CN111198271A - 一种用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒 - Google Patents

一种用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒，包括：包被有甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶标准品、碱性磷酸酯酶标记的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶单克隆抗体、样品稀释液、抗体稀释液、化学发光液和洗涤液。本公开采用化学发光酶联免疫试剂盒对甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶进行检测，操作简单、样品用量少、用时短、灵敏度高、准确性和重复性好。与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。

Description

一种用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试 剂盒
技术领域
本公开涉及临床诊断技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
恶性肿瘤是全球性的常见病及多发病，是危害人们健康的重大疾病之一。我国2015年约有429.2万例新增癌症病例，平均每天新增1.2万例；同时约有281.4万人死于癌症，平均每天死亡例数达7500例。其中肺和支气管癌、胃癌、肝癌、食道癌和结直肠癌占所有癌症死亡情况的四分之三(CA Cancer J Clin.2016；66:115-132)。我国恶性肿瘤发病率近年来呈持续高发趋势，已成为国内居民的首要死因。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是糖酵解过程中重要的酶。分子量37kDa，催化3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde 3-phosphate)到1，3-二磷酸甘油酸的反应(D-glycerate 1,3-bisphosphate)。除此众所周知的代谢调控功能外，近几年研究证明GAPDH还参与了许多非代谢调控过程，包括转录激活(Oncogene.2007；26(18):2606–20.)等。
有研究报道在黑色素瘤(Anticancer Research.2013；35(1):439–44)和非小细胞肺癌组织中(PLOS ONE.2013；8(4):e61262)GAPDH的mRNA水平显著上升，且表达水平与肿瘤恶性程度正相关。这是因为GAPDH在糖酵解过程中的重要作用以及其抗凋亡功能对肿瘤细胞的增殖和保护也十分重要，例如GAPDH可以保护因化疗药物的作用导致的端粒缩短。但如果氧化压力等条件破坏了GAPDH的功能，细胞就会老化或者死亡(Clinical andExperimental Pharmacology&Physiology.2012；39(8):674–9.)，GAPDH的缺失同样会导致肿瘤细胞老化(Biochemical and Biophysical Research Communications.2011；411(2):409–15.)。我国科研工作者针对GAPDH在肿瘤中转录水平升高也有过类似报道，例如利用荧光定量PCR方法检测乳腺癌患者血清中的游离DNA，结果发现84.5％的乳腺癌患者DNA检测为阳性，I～II期乳腺癌患者阳性率为84％(肿瘤2011；31(12)：1099-1102)。目前，相关研究主要集中在几个瘤种中GAPDH基因水平，特别是mRNA的表达量的变化与肿瘤的关系，其蛋白水平的表达和变化情况鲜有报道，特别是肿瘤患者血清/血浆中GAPDH的含量与肿瘤发生发展的相关性更是有待研究。
化学发光免疫分析技术是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项新的免疫测定技术。它将化学发光分析的高灵敏度与抗原抗体反应的高特异性相结合，与目前常用的其他免疫分析法相比具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、测量线性范围宽、稳定性好，可实现自动化、使用简便、安全、无放射性污染等诸多优点,因此倍受人们的青睐，该技术已广泛应用于传染性疾病、肥胖及相关疾病、内分泌系统、遗传病、肿瘤的早期诊断、动植物检验检疫等众多领域。
但是，目前尚未有化学发光酶联免疫方法检测人血清甘油醛-3-磷酸脱氢酶的相关报道，也没有用于人血清甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒。
发明内容
针对背景技术，本公开将化学发光酶联免疫技术用于人血清甘油醛-3-磷酸脱氢酶的检测，进行人血清甘油醛-3-磷酸脱氢酶化学发光酶联免疫检测试剂盒的开发和应用。
本公开具体采用以下技术方案：
在本公开的第一个方面，提供一种用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒，包括：
包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板、甘油醛-3-磷酸脱氢酶标准品、碱性磷酸酯酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体、样品稀释液、抗体稀释液、化学发光液和洗涤液；
其中，所述化学发光液为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.02～0.04M、4-碘苯酚0.001～0.002M、4-4-甲氧基苯酚0.001～0.002M pH＝8.0～8.8的氨-氯化铵溶液。
在本公开的第二个方面，提供所述用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒的制备方法，该方法包括：
甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的制备：采用基因工程技术以大肠杆菌为载体制备人重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶，将纯化后的甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫BALB/C小鼠，通过杂交瘤融合技术制备得到人甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体；
包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板的制备：将所得甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体稀释后，加入微孔中进行包被，即得到包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板；
酶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体的制备：制备碱性磷酸酯酶溶液，将甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体与所述碱性磷酸酯酶溶液混合反应，然后在得到的反应液中加入硼氢化钾透析过夜，再加入甘油，避光保存。
在本公开的第三个方面，提供一种利用所述的化学发光酶联免疫试剂盒进行甘油醛-3-磷酸脱氢酶含量检测的方法，包括以下步骤：
(1)标准曲线的建立：
向包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板的微孔中分别加入不同浓度的标准品溶液，然后分别加入稀释后的碱性磷酸酯酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体，水浴后加入洗涤液，静置，拍干，并依此方法重复洗涤，然后向微孔中加入发光液，静置，在化学发光免疫分析仪上检测，检测波长为470～480nm(优选477nm)，得到各微孔的发光值(RLU)，然后以甘油醛-3-磷酸脱氢酶浓度为纵坐标，发光值为横坐标绘制标准曲线；
(2)样品的检测；
将待检测样品加入酶标板的微孔中，再加入稀释后的碱性磷酸酯酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体，然后按照步骤(1)中的方法进行操作，得待检测样品的发光值，将发光值代入所述的标准曲线中，即可计算待检测样品中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的含量。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：
本公开采用化学发光酶联免疫试剂盒对甘油醛-3-磷酸脱氢酶进行检测，操作简单、样品用量少、用时短、灵敏度高、准确性和重复性好。与传统的ELISA法比较，操作时间大幅度减少。
本公开的化学发光酶联免疫试剂盒可通过检测人血清或血浆中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的含量对肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌等10种癌症进行诊断、预后评价和疗效检测。所述试剂盒可用于包括但不限于癌症筛查、受试者发生癌症的风险评估、癌症进展阶段的区分、癌症治疗疗效的鉴定以及癌症进展的风险分析。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1是本公开化学发光酶联免疫试剂盒标准曲线。
图2不同化学发光体系对发光强度的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，目前尚未有化学发光酶联免疫方法检测人血清甘油醛-3-磷酸脱氢酶的相关报道，也没有用于人血清甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒。
针对此，在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒，包括：包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板、甘油醛-3-磷酸脱氢酶标准品、碱性磷酸酯酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体、样品稀释液、抗体稀释液、化学发光液和洗涤液。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述化学发光酶联免疫试剂盒的检测样本为人血清样本或血浆样本或其它溶液。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述化学发光酶标板的微孔的抗体包被浓度为2.5～5μg/mL。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述化学发光酶标板采用乳白色或白色不透明聚苯乙烯48孔或96孔化学发光板。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶标准品的浓度分别为0ng/mL、0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶采用的是重组人甘油醛-3-磷酸脱氢酶；所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的标记物为碱性磷酸酯酶，采用过碘酸钠法进行标记。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述样品稀释液为磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，磷酸盐缓冲液是每升含有8g NaCl，0.2g KCl，0.27g KH2PO4，1.42g Na2HPO4的水溶液。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述抗体稀释液为含有BSA的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，每升含有20g BSA，10g NaCl，0.5g KCl，0.27g KH2PO4，1.42g Na2HPO4的水溶液。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述化学发光液为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.02～0.04M、4-碘苯酚0.001～0.002M、4-4-甲氧基苯酚0.001～0.002M pH＝8.0～8.8的氨-氯化铵溶液。
优选的，所述化学发光液为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.02M、4-碘苯酚0.001M、4-4-甲氧基苯酚0.001M pH＝8.6的氨－氯化铵溶液。
氨-氯化铵缓冲液：取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml，再加稀氨溶液调节pH值至8.0～8.8，即得。
经过试验验证，在检测人血清或血浆中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶时，化学发光液对其灵敏度和准确性具有较大的影响，在试验研究过程中，本发明人发现选择AMPPD为发光底物、4-碘苯酚和4-4-甲氧基苯酚同时作为AMPPD的增强发光剂，相比于其他发光体系(比如：鲁米诺化学发光体系或含有单一增强发光剂的化学发光体系)，能够增强发光信号，该发光体系能稳定较长的时间，便于重复测量，大幅度提高了检测灵敏度和准确性。选择的氨-氯化铵溶液可以提供碱性的缓冲体系，让化学发光更加顺利，并且能够较好的溶解4-碘苯酚和4-4-甲氧基苯酚，为了更好的溶解，也可预先采用N，N-二甲基甲酰胺进行溶解。经试验验证，与其他pH值相比，在pH＝8.0～8.8的氨-氯化铵溶液的碱性体系化学发光强度相对较高。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述洗涤液是含有体积分数0.05％吐温20的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液是每升含有8g NaCl，0.2g KCl，0.27g KH2PO4，1.42g Na2HPO4的水溶液。
在本公开的第二个典型的实施方式中，提供所述用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒的制备方法，该方法包括：
甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的制备：采用基因工程技术以大肠杆菌为载体制备人重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶，将纯化后的甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫BALB/C小鼠，通过杂交瘤融合技术制备得到人甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体；
包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板的制备：将所得甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体稀释后，加入微孔中进行包被，即得到包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板；
酶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体的制备：制备碱性磷酸酯酶溶液，将甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体与所述碱性磷酸酯酶溶液混合反应，然后在得到的反应液中加入硼氢化钾透析过夜，再加入甘油，避光保存。
在本公开的一个或一些实施方式中，在甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的制备中，重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶采用离子交换层析和凝胶过滤技术进行制备；所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体分别通过蛋白质亲和层析技术和凝胶过滤技术进行纯化，然后利用酶联免疫技术筛选得到具有高度特异性的诊断用甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体。
在本公开的一个或一些实施方式中，在包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板的制备中，利用所述抗体稀释液对甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体进行稀释，得到单克隆抗体稀释液，然后在4℃条件下将单克隆抗体稀释液加入化学发光酶标板的微孔中，放置12-24h后，利用所述洗涤液对微孔进行洗涤，然后加入封闭液，水浴加热后再次洗涤，并依次重复2～3次后拍干，即得所述酶标板，可将酶标板于4℃保存。
在本公开的一个或一些实施方式中，在酶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体的制备中，制备碱性磷酸酯酶溶液，将碱性磷酸酯酶溶解于水中，将所得溶液于4℃条件下静置10～12h后与NaIO4水溶液混合，在4℃条件下避光搅拌，然后在4℃条件下进行透析10～12h，即得所述碱性磷酸酯酶溶液。
在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种利用所述的化学发光酶联免疫试剂盒进行甘油醛-3-磷酸脱氢酶含量检测的方法，包括以下步骤：
(1)标准曲线的建立：
向包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板的微孔中分别加入不同浓度的标准品溶液，然后分别加入稀释后的碱性磷酸酯酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体，水浴后加入洗涤液，静置，拍干，并依此方法重复洗涤，然后向微孔中加入发光液，静置，在化学发光免疫分析仪上检测，检测波长为470～480nm(优选477nm)，得到各微孔的发光值(RLU)，然后以甘油醛-3-磷酸脱氢酶浓度为纵坐标，发光值为横坐标绘制标准曲线；
(2)样品的检测；
将待检测样品加入酶标板的微孔中，再加入稀释后的碱性磷酸酯酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体，然后按照步骤(1)中的方法进行操作，得待检测样品的发光值，将发光值代入所述的标准曲线中，即可计算待检测样品中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的含量。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
一种血清甘油醛-3-磷酸脱氢酶的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光酶标板和设在盒体内的试剂：
(1)包被抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的乳白色不透明96孔的聚苯乙烯化学发光酶标板，抗体包被浓度为2.5μg/mL。
(2)一系列甘油醛-3-磷酸脱氢酶标准品溶液，浓度分别为：0ng/mL、0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL。
(3)样品稀释液，为磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，磷酸盐缓冲液是每升含有8g NaCl，0.2g KCl，0.27g KH2PO4，1.42g Na2HPO4的水溶液。
(4)酶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体的标记物为碱性磷酸酯酶，采用过碘酸钠法进行标记；所述显色液的化学发光底物为AMPPD，用氨-氯化铵溶液配制得到。
(5)化学发光液：所述化学发光液为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.02M、4-碘苯酚0.001M、4-4-甲氧基苯酚0.001M pH＝8.6的氨-氯化铵溶液。
(6)洗涤液：洗涤液具体为含有吐温20(Tween-20)缓冲液的20倍浓缩磷酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤化学发光酶标板。
该试剂盒适用于确定受试者是否患有癌症或处于患癌风险中；用于肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺瘤等癌症进展阶段的分类；用于对肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺瘤患者进行病情监测和/或疗效评价。
该试剂盒检测样本为人血清样本。
实施例2
实施例1的试剂盒中涉及的甘油醛-3-磷酸脱氢酶标准品溶液、样本稀释液、化学发光液及洗涤液的主要成分及其配制方法是：
(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶标准品溶液：以常规方法将重组人甘油醛-3-磷酸脱氢酶纯品用标准品稀释液配制成浓度分别为0ng/mL、0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的标准溶液。
(2)酶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体溶液：将甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体与碱性磷酸酯酶偶联，将所得酶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体用抗体稀释液稀释成1:250的工作浓度。
(3)标准品稀释液：为含有BSA的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，每升含有20g BSA，8gNaCl，0.4g KCl，0.4g KH2PO4，5.8g Na2HPO4的水溶液。
(4)抗体稀释液：为含有BSA的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，每升含有20g BSA，8gNaCl，0.2g KCl，0.27g KH2PO4，1.42g Na2HPO4的水溶液。
(5)样品稀释液:为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，每升含有8g NaCl，0.2g KCl，0.27gKH2PO4，1.42g Na2HPO4的水溶液。
(6)洗涤液：按体积分数0.05％将吐温20添加至pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中。
(7)封闭液：10g BSA溶于1L洗涤溶液中，再加入质量为0.5g的NaN3。
实施例3
实施例1中的用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒的制备方法，该方法包括：
(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的制备：采用基因工程技术以大肠杆菌为载体制备人重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶，再采用离子交换层析和凝胶过滤技术分离纯化人重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶，将纯化的人重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫BALB/C小鼠，通过杂交瘤融合技术制备抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶的单克隆抗体，并通过蛋白质亲和层析技术和凝胶过滤技术纯化单克隆抗体；利用酶联免疫技术筛选具有高度特异性的诊断用单克隆抗体。
(2)试剂盒中酶标抗体的制备：称取碱性磷酸酯酶溶解于超纯水中，配制成溶液，4℃静置过夜，使之充分溶解；次日取上述溶液，并向其中加入新配NaIO4水溶液，混匀后放置冰箱避光搅拌。取出反应液装入透析袋中，4℃条件下，对反应液透析过夜。次日将透析后的混合物取出，调节混合物pH值为7.0；立即将甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体加入，室温避光搅拌，搅拌时间5min。反应结束后取混合液中加入KBH4溶液；然后将混合液超滤加等量甘油保存。
(3)酶标板的制备：将甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体用稀释液稀释至终浓度为2.5μg/mL后，向微孔板每孔中加入100μL稀释液置于4℃过夜包被，次日将包被甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的酶标板取出洗涤后每孔加封闭液，37℃水浴30min后再洗涤，重复3次，拍干，密封在4℃下保存。包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选BSA。
实施例4实施例1试剂盒的使用方法
(1)化学发光酶标板使用前每孔加200μL洗涤液，等待30秒后甩尽清洗液，重复2次。
(2)将标准品溶液或待样本溶液各100μL分别加入化学发光板微孔中，震荡混匀后，用封板膜封板，37℃水浴60分钟。
(3)甩去化学发光酶标板孔内液体，每孔加200μL洗涤液，等待30秒后甩尽清洗液，重复此操作5次。
(4)加入碱性磷酸酯酶标记抗体，每孔100μL，用封板膜封板，37℃水浴60分钟。
(5)甩去孔内液体，每孔加200μL清洗液，等待30秒后甩尽清洗液，重复此操作5次。
(6)每孔分别加入50μL化学发光液A液，反映5-15分钟置于化学发光仪器中读数。
实施例5实施例1试剂盒的灵敏度
用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定9次，得出9次测量结果的发光值(RLU值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对应的RLU值,根据试剂盒所用校准品的定标曲线方程，将M+2SD所对应的RLU值带入标准曲线中，求出对应的浓度值，即为检测限。
Figure BDA0001868508310000091
实施例6实施例1试剂盒的准确度
取浓度为20ng/ml标准品进行检测。重复测量3次后，其平均结果记为M，根据公式(1)计算测量浓度的相对偏差。
公式(1)：B＝(M－T)/T×100％
式中：
B－相对偏差；
M－测量浓度3次结果的平均值；
T－准确度参考品的浓度。
Figure BDA0001868508310000092
实施例7实施例1试剂盒的重复性
用20ng/ml的样本各重复检测6次，计算6次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，根据公式(2)得出变异系数CV。
公式(2)：CV＝SD/M×100％
式中：
CV－变异系数；
SD－6次测量结果的标准差；
M－6次测量结果的平均值。
Figure BDA0001868508310000101
本公开对不同的化学发光液进行的对比试验，包括但不限于以下试验，每组重复三次，取平均值。
本实施例1中的化学发光液1：所述化学发光液为AMPPD 0.02M、4-碘苯酚0.001M、4-4-甲氧基苯酚0.001M pH＝8.6的氨-氯化铵溶液。
与实施例1的区别是，化学发光液2：所述化学发光液为AMPPD 0.02M、4-碘苯酚0.002M pH＝8.6的氨-氯化铵溶液。
与实施例1的区别是，化学发光液3：所述化学发光液为AMPPD 0.02M、4-碘苯酚0.001M、4-4-甲氧基苯酚0.001M pH＝8.6的Tris-HCl溶液。
与实施例1的区别是，化学发光液4：所述化学发光液为AMPPD 0.02M、对甲苯酚0.002M pH＝8.6的氨-氯化铵溶液。
与实施例1的区别是，化学发光液5：所述化学发光液为AMPPD 0.02M、对甲苯酚0.002M pH＝8.6的Tris-HCl溶液。
与实施例1的区别是，化学发光6：化学发光液A液为鲁米诺含量为0.02M、对甲苯酚含量为0.002M pH＝8.6的Tris-HCl缓冲液；化学发光液B液为每100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 1.42g，0.75％的过氧化氢水溶液，并且甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体的标记物为辣根过氧化物酶。
取浓度为20ng/ml标准品按照实施例4的方法进行检测化学发光强度的大小，结果如图2所示，从图2可以看出本公开实施例1的化学发光体系的增强发光效果十分优异，化学发光稳定性好，与其他化学发光体系差异较为明显；而且经过试验验证，采用本公开实施例1的化学发光体系其最终的检测结果的灵敏度更低、准确度和重复性更好。
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒，其特征是，该试剂盒包括：
包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板、甘油醛-3-磷酸脱氢酶标准品、碱性磷酸酯酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体、样品稀释液、抗体稀释液、化学发光液和洗涤液；其中，所述化学发光液为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐0.02～0.04M、4-碘苯酚0.001～0.002M、4-4-甲氧基苯酚0.001～0.002M pH＝8.0～8.6的氨-氯化铵溶液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：所述化学发光酶标板的微孔的抗体包被浓度为2.5～5μg/mL。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶标准品的浓度分别为0ng/mL、0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：所述样品稀释液为磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，磷酸盐缓冲液是每升含有8g NaCl，0.2g KCl，0.27g KH2PO4，1.42g Na2HPO4的水溶液。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：所述抗体稀释液为含有BSA的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4，每升含有20g BSA，10g NaCl，0.5g KCl，0.27g KH2PO4，1.42g Na2HPO4的水溶液。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是：所述洗涤液是含有体积分数0.05％吐温20的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液是每升含有8g NaCl，0.2g KCl，0.27g KH2PO4，1.42g Na2HPO4的水溶液。
7.权利要求1～6中任一项所述的用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶检测的化学发光酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的制备：采用基因工程技术以大肠杆菌为载体制备人重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶，将纯化后的甘油醛-3-磷酸脱氢酶免疫小鼠，通过杂交瘤融合技术制备得到人甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体；
包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板的制备：将所得甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体稀释后，加入微孔中进行包被，即得到包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板；
酶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体的制备：制备碱性磷酸酯酶溶液，将甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体与碱性磷酸酯酶溶液混合反应，然后在得到的反应液中加入硼氢化钾透析过夜，再加入甘油，避光保存。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征是：在包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板的制备中，利用所述抗体稀释液对甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体进行稀释，得到单克隆抗体稀释液，然后将单克隆抗体稀释液加入化学发光酶标板的微孔中，放置12-24h后，利用所述洗涤液对微孔进行洗涤，然后加入封闭液，水浴加热后再次洗涤，并依次重复2～3次后拍干，即得所述酶标板。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征是：在酶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体的制备中，制备碱性磷酸酯酶溶液，将碱性磷酸酯酶溶解于水中，将所得溶液于4℃条件下静置10～12h后与NaIO4水溶液混合，在4℃条件下避光搅拌，然后在4℃条件下进行透析10～12h，即得所述碱性磷酸酯酶溶液。
10.一种利用权利要求1～6中任一项所述的化学发光酶联免疫试剂盒进行甘油醛-3-磷酸脱氢酶含量检测的方法，包括以下步骤：
(1)标准曲线的建立：
向包被有甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体的化学发光酶标板的微孔中分别加入不同浓度的标准品溶液，然后分别加入稀释后的碱性磷酸酯酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体，水浴后加入洗涤液，静置，拍干，并依此方法重复洗涤，然后向微孔中加入发光液，静置，在化学发光免疫分析仪上检测，检测波长为470nm～480nm，得到各微孔的发光值(RLU)，然后以甘油醛-3-磷酸脱氢酶浓度为纵坐标，发光值为横坐标绘制标准曲线；
(2)样品的检测；
将待检测样品加入酶标板的微孔中，再加入稀释后的碱性磷酸酯酶标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶单克隆抗体，然后按照步骤(1)中的方法进行操作，得待检测样品的发光值，将发光值代入所述的标准曲线中，即可计算待检测样品中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的含量。
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