施例1(4)记载的方法进行。结果如图5所示。
抗SCGF单克隆抗体KM2142是使用来自相当于序列1所示的SCGF的氨基酸序列的N末端的第6个残基直至第25个残基的部分肽(化合物1)作为抗原制作的杂交瘤的抗体。抗SCGF单克隆抗体KM2142对SCGF蛋白质也表现出反应性。而且，抗SCGF单克隆抗体KM2142对人和小鼠SCGF蛋白质两方都具有反应性。
抗SCGF单克隆抗体KM2804是来自用CHO细胞表达人SCGF作为抗原制作的杂交瘤的抗体。抗SCGF单克隆抗体KM2804只与人SCGF反应，而对小鼠SCGF没有表现出交叉反应性。
抗SCGF单克隆抗体KM2945是来自用SDS变性SCGF蛋白质(CHO细胞表达)作为抗原制作的杂交瘤的抗体。抗SCGF单克隆抗体KM2945对未变性的SCGF蛋白质也表现出反应性。但抗SCGF单克隆抗体KM2945对小鼠SCGF没有表现出交叉反应性。
(2)Western blotting
使用实施例2(3)得到的CHO细胞表达人SCGF蛋白质，对实施例3和4制作的抗人SCGF单克隆抗体KM2804以及KM2945在Western印迹中的反应性进行研究。
与实施例2(2)同样将转印到PVDF膜的样品在封闭溶液中于室温下振荡30分钟后，在用封闭溶液稀释到1mg/mL的抗SCGF单克隆抗体中于室温下振荡60分钟。转印膜再用含有0.05％Tween20的PBS缓冲液洗2次(每次5分钟)，用PBS缓冲液洗1次(5分钟)后，再于用PBS稀释到1/1,000的过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)溶液中于室温下振荡60分钟。用含有0.05％Tween20的PBS缓冲液洗2次(每次5分钟)，用PBS缓冲液洗1次(5分钟)后，通过上述的ECL发光法进行检测。
图2中的带3、4、5分别表示使用KM2142、KM2804、KM2945的纯化人SCGF蛋白质的Western blotting结果。KM2804虽然对N末端缺失59个残基的SCGF蛋白质Δ59体没有反应性，但对全长SCGF以及N末端缺失28个残基的SCGF蛋白质Δ28体有反应性。而KM2945对全长SCGF和各缺失体都有反应性。
实施例6.人SCGF定量体系
通过以下方法对实施例1得到的抗人SCGF单克隆抗体KM2142进行生物素标记。用PBS将实施例1得到的KM2142纯化抗体稀释到1mg/mL，加1/4容量的0.5mol/L碳酸缓冲液(pH 9.2)。再于搅拌下滴加与缓冲液同量的NHS-Lc-Biotin(用二甲基甲酰胺溶解成1mg/mL；Pierce公司生产)。于室温下进行3小时搅拌反应后，将用PBS透析过夜的溶液用作生物素标记KM2142。
按照50μL/孔向96孔的EIA用板(Greiner公司生产)分注实施例3得到的5μg/mL的抗人SCGF单克隆抗体KM2804，于4℃下放置过夜使其吸附。洗涤后、按照100μL/孔加1％BSA-PBS，于室温下反应1小时，对残留的活性基进行封闭。弃去1％BSA-PBS，按照50μL/孔，将用血清稀释液(协和Medex公司生产)以从17.5ng/mL开始2倍稀释系列对实施例2(4)得到的CHO细胞表达人SCGF蛋白质稀释14点后的样品进行分注，于室温下反应2小时。用Tween-PBS洗涤后，按照50μL/孔加上述得到的生物素标记KM2142(用BSA-PBS稀释到0.2μg/mL)，于室温下反应2小时，用Tween-PBS洗涤后、再按照50μL/孔加稀释了32,000倍的碱性磷酸酶标记抗生物素蛋白(ザイメツド公司生产)，于室温反应1小时。用Tween-PBS洗涤后，用AmpliQ(DAKO公司生产)发色，通过酶标板比色仪(E-max；Molecular Devices公司生产)测定OD490nm的吸光度。测定结果就象图6所示那样，通过本定量体系可以在0.04～2.0ng/mL范围对人SCGF蛋白质进行定量。
实施例7.白血病、前白血病患者以及非白血病性恶性血液疾病的血清SCGF浓度
通过实施例6的方法对获得同意书的白血病、前白血病患者以及非白血病性恶性血液疾病患者的血清中的SCGF浓度进行测定。另外，将血细胞检查值表现出正常值的男女10名健康人作为对照例同样进行血清中SCGF浓度的测定。图7给出了测定结果。
确认健康人的值的分布表现出正态分布后，从该组计算与平均值的标准偏差(SD)，将平均值+2SD的值设定为区别正常和异常的基准值。以该基准值为基础，将白血病、前白血病患者以及非白血病性恶性血液疾病的值分为正常·异常，确认能否用SCGF测定值检测白血病、前白血病患者以及非白血病性恶性血液疾病。表4给出了确认的结果。
(表4)
           患者数       阳性者数           阳性率(％)
ALL        7            7                  100.0
AML        7            6                  85.7
CML        6            6                  100.0
MDS        5            5                  100.0
NHL        7            6                  85.7
MM         6            4                  66.7
AA         7            0                  0.0
临界值为健康人的平均值+2SD＝18.2ng/mL。
与健康人组比较，表明急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓发育异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)患者的中央值有显著意义的高，SCGF测定值在这些疾病中有显著意义地上升(图7)。
另外表明用由健康人的值确定的临界值可以高灵敏度地检测白血病、前白血病患者以及非白血病性恶性血液疾病(表4)。另一方面，虽然都是血液疾病，再生障碍性贫血(AA)患者的值观察不到与健康人的显著性差异，即使用临界值也检测不出该疾病。
如果对伴随血液细胞数异常的疾病非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓发育异常综合征(MDS)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)进行比较，急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)等白血病患者的F血液中SCGF浓度比非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓发育异常综合征(MDS)等其它的前白血病和非白血病性恶性血液疾病患者的血液中SCGF浓度有显著意义的高，血液中SCGF浓度可以用于白血病与前白血病或非白血病性恶性血液疾病的区别。另外如果对难以区别诊断的AA患者和MDS患者进行比较的话，MDS患者血中SCGF浓度比AA患者的SCGF浓度有显著意义的高，可以通过血中SCGF浓度对两者进行区别诊断。
实施例8.造血干细胞移植后GVHD发病和SCGF浓度
通过实施例6的方法在每个时期都对在取得同意书的白血病和前白血病患者中接受造血干细胞移植的23例内GVHD发病例15例、没有发病的8例血清中SCGF浓度进行测定。图8给出了测定结果。
接受造血干细胞移植的患者的SCGF浓度与预处理期或再生障碍期相比，恢复期或稳定期表现出有显著意义的高值。
在接受造血干细胞移植的患者中，GVHD发病的病例与没有发病的例子相比，由于在再生障碍期以及恢复期血清中SCGF浓度有显著意义的高，所以通过测定血清中的SCGF浓度，可以判定GVHD发病。
另外对在确定临界值之后，能否判定GVHD发病例和非发病例进行了研究。研究结果如图9所示。分别测定SCGF浓度，通过在预处理期将临界值定为例如5ng/mL，可以以灵敏度87％、特异度57％，在再生障碍期将临界值定为10ng/mL，可以以灵敏度87％、特异度63％，在恢复期将临界值定为15ng/m，可以以灵敏度87％、特异度63％，与在诊断中不能使用SCGF时相比，可以对GVHD发病例和非发病例进行有显著意义(p＜0.05)地区别。
实施例9.移植造血干细胞的存活和血清SCGF浓度
用实施例6的方法在各个时期对取得同意书的血液疾病患者中接受造血干细胞移植的23例中，存活延迟的4例、没有延迟的19例的血清中SCGF浓度进行测定。图10给出了测定结果。
在存活没有延迟例中，恢复期以及稳定期的SCGF浓度与预处理期相比有显著上升。另一方面，在存活延迟例中，在这些时期都没有观察到有显著上升。
因此，测定造血干细胞移植患者的SCGF浓度，对定下该临界值通过该值与各个患者的值比较能否判定造血干细胞存活延迟例和非延迟例进行了研究。图11给出了研究结果。在预处理期，通过将临界值定为例如9.5ng/mL，可以以灵敏度75％、特异度67％，在再生障碍期通过将临界值定为12ng/mL可以以灵敏度75％、特异度63％对造血干细胞存活延迟例和非延迟例进行区别。
实施例10.SCGF在白血病患者末梢血细胞中的表达
用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司生产)按照程序从取得同意书的各种白血病患者的末梢血细胞提取总RNA，将总RNA 1μg用DNaseI(GIBCO公司生产)处理，通过SuperScript First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR(GIBCO公司生产)进行逆转录，制备First-StrandDNA。以用Taq Polymerase(TaKaRa公司生产)制备的First-StrandDNA作为模板，将具有序列8和9以及序列10和11的碱基序列的寡DNA作为引物，分别对人G3PDH、SCGF基因的检测进行研究时，在G3PDH的检测量大致同等的条件下，在健康人中有1例没有检测到SCGF的表达，但在2例急性淋巴性白血病(ALL)中有1例、在2例急性骨髓性白血病(AML)中有2例检测到SCGF的表达。
产业上利用的可能性
本发明提供使用与SCGF反应的抗体对白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行判定的方法、对造血干细胞移植后的造血干细胞存活延迟以及移植物抗宿主病进行判定的方法、以及这些疾病的诊断药以及诊断试剂盒。
                              序列表
<110>学校法人东海大学
     协和发醇工业株式会社
     协和梅迪克斯株式会社
<120>白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的判定方法以及诊断药
<130>11470WO1
<140>
<141>
<150>JP P2002-106786
<151>2002-04-09
<160>11
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>302
<212>PRT
<213>人Homo sapiens
<400>1
Ala Arg Gly Ala Glu Arg Glu Trp Glu Gly Gly Trp Gly Gly Ala Gln
  1               5                  10                  15
Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Leu Met Leu Lys His Leu Gln Glu
             20                  25                  30
Ala Leu Gly Leu Pro Ala Gly Arg Gly Asp Glu Asn Pro Ala Gly Thr
         35                  40                  45
Val Glu Gly Lys Glu Asp Trp Glu Met Glu Glu Asp Gln Gly Glu Glu
     50                  55                  60
Glu Glu Glu Glu Ala Thr Pro Thr Pro Ser Ser Gly Pro Ser Pro Ser
 65                  70                  75                  80
Pro Thr Pro Glu Asp Ile Val Thr Tyr Ile Leu Gly Arg Leu Ala Gly
                 85                  90                  95
Leu Asp Ala Gly Leu His Gln Leu His Val Arg Leu His Ala Leu Asp
            100                 105                 110
Thr Arg Val Val Glu Leu Thr Gln Gly Leu Arg Gln Leu Arg Asn Ala
        115                 120                 125
Ala Gly Asp Thr Arg Asp Ala Val Gln Ala Leu Gln Glu Ala Gln Gly
    130                 135                  140
Arg Ala Glu Arg Glu His Gly Arg Leu Glu Gly Cys Leu Lys Gly Leu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Gly His Lys Cys Phe Leu Leu Ser Arg Asp Phe Glu Ala Gln
                165                 170                 175
Ala Ala Ala Gln Ala Arg Cys Thr Ala Arg Gly Gly Ser Leu Ala Gln
            180                 185                 190
Pro Ala Asp Arg Gln Gln Met Glu Ala Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ala
        195                 200                 205
Ala Leu Ala Pro Tyr Asn Trp Pro Val Trp Leu Gly Val His Asp Arg
    210                 215                 220
Arg Ala Glu Gly Leu Tyr Leu Phe Glu Asn Gly Gln Arg Val Ser Phe
225                 230                 235                 240
Phe Ala Trp His Arg Ser Pro Arg Pro Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ser
                245                 250                 255
Ala Ser Pro His Pro Leu Ser Pro Asp Gln Pro Asn Gly Gly Thr Leu
            260                 265                 270
Glu Asn Cys Val Ala Gln Ala Ser Asp Asp Gly Ser Trp Trp Asp His
        275                 280                 285
Asp Cys Gln Arg Arg Leu Tyr Tyr Val Cys Glu Phe Pro Phe
    290                 295                 300
<210>2
<211>224
<212>PRT
<213>人Homo sapiens
<400>2
Ala Arg Gly Ala Glu Arg Glu Trp Glu Gly Gly Trp Gly Gly Ala Gln
  1               5                  10                  15
Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Leu Met Leu Lys His Leu Gln Glu
             20                  25                  30
Ala Leu Gly Leu Pro Ala Gly Arg Gly Asp Glu Asn Pro Ala Gly Thr
         35                  40                  45
Val Glu Gly Lys Glu Asp Trp Glu Met Glu Glu Asp Gln Gly Glu Glu
     50                  55                  60
Glu Glu Glu Glu Ala Thr Pro Thr Pro Ser Ser Gly Pro Ser Pro Ser
 65                  70                  75                  80
Pro Thr Pro Glu Asp Ile Val Thr Tyr Ile Leu Gly Arg Leu Ala Gly
                 85                  90                  95
Leu Asp Ala Gly Leu His Gln Leu His Val Arg Leu His Ala Leu Asp
            100                 105                 110
Thr Arg Val Val Glu Leu Thr Gln Gly Leu Arg Gln Leu Arg Asn Ala
        115                 120                 125
Ala Gly Asp Thr Arg Asp Ala Val Gln Ala Leu Gln Glu Ala Gln Gly
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Arg Glu His Gly Arg Leu Glu Gly Cys Leu Lys Gly Leu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Gly His Lys Cys Phe Leu Leu Ser Arg Asp Phe Glu Ala Gln
                165                 170                 175
Pro Ser Ala Ser Pro His Pro Leu Ser Pro Asp Gln Pro Asn Gly Gly
            180                 185                 190
Thr Leu Glu Asn Cys Val Ala Gln Ala Ser Asp Asp Gly Ser Trp Trp
        195                 200                 205
Asp His Asp Cys Gln Arg Arg Leu Tyr Tyr Val Cys Glu Phe Pro Phe
    210                 215                 220
<210>3
<211>248
<212>PRT
<213>人Homo sapiens
<400>3
Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr
  1               5                  10                  15
Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr
             20                  25                  30
Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met
         35                  40                  45
Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser
     50                  55                  60
Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val
 65                  70                  75                  80
Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys
                 85                  90                  95
Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro
            100                 105                 110
Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp
        115                 120                 125
Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu
    130                 135                 140
Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu
145                 150                 155                 160
Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn
                165                 170                 175
Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala
            180                 185                 190
Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly
        195                 200                 205
Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu
    210                 215                 220
Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu
225                 230                 235                 240
Lys Glu Arg Glu Phe Gln Glu Val
                245
<210>4
<211>22
<212>PRT
<213>人Homo sapiens
<400>4
Arg Glu Trp Glu Gly Gly Gly Trp Gly Gly Ala Gln Glu Glu Glu Arg
  1               5                  10                  15
Glu Arg Glu Ala Leu Cys
             20
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>人Homo sapiens
<400>5
Ala Arg Gly Ala Glu Arg Glu Trp Glu Gly
  1               5                  10
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>人Homo sapiens
<220>
<221>不确定
<222>(1)
<223>Xaa为不确定
<400>6
Xaa Leu Gln Glu Ala Leu Gly Leu Pro Ala
  1               5                  10
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>人Homo sapiens
<400>7
Asp Gln Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala
  1               5                  10
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成序列
<400>8
cccatcacca tcttccagga gc                                         22
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成序列
<400>9
ttcaccacct tcttgatgtc atcata                                     26
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成序列
<400>10
gtcctctttt ccctcaaca                                             19
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成序列
<400>11
ttttgggggc tttggtgg                                              18

Claims (20)

1.对白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行判定的方法，其特征在于测定机体样品中造血干细胞生长因子SCGF。
2.对白血病和、前白血病或非白血病性恶性血液疾病进行区别的方法，其特征在于测定机体样品中造血干细胞生长因子SCGF。
3.对再生障碍性贫血和骨髓发育异常综合征进行区别的方法，其特征在于测定机体样品中造血干细胞生长因子SCGF。
4.对造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态进行判定的方法，其特征在于测定机体样品中造血干细胞生长因子SCGF。
5.对移植物抗宿主病进行判定的方法，其特征在于测定机体样品中造血干细胞生长因子SCGF。
6.权利要求1～5中任一项所述的方法，其中判定或区别方法是免疫学的测定方法。
7.权利要求6所述的方法，其中免疫学的测定方法是夹层法。
8.权利要求7所述的方法，其特征是：夹层法使用与造血干细胞生长因子SCGF的不同抗原表位反应的2种抗体。
9.权利要求8所述的方法，其中抗体是选自多克隆抗体和单克隆抗体的抗体。
10.权利要求9所述的方法，其中单克隆抗体是选自可识别以序列1的6～28位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体、识别以29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体以及60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体的单克隆抗体。
11.白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的诊断药，含有与造血干细胞生长因子SCGF反应的抗体作为有效成分。
12.造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态的诊断药，含有与造血干细胞生长因子SCGF反应的抗体作为有效成分。
13.移植物抗宿主病的诊断药，含有与造血干细胞生长因子SCGF反应的抗体作为有效成分。
14.权利要求11～13中任一项中所述的诊断药，其中抗体是选自多克隆抗体和单克隆抗体的抗体。
15.权利要求14所述的诊断药，其中单克隆抗体是选自可识别以序列1的6～28位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体、识别以29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体以及以60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体的单克隆抗体。
16.白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病、造血干细胞移植后的造血干细胞的存活状态或移植物抗宿主病的诊断用试剂盒，含有与造血干细胞生长因子SCGF反应的抗体。
17.权利要求16所述的诊断用试剂盒，含有造血干细胞生长因子SCGF。
18.识别序列1的29～59位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体。
19.识别序列1所述的60～302位的氨基酸序列表示的区域的单克隆抗体。
20.生产权利要求18或19所述单克隆抗体的杂交瘤。
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